KR20140065657A - 신규한 변이 균주 ａｃｅｐ－１ 및 이를 이용한 홍국미의 제조 - Google Patents

신규한 변이 균주 ａｃｅｐ－１ 및 이를 이용한 홍국미의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍국균에 대하여 UV-C 조사와 NTG를 조사하여 모나콜린 K를 다량 생산하고 시트리닌을 생산하지 않는 홍국균(Monascus) 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 및 이를 쌀에 접종시켜 배양한 홍국미에 관한 것이다.
본 발명의 홍국균(Monascus) 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P는 종래의 홍국균 변이주 대비 모나콜린 K의 생산성이 뛰어나며, 오렌지색 및 적색의 색소 생산능이 있어 색소 관련 분야에도 이용 가능하다.

Description

신규한 변이 균주 ＡＣＥＰ－１ 및 이를 이용한 홍국미의 제조 {Novel Monascus sp. mutant ACEP-1 and rice using thereof}
본 발명은 방사선 조사를 통해 개발된 콜레스테롤 합성저해제인 모나콜린 K(Monacolin K) 생산능이 뛰어나고 곰팡이독소인 시트리닌 비생산성인 홍국균(Monascus) 변이주 및 이를 이용한 홍국미의 제조 방법에 관한 것이다.
홍국균(紅麴菌)은 Monascus 속 균류가 쌀이나 콩에 발효하여 생성된 선홍색 누룩으로서, 1884년 Van Tieghem에 의해 감자에서 처음 분리되었고, 쌀에서는 1895년에 Went에 의해 분리되었다. 현재 이 균은 약 20종, 균주로서 약 70여종이 분리 동정되어 있으며, Hawkworth 등은 동양의 전통 식품으로부터 분리된 Monascus 균주를 M. purpureus , M. ruber , M. pilosus 등 3개의 종으로 재분류한 바 있다. 이 균은 분류학적으로 자낭을 만드는 자낭균류에 속하며, Ascomycotina 문, Plectomycetes 강, Eurotiales 목, Monascaceae 과, 홍국균속(Monascus sp.)으로 분류되고 있다.
홍국균이 쌀 등의 곡류에 발효된 홍국(紅麴)은 중국, 일본, 대만 등 동아시아 지역에서 오래전부터 전통적으로 사용되어 왔으며, 중국의 본초강목에는 소식활혈(消食活血)이나 건비조위(健脾燥胃)의 기능이 기록되어 있고, 한국의 동의보감에도 홍국은 피를 잘 돌게 하고 음식이 소화되게 하며 이질을 멎게 하는 신국(神麴)이라고 기록되어 있다. 그 외에도 오래전부터 착색, 양조, 방부 등의 기능으로 사용되어 왔고, 식품과 한약재의 원료로 사용되어 왔다.
홍국은 그 대사산물 중 하나인 monacolin K 성분이 혈중 콜레스테롤 수치를 저하시키는 기능을 한다는 것이 1979년 일본의 Endo 교수에 의해 밝혀진 이후 여러 가지 생체기능이 연구되기 시작하였고, 특히 monacolin K 성분에 의한 고지혈 예방 및 치료기능을 갖는 건강기능식품으로 개발되기 시작하였다. 하지만 홍국균은 유용성분인 monacolin K 외에도 citrinin을 추가적으로 생산하는데, 이는 신장에 독성을 일으키는 신독소로 알려져 있어 이를 생산하지 않도록 제조해야 한다. 또한 monacolin K 도 활성형이 별도로 있으므로 이의 함량이 높은 것이 생체 활성이 더 좋다고 할 수 있다.
따라서, 홍국은 생산하는 monacolin K의 활성형이 많고, citrinin이 적고, 총 생산량이 많은 균주일수록 유용성이 크다고 할 수 있다.
본 발명자들은 홍국균에 대하여 UV-C 조사와 NTG를 조사하여 모나콜린 K를 다량 생산하고 시트리닌을 생산하지 않는 홍국균(Monascus) 변이주 Monascus ruber ACEP-1를 개발하고 홍국균(Monascus) 변이주 M. ruber ACEP -1 배양조건의 최적화 조건을 개발하였다. 홍국균(Monascus) 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종시킨 후 모나콜린 K 생성능 뿐 아니라 색소 생성이 뛰어난 변이주를 확인하여 이를 이용한 기능성 쌀을 생산할 수 있게 되었다.
본 발명은 모나콜린 K를 다량 생산하고, 시트리닌을 생성시키지 않고 색소 생성능이 있는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P을 쌀에 접종하여 배양한 홍국미를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 홍국미의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 모나콜린 K를 다량 생산하고, 시트리닌을 생성시키지 않고 색소 생성능이 있는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종하여 배양한 홍국미를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(i) 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종시키는 단계; 및
(ii) 상기 홍국균 변이주에 접종된 쌀을 배양하는 단계
를 포함하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 홍국미의 제조방법을 제공한다.
본원 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명은 홍국균에 대하여 UV-C 조사와 NTG를 조사하여 모나콜린 K를 다량 생산하고 시트리닌을 생산하지 않는 홍국균(Monascus) 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 및 이를 쌀에 접종시켜 배양한 홍국미에 관한 것이다.
(ii) 본 발명의 홍국균(Monascus) 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P는 종래의 홍국균 변이주 대비 모나콜린 K의 생산성이 뛰어나며, 오렌지색 및 적색의 색소 생산능도 훌륭하여 이를 이용한 식품 개발 또는 색소 개발이 가능하다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 모나콜린 K를 다량 생산하고, 시트리닌을 생성시키지 않고 색소 생성능이 있는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 제공한다.
citrinin을 생산하지 않고 Monacolin K를 일정량 이상 생산하는 균주를 찾아내기 위하여 M. ruber KCCM 60141, M. ruber KCCM 60167, M. ruber KCCM 60394, M. ruber KCTC 6122, M. ruber KACC 46224 5균주를 모균주로 선발하여 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 변이주는 모균에 NTG ( N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine), UV를 조사하여 돌연변이화시킨 것을 특징으로 하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1이다. 상기 균주를 2012년 11월 7일 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였고, 균주 기탁 번호를 KACC 93162P로 부여받았다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 색소 생성능은 오렌지색 및 적색 생성능을 가진다.
본 발명의 일 양태로 선발균주인 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P을 고체평판배지에서 배양한 다음 크기 5mm 디스크 5개로 잘라 50ml의 PYDB 액체배지에 접종하여 25℃에서 7일간 180 rpm으로 배양시킨다.
액체 배양 후 배양액은 filter paper로 여과한 다음 여과된 배양액을 96well plate에 100 μ씩 분주하여 spectrophotometer(TECAN)를 이용하여 흡광도를 측정할 수 있으며, 기타 색소량을 측정하는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 오렌지색 및 적색 색소는 각각 385 nm 및 495 nm에서 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종하여 배양한 홍국미를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은
(i) 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종시키는 단계; 및
(ii) 상기 홍국균 변이주에 접종된 쌀을 배양하는 단계
를 포함하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 홍국미의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (i)의 쌀은 수침시켜 수분 함유량을 25-40%로 조절한다. 보다 바람직하게는 수분 함유량을 30%로 조절한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (i)에서 상기 접종 단계는 25℃에서 액체 배양시킨 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 종균을 상기 쌀을 기준으로 8 중량%를 첨가시킨다.
바람직하게는 상기 쌀은 현미 또는 백미를 이용할 수 있으며, 충분한 양의 증류수 등으로 하룻밤 동안 침지시키면서 수분 함유량을 조절하여야 하며, 다른 잡균을 제거하기 위해 물기를 제거한 뒤, 고온에서 멸균시켜 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 양태로서 배양원료로서의 현미 또는 백미를 대략 115 ~ 125 ℃ 범위의 온도 범위, 약 1.1 ~ 1.3 기압의 조건에서 고압 멸균(autoclaving)시켜 멸균 제거 시킨다. 상기의 방법을 이용하여 멸균시킨 백미 또는 현미에 사전 배양시킨 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 종균 접종하고, 고체 배양시킨다. 배양 중 매일 1~2회씩 손으로 쳐서 강제 교반을 시킨 후 10일 이상 배양 후 배양 종료시점에 꺼내어 60℃에서 열풍건조를 하여 최종 홍국미를 제조하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
(1) 실시예 1 : 균주의 수집
실험에 사용한 홍국균은 Monascus sp .를 식약청에서 건강기능식품 제조에 사용할 수 있도록 인정하고 있는 균주인 M. ruber, M. perpureus M. philosus , M. anka 4종에 속하는 균주를 수집하여 사용하였다. 수집기관은 한국미생물보존센터 (KCCM), 생명공학연구원 미생물지원센터 (KCTC)를 이용하였고, 해외기관인 CBS에서 보관하고 있는 해외 균주들은 한국농업미생물자원센터 (KACC)를 통하여 분양 받아 사용하였다 (표 1).
실험에 사용한 총 균주수는 35개 균주로 M. perpureus 15종, M. ruber 13종, M. pilosus 7종이 수집 되었고 이를 이용하여 실험에 사용하였다.
No. Species Strain name Recommended condition
1 Monascus ruber KCCM 60141 PDYA , 24℃
2 Monascus perpureus KCCM 11832 MEA , 26℃
3 Monascus perpureus KCCM 12002 PDA , 24℃
4 Monascus perpureus KCCM 60170 MEA , 30℃
5 Monascus perpureus KCCM 60461 PDYA , 24℃
6 Monascus perpureus KCCM 60462 PDYA , 24℃
7 Monascus perpureus KCCM 60016 PDA , 24℃
8 Monascus ruber KCCM 60167 PDA , 24℃
9 Monascus pilosus KCCM 60084 PDYA , 24℃
10 Monascus pilosus KCCM 60160 MEA , 26℃
11 Monascus ruber KCCM 11845 MEA , 30℃
12 Monascus perpureus KCCM 11847 MEA , 26℃
13 Monascus ruber KCCM 11876 PDYA , 26℃
14 Monascus perpureus KCCM 35473 MEA , 26℃
15 Monascus ruber KCCM 60142 PDYA , 24℃
16 Monascus perpureus KCCM 60168 MEA , 30℃
17 Monascus perpureus KCCM 60344 MEA , 30℃
18 Monascus pilosus KCCM 60399 MEA , 30℃
19 Monascus pilosus KCCM 60398 SDA , 26℃
20 Monascus pilosus KCCM 60396 MEA , 26℃
21 Monascus perpureus KCCM 60169 MEA , 24℃
22 Monascus ruber KCCM 60392 PDA , 28℃
23 Monascus ruber KCCM 60394 SDA , 26℃
24 Monascus perpureus KCCM 60397 MEA , 26℃
25 Monascus ruber KCCM 60400 SDA , 30℃
26 Monascus ruber KCCM 60401 MEA , 30℃
27 Monascus perpureus KCTC 6121 PDA , 24℃
28 Monascus ruber KCTC 6122 PDA , 24℃
29 Monascus pilosus KACC 46219 PDA , 24℃
30 Monascus purpureus KACC 46221 CMA
31 Monascus purpureus KACC 46222 PDA
32 Monascus ruber KACC 46224 PDA
33 Monascus ruber KACC 46225 CMA , 24℃
34 Monascus ruber KACC 46226 CMA
35 Monascus pilosus KACC 46319 PDA , 24℃
(2) 실시예 2 : 1차 모균주 선별
수집한 균주를 이용하여 모균주를 선별하였다. 각 균주를 이용하여 간단하게 홍국을 제조한 후 제조한 홍국내에 있는 monacolin K와 citrinin의 함량을 측정하여 monacolin K의 함량이 많고 citrinin의 함량이 적은 균주를 선발하고 이를 모균주로 사용하고자 하였다.
1) < 홍국미의 제조>
시중에서 구입한 쌀을 이용하여 각 균주를 접종하여 제조하였다. 우선 쌀 50g을 무게에 단 뒤 수돗물에 하루 밤 수침하여 수분을 충분히 함유하게 한 후 수분함유량을 30%로 맞춘 후 이를 250ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 증자하였다. 여기에 수분을 추가로 첨가한 후 골고후 섞은 후 25℃에서 액체 배양한 종균을 5% 첨가하여 접종하고 25℃ 배양기에서 암조건에서 고체 배양하였다. 배양 중 매일 1~2회씩 손으로 쳐서 강제 교반을 시킨 후 7일간 배양 후 배양 종료시점에 꺼내어 60℃에서 열풍건조를 하여 최종 홍국미를 제조하였다.
홍국미 제조를 위한 종균은 먼저 각 균을 PYDA 고체평판배지에서 배양한 후 고체평판배지에서 배양한 균주를 크기 5mm 디스크 5개로 잘라 50ml의 각 액체배지에 접종하여 25℃에서 3일간 180 rpm으로 배양하였다. 배양한 배양액은 고체배양시에 접종하여 홍국균의 종균으로 8% 접종하여 사용하였다.
2) < Monacolin K 및 citrinin 분석>
홍국균이 생산하는 주요 유용성분인 monacolin K와 신장 독소로 작용하는 citrinin의 분석은 식약청에서 고시한 건강기능식품의 기준 및 규격의 시험방법 III.3.6.6 과 III.2.5.4에 따라 표준분석방법인 HPLC 방법을 사용하여 분석하였다.
Monacolin K의 분석은 HPLC (Dionex ultimate3000)를 이용하여 UV detector를 이용하여 237 nm에서 측정하였다. 하기 표 2에서 Monacolin K 분석 조건을 기재하였다. 컬럼은 C18 column (4.6 mm x 250 mm, 5 μm)을 사용하여 0.2% phosphoric acid: acetonitrile = 65: 35(v/v)로 한 용액을 이동상으로 하고 농도 변화를 주며 1 ml/min의 유속으로 주입하여 분석하였다. 표 3은 인산용액(A)과 아세토니트릴(B)의 시간별 농도의 변화 조건을 기재하였다. 표준물질은 비활성형의 경우 Sigma사로부터 구입하여 표준물질 10mg을 75% 에탄올 50mL에 녹여 200ug/mL 농도로 한 다음 사용하였고, 활성형은 비활성형 표준물질 용액 2mL를 0.5mL 0.05N NaOH에 혼합한 후 실온에서 방치 한 후 표준용액으로 사용하였다.
Citrinin의 분석은 HPLC (Dionex ultimate3000)를 이용하여 fluorescence detector를 이용하여 측정하였다. 표 4에서는 Citrinin 분석 조건을 기재하였다. 컬럼은 C18 column (4.6 mm x 250 mm, 5 μm)을 사용하여 0.12% trifluoride acetic acid: acetonitrile = 60: 40(v/v)로 한 용액을 이동상으로 하고 1ml/min의 유속으로 fluorescence detector를 이용하여 λex= 335 nm, λem= 502 nm에서 측정하였다. 표준물질은 Sigma사로부터 구입하여 메탄올로 녹여 사용하였다.
항목 조건
주입량 20 μL
검출기 파장 237 nm
칼럼 온도 40℃
이동상 A : 0.2% 인산용액, B : 아세토니트릴
유속 1.0 mL/분
시간(분) A용액(%) B용액(%)
0 65 35
20 25 75
21 0 100
35 0 100
36 65 35
50 65 35
항목 조 건
주입량 10 μL
검출기 파장 여기파장 : 335 nm, 측정파장 : 502 nm
칼럼 온도 40℃
이동상 0.1% 삼불화초산용액 : 100% 아세토니트릴 (60 : 40)
유속 1.0 mL/분
3) < 홍국미로부터 성분 추출>
홍국미에 포함된 성분인 monacolin K와 citrinin을 추출하기 위해서 제조된 홍국미를 이용하여 홍국미 1g에 ethanol 9ml을 가한 후 실온에서 180rpm, 1hr 동안 교반하여 추출한 다음하여 filter paper로 여과한 뒤 여과액을 이용하여 HPLC 분석을 실시 하였다.
4) <수집 균주를 이용한 monacolin K 생산>
각 균주를 이용하여 간단하게 Monacolin K 생산성을 확인하고 citrinin 생산성을 확인한 결과는 하기 표 5와 같다. 이와 같은 결과를 통하여 citrinin을 생산하지 않고 Monacolin K를 일정량 이상 생산하는 균주인 M. ruber KCCM 60141, M. ruber KCCM 60167, M. ruber KCCM 60394, M. ruber KCTC 6122, M. ruber KACC 46224 5균주를 모균주로 선발하였다.
균주 Monacolin K(ppm) Citrinin(ppm)
M. ruber KCCM 60141 11.32 ND
M. perpureus KCCM 11832 ND 3.49
M. perpureus KCCM 12002 ND 2.62
M. perpureus KCCM 60170 ND ND
M. perpureus KCCM 60461 ND 0.45
M. perpureus KCCM 60462 ND 0.57
M. perpureus KCCM 60016 ND 1.23
M. ruber KCCM 60167 9.78 ND
M. pilosus KCCM 60084 ND ND
M. pilosus KCCM 60160 ND ND
M. ruber KCCM 11845 ND ND
M. perpureus KCCM 11847 ND ND
M. ruber KCCM 11876 ND ND
M. perpureus KCCM 35473 ND 0.39
M. ruber KCCM 60142 ND ND
M. perpureus KCCM 60168 ND 3.65
M. perpureus KCCM 60344 ND ND
M. pilosus KCCM 60399 ND ND
M. pilosus KCCM 60398 ND ND
M. pilosus KCCM 60396 ND ND
M. perpureus KCCM 60169 ND ND
M. ruber KCCM 60392 ND ND
M. ruber KCCM 60394 8.23 ND
M. perpureus KCCM 60397 ND ND
M. ruber KCCM 60400 ND ND
M. ruber KCCM 60401 ND ND
M. perpureus KCTC 6121 ND 5.00
M. ruber KCTC 6122 42.23 ND
M. pilosus KACC 46219 ND ND
M. purpureus KACC 46221 ND 0.42
M. purpureus KACC 46222 ND ND
M. ruber KACC 46224 12.67 ND
M. ruber KACC 46225 ND ND
M. ruber KACC 46226 ND ND
M. pilosus KACC 46319 ND ND
(3) 실시예 3: 모균주의 돌연변이 유발
위와 같은 5가지 모균주를 대상으로 하여 돌연변이를 유발하여 monacolin K 생산성이 올라간 균주를 찾고자 하였다.
1) < NTG 처리를 이용한 돌연변이주 유발>
우선 0.2M citrate buffer(pH 5.0)에 100ug/ml로 NTG ( N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)를 녹인 후 각 균주별로 확보한 포자현탁액(106 spore/ml) 1ml에 NTG 1ml을 첨가하였다. 사멸율이 대략 95%가 되도록 포자현탁액을 NTG가 첨가된 상태에서 25℃에서 1시간동안 처리한 후 증류수로 1,000배 희석하였다. 이 용액을 원심분리하여 상징액을 제거한 뒤 증류수로 3회 반복하여 첨가된 NTG를 washing하였다. 최종적으로 남은 포자현탁액을 PDYA(potate dextrose yeast agar) 배지에 접종하여 25℃에서 배양한 다음 생존한 균주들을 새로운 PDYA 배지에 옮겨줘서 25℃에서 72시간 배양하였다. 배양된 각 돌연변이주는 별도로 보관하면서 실험에 사용하였다. 하기 표 6에는 균주별 NTG 처리를 통해 얻은 돌연변이 균주 수를 기재하였다.
모균주명 확보한 돌연변이 균주수 사멸율
M. ruber KCCM 60141 12 95.2%
M. ruber KCCM 60167 7 96.9%
M. ruber KCCM 60394 4 97.9%
M. ruber KCTC 6122 24 93.8%
M. ruber KACC 46224 7 94.4%
2) < UV -C 처리를 이용한 돌연변이주 유발>
UV-C 처리를 이용하여 돌연변이가 일어난 균주를 찾기 위하여 각 균주별로 액체배양을 통해서 포자현탁액을 얻어서 106 spore/ml 농도로 조정하였다. 각 포자현탁액 4ml을 petri dish에 담근 다음 UV lamp(8W, UV-C)를 이용하여 거리가 15cm가 되도록 조정한 다음 균주별로 사멸율이 95% 이상이 되도록 시간을 조정하여 자외선을 조사하였다. UV-C가 조사된 각 포자현탁액은 증류수로 washing 한 다음 원심분리하여 상징액을 제거하고 포자만 회수하여 PDB(Potato dextrose broth) 액체배지에 25℃에서 12시간 배양한 다음 다시 PDA(Patato dextrose agar) 배지에 옮겨 25℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양된 각 돌연변이주는 별도로 보관하면서 실험에 사용하였다. 하기 표 7은 균주별 UV-C 처리를 통해 얻은 돌연변이 균주 수를 기재하였다.
모균주명 확보한 돌연변이 균주수 사멸율
M. ruber KCCM 60141 24 97.6%
M. ruber KCCM 60167 12 98.8%
M. ruber KCCM 60394 18 98.2%
M. ruber KCTC 6122 8 99.1%
M. ruber KACC 46224 12 98.3%
이상을 통하여 NTG 처리를 통해 돌연변이 주 54균주, UV-C 처리를 통해 74균주 총 128균주를 확보하였다.
(4) 실시예 4 : agar plug 방법을 이용한 monacolin 생산 균주의 선발
본 방법은 기존에 알려진 agar plug 방법을 변형한 Ferron 등의 방법을 적용하여 수행하였다. (Rapid screening of Aspergillus terrus mutants for overproduction of lovastatin, World Journal of Microbiology & Biotechnology 2005 21: 123.125)기존의 방법에 사용한 agar plug 방법을 변형하고, 효모균주인 Candida albicans를 대신 대상 균주로 적용하여 agar plug 방법으로 저해능이 우수한 균주들을 선발하였다.
우선 각 돌연변이 균주를 배양한 다음 콜로니를 형성한 각 균주를 agar plug를 만든 다음 monacolin K에 민감한 균주인 candida albicans 효모가 도말된 배지에서 배양하여 성장저해환의 크기가 큰 균주들 23균주를 1차 선별하였다.
(5) 실시예5 : 선발된 균주를 통한 홍국쌀의 제조 및 Monacolin K 및 citrinin 함량의 측정
선발된 23균주를 쌀에 접종하여 홍국쌀을 제조하였다. 처음과 동일한 방법으로 제조된 홍국쌀 내에 포함된 monacolin K와 citrinin의 함량을 측정하여 최종 균주를 선발하였다(표 8).
균주명 Monacolin K 함량(ppm) Citrinin 함량(ppm)
M. ruber ACEP -1 123 ND
M. ruber ACEP -2 212 12.23
M. ruber ACEP -5 86 ND
M. ruber ACEP -8 112 1.52
M. ruber ACEP -9 36 0.12
M. ruber ACEP -13 75 ND
M. ruber ACEP -18 14 ND
M. ruber ACEP -22 108 1.37
M. ruber ACEP -37 166 0.72
M. ruber ACEP -54 84 ND
M. ruber ACEP -56 95 2.41
M. ruber ACEP -63 88 ND
M. ruber ACEP -70 74 1.38
M. ruber ACEP -74 142 5.23
M. ruber ACEP -91 82 0.17
M. ruber ACEP -93 86 ND
M. ruber ACEP -96 219 2.11
M. ruber ACEP -104 102 ND
M. ruber ACEP -108 34 ND
M. ruber ACEP -109 285 4.62
M. ruber ACEP -112 168 0.61
M. ruber ACEP -118 113 ND
M. ruber ACEP -123 77 0.98
위와 같은 결과를 통하여 citrinin이 생성되지 않는 균주 중에서 Monacolin K 의 생산량이 우수한 균주를 최종 균주로 선발하였다. 전반적으로 monacolin K의 함량이 우수한 돌연변이 균주일수록 citrinin 생성량도 증가하는 경향을 보였으며, 이는 monacolin K와 citrinin의 생합성 경로가 유사한 부분이 있어 돌연변이가 일어날 경우 같이 영향을 주었기 때문인 것으로 판단되었다. 위와 같은 결과 중 citrinin 생성을 하지 않는 균주 중에서는 ACEP-1이 가장 많은 monacolin K를 생성함으로써 이 균주를 생산균주로 선발하였다. 또한, 모균주의 종이 M. ruber 였으므로 돌연변이 신균주도 M. ruber로 명명하였다. 상기 균주를 2012년 11월 7일 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였고, 균주 기탁 번호를 KACC 93162P로 부여받았다.
(6) 실시예 6: 최종 선발 균주의 홍국쌀 배양 및 Monacolin K 및 색소 생산능
1) Monacolin K 및 Active Monacolin K의 함량 및 Citrinin 수치
선발한 균주를 이용하여 모균주와 비교하여 생산량 증가 등을 검토하였다. 모균주와 선발균주를 먼저 PYDA 고체평판배지에서 배양한 후 고체평판배지에서 배양한 균주를 크기 11mm 디스크 5개로 잘라 50ml의 PYDB 액체배지에 접종하여 25℃에서 7일간 180 rpm으로 배양하였다. 배양한 배양액은 고체배양시에 접종하여 홍국균의 종균으로 8% 접종하여 사용하였다.
홍국쌀을 배양하기 위하여 시중에서 구입한 쌀을 이용하여 액체배양한 종균을 접종하여 제조하였다. 제조방법은 실시예1의 방법을 약간 변경하여 우선 쌀 50g을 무게에 단 뒤 수돗물에 하루 밤 수침하여 수분을 충분히 함유하게 한 후 수분함유량을 30%로 맞춘 후 쌀과 배지성분을 250ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 10분간 증자하였다. 여기에 수분을 추가로 첨가한 후 골고후 섞은 후 25℃에서 액체 배양한 종균을 8% 첨가하여 접종하고 고체 배양하였다. 배양 중 매일 1~2회씩 손으로 쳐서 강제 교반을 시킨 후 10일 이상 배양 후 배양 종료시점에 꺼내어 60℃에서 열풍건조를 하여 최종 홍국미를 제조하였다.
최종 홍국미에 포함된 성분인 monacolin K와 citrinin을 분석하기 위해서 제조된 홍국미를 이용하여 홍국미 1g에 ethanol 9ml을 가한 후 실온에서 180rpm, 1hr 동안 교반하여 추출한 다음하여 filter paper로 여과한 뒤 여과액을 이용하여 HPLC 분석을 실시하였다. 표 9는 각각 모균주와 선발 균주 중 M. ruber ACEP-1 에서의 모나콜린 K의 함량, 활성 모나콜린 K의 함량과 비율, 시트리닌의 함량수치를 기재하였다.
균주 균주명 Total
Monacolin K (ppm)		 Active
monacolin K(ppm)		 active
monacolin K ratio(%)		 Citrinin (ppm)
모균주 M. ruber KACC 46224 86.9 41.0 47.2 N.D
선발균주 M. ruber ACEP-1 338.3 177.4 52.4 N.D
이와 같은 결과는 선발균주가 모균주보다 4배 가량 monacolin K를 많이 생산함을 알 수 있었고, 또 생체 내에서 활성이 좋은 활성형의 비율도 모균주보다는 더 많이 생성됨을 알수 있었다. 특히 독소성분인 citrinin의 생산은 모두 생산되지 않으므로써 안전한 생산균주로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
2) 색소생산능력
선발균주의 색소생산능을 비교하기 위하여 모균주인 M. ruber KACC 46224와 선발균주인 M. ruber ACEP-1을 고체평판배지에서 배양한 다음 크기 5mm 디스크 5개로 잘라 50ml의 PYDB 액체배지에 접종하여 25℃에서 7일간 180 rpm으로 배양하였다. 액체 배양 후 배양액은 filter paper로 여과한 다음 여과된 배양액을 96well plate에 100 μ씩 분주하여 spectrophotometer(TECAN)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 각 균주의 색소 생산량은 황색 색소는 385 nm에서, 적색 색소는 495 nm에서 측정한 값으로 비교하였다(표 10).
균주 균주명 A385 (Orange) A495 (Red)
모균주 M. ruber KACC 46224 0.254 0.068
선발균주 M. ruber ACEP-1 1.124 0.804
액체배양시의 색소 생산능을 비교한 경우에 모균주의 황색, 적색 색소 생산능보다 월등히 높은 흡광도를 보여주어 선발한 균주가 매우 높은 색소생산능을 지니고 있음을 알 수 있었다. 특히 황색색소는 5배 가량 적색은 12배 가량 색소생산능이 우수하게 나타나 향후 색소 생산용 균주로도 사용할 수 있을 것으로 보인다.
농업생명공학연구원 KACC93162 20121107

Claims (7)

  1. 모나콜린 K를 다량 생산하고, 시트리닌을 생성시키지 않고 색소 생성능이 있는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 변이주는 모균에 NTG ( N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine), UV를 조사하여 돌연변이화시킨 것을 특징으로 하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 색소 생성능은 오렌지색 및 적색 생성능인 것을 특징으로 하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종하여 배양한 홍국미.
  5. (i) 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P를 쌀에 접종시키는 단계; 및
    (ii) 상기 홍국균 변이주에 접종된 쌀을 배양하는 단계
    를 포함하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 홍국미의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 단계 (i)의 쌀은 수침시켜 수분 함유량을 35-40%로 조절시킨 쌀인 것을 특징으로 하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 홍국미의 제조방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 단계 (i)에서 상기 접종 단계는 25℃에서 액체 배양시킨 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1KACC 93162P 종균을 상기 쌀을 기준으로 8 중량%를 첨가하는 것을 특징으로 하는 홍국균 변이주 Monascus ruber ACEP-1 KACC 93162P 홍국미의 제조방법.
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