KR20140076590A - 세포 및/또는 입자 분리 시스템 및 방법 - Google Patents

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어쿠솔트 에이비
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Abstract

본 발명은 현탁액에 존재하는 대상으로부터 하위 집단의 대상을 분리하는 방법 및 시스템에 관한 것으로, 이때, 상기 현탁액은 1차원 또는 2차원에서 작용하는 음향력에 노출되면 상기 대상이 크기 및/또는 질량 밀도 및/또는 압축률과 관련하여 비슷한 성질을 나타내는 집단으로 서로 분리되게 한다.

Description

세포 및/또는 입자 분리 시스템 및 방법{SYSTEM AND METHOD TO SEPARATE CELLS AND/OR PARTICLES}
본 발명은 현탁액에 존재하는 세포 및/또는 입자 혼합물로부터 하위 집단의 세포 및/또는 입자를 분리하는 방법 및 시스템에 관한 것으로, 이때, 상기 현탁액은 1차원 또는 2차원에서 작용하는 음향력에 노출되면 상기 세포 및/또는 입자가 크기 및/또는 질량 밀도 및/또는 압축률과 관련하여 비슷한 성질을 나타내는 집단으로 서로 분리되게 한다.
마이크로유체 공학은 본질적으로 고성능의 세포 및 입자 취급이 매우 성공적인 것으로 밝혀진 영역이다. 지배적인 기술 플랫폼 일부는 고품질의 세포 처리를 위한 산업 및 임상 표준으로, 형광 활성 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS)(형광 검출 및 분류)와 코울터 계수기(크기 분포 측정)에서 볼 수 있다. 형광 꼬리표를 붙인 세포 특이적인 항체와 FACS 기법의 조합은 현대 세포생물학에 혁명의 길을 열었다. 그러나, 그러한 기법으로는 아직 어떠한 지표도 사용되지 않아, 아무런 생체 분자 수정이나 기타 세포 교란이 없는 세포 집단으로부터 특이적인 세포를 분류하는 것과 같은, 모든 문제를 해결할 수는 없다.
결정론적 측방 치환법, 수리동력학적 여과법, 유체영동 분리법 및 핀치드 플로우 분획법(pinched flow fractionation)과 같은 세포 및 입자를 분리하는 패시브(수동) 수리동력학적 기법들에 대해 광범위한 연구가 이루어졌다. 이들 기법은 전적으로 입자 크기와 관련된 분리 채널의 유체 동력학적 특성에 의해 좌우된다. 이러한 기법들은 보통 양호한 분리 특성을 나타내지만, 양호한 분리를 달성하기 위해서는 입자 농도가 낮아야 하므로 낮은 처리량으로 지장이 있다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 유전영동법 뿐만 아니라, 스플릿 신 플로우 분획법(split thin flow fractionation), 자기영동법, 광학적 방법을 포함하는 다수의 대안적인 접근법이 조사되었다. 이러한 접근법의 공통적인 특징은 입자/세포 궤도의 선택적인 편향을 초래하기 위하여 일반적인 유동 방향의 방향에 대해 가로지르도록 유도된, 적용된 역장(force field)을 이용하여 입자/세포가 분리된다는 점이다. 그러나, 이러한 기법 전부는 현재까지 생명과학 응용 분야에서 광범위한 응용가능성이 충분한, 고도의 입자/세포 구분 및/또는 입자 처리량으로 세포를 분리해내지 못했다. 음향영동법 또한 현탁액 중의 입자에 작용하는 음향력의 장을 이용하여 입자/세포 분리를 수행하는 것으로 나타났다. 음향영동법은 더 낮은 처리량의 제한을 받으며, 예컨대, 유전영동 기법에 비해, 이온 강도 또는 pH에 매우 의존적이지도 않다.
수성 현탁액 중의 종을 분리하기 위한 마이크로채널을 이용할 때의 일반적인 문제점은 작은 길이 규모와 관련된 층류로 인한 분산이다. 층류는 그러한 채널의 길이 방향(x)의 유체 속도(u)가 채널 폭(y 방향)과 높이(z 방향)에 대한 공간적인 위치에 의존함을 의미한다. 벽 근처에서 속도는 0에 접근하지만, 벌크에서 유속은 더 높다. 따라서, 입자/세포의 채널에서의 체류 시간은 사실상 초기의 측면 위치(y와 z)에 의해 좌우될 것이다. 즉, 채널의 횡방향 단면의 상이한 위치로 진입하는 세포/입자들은 상이한 속도로 채널을 통과할 것이다. 입자/세포들이 정확히 동일한 측면 위치에서 분리 채널로 진입하여, 동일한 속도로 분리 채널을 통과하여 흐를 때만, 분리가 정확하게 결정론적일 수 있다. 따라서, 그러한 분리 채널의 말단에서의 입자/세포 위치는 입자/세포의 초기 위치와 이용된 외부 역장의 함수이다.
결정론적 분리 결과의 요건을 만족시키기 위한 전제조건은 실제 분리 단계를 처리하는 채널 영역으로 진입하기 전에 유체 흐름의 yz 평면에 세포/입자들을 사전 정렬시키는 것이다. 사전 정렬은 y 축과 z 축을 따라 2차원의 외부 힘을 써서 달성할 수 있다.
US2009/0042310호는 음향력을 이용한 입자의 분리를 개시하고 있는데, 이때, 상기 음향력은 세포들을 분리하고자 2회 적용한 1차원의 힘이며, 이때, 그것들은 입자들을 유동률로 이동시킨다.
Mannebeg O 등(J of micromechanics and microengineering, 2008, 18, page 1-9)은 어떻게 1차원의 힘이 x 축과 y 축에 있는 지를 개시하고 있다.
순환종양세포(circulating tumor cells, CTC) 단리를 위해, 물리적인 예컨대, 종양 세포를 포획하는 채널의 물리적 구조 및 마이크로비즈 또는 마이크로포스트를 포함하는 생화학적 친화도를 기반으로 한 접근법과 같은 몇몇 전략들이 제안되었다. 지금까지, 전이성 암 환자로부터 CTC를 농축하는 가장 성공적인 기법은 면역표지법(immune-labeling)에 의존한다. 일반 상피세포와 대다수의 상피 유래 종양 세포는 상피세포 부착단백질(EpCAM) 및 서로 다른 시토케라틴(CK)을 발현하며, 이것들은 정상적인 혈액 세포에는 존재하지 않는다. 이러한 지표들은 이용할 수 있는 CTC 단리법에 널리 이용되고 있다.
그러나, EpCAM 또는 CK 음성 CTC들을 배제한다는 것이 단점이다. CTC 중에서도 형태와 항원 발현의 상당한 차이는 결과적으로 CTC 농축을 증진시키기 위한 혁신적인 접근법을 필요로 한다. 본 발명은 위에서 정의된 이러한 시스템의 단점에 초점을 두고 있다.
음향 정상파 역장은 마이크로유체 시스템에서 세포를 집중시키는 데 광범위하게 이용되었으며, 유동 채널이 채널 규모로 정의된 음향 공명기로 작용함에 따라, 동시에 유로 역할도 한다는 사실을 이용한다. 입자들의 고유한 음향물리적 매개변수를 기초로 하여 음향 역장의 서로 다른 입자들을 분리하고자 하는 노력이 보고된 바 있으나, 여전히 분리 단계를 수행하는 역장에서의 체류 시간 차이를 유발하는 포물선형 유동 프로파일이 문제가 된다. 본 발명이 이루어진 시점에서, 하나의, 그리고 동일한 주파수를 이용하여 두 개의 음향파를 생성하는 것은 불가능하다는 것은 주지의 일반 상식이었다. 우연하게도 본 발명자들은 이용하는 주파수들에서 이를 시도하였고, 그것이 가능하다는 점을 발견했다. 과학자로서 보통은 먼저 가설적으로 수학식을 이용하여 성공 가능성을 계산하며, 하나의 그리고 동일한 주파수를 이용하여 음향 정상파를 만드는 것이 이론상으로는 가능하지 않을 것이므로, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 그러한 결과를 얻고자 시도조차 하지 않았을 것이다.
본 발명은 음향 정상파 역장이 2차원 및 1차원 모두에서, 즉, 3차원에서 세포/입자들에 작용하도록 채널을 설계함으로써, 세포 및 입자들의 사전 정렬이 어떻게 수행될 수 있는지를 개시한다. 무세포 완충용액 도입과 함께 먼저 2차원의 힘을 이용한 다음, 1차원의 힘을 이용함으로써, 이전에 비해 더 높은 분해능으로 특이적인 분리 경로로 세포를 분리하고 집중시키는 것이 가능하다.
이어서, 사전 정렬된 입자/세포들은 음향 정상파 공명 모드를 위해 설계된 마이크로채널 세그먼트로 들어가고, 이 마이크로채널은 단일한 차원을 따라 세포/입자 분리를 수행하는 역장을 만들어 낸다. 세포/입자들의 사전 정렬은 분리 영역에서 동일한 체류 시간을 보장하며, 따라서, 층류 조건의 포물선형 유동 프로파일로 인한 나쁜 분리 분해능으로 흔히 겪었던 문제가 줄어든다.
일 양태에서, 본 발명은
i) 현탁액이 압력을 받도록 하는 단계로서, 상기 압력은 상기 현탁액을 적어도 하나의 유입구(11)로 그리고 마이크로유체칩에 존재하는 적어도 하나의 사전 정렬 채널로 밀어내는 단계,
ii) 상기 현탁액이 사전 정렬 채널(15)의 길이 방향에 대해 수직으로 유도되는 2차원의 음향력을 받도록 하는 단계,
iii) 상기 세포 및/또는 입자들의 혼합물을 밀어내고, 동시에 무세포 완충용액을 제2 유입구(12)를 통해 적어도 하나의 분리 채널로 주입하는 단계로서, 상기 세포 및/또는 입자들의 혼합물은 채널 벽을 향해 밀리는 단계,
iv) 상기 세포 및/또는 입자들이 분리 채널(16)의 길이 방향에 대해 수직으로 유도되는 1차원의 음향력을 받도록 하는 단계 및
v) 적어도 두 개의 유출구(13, 14)를 통해 마이크로유체칩에 존재하는 분리 채널 말단에서 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 세포 및/또는 입자들을 수집하는 단계
를 포함하는, 현탁액 중의 상이한 유형의 세포 및/또는 입자들의 혼합물로부터 하위 집단의 세포 및/또는 입자들을 분리하는 마이크로 규모의 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은
i) 적어도 두 개의 유입구(11, 12)와 적어도 두 개의 유출구(13, 14)와 함께, 적어도 하나의 사전 정렬 채널(15)과 적어도 하나의 분리 채널(16)이 있는 마이크로칩,
ii) 압력 제공 수단으로서, 상기 압력은 상기 현탁액을 제1 유입구(11)로 밀어내는 수단,
iii) 2차원의 음향력 제공 수단으로서, 상기 2차원의 음향력은 사전 정렬 채널(15)에 대해 수직으로 유도되는 수단,
iv) 상기 제2 유입구(12) 안으로 무세포 완충액을 주입하는 수단,
v) 1차원의 음향력 제공 수단으로서, 상기 1차원의 음향력은 분리 채널(16)에 대해 수직으로 유도되는 수단 및
vi) 적어도 두 개의 유출구(13, 14)로부터 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 대상을 수집하는 수단
을 포함하는 현탁액 중의 상이한 유형의 세포 및/또는 입자들의 혼합물로부터 하위 집단의 세포 및/또는 입자들을 분리하는 마이크로 시스템에 관한 것이다.
처음으로, 세포 및/또는 입자들 사이의 작은 차이도 이들을 분리 가능하게 만드는 수준까지 마이크로 시스템의 분해능을 증가시키는 것이 가능하다. 이는 세포/입자들이 y-z 평면의 정의된 위치로 유도될 수 있는, 적어도 하나의 사전 정렬 채널에 2차원의 음향력장을 도입함으로써 달성된다. 이는 입자/세포들이 분리 채널에 진입하기 전에, 입자/세포들을 흐름에 대해 가로지르는 평면에서 하나 이상의 별개의 위치로 국한시키며, 따라서 입자/세포들의 고유한 특성들과 입자/세포와 수성 매체 사이의 유체 역학적 상호작용이 분리 결과를 좌우하도록 분리를 결정론적이 되게 한다. 따라서, 사전 정렬과 분리를 조합한 효과는 그러한 시스템의 분해 능력을 증가시킬 것이고, 실시예에 나타난 바와 같이, 밀접하게 관련된 세포들을 서로 분리할 가능성을 처음으로 가능하게 한다.
도 1은 두 가지 현탁 종의 온칩 수송을 개략적으로 도시한 것이다. 평면도. 비례척을 따르지 않음.
도 2는 두 가지 현탁 종의 온칩 수송을 개략적으로 도시한 것이다. 측단면도. 비례척을 따르지 않음.
도 3은 완전한 장치의 실현을 제시한 도면이다. 평면도. 비례척.
도 4는 완전한 장치의 실현을 제시한 도면이다. 수직 중심면을 따라 절반으로 절단한 측단면도. 비례척.
도 5는 흐름을 채널로 밀어 보내는 외부 유체소자를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 유출구의 유동 분할 비율을 도시한 것이다.
도 7은 단면 FFA를 도시한 것이다.
도 8은 5μm와 7μm의 폴리스티렌 입자들을 함유하는 시료 혼합물에 대한 사전 집중시키기(pre-focusing)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 DU145 암세포와 백혈구를 함유하는 시료 혼합물에 대한 사전 집중시키기의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 DU145 암세포와 백혈구를 함유하는 시료 혼합물에 대한 유동률 변경의 효과를 나타내는 그래프이다.
정의
글자 (x), (y) 및 (z)는 각각 마이크로채널의 길이(l), 폭(w) 및 높이(h)를 따른 공간적 위치를 의미한다. 글자 (Qi), (v) 및 (pi)는 각각 부피 유동률, 유속 및 압력을 의미하며, 첨자 (i)는 속성의 여러 가지 사례를 나타낸다.
단어 현탁액은 침전시키기에 충분히 큰 고체 입자 또는 세포를 함유하는 유체를 의미한다.
방법 및 시스템
본 발명은 현탁액으로부터 세포 및/또는 입자들과 같은 대상의 하위 집단을 분리하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
방법 I
일 양태에서 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다.
a) 채널 유입구(11)의 압력이 임의의 나머지 유체 연결부(12, 13 및 14)의 압력보다 높도록 현탁액(51) 용기의 정수압 p1을 높여 현탁액(51)을 튜빙(55)을 통해 적어도 하나의 사전 정렬 채널(15)로 밀어내는 단계. 상기 압력 차이는 1?/분 내지 2mL/분으로 달라질 수 있는, 채널 내의 층류를 유발한다. 높은 압력은 시린지 펌프, 연동 펌프를 이용하여, 또는 유체 용기가 놓이는 밀봉 챔버의 기체 압력을 조절함으로써 설정할 수 있다.
b) 상기 현탁액 중의 현탁 대상(도 1, 삽도 c)이 사전 정렬 채널(15)에 대해 수직으로 유도된 2차원의 음향력 포텐셜(도 1, a-a' 및 도 2, f-f')을 받도록 하여, 세포 및/또는 입자들 전부가 흐름의 횡방향 단면의 하나 이상의 지점으로 국한되도록 하는 단계. 2차원의 음향력 포텐셜은 음향적으로 유연한 물과 채널의 음향적으로 굳은 벽 사이 계면의 반사에 의한, 물이 채워진 채널 내부 초음파의 공명 모드에서 기인한다. 초음파 진동의 주파수를 조정함으로써, 현탁 세포 및/또는 입자들을 채널의 벽, 바닥 및 천장으로부터 가장 가까운 진동 압력 노드를 향해 밀어내는 모드를 활성화시킬 수 있다. 2차원의 음향력 포텐셜과 조합된 (11)에서의 현탁액의 일정한 유입은 현탁액의 세포 및/또는 입자들이 사전 정렬 채널을 떠나기 직전에 좁은 띠로 정렬되게 한다(도 1, 삽도 d 및 도 2, 삽도 h).
사전 정렬 채널은 75㎛ 내지 200㎛와 같은 75㎛ 내지 800㎛의 범위, 또는 200㎛ 내지 375㎛의 범위, 또는 300㎛ 내지 400㎛의 범위, 또는 400㎛ 내지 700㎛의 범위, 또는 700㎛ 내지 800㎛의 범위, 또는 150㎛, 300㎛, 188㎛, 375㎛ 또는 750㎛의 폭 및/또는 높이를 나타낼 수 있다.
사전 정렬 채널의 폭과 높이는 폭 w 나누기 정수 n이 높이 h 나누기 정수 m과 같은 관계에 있을 수 있다. 이러한 경우, 진동의 단일 주파수는 동시에 높이와 폭 치수에 대해
Figure pct00001
(여기서 c는 현탁 유체에서 음파의 속도임)의 공명 조건을 만족하도록 선택될 수 있다.
채널의 폭과 높이가 아무런 관련이 없다면, 공명 조건은 높이와 폭 각각에 대한 별도의 진동 주파수를 이용하여 개별적으로/선택적으로 조절될 수 있다. 진동의 주파수는 1MHz 내지 10MHz의 범위일 수 있고, 위에 언급된 채널의 규모에 의해, 그리고 n = 1, m = 2, c = 1500m/s 중 어느 하나를 선택함으로써 절대적으로 결정된다. 다른 예는 2~5MHz와 같이 1~5MHz로부터 오거나, 2MHz 또는 5MHz이다.
이러한 2차원의 음향력 포텐셜의 한 예는 진동 주파수 f15　=　5MHz에 대해, 물이 채워진 사전 정렬 채널(15)의 폭 w15 = 300㎛, 높이 h = 150㎛일 때이다. 1500m/s의 현탁액의 음파 c의 규정된 속도에 대해, 음향 파장 λ5　= c / f15 = 300μm이다. 채널만이 반파장의 배수를 유지할 수 있음을 감안할 때, 진동은 y 축(도 1, a-a')을 따라, 그리고 z 축(도 2, f-f')을 따라, 채널에 공명을 유도할 수 있음이 명백하다. 조합된 yz 모드는 (y1, z1) = (w15 / 4, h / 2) 및 (y2,　z2)　=　(3　w15　/　4,　h　/　2)에서 두 개의 최소 진동 압력을 나타낼 것이다.
c) 상기 음향적으로 사전 집중시킨 현탁액을 밀어내고, 동시에 중심 유입구(12)를 통해 제2 분리 채널(16)로 무입자 액체를 주입하는 단계로서, 상기 세포 및/또는 입자들의 혼합물이 상기 제2 채널의 하나 이상의 벽 가까이로 밀리는 단계. 따라서, 현탁액은 음향영동 마이크로채널의 일측 또는 양측을 따라 얇은 층으로 갈라지는 한편, 무입자 액체가 채널의 나머지 부분을 차지한다. 무입자 액체와 현탁액의 상대적인 부피 유동률 Q2와 Q1은 각각 제2 채널(16)로 진입할 때, 세포 및/또는 입자들의 측면 위치(y=w1)를 결정한다. Q2의 증가는 w1의 감소를 가져온다. 그 이유는 단락 (d 및 e)에서 명확해질 것이다.
d) 상기 세포 및/또는 입자들의 혼합물이 주로 상기 분리 채널의 y 축을 따라 유도된 1차원의 음향력 포텐셜을 받도록 하여, 대상 전부가 그 채널의 수직 중심면을 향해 이동하게 하는 단계. 1차원의 음향력 포텐셜은 음향적으로 유연한 물과 음향적으로 굳은 채널 벽 사이 계면의 반사에 의한, 물이 채워진 채널 내부 초음파의 공명 모드에서 기인한다. 초음파 진동의 주파수를 조정함으로써, 현탁 대상들을 채널 벽으로부터 채널 중심의 진동 압력 노드를 향해 밀어내는 반파장 공명 모드를 활성화시킬 수 있다. 이전에 2차원의 사전 정렬 채널에 의해 정렬되어 벽 근처에 있는 대상들은 채널 중심의 최소 중심 진동 압력을 향해 이동한다.
분리 채널은 75㎛ 내지 200㎛와 같은 75㎛ 내지 800㎛의 범위, 또는 200㎛ 내지 375㎛의 범위, 또는 300㎛ 내지 400㎛의 범위, 또는 400㎛ 내지 700㎛의 범위, 또는 700㎛ 내지 800㎛의 범위, 또는 150㎛, 300㎛, 188㎛, 375㎛ 또는 750㎛의 폭을 나타낼 수 있다.
이러한 폭은 진동 주파수 f가
Figure pct00002
(여기서 c는 현탁 유체에서 음파의 속도임)이 되도록 선택될 수 있다.
진동 주파수는 1MHz 내지 10MHz의 범위일 수 있고, 위에 언급된 채널의 소정 규모에 의해, 그리고 n = 1 및 c = 1500m/s를 선택함으로써 절대적으로 결정된다.
이러한 1차원의 음향력 포텐셜의 한 예는 진동 주파수 f16　=　2MHz에 대해, 폭 w15 = 375μm이고, 높이 h = 150μm인 물이 채워진 분리 채널(16)일 수 있다. 1500m/s의 현탁액의 음파 c의 규정된 속도에 대해, 음향 파장 λ6　= c / f16 = 750μm이다. 채널만이 반파장의 배수를 유지할 수 있음을 감안할 때, 진동만이 y 축(도 1, b-b')을 따라 채널에 공명을 유도할 수 있음이 명백하다. 이러한 모드는 y = w16 / 2에서 하나의 최소 진동 압력을 나타낼 것이다.
각각의 세포 및/또는 입자는 흐름에 이끌려 채널을 따라 x 방향으로 이동하며, 한편, 현탁 매체 및 세포 및/또는 입자 각각의 음향기계적 성질, 중량 밀도 및 압축률에 의해 결정되는 속도로, y 방향의, 중심 진동 노드를 향해 밀린다. 이러한 속도는 세포 및/또는 입자의 크기와 음향 공명의 강도에 의해서도 결정된다. 제2 채널의 음향 공명의 진폭을 조정함으로써, 세포 및/또는 입자들의 경로를, 상이한 음향 이동도의 세포 및/또는 입자들이 y 축을 따라 서로 다른 위치의 채널로 나가도록 편향시킬 수 있다.
분리 채널로 진입할 때 모든 세포 및/또는 입자들이 yz 평면에 사전 정렬되므로, 그것들의 개별적인 궤도들은 그것들의 음향물리적 속성 및 크기를 높은 정도로 반영한다. 사전 정렬의 부재 시, 개별적인 세포 및/또는 입자들의 궤도는 분리 채널로 진입할 때 그것들의 초기 위치에 강하게 영향을 받을 것이며, 이는 실제로 세포 및/또는 입자의 고유한 성질이 아니다.
e) 처리 시간을 희생하여 이동거리(w2)를 최대화하도록 유입구(도 6, Q1 및 Q2)와 유출구 Q3 및 Q4의 부피 유동률을 조정하는 단계. 세포 및/또는 입자들이 중심 유출구(13)에 도달하는 데 있어서 더 먼 이동거리를 부과함으로써, 그 유출구에서의 잘못된 세포 및/또는 입자들의 수가 줄어들 것이다. Q4에 대해 Q3를 감소시키면, 중심 유출구의 유체 역학적 틈새(w3)를 좁히고, 증가된 (w2)를 초래할 것이다. 이와 마찬가지로, Q2에 대해 Q1을 감소시키면, (w1)을 줄일 것이다. 증가된 선택성은, Q1과 관련이 있는 어느 정도 유한한 부피의 시료의 처리 시간 및 Q4에서의 임의의 교란에 대한 Q3와 관련이 있는 안정적인 충분한 흐름을 생성하는 외부 유체 소자의 능력에 대한 요구와 균형을 이루어야 한다.
방법 II
제2 양태에서 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다.
a) 채널 유입구(11)의 압력이 임의의 나머지 유체 연결부(12, 13, 14 및 71)의 압력보다 높도록 현탁액(51) 용기의 정수압 p1을 높여 현탁액(51)을 튜빙(55)을 통해 적어도 하나의 사전 정렬 채널(15)로 밀어내는 단계. 상기 압력 차이는 1?/분 내지 2mL/분으로 달라질 수 있는, 채널 내의 층류를 유발한다. 높은 압력은 시린지 펌프, 연동 펌프를 이용하여, 또는 유체 용기가 놓이는 밀봉 챔버의 기체 압력을 조절함으로써 설정할 수 있다.
b) 세포 및/또는 입자들의 현탁액을 사전 정렬 채널(11)로 밀어내고, 상기 현탁액 중의 현탁 세포 및/또는 입자들이 상기 사전 정렬 채널에 대해 수직으로 유도된 2차원의 음향력 포텐셜을 받도록 하는 단계(도 7, 삽도 d). 그렇게 함으로써 모든 입자들이 한 지점으로 사전 정렬되고, 동시에, 흐름의 횡방향 단면의 z 평면뿐만 아니라 xy 평면에 중심이 있게 된다(도 7, 삽도 e). 앞서 언급된 흐름 속도 및 채널 규모에서 가장 두드러지는 층류 프로파일은 사전 정렬 후 상기 지점에 집중된 세포 및/또는 입자들을 함유한다.
현탁액 중의 세포 및/또는 입자들의 음향력에 의한 분리를 향상시키기 위한 2차원의 힘 포텐셜을 구현하는 한 예는 공명 주파수 f　=　5MHz에 대해 설계된 폭 w2 = 150㎛ 및 높이 h = 150㎛의 물이 채워진 채널 세그먼트(15)일 수 있다. 1500m/s의 현탁액의 음파 c의 규정된 속도에 대해, 음향 파장 λ= c / f = 300㎛이고, 따라서, 그 때, 정사각형의 채널 단면은 높이 (z) 및 폭 (xy) 방향으로 반파장 정상파를 유지할 수 있다.
c) 현탁액 중의 상기 사전 정렬된 세포 및/또는 입자들을, (12)로부터 진입하는 주 완충액 층류를 가지고 있는, 폭 w3 = 375㎛ 및 높이 h2 = 150㎛를 나타낼 수 있는, 채널로 밀어내는 한편, 여전히 채널에서 층류 체제를 유지하기 위한 충분히 낮은 전체 흐름(사전 정렬된 흐름 + 주 완충액 흐름)을 유지시켜 상기 제2 채널의 측벽을 따라 사전 정렬된 세포 및/또는 입자들의 스트림을 얇은 층으로 가르는 단계(도 7, 삽도 e). 상기 채널은 공명 주파수 f　=　2MHz에 대해 설계될 수 있다. 1500m/s의 현탁액의 음파 c의 규정된 속도에 대해, 음향 파장 ё= c / f = 750㎛이고, 따라서, 그 때, 직사각형의 채널 단면(c-c')은 오직 폭 (y) 방향으로 반파장 정상파를 유지할 수 있다.
d) 상기 사전 정렬된 세포 및/또는 입자들의 스트림이 상기 제2 채널에 수직으로 유도된 1차원의 음향력 포텐셜을 받도록 하여(c-c'), 대상 전부가 흐름의 횡방향 단면의 y 평면을 따라 한 지점을 향해 이동하게 하는 단계(도 7, 삽도 f). 이전에 2차원의 사전 정렬에 의해 정렬되고, 이제는 측벽에 가까이 있는 세포 및/또는 입자들이 향하는 지점은 이전에 언급된 채널 폭 w3와 음파의 규정된 속도에서의 음향 공명 주파수에 의해 결정된 채널 중심의 최소 중심 진동 압력이다. 제2 채널의 중심으로의, 입자들 간의 수송 속도의 차이는 입자의 물질 특성, 즉, 크기, 밀도 및 음파의 속도의 차이에 의해 결정된다. 따라서, 일정한 음파 진폭 및 완충액 조건 하에서, 채널 내의 세포 및/또는 입자들의 측면 위치(도 7, 삽도 f 및 i)는 세포 및/또는 입자들이 시스템을 나가는 유출구 (13), (14), (71)을 결정할 것이다. 그러면, 유출구의 수, 흐름 속도 및 음향 효과를 조절함으로써, 특정 유출구를 향한 층류의 분획을 유도하는 것이 가능하다. 이것은 크기뿐만 아니라, 이전에 언급된 임의의 음향 특성에 따라 소정의 세포 및/또는 입자들의 추출을 차별할 수 있게 한다.
e) 흐름을 둘 이상의 채널로 분할함으로써, 상기 제2 채널로부터 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 세포 및/또는 입자들을 수집하는 단계.
시스템
또 다른 양태에서, 본 발명은
i) 두 개의 유입구(11, 12) 및 적어도 두 개의 유출구(13, 14) 및 적어도 제1 채널이 있는 마이크로칩,
ii) 압력 제공 수단으로서, 상기 압력은 상기 현탁액을 유출구(11)를 통해 적어도 사전 정렬 채널(15)로 밀어내는, 압력 제공 수단,
iii) 2차원의 음향력(15) 제공 수단,
iv) 무입자 용액을 상기 채널(12)로 도입하는 수단,
v) 1차원의 음향력(16) 제공 수단 및
vi) 적어도 두 개의 유출구(13, 14)로부터 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 대상을 수집하는 수단
을 포함하는 현탁액 중의 서로 다른 유형의 세포 및/또는 입자들의 혼합물로부터 세포 및/또는 입자들의 하위 집단을 분리하는 시스템에 관한 것이다.
시스템의 한 예는 도 1 내지 도 5에 도시되어 있다. 도 1 및 도 2는 세포의 부분집합일 수 있는 입자들을 포함하는 현탁액이 어떻게 시스템(11)로 밀리는지를 보여준다. 그런 다음, 입자들이 있는 현탁액(도 1, 삽도 c)은 사전 정렬 채널(15)을 통해 수송되어, 주로 yz 평면에 작용하는 제1의 2차원의 음향력 포텐셜에 노출되며(각각 도 1, a-a' 및 도 2, f-f'), 세포들은 두 개의 세포의 하위 집단으로 집중된다. 그런 다음, 하위 집단은 두 개의 별도 채널로 분리되며, 무세포 용액이 (12)를 통해 시스템으로 도입된다. 무세포 용액은 사전 정렬된 입자들의 두 개의 하위 집단을 채널 벽 가까이의 위치로 밀어낸다(도 1, 삽도 d). 그런 다음, 세포의 하위 집단은 1차원의 음향력(16)에 노출되고(도 1, b-b'), 이는 서로 상이한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 세포들을 상이한 새로운 하위 집단의 세포들로 분리한다(도 1, 삽도 e). 그런 다음, 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 세포들은 (13) 및 (14)에서 수집된다. 이와 동일한 사항을 도 5에서 볼 수 있는데, 도 5는 사용 시 시스템에서 발생하는 것을 단순화한 그림이다. 또 다른 예는 도 7에 도시되어 있다.
일 구현예에서, 마이크로칩은 도 3과 도 4에 도시된 바와 같이 장착될 수 있는데, 도 3과 도 4는 동일한 마이크로칩의 두 가지 관점에서의 도면을 나타낸다.
도 3에는 현탁액 중의 세포 및/또는 입자들이 마이크로칩으로 진입하는 유입구(11)가 있다. 무입자 완충 용액의 유입구(12)가 있는데, 이때, 무입자 완충 용액은 임의의 적합한 완충액일 수 있고, 분리 수준에서 무엇이 분리되느냐, 즉, 세포 및/또는 입자들이 서로 얼마나 유사한가에 달려 있다. 완충액의 예로는 물, 0.9 % NaCl과 같은 염류 용액, 또는 혈액, 혈청, 소변, 유즙 또는 기타 생체액과 같은, 포유동물로부터 얻어진 세포 배지 또는 액체일 수 있다. 다른 예는 석유, 호수의 물, 마시는 물과 같은 환경의 액체 또는 물에 현탁된 침전물이다. 적어도 두 개의 유출구가 있는데, 하나는 중심 유출구(13)이고, 하나는 끝의 유출구(14)이며, 여기서 세포 및/또는 입자들이 수집된다.
채널이 있는 마이크로칩 위에, 마이크로채널(31)을 밀봉하는 유리 커버/천장이 있다. 채널 세그먼트가 에칭되는 실리콘 기판(32)도 있다. 분리 챔버 내에 초음파의 작동을 위한 변환기(33)가 있다. 2차원의 사전 정렬을 위한 초음파의 작동을 위해 존재하는 제2 변환기(34)도 있다. 이 구현예에서는, 장치의 온도를 조절할 수 있도록 존재하는 펠티에 소자(35)도 있다. 또한, 펠티에 소자로부터 과잉의 열을 흡수하기 위해 알루미늄 현미경 마운팅 플레이트/히트 싱크(36)가 존재한다. PT-100 열저항 온도 센서(37)는 피드백 조절 루프의 온도를 모니터링하는 데 이용된다.
도 4에서, 알루미늄 플레이트(41)는 장치 내 열의 균일한 분포를 위해 이용된다. 유입구 커넥터(42), 실리콘 튜빙 조각들이 있으며, 나머지 참조부호는 도 3에 도시된 바와 같고, 위에 설명된 바와 같다.
도 5는 작동 중의 시스템을 단순화한 개요도이다. 세포 및/또는 입자 현탁액을 위한 압력 챔버(51)가 있으며, 이때, 세포 및/또는 입자들은 마이크로칩 안으로 밀려간다. 세포 및/또는 입자 불포함 완충용액을 위한 하나의 압력 챔버(52)가 있으며, 이는 용액을 마이크로칩으로 밀어낸다. 중심 유출구(53)와 끝의 유출구(54)를 위한 두 개의 압력 챔버도 있다. 챔버 내에 존재하는 네 개의 용기도 있는데, 하나는 세포 및 우리의 입자 현탁액을 위한 용기(51), 위에서 언급된 것들과 같은 임의의 용액일 수 있는, 세포 및/또는 입자 불포함 완충용액을 위한 용기(52), 중심 유출구를 위한 용기(53) 및 끝의 유출구를 위한 용기(54)이다. 챔버 (51)과 (52) 그리고 두 개의 챔버 (53)과 (54)로부터의 액체 수송을 가능하게 하는 여러 개의 튜빙들(55, 56, 57 및 58)도 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 열적 변동이 일부 구현예에서 마이크로채널 음향 공명기의 음향 특성 및 그에 따른 분리 결과에 심각하게 영향을 줄 수 있으므로, 음향 분리 시스템은 등온 조건 하에서 작동된다. 이는 분리 칩 부근에서의 온도 센서 피드백을 통해 컴퓨터로 조절되는 펠티에 소자 위에 마이크로유체 음향 분리 칩을 장착시킴으로써 실현될 수 있다. 그에 의해, 전체 마이크로칩의 온도는 동일한 수준으로 유지된다. 온도가 너무 높으면, 세포 및/또는 입자들에 영향을 미칠 수도 있다. 한 예는, 세포들이 나중에 인간과 같은 포유류로 전달되도록 분리될 때이다. 세포들이 너무 높은 온도에 노출되면, 그것들은 스트레스를 받거나, 죽을 수 있고, 그러한 세포들을 필요로 하는 대상자에 다시 전달될 수 없다.
마이크로채널의 크기는 분리되는 세포 및/또는 입자들의 크기의 상한을 구성한다. 분리되는 세포 및/또는 입자들은 형상 및 크기에 따라 달라질 수 있으며, 1~5㎛, 1~25㎛, 5~50㎛, 5~40㎛, 5~30㎛, 5~25㎛, 8~25㎛와 같은 1㎛ 내지 50㎛의 범위, 또는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20㎛, 또는 10~20㎛부터 또는 10~15㎛ 부터이다. 세포 또는 입자들은 0.0005~0.003 x 10-15m3, 0.0005~0.07 x 10-15m3, 0.0005~8 x 10-15m3, 0.05~0.10 x 10-15m3, 0.07~70 x 10-15m3, 0.07~35 x 10-15m3, 0.07~14 x 10-15m3, 0.07~8 x 10-15m3, 0.25~6　x　10-15m3, 0.3~8　x　10-15m3, 0.07~35 x 10-15m3 또는 0.5~15　x　10-15m3과 같이, 0.0005 내지 70 x 10-15m3 범위의 부피를 나타낼 수 있다.
그에 의해, 포유동물에 존재하는 세포 대부분 뿐만 아니라, 박테리아 세포를 포함하는 세포들이 포함된다. 세포는 임의의 종류의 원핵세포 내지 진핵세포일 수 있으며, 예로는 박테리아 세포뿐만 아니라, 포유동물의 세포를 포함한다. 구체적인 예로는 암세포, 혈소판, 적혈구, (호중성 백혈구, 호산성 백혈구, 호염기성 백혈구, 림프구, 단핵 백혈구 및 대식세포와 같은) 백혈구, 지방 세포 및 대장균이다.
상기 입자들은, 상이한 생물학적 부분으로 이루어진 현탁액으로부터 생물학적 부분을 분리하고자 인식 요소의 항체들이 커플링될 수 있는 비즈와 같은, 예를 들어, 상이한 생물학적 부분으로부터 서로를 분리하는 데 종종 사용되는 임의의 종류의 비즈일 수 있다. 한 가지 예는, 항체들이 고분자 비즈, 자성 비즈 및 실리카 비즈와 같은 비즈와 커플링될 때이며, 이때, 항체들은 생물학적 시료와 같은, 시료로부터 항원을 분리하는 데 사용된다.
실시예 3에서, 도 8에 도시된 바와 같이, 2차원의 사전 정렬이 이용됨에 따라, 5 및 7 마이크로미터의 폴리스티렌 입자들의 분리가 향상되었음이 밝혀졌다.
상기 채널들의 폭은 50~1000, 150~750㎛, 300~750㎛와 같이, 50㎛ 내지 2000㎛로 다를 수 있다. 이러한 폭은 상이한 세포 및/또는 입자들을 집중시키는 시스템 및 방법에 적합한 바람직한 파장의 크기에 의해 정의된다.
본 발명이 이용될 수 있는 한 예는 암의 영역이다. 이러한 시스템은 잠복성/무통성 암 대 질환 이환율의 높은 위험과 관련이 있는 침습성 암의 구별에 유용할 수 있다. 그것은 또한 질병 재발, 진행 및 치료 개입에 대한 반응의 검출에도 이용될 수 있다.
CTC가 면역 친화도를 기초로 한 기법(즉, 베리덱스(Veridex)-셀서치(CellSearch®))을 이용하여 단리되는 현재의 임상 실무와는 대조적으로, 본 발명은 혈액 세포로부터 꼬리표 없는 분리를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 현재 발견되지 않은 CTC의 하위 군집, 즉, 성공적인 종래 면역 친화도 추출을 위해 충분히 높은 수준의 EpCAM을 발현하지 않는 세포들도 잠재적으로 단리할 수 있다.
암은 점점 더 초기 단계에서 지속적으로 진단되고 있다. 그럼에도 불구하고, 많은 환자들이 전이성 질환에 계속해서 굴복하고 있으며, 국소적으로 전파되었거나 멀리 전파된 환자들의 경우, 예후가 여전히 불량하다. 종양은 순환종양세포(CTC)에 의해 새로운 위치로 확산된다고 여겨진다. CTC는 말초 혈액에서 순환하는 종양 세포로 정의되며, 1차 종양 또는 그 전이로부터 탈락된다. CTC는 전이성 질환을 앓는 상피암 환자의 혈액에서 발견되었다. 또한, CTC는 외견상 고형의 국소형 종양을 앓는 환자에서도 검출되었으나, 건강한 사람에서는 매우 드물어서, CTC가 전이성 질환의 발병 전에도 혈류로부터 탈락됨을 시사한다.
혈액 내 CTC의 존재와 임상적 적절성 사이의 관계는 상이한 유형의 상피암을 앓는 환자에서 밝혀진 바 있다. CTC는 전이성 질환을 앓는 환자의 무진행 생존 및 전체 생존의 독립적인 예측변수인 것으로 밝혀졌다. 보고된 불일치는 명백히 다양한 종류의 상피암들 간의 차이뿐만 아니라, 말초 혈액 시스템의 CTC의 부족으로 인한 것일 수 있어, 임상 시료 중 종양 세포의 검출에 엄청난 과제를 발생시킨다. 10억 개의 혈액 세포에 하나의 CTC만큼 적은 수가 있을 수 있다.
말초 혈액으로부터의 CTC의 추출 및 분석은 세포 수 또는 유전자 발현 프로파일링에 의해, 전이성 암 단계들을 모니터링하고, 상이한 치료 양식의 치료적 효능을 평가하기 위하여 최근에 등장했다.
이러한 방법 및 시스템이 이용될 수 있는 상이한 종류의 암의 예로는 위에 언급된 것들과 같은 고형 종양, 전립선, 결장, 유방, 폐 선암종, NSCLC, 난소, 췌장, GIST, 신장암, 방광 또는 신장의 요로 상피암, 흑색종, 중피종 및 신경교종을 포함한다.
다음의 예는 본 발명을 설명하고자 한 것이며, 명시적으로 또는 암시적으로, 어떠한 방식, 형상 또는 형태로든 본 발명을 제한하고자 한 것이 아니다.
실시예
실험 설정
마이크로채널 구조 및 유입구와 유출구를 위한 구멍은 두께 350㎛의 <100> 실리콘 웨이퍼에 KOH 에칭하였고, 40mm X 3mm 규모로 절단하였다(32). 채널을 밀봉하기 위하여 붕규산 유리 조각(31)(40mm X 3mm X 1mm)을 양극으로 접합시켰다. 유입구와 유출구는 외부 유체 소자를 위한 튜빙을 연결하기 위하여 칩의 뒷면에 부착시킨 여러 개의 실리콘 튜빙들(42)로 구성된다.
칩 어셈블리의 모든 부분들을 함께 붙였다. 히트 싱크로도 기능하는 알루미늄 마운팅 플레이트, 펠티에 소자(35)(15mm X 15mm), 실리콘 유입구/유출구 튜빙의 반경에 맞춰 뚫은 구멍이 있는 알루미늄 바(41)(40mm X 3mm X 2mm), 두 개의 압전 세라믹 액추에이터, 사전 정렬 채널 아래에 위치시킨 하나의 약 5MHz 변환기(34)(5mm X 5mm), 및 분리 채널 밑에 놓인 하나의 약 2MHz 변환기(33)(15mm X 5mm), 및 음향영동 칩을 바닥부터 위까지 함께 끼워 넣었다. 도 3 및 도 4 참조. 온도 측정을 위한 Pt100 열 저항 요소를 음향영동 칩을 따라 2MHz 압전 세라믹 액추에이터 위에 붙였다. 도 3 참조.
압전 세라믹 변환기는 신호 전력 증폭기를 구비한 두 개의 신호 발생기에 의해 구동된다. 음향 공명은 변환기에 대하여 주파수와 전압을 조정함으로써 조절할 수 있다.
현탁액 중의 세포/마이크로입자는 50　또는　70μＬ min-1의 유동률로 제1 사전 집중 채널(15)로 진입한다. yz 평면의 5MHz 공명은 두 개의 좁은 띠에 입자들을 집중시킨다. 도 1 및 도 2 참조. 깨끗한 완충액 매체가 450　또는　490μＬ/분의 부피 유동률로 (12)를 통해 진입하고, 입자들의 스트림이 분리 채널(16)의 벽에 가깝게 내몰리도록 사전 정렬된 입자들을 더 나눈다. y 좌표를 따른 1.94MHz 공명만이 채널의 수직 중심면을 향해 입자들을 집중시킨다. 분리 채널의 말단에서, 흐름은 세 갈래의 유출구(13 및 14)로 분할된다. 중심 유출구(13) 부피 흐름을 150 또는 280?/분으로 설정하고, 결합된 끝의 유출구(14)의 부피 유동률은 250 또는 280?/분이었다.
실시예 1, 5㎛ 및 7㎛ 폴리스티렌 비즈의 분리
시료 준비 . 5㎛ 및 7㎛ 폴리스티렌 비즈 혼합물(약 5 mg mL-1)을 PBS 중의 트리톤 X100(0.01%)의 용액에 첨가하였다.
유동 시스템 준비 . 시스템의 부피 유동을 3개의 10mL 유리 시린지(1010 TLL, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, 스위스)로 조절하고, 이때, 2개의 유리 시린지는 각각 중심 유출구 및 결합된 끝의 유출구에서 부피 유동 Q3 = Q4 = 250μＬ min-1을 유지하는 동일한 시린지 펌프(WPI sp260p, World Precision Instruments Inc., Sarasota, 미국 플로리다 주)에 장착되어 있다(Qi의 정의에 대해서는 도 6 참조). 이러한 두 개의 시린지의 유동률은 주 채널의 총 부피 유동(Qtotal = 500 μＬ min-1)률을 결정한다. 별도의 시린지 펌프(neMESYS, Cetoni GmbH, 독일)에 장착된 제3의 시린지는 중심 유입구의 무세포 완충용액을 전체 유동률의 90%(Q2 = 450μＬ min-1)에 해당하는 부피 유동률로 채널에 주입한다. 입자 혼합물을 세 개의 시린지에 의해 생성된 순흐름에 의해 결정된 전체 부피 유동률의 10%의 유동률(Q1 = 50μＬ min-1)로, 대기압에서, 시험관의 바닥으로부터 끝의 유입구 안으로 끌어들였다. 시스템을 작동하는 동안 분리 성능을 살피기 위해, 각각의 부피가 100μＬ인 두 개의 6-포트, 2-웨이 시료 루프(V-451, Upchurch Scientific, Oak Harbor, 미국 워싱턴 주)를 유출구와 직렬로 연결하였다.
장치의 유입구 튜빙을 약 1mL의 입자 혼합물을 함유하는 시험관 안에 담갔다. 시험관 내에서 입자들의 임의의 침전의 영향을 최소화하기 위하여, 시료를 처리하는 동안 위 아래로 피펫팅하여 시료를 약하게 혼합하였다. 두 개의 시료 루프를 수집 모드로 전환하기 전에 수 초 동안 시스템에서 흐름을 안정화시켰다. 끝 유출구 및 중심 유출구 각각의 입자 함량 분석을 할 수 있도록 각 실험의 과정에서 루프를 3회 표본 추출을 하였다.
획득된 유출구 분획의 분석 . 음향영동 후, 중심의 각 끝 유출구 분획의 마이크로비즈의 수를 유동 세포 계수법으로 확인하였다(FACS Canto II 유동 세포 계수기 및 FACSDiva 소프트웨어, BD Biosciences). 두 가지 비즈 크기는 전방/측방 산란도에서 명백히 구별 가능하다.
음향영동 입자 분리 절차 . 제1의 2차원의 사전 집중 채널에서 초음파 작동 주파수를 대략 4.79MHz로 조정하였고, 제2의 분리 채널에서는, 대략 1.94MHz의 기본적인 공명이 이용되었다. 제1 실험에서, 2MHz 분리 채널 변환기(33) 위의 전압 진폭은 0에서 11Vpp까지 바뀌었고, 5MHz 사전 정렬 변환기(34)는 꺼졌다. 사전 정렬 변환기를 켠 후, 분리 채널에 대한 전압은 다시 0에서 11Vpp까지 바뀌었다. 결과를 도 8에 도시하였다. 마이크로비즈의 2차원의 사전 정렬이 두 가지 비즈 크기를 구별할 수 있는 능력을 향상시킴은 명백하다.
실시예 2, 혈액으로부터의 종양 세포의 추출
세포 배양 및 건강한 헌혈자. 인간 전립선암 세포주 DU145는 ATTC(American Type Tissue Collection)로부터 획득하여, ATTC 권고에 따라 배양하였다. 룬드대학병원(스웨덴 룬드)의 혈액 은행에서 건강한 지원자로부터 혈액을 획득하였다.
세포 면역 염색, 준비 및 스파이킹 실험. 1mL 시료의 처리를 위해, 100mL 혈액을 형광 색소가 결합된 항체 CD45-APC(1:5로 희석됨) 또는 대조군 IgG-APC(양자 모두는 미국 캘리포니아 주 산 호세의 BD Bioscience 제품)와 함께, 실온에서 20분 동안 배양한 다음, 15분 동안 등장성 RBC 용해를 실시하였다. 500g에서 원심분리 5분한 후, 용해된 적혈구를 함유하는 상층액을 따라내고, FACS 완충액(PBS, 1% BSA, 2mM EDTA)을 이용한 세척 단계를 수행하였다. 세포 펠릿을 FACS 완충액에 재현탁시키기 전에, 적용에 따라, 세포를 2% 파라포름알데히드(PFA)에 고정시키거나 고정시키지 않았다.
전립선암 세포를 트립신/EDTA로 분리시키고, FACS 완충액으로 반복하여 세척하였다. 세포를 형광 색소가 결합된 항체 EpCAM-PE(1:5로 희석됨) 또는 대조군 IgG-PE 항체(양자 모두는 BD Bioscience 제품)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시키고, 얼음 위에서 40분 동안 배양하였다. 암세포들을 FACS 완충액에 재현탁시키기 전에 2% PFA에 고정시키거나 고정시키지 않았다. PBS 중의 적혈구 용해된 혈액(1:10으로 희석됨)을 2.5 x 105mL-1 DU145 세포로 스파이킹하였다.
유동 시스템 준비. 시스템의 부피 유동을 3개의 10mL 유리 시린지(1010 TLL, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, 스위스)로 조절하고, 이때, 2개의 유리 시린지는 각각 중심 유출구 및 결합된 끝의 유출구에서 부피 유동 Q3 = Q4 = 250μＬ min-1을 유지하는 동일한 시린지 펌프(WPI sp280p, World Precision Instruments Inc., Sarasota, 미국 플로리다 주)에 장착되어 있다(Qi의 정의에 대해서는 도 6 참조) . 이러한 두 개의 시린지의 유동률은 주 채널의 총 부피 유동(Qtotal = 560 μＬ min-1)률을 결정한다. 별도의 시린지 펌프(neMESYS, Cetoni GmbH, 독일)에 장착된 제3의 시린지는 중심 유입구의 무세포 완충용액을 전체 유동률의 7/8(Q2 = 490μＬ min-1)에 해당하는 부피 유동률로 채널에 주입한다. 입자 혼합물을 세 개의 시린지에 의해 생성된 순흐름에 의해 결정된 전체 부피 유동률의 1/8의 유동률(Q1 = 70μＬ min-1)로, 대기압에서, 시험관의 바닥으로부터 끝의 유입구 안으로 끌어들였다. 시스템을 작동하는 동안 분리 성능을 살피기 위해, 각각의 부피가 100μＬ인 두 개의 6-포트, 2-웨이 시료 루프(V-451, Upchurch Scientific, Oak Harbor, 미국 워싱턴 주)를 유출구와 직렬로 연결하였다.
장치의 유입구 튜빙을 약 1mL의 입자 혼합물을 함유하는 시험관 안에 담갔다. 시험관 내에서 입자들의 임의의 침전의 영향을 최소화하기 위하여, 시료를 처리하는 동안 위 아래로 피펫팅하여 시료를 약하게 혼합하였다. 두 개의 시료 루프를 수집 모드로 전환하기 전에 수 초 동안 시스템에서 흐름을 안정화시켰다. 끝 유출구 및 중심 유출구 각각의 입자 함량 분석을 할 수 있도록 각 실험의 과정에서 루프를 3회 표본 추출을 하였다.
음향영동 세포 분리 절차. 제1의 2차원의 사전 집중 채널에서 초음파 작동 주파수를 대략 5.0MHz로 조정하였고, 제2의 분리 채널에서는, 대략 2MHz의 기본적인 공명이 이용되었다.
획득된 유출구 분획의 분석 . 음향영동 후, 중심의 각 끝 유출구 분획의 형광으로 꼬리표를 붙인 세포의 수를 유동 세포 계수법으로 확인하였다. WBC는 CD45 양성 및 EpCAM 음성을 특징으로 하는 반면, 종양 세포는 EpCAM 양성 및 CD45 음성을 나타냈다. 형광을 FACS Canto II 유동 세포 계수기 및 FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences)로 정량하였다.
음향 사전 정렬 대 비 사전 정렬 . 세포의 사전 정렬의 영향을 DU145 및 WBC의 세포 혼합물을 대상으로 시험하였다. 사전 정렬 채널에서 초음파의 존재 또는 부재 하에서 마이크로칩을 통해 세포를 처리하고, 분리 채널에서 증가하는 전압 진폭으로 작동시켰다. 중심 및 끝 유출구 분획의 세포 조성물을 평가하는 데 유동 세포 계수법을 이용하였다. 정상파의 압력 노드로의 세포의 사전 정렬은 그것들이 동일한 높이와 속도로 분리 채널로 진입하게 하여, WBC와 암세포를 향상되게, 그리고 더욱 안정적으로 분리할 수 있게 하였다. 도 9 참조.
실험 결과의 분석. 실험 결과를 분석하기 위하여, 중심 및 끝 유출구의 암세포 및 WBC의 수를 유동 세포 계수법으로 확인하였다. 분리 성능의 윤곽을 그리고자 세 가지 척도를 계산하였다: 종양 세포 포획 효율 - 양 유출구에서 검출된 모든 암세포에 대한 중심 유출구에서의 암세포의 수, WBC 고갈 효율 - 양 유출구에서 검출된 모든 WBC에 대한 끝 유출구의 WBC의 수, 종양 세포 포획 순도 - 중심 유출구에서 검출된 모든 세포에 대한 중심 유출구의 암세포의 수.
변동 체류 시간 . WBC와 종양 세포를 구별하는 능력은 칩에서의 세포 체류 시간에 매우 의존적인 것으로 나타났다. 칩에서 전체 유동률을 변동시키되, 유입구와 유출구에서 상대적인 유동 비율을 일정한 압전 액추에이터 구동 전압 및 주파수로 유지하며, 체류 시간을 평가하였다.
원하는 적용에 따라, 완전한 WBC 고갈 또는 전체 DU145 세포 회수가 (그러나 WBC 고갈 감소 비용에 대해) 달성될 수 있다. 도 10. 시료 처리율을 전체 유동률의 1/8로 유지시켜, 40μＬ min-1 내지 100μＬ min-1 범위로 하였다.
위의 시료 처리율은 시스템의 용량의 상한을 구성하지 않는다. 압전 액추에이터 구동 전압의 진폭을 증가시킴으로써, 더 낮은 유동률에 대한 것에서 보는 바와 같이(데이터 미도시) 비슷한 분리 작용을 유지하면서, 시표 처리량을 10mL h-1보다 훨씬 높은 수준으로 높일 수 있다.
유출구 유동 비율의 효과. 도 10에서 시료 유입구 흐름과 중심 완충액 유입구 흐름은 1:7의 비율을 나타냈다. 이러한 배열은, 두 개의 시료 수집 루프에서 동일한 체류 시간을 보장하도록 유동이 1:1의 비율로 일정하게 유지되었던 두 유출구에서의 세포의 희석을 초래한다. 끝 대 중심의 유출구 유동 비율을 7:1로 조정함으로써, 중심 유출구 분획과 입력 시료 조성물에서 검출된 세포들 사이의 직접적인 비교가 이루어질 수 있다.
중심 유출구의 유체 역학적 틈새를 조정하는 이러한 전략은 분리 조건을 최적화하는 수단을 제공한다. 유출구 비율을 조절함으로써, 최적의 농축이 달성될 수 있다. 유출구 흐름 구성의 변화는 낮은 정도의 WBC를 유지하면서, 높은 종양 세포 포획 효율을 가져오며, WBC로부터 적어도 800배의 종양세포의 농축이 달성되었다. 중심 유출구 흐름과 끝의 유출구 흐름 사이의 감소된 유출구 비율(더 미세한 유체 역학 틈새)은 세포가 중심 유출구에 이르기 위해 더 먼 거리를 이동하도록 매개하고, 그에 의해 WBC 배제 효율을 증가시킨다.
실시예 2는 음향영동이 단독 기법 또는 기타 직렬로 연결된 CTC 분리 기법과 하이픈으로 연결하여, CTC의 효율적인 단리를 향한 실행 가능한 방법이라는 최초의 실험적 증거를 설명한다.
제안된 CTC 단리법의 핵심적인 특질은 꼬리표가 붙지 않은 고정된 세포 또는 살아있는 세포가 해결될 수 있다는 점이다. 후자의 사례에서, 살아있는 세포의 회수는 유전자 프로파일의 깊이 분석 및 다양성을 위한 추출된 CTC의 분리 후 배양 및 확장을 향한 길을 열 수 있으며, 따라서, 진단 및 예후의 전제조건을 개선할 수 있다.

Claims (9)

  1. i) 현탁액이 압력을 받도록 하는 단계로서, 상기 압력은 상기 현탁액을 하나의 유입구(11)로 그리고 마이크로유체칩에 존재하는 적어도 하나의 사전 정렬 채널로 밀어내는 단계,
    ii) 상기 현탁액이 사전 정렬 채널(15)의 길이 방향에 대해 수직으로 유도되는 2차원의 음향력을 받도록 하는 단계,
    iii) 상기 세포 및/또는 입자들의 혼합물을 밀어내고, 동시에 무세포 완충용액을 제2 유입구(12)를 통해 적어도 하나의 분리 채널로 주입하는 단계로서, 상기 세포 및/또는 입자들의 혼합물은 채널 벽을 향해 밀리는 단계,
    iv) 상기 세포 및/또는 입자들이 분리 채널(16)의 길이 방향에 대해 수직으로 유도되는 1차원의 음향력을 받도록 하는 단계 및
    v) 적어도 두 개의 유출구(13, 14)를 통해 마이크로유체칩에 존재하는 상기 제2 채널로부터 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 세포 및/또는 입자들을 수집하는 단계를 포함하는, 현탁액 중의 상이한 유형의 세포 및/또는 입자들의 혼합물로부터 하위 집단의 세포 및/또는 입자들을 분리하는 마이크로 규모의 방법.
  2. 제1항에 있어서, ii) 단계의 2차원의 음향력은 서로에 대해 수직인 1/2 파장과 1 파장으로 이루어지는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, iv) 단계의 상기 1차원의 음향력은 1/2 파장으로 이루어지는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차원의 음향력은 1 내지 10MHz의 주파수에 의해 유발되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 일정한 온도에서 유지되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 채널의 높이 또는 폭은 75um 내지 800um인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및/또는 입자들은 1~50㎛로부터의 크기를 나타내는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암세포이고 상기 현탁액은 혈액인 방법.
  9. i) 적어도 두 개의 유입구(11, 12)와 적어도 두 개의 유출구(13, 14)와 함께, 적어도 하나의 사전 정렬 채널(15)과 적어도 하나의 분리 채널(16)이 있는 마이크로칩,
    ii) 압력 제공 수단으로서, 상기 압력은 상기 현탁액을 제1 유입구(11)로 밀어내는 수단,
    iii) 2차원의 음향력 제공 수단으로서, 상기 2차원의 음향력은 상기 사전 정렬 채널(15)에 대해 수직으로 유도되는 수단,
    iv) 상기 제2 유입구(12) 안으로 무세포 완충액을 주입하는 수단,
    v) 1차원의 음향력 제공 수단으로서, 상기 1차원의 음향력은 상기 분리 채널(16)에 대해 수직으로 유도되는 1차원의 음향력 제공 수단 및
    vi) 상기 채널(13, 14)로부터 동일한 크기 및/또는 중량 밀도 및/또는 압축률을 나타내는 세포 및 입자들을 수집하는 수단을 포함하는 현탁액 중의 상이한 유형의 세포 및/또는 입자들의 혼합물로부터 하위 집단의 세포 및/또는 입자들을 분리하는 마이크로 시스템.
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