KR20140064922A - 네이세리아에서 항원의 발현을 용이하게 하는 조작된 서열 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시는 일반적으로 네이세리아 메닝기티디스에서 원하는 하나 이상의 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드, RNA)의 높은 수준의 발현을 용이하게 하는 비-자연 발생한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 서열의 사용 방법, 예를 들어, 백신 생산에서의 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

네이세리아에서 항원의 발현을 용이하게 하는 조작된 서열 및 사용 방법{ENGINEERED SEQUENCES TO FACILITATE EXPRESSION OF ANTIGENS IN NEISSERIA AND METHODS OF USE}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2011년 8월 31일 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 61/529,776의 우선권을 주장하며, 전문이 본원에 참고로 포함된다.

연방 정부에서 후원하는 연구에 관한 진술

본 발명은 정부 지원으로 미국 국립 보건원 (the National Institutes of Health)에 의해 부여된 승인번호 AI 046464, 및 AI 082263 하에 이루어진다. 정부는 본 발명에 특정 권한이 있다.

효과적인 콜로니화 및 전염을 보장하기 위해, 뇌척수막염균 (meningococcus) 박테리아는 발병에 수반된 유전자의 차등적 발현을 통해 다른 미세환경에 적응하고 반응한다. 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis)에서, 병원성 결정 요인의 존재 또는 부재는 전사 수준에서 조절되는 한편, 결정 요인 수준의 추가의 미세 조정은 전사 및 번역 수준 둘 다에서 이루어질 수 있다. 유전자 활성화는 전형적으로 프로모터 영역, 암호화 영역, 및/또는 전사 종결자 서열 영역에 위치한 단순 DNA 서열 부분 (일부 예에서, 반복) 내의 가역적 변화와 연관된다. 반복의 횟수는 얇은 가닥의 짝짓기오류 (mis-pairing)와 같은 메카니즘을 통해 복제 중에 변형될 수 있고, 그 결과 프레임-이동 돌연변이 (frame-shift mutation)를 도입하거나 중요한 프로모터 간격을 변화시킴으로써 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 반복 단위의 손실 또는 획득은 전형적으로 표면 항원에 결합된 유전자의 발현의 높은 빈도의 온-오프 스위칭 (on-off switching) (프레임-이동/번역 제어의 경우에) 또는 상기 유전자 발현의 수준의 조절 (프로모터 제어의 경우에)을 일으킨다.

PorA는 프로모터 강도가 전사 시작 부위에 관하여 염기쌍 -35 및 -10 사이에 위치한 폴리-G 부분의 변화에 의해 적어도 부분적으로 조절되는 표면 항원의 예이다. NadA는 프로모터 강도가 상변이 (phase variation)에 의해 부분적으로 조절되는 표면 항원의 예이다. 세 가지 다른 작동 요소와 nadR 전사 억제자의 결합과 함께, nadA 프로모터의 업스트림에 위치한 반복 TAAA 서열의 부분은 nadA의 상변이의 빈도를 지시한다. 그러므로 네이세리아 메닝기티디스 숙주에서 강력한 고유의 프로모터의 표면 항원을 과발현하는 것은, 이들 메카니즘이 표면 항원의 불일치 발현을 일으킬 수 있기 때문에, 백신을 생산할 때 어려움을 제공한다.

본 개시는 일반적으로 네이세리아 메닝기티디스에서 원하는 하나 이상의 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드)의 높은 수준의 발현을 용이하게 하는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 서열의 사용, 예를 들어, 백신 생산에서의 사용 방법이 또한 제공된다.

일부 구체예에서, 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 ATGGTT를 포함하는 고유의 엔. 메닝기티디스 porA 프로모터의 5' 부분, 스페이서 (spacer) 부분, 및 서열 TATAAT를 포함하는 고유의 엔. 메닝기티디스 porA 프로모터의 3' 부분을 포함하는 프로모터이며, 스페이서는 식 N¹-TTTCA-N²의 서열을 포함하고, N¹은 X^a(T/A)(T/A)(T/A)(T/G)(C/G)(C/G)(C/G/A)(G/T)CX^b이고 N²는 XcXdXe이며, X^a는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 T 또는 A이고, X^b는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 A 또는 C이고, X^c는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 T 또는 G이고, X^d는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 A 또는 G이고; X^e는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 G이며, 5' 부분, 스페이서, 및 3' 부분은 엔. 메닝기티디스에서 작동 가능하게 결합되어 전사를 제공한다.

일부 구체예에서, 스페이서는 서열 ATATGCCTCCTTTCATA를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 TATATGCCTCCTTTCATA를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 ATAATGCCTCCTTTCATA를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 ATATGCATCATTTCATA를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 TTTTGCGGGCTTTCATA를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 TTTTGCGGGCTTTCAGGG를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 서열 TTTTGCGGGCTTTCAG를 포함한다.

일부 구체예에서, 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로, 식 TFB-X-E-ATG를 포함하는 프로모터이며, TFB는 고유의 nmb1523 프로모터의 전사 인자 결합 서열을 나타내고, E는 고유의 nmb1523 프로모터의 66 염기쌍 연장 서열을 나타내고, X는 TFB 및 E 사이에 위치한 고유의 nmb1523 프로모터의 스페이서 서열을 나타내며, E가 존재할 때, TFB가 없고, TFB가 존재할 때, E가 없다는 단서와 함께, 부분 TFB, X, 및 E가 작동 가능하게 결합되어 엔. 메닝기티디스의 전사를 위해 제공된다. 특정 구체예에서, TFB 및 E는 둘 다 없다.

일부 구체예에서, 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 상기 설명된 프로모터를 포함하는 핵산 구조물이다.

일부 구체예에서, 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아는 상기 설명된 프로모터, 또는 상기 설명된 핵산 구조물를 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아는 박테리아의 게놈에 작동 가능하게 위치가 지정된 내인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 용이하게 하는 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 내인성 폴리뉴클레오티드는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 암호화한다.

일부 구체예는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법과 관련되며, 방법은 상기 설명된 바와 같이 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 한다.

일부 구체예는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법과 관련되며, 방법은 상기 설명된 프로모터 서열을 고유의 표면 항원 유전자의 네이세리아 메닝기티디스 숙주의 업스트림의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하는 단계, 및 네이세리아 메닝기티디스 숙주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 한다.

일부 구체예는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법과 관련되며, 방법은 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 상기 설명된 프로모터 서열을 포함하는 핵산 구조물를 네이세리아 메닝기티디스 숙주의 게놈으로 삽입하는 단계, 및 네이세리아 메닝기티디스 숙주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배양 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 한다.

일부 구체예는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법과 관련되며, 방법은 상기 설명된 제1 프로모터 서열을 고유의 표면 항원 유전자의 네이세리아 메닝기티디스 숙주 업스트림에서 게놈으로 작동 가능하게 삽입하는 단계, 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된, 상기 설명된 제2 프로모터 서열을 포함하는 핵산 구조물를 네이세리아 메닝기티디스 숙주의 게놈으로 삽입하는 단계, 및 네이세리아 메닝기티디스 숙주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 한다. 일부 구체예에서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 같다. 다른 구체예에서는, 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 다르다.

일부 구체예에서, 핵산 구조물는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되며, 이로 인해 프로모터는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동한다. 일부 구체예에서, 핵산 구조물는 같은 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 구조물는 다른 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 원하는 유전자 산물 중 하나 또는 둘은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. 일부 구체예에서, 핵산 구조물는 제2 폴리뉴클레오티드의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자를 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 구조물는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되고, 제2 폴리뉴클레오티드는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되며, 이로 인해 프로모터는 제1, 제2, 및 제3 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동한다. 일부 구체예에서, 핵산 구조물는 같은 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1, 제2, 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 원하는 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 중 둘은 원하는 제1 유전자 산물을 암호화하고 폴리뉴클레오티드 중 하나는 원하는 제1 유전자 산물과 다른, 원하는 제2 유전자 산물을 암호화한다. 일부 구체예에서, 원하는 제1 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. 일부 구체예에서, 원하는 제2 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. 일부 구체예에서, 제1, 제2, 및 제3 폴리뉴클레오티드 각각은 다른 원하는 유전자 산물을 암호화한다. 일부 구체예에서, 원하는 유전자 산물 각각은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. 일부 구체예에서, 핵산 구조물는 제3 폴리뉴클레오티드의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자를 포함한다.

도 1A-1B는 두 개의 상변이 네이세리아 외막 단백질 유전자의 고유의 프로모터의 개략도를 나타낸다. 도 1A는 고유의 nadA 및 porA 프로코너의 주요한 서열의 특징을 나타낸다. 밑줄이 그어진 서열은 상변이의 원인이 되는 세그먼트를 나타낸다. nadA 프로모터의 박스로 둘러싸인 부분은 전사 억제자 NadR (NMB1843)에 의해 인식된 부위를 나타낸다. NadR의 결합은 nadA 프로모터가 기능하는 것을 방지한다. 도 1B는 nadA 및 porA 프로모터 서열의 정렬을 나타내며, 전사 시작 부위의 -35 및 -10 사이에 위치한 염기쌍의 영역에 초점을 맞춘다.
도 2는 두 가지 대표적인 네이세리아 균주, 캡슐 그룹 B 균주 MC58, 및 캡슐 그룹 A 균주 Z2491에서 인자 H 결합 단백질 (fHbp) 모델 유전자/항원의 업스트림 및 다운스트림에 위치한 유전자의 계통도를 나타낸다. 인근의 유전자의 추정된 전사 활성의 방향은 파선으로 표시된다.
도 3: 패널 A는 프로모터 생산량을 증가시키고 그러므로 네이세리아 세포에 의해 생산된 모델 유전자/항원 (예를 들어, fHbp)의 양을 증가시키는 서열을 확인하기 위한 계획을 표현하는 도면을 나타낸다. 고유의 fHbp 프로모터는 상동 재조합을 통해 조작된 프로모터 서열로 대체되었다. 패널 B는 조작된 프로모터 서열의 패밀리를 나타낸다.
도 4는 본 개시의 키메라 프로모터 (X1-X7로 불림)에 존재하는 서열의 특성을 나타내며, 이것은 네이세리아 porA 및 nadA 프로모터 영역의 서열의 조합을 함유한다. X0은 원래의, 변형되지 않은 porA 프로모터 서열이다. 조작된 서열은 nadA 프로모터 (X1)의 스페이서 서열, 또는 다른 서열 변이체를 사용하는 완벽한 대체물로서, 전사 시작 부위에 관하여 -35 내지 -10 뉴클레오티드에 위치한 영역으로 삽입되었다.
도 5는 키메라 프로모터에 존재하는 서열 특징을 설명하는 정렬을 나타낸다. X0은 대조군으로 사용된 원래의, 변형되지 않은 porA 프로모터 서열이다. 그러므로 X0은 폴리 G 부분을 함유하고 상 가변적이다. X1은 nadA 유전자의 공간 서열 (밑줄 그어져 있음)을 함유한다. X2에서 X4는 하나의 추가의 T (X2), 하나의 추가의 A 및 두 번째 T에서 A로의 돌연변이 (X3), 및 하나의 C에서 A로의 돌연변이 (X4)를 포함하는 X1의 돌연변이 변이체이다. X5는 고유의 porA 유전자의 5' 부분 및 고유의 nadA 유전자의 3' 부분을 포함하는 스페이서를 포함한다. X6 및 X7은 고유의 porA 유전자의 5' 부분 및 고유의 porA 유전자의 3' 부분을 포함하는 스페이서 부분을 포함한다.
도 6은 결실된 두 개의 요소, 전사 인자 결합 도메인 및 66 bp 연장 도메인을 함유하는 고유의 nmb1523 프로모터 (SL)의 계통도를 나타낸다. S1은 66 bp 연장 부위가 없지만 전사 인자 결합 부위를 유지하는 nmb1523이고, S2는 66 bp 연장 부위가 있지만 전사 인자 결합 부위가 없는 nmb1523이고, S3은 66 bp 연장 부위가 없고 전사 인자 결합 부위가 없는 nmb1523이다.
도 7: 패널 A는 정량적 웨스턴 블롯으로 측정된, 조작된 CH21A 네이세리아 분리체 사이의 fHbp ID 5의 발현을 나타낸다. 패널 B 및 C는 유동 세포 분석 데이터를 나타낸다.
도 8은 조작된 프로모터의 하나 (X1) 또는 하나 이상의 카피 (X1-S1, 및 X1-X1)를 함유하는 돌연변이 CH21A 균주에서 fHbp ID 5 수준에 대한 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타낸다.
도 9: 패널 A는 정량적 웨스턴 블롯으로 측정된, 조작된 CH38W 네이세리아 분리체의 fHbp ID 5 발현을 나타낸다. 패널 B 및 C는 유동 세포 분석 데이터를 나타낸다.
도 10은 돌연변이 CH38W 균주에서 fHbp ID 9의 발현 수준에 대한 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타낸다.
도 11: 패널 A는 정량적 웨스턴 블롯으로 측정된, 조작된 CH248B (H44/76으로도 알려짐) 네이세리아 돌연변이 분리체 사이에서의 fHbp의 발현 수준을 나타낸다. 패널 B 및 C는 유동 세포 분석 데이터를 나타낸다.
도 12는 CH253B (NZ98/254로도 알려짐) 유도체 사이에서의 fHbp ID 14 발현 수준을 측정하는 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타낸다.
도 13은 정량적 웨스턴 블롯에 의해 측정된, 조작된 CH164X 네이세리아 사이에서의 fHbp ID74의 발현 수준을 나타낸다.
도 14: 패널 A는 CH36W 돌연변이에서 발현 수준의 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타낸다. 패널 B 및 C는 유동 세포 분석 데이터를 나타낸다.
도 15는 전사 종결자 서열을 갖거나 그렇지 않은 CH21A 균주에서의 fHbp ID 5의 발현 수준을 나타낸다.
도 16은 네이세리아 메닝기티디스 FAM18 균주에서 코돈 사용의 빈도를 나타내는 표이다.
도 17은 네이세리아 메닝기티디스 Z2491 균주에서 코돈 사용의 빈도를 나타내는 표이다.
도 18은 fHbp ID 9에 대한 코돈-최적화된 서열 및 원래의 서열 사이의 서열 비교이다. 최적화된 코돈은 회색으로 나타난다.
도 19는 fHbp ID 23의 코돈-최적화된 서열이다.
도 20은 fHbp ID 4의 코돈-최적화된 서열이다.
도 21은 fHbp ID 28의 코돈-최적화된 서열이다.
도 22는 fHbp ID 1의 코돈-최적화된 서열이다.
도 23은 fHbp ID 14의 코돈-최적화된 서열이다.
도 24는 fHbp ID 45의 코돈-최적화된 서열이다.
도 25는 fHbp ID 55의 코돈-최적화된 서열이다.
도 26은 fHbp ID 19의 코돈-최적화된 서열이다.
도 27은 fHbp ID 77의 코돈-최적화된 서열이다.
도 28은 NspA의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb0663).
도 29는 NspA의 코돈-최적화된 서열이다 (nmc0612, nma0862).
도 30은 NHbp의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb2132).
도 31은 TbpB의 코돈-최적화된 서열이다 (Tbp2, nmb0461).
도 32는 TbpA의 코돈-최적화된 서열이다 (Tbp1, nmb0461).
도 33은 LbpB의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb1541).
도 34는 LbpA의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb1540).
도 35는 불투명 단백질 (등급 5, nmb1053)의 코돈-최적화된 서열이다.
도 36은 NadA의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb1994).
도 37은 PorA의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb1429).
도 38은 feta의 코돈-최적화된 서열이다 (nmb1988).
도 39: 패널 A는 표면 항원을 암호화하는 세 개까지의 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 구동하고, 표면 항원-암호화 서열의 다운스트림에 위치한 전사 종결자 서열을 포함하는 조작된 프로모터의 개략도이다. 패널 B는 fHbp 및 NspA의 발현을 구동하고, 표면 항원-암호화 서열의 다운스트림에 위치한 전사 종결자를 포함하는 조작된 프로모터의 개략도이다. 패널 C는 fHbp, TbpB, 및 TbpA의 발현을 구동하고, 표면 항원-암호화 서열의 다운스트림에 위치한 전사 종결자를 포함하는 조작된 프로모터의 개략도이다.
도 40은 CH38W 돌연변이 네이세리아 메닝기티디스 균주에서 fHbp 및 NspA 표면 항원 서열 둘 다의 발현 수준의 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타내며, 표면 항원 서열 둘 다의 발현은 단일 조작된 프로모터에 의해 구동된다.

본 발명이 더 설명되기 전에, 본 발명이 설명된 특정 구체예에 제한되지 않으며, 이러한 구체예들이 물론 변형될 수 있다고 생각되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 제한하려는 것은 아니므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 것으로 생각되어야 한다.

값의 범위가 제공될 경우, 문맥에서 명확히 달리 지시되지 않으면 상기 범위의 상한 및 하한 사이의 중간값은 하한의 단위의 1/10까지, 그리고 상기 범위 내의 어떤 다른 진술된 값이나 중간값도 본 발명 내에 포함되는 것으로 생각된다. 진술된 범위 내에서 어떤 특이적으로 제외되는 한계를 조건으로, 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 또한 본 발명 내에 포함되는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수도 있다. 진술된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하면, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위 또한 본 발명에 포함된다.

달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 이제 바람직한 방법 및 재료가 설명되지만, 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료는 또한 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것에 관하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용되고 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "한", "한", 및 "그"는 문맥상 명확히 달리 지시하지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, "프로모터"에 대한 언급은 하나 이상의 프로모터, 등에 대한 언급을 포함한다. 추가로 청구범위가 어떤 선택적인 요소도 제외하도록 선발될 수도 있다는 것을 유념해야한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용, 또는 "부정적인" 제한의 사용에 관련하여 "단독으로", "단지" 등과 같은 독점적인 용어의 사용에 대한 선행 기준의 역할을 하려는 것이다.

본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그것들의 개시에 대해서만 제공된다. 본원에서는 어느 것도 본 발명이 선행 발명 때문에 이러한 간행물에 선행하여 권리를 받지 못한다는 입장으로서 해석되어서는 안 된다. 게다가, 제공된 간행물의 날짜는 실제 간행일과 다를 수도 있으며, 이것은 개별적으로 확인될 필요가 있다.

정의

다음 용어는 달리 지시되지 않으면 다음 의미를 갖는다. 어떤 정의되지 않은 용어도 그것들의 업계에서 인식되는 의미를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 및 이들의 단편 또는 일부, 및 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 가닥을 나타내는, 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 나타낸다.

"프로모터"는 다운스트림 (3' 방향) 서열의 전사를 개시할 수 있는 서열을 갖는 DNA 조절 영역을 나타낸다.

"전사 종결자"는 업스트림 (5' 방향) 서열의 전사를 종결할 수 있는 DNA 조절 영역을 나타낸다.

"코돈"은 폴리펩티드 사슬의 특정 아미노산 잔기를 암호화하거나 번역의 종결을 암호화하는 일련의 세 개의 인접한 뉴클레오티드 (예를 들어 "종결" 코돈)이다.

"번역 최적화 서열"은 DNA 서열의 더 충분한 발현을 용이하게 하기 위해 같은 아미노산을 암호화하는 여러 코돈 중 하나에 대한 서열을 발현하는 유기체의 선호도에 기초하여 코돈이 변화된 비-천연 DNA 서열을 나타낸다.

"결실"은 자연 발생한 참조 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 염기가 없는, 뉴클레오티드 서열의 변화로서 정의된다.

"삽입" 또는 "추가"는 자연 발생한 참조 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 추가를 발생시키는, 뉴클레오티드 서열의 변화이다.

"치환"은 자연 발생한 참조 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 다른 뉴클레오티드에 의한 하나 이상의 뉴클레오티드의 대체로부터 발생한다.

"구조" 또는 "폴리뉴클레오티드 구조"는 자연에서 발견되지 않는 하나 이상의 기능적 단위를 포함하도록 구성된 핵산 서열을 의미한다.

"작동 가능하게 결합된"은 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열에 결합할 때 DNA 서열 및 조절 서열(예를 들어 프로모터)이 유전자 발현을 허용하는 것과 같은 방법으로 결합된다는 것을 의미한다. DNA 서열 및 조절 서열을 작동 가능하게 결합하는 것은 DNA 서열의 업스트림에서 (예를 들어 5' 방향으로) 조절 서열을 작동 가능하게 삽입함으로써, 또는 조절 서열의 다운스트림에서 (예를 들어 3' 방향으로) DNA 서열을 작동 가능하게 삽입함으로써 달성될 수 있다.

용어 "내인성"은 세포의 어떤 자연 발생한 구성요소도 나타낼 수 있다.

용어 "외인성"은 세포 외부에서 유래한, 세포의 어떤 비-자연 발생 구성요소도 나타낼 수 있다.

용어 "이종 기원" 또는 "키메라"는 상이한 공급원으로부터 유래한 구조에 의해 한정된 두 가지 구성요소이다. 예를 들어, "이종 기원"이 키메라 프로모터의 맥락에서 사용되는 경우 , 키메라 프로모터는 상이한 폴리뉴클레오티드 참조 서열(예를 들어, 알파 참조 뉴클레오티드 서열의 제1 구성요소 및 베타 참조 뉴클레오티드 서열의 제2 구성요소)로부터 유래할 수 있는, 작동 가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 둘 이상의 한정된 세그먼트를 함유하는 키메라 폴리뉴클레오티드는, 각각 다른 참조 서열의 것이며, 자연 발생한 또는 인공의(비-자연 발생한) 것일 수 있다. 비-자연 발생한 키메라 폴리뉴클레오티드 서열은 "인공의 키메라"를 나타내고 , 예를 들어, 자연에서 발견되지 않는 이종 기원 구성요소를 갖는 프로모터를 포함할 수도 있다.

다른 전형적인 "이종 기원" 핵산은 암호화 서열을 포함하는 핵산이 암호화 서열과 다른 유전적 기원을 갖는 조절 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 결합된 발현 구조를 포함한다 (예를 들어, 프로모터, 암호화 서열 또는 둘 다에 관하여 다른 유전적 기원일 수도 있는 원하는 숙주 세포에서의 발현을 제공하기 위해). 예를 들어, fHbp 폴리펩티드 또는 이들의 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합된 키메라 프로모터를 이종 기원 핵산이라고 한다.

본원에 사용된 바와 같이 "도메인 결실 프로모터"는 고유의 프로모터 서열로부터 유래하지만, 하나 이상의 도메인(예를 들어, 전사 인자 결합 도메인 및/또는 염기쌍 연장 도메인)이 결실된 폴리뉴클레오티드 프로모터 서열을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이 "재조합"은 유전자 산물을 암호화하는 핵산, 이러한 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드), 또는 사람의 손에 의해 조작되고, 따라서 자연에서 발견되지 않는 구성 또는 형태로 제공되는 세포(예를 들어, 박테리아 세포)를 나타낸다. 따라서 "재조합"은, 예를 들어, 이종 기원 프로모터에 작동 가능하게 결합된 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다(이와 같이 작동 가능하게 결합된 프로모터의 유전자 산물의 발현을 제공하는 구조는 자연에서 발견되지 않는다). 예를 들어, "재조합 fHbp"는 fHbp 암호화 서열, 자연 발생한 fHbp에 관하여 (예를 들어, 융합 단백질에서와 같이) 변형된 fHbp 폴리펩티드, 등에 이종 기원인 프로모터의 발현을 제공하는 구조에 의해 암호화된 fHbp를 포함한다. 재조합 fHbp 폴리펩티드는 이러한 재조합 fHbp-암호화 구조가 존재하는 네이세리아 메닝기티디스 균주에 내인성이거나 이종 기원일 수 있다는 것을 유념해야 한다. 재조합 유기체(예를 들어 재조합 박테리아)는 영구적인 또는 일시적인 유전적 변화를 달성하기 위해 외인성 DNA를 유기체에 통합함으로써 만들어질 수 있다. 유전적 변화는 외인성 DNA의 숙주 세포의 게놈으로의 통합에 의해, 또는 에피솜의 요소로서 외인성 DNA의 일시적인 또는 안정한 유지에 의해 달성될 수 있다.

표적 유전자의 "넉-아웃(knock-out)" 또는 "넉아웃(knockout)"은 표적 유전자의 기능의 감소를 일으키는, 예를 들어, 표적 유전자 발현은 검출 가능하지 않거나 미미하고, 및/또는 유전자 산물이 기능하지 않거나 크게 기능적이지 않은 유전자 서열의 변화를 나타낸다. 예를 들어, LPS 합성에 수반된 유전자의 "넉아웃"은 유전자의 발현이 검출 가능하지 않거나 미미한 수준으로만 존재하고 및/또는 유전자 산물의 생물학적 활성(예를 들어, 촉매 활성)이 변형 전에 비해 크게 감소하거나 검출 가능하지 않고, 따라서 유전자의 기능이 실질적으로 크게 감소했다는 것을 의미한다. "넉-아웃"은, 예를 들어, 미리 정의된 조건에 노출(예를 들어, 온도, 삼투압, 표적 유전자 변화를 촉진하는 물질에 노출)시 표적 유전자의 변화가 발생할 수 있는 조건부 넉-아웃을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된"은 분자가 자연 발생하는 것과 다른 환경에 있는 원하는 분자(예를 들어, 프로모터)를 설명하기 위한 것이다. 따라서, 예를 들어, "분리된"은 자연 환경으로부터 분리되고 이종 기원 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 자연 발생한 프로모터를 포함한다. "분리된"은 또한 원하는 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플 내에 있는 화합물, 예를 들어, 분리된 표면 항원 단백질을 포함할 수도 있다.

"풍부한"은 샘플에서 원하는 화합물이 실험자 또는 임상의에 의해 조작되어 항원 조성물이 얻어지는 균주에서 상기 항원의 농도보다 적어도 3배 더 높은 총 중량 농도, 보통은 적어도 5배 더 높은 농도, 더 바람직하게는 적어도 10배 더 높은 농도, 더 보통은 적어도 100배 더 높은 농도로 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 특정 항원의 농도가 총 박테리아 조제물(또는 총 박테리아 단백질)의 그램 당 1 미크로그램이면, 풍부한 조제물은 적어도 총 박테리아 조제물(총 박테리아 단백질)의 그램 당 3 미크로그램을 함유할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된"은 자연 환경으로부터 제거되어 자연적으로 결합된 다른 성분이 적어도 60% 없고, 바람직하게는 75% 없고, 가장 바람직하게는 90% 없는 화합물(예를 들어, 표면 항원)을 나타낸다.

용어 "고유의"는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 표면 항원을 암호화하는 프로모터 또는 폴리뉴클레오티드 서열)의 맥락에서 사용될 때 자연 발생한 서열(예를 들어, 자연 발생한 porA 또는 nadA 프로모터 서열, 또는 자연 발생한 fHbp-암호화 서열)을 나타내는데, 그것들이 전형적으로 네이세리아 메닝기티디스 박테리아에서 발견되기 때문이다.

폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 고유의 네이세리아 프로모터로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열)의 맥락에서 "으로부터 유래한"은 폴리뉴클레오티드가 참조 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 자연 발생한 폴리뉴클레오티드 서열에 관하여 변형된 서열을 갖는다는 것을 나타내는 것을 의미하고 , 폴리뉴클레오티드가 만들어지는 공급원 또는 방법에 제한된다는 것을 의미하지 않는다. 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래한 폴리뉴클레오티드 서열은 , 예를 들어, 특정 핵산의 다수의 추가, 결실, 또는 치환을 포함할 수도 있다.

구절 "네이세리아 메닝기티디스에 의해 유발된 질환"은 네이세리아 메닝기티디스 박테리아로 감염시 존재하는 어떤 임상적 증상 또는 임상적 증상의 조합도 포함한다. 이들 증상은 네이세리아 메닝기티디스의 병원성 균주에 의한 상기도 (upper respiratory tract) (예를 들어, 비인두 및 편도선의 점막)의 콜로니화, 점막 및 점막하 조직 혈관상(vascular bed)으로 박테리아의 침투, 패혈증(septicemia), 패혈성 쇼크, 염증, 출혈성 피부 병변, 섬유소 분해 및 혈액 응고의 활성화, 신장, 폐, 및 심부전과 같은 기관 기능장애, 부신 출혈 및 근육 경색, 모세관 누출, 부종, 말초 사지 허혈, 호흡 장애 증후군, 심낭염 및 수막염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

구절 " 대상체의 면역학적 반응을 유도하다"는 특정 항원 조제물의 투여 전 및 후에 측정된 면역학적 반응 지표 사이에 검출 가능한 차이가 있다는 것을 의미한다. 면역 반응 지표는 효소 결합 면역 검정(enzyme-linked immunoassay; ELISA), 살균 검사, 유동 세포 분석법, 면역 침강법, 오우쳐-로우니 면역확산법 (Ouchter-Lowny immunodiffusion), 예를 들어, 스폿 블롯, 웨스턴 블롯 또는 항원 어레이의 결합 검출 검정, 세포 독성 검정, 등에 의해 검출된, 항체 역가 또는 특이성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

"표면 항원"은 네이세리아 메닝기티디스의 표면 구조(예를 들어 외막, 내막, 주변세포질 공간, 캡슐, 알약, 등)에 존재하는 항원이다.

"혈청군" 또는 "캡슐 군"은 본원에 사용된 바와 같이 캡슐 다당류에서 면역학적으로 검출 가능한 변이의 장점에 의한 네이세리아 메닝기티디스의 분류를 나타낸다. 약 12가지의 혈청군, A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, H, I, K 및 L이 알려져 있다. 어느 하나의 혈청군도 다수의 혈청형 및 다수의 혈청아형을 포함할 수 있다.

"혈청형"은 본원에 사용된 바와 같이 외막 단백질 포린 B에서 단클론성 항체 한정 항원의 차이를 기반으로 하는 네이세리아 메닝기티디스 균주의 분류를 나타낸다.

"혈청아형"은 본원에 사용된 바와 같이 포린 A로 불리는 외막 단백질 상의 항체 한정 항원의 변화, 또는 DNA 시퀀싱으로부터 추정된 아미노산 서열의 VR 타이핑을 기반으로 하는 네이세리아 메닝기티디스 균주의 분류를 나타낸다(Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182: 1169; 또한 Multi Locus Sequence Typing 웹사이트를 참고하면 된다). PorA 단백질 사이에서 대부분의 가변성은 8개의 추정상, 표면 노출된 루프 중 두 가지 (루프 I 및 IV)에서 발생한다. 가변 루프 I 및 IV는 각각 VR1 및 VR2로 지정되었다. 단일 혈청아형은 다수의 혈청군 및 다수의 혈청형에서 발견될 수 있다.

"일가 백신"은 단일 균주로부터 제조된 소포 백신을 나타낸다. 균주는 돌연변이 균주(즉, 유전적으로 변형됨) 또는 야생형 균주(자연 발생함)일 수도 있다. 이러한 백신은 다른 면역원성 또는 항원 성분과 조합되어 백신 조성물을 제공할 수도 있다(예를 들어, 하나 이상의 재조합 단백질 항원과 조합됨).

"이가 백신"은 두 가지 다른 균주로부터 제조된 소포 백신을 나타낸다. 두 개의 균주는 돌연변이 균주 또는 야생형 균주 또는 돌연변이 및 야생형 균주의 조합일 수도 있다. 이러한 백신은 다른 면역원 또는 항원 성분과 조합되어 백신 조성물을 제공할 수도 있다(예를 들어, 하나 이상의 재조합 단백질 항원과 조합됨).

용어 "대상체"는 본원에 사용된 바와 같이 사람 또는 비-사람 동물, 예를 들어, 사람, 영장류, 말, 소, 개, 고양이, 설치류, 등과 같은, 가정용 동물 및 가축, 및 동물원의 동물, 스포츠 동물, 실험 동물, 또는 애완 동물을 포함하는 포유동물을 나타낼 수 있다.

상세한 설명

본 개시는 일반적으로 재조합 숙주 세포에서 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드, RNA)의 일정하고, 높은 수준의 발현을 용이하게 하는 , 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 서열의 사용 방법, 예를 들어, 백신 생산에서의 사용 방법 또한 제공된다.

하기 더 상세히 설명된 바와 같이, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 프로모터로서 기능하는 한편, 다른 것들은 전사 종결자로서 기능한다. 본원에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열은 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드, RNA)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합될 수도 있고, 결과의 구조는 숙주 세포, 예를 들어, 네이세리아 메닝기티디스 세포에 도입되어 원하는 하나 이상의 유전자 산물을 발현할 수 있는 재조합 숙주를 높은 수준으로 생성할 수도 있다. 원하는 단백질을 암호화하는 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 숙주 세포에서 원하는 단백질의 발현을 증가시키기 위해 코돈-최적화될 수도 있다.

조작된 프로모터

본 개시는 일반적으로 숙주 세포, 예를 들어, 네이세리아 세포, 예를 들어, 엔. 메닝기티디스, 엔. 고노르회애 (N. gonorrhoeae) 또는 관련 엔. 플라브센스 (N. flavescens), 엔. 락타미카 (N. lactamica), 엔. 폴리사카레아 (N. polysaccharea), 엔. 시네레아 (N. cinerea), 엔. 뮤코사 (N. mucosa), 엔. 서브플라바 (N. subflava), 엔. 시카 (N. sicca), 엔. 엘롱가타 (N. elongata), 또는 헤모필루스 종 (haemophilus spp)에서 프로모터로서 작용할 수 있는 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 개시된 프로모터 서열은 숙주 세포에서 높은 수준의 유전자 산물(예를 들어, 원하는 단백질, 예를 들어, 표면 항원)의 발현을 용이하게 한다. 조작된 프로모터는, 예를 들어, 둘 이상의 다른 고유의 네이세리아 프로모터(또는 이들의 변이체)의 서열을 포함하는 키메라 프로모터일 수 있다. 조작된 프로모터는 또한 , 예를 들어, 프로모터의 하나 이상의 기능적 도메인이 결실된 고유의 네이세리아 프로모터로부터 유래한 도메인 결실 프로모터일 수도 있다(전사 인자 결합 도메인 및/또는 염기쌍 연장 도메인이 결실된 경우). 도 3은 네이세리아 숙주 균주에서 증가된 프로모터 산출을 용이하게 하는지에 대하여 이후에 테스트된 서열을 확인하기 위해 이용된 계획을 나타내는 도면을 나타낸다.

본 개시의 조작된 프로모터는 그것의 고유의 프로모터의 유전자 산물의 발현에 비해 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75% 이상이 작동 가능하게 결합된 원하는 유전자 산물의 발현의 증가를 제공할 수 있다. 본 개시의 조작된 프로모터는 그것의 고유의 프로모터의 유전자 산물의 발현에 비해 적어도 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배 또는 적어도 약 15배인 원하는 유전자 산물의 발현의 증가를 제공할 수 있다.

본 개시의 전사 종결자와 결합될 때, 전사 종결자가 있는 조작된 프로모터는 전사 종결자가 없는 조작된 프로모터에 의해 제공된 것 이상, 예를 들어, 전사 종결자가 없는 조작된 프로모터에 비해 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30% 이상만큼의 상기 원하는 유전자 산물의 발현의 추가의 증가를 제공할 수 있다.

키메라 프로모터

고유의 네이세리아 프로모터 서열(또는 이들의 변이체)의 조합을 함유하는, 본 개시의 조작된 프로모터는 본원에서 키메라 프로모터로서 언급된다.

일반적으로, 키메라 프로모터는 1) 인접한 뉴클레오티드 서열 ATGGTT를 갖는 고유의 porA 프로모터의 5' 부분(전사 시작 부위에 관한 그것의 위치로 인해 "-35 영역"으로 불림), 2) 스페이서 부분, 및 3) 인접한 뉴클레오티드 서열 TATAAT를 갖는 고유의 PorA 프로모터의 3' 부분(전사 시작 부위에 관한 그것의 위치로 인해 "-10 영역"으로 불림)을 함유한다. 도 1A 및 1B는 고유의 NadA 및 PorA 프로모터 서열의 개략도를, 그것들의 주요 서열의 특징과 함께, 나타낸다.

스페이서 부분은 일반적으로 고유의 PorA 및/또는 NadA 프로모터로부터 유래한 10 내지 11개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 5' 부분, 서열 TTTCA를 갖는 5개의 인접한 뉴클레오티드, 및 고유의 PorA 또는 NadA 프로모터로부터 유래한 1 내지 3개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 3' 부분을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유사한"은 참조 프로모터 또는 근원 프로모터의 같은 지리적 영역으로부터 비롯된 키메라 프로모터의 이종 기원 부분을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, NadA 프로모터의 -35 영역에 인접하게 위치한 10개의 인접한 뉴클레오티드의 서열은 PorA 프로모터의 -35 영역에 인접하게 위치한 10개의 인접한 뉴클레오티드의 서열과 "유사"할 것이다. 도 4는 본 개시의 여러 키메라 프로모터의 서열의 특징을 나타낸다.

본 개시의 키메라 프로모터의 스페이서 부분은, 일반적으로, 5'에서 3' 방향으로, N¹이 TTTCA와 인접하고 식 X^a(T/A)(T/A)(T/A)(T/G)(C/G)(C/G)(C/G/A)(G/T)CX^b인 경우 식 N¹-TTTCA-N²의 구조를 가지며,

X^a가 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 T 또는 A이고;

X^b가 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 A 또는 C이고;

N²가 TTTCA와 인접하고 식 X^cX^dX^e인 경우,

X^c가 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 T 또는 G이고,

X^d가 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 A 또는 G이고,

X^e가 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 G이다.

스페이서의 구성요소는 고유의 네이세리아 프로모터 (예를 들어, 고유의 PorA 프로모터)의 부분을 또 다른 고유의 네이세리아 프로모터 (예를 들어, 고유의 NadA 프로모터)의 유사한 부분으로 대체함으로써 선택되었다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 치환, 제거, 또는 추가를 포함하는, 유사한 서열의 변이체가 사용되었다. 도 5는 본 개시의 키메라 프로모터의 정렬을 나타낸다.

일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 ATATGCCTCCTTTCATA이다. 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 TATATGCCTCCTTTCATA이다. 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 ATAATGCCTCCTTTCATA이다. 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 ATATGCATCATTTCATA이다. 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 TTTTGCGGGCTTTCATA이다. 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 TTTTGCGGGCTTTCAGGG이다. 일부 구체예에서, 스페이서 부분은 서열 TTTTGCGGGCTTTC AG이다.

본 개시의 키메라 프로모터는 고유의 프로모터의 유전자 산물의 발현 수준에 비해 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 50%, 약 75% 이상의 원하는 유전자 산물의 발현 증가를 제공할 수 있다. 본 개시의 조작된 프로모터는 그것의 고유의 프로모터의 유전자 산물의 발현 수준에 비해 적어도 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배, 약 15배 이상의 원하는 유전자 산물의 발현의 증가를 제공할 수 있다.

본 개시의 전사 종결자와 결합될 때, 키메라 프로모터 및 전사 종결자는 전사 종결자가 없는 키메라 프로모터에 의해 제공된 것 이상, 예를 들어, 전사 종결자가 없는 키메라 프로모터에 비해 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30% 이상만큼의 원하는 유전자 산물의 발현의 추가의 증가를 제공할 수 있다.

도메인 결실 프로모터

본 개시의 조작된 프로모터는 고유의 프로모터 서열로부터 유래하며 고유의 프로모터의 하나 이상의 기능적 도메인이 결실된 도메인 결실 프로모터로서 언급된다. 일반적으로, 본 개시의 도메인 결실 프로모터는 고유의 네이세리아 프로모터로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 도메인 결실 프로모터는 고유의 네이세리아 nmb1523 프로모터로부터 유래한다. 고유의 네이세리아 nmb1523 프로모터는 길이가 대략 580개의 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드 105 및 369 사이에 위치한 전사 인자 결합 도메인을 갖는다. 고유의 nmb1523 프로모터는 또한 뉴클레오티드 511 및 577 사이에 위치한 66 염기쌍 연장 도메인을 갖는다. 도 6은 본 개시의 여러 도메인 결실 프로모터의 개략도를 나타낸다.

도메인 결실 프로모터는, 5'에서 3' 방향으로 , 다음 일반식

TFB-X-E-ATG

이며, 본원에서 TFB는 고유의 nmb1523 프로모터의 전사 인자 결합 서열을 나타내고, E는 고유의 nmb1523 프로모터의 66 bp 연장 서열을 나타내고, X는 고유의 nmb1523 프로모터의 TFB 서열 및 E 서열 사이에 자리한 스페이서 서열을 나타내며, 단, 5'에서 3' 방향으로, 다음 식 TFB-X-ATG, X-E-ATG의 도메인 결실 프로모터를 제공하기 위해, TFB가 존재할 때는, E가 없고, E가 존재할 때는, TFB가 없다. 일부 구체예에서, 식 X-ATG를 갖는 도메인 결실 프로모터를 제공하기 위해, TFB 및 E 둘 다가 없다.

일부 구체예에서, 도메인 결실 프로모터는, 5'에서 3' 방향으로, 식 TFB-X-ATG이고 이로 인해 프로모터는 전사 인자 결합 도메인을 함유하는 고유의 nmb1523 프로모터 서열을 포함지만, 66 염기쌍 연장 도메인이 없다. 한 예에서, 이 도메인 결실 프로모터의 서열은 다음을 포함한다:

ATTTGTCCTTTCAGGAACAGCAGATTAATTACAGGCGCATTCTAACACAACCGCCGCGCCGGCCGATTACCGTTAACCTGTTCATAAACTGTACAGCACATATTTCAATGTAAATCTTTGTTATTTTATTGCGGTGTAACTTTTTTACAACATTCTTAAAACCATTCCGACCTGTCTGCCGACTTTCCCAATCCGCCTTAATAAATCATACAAGATACTGAAATTATATTAATCTCTATAATATTTATCCCTATCGAATTTTTAACAGCAAAACCGTTTTACAGGATTTATCAATCCGCCCGCCAGAAAACTTTTCATTCAAACCTTTTTCCCATCTGTACGACATTGCAATCCCTTATTCCATAGTGCATAATTACGCAAATTCAGCGATGAATTTCCAACCCGG.

다른 구체예에서, 도메인 결실 프로모터는 , 5'에서 3' 방향으로, 식 X-E-ATG이고 이로 인해 프로모터는 66 염기쌍 연장 도메인을 함유하는 고유의 nmb1523 프로모터 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 전사 인자 결합 도메인이 없다. 한 예에서, 도메인 결실 프로모터의 서열은 다음을 포함한다:

CATGGATCCACAGCAAAACCGTTTTACAGGATTTATCAATCCGCCCGCCAGAAAACTTTTCATTCAAACCTTTTTCCCATCTGTACGACATTGCAATCCCTTATTCCATAGTGCATAATTACGCAAATTCAGCGATGAATTTCCAACCCGGTTTGTAGTATGGTCGATAAAGACCTATTTGTTTCAATAATTTAAATTGGTTCTAAAGGTTACTCATATGCGA.

다른 구체예에서, 도메인 결실 프로모터는 , 5'에서 3' 방향으로, 식 X-ATG이고 이로 인해 프로모터는 스페이서 요소를 포함하지만, 고유의 nmb1523 프로모터의 전사 인자 결합 도메인 및 66 염기쌍 연장 도메인이 없다. 한 예에서, 도메인 결실 프로모터의 서열은 다음을 포함한다:

CATGGATCCACAGCAAAACCGTTTTACAGGATTTATCAATCCGCCCGCCAGAAAACTTTTCATTCAAACCTTTTTCCCATCTGTACGACATTGCAATCCCTTATTCCATAGTGCATAATTACGCAAATTCAGCGATGAATTTCCAACCCGGCATATGCGA.

본 개시의 도메인 결실 프로모터는 그것의 고유의 프로모터의 유전자 산물의 발현 수준에 비해 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 50%, 약 75% 이상만큼의 원하는 유전자 산물의 발현의 증가를 제공할 수 있다. 본 개시의 도메인 결실 프로모터는 그것의 고유의 프로모터의 유전자 산물의 발현 수준에 비해 적어도 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 8배, 약 10배 이상의 유전자 산물의 발현의 증가를 제공할 수 있다.

본 개시의 전사 종결자와 조합될 때, 도메인 결실 프로모터 및 전사 종결자는 전사 종결자가 없는 도메인 결실 프로모터에 의해 제공된 것 이상, 예를 들어, 전사 종결자가 없는 도메인 결실 프로모터에 비해 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30% 이상만큼의 추가의 원하는 유전자 산물의 발현의 증가를 제공할 수 있다.

전사 종결자

본 개시는 일반적으로 전사 종결자로서 기능하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며, 이것은 숙주 세포, 예를 들어, 네이세리아 세포에서 유전자 산물의 효율적인 발현을 더 용이하게 할 수 있다. 이론에 결부되지 않고, 전사 종결자 서열은 일반적으로 DNA 주형 서열로부터 RNA 폴리머라제를 분리함으로써 기능하고, 따라서 전사 과정을 종결한다.

본 개시는 일반적으로 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합되어 효율적인 발현을 용이하게 할 수 있는 전사 종결자 서열을 제공한다. 일부 구체예에서, 전사 종결자 서열이 프로모터 서열, 암호화 서열, 또는 둘 다에 이종 기원인, 전사 종결자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조가 제공된다. 다른 구체예에서, 전사 종결자 서열은 자연에서 암호화 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 부착되어 발견되는 고유의 서열일 수 있다. 전사 종결자 서열은 고유의 표면 항원 암호화 서열, 예를 들어, fHbp 암호화 서열, 특히 자연적으로 다른 fHbp 암호화 서열에 비해 증가된 발현을 나타내는 고유의 fHbp 암호화 서열의 자연 발생한 전사 종결자일 수 있다.

전사 종결자로서 기능하는 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로 다음 서열과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다:

TAACCATTGTGAAAATGCCGTCCGAACACGATAATTTACCGTTCGGACGGCATTTTGTA

일부 구체예에서, 전사 종결자 서열은 상기 개시된 서열과 약 90%까지, 약 95%까지, 또는 약 98%까지의 서열 동일성을 갖는다.

도 15에 나타난 바와 같이, 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자 서열의 존재는 재조합 숙주에서 표면 항원의 증가된 발현을 일으켰다. 발현을 증가시키기 위한 전사 종결자 서열의 사용은 실시예 9에서 더 설명된다.

폴리뉴클레오티드 구조

본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 설명된 방법에 사용되는 구조, 예를 들어, 발현 구조와 같이, 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예는 원형, 선형, 이중 가닥, 염색체 외 DNA 분자 (플라스미드), 코스미드(cosmid) (람다 파지(lambda phage)의 COS 서열을 함유하는 플라스미드), 비-고유의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 게놈, 등을 포함한다. "벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 이동시킬 수 있는 어떤 분자 또는 시약이다. 전형적으로, "벡터 구조", "발현 벡터", 및 "유전자 이동 벡터"는 원하는 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 이동시킬 수 있는 어떤 폴리뉴클레오티드도 의미하며, 이것은 벡터의 모두 또는 일부의 게놈 통합, 또는 염색체 외 요소로서 벡터의 일시적 또는 유전적 유지에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 용어는 클로닝 및 발현 비히클 (vehicle), 뿐만 아니라 통합 벡터를 포함한다.

본 개시의 구조는 , 예를 들어, 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드 또는 mRNA)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합된 조작된 프로모터를 포함하는 발현 구조를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 발현 구조는 또한 원하는 암호화 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자 서열을 포함할 수도 있다. "발현 카세트"는 원하는 하나 이상의 암호화 서열의 발현을 지시할 수 있는 어떤 핵산 구조물도 포함하며, 이것은 발현 카세트의 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 이러한 카세트는 발현 카세트를 표적 세포로 이동시키기 위해 , "벡터", "벡터 구조", "발현 벡터", 또는 "유전자 이동 벡터"로 구성될 수 있다. 따라서, 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다.

본 개시의 핵산 구조물는 또한 구조 사이로 또는 숙주의 게놈으로 핵산 서열의 이동을 용이하게 할 수 있는 특이적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 제한 효소 인식 서열 또는 상동 재조합 서열)을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 조작된 프로모터(또는 조작된 프로모터를 포함하는 발현 구조)가 세포의 게놈의 원하는 위치에서 상동 재조합에 의한 표적 서열의 숙주 세포(예를 들어, 네이세리아 세포)의 게놈으로의 게놈 삽입을 용이하기 하기 위해 상동 재조합 서열에 의해 플랭크(flank)된 구조가 제공될 수도 있다.

본 개시는 일반적으로 원하는 유전자 산물 (예를 들어, 원하는 단백질, 예를 들어, 표면 항원 (예를 들어, fHbp)과 같은, 원하는 항원)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 본 개시의 조작된 프로모터 서열을 포함할 수도 있는 발현 구조를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 발현 구조는 또한 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 3'에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 발현 구조는 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수도 있다. 이러한 구체예에서, 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다른 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화할 수도 있거나, 같은 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화할 수도 있다.

일부 구체예에서, 본 개시의 발현 구조는 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 조작된 프로모터 서열을 포함할 수도 있고, 이로 인해 단일 조작된 프로모터 서열은 원하는 단일 유전자 산물(예를 들어, 단백질)의 발현을 구동한다.

일부 구체예에서, 본 개시의 발현 구조는 원하는 유전자 산물 (예를 들어, 단백질)을 암호화하는 둘 이상, 또는 셋 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 같이 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 조작된 프로모터 서열을 포함할 수도 있고, 이로 인해 단일 조작된 프로모터 서열은 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 구동한다. 이러한 구체예에서, 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 같은 유전자 산물을 암호화할 수도 있거나 , 다른 유전자 산물을 암호화할 수도 있다(예를 들어, 다른 표면 항원을 암호화할 수도 있다). 상기 설명된 바와 같이, 일부 구체예에서, 본 개시의 발현 구조는 원하는 유전자 산물-암호화 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자 서열을 포함할 수도 있다. 본 개시의 발현 구조는 또한 구조 사이로 또는 적합한 숙주로 폴리뉴클레오티드 서열의 이동을 용이하게 하는 제한 효소 인식 서열 및/또는 상동 재조합 서열을 함유할 수도 있다.

재조합 숙주

일반적으로, 본 개시는 핵산 구조물의 복제 및 발현을 위한 재조합 숙주의 사용을 수반한다. 다양한 적합한 숙주 세포(예를 들어, 다양한 적합한 네이세리아 균주) 중 어느 것도 본 개시의 구조 및 방법과 함께 사용될 수 있으며, 자연 발생한 균주 및 유전적으로 변형된 균주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 구체예에서, 복제 숙주는 본 개시의 핵산 구조물를 복제하기 위해 사용된다. 구조는 어떤 적합한 기술을 사용해서도 복제 숙주로 도입되고 , 숙주 세포는 이후 구조의 복제를 용이하게 하는 적절한 조건 하에 배양된다. 숙주 세포가 충분한 시간 동안 배양된 후, 세포는 용해되고 복제된 핵산 구조물는 본 개시의 방법에서 추가의 사용을 위해 분리되고 정제된다.

적합한 복제 숙주는 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, DH5 알파 컴피턴트 세포(competent cell), DH10B 세포, X1-1 Blue 세포, JM109 세포, 등을 포함한다.

다양한 적합한 숙주 세포 중 어느 것도 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열의 다양한 조합을 사용하여 원하는 항원을 발현하기 위한 발현 숙주로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 병원성 또는 공생성 헤모필루스 종 또는 네이세리아 종 또는 병원성 네이세리아 종, 특히 사람에 대하여 병원성인 균주로부터 유래하거나 사람에 대하여 병원성 또는 공생성인 균주로부터 유래한 균주가 발현 숙주로서 사용된다. 전형적인 네이세리아 종은 엔. 메닝기티디스, 엔. 플라브센스, 엔. 고노르회애, 엔. 락타미카, 엔. 폴리사카레아, 엔. 시네레아, 엔. 뮤코사, 엔. 서브플라바, 엔. 시카, 엔. 엘롱가타, 등을 포함한다. 박테리아 균주의 맥락에서 "으로부터 유래된"은 균주가 모체 균주의 생체 내, 또는 시험관 내 배양의 계대 배양을 통해 얻어졌고 및/또는 모체 균주의 변형에 의해 얻어진 재조합 세포임을 나타내는 것을 의미한다.

엔. 메닝기티디스 균주는 다른 표면 항원과 상호작용하는 다클론성(Frasch, C. E. and Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127: 149-154) 또는 단클론성 항체와의 반응에 기초하여 혈청학적 캡슐군 (혈청군으로도 불림), PorB 혈청형 및 PorA 혈청형으로 나누어질 수 있다. 혈청군으로 분류는 캡슐 다당류에서 면역학적으로 검출 가능한 변이에 기초한다. 약 12개의 혈청군 (A, B, C, X, Y, Z, 29-E, 및 W-135)이 알려져 있다. PorA 혈청형은 또한 두 개의 가변 영역(VR1 및 VR2)의 DNA 서열 차이에 의해 분류될 수 있고, VR 타입으로 언급된다(예를 들어, Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-78; Sacchi CT, et al. Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5:845-55; Sacchi et al, J. Infect Dis 2000;182: 1169-76을 참고하면 된다).

발현 숙주로서 사용되기 위한 네이세리아 균주는 바람직할 수도 있는 많은 다른 특성에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 균주는 바람직한 혈청군, 혈청형, 혈청아형, 등; 감소된 캡슐 다당류 생성물, 등에 따라 선택될 수도 있다.

대안으로 또는 추가로, 적합한 발현 숙주 균주는 캡슐 결핍 균주일 수 있다. 캡슐 결핍 균주는 백신이 투여된 대상체에서 큰 자가항체 반응을 유도하는 감소된 위험을 제공하는 소포-기반 백신을 생성하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 숙주 세포 표면에서 시알산과 교차 반응하는 항체의 생성으로 인해). "캡슐 결핍" 또는 "캡슐 다당류의 결핍"은 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생한 균주의 그것보다 더 낮거나, 균주가 유전적으로 변형된 경우, 캡슐 결핍 균주가 유래되는 모체 균주의 그것보다 더 낮은 박테리아 표면상의 캡슐 다당류의 수준을 나타낸다. 캡슐 결핍 균주는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상만큼의 표면 캡슐 다당류 생성을 감소시키는 균주를 포함하고, 캡슐 다당류가 박테리아 표면상에서 검출 불가능한 (예를 들어, 항-캡슐 다당류 항체를 사용하는 전체 세포 ELISA에 의해) 균주를 포함한다.

캡슐 결핍 균주는 자연 발생한 또는 재조합에 의해 발생한 유전적 변형으로 인해 캡슐 결핍된 것들을 포함한다. 자연 발생한 캡슐 결핍 균주 (예를 들어, Dolan-Livengood et al. J. Infect. Dis. (2003) 187 (10): 1616-28을 참고하면 된다), 뿐만 아니라 캡슐 결핍 균주를 확인하고 및/또는 발생시키는 방법 (예를 들어, Fisseha et al. (2005) Infect. Immun. 73 (7):4070-4080; Stephens et al. (1991) Infect Immun 59 (11):4097-102; Frosch et al. (1990) Mol Microbiol. 1990 4 (7): 1215-1218을 참고하면 된다)은 업계에 알려져 있다.

캡슐 다당류의 감소된 생성을 제공하기 위한 네이세리아 숙주 세포의 변형은, 예를 들어, 변형이 변형 전 모체 세포에 비해 감소된 수준의 캡슐 다당류를 제공하는 경우, 캡슐 합성에 수반된 하나 이상의 유전자의 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 유전적 변형은 균주를 캡슐 결핍으로 만드는 (예를 들어, 하나 이상의 캡슐 생합성 유전자에서 하나 이상의 삽입, 결실, 치환 등으로 인해) 하나 이상의 캡슐 생합성 유전자에서 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열의 변화를 포함할 수 있다. 캡슐 결핍 균주는 하나 이상의 캡슐 유전자가 부족하거나 비-기능성일 수 있다.

시알산 생합성이 결핍된 균주는 또한 발현 숙주로서 사용될 수도 있다. 이러한 균주는 시알산 항원과 교차 반응하는 항-시알산 항체를 유도할 감소된 위험을 갖고, 개선된 제조 안전성을 추가로 제공할 수 있는 소포의 생성을 제공한다. 시알산 생합성의 결함을 갖는 균주(자연 발생한 변형 또는 조작된 변형으로 인해)는 시알산 생합성 경로의 많은 다른 유전자 중 어느 것도 결핍될 수 있다. 특히 흥미로운 것은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 2-에피머라제 유전자(synX AAF40537.1 또는 siaA AAA20475로 알려짐)에 의해 암호화된 유전자 산물이 결핍된 균주이며, 불활성화된 이 유전자를 갖는 균주가 특히 흥미롭다. 예를 들어, 한 구체예에서, 캡슐 결핍 균주는 기능적 synX 유전자 산물의 생성을 방해함으로써 발생한다 (예를 들어, Swartley et al. (1994) J Bacteriol. 176 (5): 1530-4를 참고하면 된다).

캡슐 결핍 균주는 또한 캡슐 다당류에서 감소된 균주를 선택하기 위해 비-재조합 기술을 사용하여, 예를 들어, 살균 항-캡슐 항체의 사용에 의해 자연 발생한 균주로부터 발생할 수 있다.

둘 이상의 발현 숙주의 사용이 수반되는 경우 (예를 들어, 다른 균주의 소포의 항원 조성물을 생성하기 위해), 숙주는 하나 이상의 균주 특성이 다르기 위해 선택될 수 있다.

재조합 네이세리아 균주의 성장 및 유지에 적절한 방법이 업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 박테리아 세포는 적절한 성장 배지(예를 들어 0.25% 글루코스 (w/v) 및 0.02 mM 시티딘 5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산 (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, US)이 보충되거나 없는 묄러-힌튼 브로스 (Mueller-Hinton broth) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, US), 일반 또는 변형된 프란츠 배지(Frantz Media), 최소 배지, 캐틀링 배지 (Catling Media), 등)에서 대략 35-37 ℃에서 키워진다.

조작된 프로모터의 발현에 적합한 유전자 산물

본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열 및 방법은 일반적으로 재조합 숙주에서 원하는 어떤 유전자 산물(예를 들어, 원하는 단백질, 예를 들어, 원하는 표면 항원)의 일정하고, 높은 수준의 발현 또한 용이하게 한다. 본 개시의 프로모터 서열 및/또는 전사 종결자 서열은 재조합 숙주에서 발현을 용이하게 하기 위해 원하는 어떤 유전자 산물도 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 암호화 서열은 번역 최적화 서열을 포함하며, 암호화 서열의 코돈은 숙주 유기체의 효율적인 발현을 용이하게 하기 위해 최적화되었다. 이 기술은 하기 더 상세히 설명된다.

다음은 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 예상되는 유전자 산물의 예이다. 유전자 산물의 다음 예는 어떠한 방식으로도 제한되지 않고, 당업자들은 본 개시의 서열 및 방법이 어떤 원하는 유전자 산물을 발현하기 위해서도 사용될 수 있다는 것을 쉽게 인정할 것이다.

발현에 적합한 원하는 유전자 산물은 재조합 폴리펩티드가 숙주 세포에 내인성 또는 외인성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수도 있는 경우, 자연 발생한 폴리펩티드(예를 들어, 내인성 게놈 서열에 의해 암호화됨), 및 재조합 폴리펩티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드가 외인성 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드는 숙주 세포에 내인성이 아닌 자연 발생한 폴리펩티드의 아미노산을 가질 수도 있고 및/또는 비-자연 발생한 아미노산 서열(예를 들어, 자연에서 발생하지 않은 아미노산 서열을 갖는 인공의 폴리펩티드)을 가질 수도 있다. 폴리펩티드는 다양한 등급 중 어느 것도 될 수 있으며, 예를 들어, 분비된 단백질, 외막 단백질(예를 들어, 표면 항원), 및 세포 내 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 원하는 유전자 산물은 또한 RNA가 숙주 세포에 내인성 또는 외인성일 수도 있는 경우, 단백질-암호화 및 비-단백질-암호화 RNA를 포함한다.

본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 방법은, 예를 들어, 재조합 숙주에서 백신 생성을 용이하게 하기 위해, 본원에 제공된 것들과 같은 유전자 산물의 발현을 용이하게 하는데 있어서의 사용법을 발견한다. 하기 더 상세한 설명의 실시예에서 착수된 바와 같이, 네이세리아 외막 단백질 및 그것들의 변이체 및 하위 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 유전자 산물이 업계에 잘 알려져 있고 본 개시의 서열 및 방법에 관련하여 사용법을 발견한다.

fHbp

문헌에서 GNA1870, ORF2086, rLP-2086, 및 "741"으로도 알려진 인자 H 결합 단백질 (fHbp)은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. 도 2는 두 개의 다른 네이세리아 균주에서 fHbp 유전자의 업스트림 및 다운스트림에 위치한 유전자의 계통도를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이 "fHbp 폴리펩티드"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 자연 발생한 fHbp 폴리펩티드와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고 네이세리아 메닝기티디스 박테리아 상에 존재하는 자연 발생한 fHbp 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있는 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함한다. "fHbp 폴리펩티드"는 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 fHbp 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 fHbp 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 fHbp 폴리펩티드는 , 예를 들어, WO 2004/048404; Masignani et al. 2003 J Exp Med 197:789-799; Fletcher et al. Infect Immun 2004 2088-2100; Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615; 및 WO 99/57280에서 설명된다. fHbp 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납 번호: NC_003112, GeneID: 904318 (NCBI Ref. NP_274866) (엔. 메닝기티디스 균주 MC58의 것); AY548371 (AAT01290.1) (엔. 메닝기티디스 균주 CU385의 것); AY548370 (AAT01289.1) (엔. 메닝기티디스 균주 H44/76의 것); AY548377 (AAS56920.1) (엔. 메닝기티디스 균주 M4105의 것); AY548376 (AAS56919.1) (엔. 메닝기티디스 균주 M1390의 것); AY548375 (AAS56918.1) (엔. 메닝기티디스 균주 N98/254의 것); AY548374 (AAS56917.1) (엔. 메닝기티디스 균주 M6190의 것); AY548373 (AAS56916.1) (엔. 메닝기티디스 균주 4243의 것); 및 AY548372 (AAS56915.1) (엔. 메닝기티디스 균주 BZ83의 것)로 GenBank에서 제공된다.

본 개시에 유용한 fHbp 폴리펩티드는 숙주로부터 제조된 소포가 원하는 에피토프, 바람직하게 살균 에피토프의 표현을 제공하고 항-fHbp 항체 반응을 제공하는 형태로 fHbp를 함유하도록 자연 발생한 fHbp 폴리펩티드의 아미노산이 다르고 네이세리아 숙주의 막에 존재하는 비-자연 발생한 (인공 또는 돌연변이) fHbp 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, fHbp 폴리펩티드는 변이체 1 (v.1) 또는 변이체 2 (v.2) 또는 변이체 3 (v.3) fHbp 폴리펩티드이며, v.1의 하위 변이체를 포함하는 v.1, v.2 및 v.3의 하위 변이체가 바람직하다 (예를 들어, Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615를 참고하면 된다). 하위변이체는 펩티드 대립유전자 또는 웹사이트 pubmlst.org/neisseria/fHbp/에서 명시된 바와 같은 식별 번호(ID)에 의해 정의된다. 한 구체예에서, fHbp 폴리펩티드는 백신 접종된 대상체의 집단의 고유한 균주 중에서 가장 일반적인 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시에 유용한 fHbp 폴리펩티드는 또한 융합 단백질을 포함하며, 융합 단백질은 그것의 N-말단 또는 C-말단에서 융합 파트너를 갖는 fHbp 폴리펩티드를 포함한다. 원하는 융합 파트너는 , 예를 들어, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), His-태그, 등 , 뿐만 아니라 다른 단백질, 특히 지질단백질의 선도 펩티드를 포함한다(예를 들어, N-말단 시스테인 이전의 아미노산 서열은 원하는 또 다른 선도 펩티드와 대체될 수도 있다).

다른 fHbp 폴리펩티드-암호화 핵산은 업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 확인될 수 있으며, fHbp 폴리펩티드는 알려진 fHbp 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 유사성에 기초하여 확인될 수 있다. 이러한 fHbp 폴리펩티드는 일반적으로 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 서열 동일성은 핵산 또는 아미노산 서열의 정렬 및 비교 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 이 방법은 업계에 잘 알려져 있다. 더 긴 서열의 비교는 두 개의 서열의 최적의 정렬을 달성하기 위해 더 정교한 방법을 필요로 할 수도 있다. 비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적의 정렬은 Smith and Waterman (1981) Adv. ApP1. Math. 2:482의 국부적 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444의 유사성 방법에 대한 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 점검에 의해 실행될 수도 있으며, 다양한 방법에 의해 발생한 최선의 정렬(즉, 비교 창 이상의 가장 높은 퍼센트의 서열 유사성을 발생시킴)이 선택된다.

PorA

PorA는 또 다른 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. "PorA 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성(비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 자연 발생한 PorA 폴리펩티드와 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 메닝기티디스 박테리아에 존재하는 자연 발생한 PorA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "PorA 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 PorA 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 PorA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 PorA 폴리펩티드는 P1.7, 16; P1.19,15; P1.7,1; P1.5,2; P1.22a,14; P1.14; P1.5,10; P1.7,4; P1.12,13의 혈청아형을 부여하는 것들; 뿐만 아니라 세로서브타이핑 (serosubtyping)에 사용된 종래의 혈청학적 시약과의 반응성을 유지할 수도 있거나 하지 않을 수도 있는 이러한 PorA 폴리펩티드의 변이체를 포함한다.

또한 원하는 것은 PorA 가변 영역 (VR) 타이핑 (typing)에 따라 특성화된 PorA 폴리펩티드이다 (예를 들어, Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678; Sacchi CT, et al, Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:845-55; Sacchi et al, J. Infect Dis 2000;182: 1169-1176을 참고하면 된다). 상당히 많은 뚜렷한 VR 타입이 확인되었으며, 이것은 VR1 및 VR2 패밀리 "원형"으로 분류될 수 있다. 이 명명법 및 이전의 타이핑 계획과의 관계를 설명하는 웹-접근 가능한 데이터베이스가 neisseria.org/nm/typing/poM에서 발견된다. 전형적인 PorA VR1 및 VR2 타입은 Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678에서 제공된다.

PorA 혈청아형에 의해 특성화된 전형적인 PorA 폴리펩티드는 P1.5,2; P1.5a,2a; P1.5a,2c; P1.5a,2c; P1.5a,2c; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,C; P1.7,16; P1.7d,1; P1.7d,1; P1.7d,1; P1.7d,1; P1.7b,3; P1.7b,4; P1.7b,4; P1.12,16; P1.12a,13a; P1.22,9; P1.23,14; P1.23,14; P1.19,15; P1.B,I; P1.C.1; P1.E,A; P1.E,A; P1.E,A; P1.5,2; P1.5,2; P1.5a,10a; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10b; P1.7,16; P1.7,16; P1.7b,1; P1.7b,13e; P1.7b,4; P1.7b,4; P1.7d,1; P1.7d,1; P1.7b,13a; P1.23,3; P1.23,3; P1.23,3; P1.19,15; P1.19,1; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.E,A; P1.E,A; P1.E,16a; P1.E,4a; P1.E,4a; P1.Ea,3; P1.Eb,9; P1.Eb,9; P1.Eb,9; P1.Eb,9; P1.Eb,9; P1.F,16; P1.7a,1; P1.7b,3; P1.7d,1; P1.Ea,3; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10; P1.5b,10b; P1.5b,10; P1.22,14a; P1.F,16; P1.D,2d; P1.D,2; P1.D,2d; P1.19c,2c; P1.D,10f; P1.A,10e; P1.A,10g; P1.A,10; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.7b,16; P1.7,16b; P1.7,16; P1.19,15; P1.Eb,9; P1.5,2e; P1.E,A; P1.7b,13d; P1.Ea,3; P1.7,16b; P1.Ec.1; P1.7b,4; P1.7b,4; P1.7,9; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15; P1.19,15a; P1.19a,15b; P1.19,15; P1.5b,16; P1.19b,13a; P1.5,16; P1.5,2; P1.5,2b; P1.7b,16; P1.7,16b; P1.7b,3; P1.Ea,3; P1.5a,2c; P1.F,16; P1.5a,9; P1.7c,10c; P1.7b,13a; P1.7,13a; P1.7a,10; P1.20,9; P1.22,B; P1.5b,del; P1.5b,10; P1.7,13a; P1.12a,13f; P1.12a,13; P1.12a,13a; P1.12a,13a; P1.12a,13; P1.12a,13; P1.E,13b; P1.7b,13a; P1.7b,13; P1.5,2; P1.5,2; P1.Ea,3; P1.22,9; P1.5,2; P1.5,2; P1.19,15; P1.5,2; P1.12b,13a; P1.5c,10a; P1.7e,16e; P1.B,16d; P1.F,16e; P1.F,16e; P1.7b,13e; P1.B,16d; P1.7e,16e; P1.7b,13g; P1.B,16f; P1.7,16c; P1.22,14b; P1.22,14c; P1.7,14; P1.7,14; 및 P1.23,14를 포함한다.

전형적인 PorA 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수납 번호 X57182, X57180, U92941, U92944, U92927, U92931, U92917, U92922, X52995, X57184, U92938, U92920, U92921, U92929, U92925, U92916, X57178, AF051542, X57181, U92919, U92926, X57177, X57179, U92947, U92928, U92915, X57183, U92943, U92942, U92939, U92918, U92946, U92496, U97260, U97259, AF042541, U92923, AF051539, AF051538, U92934, AF029088, U92933, U97263, U97261, U97262, U92945, AF042540, U92935, U92936, U92924, AF029086, AF020983, U94958, U97258, U92940, AF029084, U92930, U94959, U92948, AF016863, AF029089, U92937, AF029087, U92932, AF029090, AF029085, AF051540, AF051536, AF052743, AF054269, U92495, U92497, U92498, U92499, U92500, U92501, U92502, U92503, AF051541, X12899, Z48493, Z48489, Z48485, Z48494, Z48487, Z48488, Z48495, Z48490, Z48486, Z48491, Z48492, X66478, X66479, X66477, X66480, X81110, X79056, X78467, X81111, X78802, Z14281/82, Z14273/74, Z14275/76, Z14261/62, Z14265/66, Z14277/78, Z14283/84, Z14271/72, Z14269/70, Z14263/64, Z14259/60, Z14257/58, Z14293/94, Z14291/92, Z14279/80, Z14289/90, Z14287/88, Z14267/68, Z14285/86, L02929, X77423, X77424, X77433, X77426, X77428, X77430, X77427, X77429, X77425, X77432, X77431, X77422, Z48024/25, Z48032/33, Z48020/21, Z48022/23, Z48028/29, Z48016/17, Z48012/13, Z48014/15, Z48018/19, Z48026/27, U31060, U31061, U31062, U31063, U31064, U31065, U31066, U31067, U93898, U93899, U93900, U93901, U93902, U93903, U93904, U93905, U93906, U93907, 및 U93908에서 발견된다.

NspA

NspA는 또 다른 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원이다. "NspA 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 자연 발생한 NspA 폴리펩티드와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 메닝기티디스 박테리아에 존재하는 자연 발생한 NspA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "NspA 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 NspA 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 NspA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 NspA 폴리펩티드는, 예를 들어, Martin et al., J Exp Med, Apr. 7, 1997, 185 (7)에서 설명된다.

NspA 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산(및 아미노산 서열)은 또한 수납 번호 U52069, GQ293900.1, AF175678.1, AF175683.1, AF175682.1, AF175681.1, AF175680.1, AF175679.1, AF175677.1, AF175676.1로서 GenBank에서 제공된다.

TbpB

TbpB는 네이세리아 표면 항원이다. "TbpB 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 자연 발생한 TbpB 폴리펩티드와 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 메닝기티디스 박테리아에 존재하는 자연 발생한 TbpB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "TbpB 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 TbpB 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 TbpB 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 TbpB 폴리펩티드는, 예를 들어, Rokbi, B. et al., "Heterogeneity of tbpB, the transferrinbinding protein B gene, among serogroup B Neisseria meningitidis strains of the ET-5 complex", Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 4 (5): 522-529 (1997)에서 설명된다.

TbpB 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납 번호 DQ355978.1, AJ704760.1, AJ704759.1, AJ704758.1, AJ704757.1, AJ704756.1, AJ704755.1, AJ704754.1, AJ704753.1, AJ704752.1, AJ704751.1로서 GenBank에서 제공된다.

TbpA

TbpA는 네이세리아 표면 항원이다. "TbpA 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 자연 발생한 TbpA 폴리펩티드와 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 박테리아에 존재하는 자연 발생한 TbpA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "TbpA 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 TbpA 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 TbpA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 TbpB 폴리펩티드는, 예를 들어, J. Med Microbiol. 1998 Sep; 47 (9): 757-60에서 설명된다.

TbpA 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납: EU339282.1 GI: 166863281, 수납: M96731.1 GI: 150360, 수납: AF240638.1 GI: 9719359, 수납: AF241227.1 GI: 9719361, 수납: AF124338.1 GI: 8439550, 수납: X94533.1 GI: 2764816, 수납: X99615.1 GI: 2764959, 수납: X99614.1 GI: 2764957, 수납: X99613.1 GI: 2764956, 수납: X99612.1 GI: 2764955, 수납: X99611.1 GI: 2764954, 수납: X99610.1 GI: 2764952로서 GenBank에서 제공된다.

LbpA

LbpA는 네이세리아 표면 항원이다. "LbpA 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 자연 발생한 LbpA 폴리펩티드와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 박테리아에 존재하는 자연 발생한 LbpA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "LbpA 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 LbpA 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 LbpA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 LbpA 폴리펩티드는, 예를 들어, Vaccine (2006) Vol. 24 Issue 17, pp. 3545-57에서 설명된다.

LbpA 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납: DQ058017.1 GI: 68359439, 수납: U16260.1 GI: 915277, 수납: AF049349.1 GI: 3582727, 수납: DQ058018.1 GI: 68359441, 수납: X79838.1 GI: 509053으로서 GenBank에서 제공된다.

LbpB

LbpB는 네이세리아 표면 항원이다. "LbpB 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 자연 발생한 LbpB 폴리펩티드와 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 박테리아에 존재하는 자연 발생한 LbpB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "LbpB 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 LbpB 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 LbpB 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 LbpB 폴리펩티드는, 예를 들어, Vaccine (2006) Vol. 24 Issue 17, pp. 3545-57에서 설명된다.

LbpB 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납: AF123382.1 GI: 4884690, 수납: AF072890.1 GI: 4106392, 수납: AF031432.1 GI: 3213214, 수납: AF022781.1 GI: 2843172, 수납: AF123380.1 GI: 4884686, 수납: AF123383.1 GI: 4884692, 수납: AF123381.1 GI: 4884688로서 GenBank에서 제공된다.

GNA2132

GNA2132는 네이세리아 표면 항원이다. "GNA2132 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 자연 발생한 GNA2132 폴리펩티드와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 박테리아에 존재하는 자연 발생한 GNA2132 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "GNA2132 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 GNA2132 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 GNA2132 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 GNA2132 폴리펩티드는, 예를 들어, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2010 Feb. 23; 107 (8): 3770-5에서 설명된다.

GNA2132 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납: FJ750981.1 GI: 224830211, 수납: AY315195.1 GI: 32455020, 수납: AY315194.1 GI: 32455018, 수납: AY315193.1 GI: 32455016, 수납: AY315192.1 GI: 32455014, 수납: GQ302857.1 GI: 254547346, 수납: AY315196.1 GI: 32455022, 수납: AF226448.1 GI: 7228725, 수납: AF226447.1 GI: 7228723, 수납: AF226446.1 GI: 7228721, 수납: AF226445.1 GI: 7228719, 수납: FN908855.1 GI: 308814886, 수납: FN908854.1 GI: 308814884, 수납: FJ615459.1 GI: 222107907, 수납: FJ615446.1 GI: 222107881로서 GenBank에서 제공된다.

NadA

NadA는 네이세리아 표면 항원이다. "NadA 폴리펩티드"는 본원에 사용된 바와 같이 자연 발생 및 합성 (비-자연 발생) 폴리펩티드를 포함하며 이것은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 자연 발생한 NadA 폴리펩티드와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 네이세리아 박테리아에 존재하는 자연 발생한 NadA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유도할 수 있다. "NadA 폴리펩티드"는 또한 융합 단백질, 예를 들어, N- 및/또는 C-말단에서 이종 기원 폴리펩티드를 갖는 NadA 폴리펩티드를 포함한다.

본 개시에 사용되는 NadA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 업계에 알려져 있다. 적합한 NadA 폴리펩티드는, 예를 들어, Infection and Immunity, July 2004, Vol. 72, No. 7, pp. 4217-23에서 설명된다.

NadA 변이체 및 하위변이체에 대한 핵산 (및 아미노산 서열)은 또한 수납: FJ750979.1 GI: 224830207, 수납: DQ239933.1 GI: 83616362, 수납: DQ239932.1 GI: 83616360, 수납: DQ239931.1 GI: 83616359, 수납: DQ239930.1 GI: 83616357, 수납: DQ239929.1 GI: 83616355, 수납: DQ239928.1 GI: 83616354, 수납: DQ239927.1 GI: 83616353, 수납: DQ239926.1 GI: 83616351, 수납: FJ619647.1 GI: 222159590으로서 GenBank에서 제공된다.

원하는 유전자 산물의 추가의 예

본 개시의 서열 및 방법과 함께 사용법을 발견한 유전자 산물의 다른 예는 불투명 외막 단백질 (예를 들어, Hobbs et al., Microbiology 144: 157-66 (1998)을 참고하면 된다), Genbank 수납 번호: U03412.1, U37255.1, U37256.1, U37257.1, AF016292.1, AF016285.1, AF001204.1, AF001203.1; FetA (예를 들어, Biegel et al, J. Bacteriology 181 (9):2895-901 (1999)을 참고하면 된다), Genbank 수납 번호: JN182195.1 GI: 343174597, EF157665.1 GI: 120971583, EF153764.1 GI: 120971579, EF153762.1 GI: 120971576; MafB, MspA, App, Opa, Opc, NhhA, MafA-1, MafA2, NalP, Mip, NMB1483, HmbR (예를 들어, Echenique-Rivera et al., PLoS Pathog 7 (5): 1-18 (2011)을 참고하면 된다)을 포함하며:

상기 유전자 산물은 어떠한 방식으로도 본 개시의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 단지 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 방법을 사용하여 발현될 수도 있는 항원의 예의 역할을 한다.

코돈 최적화

원하는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생한 서열, 뿐만 아니라 코돈-최적화된 서열을 포함한다. 자연 발생한 서열은 발현을 위해 선택된 숙주 유기체의 알려진 코돈 선호도에 기초하여 증가된 발현 수준을 더 용이하게 하기 위해 코돈-최적화될 수도 있다. 예를 들어, 표면 항원 (예를 들어, fHbp)을 암호화하는 알려진 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 유기체가 선호하지 않는 상기 코돈을 같은 아미노산 잔기를 암호화하지만, 숙주 유기체가 선호하는 불필요한 코돈으로 바뀔 수도 있고, 그러므로 숙주 유기체에서 암호화 서열의 더 효율적인 발현을 용이하게 한다.

코돈 최적화를 용이하게 하는 다양한 컴퓨터 알고리즘은 인터넷을 통해 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, Puigb P., Guzman E., Romeu A., and Garcia- Vallv S., OPTIMIZER: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research, 35:W126-W131 (2007)을 참고하면 된다. 이러한 알고리즘은 일반적으로 사용자가 유전자 산물을 암호화하는 알려진 폴리뉴클레오티드를 입력하는 것을 허용한다. 서열이 제공되면, 사용자는 어떤 바람직한 코돈-사용 선호도 (예를 들어, 선택된 발현 숙주에서 각각의 아미노산 잔기에 대하여 가장 빈번하게 사용되는 코돈)을 명시할 수 있고 컴퓨터 알고리즘은 이후에 사용자에게 코돈-최적화된 서열을 제공할 것이다. 예를 들어, 도 16 및 17은 네이세리아 메닝기티디스 FAM18 및 Z2491 균주의 각 아미노산 잔기에 대하여 천명 당 평균 코돈 사용을 제공하는 표를 나타낸다. 특정 발현 숙주에 대한 평균 코돈 사용이 결정되면, 원하는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 불필요한 코돈을 같은 아미노산 잔기를 암호화하지만, 발현 숙주에 의해 더 빈번하게 이용되는 코돈, 즉, 같은 아미노산 잔기를 암호화하지만 더 높은 평균 사용값을 갖는 코돈으로 대체함으로써 조작될 수 있다. 도 18은 같은 유전자 산물에 대한 코돈-최적화 서열과 비교된 고유의 fHbp ID 9의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 서열 비교이다. 코돈-최적화된 서열에서, 덜 바람직한 코돈은 더 빈번하게 이용되는 불필요한 코돈으로 대체되었다. 코돈 최적화는 실시예 10에서 더 설명된다.

만드는 방법

본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열은 화학적 돌연변이 유발, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 하나 이상의 뉴클레오티드의 부위-지향성 돌연변이 유발, 등을 포함하는, 돌연변이 유발 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 업계에 알려진 어떤 수단에 의해서도 생성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 업계에 알려진 시약 및 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수도 있다. 본 개시에 따른 발현 구조는 PCR, 클로닝 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 업계에 알려진 기술을 사용함으로써 발생될 수도 있다. 본 발명의 실행은 업계에 잘 알려진 종래의 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학 기술의 사용을 수반할 수도 있다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어 Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)에서 충분히 설명된다.

일반적으로, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열은 본 개시의 방법에 사용되는 적합한 벡터 또는 발현 구조에 클로닝될 수도 있다. 일부 구체예에서, 조작된 프로모터 서열은 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합되며, 이것은 전사 종결자 서열에 작동 가능하게 결합된다. 결과의 서열 (프로모터 서열, 표면 항원-암호화 서열, 및 전사 종결자 서열 등)은 이후에, 예를 들어, PCR에 의해 또는 제한 효소를 가지고 분리될 수도 있고 적합한 벡터 또는 구조에 클로닝될 수도 있다. 일부 구체예에서, 구조는, 예를 들어, 상동 재조합에 의해, 표적 서열을 숙주의 게놈으로 도입하기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수도 있다.

사용 방법

일반적으로, 본 개시는 재조합 숙주 유기체에서, 원하는 하나 이상의 유전자 산물, 예를 들어, 원하는 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 원하는 하나 이상의 표면 항원을 높은 수준으로 발현시키는 방법을 제공한다. 방법은 선택된 재조합 숙주 유기체, 예를 들어, 네이세리아 메닝기티디스 박테리아에서 원하는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)의 높은 수준의 발현을 용이하게 하는 방법으로 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합하는 단계를 수반한다. 본 개시의 방법은, 예를 들어, 백신의 생성에서의 사용법을 발견하고 , 일정한 경우, 표면 항원의 높은 수준의 발현이 바람직하다.

상기 설명된 바와 같이, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 숙주 유기체에서 프로모터로서 기능한다. 일부 자연 발생한 프로모터 서열과 달리, 본 프로모터는 작동 가능하게 결합되는 하나 이상의 유전자 산물-암호화 폴리뉴클레오티드 서열의 가변적 발현을 유발하지 않지만, 대신에 일정하고, 높은 수준의 발현을 제공한다. 본 개시의 다른 폴리뉴클레오티드 서열은은 효율적인 전사를 용이하게 하고, 그러므로 작동 가능하게 결합된 유전자 산물-암호화 서열의 향상된 발현을 용이하게 하는 전사 종결자로서 기능한다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드 서열의 다양한 조합은 재조합 숙주에서 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 표면 항원)의 높은 수준의 발현을 용이하게 하기 위해 사용될 수도 있다. 게다가, 본 개시는 발현을 위해 선택된 재조합 유기체의 코돈 선호도에 기초하여, 발현되는 단백질 생성물, 예를 들어, 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 코돈-최적화를 제공한다. 본 개시의 방법은 선택된 재조합 숙주 유기체에서 원하는 하나 이상의 유전자 산물의 일정하고, 높은 수준의 발현을 용이하게 하기 위한 다양한 방법으로 이들 폴리뉴클레오티드 서열을 조합하는 단계를 수반한다.

내인성 숙주 서열의 업스트림에서 프로모터의 도입

일부 구체예에서, 본 개시의 방법은 고유의 유전자, 예를 들어, 고유의 표면 항원 유전자의 업스트림에서 (예를 들어, 5' 방향으로) 본 개시의 폴리뉴클레오티드 프로모터 서열을 적합한 숙주 유기체, 예를 들어, 네이세리아 숙주 세포의 게놈으로 삽입하는 단계를 수반한다. 재조합 숙주 세포는 이후 고유의 유전자의 발현을 용이하게 하는 조건 하에 배양된다. 엔. 메닝기티디스가 숙주 유기체로서 선택되는 일부 구체예에서, 숙주 세포에 의해 생성된 소포는 대상체의 면역학적 반응을 유발하기 위해 분리되어 대상체에 투여될 수 있는 백신 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 일부 구체예에서, 키메라 프로모터 (예를 들어, X1-X7) 또는 도메인 결실 프로모터 (예를 들어, S1-S3)는 고유의 fHbp 유전자의 네이세리아 균주 업스트림에서 게놈으로 삽입된다. 조작된 프로모터 서열의 도입은 높은 수준의 fHbp 유전자의 발현을 용이하게 한다.

발현 구조의 도입

일부 구체예에서, 본 개시의 방법은 원하는 유전자 산물, 예를 들어, 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 조작된 프로모터를 포함하는 발현 구조를 숙주 유기체의 게놈으로 삽입하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 전사 종결자 서열은 원하는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 암호화 fHbp에 작동 가능하게 결합되고 상기 설명된 서열을 갖는 전사 종결자에 작동 가능하게 결합된 키메라 프로모터 (예를 들어, X1-X7) 또는 도메인 결실 프로모터 (예를 들어, S1-S3)를 포함하는 발현 구조는 네이세리아 숙주 세포의 게놈의 적합한 영역 (예를 들어, lpxL1 자리)으로 삽입된다.

일부 구체예에서, 발현 구조는 하나 이상의 숙주 유전자의 발현을 방해하는 위치에서 숙주의 게놈으로 삽입될 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 발현 구조는 내독소 (지질다당류, LPS)의 생성을 용이하게 하는 유전자의 발현을 방해하는 위치에서 숙주의 게놈으로 삽입될 수도 있다. 결과의 재조합 숙주는 내독소 넉아웃(knockout) 숙주이며, 이것은 내독소가 감소된 백신의 생성에 유용할 수도 있다.

일부 구체예에서, 제1 조작된 프로모터 서열은 고유의 유전자, 예를 들어, 고유의 표면 항원 유전자의 업스트림에서 숙주 세포의 게놈으로 삽입되고, 원하는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제2 조작된 프로모터 서열을 포함하는 발현 구조는 숙주 세포의 게놈 내 적합한 위치 (예를 들어, lpxL1 위치)에서 숙주 세포의 게놈으로 삽입된다.

일부 구체예에서, 제1 및 제2 프로모터 서열이 같은 한편, 다른 구체예에서, 제1 및 제2 프로모터 서열은 다르다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 키메라 프로모터 X1은 고유의 fHbp 유전자의 네이세리아 세포 업스트림에서 게놈으로 삽입되고 fHbp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합된 키메라 프로모터 X1을 포함하는 발현 구조는 숙주 네이세리아 세포의 lpxL1 자리로 삽입된다. 다른 구체예에서, 키메라 프로모터 X1은 고유의 fHbp 유전자의 업스트림에서 네이세리아 균주의 게놈으로 삽입되고 fHbp를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 도메인 결실 프로모터 S1을 포함하는 발현 구조는 숙주 네이세리아 세포의 lpxL1 자리로 삽입된다.

고유의 유전자, 예를 들어, 고유의 표면 항원 유전자에서 조작된 프로모터의 도입은 유전자의 증가된 발현을 일으키는 한편, 숙주 게놈 내 또 다른 위치에서 조작된 프로모터에 의해 구동된 유전자의 제2의 카피의 도입은 더욱 증가된 발현을 용이하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 원하는 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, 하나 이상의 원하는 단백질)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가적인 발현 구조는 또한 숙주 세포 게놈으로 삽입될 수도 있다. 일부 구체예에서, 조작된 프로모터에 의해 구동되는 원하는 유전자 산물(예를 들어, 원하는 표면 항원)의 제3, 제4, 또는 제5의 카피의 도입은 원하는 유전자 산물의 발현을 더욱 증가시킨다.

일부 구체예에서, 원하는 여러 다른 유전자 산물이 같은 숙주 세포에서 발현될 수도 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 조작된 프로모터는 제1 고유의 표면 항원 유전자 (예를 들어, fHbp)의 업스트림으로 삽입되고, 같거나 다른 조작된 프로모터 서열에 의해 구동된 다른 표면 항원 유전자(예를 들어, NspA)를 포함하는 하나 이상의 발현 구조는 또한 숙주 세포의 게놈으로 삽입된다. 결과의 숙주 세포는 둘 이상의 다른 표면 항원을 발현하고, 백신의 생성에 유용할 수도 있다.

유전 물질을 네이세리아 숙주 세포로 도입하는 벡터 및 방법

본 개시의 핵산 구조물를 갖는 숙주 세포의 유전적 변형을 제공하도록 쉽게 조정될 수 있는 방법 및 조성물이 업계에 알려져 있다. 전형적인 벡터 및 방법은, 예를 들어, WO 02/09746 및 O'Dwyer et al. Infect Immun 2004; 72:6511-80에 제공된다.

유전 물질의 숙주 세포로의 이동 방법은 , 예를 들어, 접합, 형질 전환, 전기 천공, 인산 칼슘 방법 등을 포함한다. 일반적으로 , 이동 방법은 도입된 구조의 안정한 발현을 제공한다. 구조는 유전되는 에피솜 요소(예를 들어, 플라스미드)로서 제공할 수 있거나 유전적으로 통합될 수 있다.

적합한 벡터는 재조합 이벤트의 어떤 타입이 수행되어야 하는지에 의존적인 조성물에 따라 다를 것이다. 통합 벡터는 조건부로 복제될 수 있거나 자살 플라스미드, 박테리오파지 (bacteriophage), 트랜스포손(transposon) 또는 제한 가수분해 또는 PCR 증폭에 의해 얻어진 선형 DNA일 수 있다. 재조합 이벤트의 선택은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자(예를 들어, 카나마이신, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 또는 겐타마이신), 중금속 및/또는 독성 화합물에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 또는 영양 요구성 돌연변이를 보충하는 유전자(예를 들어, pur, leu, met, aro)와 같은 선택 가능한 유전적 마커의 사용에 의해 달성될 수 있다.

백신 생성

항원 조성물

본 개시에 의해 예상된 항원 조성물은 일반적으로 표면 항원을 발현하는 네이세리아 세포로부터 제조된 소포를 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, "소포"는 외막 소포, 뿐만 아니라 미세 소포(수포로도 불림)를 포함하는 것을 의미한다. .

백신의 생성에 사용되는 항원 조성물은 표면 항원, 예를 들어, fHbp를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 네이세리아 메닝기티디스 종의 배양된 균주의 외막으로부터 제조된 외막 소포(OMV)를 함유할 수 있다. OMV는 , 바람직하게 배양 배지로부터 박테리아 세포를 분리함으로써(예를 들어, 여과에 의해 또는 세포를 펠릿으로 만드는 저속 원심분리, 등에 의해), 세포를 용해함으로써(예를 들어, 세제의 추가, 삽투압 충격, 초음파 분해, 캐비테이션(cavitation), 균질화, 등에 의해) 및 외막 분획을 세포질 분자에서 분리함으로써(예를 들어, 여과에 의해; 또는 외막 및/또는 외막 소포의 차별적 침전 또는 응집에 의해, 또는 외막 분자를 특이적으로 인식하는 리간드를 사용하는 친화도 분리 방법에 의해; 또는 외막 및/또는 외막 소포를 펠릿으로 만드는 고속 원심분리에 의해) 브로스 또는 고체 배지 배양에서 키워진 네이세리아 메닝기티디스로부터 얻어질 수도 있다; 외막 분획은 OMV를 생성하기 위해 사용될 수도 있다.

항원 조성물은 표면 항원을 함유하는 미세소포(MV) (또는 "수포")를 함유할 수 있으며, MV 또는 수포는 표면 항원을 발현하도록 유전적으로 변형된 네이세리아 메닝기티디스 균주의 배양 중에 방출된다. 예를 들어, MV는 브로스 배양 배지에서 네이세리아 메닝기티디스의 균주를 배양함으로써, 브로스 배양 배지로부터 전체 세포를 분리함으로써(예를 들어, 여과에 의해, 또는 세포만을 펠릿으로 만들지만 더 작은 수포, 등을 펠릿으로 만들지 않는 저속 원심분리에 의해), 및 이후 세포가 없는 배양 배지에 존재하는 MV를 수거함으로써(예를 들어, 여과, MV의 차별적 침전 또는 응집에 의해, 또는 수포, 등을 펠릿으로 만드는 고속 원심분리에 의해) 얻어질 수도 있다. MV의 생산에 사용되는 균주는 일반적으로 배양에서 생산된 수포의 양에 기초하여 선택될 수 있다 (예를 들어, 박테리아는 본원에 설명된 방법의 분리 및 투여에 적합한 수포의 생산을 제공하기 위해 합리적인 수로 배양될 수 있다). 높은 수준의 수포를 생산하는 전형적인 균주는 PCT 공개 번호 WO 01/34642 호에서 설명된다. 수포 생산에 더하여, MV 생산에 사용되는 균주는 또한 다른 표면 항원의 생산량에 기초하여 선택될 수도 있으며, 더 높은 수준의 특이적 표면 항원을 생산하는 균주는 특히 바람직할 수도 있다 (다른 NspA 생산 수준을 갖는 엔. 메닝기티디스 균주의 예를 들어, Moe et al. (1999 Infect. Immun. 67: 5664)를 참고하면 된다). 수포의 생산에 사용되는 바람직한 다른 균주는 불활성화된 GNA 유전자를 갖는 균주를 포함하며, 이것은 세포 분리, 막 구조 및 병독성에 필요한 지질단백질을 암호화한다(예를 들어, Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 2: 1914-1919를 참고하면 된다).

본 개시의 항원 조성물은 한 균주, 또는 2, 3, 4, 5가지 이상의 균주의 소포를 함유할 수 있으며, 이 균주는 서로 상동성 또는 이종 기원일 수도 있고, 보통은 이종 기원이다. 예를 들어, 균주는 porA 및/또는 fHbp와 같은 , 특정 표면 항원에 관하여 상동성 또는 이종 기원일 수도 있다. 소포는 특이적 표면 항원의 하나 이상의 변이체 또는 하위 변이체(예를 들어, fHbp의 1, 2, 3가지 이상의 변이체)를 발현하는 균주로부터 제조될 수 있으며 이것은 다른 변이체 (v.1, v.2, 또는 v.3) 또는 하위변이체 (예를 들어, v.1, v.2, 또는 v.3의 하위변이체)의 fHbp 아미노산 서열로 구성될 수도 있다.

항원 조성물은 같거나 다른 표면 항원을 제공하는 OMV 및 MV의 혼합물을 포함할 수 있으며, 표면 항원은 선택적으로 다른 조합의 변이체 및/또는 하위 변이체의 에피토프를 제공할 수도 있고 OMV 및/또는 MV는 같거나 다른 균주의 것일 수도 있다. 다른 균주의 소포는 혼합물로서 투여될 수 있거나, 연속적으로 투여될 수 있다.

바람직한 경우 (예를 들어, 소포를 생산하기 위해 사용된 균주가 내독소 또는 특히 높은 수준의 내독소와 관련되는 경우), 소포는 내독소를 감소시키기 위해 , 예를 들어, 투여 후 독성을 감소시키기 위해 선택적으로 처리될 수 있다. 잠재적으로 덜 바람직하지만, 내독소의 감소는 적합한 세제 (예를 들어, 0.1-10%, 바람직하게 0.5-2%의 농도로, BRIJ-96, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 라우로일사코시네이트, Empigen BB, Triton X-100, TWEEN 20 (소르비탄 모노라우레이트 폴리옥시에틸렌), TWEEN 80 및 SDS)로 추출에 의해 성취될 수 있다. 세제 추출이 사용되는 경우, 데옥시콜레이트 이외의 세제를 사용하는 것이 바람직하다.

항원 조성물의 소포는 세제 없이, 예를 들어, 데옥시콜레이트를 사용하지 않고 제조될 수 있다.세제 처리가 내독소 활성을 제거하기 위해 유용하지만 , 제조시 표면 항원 단백질에 부정적으로 영향을 미칠 수도 있다. 따라서 세제가 필요하지 않은 기술을 사용하여 내독소 활성을 감소시키는 것이 특히 바람직할 수도 있다. 한 다른 접근에서, 내독소 (지질다당류, LPS)의 상대적으로 낮은 생산자인 균주는 사람에서 사용되기 전에 최종 조제물로부터 내독소를 제거할 필요성을 방지하기 위해 사용된다. 예를 들어, 소포는 백신에 바람직하지 않을 수도 있는 지질다당류 또는 다른 항원(예를 들어, Rmp)이 감소되거나 제거되는 네이세리아 돌연변이로부터 제조될 수 있다.

소포는 지질 A의 감소된 또는 검출 불가능한 독성 활성을 발생시키는 유전적 변형을 함유하는 엔. 메닝기티디스 균주로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 균주는 지질 A 생합성에서 유전적으로 변형될 수 있다 (Steeghs et al. (1999) Infect Immun 67:4988-93; van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90; Steeghs et al. (2004) / Endotoxin Res 10: 113-9; Fissha et al, (2005) Infect Immun 73:4070). 면역원성 조성물은 각각 lpxL1 또는 lpXL2에 의해 암호화된 효소의 하향 조절 및/또는 불활성화와 같은, LPS의 변형에 의해 독소가 제거될 수도 있다. lpxL1 돌연변이에서 만들어진 5-아실화된 지질 A의 생산은 lpxL1에 의해 암호화된 효소가 C12를 GlcN II의 2' 위치에서 N-결합된 3-OH C14에 추가한다는 것을 나타낸다. lpxL2 돌연변이에서 발견된 대부분의 지질 A 종은 4-아실화되며, lpxL2에 의해 암호화된 효소는 다른 C12를, 즉, GlcN I의 2' 위치에서 N-결합된 3-OH C14에 추가한다는 것을 나타낸다. 이들 유전자의 감소된 발현 (또는 미발현) (또는 이들 유전자의 생성물의 감소된 활성 또는 비활성)을 일으키는 돌연변이는 지질 A의 변화된 독성 활성을 발생시킨다 (van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90). 4-아실화된 (lpXL2 돌연변이) 및 5-아실화된 (lpxL1 돌연변이) 지질 A는 야생형 지질 A보다 덜 독성이다. 지질 A 4'-키나제 암호화 유전자 (lpxK)의 돌연변이는 또한 지질 A의 독성 활성을 감소시킨다. 소포 (예를 들어, MV 또는 OMV)의 생산에 사용되는 특히 바람직한 것은 감소된 또는 검출 불가능한 기능적 lpxL1-암호화된 단백질을 제공하도록 유전적으로 변형된 엔. 메닝기티디스 균주이다, 예를 들어, 네이세리아 박테리아 (예를 들어, 엔. 메닝기티디스 균주)는 lpxL1 유전자의 유전자 산물의 감소된 활성 또는 비활성을 제공하도록 유전적으로 변형된다. 예를 들어, 네이세리아 박테리아는 lpxL1 유전자 넉아웃을 갖도록 유전적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어, lpxL1 유전자는 분열된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0035328 호를 참고하면 된다. 네이세리아 박테리아는 lpxL1 유전자 및/또는 lpXL2 유전자의 유전자 산물의 감소된 활성 또는 비활성을 제공하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 소포는 LPS 생산에 대하여 야생형인 엔. 메닝기티디스 균주와 비교하여 감소된 독성을 제공하는 한편, 표면 항원, 예를 들어, fHbp의 면역원성을 유지한다.

LPS 독성 활성은 또한 폴리믹신 B 저항성에 수반된 유전자/자리에서 돌연변이를 유발함으로써 변화될 수 있다 (이러한 저항성은 지질 A의 4' 포스페이트에서 아미노아라비노제의 추가와 관련된다). 이들 유전자/자리는 UDP-글루코스 데히드로게나제, 또는 아미노아라비노제 합성 및 이동에 수반될 수 있는 많은 엔테로박테리아시애(enterobacteriaciae)에 공통된 항균성 펩티드-저항 유전자의 영역을 암호화하는 pmrE일 수 있다. 이 영역에 존재하는 유전자 pmrF는 돌리콜-포스페이트 마노실 트랜스퍼라제를 암호화한다 (Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).

PhoP-PhoQ 조절 시스템에서 돌연변이는 포스포-릴레이(phospho-relay) 두 개의 성분 조절 시스템 (예를 들어, PhoP 구성 성분 표현형, PhoPc), 또는 낮은 Mg++ 환경 또는 배양 조건 (PhoP-PhoQ 조절 시스템을 활성화함)이며, 4'-포스페이트에서 아미노아라비노제 및 미리스테이트를 대체하는 2-히드록시미리스테이트 (미리스테이트의 히드록실화)의 추가로 이어진다. 이 변형된 지질 A는 사람 내피 세포에 의한 E-셀릭틴 발현 및 사람 단핵구로부터 TNF 분비를 자극하는 감소된 능력을 나타낸다.

폴리믹신 B 저항성 균주도 사용에 적합하며, 이로 인해 균주는 감소된 LPS 독성을 갖는 것으로 나타난다 (예를 들어, van der Ley et al. (1994) In: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, England를 참고하면 된다). 대안으로는, 폴리믹신 B의 결합 활성을 모방하는 합성 펩티드는 LPS 독성 활성을 감소시키기 위해 항원 조성물에 추가될 수도 있다 (예를 들어, Rustici et al. (1993) Science 259:361-365; Porro et al. (1998) Prog Clin Biol Res.391:315-25를 참고하면 된다).

내독소는 또한 배양 조건의 선택을 통해 감소될 수 있다. 예를 들어, 리터 배지 당 0.1 mg-100 mg의 아미노아라비노제를 함유하는 성장 배지에서 균주의 배양은 감소된 지질 독성을 제공한다 (예를 들어, WO 02/097646 호를 참고하면 된다).

키트

또한 상기 설명된 방법을 실행하기 위해 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하는 키트가 본 개시에 의해 제공된다. 키트는 추가의 발현 구조 및/또는 재조합 네이세리아 메닝기티디스 균주의 생산에 사용되기 위한 벡터 또는 발현 구조의 형태로 본 개시의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수도 있다. 키트는 또한 벡터 또는 발현 구조의 형태로 네이세리아 메닝기티디스 숙주 균주에서 발현되도록 항원을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수도 있다. 키트는 본원에 개시된 조작된 프로모터 서열 및/또는 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 전사 종결자 서열 중 하나 이상을 포함하는, 하나 이상의 재조합 네이세리아 메닝기티디스 균주를 더 포함할 수도 있다.

상기 언급된 성분에 더하여, 키트는 대상 방법을 실행하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 더 포함한다. 대상 방법을 실행하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다, 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱, 등과 같은 기판에 인쇄될 수도 있다. 이와 같이, 설명서는 포장 삽입물로서 키트 내에, 키트의 용기 또는 이들의 구성요소의 표지(즉, 포장 및 하위 포장과 관련됨), 등에 존재할 수도 있다. 다른 구체예에서, 설명서는 적합한 컴퓨터로 판독 가능한 매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓, 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 다른 구체예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 원격 공급원으로부터, 예를 들어, 인터넷을 통해 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 이 구체예의 예는 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 이 수단이 적합한 기판에 기록된다.

실시예

다음 실시예는 당업자에게 본 발명을 만들고 사용하는 방법의 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해 설명되고 , 발명자가 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것이 아니다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관한 정확도를 보장하기 위해 노력하였지만 몇몇 실험적 오차 및 편차가 설명되어야 한다. 달리 지시되지 안으면, 부품은 중량 부품이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 근처이다. 표준 축약형, 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pi, 피코리터 (들); s 또는 sec, 초 (들); min, 분 (들); h 또는 hr, 시간 (들); aa, 아미노산 (들); nt, 뉴클레오티드 (들); 등이 사용될 수도 있다.

방법 및 재료

다음 방법 및 재료를 하기 실시예에서 사용하였다.

박테리아 균주

다음 실시예에 사용된 6개의 엔. 메닝기티디스 균주를 표 1에 나열한다.

표 1. 다음 실시예에 사용된 엔. 메닝기티디스 균주.

웨스턴 블롯에 의한 fHbp 발현의 측정

fHbp 발현을 정량적 웨스턴 블롯에 의해 측정하였으며, 이것을 사소하게 변화된, 이전에 보고된 바와 같이 수행하였다 (Pajon, Vaccine 2010 Feb 25;28 (9):2122-9). 변이체 그룹 1의 fHbp 서열에 대하여, 항-fHbp mAb JAR3을 fHbp 서열 변이체 ID 1, 4 또는 9의 검출에 사용하였고, JAR5를 ID 74에 사용하였다. 변이체 그룹 2 또는 3의 fHbp에 대하여, 항-fHbp mAb JAR31을 사용하였다 (Beernink, Infect Immun. 2008 Sep;76 (9):4232-40). 테스트 균주에 대한 결과를 각각 fHbp 변이체 1 (ID 1) 및 2 (ID 77)이 높게 발현되는 해당 참조 균주 H44/76 또는 8047의 박테리아 세포에 의해 발현된 fHbp의 양의 퍼센트로서 보고하였다.

유동 세포 분석법

마우스 항-fHbp mAb의 살아있는 뇌척수막염균에 결합을 측정하여 대조군에 비해 증가된 또는 감소된 fHbp를 갖도록 조작된 돌연변이에서 항체에 접근 가능한 박테리아 표면상의 fHbp의 상대적인 양을 평가하였다. 유동 세포 분석법을, 각각 10 μg/mL의 최종 농도로, 두 개의 마우스 항-fHbp mAb, JAR4 및 JAR5의 조합을 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Welsch, J Infect Dis. 2008 Apr 1 ; 197 (7): 1053-61). 검정의 대조군은 그룹 A (JW-A1) 또는 B (SEAM 12) 다당류에 특이적인 마우스 mAb를 포함하였다 (Moe, Mol Immunol. 2006 Mar;43 (9): 1424-31).

실시예 1: CH21A , FHBP ID 5를 발현하는 혈청군 A 균주의 일련의 동질 유전자형 돌연변이에서 조작된 프로모터에 의해 구동된 높은 FHBP 수준

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH21A은 fHbp ID 5를 발현하는 혈청군 A 균주로서, 발현을 구동하는 본 개시의 조작된 프로모터의 능력을 테스트하기 위해 사용하였다. 키메라 프로모터 및 도메인 결실 프로모터를

fHbp 유전자의 업스트림에서 CH21A 숙주 균주의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하였고, fHbp의 이후의 발현을 정량적 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 결과는 도 7에 나타난다. 패널 A의 값은 참조 그룹 B 균주 H44/76에 의한 fHbp의 발현과 비교된 퍼센트이며, fHbp ID 1 (변이체 그룹 1)의 상대적으로 더 높은 발현자이다. 오차 막대는 두 개의 독립적인 실험에서 측정된 값의 범위를 나타낸다. 대조군 균주는 모체 야생형 균주 및 fHbp KO를 포함하며, 불활성화된 fHbp 유전자를 갖는 돌연변이이고 어떤 fHbp 단백질도 생산하지 않는다; WT는 자연적으로 낮은 fHbp ID 5 생산자인 CH21A 야생형 분리체이고; X1, X5-X7은 키메라 프로모터이고; SL 및 S1-S3은 도메인 결실 프로모터이고; pFP12-f는 높은 수준의 fHbp를 발현하는 네이세리아에서 복제되지만, 플라스미드 불안정성으로 인해 백신 생성에 적합하지 않은 플라스미드 구조이다. X1 프로모터는 플라스미드-기반 시스템 pFP12-f에서 보이는 것들과 유사한 수준으로 fHbp 발현 수준을 구동할 수 있다. 패널 B는 KO (밝은 회색), WT (파선), 및 X1 (실선) 균주에 대하여 fHbp에 특이적인 단클론성 항체 (4 μg/mL의 총 농도의 JAR4 및 JAR5 혼합물)를 사용하는 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다. 패널 C는 항-캡슐 단클론성 항체 JW-A1에 대한 유동 세포 분석법 데이터를 나타내며, 캡슐 군 A 다당류를 인식한다. 데이터는 모든 테스트된 균주 중에 캡슐 다당류에 대하여 유사한 발현 수준을 나타낸다.

실시예 2: FHBP 유전자의 제2 카피의 삽입은 단일-카피 또는 야생형 균주와 비교하여 CH21A 의 FHBP 수준을 증가시킨다

키메라 프로모터 X1을 네이세리아 메닝기티디스 균주 CH21A의 fHbp 유전자의 업스트림으로 작동 가능하게 삽입하였다. 게다가, fHbp 유전자의 카피에 작동 가능하게 결합된 키메라 프로모터 X1 또는 도메인 결실 프로모터 S1을 포함하는 발현 구조를 숙주 균주의 lpxL1 자리로 삽입하여 fHbp 유전자의 제2 카피를 제공하였다. fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 8에 나타난다. 값은 참조 그룹 B 균주 H44/76에 의한 fHbp의 발현과 비교된 평균 퍼센트이며, 이것은 fHbp ID1 (변이체 그룹 1)의 상대적으로 높은 발현자이다. 오차 막대는 두 개의 독립적인 실험에서 측정된 값의 범위를 나타낸다. KO는 fHbp 유전자가 불활성화되고, 단백질을 발현하지 않는 돌연변이이고; WT는 자연적으로 낮은 fHbp ID 5 생산자인 CH21A 야생형 분리체이고; X1은 키메라 프로모터이고; X1-S1은 fHbp 고유의 자리에서 X1-fHbp 및 lpxL1 자리로 삽입된 S1-fHbp 유전 카세트의 형태인 fHbp 유전자의 제2 카피를 함유하는 돌연변이이고; X1-X1은 fHbp 고유의 자리에서 X1-fHbp 및 lpxL1 자리로 삽입된 X1-fHbp 유전 카세트의 제2 카피를 함유하는 돌연변이이다. 제2 카피의 lpxL1 자리로의 삽입은 또한 내독소 활성의 약화를 일으켰다. 이들 데이터는 원하는 조작된 프로모터-유전자의 다수의 카피가 게놈에서의 위치와 상관없이 증가된 발현 수준을 구동할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 키메라 프로모터에 의해 구동된 높은 FHBP 수준

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH38W, fHbp ID 9를 발현하는 혈청군 W-135 균주를 사용하여 발현을 구동하는 본 개시의 키메라 프로모터의 능력을 테스트하였다. 키메라 프로모터 X1-X4를 fHbp 유전자의 CH38W 숙주 균주 업스트림에서 게놈으로 작동 가능하게 삽입하였고, fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 9에 나타난다. 값은 참조 그룹 B 균주 H44/76에 의한 fHbp의 발현과 비교된 평균 퍼센트 (두 번의 실험의 +/- 범위)이며, 이것은 fHbp ID 1 (변이체 그룹 1)의 상대적으로 높은 발현자이다. KO는 fHbp 유전자가 항생제 마커 (균주가 어떤 검출 가능한 fHbp 단백질도 생산할 수 없게 함)의 삽입에 의해 불활성화되는 돌연변이이고; WT는 fHbp ID 9의 자연적으로 낮은 생산자인 CH38W 야생형 분리체이고; X1-X4는 키메라 프로모터이다. 이들 프로모터를 이용한 발현 수준은 고유의 porA 프로모터 (XO)에 의해 달성된 것과 유사하거나 그보다 더 높았다. 패널 B는 KO (밝은 회색), WT (파선), 및 X1 (실선) 균주에 대하여 fHbp에 특이적인 단클론성 항체 (4 ug/mL의 JAR4 및 JAR5 혼합물)를 사용하여 수거된 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다. 패널 C는 캡슐 군 W135 다당류를 인식하는 항-캡슐 단클론성 항체 JW-W1을 사용하여 수거된 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다.

실시예 4: 고유의 FHBP 부위에서 조작된 프로모터의 삽입에 이외에 조작된 프로모터에 의해 구동된 FHBP 유전자의 제2 카피의 LPXL1 자리로의 삽입

키메라 프로모터 X1을 네이세리아 메닝기티디스 균주 CH38W에서 fHbp 유전자의 업스트림으로 작동 가능하게 삽입하였다. 게다가, fHbp 유전자의 카피에 작동 가능하게 결합된 키메라 프로모터 X1 또는 도메인 결실 프로모터 S1을 포함하는 발현 구조를 숙주 균주의 lpxL1 자리로 삽입하여 fHbp 유전자의 제2 카피를 제공하였다. fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 10에 나타난다. KO는 불활성화된 fHbp 유전자를 갖는 (및 fHbp 단백질 발현을 갖지 않는) 돌연변이이고; WT는 자연적으로 낮은 fHbp ID 5 생산자인 야생형 분리체이고; X1은 고유의 fHbp 프로모터를 X1 프로모터로 치환하여 구성된 동질 유전자형 돌연변이이고; X1-lpXL1은 불활성화된 고유의 fHbp 유전자 및 lpxL1 자리로 삽입된 X1-fHbp 발현 구조의 카피를 갖는 돌연변이이고; X1-S1은 fHbp 고유의 자리의 X1-fHbp 및 lpxL1 자리로 삽입된 S1-fHbp 유전 카세트의 형태인 fHbp 유전자의 제2 카피를 함유하는 돌연변이이고; X1-X1은 fHbp 고유의 자리의 X1-fHbp 및 lpxL1 자리로 삽입된 X1-fHbp 유전 카세트의 제2 카피를 함유하는 돌연변이이다. 값은 참조 그룹 B 균주 H44/76에 의한 fHbp의 발현과 비교된 평균 퍼센트 (두 번의 실험의 +/- 범위)이며, 이것은 fHbp ID 1 (변이체 그룹 1)의 상대적으로 높은 발현자이다.

실시예 5: CH248B 캡슐 군 B 균주에 의한 FHBP 모델 항원의 과생성

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH248B, 캡슐 군 B 균주를 사용하여 발현을 구동하는 본 개시의 키메라 프로모터의 능력을 테스트하였다. 이 균주는 또한 H44/76으로도 불린다. 키메라 프로모터 X1을 fHbp 유전자의 업스트림에서 CH248B 숙주 균주의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하였고, fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 11에 나타난다. 값은 fHbp 단독의 발현과 비교된 평균 퍼센트 (복제 실험에서 +/- 범위)인데 , 이것이 참조 그룹 B 균주 및 fHbp ID1 (변이체 그룹 1)의 상대적으로 높은 발현자이기 때문이다. KO는 fHbp 유전자 및 단백질이 결핍된 돌연변이이고; WT는 자연적으로 높은 fHbp ID 1 생산자인 야생형 분리체이고; X1은 고유의 fHbp 프로모터를 X1 프로모터로 치환하여 구성된 동질 유전자형 돌연변이이고; pFP12-f는 높은 수준의 fHbp ID 1을 발현하는 네이세리아에서 복제하지만, 플라스미드 불안정성으로 인해 백신 생산에 적합하지 않은 플라스미드 구조를 함유하는 균주이다. 패널 B는 KO (밝은 회색), WT (파선), XI (실선), 및 pFP12-f (점선) 균주에 대하여 fHbp에 특이적인 단클론성 항체 (4 ug/mL의 JAR4 및 JAR5 혼합물)를 사용하여 수거된 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다. X1 키메라 프로모터는 표면 fHbp 발현 수준을 플라스미드 기반 시스템 pFP12-f의 그것과 유사한 수준으로 구동할 수 있었다. 패널 C는 캡슐 군 B 다당류를 인식하는 항-캡슐 단클론성 항체 SEAM-12를 사용하여 수거된 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다.

실시예 6: CH253B 캡슐 군 B 균주에서 FHBP 모델 항원의 과생성

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH253B, fHbp ID 14를 발현하는 캡슐 군 B 균주를 사용하여 발현을 구동하는 키메라 프로모터 X1의 능력을 테스트하였다. 키메라 프로모터 X1을 fHbp 유전자의 업스트림에서 CH253B 숙주 균주 (NZ98/254로도 알려짐)의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하였고, fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 12에 나타난다. 값은 참조 그룹 B 균주 H44/76에 의한 fHbp의 발현과 비교된 평균 퍼센트 (복제 실험에서 +/- 범위)이며, 이것은 fHbp ID 1 (변이체 그룹 1)의 상대적으로 높은 발현자이다. KO는 fHbp 유전자 및 단백질이 결핍된 돌연변이이고; WT는 자연적으로 낮은 fHbp ID 14 생산자인 야생형 분리체이고; X1은 고유의 fHbp 프로모터를 X1 프로모터로 치환하여 구성된 동질 유전자형 돌연변이이다. 키메라 프로모터 X1은 야생형 분리체와 비교하여 fHbp의 훨씬 더 높은 발현을 달성하였다.

실시예 7: CH164X 캡슐 군 X 균주에 의한 FHBP 모델 항원의 과생성

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH164X, fHbp ID 74를 발현하는 캡슐 군 X 균주를 사용하여 발현을 구동하는 키메라 프로모터 X1의 능력을 테스트하였다. 키메라 프로모터 X1을 fHbp 유전자의 업스트림에서 CH164X 숙주 균주의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하였고, fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 13에 나타난다. KO는 fHbp 유전자 및 단백질이 결핍된 돌연변이이고; WT는 자연적으로 낮은 fHbp ID 74 생산자인 야생형 분리체이고; X1은 고유의 fHbp 프로모터를 X1 프로모터로 치환하여 구성된 동질 유전자형 돌연변이이다. 키메라 프로모터 X1은 야생형 분리체와 비교하여 fHbp의 훨씬 더 높은 발현을 달성하였다.

실시예 8: CH36W 캡슐 그룹 W135 균주에 의한 FHBP 변이체 2 모델의 과생성

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH36W, fHbp ID 23 (변이체 2)을 발현하는 캡슐 군 W135 균주를 사용하여 발현을 구동하는 키메라 프로모터 X1의 능력을 테스트하였다. 키메라 프로모터 X1을 fHbp ID 23 유전자의 업스트림에서 CH36W 숙주 균주의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하였고, fHbp의 이후 발현을 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 결과는 도 14에 나타난다. 패널 A는 CH36W 돌연변이의 발현 수준의 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타낸다. 값은 참조 그룹 B 균주 8047에 의한 fHbp의 발현과 비교된 평균 퍼센트 (두 번의 복제 실험에서 +/- 범위)이며, 이것은 fHbp ID 77 (변이체 그룹 2)의 상대적으로 높은 발현자이다. KO는 fHbp 유전자가 불활성화되고 단백질을 발현하지 않는 돌연변이이고; WT는 자연적으로 낮은 fHbp ID 23 생산자인 야생형 분리체이고; X1은 키메라 프로모터이다. 패널 B는 KO (밝은 회색), WT (파선), 및 X1 (실선) 균주에 대하여 fHbp에 특이적인 단클론성 항체 (4 ug/mL의 JAR31)을 사용하여 수거된 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다. 패널 C는 캡슐 군 W135 다당류를 인식하는 대조군으로서 사용된 항-캡슐 단클론성 항체 JW-W1을 사용하여 수거된 유동 세포 분석법 데이터를 나타낸다. 전체적으로, 데이터는 변이체 그룹 2 fHbp의 증가된 발현을 구동하는 조작된 프로모터의 능력을 설명한다.

실시예 9: 발현을 증가시키기 위한 전사 종결자 서열의 사용

네이세리아 메닝기티디스 균주 CH21A, 캡슐 군 A 균주를 사용하여 fHbp ID 5의 발현 수준에 대한 전사 종결자 서열의 영향을 평가하였다. X1 프로모터 서열을 fHbp ID 5를 암호화하는 서열의 CH21A 균주 업스트림의 게놈으로 삽입하였다. 제1 재조합 숙주에서, 서열 TAACCATTGTGAAAATGCCGTCCGAACACGATAATTTACCGTTCGGACGG CATTTTGTA를 갖는 고유의 전사 종결자를 fHbp ID5 암호화 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합시켰다. 제2 재조합 숙주에서, 고유의 전사 종결자 서열을 결실하였다. 재조합 숙주 둘 다를 이후에 같은 조건 하에 배양하였고 , fHbp ID 5의 발현 수준을 두 숙주 사이에서 비교하였다. 결과는 도 15에 나타난다. fHbp ID 5의 발현 수준은 전사 종결자 서열을 함유하는 숙주에서 더 높았으며, 전사 종결자 서열이 더 높은 발현을 용이하게 한다는 것을 나타낸다.

실시예 10: 코돈 최적화에 사용되는 코돈 사용 빈도의 결정

코돈 사용 빈도를 두 가지 다른 네이세리아 메닝기티디스 균주인, FAM18 및 Z2491에서 결정하였다. 두 가지 균주에 대한 코돈 사용 평균 및 표준 편차 결과는 도 16 및 17에 나타난다. 각각의 아미노산 잔기에 대하여, 가장 높은 평균 사용 값을 가진 코돈을 확인하였다. 그 다음에, fHbp ID 9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 코돈 사용 결과에 기초하여 각각의 균주의 발현을 위해 조작하였다. fHbp ID 9 암호화 서열을 온라인 코돈 최적화 도구에 업로드하였고, 각각의 균주에 대한 코돈 사용 선호도를 제공하였다. 온라인 코돈 최적화 도구는 암호화 서열의 불필요한 코돈을 각각의 아미노산 잔기에 대하여 바람직한 코돈으로 대체하였다. 원래의 fHbp 서열과 코돈-최적화된 서열의 비교는 도 18에 나타난다.

코돈 최적화를 또한 fHbp ID 23, ID 4, ID 28, ID 1, ID 14, ID 45, ID 55, ID 19, ID 77, NspA (nmb0663), NspA (nmc0612, nma0862), NHbp (nmb2132), TbpB (Tbp2, nmb0461), TbpA (tbp1, nmb0461), LbpB (nmb1541), LbpA (nmb1540), 불투명 단백질 (등급 5, nmb1053), NadA (nmb1994), PorA (nmb1429), 및 feta (nmb1988)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 수행하였다. 코돈-최적화된 서열은 도 19-38에 나타난다.

실시예 11: 다수의 표면 항원의 발현을 구동하기 위한 단일 조작된 프로모터 서열의 사용

조작된 프로모터 서열을 사용하여 오페론-유사 방식으로 조직화된 표면 항원을 암호화하는 다수의 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동하였다. 도 39, 패널 A. 이것은 조작된 프로모터의 단일 카피의 비교 하에 다수의 표면 항원의 과발현을 허용하였다. 시스템을 사용하여 조작된 프로모터의 높은 생산량으로 인해 같은 시간에 복수의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 테스트된 표면 항원-암호화 폴리뉴클레오티드 서열 배열의 실시예는 도 39, 패널 B 및 C에 제공되며, fHbp는 NspA (패널 B) 및 TbpB 및 TbpA 둘 다 (패널 C)와 함께 과발현된다.

이 접근법을 더 예시하기 위해, 조작된 프로모터 X1을 네이세리아 메닝기티디스 균주 CH38W, fHbp ID 9 및 NspA를, 둘 다 낮은 수준으로, 발현하는 캡슐 W-135 균주에서 fHbp-암호화 폴리뉴클레오티드 서열의 업스트림으로 작동 가능하게 삽입하였다. NspA-암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 fHbp-암호화 서열의 다운스트림으로만 작동 가능하게 삽입하였다. fHbp의 전사 종결자 서열을 NspA-암호화 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합시켰다. fHbp 및 NspA 둘 다의 이후의 발현을 각각의 항원에 대하여 특이적인 단클론성 항체를 사용하는 정량적 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 도 40은 X1 조작된 프로모터의 조절 하에 fHbp-암호화 폴리뉴클레오티드 서열 및 NspA-암호화 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 CH38W 돌연변이 균주에서의 발현 수준의 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 나타낸다 (도 39, 패널 B). 나타난 값은 야생형 (WT) 분리체의 fHbp 또는 NspA의 발현과 비교된 평균 형광 단위 (두 번의 복제에서 +/- 범위)이다. 돌연변이에서 fHbp 및 NspA 둘 다의발현 수준은 WT 균주에서보다 훨씬 더 높다. 이들 데이터는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 단일 조작된 프로모터에 의해 높은 수준으로 구동될 수 있다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Pajon Feyt, Rolando <120> Engineered Sequences to Facilitate Expression of Antigens in Neisseria and Methods of Use <130> CHOR-064WO <150> 61/529,776 <151> 2011-08-31 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> W at this location can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> M at this location can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> K at this location can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> R at this location can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> G at this location can be present or absent <400> 1 wwwwkssvkc mtttcakrg 19 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 2 atggtt 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 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180 aacaccggca aactgaaaaa tgacaaaatt tctcgcttcg acttcgtaca aaaaatcgaa 240 gtcgacggtc aaacaatcac attggcaagc ggcgaattcc aaatttataa acaaaaccac 300 tcagccgttg tcgccctgca aattgagaaa attaacaacc ctgacaaaac ggactccctg 360 atcaaccaac gttccttctt ggtgtctggc ctgggcggtg aacataccgc gttcaatcaa 420 ctacctggtg gtaaagcgga atatcacggt aaagctttct cttccgacga ccccaacggc 480 cgtttgcact actccatcga tttcaccaaa aaacagggtt atggtcgcat tgaacacctg 540 aaaaccctgg agcaaaatgt agaattggcc gctgccgaac tgaaggctga cgaaaaatct 600 cacgccgtta tcctgggtga tacccgctac ggttctgaag aaaaaggcac ttaccacctg 660 gccctgtttg gcgaccgtgc gcaagaaatt gccggcagcg ccaccgtcaa aatcggtgaa 720 aaagtccacg aaatcggcat tgcgggcaag caa 753 <210> 33 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 33 ggtgttgcgg ccgacatcgg cgccgggctg gccgacgcgc tgacggcgcc tctggaccac 60 aaagacaaag gcttgcagtc tttgactctg gaccaatctg tacgcaagaa cgaaaaactc 120 aaactggccg ctcaaggtgc ggaaaagacc tacggcaacg gcgacagcct gaacactggc 180 aaactgaaaa 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 46 atgaaaaaga ccgtttttac ctgtgccatg attgcactga ccggtaccgc tgcggccgcc 60 caggaattgc aaaccgcgaa cgaattcacc gttcatactg acctctcttc tatttcctcc 120 actcgtgcct tcttgaaaga aaaacacaaa gcagccaaac acatctctgt acgcgccgac 180 attcctttcg atgccaatca aggtattcgc ctggaagccg gttttggtcg ctccaaaaaa 240 aacattatca atctggaaac cgacgaaaac aagctgggca aaactaaaaa cgtaaaactg 300 cccaccggtg tacccgaaaa tcgtatcgac ctttacaccg gttacaccta tacacagacc 360 ctcagcgact ccttgaactt ccgcgttggt gcaggcttgg gctttgagtc ttccaaggac 420 tcgatcaaaa ctaccaaaca caccctccac tcctctcgtc agtcatggtt ggccaaagta 480 cacgccgatc tgttgtccca attgggcaac ggctggtata ttaacccttg gtctgaggtt 540 aaattcgact tgaactctcg ctacaaattg aacacaggcg tcacaaacct gaaaaaagac 600 attaaccaaa aaacaaacgg ctggggcttc ggcttgggcg ccaacattgg caaaaaactg 660 ggcgaaagcg cttccatcga ggccggtccg ttctacaaac aacgtaccta caaagaatcc 720 ggtgaattct ctgtcactac taaatccgga gacgtatctt tgacaatccc taaaacttcc 780 atccgcgagt atggcttgcg cgtcggcatc aaattttga 819 <210> 47 <211> 1095 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 47 atgtccatga aacacttccc gtccaaagtt ttgaccaccg ccatcttggc caccttctgc 60 tccggcgcct tggccgccac ctccgacgac gacgttaaaa aagccgccac cgttgccatc 120 gttgccgcct acaacaacgg ccaagaaatc aacggcttca aagccggcga aaccatctac 180 gacatcggcg aagacggcac catcacccaa aaagacgcca ccgccgccga cgttgaagcc 240 gacgacttca aaggcttggg cttgaaaaaa gttgttacca acttgaccaa aaccgttaac 300 gaaaacaaac aaaacgttga cgccaaagtt aaagccgccg aatccgaaat cgaaaaattg 360 accaccaaat tggccgacac cgacgccgcc ttggccgaca ccgacgccgc cttggacgaa 420 accaccaacg ccttgaacaa attgggcgaa aacatcacca ccttcgccga agaaaccaaa 480 accaacatcg ttaaaatcga cgaaaaattg gaagccgttg ccgacaccgt tgacaaacac 540 gccgaagcct tcaacgacat cgccgactcc ttggacgaaa ccaacaccaa agccgacgaa 600 gccgttaaaa ccgccaacga agccaaacaa accgccgaag aaaccaaaca aaacgttgac 660 gccaaagtta aagccgccga aaccgccgcc ggcaaagccg aagccgccgc cggcaccgcc 720 aacaccgccg ccgacaaagc cgaagccgtt gccgccaaag ttaccgacat caaagccgac 780 atcgccacca acaaagccga catcgccaaa aactccgccc gcatcgactc cttggacaaa 840 aacgttgcca acttgcgcaa agaaacccgc caaggcttgg ccgaacaagc cgccttgtcc 900 ggcttgttcc aaccgtacaa cgttggccgc ttcaacgtta ccgccgccgt tggcggctac 960 aaatccgaat ccgccgttgc catcggcacc ggcttccgct tcaccgaaaa cttcgccgcc 1020 aaagccggcg ttgccgttgg cacctcctcc ggctcctccg ccgcctacca cgttggcgtt 1080 aactacgaat ggtaa 1095 <210> 48 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 48 atgcgcaaaa aattgaccgc cttggttttg tccgccttgc cgttggccgc cgttgccgac 60 gtttccttgt acggcgaaat caaagccggc gttgaaggcc gcaactacca attgcaattg 120 accgaagccc aagccgccaa cggcggcgcc tccggccaag ttaaagttac caaagttacc 180 aaagccaaat cccgcatccg caccaaaatc tccgacttcg gctccttcat cggcttcaaa 240 ggctccgaag acttgggcga cggcttgaaa gccgtttggc aattggaaca agacgtttcc 300 gttgccggcg gcggcgccac ccaatggggc aaccgcgaat ccttcatcgg cttggccggc 360 gaattcggca ccttgcgcgc cggccgcgtt gccaaccaat tcgacgacgc ctcccaagcc 420 atcgacccgt gggactccaa caacgacgtt gcctcccaat tgggcatctt caaacgccac 480 gacgacatgc cggtttccgt tcgctacgac tccccggaat tctccggctt ctccggctcc 540 gttcaattcg ttccgatcca aaactccaaa tccgcctaca ccccggccta ctacaccaaa 600 aacaccaaca acaacttgac cttggttccg gccgttgttg gcaaaccggg ctccgacgtt 660 tactacgccg gcttgaacta caaaaacggc ggcttcgccg gcaactacgc cttcaaatac 720 gcccgccacg ccaacgttgg ccgcaacgcc ttcgaattgt tcttgatcgg ctccggctcc 780 gaccaagcca aaggcaccga cccgttgaaa aaccaccaag ttcaccgctt gaccggcggc 840 tacgaagaag gcggcttgaa cttggccttg gccgcccaat tggacttgtc cgaaaacggc 900 gacaaaacca aaaactccac caccgaaatc gccgccaccg cctcctaccg cttcggcaac 960 gccgttccgc gcatctccta cgcccacggc ttcgacttca tcgaacgcgg caaaaaaggc 1020 gaaaacacct cctacgacca aatcatcgcc ggcgttgact acgacttctc caaacgcacc 1080 tccgccatcg tttccggcgc ctggttgaaa cgcaacaccg gcatcggcaa ctacacccaa 1140 atcaacgccg cctccgttgg cttgcgccac aaattctaa 1179 <210> 49 <211> 2145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 49 atgaacaccc cgttgttccg cttgtccttg ttgtccttga ccttggccgc cggcttcgcc 60 cacgccgccg aaaacaacgc caaagttgtt ttggacaccg ttaccgttaa aggcgaccgc 120 caaggctcca aaatccgcac caacatcgtt accttgcaac aaaaagacga atccaccgcc 180 accgacatgc gcgaattgtt gaaagaagaa ccgtccatcg acttcggcgg cggcaacggc 240 acctcccaat tcttgacctt gcgcggcatg ggccaaaact ccgttgacat caaagttgac 300 aacgcctact ccgactccca aatcttgtac caccaaggcc gcttcatcgt tgacccggcc 360 ttggttaaag ttgtttccgt tcaaaaaggc gccggctccg cctccgccgg catcggcgcc 420 accaacggcg ccatcatcac caaaaccgtt gacgcccaag acttgttgaa aggcttggac 480 aaaaactggg gcgttcgctt gaactccggc ttcgcctcca acgaaggcgt ttcctacggc 540 gcctccgttt tcggcaaaga aggcaacttc gacggcttgt tctcctacaa ccgcaacaac 600 gaaaaagact acgaagccgg caaaggcttc cgcaacaact tcaacggcgg caaaaccgtt 660 ccgtactccg ccttggacaa acgctcctac ttggccaaaa tcggcacctc cttcggcgac 720 ggcgaccacc gcatcgtttt gtcccacatg aaagaccaac accgcggcat ccgcaccgtt 780 cgcgaagaat tcaccgttgg cggcgacaaa gaacgcatct ccatggaacg ccaagccccg 840 gcctaccgcg aaaccaccca atccaacacc aacttggcct acaccggcaa aaacttgggc 900 ttcgttgaaa aattggacgc caacgcctac gttttggaaa aagaacgcta ctccgccgac 960 gactccggca ccggctacgc cggcaacgtt aaaggcccga accacaccca aatcaccacc 1020 cgcggcatga acttcaactt cgactcccgc ttggccgaac aaaccttgtt gaaatacggc 1080 atcaactacc gccaccaaga aatcaaaccg caagccttct tgaactccca attcaaaatc 1140 gaagacaaag aaaaagccac cgacgaagaa aaaaacaaaa accgcgaaaa cgaaaaaatc 1200 gccaaagcct accgcttgac caacccgacc aaaaccgaca ccggcgccta catcgaagcc 1260 atccacgaaa tcgacggctt caccttgacc ggcggcttgc gctacgaccg cttcaaagtt 1320 aaaacccacg acggcaaaac cgtttcctcc aacaacttga acccgtcctt cggcgttatc 1380 tggcaaccgc acgaacactg gtccttctcc gcctcccaca actacgcctc ccgctccccg 1440 cgcttgtacg acgccttgca aacccacggc aaacgcggca tcatctccat cgccgacggc 1500 accaaagccg aacgcgcccg caacaccgaa atcggcttca actacaacga cggcaccttc 1560 gccgccaacg gctcctactt ctggcaaacc atcaaagacg ccttggccaa cccgcaaaac 1620 cgccacgact ccgttgccgt tcgcgaagcc gttaacgccg gctacatcaa aaaccacggc 1680 tacgaattgg gcgcctccta ccgcaccggc ggcttgaccg ccaaagttgg cgtttcccac 1740 tccaaaccgc gcttctacga cacccacaaa gacaaattgt tgtccgccaa cccggaattc 1800 ggcgcccaag ttggccgcac ctggaccgcc tccttggcct accgcttcca aaacccgaac 1860 ttggaaatcg gctggcgcgg ccgctacgtt caaaaagccg ttggctccat cttggttgcc 1920 ggccaaaaag accgcaacgg caaattggaa aacgttgttc gcaaaggctt cggcgttaac 1980 gacgttttcg ccaactggaa accgttgggc aaagacacct tgaacgttaa cttgtccgtt 2040 aacaacgttt tcaacacctt ctactacccg cactcccaac gctggaccaa caccttgccg 2100 ggcgttggcc gcgacgttcg cttgggcgtt aactacaaat tctaa 2145 <210> 50 <211> 406 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 50 atttgtcctt tcaggaacag cagattaatt acaggcgcat tctaacacaa ccgccgcgcc 60 ggccgattac cgttaacctg ttcataaact gtacagcaca tatttcaatg taaatctttg 120 ttattttatt gcggtgtaac ttttttacaa cattcttaaa accattccga cctgtctgcc 180 gactttccca atccgcctta ataaatcata caagatactg aaattatatt aatctctata 240 atatttatcc ctatcgaatt tttaacagca aaaccgtttt acaggattta tcaatccgcc 300 cgccagaaaa cttttcattc aaaccttttt cccatctgta cgacattgca atcccttatt 360 ccatagtgca taattacgca aattcagcga tgaatttcca acccgg 406 <210> 51 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 51 catggatcca cagcaaaacc gttttacagg atttatcaat ccgcccgcca gaaaactttt 60 cattcaaacc tttttcccat ctgtacgaca ttgcaatccc ttattccata gtgcataatt 120 acgcaaattc agcgatgaat ttccaacccg gtttgtagta tggtcgataa agacctattt 180 gtttcaataa tttaaattgg ttctaaaggt tactcatatg cga 223 <210> 52 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 52 catggatcca cagcaaaacc gttttacagg atttatcaat ccgcccgcca gaaaactttt 60 cattcaaacc tttttcccat ctgtacgaca ttgcaatccc ttattccata gtgcataatt 120 acgcaaattc agcgatgaat ttccaacccg gcatatgcga 160 <210> 53 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 53 taaccattgt gaaaatgccg tccgaacacg ataatttacc gttcggacgg cattttgta 59

Claims (35)

1. 서열 ATGGTT를 포함하는 고유의 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) porA 프로모터의 5' 부분;
   스페이서 부분; 및
   서열 TATAAT을 포함하는 고유의 네이세리아 메닝기티디스 porA 프로모터의 3' 부분을 포함하는 프로모터로서,
   스페이서는 식 N¹-TTTCA-N²의 서열을 포함하고, N¹은 X^a(T/A)(T/A)(T/A)(T/G)(C/G)(C/G)(C/G/A)(G/T)CX^b이고 N²는 X^cX^dX^e이며,
   X^a는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 T 또는 A이고;
   X^b는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 A 또는 C이고;
   X^c는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 T 또는 G이고;
   X^d는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 A 또는 G이고;
   X^e는 존재하거나 존재하지 않으며, 존재할 때는 G이며,
   5' 부분, 스페이서, 및 3' 부분은 작동 가능하게 결합되어 네이세리아 메닝기티디스의 전사를 위해 제공되는 프로모터.
2. 제1 항에 있어서, 스페이서는 ATATGCCTCCTTTCATA를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
3. 제1 항에 있어서, 스페이서는 TATATGCCTCCTTTCATA를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
4. 제1 항에 있어서, 스페이서는 ATAATGCCTCCTTTCATA를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
5. 제1 항에 있어서, 스페이서는 ATATGCATCATTTCATA를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
6. 제1 항에 있어서, 스페이서는 TTTTGCGGGCTTTCATA를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
7. 제1 항에 있어서, 스페이서는 TTTTGCGGGCTTTCAGGG를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
8. 제1 항에 있어서, 스페이서는 TTTTGCGGGCTTTCAG를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
9. 5'에서 3' 방향으로, 식 TFB-X-E-ATG를 포함하는 프로모터로서,
   TFB는 고유의 nmb1523 프로모터의 전사 인자 결합 서열을 나타내고;
   E는 고유의 nmb1523 프로모터의 66 염기쌍 연장 서열을 나타내고;
   X는 TFB 및 E 사이에 위치한 고유의 nmb1523 프로모터의 스페이서 서열을 나타내며,
   E가 존재할 때는, TFB가 없고, TFB가 존재할 때는, E가 없다는 단서와 함께, 부분 TFB, X, 및 E는 작동 가능하게 결합되어 네이세리아 메닝기티디스의 전사를 제공하는 프로모터.
10. 제9 항에 있어서, TFB와 E가 모두 없는 것을 특징으로 하는 프로모터.
11. 원하는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합된 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 프로모터를 포함하는 핵산 구조물.
12. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 프로모터, 또는 제11 항의 핵산 구조물를 포함하는 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아.
13. 제12 항에 있어서, 프로모터는 박테리아의 게놈에 작동 가능하게 위치하여 내인성 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 용이하게 하는 것을 특징으로 하는 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아.
14. 제13 항에 있어서, 내인성 폴리뉴클레오티드는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아.
15. 제12 항의 분리된 네이세리아 메닝기티디스 박테리아를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 하는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법.
16. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 프로모터 서열을 고유의 표면 항원 유전자의 업스트림에서 네이세리아 메닝기티디시 숙주의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하는 단계; 및
    네이세리아 메닝기티디스 숙주를 배양하는 단계
    를 포함하며, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 하는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법.
17. 표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 프로모터 서열을 포함하는 핵산 구조물를 네이세리아 메닝기티디스 숙주의 게놈으로 삽입하는 단계; 및
    네이세리아 메닝기티디스 숙주를 배양하는 단계
    를 포함하며, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 하는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법.
18. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 제1 프로모터 서열을 고유의 표면 항원 유전자의 업스트림에서 네이세리아 메닝기티디스 숙주 업스트림의 게놈으로 작동 가능하게 삽입하는 단계;
    표면 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 제2 프로모터 서열을 포함하는 핵산 구조물를 네이세리아 메닝기티디스 숙주의 게놈으로 삽입하는 단계; 및
    네이세리아 메닝기티디스 숙주를 배양하는 단계
    를 포함하며, 상기 배양하는 단계는 표면 항원의 발현을 용이하게 하는 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원을 발현하는 방법.
19. 제18 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로모터는 같은 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제18 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로모터는 다른 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제11 항에 있어서, 프로모터는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동하기 위해, 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되고, 제1 폴리뉴클레오티드는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
22. 제21 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 각각 같은 원하는 유전자 산물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
23. 제21 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 각각 다른 원하는 유전자 산물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
24. 제22 항에 있어서, 원하는 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원인 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
25. 제23 항에 있어서, 다른 원하는 유전자 산물 각각은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원인 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
26. 제21 항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
27. 제11 항에 있어서, 프로모터는 제1, 제2, 및 제3 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동하기 위해, 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되고, 제1 폴리뉴클레오티드는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되고, 제2 폴리뉴클레오티드는 원하는 유전자 산물을 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
28. 제27 항에 있어서, 제1, 제2, 및 제3 폴리뉴클레오티드는 각각 같은 원하는 유전자 산물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
29. 제28 항에 있어서, 원하는 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원인 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
30. 제27 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 중 둘은 원하는 제1 유전자 산물을 암호화하고, 폴리뉴클레오티드 중 하나는 원하는 제1 유전자 산물과 다른 원하는 제2 유전자 산물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
31. 제30 항에 있어서, 원하는 제1 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원인 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
32. 제30 항에 있어서, 원하는 제2 유전자 산물은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원인 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
33. 제27 항에 있어서, 제1, 제2, 및 제3 폴리뉴클레오티드는 각각 다른 원하는 유전자 산물을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
34. 제33 항에 있어서, 다른 원하는 유전자 산물 각각은 네이세리아 메닝기티디스 표면 항원인 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
35. 제27 항에 있어서, 제3 폴리뉴클레오티드의 3' 끝에 작동 가능하게 결합된 전사 종결자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조물.
    

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