KR20140084154A

KR20140084154A - 예비 칼럼 크로마토그래피 시스템

Info

Publication number: KR20140084154A
Application number: KR1020147012489A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 블라쉬크; 다르코 드베카르; 크리슈티안 슈말츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2014-07-04
Also published as: WO2013068349A1; EP2776825A1; MX2014005119A; BR112014008339A2; HK1200219A1; CN103946705A; CA2850581A1; RU2610386C2; US11204339B2; US20140305195A1; JP2015504511A; CN103946705B; RU2014121794A; JP6158819B2; US20220170893A1

Abstract

크로마토그래피 시스템으로서, 혼합 회로 또는 혼합실, 기포 트랩, 농도 검출기 및 하나 이상의 펌프를 포함하고, 상기 기포 트랩은 최고점에서 영구 개방도를 갖는 크로마토그래피 시스템이 기재된다. 또한, 혼합 회로 또는 혼합실에 제 1 농도 검출기가 위치되고, 주펌프의 하류에 제 2 농도 검출기가 위치되는 2개의 농도 검출기를 포함하는 크로마토그래피 시스템이 기재된다.

Description

예비 칼럼 크로마토그래피 시스템{PREPARATIVE COLUMN CHROMATOGRAPHY SYSTEM}

본 발명은 예비 칼럼 크로마토그래피 시스템에 관한 것이다. 이 시스템의 한 가지 요소는 크로마토그래피 칼럼의 상류 한 곳과 하류 한 곳에 설치된 두 가지의 NIR 검출기를 사용하는 것인데, 용리 구배를 설정 및 관찰하고, 사용되는 HPLC 의 품질을 계속 확인할 수 있다. 또 다른 요소는 다양하게 폐쇄 가능한 기포 트랩이 장착된 새롭게 고안된 혼합 회로로서, 이러한 기포 트랩은 시스템의 혼합 회로와 분리되어, 체적 유동을 분리할 수 있다.

현재 기존의 예비 HPLC 시스템은 특정 크기로 개별적으로 설치되며, 그 이유는 시스템 내에서의 구배 형성이 다른 크기로 정확하게 전달되지 않기 때문이다. 또한, 분석이나 준예비 시스템으로 공정 조건을 전달하는 것이 거의 불가능하다. 이는 다른 구성의 시스템으로 구배를 전달하는 것에도 동일하게 적용된다.

크로마토그래피에 사용되는 용리제의 관련성이 높은 질소와 기체의 함유량은 구배가 형성되는 동안 용리제에 용해된 기체의 유리를 유발하고, 이는 한편으로, 크로마토그래피 칼럼 상류의 NIR측정, 그리고 동시에 구배의 형성과 그 복원에도 역효과를 준다. 반면에 HPLC의 칼럼, 특히 칼럼의 패킹(packing) 역시 이러한 사항에 영향을 받고, 그 이유는 칼럼 패킹 내부의 가스가 유리되기 때문이며, 이는 크랙을 발생시키거나 칼럼 패킹 내에서의 불균일을 야기할 수도 있다. 종래의 HPLC시스템에 장착되어 있는 기포 트랩은, 전체 혼합 회로와 마찬가지로, 압력하에 있기 때문에 탈기 기능을 완전하게 충족시키지 못한다.

US 2011/073548호에서 분리 시스템과 방법을 기재하고 있다. 액체 크로마토그래피에서 용리제의 대폭(band width)을 최소화하는 것은 EP 0 444 441호에 기재되어 있다. US 4,116,046호에는 액체 크로마토그래피 시스템이 기재되어 있다. EP 2 113 770호에는 액체 조제물에 있어서의 에탄올 분율을 줄이기 위한 장치와 방법이 기재되어 있다.

일반적으로, 예비 HPLC 시스템의 구배는 펌프의 정해진 유출량에 의해 조절되지만, 실질적인 구배는 고려되지 않는다. 또한, 부피 축소 효과도 고려되지 않는다.

이 경우에 있어서, 크로마토그래피 칼럼의 하류나 직접 칼럼의 상류에 선택적으로 장착할 수 있는 추가된 다기능 NIR 측정과 탈기 기능을 갖는 변형된 구배 혼합 회로를 갖는 새로운 다양한 크기의 HPLC 시스템에 대하여 설명하고, 특허청구범위로서 청구하고자 한다.

본 발명에 있어서, 크로마토그래피는 혼합 회로 또는 혼합실, 기포 트랩, 농도 검출기, 그리고 하나 이상의 펌프를 포함하며, 상기 기포 트랩은 최고점에서 영구 개구를 가지며, 개구의 개방 정도가 조절되는 것을 일 실시 형태로 하여 설명될 것이다.

액체에서 유출되는 가스와 과량의 액체는 미리 정한, 조정가능한 체적 유동에서 상기 영구 개구를 통해 기포 트랩으로부터 언제든지 제거될 수 있다. 또한, 상기 영구 개구를 통해, 액체의 탈기를 향상시킬 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 기포 트랩은 혼합 회로 또는 혼합실의 외부 또는 하류에 위치한다. 일 실시 형태에 있어서, 기포 트랩로의 유입은 조절될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 이는 밸브로 조절된다.

기포 트랩으로의 유입을 조절함으로써, 혼합 회로에서 나와 크로마토그래피 칼럼으로 흐르는 액체 또는 최고점에서 상기 기포 트랩을 지나 시스템으로부터 제거되는 액체의 양을 조정할 수 있다. 이는 크로마토그래피 칼럼에 예정된 구배 형성의 조절을 향상시키거나 용이하게 할 수 있다. 필요한 관류 체적은 시스템의 주 펌프 하류의 제 2 농도 검출기와 함께 조절될 수 있으며, 이를 통해 기포 트랩에 의해 분리되는 용적량을 최소화하거나 없게 할 수도 있다. 이는 실제 구배와 목표 구배를 비교하고, 기포 트랩에 대한 밸브의 개구와 최고점에서의 밸브를 조절하여 달성될 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 기포 트랩은 혼합 회로 또는 혼합실 내에 위치한다.

일 실시 형태에 있어서, 체적 유량은 상기 영구 개구를 통해 조절될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 상기 조절은 밸브를 통해 이루어진다.

기포 트랩에서의 과유량을 제어함으로써, 한편으로는 탈기의 질을 조절할 수 있다. 다른 한 편으로는, 이를 통해, 배출된 액체 부피의 양을 조절할 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 제 1 체적 유동 측정 장치는 상기 기포 트랩 영구 개구의 하류에 위치되고, 제 2 체적 유동 측정 장치는 칼럼의 하류에 위치된다.

일 실시 형태에 있어서, 상기 크로마토그래피 시스템은 주펌프의 하류에 제 2 농도 검출기를 포함한다.

또한, 여기에 기재된 다른 양태는 크로마토그래피 시스템으로서, 2 개의 농도 검출기를 포함하고, 혼합 회로 또는 혼합실에 제 1 농도 검출기가 위치되고, 주펌프의 하류에 제 2 농도 검출기가 위치되는 것을 특징으로 한다.

두 개의 농도 검출기를 배치, 즉, 하나는 혼합 회로 또는 혼합실에, 다른 하나는 주펌프의 하류에 배치하여, 제 1 농도 검출기의 값과 제 2 농도 검출기의 값을 비교하여 크로마토그래피 시스템의 효율을 체크할 수 있다. 두 개의 신호 사이에 어긋남이 있는 경우에는(제 1 농도 검출기를 통과하는 시간 주기와 제 2 농도 검출기를 통과하는 시간 주기의 시간 수정 이후), 시스템의 효율에 손실이 있는 것으로 결론내릴 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 크로마토그래피 칼럼은 주펌프와 제 2 농도 검출기 사이에 위치된다.

추가적인 양태에 있어서, 이하에서 설명될 크로마토그래피 시스템을 전체 크로마토그래피 시스템의 효율을 체크하는데 이용할 수 있다.

또한, 이하에서 설명될 크로마토그래피 시스템을 크로마토그래피 칼럼의 완전성을 체크하는데 이용할 수 있다.

두 개의 농도 검출기 배치, 즉, 혼합 회로 또는 혼합실에 하나, 다른 하나는 크로마토그래피 칼럼의 하류에 설치하여, 제 1 농도 검출기의 값과 제 2 농도 검출기의 값을 비교하여 크로마토그래피 시스템의 완전성을 체크할 수 있다. 이하에서 기재된 바와 같이, 크로마토그래피 시스템의 효율성을 체크할 수 있도록 배치함으로써, 두 개의 검출기 신호 사이의 차이는 시스템과 관련되거나 칼럼과 관련된 문제로 인한 것으로 판단될 수 있다. 두 개의 신호 사이에 어긋남이 있는 경우(제 1 농도 검출기를 통과하는 시간 주기와 제 2 농도 검출기를 통과하는 시간 주기의 시간 수정 이후), 시스템의 완전성에 손실이 있는 것으로 결론내릴 수 있다.

이하에서 기재된 다른 양태는 제 1 농도 검출기의 신호와 제 2 농도 검출기의 신호의 비율을 이용하여, 크로마토그래피 시스템을 제어할 수 있다.

만일, 두 개의 농도 검출기에서 확인된 신호가 서로 다른 경우, 크로마토그래피 시스템을 조절할 수 있다. 크로마토그래피 분리를 실시하기 이전 또는 이후및 실시 중에도 조절될 수 있다. 조절시, 혼합 회로 또는 혼합실 내의 용리제 비율, 기포 트랩에 대한 밸브의 개방도, 기포 트랩의 영구 밸브의 개방도, 혼합 회로로부터의 배출율 또는 크로마토그래피 칼럼으로의 체적 유동을 사용할 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 농도 검출기는 자외선 검출기, NIR 검출기, pH 검출기 또는 전도도 검출기가 될 수 있으며, 바람직하게, 자외선 검출기 또는 NIR 검출기가 될 수 있다.

도 1은 10cm HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타낸다.
도 2는 10cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타낸다.
도 3은 혼합 회로에서 기포 트랩이 개방되어 과유량이 발생하도록 한 후, 10cm 직경과 15cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 중첩된 구배를 나타낸다.
도 4는 10cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타낸다.
도 5는 10cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타낸다.
도 6은 완전한 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 재생성 도표를 나타낸다.
도 7은 결함이 있는 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 재생성 도표를 나타낸다.
도 8은 결함이 있는 30cm 직경의 HPLC 칼럼의 재생성 도표를 나타낸다.
도 9는 HPLC 칼럼에 투입되기 전의 용매 임펄스의 NIR 신호를 나타낸다.
도 10은 손상된 칼럼 패킹을 통과한 이후의 용매 피크를 나타낸다.
도 11은 좌측에 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 기재되어 있으며, 본 발명에 따라 변경되지 않은 시스템에서 얻어진 것을 나타낸다.
도 12는 좌측에 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 나타나 있고, 종래 시스템을 통해 얻어진 것을 나타낸다.
도 13은 좌측에 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 나타나 있고, 우측에 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 나타나 있으며, 이들은 종래 시스템을 통해 얻어진 것을 나타낸다.
도 14는 좌측에 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 두 개의 구배 시간 경로가 나타나 있고, 우측에 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 두 개의 구배 시간 경로가 나타나 있으며, 이들은 본 발명에 따른 시스템, 즉, 혼합 회로에서 분리되고 과유량이 가능한 기포 트랩이 장착된 시스템을 통해 얻어진 것을 나타낸다.
도 15는 Akta HPLC 시스템에서 기록된 두 개의 다른 구배 시간 경로를 나타낸다.
도 16은 Akta-HPLC 시스템을 통해 생성된 겹쳐진 도표를 나타낸다.
도 17은 가압된 기포 트랩이 장착된 종래의 예비 HPLC 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 18은 혼합 회로에서 분리되고, 혼합 회로에서의 압력보다 훨씬 낮은 압력하에서 작동될 수 있는 기포 트랩을 장착한 본 발명에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 19는 종래의 예비 HPLC 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 20은 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 실시예를 나타낸다.
도 21은 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 실시예를 나타낸다.
도 22는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 실시예를 나타낸다.
도 23은 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서 최적 구배 시간 코스를 설정하는 절차를 나타낸다.
도 24는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서 최적 구배 시간 코스를 설정하는 절차를 나타낸다.
도 25는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서 최적 구배 시간 코스를 설정하는 절차를 나타낸다.
도 26은 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서 최적 구배 시간 코스를 설정하고 연속하여 모니터링하는 절차를 나타낸다.
도 27은 주펌프의 하류에서 제 2 NIR 측정을 실시하는 HPLC 시스템을 사용하여, 사용된 HPLC 칼럼의 품질을 체크할 수 있는 절차의 실시예를 나타낸다.
도 28은 주펌프의 하류에서 제 2 NIR 측정을 실시하는 HPLC 시스템을 사용하여, 사용된 HPLC 칼럼의 품질을 체크할 수 있는 절차의 실시예를 나타낸다.
도 29는 사용된 HPLC 칼럼의 품질을 체크할 수 있는 절차의 실시예를 나타낸다.

이하에서는 구배 형성시 연속적인 탈기를 허용/수행할 수 있는 크로마토그래피 시스템을 설명하며, 상기 구배는 혼합 회로에서 형성되고, 상기 시스템은 최고점에서 조절 가능한 밸브를 포함하는 기포 트랩을 포함하며, 상기의 연속적인 탈기는 상기 기포 트랩의 조절 가능한 밸브의 개방도와 주펌프의 펌프 속도와의 상호 작용을 통해 이루어진다. 기포 트랩에 밸브가 존재하기 때문에, 기포 트랩으로 들어가는 용리제의 양을 처리되는 용리제의 양, 즉, 주펌프를 통해 칼럼에 적용되고, 혼합 회로에서 제거되는 용리제의 양과 조절할 수 있다.

또한, 혼합 회로에서 나오는 과잉의 용리제는 기포 트랩의 밸브를 통해 기포 트랩으로부터 나올 수 있다. 이러한 작동 모드에 있어서, 다양한 크기의 크로마토그래피 시스템의 적용이 가능해지고, 즉, 상기 시스템을 다른 직경과 크기의 칼럼으로, 즉, 계획된 크로마토그래피 시스템의 용량보다 낮게 작동할 수 있다. 이는 예비의 대형 크로마토그래피 시스템이 단일의 칼럼, 즉, 정해진 크기와 직경을 갖는 칼럼으로 작동되도록 일반적으로 고안되고 설치된다는 점에서 중요하다. 또한, 다른 유속으로 동일한 구배를 실현할 수 있으며, 이를 통해, 동일한 예비의 대형 크로마토그래피 시스템으로 다른 크기 및 직경의 크로마토그래피 칼럼을 사용할 수 있다.

기포 트랩으로부터 나오는 펌프에서의 또는 기포 트랩의 최고점에서의 조절가능한 밸브는, 혼합 회로의 압력과는 완전하게 개별적으로 다른 기포 트랩 내부의 압력을 설정할 수 있다.

따라서, 이하에 기재된 기포 트랩은 고안된 대형의 크로마토그래피 시스템이 융통성 있게 작동될 수 있게 하는 개별적이고, 독립적인 시스템을 규정한다.

용해된 가스의 대부분은 HPLC 시스템의 혼합 회로의 혼합된 용리제에 존재한다. 필수적인 여압으로 인하여, 여기에서 소량의 가스 유리만이 가능하다.

종래의 HPLC 시스템에 있어서, 가압된 기포 트랩이 사용되며, 여기에는 혼합 회로의 압력과 유사한 압력이 존재한다. 따라서, 이러한 기포 트랩에서는 매우 소량의 가스 방출만이 있다. 또한, 낮은 유속과 관련되는 소규모의 처리 영역이 처리되는 경우, 유속이 느리거나 낮기 때문에, 기포 트랩 내에서의 혼화성은 좋지 않다(도 17 및 도 19 개략도 참조).

제어 가능한 차단 장치, 예를 들어, 밸브를 통해 혼합 회로에서 분리되는 본 발명의 기포 트랩은 가압되어 있지 않으므로(과잉 가능), 용리제에 용해된 가스의 더 많은 방출이 가능해진다. 또한, 과잉의 구배 혼합물은 배출될 수 있다. 이 역시 유속이 빠르기 때문에 매우 양호한 혼화성을 나타낸다(도 18의 개략도 참조).

여기에 기재된 HPLC 시스템을 통해, 혼합 회로에 형성된 구배의 칼럼상에서의 이동성의 품질을 체크할 수 있다. 따라서, 예를 들어, HPLC 시스템에서 방해 요소 또는 불가피한 조건으로 인하여 발생하는 프로그래밍된 구배의 변화를 검출할 수 있다(도 15, 도 23 내지 도 26 참조).

또한, 여기에 기재된 HPLC 시스템을 통해, 처리 단계 이전 및 처리시 사용되는 HPLC 칼럼의 품질을 확인할 수 있으며, 그 이유는 칼럼에 가장 큰 부하가 걸려 칼럼이 손상되거나 더 이상 제조에 사용될 수 없는 재생 단계로 칼럼이 보내진 이후에 평판 개수를 확인할 필요가 없기 때문이다(도 6 내지 도 10, 도 27 내지 도 29 참조).

혼합 회로의 하류에 위치되는 기포 트랩에서의 처리 용량에 따라 혼합 용리제 요구량을 제공할 수 있도록, 처리될 최대 용량으로 시스템의 구배-형성 혼합 회로가 구성된 예비 HPLC 시스템을 이하에서 기재하도록 하겠다. 주펌프에 의해 요구 체적 유량이 칼럼에 적용되고, 나머지는 개방된 기포 트랩을 통해 상기 시스템으로부터 배출되며, 이는 더 이상 혼합 회로로 통합되지 않는다(도 20 내지 도 22 참조).

이러한 구성을 통해, 구배가 항상 동일한 조건하에서 발생하며, 동일한 품질로 칼럼에 전달되는 것을 발견하였다. 기포 트랩을 통해 시스템으로부터 배출되는 미사용 용리제의 양은 칼럼의 크기와 용리제의 체적 유량에 따라 달라진다. 최소 처리 크기의 경우, 배출된 양은 최대이며, 최대 처리 크기인 경우, 최소량이 배출된다. 상기 칼럼에 적용되는 구배는 모든 경우에 있어서 동일하며, 다른 크기의 칼럼들이 동일한 처리 조건하에서 작동될 수 있다. 이를 통해, 처리 품질 및 신뢰성을 도모할 수 있다(도 3, 도 11, 도 12, 도 14, 도 20 내지 도 22 참조).

크로마토그래피 칼럼의 하류에 추가적인(제 2 의) NIR 측정을 실시함으로써, 구배를 어떠한 칼럼 크기나 어떠한 시스템 고안에도 전달할 수 있음을 발견하였다. 칼럼 하류의 검출 라인에서 측정된 NIR 신호는 칼럼 하류에서 측정된 결과가 요구되는 결과(목표값)와 동일해질 때까지 상기 시스템의 프로그래밍이 실행됨에 따른 주요 파라미터를 나타낸다(도 15 참조).

용리제의 집중 탈기는 개방된 기포 트랩을 통해 획득된다. 혼합 회로로부터 분리된 기포 트랩에서 실행될 수 있는 이러한 집중 탈기는 유입되는 액체의 혼화성을 향상시켜 보완된다. 이러한 방식으로서, 다량의 분해된 가스가 상기 혼합 회로로부터 연속적으로 제거될 수 있다. 이를 통해, NIR 신호의 간섭을 줄이고, 크로마토그래피 칼럼에서 향상되고 더욱 복원이 가능한 구배를 형성할 수 있다. 또한, 시스템으로부터 배출된 가스량은 실질적으로 이러한 처리 단계의 항내성(robustness)을 증가시키는 HPLC 칼럼의 하류에 더 이상 부하를 가하지 않는다(도 2 내지 도 4, 도 14 참조).

추가적인 NIR 측정을 통해, 칼럼에 적용되는 구배의 품질이 연속적으로 또는 소정의 빈도로 모니터될 수 있다. 시스템의 장애는 즉시 감지되고, 바로 수정될 수 있다.

사용되는 칼럼의 품질은 크로마토그래피 칼럼 하류의 NIR 측정을 통해 연속적으로 모니터될 수 있다. 예를 들어, 이는 칼럼 상류와 하류의 구배를 비교하여 수행될 수 있다. 액체는 항상 저항이 작은 경로, 예를 들어, 칼럼 크랙을 따라 이동하므로, 칼럼 패킹 또는 칼럼 하드웨어가 균일하지 않거나 손상이 있는 경우, 칼럼을 통해 이동하는 구배를 왜곡하게 된다. 만일, 양 구배를 비교하는 경우, 어느 정도의 차이가 있는지 확인할 수 있다. 칼럼이 손상되었음을 나타내는 서로 벗어나는 구배가 존재하는 경우, 제품군에서 손실이 발생하기 이전이라도, 상기 칼럼은 처리 공정에서 바로 제거되거나, 분리된 시험 절차 또는 보수 절차로 보내질 수 있다. 또한, 이러한 절차는 칼럼 시험 이후에 이행되는 칼럼 복원시에도 사용될 수 있다. 따라서, 요구되는 적절한 방식으로 적합한 절차로 시행 선택사항으로 분리하기 전에 바로 칼럼의 품질이 평가될 수 있다(도 6 내지 도 10, 도 27 내지 도 29 참조).

추가적인 NIR 측정을 실시함으로써, 또한, 칼럼을 통해 이동하는 구배를 연속적으로 모니터함으로써, 재생된 이후와, 제품이 적용되고, 칼럼에서 나온 이후 형성된 피크의 형상을 평가하기 바로 전에, 소량의 용매(바람직하게 완충제 B)의 형태인 작은 충격이 평형상으로 칼럼에 적용될 수 있다. 이는 각각의 제품을 사용하기 이전에 시행되며, 차후에 칼럼을 재생할 필요가 없다. 칼럼의 품질을 연속적으로 다중 모니터하는 것은 크로마토그래피 칼럼의 상류에서의 NIR 측정과 함께 크로마토그래피 칼럼의 하류에서의 추가적인 NIR 측정으로 수행될 수 있으며, 따라서, HPLC 단계의 품질과 항내성이 향상될 수 있다(도 9 및 도 10 참조).

또한, 크로마토그래피 칼럼의 하류에서의 제 2 NIR 검출기는, 탈기 기능과 다양한 크기의 기능을 이용할 수 있게 하며, 그 이유는 소정의 시스템 구성(예를 들어, 기포 트랩의 부피 및 구성)의 최적화와 수반되는 부품(예를 들어, 혼합 회로 펌프 및 밸브)의 적절한 조절이 요구되기 때문이다. 시스템이 최적으로 조절된 이후, 일정하게 연속적인 모니터링 기능을 충족시킬 수 있으며, 필요하다면, 즉시, 수정이 가능해진다(도 23 내지 도 26 참조).

새로운 구성의 HPLC 시스템은 기포 트랩이 혼합 회로로부터 분리되어 있다. 조절가능한 밸브를 통해 혼합 회로로부터 기포 트랩을 분리하고, 기포 트랩의 개방 구성, 즉, 유입 가스와 유입 용리제를 제거할 수 있는 기능, 즉, 기포 트랩이 과유량이 될 수 있도록 하는 구성을 통해, 용리제가 칼럼에 도착하기 전에 용리제의 탈기를 위한 향상된 해결책을 제공할 수 있다(도 18 참조).

용리제로부터 가스를 제거함으로서 다음의 두 가지 실질적인 향상을 도모할 수 있다.

- 칼럼에서 가스를 제거할 필요가 없기 때문에, 크로마토그래피 칼럼의 품질이 향상된다.

- 가스 기포가 NIR 신호에 영향을 미치지 못하기 때문에, 혼합 회로에서 형성된 구배의 품질이 향상된다.

또한, 이러한 이점들은 크로마토그래피 칼럼 하류에서의 제 2 NIR 기준 검출을 통해 더욱 향상될 수 있다.

과유량이 가능한 기포 트랩을 통해, 구배 형성 기능과 탈기 기능을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 이들은 아래의 사항들을 통해 이루어질 수 있다.

- 기포 트랩으로부터 현저한 탈기 및 시스템으로부터 기포 제거.

- 혼합 회로에서의 향상된 구배 형성(제 1 NIR 측정 신호).

과유량이 가능한 기포 트랩을 이용하여, 크로마토그래피 칼럼 이후의 제 2 NIR 측정을 통해, 다음의 사항들이 가능해진다.

- 혼합 회로에서 형성된 구배의 이동성을 체크할 수 있으며, 이러한 기능은 혼합 회로 또는 시스템의 구성의 작동 모드에 좌우된다.

- 다양한 크기로 구배를 최적으로 조절할 수 있다.

NIR 기준 검출기의 추가적인 기능, 즉, 서로 개별적인 시스템과 칼럼의 품질 체크는 과유량이 가능한 기포 트랩과 별개이다.

혼합 회로로부터 기포 트랩을 분리하여, 주펌프에서 칼럼으로 통과되는 것보다 더욱 많은 유량이 기포 트랩을 통해 흐르게 할 수 있으며, 기포 트랩을 통해 배출될 수 있다. 이 경우에 있어서, 기포 트랩이 과유량이 되며, 기포 트랩은 가스들을 배출할 뿐만 아니라, 혼합 용리제 양의 일부를 배출한다. 예를 들어, 기포 트랩을 통해 유속이 빠를 필요가 있는 매우 고가이거나 복잡한 구배인 경우에 다른 것들 중에서도 형성된 가스를 효과적으로 배출할 수 있도록 이러한 작동 모드가 필요하다. 이를 통해, 프로그래밍화 된 것과 같이 구배를 형성할 수 있고, 더욱 안정적이고 질적으로 향상된 구배 경로를 형성할 수 있다. 기포 트랩의 과유량은 시스템이 크거나 작거나, 또는 일반적으로 구배 품질을 향상시키기 위한 경우에, 주요 변경(1:1)을 하지 않고 구배의 전달에 사용될 수 있다.

이러한 기술적인 양태는 원칙적으로 크로마토그래피 하류의 제 2 NIR 측정과 별개이다. 상기 시스템의 조절과 시스템의 이용은 상기 제 2 NIR 기준 검출기를 통해 더욱 향상될 수 있다.

10cm 직경의 크로마토그래피의 도표가 도 1에 기재되어 있으며, 잘못된 분리 구배의 경로가 나타나 있다. 이를 통해, 처리 경로가 어긋나게 된다. 이러한 신호는 혼합 회로에서 NIR 측정을 실시한 경우에 발생된다.

도 13에는 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 가지 구배 시간 경로가 좌측에 나타나 있고, 우측에는 종래 시스템에서 얻어지는 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 가지 구배 시간 경로가 나타나 있다. 복원할 수 없으며, 다양한 구배 시간 경로와 아세트산니트릴 밸브의 개방도가 두 영역에서 분명하게 나타난다. 이들 신호는 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 발생된다.

10cm 직경의 크로마토그래피 칼럼의 도표가 도 2에 기재되어 있으며, 이 때, 기포 트랩을 개방하여 과유량이 발생하도록 한 이후 분리 구배의 시간 경로가 나타나 있다. 이러한 시간 경로는 양호하며, 복원이 가능하다. 이러한 신호는 혼합 회로에서 NIR 측정을 통해 발생된다.

도 5에는 10cm 직경의 크로마토그래피 칼럼의 도표가 기재되어 있으며, 결함이 있는 재생성 구배 피크의 시간 경로가 나타나 있다. 상기 구배 피크는 선명하게 나타나지 않았다. 이러한 신호는 혼합 회로에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 4에는 10cm 직경의 크로마토그래피 칼럼의 도표가 기재되어 있으며, 기포 트랩을 개방하여 과유량이 발생하도록 한 이후 재생성 구배의 시간 경로가 나타나 있다. 구배 피크는 정확하고 복원 가능하게 나타났다. 이러한 신호는 혼합 회로에서 NIR 측정을 통해서만 생성된다.

또한, 매우 효과적인 탈기의 효과가 기포 트랩을 개방하여 나타났으며, 이는 급작스런 압력 저하를 통해 발생된다.

다음의 실시예들과 도면들은 본 발명의 주요 구성을 설명하기 위해 제공된다. 권리범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정해진다. 발명의 주요 사상을 훼손하지 않고, 개시된 방법의 주요 사상을 변경할 수 있음은 당연하다.

도 1은 10cm HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타내며, 결함이 있는 분리 구배의 시간 경로가 나타나 있다. 이는 편차로 인하여 처리 경로에서 어긋남이 발생되어 있다. 이러한 신호는 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 2는 10cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타내며, 기포 트랩을 개방하여 과유량이 발생하도록 한 후 분리 구배의 시간 경로가 나타나 있다. 이러한 시간 경로는 복원이 가능하고, 편차가 없었다. 이러한 신호는 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 3은 혼합 회로에서 기포 트랩이 개방되어 과유량이 발생하도록 한 후, 10cm 직경과 15cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 중첩된 구배를 나타낸다. 양 쪽 모두의 시간 경로는 유사하며, 복원할 수 있고, 변동이 거의 없다(또는 변동이 거의 부분적으로 소량 발생한다). 이러한 신호는 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 4는 10cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타내며, 본 발명에 기재된 것과 같이, 기포 트랩을 개방하여 과유량이 발생하도록 한 후 분리 구배의 시간 경로가 나타나 있다. 구배 피크는 복원 가능하게 나타났다. 이러한 신호는 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 5는 10cm 직경의 HPLC 크로마토그래피 칼럼의 도표를 나타내며, 결함이 있는 재생성 구배의 시간 경로가 나타나 있다. 구배 피크는 양호하게 나타나지 않았다. 이러한 도표는 본 발명에 따르지 않고 작동된 HPLC 시스템에서 생성된다. 이러한 신호는 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 6은 완전한 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 재생성 도표를 나타낸다. 세 개의 모든 구배 피크는 왜곡이 나타나지 않았으며, 완전한 칼럼 패킹을 나타내는 것과 매우 유사하다. 이는 종래의 방법을 통해 이어서 확정된다. 이러한 신호는 주펌프의 하류와 칼럼의 하류에 위치되는 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 7은 결함이 있는 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 재생성 도표이다. 칼럼 패킹의 크랙으로 인하여 제 1 구배 피크의 상승 측면에 왜곡이 명확하게 나타나 있다. 또한, 제 2 구배 피크의 NIR 신호에서도 왜곡이 나타나 있다. 뚜렷하게 나타나는 칼럼의 결함은 평판 계수 확인을 통한 패킹 품질의 종래 시험과 칼럼 매트릭스의 심사를 통해 연이어 확정된다. 이러한 신호는 주펌프의 하류와 칼럼의 하류에 위치되는 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 8은 결함이 있는 30cm 직경의 HPLC 칼럼의 재생성 도표를 나타낸다. 이 경우에 있어서, 구배 피크의 왜곡은 칼럼 결함을 나타내는 것으로 보인다. 칼럼의 결함은 종래의 방법과 칼럼 매트릭스의 심사를 통해 확정된다. 이러한 신호는 주펌프의 하류와 칼럼의 하류에 위치되는 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 9는 HPLC 칼럼에 투입되기 전에 용매 충격을 가한 NIR 신호를 나타낸다. 이러한 피크는 급격하게 나타났고, 변형된 측면이 나타나 있지 않다. 이러한 신호는 주펌프 하류와 칼럼 하류에 위치되는 NIR 측정을 통해 생성된다.

손상된 칼럼 패킹을 통과한 이후의 용매 피크(도 9의 이상적인 피크와 비교)가 도 10에 도시되어 있다. 칼럼 패킹 내의 결함으로 인한 두 개의 피크 측면의 왜곡이 분명하게 나타나 있다. 결합된 패킹의 품질은 종래 방법을 통해서도 명확해진다. 이러한 신호는 주펌프의 하류와 칼럼의 하류에 위치되는 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 11에는 좌측에 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 기재되어 있으며, 본 발명에 따라 변경되지 않은 시스템에서 얻어진 것이다. 아세트산 니트릴 밸브의 개방도에 따른 요동이 나타나 있으며, 이들은 일부 경우에 있어서 심각한 수준이고, 따라서, 구배의 요동이 된다. 우측의 두 개의 시간 경로는 본 발명의 사상, 즉, 분리되고 과유량이 가능한 기포 트랩에 따라 재구성된 시스템에서 얻어진다. 분명하게 복원 가능한 구배 시간 경로와 아세트산 니트릴 밸브의 개방도가 특별한 요동 없이 나타나 있다. 이러한 신호들은 혼합 회로에서 NIR 측정을 통해서만 생성된다.

도 12에는 좌측에 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 나타나 있고, 종래 시스템을 통해 얻어진다. 이 경우에 있어서, 아세트산 니트릴 밸브의 개방도에 따른 요동이 나타나 있으며, 이들은 일부 경우에 있어서 심각한 수준이고, 따라서, 10cm 크기의 경우보다 작게 구배가 나타난다. 우측의 두 개의 시간 경로는 본 발명의 사상, 즉, 분리되고 과유량이 가능한 기포 트랩에 따라 재구성된 시스템에서 얻어진다. 분명하게 복원 가능한 구배 시간 경로와 아세트산 니트릴 밸브의 개방도가 특별한 요동 없이 나타나 있다. 이러한 신호들은 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 13에는 좌측에 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 나타나 있고, 우측에 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 세 개의 구배 시간 경로가 나타나 있으며, 이들은 종래 시스템을 통해 얻어진다. 양 쪽 모두에서 복원이 불가능하고, 구배 시간 경로와 아세트산 밸브의 개방도가 다양하게 나타났다. 이러한 신호들은 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 14에는 좌측에 15cm 직경의 HPLC 칼럼의 두 개의 구배 시간 경로가 나타나 있고, 우측에 10cm 직경의 HPLC 칼럼의 두 개의 구배 시간 경로가 나타나 있으며, 이들은 본 발명에 따른 시스템, 즉, 혼합 회로에서 분리되고 과유량이 가능한 기포 트랩이 장착된 시스템을 통해 얻어진다. 이들은 복원이 가능하고, 양 크기로 거의 동일한 구배 시간 경로와 아세트산 니트릴 밸브의 개방도가 나타나 있다. 이러한 신호들은 혼합 회로, 즉, 칼럼의 상류에서 NIR 측정을 통해 생성된다.

도 15에는 Akta HPLC 시스템에서 기록된 두 개의 다른 구배 시간 경로가 나타나 있다. AKTA 신호는 시스템을 프로그래밍화 하는데 사용되는 구배 펌프의 작동 데이터의 전달에 의해 형성된다. 구성과 크기 면에서 Akta-HPLC 시스템과 현저히 다른 예비 HPLC 시스템의 NIR 프로그래밍 밸브가 NIR 밸브로 프로그래밍화 될 수 없는 Akta-HPLC 시스템의 프로그램을 기초로 하는데 사용되었다. Akta-HPLC 시스템의 두 개의 구배 시간 경로(하나는 구배 펌프의 수행 데이터, 다른 하나는 혼합실 이후의 실제 측정된 NIR값)가 도표로 나타났고, 동일한 시작점을 갖는다는 점을 고려해보아야 한다. 프로그래밍에 따라 동일한 시간 경로가 결과로 나타나야함에도 불구하고, 두 개의 시간 경로에 상당한 차이가 발생됨을 알 수 있다. 이 도표는 만일 혼합 회로 또는 혼합실 하류의 추가적인 NIR 신호를 사용하거나 고려하지 않는다면, 다른 구성과 크기의 시스템 사이의 구배 이동이 편이를 발생시키지는 않고 바로는 불가능하다는 것을 나타내고 있다.

도 16에는 겹쳐진 도표가 나타나 있고, 이들은 Akta-HPLC 시스템을 통해 생성되었다. 두 개의 피크가 다른 폭과 형상을 갖는 것이 분명하게 나타나 있다. 이러한 피크들은 시스템 혼합실 하류의 실제 NIR 측정을 고려하기 전후에 두 개의 다른 프로그래밍된 구배를 통해 형성된다. Akta 구배의 수정(생산 시스템의 변경)을 통해 처리 시스템과 Akta-HPLC 시스템의 분리 시간 경로의 향상된 일치와 이동이 가능해진다.

가압된 기포 트랩이 장착된 종래의 예비 HPLC 시스템의 개략도가 도 17에 나타나 있다. 여기에는 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 차단 장치(밸브)가 없다. 기포 트랩의 유동을 분리하고 용리제의 가스를 제거하는 것은 불가능하다. 또한, 다른 크기에서 가동하는 동일한 구배를 시행하는 것도 불가능하다. 혼합 회로에서의 순환율은 일정하다. 상기 시스템은 혼합 회로에 위치되는 하나의 NIR 측정만을 실시한다. 따라서, 칼럼과 라인상의 구배 품질을 체크하는 것이 불가능하다.

도 18은 혼합 회로에서 분리되고, 혼합 회로에의 압력보다 훨씬 낮은 압력하에서 작동될 수 있는 기포 트랩을 장착한 본 발명에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 개략도를 나타낸다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)는 선택적으로 상기 기포 트랩의 상부 배출구에 설치될 수 있다. 유동은 기포 트랩에서 분리될 수 있으며, 용리제의 탈기는 이곳에서 발생한다. 또한, 다른 칼럼 크기에서 진행하는 동일한 구배를 가동하는 것도 가능하다. 혼합 회로에서의 순환율은 다양하게 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 칼럼의 우회(bypass) 모드에서 칼럼의 품질과 라인상의 구배 품질을 체크할 수 있다.

도 19에는 종래의 예비 HPLC 시스템의 개략도가 기재되어 있으며, 이는 기포 트랩이 가압되어 혼합 회로에 결합되어 있다. 상기 기포 트랩과 혼합 회로 사이에는 차단 장치가 없다. 또한, 기포 트랩에서 유동이 분리될 수 없으며, 용리제의 탈기도 불가능하고, 또한, 다른 크기에서 진행하는 구배들을 동일하게 가동할 수 없다. 혼합 회로에서의 순환율은 일정하다. 상기 시스템은 혼합 회로에 위치되는 하나의 NIR 측정 위치만을 갖는다. 라인상에서 칼럼과 구배 품질을 체크하는 것은 불가능하다.

도 20에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 실시예가 기재되어 있으며, 이는 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 갖는다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 이러한 실시예는 최대 크기의 시스템이 구성될 때를 나타낸다. 따라서, 용리제의 탈기가 기포 트랩에서만 발생한다. 유동을 분리할 필요는 없지만, 선택적으로 가능하다. 혼합 회로의 순환율은 유연한 방식으로 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배 품질을 체크하는 것이 가능하다.

도 21에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 실시예가 기재되어 있으며, 이는 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 갖는다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 이 경우에 있어서, 용리제의 탈기와 기포 트랩에서 유동의 분리가 발생함을 의미하는 중간 처리 변형례를 나타낸다. 유동의 분리를 통해, 가장 큰 크기(도 21 참조)에서 사용될 수도 있는 구배가 동일한 방식으로 실행될 수 있다. 칼럼을 향해 통과되며, 기포 트랩을 거쳐 시스템에서 나오는 유량의 합계는 가장 큰 크기의 처리 유량과 동일하다. 혼합 회로의 순환율은 다양하게 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다.

도 22에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템의 실시예가 기재되어 있으며, 이는 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 갖는다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 이 경우에 있어서, 용리제의 탈기와 기포 트랩에서 유동의 분리가 발생함을 의미하는 최소의 처리 변형례를 나타낸다. 유동의 분리를 통해, 가장 큰 크고, 중간 크기에서 사용될 수도 있는 구배가 동일한 방식으로 실행될 수 있다. 칼럼을 향해 통과되며, 기포 트랩을 거쳐 시스템에서 나오는 유량의 합계는 가장 큰 크기의 처리 유량과 동일하다. 혼합 회로의 순환율은 다양하게 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다.

도 23에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서, 상기 시스템은 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 가지며, 최적의 구배 시간 경로를 설정하는 절차가 기재되어 있다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 혼합 회로의 순환율은 유연한 방식으로 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다. 이러한 도면은 최적의 구배를 설정하는 제 1 단계는 혼합 회로와 완충기 공급 영역에서 필요한 모든 파라미터의 수정임을 나타낸다. 혼합 회로에서 발생하는 NIR 측정이 이 지점에서의 최적의 목표 구배 상태를 반영할 때, 상기 파라미터들이 훌륭하게 조절되었다. 이 경우에 있어서, 파라미터의 조절은 중첩된 완충제 용기의 압력, 혼합 회로의 최적 순환율을 조절하는 것 중 하나에 해당한다.

도 24에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서, 상기 시스템은 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 가지며, 최적의 구배 시간 경로를 설정하는 절차가 기재되어 있다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 혼합 회로의 순환율은 다양한 방식으로 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다. 이러한 도면은 최적의 구배를 설정하는 제 2 단계는 시스템의 주펌프로부터 유동 크기를 수정한 이후, NIR 측정의 제 2 의 하류와 정렬하는 것임을 나타낸다. 이 경우에 있어서, 두 개의 구배들 사이에 현저한 차이가 분명하게 나타나고, 조정 방안을 통해 제거되어야 한다.

도 25에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서, 상기 시스템은 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 가지며, 최적의 구배 시간 경로를 설정하는 절차가 기재되어 있다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 혼합 회로의 순환율은 다양한 방식으로 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다. 이러한 도면은 최적의 구배를 설정하는 다음 단계가 다음의 방안을 포함할 수 있음을 나타낸다 : 예를 들어, 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치하는 조절 가능한 밸브를 통하여 혼합 회로로부터의 유입량의 조절, 최고점에서 기포 트랩을 통해 시스템에서 나가는 유량 조절, 및 모든 시스템 부품들의 일반적인 체크.

도 26에는 본 발명의 사상에 따라 변경된 예비 HPLC 시스템을 사용하는 실시예로서, 상기 시스템은 혼합 회로로부터 분리되고, 가압되지 않은 상태로 작동될 수 있는 기포 트랩을 가지며, 최적의 구배 시간 경로를 설정하고 연속적으로 모니터할 수 있는 절차가 기재되어 있다. 조절 가능한 차단 장치(예를 들어, 밸브)가 기포 트랩과 혼합 회로 사이에 위치된다. 혼합 회로의 순환율은 다양한 방식으로 조절될 수 있다. 상기 시스템은 두 개의 NIR 측정 위치를 가지며, 하나는 혼합 회로에 위치되고, 다른 하나는 주펌프의 하류에 위치된다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다. 이러한 도면은 모든 시스템의 파라미터를 훌륭하게 설정한 이후에, 혼합 회로와 주펌프의 하류에서 측정된 양 구배가 동일함을 나타낸다. 이러한 상태에 이르게 되면, 조정 처리가 완료되고, 확인된 값이 시스템을 영구적으로 프로그래밍하는데 사용될 수 있다. 이러한 시간으로부터 계속되면, 추가적인 NIR 측정을 통해 칼럼의 우회 모드에서 구배의 품질이 연속적으로 모니터된다. 이러한 목적을 위해, 칼럼을 사용하지 않고 시험이 가동되거나, 칼럼의 우회 모드에서 규칙적인 간격으로 시험이 실행된다. 이를 통해, 시스템은 사용된 HPLC 칼럼에 나쁜 영향을 끼치지 않게 된다. 동일하게 어긋남이 빠르게 감지되어, 제거될 수 있다.

도 27에는 주펌프의 하류에서 제 2 측정을 실시하는 HPLC 시스템을 사용하여, 사용된 HPLC 칼럼의 품질을 체크할 수 있는 절차의 실시예를 나타낸다. 이러한 추가적인 NIR 측정이 칼럼의 상류 또는 하류 중 어느 하나의 적절한 우회를 통해 발생할 수 있다. 제 1 NIR 측정은 주펌프의 상류에서 이루어진다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다. 이러한 도면은 칼럼의 품질을 체크하는 제 1 단계는 칼럼의 하류의 칼럼 품질에 영향을 미치는 구배 시간 경로를 탐지하는 것임을 나타낸다. 예를 들어, 구배 또는 칼럼의 제어된 시간 경로의 의미가 그 자체로서 칼럼의 구배시 발생하는 극압성 요동을 나타낼 수 있다. 또한, 요동 인자는 칼럼 매트릭스에 있는 완충제의 조성에 따라 발생할 수 있는 가스 배출과 온도 변화이다. 또한, 매우 급격한 경사면을 갖는 구배가 HLPC 칼럼의 패킹 품질을 평가하는데 가장 최적임을 알 수 있었다. 일반적으로, 제품 분리전의 칼럼 재상은 매우 중요한 단계이다. 동시에, 재생시 형성된 칼럼의 결함이 분리되기 전에 탐지되지 않은 상태로 존재할 수 있는 위험이 있고, 이는 분리 공정에 매우 부정적인 결과로 나타날 수 있다.

도 28에는 주펌프의 하류에서 제 2 측정을 실시하는 HPLC 시스템을 사용하여, 사용된 HPLC 칼럼의 품질을 체크할 수 있는 절차의 실시예를 나타낸다. 이러한 추가적인 NIR 측정이 칼럼의 상류 또는 하류 중 어느 하나의 적절한 우회를 통해 발생할 수 있다. 제 1 NIR 측정은 주펌프의 상류에서 이루어진다. 따라서, 라인상에서 칼럼과 구배의 품질을 체크하는 것이 가능하다. 이러한 도면은 두 개의 구배(칼럼의 상류 및 칼럼의 하류)를 일치시키는 단계에서, 어떻게 결함이 있는 칼럼을 표시할지를 나타낸다. 두 개의 구배 시간 경로에서의 차이가 이러한 표시로서 나타난다. 이러한 경로를 추정하기 위한 전제 조건은 다음 사항들이다:

- 칼럼 상류의 구배 시간 경로가 평범하다, 즉, 구배 시스템이 완전하게 기능하고, 완전한 구배가 칼럼으로 이동된다. 이러한 상태를 구별하고 얻는 절차가 위에서 설명되어 있다(도 23 내지 도 26 참조).

- 불확실한 경우에는, 시스템의 체크가 먼저 실행되어야 한다.

- 만일, 어떠한 시스템의 영향도 칼럼 하류의 구배 시간 경로에 비정상에 원인이 되지 않는 경우에는, 결함이 있는 패킹의 원인을 찾아야 한다. HLPC 칼럼에 가장 큰 손상을 끼치는 것은 처리 과정에서 공통적인 고압에 의해 야기되는 크랙의 형성 때문이다. 재료가 연속적으로 압축되고 이완되기 때문에, 칼럼에 작용하는 스트레인(strain)은 막대하다. 주로 칼럼 벽 부분에 발생하는 크랙이 형성된 이후, 칼럼 패킹의 불균일한 분포와 칼럼으로의 불균일한 유량 유입이 발생한다. 이러한 거동은 최소한의 저항 경로를 항상 선택하는 액체의 특성에 기인하는 것이다. 크랙이 형성된 칼럼에 있어서, 액체는 가장 짧은 경로로 칼럼에서 나와 인장력을 해제할 수 있기 때문에, 칼럼 패킹의 손상 영역은 바람직하게 흩어질 수 있다. 이러한 거동은 칼럼 하류의 NIR 검출기를 통해 볼 수 있으며, 특히, 완충제 조성의 급작스런 변화의 경우에 볼 수 있다. 만일, 칼럼 상류의 완충제 조성이 변하는 경우, 칼럼 패킹에 결함이 있음을 나타내는 칼럼의 소위 불용 체적(dead volume)에 의해 야기되는 지연보다 더 칼럼 하류의 신호 변화가 더욱 급속하게 감지될 수 있다. 또한, 손상된 HPLC 칼럼 패킹에서의 조건이 매우 불안정하고, 손상이 급속하게 퍼지기 때문에, 칼럼이 손상된 이후 기록되는 구배 시간 경로는 일반적으로 복원할 수 없으며, 불규칙적이다.

도 29는 사용된 HPLC 칼럼의 품질을 체크할 수 있는 절차의 실시예를 나타낸다. 이러한 체크 절차는 소위 평판 계수 측정(HETP)을 실시하여 이루어진다. 이러한 시험에 있어서, 하나 이상의 자외선 피크가 생성되고 평가된다. 제품의 품질에 영향을 미치지 않도록 다음 단계의 제품 사용 이전에 시험을 실시하는데 사용되는 자외선 반응 물질이 반드시 제거되어야 한다. 따라서, 도 27 및 도 28 에서 이미 설명한 바와 같이, 칼럼의 특정 스트레인을 나타내는 이러한 시험 이후에 일반적으로 재생성이 수행되어야 한다. 흔히, 상기 시험 방법 자체로 칼럼에 높은 스트레스를 가하기도 한다. 칼럼이 재생성되기까지 제품의 사용과 연속적인 분리가 발생할 수 없다.

실시예

실시예 1

다른 구성과 크기를 갖는 HPLC 시스템에서의 구배 시간 경로의 차이

Akta-HPLC 시스템의 구배는 오로지 펌프의 전달 부피에 의해서만 제어되지만, 실제 구배 시간 경로는 고려되지 않는다. 또한, 부피의 수축 효과들도 고려되지 않는다.

큰 제품 크기의 처리는 NIR 검출기를 통해 완충제 조성의 조절을 수반하고, 실제 완충제 조성(구배)이 측정되고 조절된다.

완충제는 전도성 측정 셀을 통해 혼합실의 하류를 지나 통상의 환형 밸브를 우회하면서 NIR 검출기로 지나게 된다. 유사한 유동 조건을 형성하도록 라인의 단면적을 크게하기 때문에, 유속이 60ml/분으로 증가될 필요가 있다. 완충제 A 및 B의 조성은 양 쪽의 크로마토그래피에서 동일하다.

이전에 사용된 프로그램의 구배가 가동되고 동시에 NIR 검출기를 통해 데이터가 기록된다. Akta 크로마토그래피(구배 펌프의 전달율)와 Akta 시스템의 혼합실 하류에서 실제 측정된 NIR 신호로부터의 양 구배값이 동일한 시작점을 참작하여 액셀 다이어그램(도 15)으로 도시된다. 두 구배의 차이가 확인되고, 상기 프로그램이 이러한 양을 통해 수정된다(도 16 및 도면들에 대한 설명 참조).

Akta 시스템의 이전 구배는 제 1 단계에서, 즉, 용리 현상이 이미 발생한 부분에서 더욱 가파르다. 결과는 피크의 폭이 새로운 구배에 비하여 작았다. Akta 가동시의 수율은 예비 가동시의 수율보다 높았으며, 이는 분리 경로가 다르고, 따라서, 분리 결과가 다름을 나타내었다.

제 2 의 하류 NIR 측정을 통해 최적화된 구배는 제품 시스템과 Akta 사이의 구배 이동에서 향상된 일치를 나타내었다(도 15 및 도 16의 상세한 설명 참조).

실시예 2

혼합 회로로부터 분리된 기포 트랩에 의해 배출된 용리제의 양

과유량이 가능한 기포 트랩을 사용하여, 시스템으로부터 과량의 용리제가 배출되는 가스와 함께 제거될 수 있었다. 시스템의 크기가 작동될 최대 칼럼의 크기에 일치하기 때문에, 배출된 과량은 사용된 유속과 사용된 칼럼의 직경에 좌우된다.

30cm 직경의 칼럼을 사용하는 경우, 유속은 162ℓ/시간이다. 과유량이 가능한 기포 트랩이 완전하게 충진되었다. 가스와 소량의 과량 용리제가 상기 시스템으로부터 제거되어야 한다(도 20).

15cm 직경의 칼럼을 사용하는 경우, 유속은 40.5ℓ/시간이다. 과유량이 가능한 기포 트랩이 완전하게 충진되었다. 가스와 121.5ℓ의 과량 용리제가 상기 시스템으로부터 제거되어야 한다(도 21).

10cm 직경의 칼럼을 사용하는 경우, 유속은 18ℓ/시간이다. 과유량이 가능한 기포 트랩이 완전하게 충진되었다. 가스와 154ℓ의 과량 용리제가 상기 시스템으로부터 제거되어야 한다(도 22).

혼합 회로에서 기포 트랩이 개방되고 과유량이된 이후 10cm 및 15cm 직경의 크로마토그래피 칼럼의 구배가 중첩되는 것을 도 3에서 볼 수 있다. 양쪽의 곡선이 완전하게 유사하다.

Claims

크로마토그래피 시스템으로서,
혼합 회로 또는 혼합실, 기포 트랩, 농도 검출기 및 하나 이상의 펌프를 포함하고,
상기 기포 트랩은 최고점에서 영구 개구를 갖는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 기포 트랩은 상기 혼합 회로 또는 상기 혼합실의 외부 또는 하류에 위치되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 기포 트랩으로의 유입은 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 3 항에 있어서, 상기 조절은 밸브에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 기포 트랩은 상기 혼합 회로 또는 상기 혼합실 내에 위치되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영구 개구를 통한 체적 유동은 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 6 항에 있어서, 상기 조절은 밸브에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영구 개구의 하류에 제 1 체적 유동 측정 장치가 위치되고, 칼럼 이후에 제 2 체적 유동 측정 장치가 위치되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 주펌프의 하류에 제 2 농도 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
크로마토그래피 시스템으로서,
2개의 농도 검출기를 포함하고, 혼합 회로 또는 혼합실에 제 1 농도 검출기가 위치되고, 주펌프의 하류에 제 2 농도 검출기가 위치되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 10 항에 있어서, 상기 주펌프와 상기 제 2 농도 검출기 사이에 크로마토그래피 칼럼이 위치되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
제 10 항에 있어서, 주펌프 이후에 그리고 크로마토그래피 칼럼 이후에 제 2 농도 검출기가 위치되는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.
전체 크로마토그래피 시스템의 효율을 체크하기 위한 제 10 항에 기재된 크로마토그래피 시스템의 사용.
크로마토그래피 칼럼의 완전성 (integrity) 을 체크하기 위한 제 11 항 또는 제 12 항에 기재된 크로마토그래피 시스템의 사용.
크로마토그래피 시스템을 제어하기 위한 제 1 농도 검출기의 신호와 제 2 농도 검출기의 신호의 비의 사용.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 회로의 체적 유동은 가변적으로 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 시스템.