KR20140081765A - 녹차로부터 클로로필류의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차로부터 클로로필류를 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 녹차로부터 분리된 클로로필류의 생리활성적 고찰과 이러한 색소계 화합물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 녹차로부터 클로로필류를 정제된 형태로 분리시키고, 분리된 각 색소 화합물에 대한 항산화 활성 및 항암활성을 검정하여 이들이 항산화 및 항암 활성을 가짐을 확인한 발명에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 녹차의 새로운 생리활성 기능을 밝히면서 항암 조성물의 새로운 원천을 제시할 수 있는 가능성 및 녹차의 항암 조성물로서의 새로운 기능을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

Description

녹차로부터 클로로필류의 추출방법{Extraction method of chlorophylls from green tea}

본 발명은 녹차로부터 분리된 색소성분인 클로로필류가 높은 항산화 활성 및 항암 활성을 나타냄을 확인하고 이를 추출하는 방법에 관한 발명이다.

최근 작물에 함유된 식이 피토케미칼(phytochemical)의 섭취가 강력한 항산화 활성을 나타내어 다양한 질병예방 및 치료에서 중요한 역할을 수행하고 있다는 것이 증명되고 있다. 다양한 항발암제와 항돌연변이제가 in vivo 상에서 종양(tumor), 암(cancer)의 중간매개 바이오마커(biomarker)의 증식과 빈도를 감소시키는 것이 확인되었으며, in vitro 상에서 단기간의 유전독성 검정을 통해 항암효능을 나타내는 것이 확인되고 있다. 다양한 동물 실험을 통해 피토케미칼이 인체에 섭취되어지는 수준 또는 그 이상의 농도에서 항암효능이 검증되고 있으나, 작물의 잎이나 과일과 같은 영양체로부터 발견되어지는 클로로필(chlorophyll)에 대한 고찰은 극히 미흡한 실정이다.

또한 작물의 활성성분 중 항산화활성에 기인하여 질병치료와 건강증진에 기여하는 것이 비타민 C 나 E, 폴리페놀(polyphenol) 등과 같은 피토케미칼에 의해서 인지 혹은 클로로필과 같은 색소화합물에 의한 것인지에 대해서는 불분명하며, 대부분의 연구가 클로로필을 제외한 다른 피토케미칼에 국한되어 있는 실정이다.

피토케미칼의 항산화활성을 구명하여 피토케미칼을 포함하는 우수한 원료를 검색하는 것은 지난 30년간 발표된 논문들의 많은 부분을 차지한다. 클로로필이 천연에 가장 많은 색소임에도 불구하고 인간의 건강을 증진 시킬 수 있는 활성소재로서 부각되지 못하고 연구의 주제에서 간과되어진 것은 클로로필과 그 유도체를 정제된 형태로 얻기 어려움과 불안정성 때문에 분해되는 양상에 의한 것이었다.

클로로필은 식물의 녹색 색깔을 나타내는 본질적인 색소이며, 전자기적 스펙트럼(spectrum)에서 적색과 청색부분을 흡수하고, 광합성 과정을 통하여 태양에너지를 화학에너지로 변환시키는데 중요한 역할을 하고 있다. 광합성을 하는 동안 산소에 전자가 직접적으로 전달되거나 여기된 에너지가 공급되어 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O₂ ^－)이나 단일항산소(singlet oxygen, ¹O₂)와 같은 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)이 발생하게 되며, 이러한 활성산소종은 식물체가 스트레스 하에서 방어 메카니즘을 유도하는 중요한 신호전달 물질로 작용할 수 있으나(Van Breusegem et al., 2001), 과도한 수준의 활성산소종은 광합성 기구에 유해한 좋지 않은 환경을 제공할 수 있다(Alscher et al. 1997). 이러한 측면에서 엽록체(chloroplast)에는 광산화적 손상(photo-oxidative damage)이나 광저해(photo-inhibition)에 대한 효과적인 방어 메카니즘이 발달될 필요가 있다 (Foyer et al., 1994; Asada, 2000). 식물체에는 이러한 이유로 여러 가지 항산화물질을 포함하고 있으며, 클로로필 유도체는 강력한 산화제 혹은 항산화제의 원천이 되어 질 수 있을 것으로 생각된다.

Jasushi 등(1985) 의하면 클로로필과 페오피틴이 암소에 저장된 식물식용유의 자체 산화를 막으며 수소 제공(hydrogen donation) 기작이 라디칼연쇄반응(radical chain reaction)을 파괴한다고 하였다. 또 그들은 포르피린(porphyrin)의 화학적 구조가 항산화활성에 중요한 것으로 보고하였다. Hoshina 등(1998)은 클로로필(chlorophyll)이 금속이 없는(metal free) 형태의 클로로필 유도체보다 우수한 항산화력을 보여 지방의 자동산화 저해에 포르피린 고리가 중요함을 확인하였다. Sakata 등(1990)은 대합조개에서 클로로필의 유도체인 페로폴라이드 에이(pheophoride a)와 연관된 물질들이 이 생물체의 항산화력에 가장 중요하다고 보고하였다. 합성 메탈로 클로로필(metallo-chlorophyll) 유도체, 특히 구리 킬레이트 클로로필(Cu-chelated chlorophyll) 물질의 항산화활성은 그대로의 클로로필이나 항산화력이 미약한 마그네슘이 없는(Mg free) 유도체보다 훨씬 높다고 보고하였다. 이와 같이 클로로필에 대한 연구는 거의 대부분이 핵 중앙에 위치한 마그네슘을 제거하거나 다른 금속으로 치환하여 안정된 형태로 만들어낸 클로로필린(chlorophyllin) 에 국한되어 있다.

클로로필이 야채류에 높은 함량 및 천연에 광범위하게 존재하며, 식품가공과 인체섭취 시의 분해 등의 이유로 인해 천연 클로로필 대사산물이 건강에 영향을 주는지에 대한 의문이 증폭되고 관련된 항산화 활성과 함량 의존적 반응(dose dependent response) 에 대해 거의 자료가 거의 없는 현 시점에, 본 발명의 녹차로부터 클로로필 및 클로로필 유도체 자체를 정제된 형태로 얻고 이들 자체의 항산화활성과 항발암활성 (anticarcinogenecity)을 검정하고자 하였다.

본 발명의 발명자들은 인간의 건강을 위한 클로로필 및 클로로필 유도체를 포함하는 클로로필류의 생리활성적 고찰과 이러한 색소계 화합물의 사용에 대한 특성을 파악하기 위하여 녹차로부터 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a, 페오피틴 b 등 클로로필 유도체를 정제된 형태로 획득하였고, 분리된 각 색소 화합물에 대한 항산화 활성 및 항암활성을 검정한 결과, 클로로필류의 높은 항산화 및 항암 활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 상기 녹차로부터 분리된 클로로필류를 포함하는 항암 조성물 및 건강 보조식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명에 따라 녹차로부터 추출되는 클로로필류는 항암활성을 가지는 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a 및 페오피틴 b를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 클로로필류는 함량이 0.1 내지 20 mg/g 범위로 포함되는 것을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명의 암 개선 및 예방용 건강 보조식품은, 상기 녹차로부터 분리된 클로로필류를 유효성분으로 하는 항암 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 항암 조성물을 녹차로부터 분리된 클로로필류를 위주로 하여 구체적으로 설명한다. 또한, 하기 명세서에서 클로로필류가 의미하는 것은 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b이다.

본 발명의 항암 조성물에 포함된 클로로필류를 녹차로부터 수득하는 일례는 다음과 같다.

먼저, 녹차 분말을 제조하기 위하여 녹차의 잎을 건조하고 분쇄하여 건조 분말을 만드는데, 이렇게 건조시킨 녹차 잎은 다양한 방법으로 분쇄하여 분말화한다.

상기 녹차 분말은 아세톤을 용매로 하여 클로로필류를 추출한다. 아세톤은 녹차 분말 중량대비 5 내지 20 배의 중량으로 사용할 수 있으며, 상기 추출은 저온의 암조건 추출, 상온 추출, 환류추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 응용할 수 있다.

저온 암조건 추출의 경우 냉장 조건, 구체적으로 3 내지 5 ℃에서 이루어지며, 10 내지 24 시간동안 추출할 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 추출효율이 높게 나타났다. 상온 추출의 경우 구체적으로 20 내지 25 ℃에서 이루어지며, 22 내지 24 시간동안 추출할 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 추출 효율이높게 나타났다. 초음파 추출의 경우 37 내지 40 ℃에서 이루어진 경우 추출시간이 160 내지 180 분의 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 추출 효율이 높게 나타났다. 환류추출의 경우 75 내지 80 ℃에서 이루어진 경우 추출시간이 120 내지 180 분의 경우 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 추출효율이 높게 나타났다.

저온 암조건 추출, 상온추출, 초음파 추출 및 환류 추출을 비교할 경우, 클로로필 및 이의 유도체를 다량으로 얻기 위해서는 환류추출이 더욱 바람직하며, 작업의 편이성을 위해서는 초음파 추출도 가능하다.

상기와 같이, 녹차의 건조 분말을 아세톤에 직접 침지하여 추출물을 얻어내는 것은, 녹차에 함유되어 있는 페놀성 및 극성물질을 제거하기 위해 녹차를 열수로 수차례 추출하고, 여과한 잔사를 건조 및 재분쇄하여 다시 아세톤에 침지하여 추출물을 얻는 기존의 방법과 비교할 경우, 열수를 사용한 극성물질 추출시 고온 및 물에 의해 야기되는 클로로필류의 열분해 및 산화에 따라 구조적으로 파괴되는 양상을 억제할 수 있고, 열수 추출 후 건조 및 재분쇄 등 부수적으로 발생되는 단계별 추출 외 작업을 간소화할 수 있는 잇점이 있다.

또한, 기존의 방법에서 극성물질의 용출 및 제거를 위해 수행된 수차례의 열수추출은 고온과 물의 사용으로 인해 클로로필류가 열분해와 산화에 의하여 구조적으로 파괴되는 현상이 수반된다.

반면, 본 발명에서는 하기한 저온 침지 및 헥산분배를 이용하여 아세톤 추출물 중 극성물질을 완전히 제거함과 동시에 고온 및 물에 의해 발생될 수 있는 클로로필류의 열 및 산화에 의한 분해를 방지하여, 구조적으로 안정하게 클로로필류를 고순도로 다량 추출할 수 있게 한다.

상기와 같이 아세톤을 사용하여 추출한 여액은 저온(4 내지 -20 ℃)에서 12 내지 24 시간동안 정치하여 불용성 침전물을 여과한다. 상기 불용성 침전물에는 저온의 아세톤 상태에서는 용해도가 극히 낮아져 재결정화 되는 당, 배당체, 페놀성 물질, 극성 단백질 및 비타민 결합체 등 다양한 극성물질이 포함되어 있으며, 이를 저온에서 방치하여 침전물을 형성한 후 여과함으로써 아세톤에 대하여 용해도가 떨어지는 극성물질의 일부를 비열처리를 통해 제거할 수 있는 잇점이 있다.

상기와 같이 저온에서 방치하여 불용성 침전물을 제거한 여액에는 아직 일부 극성물질 및 중간극성 물질이 공존하고 있으므로, 구조적 파괴를 최소화 할 수 있는 비열처리 방법인 용매분배를 이용하여 혼재된 극성물질 및 중간극성 물질을 완전히 제거한다.

즉, 불용성 침전물이 제거된 아세톤 여액에 포화식염수 및 증류수를 첨가하고, 여기에 비극성 용매이면서 비중이 낮은 헥산을 첨가하여 격렬히 흔들어 준 후 층 분리를 유도하고, 클로로필류가 용해되어 있는 상층인 헥산 층을 회수함으로써, 클로로필류를 극성물질의 혼입이 전혀 없이 분리회수 할 수 있다.

한편, 아세톤은 유기용매이면서 그 외 기타 유기용매나 증류수와 잘 섞이는 특징이 있는데, 아세톤 추출물에서 극성물질을 제거하기 위해 증류수 혹은 극성용매를 단순히 첨가할 경우 상기와 같이 아세톤과 그 외 유기용매 및 증류수가 서로 잘 섞이는 특징으로 인해 층 분리가 유도되질 않고 서로 섞여버리는 현상이 발생되므로 실제 용매의 극성을 이용한 층 분리를 통해서는 아세톤 추출물 중 중간극성 및 극성물질의 제거가 불가능하다.

이에, 본 발명에서는 녹차로부터 클로로필류를 수득하기 위하여 아세톤 추출물에 혼재된 일부 중간극성 및 극성물질을 제거하기 위하여 포화식염수를 사용하였다. 이와 같이 포화식염수를 사용하는 방법은 비열처리에 의한 방법이므로 열처리에 의해 야기되는 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 아세톤 추출물에 포화식염수와 증류수를 동시에 넣게 되면 증류수와 함께 사용된 포화식염수는 극성용매로 작용하게 되지만 첨가된 포화상태의 소금에 의해 증류수가 거의 용질로 포화된 상태가 되기 때문에 아세톤에 녹아있던 극성물질은 녹일 수 있으나 비극성 물질까지 용해시킬 수 있는 수준의 용해도는 완전히 상실한 상태가 된다. 이때 비극성 용매인 헥산을 첨가하면 아세톤 추출물에 함유되어 있던 비극성 물질인 클로로필류가 자연스럽게 포화식염수 보다는 상대적으로 극성의 친화성이 월등히 높은 헥산 층으로 이행하게 되며, 헥산 층으로 이행하지 못한 극성물질은 식염수 층으로 이행되므로, 헥산층으로 극성물질이 혼입되는 것을 배제할 수 있다.

상기 헥산 분배를 이용하여 중간극성 및 극성물질을 제거하고 고순도의 클로로필류를 함유한 헥산용액에서 용매로 사용한 헥산을 제거한 녹차 아세톤 추출물은 농축시킨 후 컬럼크로마토그래피를 수행하여 클로로필 및 이의 유도체의 분획을 얻고 각 분획을 농축 건조하여 재용해한 다음 분취 HPLC를 사용하여 순수 분리한다.

얻어진 클로로필류의 구조는 MS 등의 다양한 분광분석법으로 동정하였으며, 그 결과 클로로필과 페오피틴임을 확인하였다.

본 발명에서는 현시점에서 녹차로부터 이상적으로 클로로필류를 수득할 수 있는 방법을 상술하였으나, 상기 클로로필류를 분리하는 방법에 본 발명이 한정되는 것이 아님은 자명할 것이다. 본 발명의 항암 조성물에 포함되는 클로로필류는 과거 또는 향후 개선 및 개발될 식물체로부터 클로로필류를 분리하는 방법에 의하여 분리 수득될 수 있음은 물론이다.

클로로필은 자연에서 가장 광범위하게 발견되는 색소이며, 식물체에 함유된 높은 함량, 인간의 소화과정 및 식품가공 과정에서의 분해 등 클로로필 및 대사산물이 건강에 미치는 영향에 대해 많은 연구자들이 관심을 가져왔다.

현재까지 보고된 클로로필의 생리활성과 관련된 자료를 검토한 결과 클로로필과 페오피틴이 암소에 저장된 식물성 기름의 자연산화를 예방하는 것으로 알려져 있고, 또한 라디칼의 연쇄반응을 차단하는 수소 공여 기작이 제시된 바 있다.

Hoshina 등은 클로로필이 금속이온과 결합되지 않은 클로로필 유도체보다 더 강력한 항산화제이며, 지질 자동산화의 억제에 있어 포르피린 고리(porphyrin ring)의 중요성을 보고하였다.

본 발명에서는 녹차로부터 분리된 클로로필류인 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b에 대해서는 지질과산화 억제작용과 물/리놀산 에멀젼(water/linoleic acid emulsion)에서의 β-카로틴 블리칭 분석(β-carotene bleaching assay)을 수행하여 이들의 항산화적 활성을 검정하였으며, MTT 분석을 통한 암세포증식 억제 활성과 흰쥐(rat)의 대장에서 헴(heme)에 의하여 유발되는 점막세포 과도증식(hyperproliferation)에 대한 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b의 저해효과를 검정하였다.

본 발명의 녹차로부터 분리된 클로로필류를 포함하는 항암 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 및 동맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 점막 또는 국소, 경피 등에 적용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 항암 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 항암 조성물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 20 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 10 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 항암 조성물은 널리 식용되는 녹차로부터 분리 동정된 클로로필류를 유효성분으로 포함하므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 암의 개선 및 예방 효과를 갖는 건강 보조식품으로 개발될 수 있다.

본 발명의 항암 조성물을 건강 보조식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이다.

즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수 있으며, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.

상기한 본 발명에 의하면, 기존에 널리 알려진 녹차 카테킨 외에도 녹차의 클로로필이 항암 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면 항암 조성물의 새로운 원천을 제시할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 녹차 아세톤 추출물을 저온 침지 및 헥산 분획을 수행하여 중간극성 및 극성물질을 제거하여 클로로필 및 페오피틴의 순도를 향상시킨 아세톤 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 녹차 아세톤 추출물로부터 분리된 클로로필 a를 동정한 질량분석스펙트럼이다.
도 3은 녹차 아세톤 추출물로부터 분리된 클로로필 b를 동정한 질량분석스펙트럼이다.
도 4는 녹차 아세톤 추출물로부터 분리된 페오피틴 a를 동정한 질량분석스펙트럼이다.
도 5는 녹차 아세톤 추출물로부터 분리된 페오피틴 b를 동정한 질량분석스펙트럼이다.
도 6은 녹차로부터 분리된 클로로필류의 리놀산 산화에 따른 퍼옥시기 생성에 대한 항산화활성(A)과 저해율(B)을 나타낸 것이다.
도 7은 물/리놀산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭 분석법(β-carotene bleaching assay method)에 의하여 측정된 클로로필류의 항산화활성을 나타낸 것이다.
도 8은 대장 상피세포 분화에 대한 헴(heme)과 클로로필류의 영향을 나타낸 것이다.

이하. 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹차로부터 클로로필류의 분리

녹차 잎을 건조 및 분쇄하여 60 mesh 체로 통과시킨 후 분쇄시료 20g에 아세톤 2L를 첨가하고 40℃ 조건의 초음파추출기에서 3시간 추출하였으며, 같은 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출된 용액은 모두 합쳐 Whatman No. 2 여지를 이용하여 여과하였고, -20℃ 저온고에서 24시간 동안 정치하면서 불용성 침전물을 재 여과하였다.

여과된 아세톤 추출액 중 600mL를 분획여두에 옮기고, 여기에 포화식염수 200mL와 증류수 1,000mL를 첨가하고, 다시 헥산 300mL를 첨가하여 격렬하게 흔들어 준 후 층 분리를 유도하였으며, 층이 분리된 후 아래층의 포화식염수 층은 버리고 상층의 헥산 층을 완전 회수하였다.

여과된 헥산 층은 40℃ 감압농축장치에서 농축하여 헥산 용매가 제거된 흑갈색 겔(gel) 상태의 녹차 아세톤 추출물을 제조하였다.

상기 녹차 아세톤 추출물을 대상으로 분취(preparative) HPLC(Agillent 1200 series, USA)를 이용하여 분리를 수행하였는데, 분취 HPLC의 분리 조건으로 컬럼은 HiQ sil C18-10 (21.0 × 250mm, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 430nm, 분당 유속 10mL, 분석 용매로 A용매는 75% 메탄올, B용매는 에칠아세테이트를 농도구배(0분 : 70% A, 25분 : 15% A, 26분 : 70% A, 35분 : 70% A)로 사용하였고, 시료 주입량은 2mL로 조절하여 고순도 분리를 실시하였다.

실시예 2. 녹차로부터 분리된 클로로필류의 확인

차나무 잎 아세톤 추출물에서 순수 분리를 수행한 결과 황색, 녹색 및 갈색을 나타내는 수종의 화합물을 분리하였으며, 이들 분리물의 자외가시 분광특성 및 질량분석을 수행하여 각 화합물을 동정하였다. 그 결과 분리화합물은 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b로 동정되었다. 다음 도 1에는 녹차 아세톤 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타내었다. 도 2 내지 5는 각각 녹차 아세톤 추출물로부터 분리한 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a 및 페오피틴 b를 각각 동정한 질량분석스펙트럼이다. 표 1에는 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a 및 페오피틴 b의 동정 확인 결과를 정리하여 나타내었다.

Compound	λmax (nm)	MS (m/z, M+H)
chlorophyll b	462, 598, 648	907
chlorophyll a	414, 432, 582, 616, 664	894
pheophytin b	414, 436, 598, 654	886
pheophytin a	410, 505, 535, 608, 665	872

실험예 1. 녹차로부터 분리한 클로로필류의 지질과산화 저해활성

녹차로부터 분리한 클로로필류에 대한 항산화 활성 검정은 Nagai 등(2005)에 의한 방법을 변형하여 사용하였다. 100 ㎍/㎖의 녹차 아세톤 추출물과 0.2 μM의 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b의 시료 0.083 ㎖에 0.208 ㎖의 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)을 혼합하고 다시 0.208 ㎖의 2.5% (w/v) 리놀산(linoleic acid)을 첨가하였다. 산화 유도 시작은 0.021 ㎖의 0.1 M 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드[2,2‘-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride]를 첨가하여 30 ℃, 암상태로 반응시키면서부터 시작하여 72시간 까지 매 12시간 마다 리놀산이 산화되는 정도를 검정하였다. 산화반응 유도 시작 후 12시간 마다 상기 기술한 반응액 0.1 ㎖에 75% 에탄올 4.7 ㎖, 30 % 암모늄 티오시아나이트(ammonium thiocyanate) 0.1 ㎖, 3.5% HCl이 포함된 0.02M 페러스 클로라이드(ferrous chloride) 0.1 ㎖를 혼합한 후에 3분 동안 정치하여 두었다가 UV-1200 UV/VIS 분광분석기(spectrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 시간의 경과에 따른 과산화물 생성정도를 500nm에서 흡광도를 측정하여 검정하였다. 대조구는 녹차 아세톤 추출물 및 클로로필 유도체 시료를 첨가하지 않고 리놀산 만을 첨가한 것을 사용하였으며, α-토코페롤(VE)을 동일한 농도의 수준으로 제조하여 사용하였다. 72시간 후에 대조구 흡광도에 대한 처리구의 최종 흡광도의 비율로 계산하여 최종 저해율(%)을 산출하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.

지질과산화는 유리기(free radical)에 의해 불포화지방산의 메틸렌(-CH₂-)기로부터 수소원자(H·)가 탈취됨에 따라 개시(initiation)된다. 이를 흔히 일으키는 라디칼로는 ·OH, RO·, ROO·, HO₂·등이 있고 O₂ ^-과 H₂O₂는 그 자체로는 그런 능력이 없다. 수소탈취에 의해 생긴 알킬기(R·)은 분자 재구성을 통해 디엔(diene) 형태로 바뀌고 이것이 다시 산소와 결합하여 과산화기(peroxy radical)를 형성한다. 과산화기는 전술한 바대로 다시 다른 불포화지방산으로부터 수소를 탈취함으로써 일종의 연쇄반응(chain reaction)이 진행되기 때문에 과산화물이 급속하게 증가하게 된다. 따라서 항산화 활성을 평가하기 위해서는 지질과산화 개시단계에서의 평가가 매우 중요하며, 특히 클로로필 혹은 이들의 유도체와 같이 높은 항산화 활성을 가지지만 안정성이 검정되어야 하는 활성소재를 검증하는 경우에서는 지질과산화 초기단계에서의 항산화 활성 평가가 매우 중요하다고 할 수 있다.

클로로필류를 0.2 μM 수준으로 처리한 후 리놀산의 과산화 초기 단계에서의 항산화 활성을 검정하여 본 결과, 대조군이 12시간부터 빠르게 흡광도가 증가하는 반면 클로로필류의 경우 대조군에 비하여 증가속도 비율이 크게 감소하는 결과를 나타내었다. 대조군인 비타민 E와 클로로필류 각각의 경우 12시간 까지는 큰 차이를 나타내지 않다가 24시간 이후에는 각각의 지질과산화 저해활성이 다르게 유도되었다. 즉, 각각의 클로로필류들은 대조군에 비하여 24시간 이후부터 1/2 ～ 1/7 수준의 흡광도를 나타내어 지질과산화에 대한 높은 저해활성을 가지는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 클로로필류가 지질과산화에 있어 중간 생성물인 과산화기의 형성에 있어 디엔 형태로 만들어진 알킬기를 안정화 시키거나 산소의 결합을 막아 급속하게 형성되는 과산화물의 형성을 억제하는 작용기전을 나타내는 것으로 생각된다.

도 6에 의하면, 최종 72시간이 경과한 후 지질과산화에 대한 저해활성을 클로로필 유도체별로 살펴본 결과 클로로필 a가 약 76.2%의 지질과산화 저해율을 나타내어 가장 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 그 다음으로는 클로로필 b가 62.7%, 페오피틴 b가 54.4%로 높아 45.4%를 나타낸 대조구 비타민 E보다 높은 활성을 나타내었으며, 페오피틴 a의 경우에서는 39.5%로 대조구보다 낮은 활성을 나타내었다.

또한 시간의 경과에 따라 지질과산화 저해활성의 변화가 크지 않은 클로로필 a는 클로로필 b보다 양호한 구조적 안정성을 가진다고 판단되어진다. 이러한 연구결과는 클로로필이 식물체가 나타내는 항산화 활성의 활성본체로 작용할 수 있다는 결과를 제시하고 있다.

실험예 2. 녹차로부터 분리된 클로로필류의 β-카로틴 블리칭 분석(β- carotene bleaching assay)

녹차로부터 분리된 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b의 항산화 활성 검정을 위하여 물/리놀산 에멀젼에서 β-카로틴 블리칭에 대한 지연능력을 Miller(1971)에 의한 방법을 변형하여 검토하였다. β-카로틴은 다른 항산화제가 없을 경우 빠른 퇴색을 보이며 유리 리놀산 기가 β-카로틴을 공격하여 이중결합을 해리하면서 특정적인 색깔 특성을 잃게 된다. 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b의 농도는 0.1, 1, 50, 100, 200, 400, 500 μM 수준으로 제조하였고, 대조군으로 동일 농도의 BHT를 사용하였다.

에멀젼의 제조를 위하여 β-카로틴 용액(1 ㎎/㎖ in chloroform) 1 ㎖, 40 ㎕의 리놀산(20 ㎎)와 400 ㎕ Triton X-100(100㎎)을 플라스크에 넣은 후 질소 존재 하에서 클로로포름을 제거한 후, 사전에 산소로 30분간 산화시킨 이온수 100 ㎖의 증류수를 천천히 넣으면서 강하게 교반하여 안정한 에멀젼을 형성하였다. 에멀젼 용액 3 ㎖를 분광분석학적 큐벳(spectrophotometric cuvette, light path 10 mm)에 넣고 다시 농도별로 조제된 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 각 0.2 ㎖를 첨가한 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 최초 흡광도를 측정한 후 반응용액을 50℃ 수욕상에서 암상태로 보관하면서 15분 간격으로 최대 120분까지 측정하였고, 항산화 활성 정도는 대조구의 광학 밀도(optical density, D.O.initial - D.O. final)가 감소된 양을 100% 산화한 것으로 산정하여 계산하였으며 색소가 없는 대조구에 대한 산화의 저해비율로 나타내었다. 그 결과는 다음 도 7에 나타내었다.

녹차로부터 분리된 클로로필 유도체들을 대상으로 0.1 ～ 500 μM의 비교적 넓은 범위의 농도에서 β-카로틴 블리칭법을 이용해 항산화 활성을 검정한 결과 기름-물 에멀젼(oil-water emulsion)에서 가장 높은 산화저해 활성을 나타낸 것은 대조구로 사용된 식용유의 안전성을 유지하기 위해 사용되고 있는 BHT 였으며, 모든 클로로필 유도체들은 0.1 ～ 500 μM의 모든 농도에서 BHT 보다 낮은 수준의 산화저해 활성을 나타내었다.

BHT의 경우 1 ～ 50 μM 까지 산화 억제활성이 급격히 증가되다가, 50 ～ 500 μM까지는 산화 저해활성율이 약 85% 이상 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 클로로필 a를 제외한 다른 클로로필 유도체들은 1 ～ 50 μM 수준에서는 산화 저해활성이 급격히 증가되었다가 그 이상의 농도에서 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 페오피틴 a의 경우는 100 μM 이상의 농도에서 급격한 감소를 나타내었다.

β-카로틴 블리칭법을 이용한 항산화 활성에서 클로로필 a는 1 μM 수준에서 동일 농도의 BHT (25%) 보다는 낮은 활성(17%) 을 나타내었으나, 다른 클로로필 유도체 보다 2배 정도 높은 항산화 활성을 나타내었고, 50 μM이상의 농도에서는 다른 클로로필 유도체 보다 낮은 활성을 나타내었다. 이렇게 클로로필 a가 낮은 항산화 활성을 나타내는 것은 화학적 불안전성이 높기 때문이라고 보고된바 있으나(Usuki et al., 1984a), 본 발명에서 낮은 농도에서는 클로로필 a가 다른 클로로필 유도체보다 높은 지질과산화 저해활성과 β-카로틴 블리칭 저해활성을 나타낸 것을 고려하여 볼 때 클로로필 a의 안정성은 농도에 의해 좌우될 수 있다는 것을 추측해 볼 수 있다. 클로로필 a의 경우 낮은 농도에서는 다른 클로로필 유도체보다 높은 활성을 가지나, 안정성이 낮은 상태로 존재하게 되거나 높은 농도에서는 다른 클로로필 유도체보다 낮은 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 한편, 지질과산화 저해활성과 β-카로틴 블리칭법에서 클로로필 a의 항산화 활성이 서로 다르게 나타나는 것은 항산화 활성 측정방법의 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 클로로필 유도체의 지질과산화 저해활성 측정의 경우 리포피틱 시스템(lipophytic system)에서 퍼록사이드 전개(peroxide development)를 검정한 반면, β-카로틴 블리칭법은 수성 에멀젼(aqueous emulsion)을 이용하였기 때문에 서로 다른 결과가 유도된 것으로 사료되며, 불포화 지방산을 함유하는 반응액은 클로로필의 분해를 촉진하여 항산화력을 떨어드린다는 보고(Usuki et al., 1984b)를 고려할 경우 클로로필 유도체의 항산화 활성을 검정하는 경우 한 가지 이상의 방법을 적용하여 각각의 항산화 활성을 평가할 필요가 있다고 할 수 있다.

클로로필 유도체 중에서 가장 높은 β-카로틴 블리칭 저해활성을 나타낸 것은 페오피틴 b로서 100 μM의 경우 약 74%의 산화저해활성을 나타내어 대조구로 사용되어진 BHT의 산화저해활성(86%)과 상응하는 저해활성을 나타내었다. 페오피틴 a의 경우 페오피틴 b와 유사한 활성을 나타내다가, 100 μM 이상에서 급격한 감소를 나타내었고, 페오피틴 b의 경우에서도 100 μM 이상의 농도에서부터는 약한 감소를 나타내었으며, 클로로필 a는 100 μM 이상에서도 약한 증가를 나타내었다. 대부분의 경우에 항산화 활성은 항산화제의 농도가 어느 수준에 도달할 때까지는 증가하지만 더 높은 농도에서는 촉진제(pro-oxidant)로 작용하여 항산화 활성이 감소한다는 결과를 고려하여 볼 때, 클로로필 a는 비교적 다른 클로로필 유도체보다 낮은 활성을 나타내었지만 500 μM 이상에서도 촉진제로 작용하지 않아 고농도에서도 안정되게 적용되어질 수 있음을 확인할 수 있었다. 클로로필 b는 β-카로틴 블리칭법을 적용하지 않았는데 그 이유는 클로로필 b가 아세톤 용액 내에서 462nm에서 강하게 흡광특성을 나타내어 447, 474nm에서 흡수되는 β-카로틴과 백그라운드 방해(background interference)를 유발하기 때문이다.

실험예 3. 녹차로부터 분리된 클로로필 유도체의 암세포 증식 억제율 검정

녹차로부터 분리된 클로로필 유도체의 암 세포주(cancer cell line)에 대한 세포증식 억제율을 검정하기 위하여 인간 폐암 세포주 A549, 위암 세포주 ACHN, 전립선암 세포주 LNCaP, 결장암 세포주 HCT-15, 유방암세포주 MCF-7를 대상으로 분리 클로로필 유도체를 농도별(200, 100, 50 ㎍/㎖)로 처리하고, MTT 분석을 통해 세포생존율(cell viability)을 검정하였다. 각 암세포주를 96 웰 플레이트에 (1 × 10⁴/well) 배양한 후에 시료를 농도별로 처리하고 36시간동안 더 배양하였다. 세포 생존율은 시판 키트(Cell Titer 96 non-radioactive cell proliferation assay kit, Promega, Madison, WI)를 통하여 검정하였는데, tetrazolium compound MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium, inner salt]와 electron coupling reagent phenazine methosulfate (PMS)를 포함하는 혼합물 20 ㎕를 각 웰에 첨가하고 다시 1시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양한 후 enzyme-linked immunosorbent assay plate reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

Compound	Concentration (㎍/㎖)	Viable Cell (% of Control)/Human Cancer Cell line*
		A549	ACHN	LNCaP	HCT15	MCF-7
ChlA	200	68.0± 4.0	76.0± 7.0	68.0± 7.0	54.0± 3.0	45.0± 3.0
	100	76.0± 6.0	82.0± 5.0	76.0± 6.0	56.0± 2.0	69.0± 2.0
	50	82.0± 3.0	83.0± 8.0	76.0± 8.0	59.0± 3.0	72.0± 1.0
ChlB	200	64.0± 6.0	64.0± 3.0	64.0± 3.0	58.0± 2.0	48.0± 2.0
	100	77.0± 5.0	78.0± 5.0	72.0± 4.0	66.0± 1.0	64.0± 1.0
	50	80.0± 3.0	83.0± 3.0	78.0± 3.0	70.0± 3.0	78.0± 2.0
PhyA	200	62.0± 2.0	76.0± 2.0	61.0± 2.0	51.0± 2.0	51.0± 2.0
	100	73.0± 3.0	85.0± 3.0	70.0± 3.0	55.0± 2.0	70.0± 2.0
	50	80.0± 4.0	91.0± 1.0	80.0± 4.0	71.0± 3.0	70.0± 3.0
PhyB	200	66.0± 1.0	63.0± 5.0	63.0± 3.0	49.0± 2.0	58.0± 3.0
	100	71.0± 2.0	76.0± 3.0	71.0± 6.0	57.0± 3.0	64.0± 3.0
	50	79.0± 4.0	81.0± 6.0	78.0± 3.0	62.0± 4.0	70.0± 3.0
*After incubation with different concentrations of camellia extracts and isolated pigments at 37 ℃ for 36 h, the effect on cell growth was examined by MTT assay. The percentage of viable cells was compared with that of the vehicle-only control. This experiment was repeated three times. Result shown as mean ± S.D. (n=3)

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 녹차로부터 분리된 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 인간 암세포주에 대한 생육 및 증식억제 효과를 검정하기 위하여 폐암 세포주(A549), 신장암 세포주(ACHN), 결장암 세포주(HCT15), 전립선암 세포주(LNCaP)와 유방암 세포주(MCF-7)를 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 분리 클로로필류의 화합물 농도별 적용에 따른 세포독성 검정을 MTT 분석으로 수행한 결과 표 2에서 보는 바와 같이 녹차에서부터 분리한 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b 의 경우 모든 세포주에 대하여 비교적 낮은 활성을 나타내었는데, 이는 클로로필과 같은 색소 화합물은 이미 발생된 암세포주에 대한 독성에 근거하는 항암활성이 아닌 암 형성과정에서 발암물질과 결합하거나 발암물질이 세포와 부착되는 것을 막아 암발생 과정을 막는 메카니즘을 가질 수 있다고 판단되어진다.

실험예 4. 헴(Heme)에 의해 유도된 쥐 대장 상피 세포의 과도증식에 대한 클로로필 유도체의 저해효과 검정

일반적으로 가공육 및 적색고기의 섭취는 흰 살고기의 섭취에 비하여 대장에서의 암 발생 빈도를 높인다는 보고(Giovannucci et al., 1994; Norat et al., 2002; Chao et al., 2005)가 있으며, 이러한 위험성을 줄이기 위하여 인간은 많은 양의 야채와 과일을 섭취해야 한다(Potter, 1999). 적색고기 섭취로 인한 대장암 발생 위험에 대한 식이요법으로 야채를 섭취한다는 것은 아직 논쟁의 여지가 있으나 적색고기에 존재하는 헴(heme)은 철-포르피린(iron-porphyrin) 색소로 배설기관에서의 광원에 대한 대장 점막세포의 노출이 증가되어짐에 따라 세포독성을 나타낸다고 보고되어지고 있다. 그 결과로 대장세포(colonocyte)의 증식이 급속히 일어나게 되고 이것은 대장암으로의 발달에 있어 중요한 요소로 고려되어지고 있다.

또한, 많은 연구에서 헴(heme)이나 적색고기의 섭취는 광독소를 촉진시키고, 쥐의 대장에서 비정상적인 함몰점(aberrant crypt foci)의 수와 크기를 증대시켜 암발생과 연관된 발암전 전이상태(pre-noplastic lesion)를 유발한다고 보고되어지고 있다. 클로로필은 야채나 과일에 존재하는 색소로서 헴(heme)과 유사하게 평판의 포르피린 골격(porphyrin backbone)을 가지고 있으나, 포르피린 중간에 반응성이 높은 금속 이온 대신에 비반응성의 마그네슘 이온을 가지고 있다. 또한 클로로필이 헴(heme)과 반응하여 "샌드위치" 형태의 소수성 헴-클로로필 복합체(heme-chlorphyll complex)를 형성한다고 보고되어지고 있다.

따라서 본 발명에서는 클로로필류가 헴(heme)에 의해서 유도되는 대장 상피세포의 증식에 대한 저해효과가 있을 것으로 판단되어 흰쥐(Rat)의 대장 상피세포에 헴(heme)을 처리하여 세포증식과 발암과정을 유도하고 여기에 녹차로부터 분리한 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b를 첨가하여 헴(heme)에 의해 유도되는 세포 과도증식에서 클로로필 유도체들의 세포과도 증식 억제능을 검정하였다.

수컷 흰쥐(SPF Wistar rat, 8주령, WU, Harlen)를 대상으로 대장과 소장을 적출하고 균질화 한 후 1 ㎖의 주사기(syringe plunger)를 이용하여 50 메쉬의 멸균 스테인레스 스틸 체를 통과 시키고, 셀 리커버리 용액(Cell Recovery Solution, BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하여 4 ℃에서 16시간 동안 배양하여 상피(epithelium)와 기질(stroma)을 분리한 후 10 배의 RIPA 완충액을 첨가하여 대장 상피 세포(young adult mouse colon cells, YAMC)를 분리하였다. 분리된 YAMC 세포를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum), 100 units/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)(GIBCO BRL)이 첨가된 40 ～ 50% confluence in RPMI 1640 glutaMAX media (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)에 접종하고 37℃ 습윤 인큐베이터(humidified incubator)에서 2일 동안 8% CO₂ 농도로 배양하였다. 세포를 24 웰 플레이트에 초기 농도를 웰 당 1× 10⁴ cell/로 조정하고 헴(heme)(Sigma, US)을 웰 당 2.5㎍ 수준으로 처리한 것을 헴(heme) 처리구로 하고, 여기에 다시 물로 희석된 클로로필 a, b 및 페오피틴 a, b를 각각 동일한 농도의 수준으로 처리하여 처리구로 하였다. 여기에 다시 [methyl-3H] thymidine을 웰 당 0.5 mCi의 수준으로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 세포를 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)으로 2회 세척한 후 아이스-콜드 트리클로로아세트산(ice-cold trichloroacetic acid) (5%)를 이용하여 세포를 고정 침전시켰다. 침전된 세포를 0.3 N NaOH에 재용해한 후 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)(MicroBeta™ Trilux, Wallac Oy, Turku, Finland)를 이용하여 [methyl-3H] 티미딘(thymidine)의 결합정도를 측정하여 세포의 증식 억제정도를 검정하였다. 그 결과는 다음 도 8에 나타내었으며, 도 8에서 수치는 스투던트 t-테스트(Student’t-test)에 의하여 측정되었고, “*”는 대조구와 유의적으로 차이를 가지는 데이터를 나타낸다[p < 0.05].

YAMC 세포를 대상으로 헴(heme)을 처리하여 세포의 증식을 유도한 결과 65.8 dpm 3H/㎍DNA를 나타내어 헴(heme)을 처리하지 않은 대조구(38.6 dpm 3H/㎍DNA)에 비하여 1.7배 높은 과도 세포 증식을 나타내었으나, 클로로필 a를 2.5 ㎍을 처리한 경우 약 21.8 dpm 3H/㎍DNA를 나타내어 헴(heme)에 의한 대장 상피세포의 증식률을 66.9% 저해하였으며, 클로로필 b를 2.5 ㎍을 처리한 경우 헴(heme) 처리에 의한 대장 상피세포 증식률을 54.3% 저해하는 결과를 나타내어 통계학적으로 헴(heme)을 처리하지 않은 대조구(control)와 유사한 수준의 세포증식 비율을 나타내었다. 반면 클로로필 분자구조에서 중앙 핵에 마그네슘이 결여되어 있는 페오피틴 처리구에서는 헴(heme)에 의해서 유도되어지는 대장 상피세포의 과도증식을 억제하는 효과가 관찰되지 않았다.

상기와 같은 결과에 의하면, 페오피틴 a 및 b 처리구 보다 상대적으로 상피세포의 과도증식을 강력히 저해한 클로로필 a와 b의 경우는 활성이 높은 항발암성 소재(anticarcinogen agent)로 사용되어질 수 있음을 나타낸다고 하겠다. 클로로필이 헴(heme)에 의해 유발되는 대장 상피세포의 과도증식과 이에 따른 발암과정을 억제할 수 있는 이유는 헴-클로로필 복합체(heme-chlorophyll complex) 형성 이외에 클로로필의 구조적 특징에 기인하는 다른 작용기전이 있는 것으로 생각된다.

클로로필과 페오피틴의 구조적 차이는 테트라피롤(tetrapyrrole) 구조 중앙에 마그네슘의 존재 유무로 구별되며, 클로로필이 위장을 통과하는 경우 산성조건에 의하여 클로로필에 포함되어져 있는 마그네슘이 쉽게 떨어져 나온다는 결과 (Ferruzzl et al., 2001)와 마그네슘 이온이 헴(heme)을 침전시키는 것을 촉진한다는 보고(Sesink et al., 1999)로 볼 때, 클로로필에 포함되어진 마그네슘 이온이 클로로필이 항발암활성 소재로 사용되어질 수 있는데 중요한 역할을 하고 있다고 생각되어지고, 이러한 결과를 통하여 클로로필은 헴(heme)에 의해서 유도되어질 수 있는 대장 상피세포의 증식과 광독성에 의해 유도되어지는 발암과정에서 효과적인 보호제로서 작용할 수 있을 것으로 판단된다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

도면에서 Chl은 클로로필, Phy는 페오피틴, VE는 토코페롤, GT는 녹차 추출물을 의미한다.

Claims (2)

1. 녹차 잎을 건조시키고 분쇄하여 녹차 분말을 제조하는 단계; 상기 녹차 분말을 아세톤에 침지하고 여과하여 얻은 여액을 4 ~ -20℃의 저온에서 12~24시간 동안 정치하여 불용성 침전물을 제거하는 단계; 상기 불용성 침전물이 제거된 아세톤 추출물에 포화식염수, 증류수 및 헥산을 첨가하여 진탕한 후 헥산 분획을 취하는 단계; 및 상기 헥산 분획을 감압 농축하여 헥산을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암활성을 가지는 클로로필 a, 클로로필 b, 페오피틴 a 및 페오피틴 b를 포함하는 클로로필류의 추출방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 암은 대장암으로, 대장 상피세포 과도 증식 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 클로로필류의 추출방법.
   
   
   

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