KR20140094973A - 수지상세포 활성화를 위한 갈근 조성물의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갈근 (Pueraria lobata)으로부터 분리된 다당류의 미성숙 수지상세포 활성화를 통한 면역증강 효능에 관한 것으로, 자세하게는 갈근의 추출물로부터 분리 및 정제된 다당류(PLP)가 TLR4와 이의 하부 신호 전달을 통해 미성숙 수지상세포(Dendritic cell, DC)를 활성화시켜 면역 반응을 유도할 수 있는 효과가 우수하여 면역 증진용 조성물 및 항암용 조성물로 사용할 수 있음을 제공하는 것이다. 또한, 갈근 유래 다당류는 천연물인 갈근으로부터 유래한 것으로서 세포에 대한 독성에 없고 부작용이 적어 체내 안정하므로, 건강기능성 식품의 원료로도 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

수지상세포 활성화를 위한 갈근 조성물의 용도{Use of Composition for Dendritic Cell Activation Comprising Pueraria lobata Polysaccharide}
본 발명은 갈근 (Pueraria lobata)으로부터 분리된 면역활성 증강용 다당류(Polysaccharide) 및 이를 유효성분으로 포함하는 수지상세포(Dendritic cell) 활성화를 위한 면역 증강용 또는 항암용 조성물에 관한 것이다.
수지상세포(Dendritic cells, DCs)는 주로 T 세포에 항원제시 기능을 수행하는 대표적인 항원제시세포의 일종이다. 이들 수지상세포는 림프계 조직을 비롯하여 여러 조직의 세포간극에서 나뭇가지모양으로 존재한다.
골수의 조혈간세포에서부터 유래하는 수지상세포는 병원체를 최초로 인식하며 주위환경의 신호(signal)의 농도에 의존하여 분화시키는데, 강력한 항원-포획 기능을 갖는 미성숙 세포의 상태로, 미세환경신호(LPS, TNF-α, IL-1 등)를 접하게 되면, 미성숙 수지상세포는 성숙화가 진행되어 2차 림프 가구의 T 세포 영역으로 이동하고 MHC-｜ 및 공동자극인자분자를 통해 CD8+ T세포를 감작 시킨다. 이러한 면역 반응은 수지상세포의 성숙화가 필수적인 단계임을 알 수 있다.
한편, 현재 암환자의 치료를 위하여 가장 일반적으로 사용하고 있는 화학요법은 암의 완전한 퇴치와 전이방지와 같은 만족스러운 치료효과를 얻기가 어려울 뿐만 아니라 유효한 치료용량을 투여할 경우 심각한 부작용을 초래할 수 있다. EH한, 최근에는 화학요법을 보조하기 위하여 동물모델과 암환자에게 면역화학요법이 시도되고 있는데, 숙주의 생물학적 반응을 조절할 수 있는 싸이토카인과 세균산물들과 같은 다양한 생물학적 반응조절제(biological response modifiers, BRM)들이 암환자의 면역화학 요법에 이용되고 있다. 그러나 현재 암환자의 면역요법에 이용되고 있는 유전자재조합 싸이토카인(IL-2, IL-12 및 IFN(interferon)-γ)의 경우 독성이 심하고 생체 내 반감기가 짧아 이용에 한계가 있으며 암환자에 대한 화학요법 및 방사선 요법시 조혈세포사멸로 인한 부작용을 극복하기 위하여 유전자재조합 집락자극인자(colony stimulating factor) 또한 과립구 및 단핵세포만 편파적으로 증식시키는 단점이 있다.
따라서 이러한 부작용을 극복하기 위하여 천연물로부터 면역증진을 통한 항암제의 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.
이에 본 발명에서는 천연물로서 갈근에 대한 연구를 진행하였는데, 갈근(Pueraria lobata)은 콩과(Leguminosae)의 덩굴나무인 칡(Pueraria lobata Ohwi.)의 뿌리로 다년생, 덩굴, 낙엽 식물로 우리나라 전역에 분포하여 자생하고 있다. 갈근의 주요 성분은 푸에라린(puerarin), 다이드제인(daizein), 다이드진(daidzin) 등의 플라보노이드 (flavonoid)계 화합물과 소야사포닌(soyasaponin) 등의 사포닌(saponin) 및 전분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 갈근은 예로부터, 갈포라고 하여 벽지로 사용되었으며, 현재는 갈근의 뿌리를 이용하여 주로 소화불량, 두통, 빈형, 이질, 복통, 술독, 감기 및 구토 등에 대한 약재로 이용하고 있다. 하지만 갈근은 다른 식물에 비해 생장이 매우 왕성한 식물로, 칡은 관목이 나 수목의 지상부까지 감고 자라는 특성으로 인해 빛을 차단하므로 다른 식물의 생장에 많은 피해를 주어, 현재는 수목의 생장을 억제하는 야초로 방제가 매우 어려운 잡초로 인식되고 있으며, 왕성한 생장으로 인하여 칡의 생장 면적이 매년 확대되어 이를 방제하기 위한 비용이 증가되고 있는 실정이기 때문에 갈근의 새로운 활용에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이러한 시점에서 본 발명은 갈근 유래의 다당류가 면역 증강 활성이 우수하여 면역증강 및 항암제를 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 10-2010-0090860
따라서, 본 발명의 목적은 갈근 (Pueraria lobata)으로부터 분리된 다당류(PLP)를 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강 및 암의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은, 갈근을 건조 및 분쇄시키는 단계; 갈근 분쇄물에 증류수를 첨가하여 1~2시간 동안 90~100℃에서 열수 추출하는 단계; 열수 추출물을 감압 농축한 후, 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물로부터 다당류를 수득하는 단계를 포함하는, 면역활성 증강 및 항암 활성을 갖는 갈근 추출물 유래 다당류를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 갈근 (Pueraria lobata)으로부터 분리된 다당류(PLP)를 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 미성숙 수지상세포를 활성화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 건조된 갈근을 열수추출한 후, 에탄올을 이용하여 에탄올 추출물을 수득하고, 에탄올 추출물로부터 분리 및 정제된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 조성물에 1~100ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 미성숙 수지상세포를 활성화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 건조된 갈근을 열수추출한 후, 에탄올을 이용하여 수득한 추출물로부터 분리 및 정제한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 조성물에 1~100ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강 및 암의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
나아가 본 발명은, 갈근을 건조 및 분쇄시키는 단계; 갈근 분쇄물에 증류수를 첨가하여 1~2시간 동안 90~100℃에서 열수 추출하는 단계; 열수 추출물을 감압 농축한 후, 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물로부터 다당류를 수득하는 단계를 포함하는, 면역활성 증강 및 항암 활성을 갖는 갈근 추출물 유래 다당류를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 갈근으로부터 분리된 다당류는 수지상세포 활성을 증가시켜 면역활성 증가 효과가 우수하여 면역증강용 및 항암용 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있고, 천연물 유래 조성물로서 기존 면역증강제의 부작용을 최소화하여 체내 안전한 특징이 있어 기능성 건강식품의 소재로도 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 PLP의 세포형 선택성의 그래프로서, (A)는 미성숙 수지상 세포를 PLP로 24시간 처리하고 MHC-∥발현 수준을 측정한 것이다. (B)는 RAW 264.7 대식세포를 24시간 동안 PLP로 처리하고 NO생성을 측정한 것이다. (C)는 비장세포를 PLP로 72시간 동안 처리하고 림프구 증식을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 PLP에 의한 수지상 세포의 표현형 성숙그래프로서, 미성숙 수지상 세포를 LPS(1㎍/ml) 또는 PLP로 처리했을 때의 결과로, 수지상 세포를 (A) CD40, (B) CD86, (C) MHC-｜에 PE-접합 CD11c AB 및 FITC-접합 Abs로 염색한 결과이다.
도 3은 수지상세포 엔도사이토시스에 미치는 PLP의 영향에 대한 결과를 보여주는 것으로서, (A) 미성숙 수지상세포를 PLS 또는 PLP로 24시간 동안 추가적으로 활성화 시킨 결과, (B) 미성숙 수지상 세포에 0.4㎎/ml의 농도로 FITC-dextran을 1시간 처리하였을 때의 결과이다.
도 4는 수지상 세포의 사이토카인 유전자 발현에 대한 PLP의 효과를 나타낸 것으로, (A) 미성숙 수지상 게포를 PLS 또는 PLP로 4시간 활성화한 다음 RT-PCR을 실시하여 IL-12, IL-1β, TNF-α, IFN-α/β 및 β-actin의 유전자 발현 수준을 조사한 것이고, (B)는 유의성 검증을 보여준 결과이다.
도 5는 PLP로 처리한 수지상 세포를 이용한 T세포의 Allo-자극을 나타낸 것으로, (A) 수지상세포와 T세포의 배양에 대해 PLP 처리에 대한 효과를 측정한 것이고, (B)는 IL-2의 유전자 발현 수준을 측정한 결과이며, (C)는 IFN-γ의 유전자 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 6은 PLP의 TLR4에 대한 막 수용체를 확인하는 결과를 보여주며, (A) CD86에 대한 항체, (B) TNF-α에 대한 항체로 염색하였으며, (C) 수지상세포들을 덱스트란-FITC으로 처리한 결과를 나타낸 결과이다.
도 7은 신호전달에 대한 PLP의 효과 시그널에 대한 결과로, (A) MAPK 신호전달에 대한 PLP의 효과 시그널, (B) NF-κB 신호 전달에 대한 PLP의 효과 시그널에 대한 결과이다.
본 발명은 면역활성 증강 활성이 우수하고 세포 내 독성을 유발하지 않는 새로운 면역활성 증강용 및 항암용 치료제를 천연물로부터 발굴하고자 연구하던 중, 갈근으로부터 분리된 다당류(Pueraria lobata Polysaccharide, PLP)가 우수한 면역활성 증강 효과가 있다는 사실을 확인함으로써, 갈근 유래 다당류의 약리학적 특징을 제공함에 그 특징이 있다.
구체적으로 본 발명에서 제공하는 면역활성 증강 효과 및 항암 효과를 가지는 유효성분은 갈근 추출물로부터 분리된 다당류(Pueraria lobata Polysaccharide, PLP)이다.
이러한 본 발명에 따른 상기 다당류가 갖는 생리활성은 하기 기술된 본 발명의 일실시예를 통해 확인할 수 있었는데, 특히 본 발명의 다당류는 수지상세포 및 대식세포의 활성을 증가시킬 수 있는 효과를 가지며, 미성숙 수지상세포의 성숙에 관여하는 사이토카인의 생성도 증가시켜 수지상세포의 활성을 촉진시킬 수 있다는 것을 알 수 있었고, TLR4 하위 신호전달인 MAPKs와 NF-κB 신호전달 기작을 통해 면역세포 활성을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었으며, 특히 이러한 효과는 갈근 추출물 보다 갈근 추출물 유래 다당류가 더 우수하다는 것을 알 수 있었다.
그러므로 이러한 사실을 통해 본 발명은 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 다당류는 조성물에 1~100ug/ml의 농도로 함유되어 있을 수 있으며, 상기 본 발명에서 제공하는 조성물이 갖는 면역활성 증강은 대식세포 뿐만 아니라 미성숙 수지상세포 활성을 통한 면역증강 활성 및 항암 활성을 갖는 특징이 있다.
일반적으로 대식세포는 면역반응에 관계하는 주 세포로서 면역세포의 작용을 조절하는 사이토카인을 분비하여 면역반응 조절, 자연면역에서 미생물, 항원, 죽은 조직 등을 식균 작용으로 파괴, 체액성 면역 반응에서 작용세포(effecor cell)로서의 활동, 지연성 과민 반응(delayed type hypersensivity)에서 항원 제거, TNF-α 분비를 통한 종양세포의 파괴, 획득면역반응에서 항원의 조작과 제시(antigen processing and presentation), 염증반응에 관여하는 물질이나 사이토카인을 분비하여 염증반응을 조절, 섬유아세포와 혈관내피세포의 성장인자를 생산하여 손상된 조직의 치유 등 다양한 기능을 한다.
따라서 이러한 대식세포의 활성촉진은 면역작용을 상실로 인해 유발되는 질환을 치료하는 역할을 한다.
본 발명에서 제공하는 갈근 추출물 유래의 다당류는 대식세포 이외에도 특히 수지상 세포의 활성 촉진시킬 수 있는 효과를 가지는데, 수지상 세포는 앞서 종래기술에서도 설명한 바와 같이, 가장 강력한 항원제시 세포로서 1차적인 세포성 면역반응을 유발할 수 있는 유일한 세포이며, 골수에서 기원해서 미성숙한 형태로 혈류를 거쳐 체내 모든 기관으로 이동해 간다. 수지상세포는 각 조직에서 주변의 항원을 채집하여 림프기관에 가서 T 림프구에 항원을 제시하며, 미성숙한 수지상세포는 CD(cluster determinant)40, CD54, CD86 등의 부신호(accessory signals) 전달에 필요한 CD가 표현되지 않아서 T세포를 활성화시키지는 못하지만 면역반응을 유발하기 위해 꼭 필요한 항원을 포획하기 위하여 이들 미분화 수지상세포는 탐식작용을 할 수 있고, 마이크로피노싸이토시스(macropinocytosis)를 할 수 있으며, C형 렉틴(lectin) 수용체와 유사한 대식세포 만노스(macrophage mannose) 수용체, DEC-205(CD205) 및 Fcγ과 Fcε수용체 등의 흡착성 엔도시토시스(adsorptive endocytosis)를 매개하는 수용체들이 세포막에 잘 발현되어 있다. 따라서 다른 항원제시 세포들이 마이크로몰 농도의 항원에 반응하는데 비하여 이들 미분화 수지상세포들은 나노몰농도(nanomolarity) 또는 피코몰농도(picomolarity) 농도의 항원에 대하여 반응할 수 있다.
또한 수지상 세포는 성숙해감에 따라 면역반응이 유발되는데 이러한 성숙과정은 여러 요소에 의해서 조절된다. 특히 세균이나 염증반응 산물, 세균의 세포벽 성분인 다당류, IL-1, GM-CSF(granulocyte /macrophage-colony stimulating factor), TNF(tumor necrosis factor)-α 등은 모두 수지상세포의 성숙을 촉진한다. 성숙한 수지상세포는 고농도의 NF-κB((nuclear transcription factor)-κB) 군의 전사인자(Rel A/p65, Rel B, Rel C, p50, p52)를 표현하는데 이들 전사인자는 다양한 면역반응과 염증반응에 관여하는 단백질의 유전자가 표현되는 것을 조절한다. TNF-R(CD120a/b), CD40, TRANCE/RANK(TNF-related activation induced-cytokine/receptor activator of NF-kB) 등의 TNF-수용체 군(family)을 통한 신호전달은 NF-κB를 활성화시키고 수지상세포를 자극하여 면역반응을 유도하게 되므로 병원체나 항원은 TNF-R 군이나 TNF-R-associated factors(TRAFs)의 신호전달경로에 관여하게 된다. 그러므로 백혈병 세포를 수지상 세포로 유도, 분화시키는 경우, 수지상세포의 특성상 종래에 자신이 가지고 있던 백혈병과 관련된 항원을 대량 세포 표면에 발현시켜서 T세포에게 항원을 제시함으로서 대개 한 개의 수지상세포가 100~3,000개의 T세포를 활성화시킨다. 이들 각각의 T세포가 자가증식촉진(autocrine growth stimulation)형태로 분지계 팽창 (clonal expansion)이 유발되는 경우, 매우 치료 효과가 강력한 항 백혈병성 T 세포의 반응(antileukemic T-cell responses)을 유도할 수 있을 것이며 실제 만성 골수구성 백혈병(CML)과 급성 골수구성 백혈병(AML) 환자의 말초혈 백혈병성 세포로부터 GM-CSF, IL-4, TNF-α를 사용하여 유도된 수지상세포가 항 백혈병성 T세포의 증식(antileukemic T-cell proliferation)을 촉진하고 이들 T세포의 세포독성을 강화시킨다는 보고도 있다.
뿐만 아니라 현재 대부분의 연구는 수지상세포가 T세포를 활성화시키는데 초점이 맞추어져 있으나 수지상세포는 외부 항원에 대해 면역반응을 유발할 뿐만 아니라 T세포가 자가 항원을 관용하는 것과 유사하게 T세포의 면역관용(immune tolerance)을 초래하기도 한다. 많은 종양환자에게서 종양 항원에 특이적인 T세포 반응이 좀처럼 유발되지 않는데 이것은 아마도 종양 세포에 대해서 수지상세포가 반응하지 못하기 때문일 것이다. 대장암이나 기저세포피부암에 침윤되어 있는 수지상세포는 CD80과 CD86을 표현하지 못해서 T세포에 대한 자극활성이 감소된다.
따라서 수지상세포의 성숙과 수지상세포의 세포 표면인자의 활성화는 강력한 항종양효과를 비롯한 면역증진에 절대적으로 필요한 요소라고 할 수 있다.
그러므로 이러한 점을 고려할 때, 본 발명에서 제공하는 갈근 추출물 유래의 다당류는 미성숙 수지상세포의 성숙과 증식 및 활성을 촉진시키는 효과가 우수하므로 면역증강이 필요한 질환 및 암 질환에 대한 치료 용도로 매우 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 조성물에 함유된 다당류는 갈근 추출물, 바람직하게는 갈근의 에탄올 추출물로부터 분리 및 정제할 수 있는데, 상기 갈근으로부터 분리된 다당류는 종래 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎 등 식물로부터 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 식물을 적절히 탈수하여 침연(macerated)하거나 단지 탈수하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 다당류는, 건조된 갈근을 분쇄하는 단계; 갈근 분쇄물에 증류수를 첨가하여 1~2시간 동안 90~100℃에서 열수 추출하는 단계; 열수 추출물을 감압 농축한 후, 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 에탄올 추출물로부터 다당류를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 제공하는 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 갈근으로부터 분리된 다당류를 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역활성 증강 및 암 증상의 개선과 치료에 충분한 양을 말하며, 상기 조성물에 대해 갈근으로부터 분리된 다당류는 0.0001 내지 100㎎/㎏ 체중범위의 농도로 함유될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 갈근으로부터 분리된 다당류의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100㎎/day/체중㎏, 바람직하게는 0.5 ~ 10㎎/day/체중㎏ 이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역 활성 증강 또는 항암 치료 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역활성 증강 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 갈근으로부터 분리된 다당류를 함유하는 조성물을 포함하는 면역활성 증강용 및 항암용 치료제를 제공할 수 있으며, 상기“암”은 이에 제한되지는 않으나, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 (Central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등을 포함할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 갈근으로부터 분리된 다당류는 천연물인 갈근으로부터 유리된 다당류로서 세포에 대한 독성을 유발하지 않고 부작용을 일으키지 않아 안전성이 있어 체내에 안심하고 사용할 수 있으므로 면역활성 증강용 및 암 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 갈근으로부터 분리된 다당류(PLP)는 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강 개선을 위한 식품 조성물은 면역활성 증강 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 면역활성 증강용 및 암 예방 및 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 면역활성 증강 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 면역활성 증강용 및 암 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 면역활성 증강용 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100㎖를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
갈근으로부터 폴리사카라이드(PLP)의 분리
본 발명자들은 갈근으로부터 면역증강용 다당류를 분리하기 위해 갈근을 자연 건조시킨 후 잘게 썰어서 100℃의 온도에서 1시간동안 열수 추출을 한 후, 추출물을 감압 농축하였다. 얻어지는 추출액에 3배의 에탄올을 이용하여 4℃에서 24시간동안 침전시키고 침전물을 원심분리하여 회수하고 에탄올로 2회 세척하였다. 그 후, 상기의 침전물을 물에 부유시키고 동결건조하여 갈근 (Pueraria lobata)의 다당류를 분리하였고, 이를 PLP라 명명하였다.
< 실험예 1>
갈근유래 다당류인 PLP 의 세포 선택성 측정
본 발명의 갈근유래 다당류인 PLP의 세포 선택성을 측정하기 위해, 수지상세포, 대식세포 및 비장세포와 같은 면역세포에 대한 PLP의 면역증강 활성을 조사하였다.
<1-1> 갈근유래 다당류인 PLP 의 골수유래 수지상 세포( DCs )의 생성
상기의 실시예 1을 통해 제조된 갈근유래 다당류인 PLP의 골수유래 수지상 세포(DCs)의 MHC-Ⅱ을 측정하기 위해, 6~7 주령의 암컷 마우스로부터 얻은 골수로부터 수지상 세포를 생성했다. 마우스의 수지상세포를 얻기 위해, 대퇴골 및 경골로부터 BM 세포를 추출하여 적혈구를 용해시킨 후, 전체 BM 세포(2 x 105 개 세포/ml)를 2ng/ml GM-CSF를 함유하는 10 ml/dish의 완전배지를 포함하는 100-mm2 배양 접시에서 배양하였다. 3일째에, 2 ng/ml GMCSF 를 함유하는 또 다른 10 ml의 새로운 완전배지를 첨가하고, 6일째에 상기 배지의 절반을 변화시켰다. 8일째에 비부착성 및 느슨한 부착성의 수지상 세포를 강한 피펫팅을 통해 회수하여 미성숙 수지상 세포(iDCs)로 이용했다. 상기 배지로부터 회시한 iDCs는 대부분 >85% CD11c+ 이었으나, CD3+ 및 B220+는 아니었다.
상기의 갈근유래 다당류인 PLP의 골수유래 수지상 세포의 MHC-Ⅱ의 발현도를 측정한 결과를 도 1의 (A)에 나타내었으며, 그 결과 미처리 군(UN)에 비해 PLP의 농도를 순차적으로 증가 시켰을 경우 MHC-Ⅱ의 발현이 점점 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
<1-2> 갈근유래 다당류인 PLP 의 NO 생성량 측정
상기의 실시예 1을 통해 제조된 갈근유래 다당류인 PLP의 NO생성량을 측정하기 위해, RAW264.7 대식세포를 96웰 플레이트에 5 x 105 개 세포/ml의 밀도로 도말한 다음, PLP 또는 PLS를 이용하여 24시간 자극하였다. 분리한 상청액을 동일 체적의 Griess 시약과 합친 다음, 실온에서 10분간 정치하였다. 그 후, NaNO2 유래 표준 곡선에 대한 540nm에서의 흡광도를 측정하여 NO 생성량을 측정하였다.
상기의 갈근유래 다당류인 PLP의 NO 생성량을 측정한 결과를 도 1의 (B)에 나타내었으며, 그 결과 미처리 군(UN)에서는 NO가 생성되지 않았으며, PLP의 경우 10 up/ml의 농도에서는 비교적 적은양의 NO가 생성이 되었지만 30 up/ml의 농도부터 LPS를 첨가하였을 만큼의 NO가 생성 되는 것을 확인하였다.
<1-3> 갈근유래 다당류인 PLP 의 림프구 증식의 분석
상기의 실시예 1을 통해 제조된 갈근유래 다당류인 PLP의 림프구 증식의 분석을 위해, 특정 병원균이 없는 C57BL/6 마우스 (암컷, 6~7 주령)로부터 비장 세포를 얻고, 이를 용해 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거 한 후, RPMI 1640 배지에서 배양을 하였다. 배양된 세포를 96웰 플레이트에 2 x 105 개 세포/ml의 밀도로 접종하고, PLP 또는 LPS를 이용하여 자극하였다. 그 후, 18시간 동안 1uCi/웰의 농도로 3H-티미딘 (113 Ci/nmol, NEN, Boston, MA, USA)을 이용하여 펄스 시키고, 자동세포 수집기(Inotech, Dottikon, Switzerland)를 이용하여 3일단 수집했다. 상기 세포에 포함된 3H-티미딘의 양을 섬광 계수기(Wallac, Turku, Finland)이용하여 측정 하였다.
상기의 갈근유래 다당류인 PLP의 림프구 증식의 정도를 측정한 결과를 도 1의 (C)에 나타내었으며, 그 결과 미처리 군(UN)과 같이 증식이 거의 되지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 상기의 <1-1, 1-2, 1-3>의 결과 갈근유래 다당류인 PLP는 수지상세포나 대식세포에서는 뛰어난 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 2>
갈근유래 다당류인 PLP 의 표현형 분석
본 발명의 갈근유래 다당류인 PLP의 수지상 세포의 표현형 성숙을 유세포 분석을 통해 분석했다. 세포를 FITC-접합 항-CD40, 항-CD86 및 항-HMC와 PE-접합 CD11c 항체의 결합물로 염색했다. FACSCalibur 유세포 분석기를 이용하여 세포를 분석 하였고, 그 데이터를 CellQuest Pro(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 전방 및 측면 산란 파라미터를 이용하여 살아있는 세포를 측정하였다.
상기의 수지상 세포의 표현형 분석의 결과를 도 2에 나타내었으며, 그 결과 갈근유래 다당류인 PLP는 (A) CD40, (B) CD86 및 (C) MHC-Ⅱ 의 발현을 투여량 의존적으로 증가 시키는 것으로 나타났다.
또한, PLP 또는 LPS로 처리한 수지상 세포는 긴 수지상 돌기 (dendrite)를 갖는 성숙 형태를 나타냈으나, 처리하지 않은 수지상 세포는 짧은 수지상 돌기를 가졌다 (데이타 미도시). 특히, 성숙 수지상 세포는 크기 및 입도가 증가하였고 PLP와 PLS는 배양동안 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.
따라서, PLP가 수지상 세포의 표현형 성숙을 유도하는 것을 증명할 수 있다.
< 실험예 3>
갈근유래 다당류인 PLP 의 세포내 이입의 분석
본 발명의 갈근유래 다당류인 PLP의 수지상 세포의 세포나 이입(Endocytosis)을 분석하시 위하여, 5 x 105 개 세포 수지상 세포를 0.4 mg/ml FITC-덱스트린 (42,000 Da, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 세포를 0.5% BSA가 함유된 차가운 PBS 완충용액으로 2회 세척하고 PE-접합 항-CD11c 항체를 이용하여 염색했다. 이 중 염색된 수지상세포를 유세포 분석기로 분석하였다.
상기의 결과를 도 3에 나타내었으며, 수지상 세포내 이입에 대한 PLP의 효과를 측정하기 위해, 수지상 세포를 덱스트란-FITC로 처리하고, PLP을 첨가한 수지상세포에서의 항원 흡수가 PLP 투여량에 대해 의존적으로 감소되는 경향을 보였으며, LPS로 처리 하였을 경우와 비슷한 결과를 얻었음을 확인하였다.
또한, 수지상 세포에 대한 텍스트란-FITC의 비특이적 결합을 배제하기 위하여 저온에서 실험을 수행한 결과, 수지상 세포에 의한 항원 흡수는 저온에서 억제되었으며, 이러한 결과는 수지상세포 내 이입이 특이적이고 활성인 과정이라는 결과를 나타내었다.
< 실험예 4>
갈근유래 다당류인 PLP 의 사이토카인 측정
전체 RNA는 TRIZOLTM 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)을 이용하여 분리하였다. RT-PCR을 사용하기 위해, 2ug의 전체 RNA부터 단일가닥 cDNA를 합성했다. 각각 사용된 프라이머는 다음과 같다. IL-12, 센스, 5`-AGA GGT GGA CTG GAC TCC CGA-3`, 안티센스, 5`-TTT GGT GCT TCA CAC TTC AG-3`, IL-1β, 센스, 5`-ATG GCA ATG TTC CTG AAC TCA ACT-3`, 안티센스, 5'-CAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT TT-3', TNF-α, 센스, 5`-AGG TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG-3`, 안티센스, 5`-AGA GAA CCT GGG AGT CAA GGT A-3`, 인터페론 (IFN)-β, 센스, 5`-CCA CAG CCC TCT CCA TCA ACT ATA AGC-3`, 안티센스, 5`-AGC TCT TCA ACT GGA GAG CAG TTG AGG-3`, β-actin, 센스, 5`-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3` 및 안티센스, 5`-TAA AAC GCA GCT CAG TAACAG TCC G-3`.
PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분획하고 5ug/ml 브롬산 에티듐을 이용하여 염색했다. 배양 상층액 내에 있는 IL-12, IL-1β, TNF-α, IL-2 및 TNF-γ의 사이토카인 수준을 측정하였다.
<4-1> 갈근유래 다당류인 PLP 에 의한 수지상세포의 기능적 성숙화
상기의 결과를 도4에 나타내었으며, 그 결과 PLP는 수지상세포에 의한 IL-12 유전자 발현을 크게 증가시켰다. IL-12는 Th1 면역 반응의 유도에 있어서 아주 중요한 인자이다. 또한, PLP는 수지상세포에 대한 IL-1β, TNF-α 및 IFN-β와 같은 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 크게 증가 시켰다. 따라서, 이러한 결과를 통해 PLP가 수지상 세포의 기능적 성숙화를 유도한다는 것을 입증할 수 있었다.
<4-2> 갈근유래 다당류인 PLP 처리된 수지상세포에 의한 동종 T 세포 활성화
PLP에 의한 수지상세포의 표현형적 및 기능적 성숙화는 PLP 처리된 수지상세포가 동종 T 세포 반응 동안 촉진 세포로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, C57BL/6 마우스 유래의 수지상 세포(H-2b) 및 BALB/c 마우스 유래의 T 세포를 용하여 혼합 백혈구 반응을 유도하였다.
상기의 결과를 도 5에 나타내었으며, PLP로 처리한 수지상세포는 동종이형의 T 세포 증직을 강력하게 강화하였으나, 미성숙 수지상세포는 상기의 반응에 약하게 반응하였고, T 세포 또는 MMC로 처리한 수지상 세포는 단독으로 증식 할 수 없었다. 또한, PLP를 처리하지 않은 수지상세포는 T 세포가 활성화되지 않고 싸이토카인도 생성되지 않은 반면, PLP를 처리한 수지상세포는 T 세포가 활성화되어 싸이토카인 IL-2 및 IFN-γ가 생성된 것을 확인 하였다.
< 실험예 5>
갈근유래 다당류인 PLP 의 막수용체 식별
본 발명의 갈근유래 다당류인 PLP는 그 크그가 커서 수지상세포를 투과할 수 없기 때문에, 수지상세포 성숙화는 PLP의 막수용체로의 결합에 의해 발생할 것으로 예상된다. 따라서, PLP는 TLR4를 통해 수지상세포를 활성화 시킬 것으로 예상하여, 정상 TLR4을 가진 C3H/HeN와, 변이 TLR4를 가진 C3H/HeJ의 2개의 마우스로부터 미성숙 수지상세포를 생성시켜 실험을 진행 하였다.
상기의 실험결과를 도 6에 나타내었으며, 그 결과 PLP는 C3H/HeN 마우스로부터 생성된 수지상세포에서 CD86 및 TNF-α의 발현을 증가 시켰으나, C3H/HeJ 마우스로부터 생성된 수지상세포에서는 이러한 효과를 보여주지 못하였다.
또한, PLP의 수지상세포에서의 엔도사이토시스에 미치는 영향에 대해 평가한 결과, C3H/HeN 마우스로부터 얻은 수지상세포의 엔도사이토시스는 감소시켰으나, TLR4 변이된 C3H/HeJ 마우스로부터 얻은 수지상세포에서는 효과를 나타내지 못하였다. 하지만, TLR3 리간드인 (I:C)의 경우 TLR4 변이된 수지상세포에서 사이토카인 유전자의 발현을 유도하였다.
< 실험예 6>
수지상세포의 신호전달에 대한 갈근유래 다당류인 PLP 의 영향
수지상세포의 성숙에 있어서 NF-κB 및 MAPK의 신호전달 경로는 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 PLP로 처리한 수지상세포에서 NF-κB 및 MAPK의 활성화를 조사하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었으며, 미성숙 수지상세포에서 인산화 ERK, JNK 및 p38 MAPKs의 수준은 낮은 반면에 MAPKs의 인산화는 LPS 또는 PLP에 노출시 수지상세포에서의 기저 수준과 비교하여 매우 감소하였으므로, MAPK 경로가 PLP를 이용하여 수지상세포를 성숙시키는데 관여하는 것을 알 수 있었다.
따라서, 이러한 상기의 결과들을 통해 PLP가 MAPK와 NF-κB 신호전달을 통해 수지상세포의 성숙을 유도했다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예 및 실험예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 갈근 (Pueraria lobata)으로부터 분리된 다당류(PLP)를 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 미성숙 수지상세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역활성 증강용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다당류는 건조된 갈근을 열수추출한 후, 에탄올을 이용하여 에탄올 추출물을 수득하고, 에탄올 추출물로부터 분리 및 정제한 것을 특징으로 하는 면역활성 증강용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 다당류는 조성물에 1~100ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 면역활성 증강용 약학적 조성물.
  5. 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 다당류는 미성숙 수지상세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 다당류는 건조된 갈근을 열수추출한 후, 에탄올을 이용하여 수득한 추출물로부터 분리 및 정제한 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 다당류는 조성물에 1~100ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  9. 갈근 추출물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강 및 암의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
  10. 갈근을 건조 및 분쇄시키는 단계;
    갈근 분쇄물에 증류수를 첨가하여 1~2시간 동안 90~100℃에서 열수 추출하는 단계;
    열수 추출물을 감압 농축한 후, 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및
    상기 에탄올 추출물로부터 다당류를 수득하는 단계를 포함하는, 면역활성 증강 및 항암 활성을 갖는 갈근 추출물 유래 다당류를 제조하는 방법.
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