KR20140057356A - 진단 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ERBB2 유전자의 메틸화 상태에 기초하여 암 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 측면은 ERBB2 유전자의 메틸화 상태에 기초하여 EGFR 억제제 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다.

Description

진단 마커 {DIAGNOSTIC MARKERS}

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본원은 2011년 8월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 61/529,917을 우선권 주장하며, 그의 전체 개시내용이 본원에 참조로 포함된다.

<발명의 분야>

본 발명은 유전자 메틸화 상태에 기초하여 암 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명은 암 환자를 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 환자가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 키나제 억제제를 사용한 치료로부터 가장 이익을 얻을 것인지를 결정하는 방법에 관한 것이다.

암은 비조절된 성장, 분화의 결손 및 국부 조직에 침입하여 전이하는 능력을 특징으로 하는 광범위한 세포성 악성종양에 대한 일반 명칭이다. 이러한 신생물성 악성종양은 다양한 정도의 유병률로 신체의 모든 조직 및 기관에 침범한다.

다수의 치료제가 다양한 유형의 암의 치료를 위해 지난 수십년에 걸쳐 개발되었다. 가장 통상적으로 사용되는 유형의 항암제는 다음을 포함한다: DNA-알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드), 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 폴레이트 길항제 및 5-플루오로우라실, 피리미딘 길항제), 미세관 파괴제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 파클리탁셀), DNA 삽입제 (예를 들어, 독소루비신, 다우노마이신, 시스플라틴) 및 호르몬 요법 (예를 들어, 타목시펜, 플루타미드).

표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리는 분화 및 증식과 같은 세포 반응에 관여하는 4가지의 밀접하게 관련된 수용체 (HER1/EGFR, HER2 (ERBB2), HER3 (ERBB23) 및 HER4 (ERBB4))를 포함한다. EGFR 키나제 또는 그의 리간드 TGF-알파의 과다발현이 유방암, 폐암, 결장직장암, 난소암, 신세포암, 방광암, 두경부암, 교모세포종 및 성상세포종을 비롯한 다수의 암과 빈번하게 관련되고, 이러한 종양의 악성 성장에 기여하는 것으로 여겨진다. EGFR 유전자에서의 특정 결실-돌연변이 (EGFRvIII)가 또한 세포 종양발생성을 증가시키는 것으로 발견되었다. EGFR 자극 신호전달 경로의 활성화는 잠재적으로 암을 촉진하는 다수의 과정, 예를 들어 증식, 혈관신생, 세포 이동성 및 침입, 감소된 아폽토시스 및 약물 내성 유도를 촉진한다. 증가된 HER1/EGFR 발현이 진행성 질환, 전이 및 불량한 예후와 빈번하게 연관된다. 예를 들어, NSCLC 및 위암에서, 증가된 HER1/EGFR 발현이 높은 전이율, 불량한 종양 분화 및 증가된 종양 증식과 상관되는 것으로 밝혀졌다.

ERBB2 과다발현은 통상적으로 특히 액와 림프절이 관련되는 원발성 질환을 갖는 환자에서 불량한 예후의 예측인자로 여겨지며 (문헌 [Slamon et al., Science 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science 244:707-712 (1989); Ravdin and Chamness, Gene 159:19-27 (1995); 및 Hynes and Stem, Biochim Biophys Acta 1198:165-184 (1994)]), 호르몬 요법 및 CMF (시클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 플루오르우라실) 및 안트라시클린을 포함하는 화학치료 요법에 대한 감수성 및/또는 내성과 연관된다 (문헌 [Baselga et al., Oncology 11(3 Suppl 2):43-48 (1997)]). HER2 항체 트라스투주맙을 사용하여 치료된 환자는 HER2 과다발현/증폭에 기초하여 요법을 위해 선택된다. 예를 들어, WO99/31140, US2003/0170234, WO01/89566을 참조한다.

수용체의 고유의 단백질 티로신 키나제 활성을 활성화시키고/거나 하류 신호전달을 증가시키는 돌연변이가 NSCLC 및 교모세포종에서 관찰되었다. 그러나, EGF 수용체 억제제, 예를 들어 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)®) 또는 게피티닙 (이레사(IRESSA)™)에 대한 감수성을 부여하는 주요 메카니즘으로서의 돌연변이의 역할은 논란이 많다. 최근에, 전장 EGF 수용체의 돌연변이체 형태는 EGF 수용체 티로신 키나제 억제제 게피티닙에 대한 반응성을 예측하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Paez, J. G. et al. (2004) Science 304:1497-1500; Lynch, T. J. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350:2129-2139]). 세포 배양 연구는 EGF 수용체의 돌연변이체 형태 (즉, H3255)를 발현하는 세포주가 EGF 수용체 티로신 키나제 억제제 게피티닙에 의한 성장 억제에 대해 보다 감수성이며, 야생형 EGF 수용체를 발현하는 종양 세포주를 억제하기 위해 훨씬 더 높은 농도의 게피티닙이 요구된다는 것을 보여주었다. 이러한 관찰은 EGF 수용체의 특정한 돌연변이체 형태가 EGF 수용체 억제제에 대한 보다 큰 감수성을 반영할 수 있으나 완전하게 비-반응성인 표현형을 확인하지는 않는다는 것을 시사한다.

EGFR의 키나제 활성을 직접적으로 억제하는 화합물의 항종양제 뿐만 아니라 EGFR 활성화를 차단함으로써 EGFR 키나제 활성을 감소시키는 항체로서 사용하기 위한 개발은 집중적인 연구가 시도되고 있는 분야이다 (문헌 [de Bono J.S. and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8:S19-S26; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313]). 여러 연구는 일부 EGFR 키나제 억제제가 특정의 다른 항암제 또는 화학요법제 또는 치료와 조합하여 사용되는 경우에 종양 세포 또는 신생물 사멸을 개선할 수도 있다는 것을 입증하거나, 개시하거나 또는 시사하였다 (예를 들어, 문헌 [Herbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732; Solomon, B. et al. (2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723; Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13; Grunwald, V. and Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867; Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6):658-666; Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3:367-380; Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3:269-279; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:2053-2063]; 및 특허 공개 번호 US 2003/0157104).

에를로티닙 (예를 들어, 에를로티닙 HCl, 또한 타르세바® 또는 OSI-774로 공지됨)은 EGFR 키나제의 경구 이용가능한 억제제이다. 시험관내에서, 에를로티닙은 결장직장암 및 유방암을 비롯한 다수의 인간 종양 세포주에서 EGFR 키나제에 대한 실질적인 억제 활성을 입증하였으며 (문헌 [Moyer J.D. et al. (1997) Cancer Res. 57:4838]), 전임상 평가는 다수의 EGFR-발현 인간 종양 이종이식편에 대한 활성을 입증하였다 (문헌 [Pollack, V.A. et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739]). 보다 최근에, 에를로티닙은 두경부암 (문헌 [Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:77]), NSCLC (문헌 [Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:310a, abstract 1235]), CRC (문헌 [Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstract 785]) 및 MBC (문헌 [Winer, E., et al. (2002) Breast Cancer Res. Treat. 76:5115a, abstract 445)를 비롯한 다수의 적응증에서의 I 및 II상 시험에서 유망한 활성을 입증하였다. III상 시험에서, 에를로티닙 단독요법은 진행성, 치료-불응성 NSCLC을 갖는 환자에서 유의하게 생존을 연장시키고, 질환 진행을 지연시키고, 폐암-관련 증상의 악화를 지연시켰다 (문헌 [Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology, 22:14S (July 15 Supplement), Abstract 7022]). 에를로티닙에 대한 많은 임상 시험 데이터가 NSCLC에서의 그의 사용에 관한 것인 반면, I/II상 연구로부터의 예비 결과는 CRC (문헌 [Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstract 785]) 및 MBC (문헌 [Jones, R.J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:45a, abstract 180])를 비롯한 광범위한 인간 고형 종양 유형을 갖는 환자에서 에를로티닙 및 카페시타빈/에를로티닙 조합 요법에 대한 유망한 활성을 입증하였다. 2004년 11월에, 미국 식품 의약품국 (FDA)은 적어도 1회의 이전 화학치료 요법의 실패 후의 국소적으로 진행되거나 전이된 비소세포 폐암 (NSCLC)을 갖는 환자의 치료를 위해 에를로티닙을 승인하였다. 에를로티닙은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 클래스 중 III상 임상 시험에서 진행성 NSCLC 환자의 생존의 증가를 입증한 유일한 약물이다.

항신생물성 약물은 이상적으로 비-악성 세포에 대한 그의 독성과 관련하여 광범위한 치료 지수로 암 세포를 선택적으로 사멸할 것이다. 또한, 심지어는 약물에 대한 연장된 노출 후에도 악성 세포에 대한 그의 효능을 유지할 것이다. 불행히도, 현재 어떠한 화학요법도 이러한 이상적 프로파일을 보유하지 않는다. 대신에, 대부분은 매우 좁은 치료 지수를 보유한다. 또한, 치사 농도보다 약간 낮은 화학요법제에 노출된 암성 세포는 이러한 작용제에 대한 내성을 매우 빈번하게 발생시킬 뿐만 아니라 여러 다른 항신생물제에 대한 교차-내성을 상당히 빈번하게 발생시킬 것이다. 추가로, 임의의 주어진 암 유형에서 환자가 특정한 치료, 심지어는 보다 새로운 유전자-표적화 요법, 예컨대 EGFR 키나제 억제제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지 예측할 수 없는 경우가 빈번하며, 이에 따라 가장 효과적인 요법을 찾기 위해서는 종종 환자에게 상당한 위험 및 불편함을 주는 상당한 시행착오가 불가피하다.

따라서, 신생물 및 다른 증식성 장애를 위해 보다 효능있는 치료, 및 어느 종양이 어느 치료에 반응할 것인지를 결정하기 위한 보다 효과적인 수단이 요구된다. 기존의 약물의 치료 효능을 증진시키기 위한 전략은 이들의 투여를 위한 스케줄의 변화, 및 또한 다른 항암 또는 생화학적 조절제와 조합된 이들의 사용을 포함한다. 조합 요법은 치료상 적절한 용량의 각각의 작용제의 단독 사용에 비해 보다 큰 효능 및 감소된 부작용을 발생시킬 수 있는 방법으로 널리 알려져 있다. 일부 경우에, 약물 조합의 효능은 부가적이지만 (조합의 효능이 각각의 약물 단독의 효과의 합과 대략적으로 동등함), 다른 경우에 효과는 상승작용적이다 (조합의 효능이 각각의 주어진 약물 단독의 효과의 합보다 큼).

표적-특이적 치료 접근법, 예컨대 에를로티닙은 일반적으로 종래의 세포독성제에 비해 감소된 독성과 연관되며, 이에 따라 이들 자체로 조합 요법에 사용되도록 한다. 유망한 결과가 베바시주맙 (문헌 [Mininberg, E.D., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:627a, abstract 2521]) 및 겜시타빈 (문헌 [Dragovich, T., (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:223a, abstract 895])과 조합된 에를로티닙의 I/II상 연구에서 관찰되었다. NSCLC III상 시험에서의 최근의 데이터는 표준 화학요법과 조합된 1차 에를로티닙 또는 게피티닙이 생존을 개선시키지 않는다는 것을 보여준다 (문헌 [Gatzemeier, U., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:617 (Abstract 7010); Herbst, R.S., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:617 (Abstract 7011); Giaccone, G., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:777; Herbst, R., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:785]). 그러나, 췌장암 III상 시험은 겜시타빈과 조합된 1차 에를로니팁이 생존을 개선시킨다는 것을 보여준다.

여러 그룹은 EGFR 억제제에 대한 환자의 반응을 예측하기 위한 잠재적 바이오마커를 연구하였다 (예를 들어, WO 2004/063709, WO 2005/017493, WO 2004/111273, WO 2004/071572; US 2005/0019785 및 US 2004/0132097 참조). 한 이러한 마커는 상피 및 중간엽 표현형이다. 대부분의 암 전이 동안, 종양 세포에서 상피로부터-중간엽으로의 전이 (EMT)로 알려진 중요한 변화가 일어난다 (문헌 [Thiery, J.P. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:442-454; Savagner, P. (2001) Bioessays 23:912-923; Kang Y. and Massague, J. (2004) Cell 118:277-279; Julien-Grille, S., et al. Cancer Research 63:2172-2178; Bates, R.C. et al. (2003) Current Biology 13:1721-1727; Lu Z., et al. (2003) Cancer Cell. 4(6):499-515)]). 단단하게 함께 결합되고 극성을 나타내는 상피 세포는 보다 느슨하게 함께 결합되고, 극성의 상실을 나타내며, 이동하는 능력을 갖는 중간엽 세포를 생성한다. 이들 중간엽 세포는 본래 조직 주변의 조직으로 확산되고, 혈관 및 림프관에 침입하고, 이들이 분열하여 추가의 종양을 형성하는 새로운 장소로 이동할 수 있다. EMT는 배아발생 동안을 제외하고 건강한 세포에서 발생하지 않는다. 정상적인 상황 하에서는 TGF-β가 성장 억제제로서 작용하지만, 암 전이 동안에는 TGF-β가 EMT를 촉진하기 시작한다.

상피 및 중간엽 표현형은 특정한 유전자 발현 패턴과 연관된다. 예를 들어, WO2006101925에서 상피 표현형은 E-카드헤린, Brk, γ-카테닌, α-카테닌, 케라틴 8, 케라틴 18, 코넥신 31, 플라코필린 3, 스트라타핀 1, 라미닌 알파-5 및 ST14의 높은 발현 수준과 연관되는 반면, 중간엽 표현형은 비멘틴, 피브로넥틴, 피브릴린-1, 피브릴린-2, 콜라겐 알파-2(IV), 콜라겐 알파-2(V), LOXL1, 니도겐, C11orf9, 테나신, N-카드헤린, 배아성 EDB+ 피브로넥틴, 튜불린 알파-3 및 에피모르핀의 높은 발현 수준과 연관되는 것으로 밝혀졌다.

후성학은 기저 DNA 서열의 변화 이외의 메카니즘에 의해 유발되는 유전자 발현 또는 세포 표현형의 유전가능한 변화를 연구하며 - 이에 따라 후성 (epi- (그리스어: 초과(over), 위(above), 외(outer)) -유전학으로 명명된다. 이러한 변화의 예는 DNA 메틸화 및 히스톤 변형을 포함하며, 이들 둘 다는 연관 유전자의 서열을 변경시키지 않고 유전자 발현을 조정하는 역할을 한다. 이러한 변화는 유기체의 남은 생애 동안 세포 분열을 통해 체세포적으로 유전가능할 수 있으며, 또한 유기체의 이후의 세대로 전해질 수 있다. 그러나, 유기체의 기저 DNA 서열의 변화는 없으며; 대신 비-유전자 인자가 유기체의 유전자를 다르게 거동하거나 발현되도록 한다.

DNA 메틸화는 고등 유기체에서 정상 유기체 발생 및 세포 분화의 중요한 부분이다. DNA 메틸화는 세포가 "이들이 어디에 존재하는지 기억"할 수 있도록 세포에서 유전자 발현 패턴을 안정하게 변경시키며; 예를 들어 배아 발생 동안 췌장섬에 있도록 프로그래밍된 세포는 이들이 췌장섬에 남아있을 필요가 있다는 것을 알려주는 신호를 계속 보내지 않고도 유기체의 일생 동안 췌장섬에 남아있는다. 또한, DNA 메틸화는 시간 경과에 따라 숙주의 게놈에 혼입되는 바이러스 유전자 및 다른 유해한 요소의 발현을 억제한다. DNA 메틸화는 또한 염색질 구조의 기반을 형성하여, 세포가 DNA의 단일 불변 서열로부터 다세포 생애에 필요한 다수의 특징을 형성할 수 있도록 한다. DNA 메틸화는 또한 거의 모든 유형의 암의 발생에서 중요한 역할을 한다. 시토신의 5 위치에서의 DNA 메틸화는 유전자 발현을 감소시키는 특정 효과를 나타내며, 조사된 모든 척추동물에서 발견되었다. 성체 조직에서, DNA 메틸화는 전형적으로 CpG 디뉴클레오티드 컨텍스트에서 일어나는 반면 비-CpG 메틸화는 배아 줄기 세포에서 보편적이다.

"CpG"는 "-C-포스페이트-G-", 즉 오직 1개의 포스페이트에 의해 분리된 시토신 및 구아닌에 대한 약어이며; 포스페이트는 DNA에서 임의의 2개의 뉴클레오시드를 함께 연결한다. "CpG" 표기는 이 선형 서열을 시토신 및 구아닌의 CG 염기-쌍형성으로부터 구별하는데 사용된다. CpG 디뉴클레오티드의 시토신은 메틸화되어 5-메틸시토신 (5-mC)을 형성할 수 있다. 포유동물에서, 유전자 내의 시토신의 메틸화는 유전자를 턴 오프시킬 수 있다. DNA에 메틸 기를 첨가하는 효소는 DNA 메틸트랜스퍼라제로 불린다. 포유동물에서, CpG 시토신의 70% 내지 80%가 메틸화된다. CpG 섬으로 공지된 보다 높은 농도의 CpG 부위를 갖는 게놈의 영역이 존재한다. 이들 "CpG 섬"은 또한 예상보다 높은 GC 함량 (즉, >50%)을 갖는다. 포유동물 게놈 내의 다수의 유전자는 유전자의 시작과 연관된 CpG 섬을 갖는다. 이 때문에, CpG 섬의 존재는 유전자의 예측 및 주석에 도움을 주기 위해 사용된다. CpG 섬은 메틸화에 대해 불응성이어서, 개방 염색질 배위를 유지하는 것을 도울 수 있다. 또한, 이는 전이 돌연변이에 대한 감소된 취약성, 그 결과로서 CpG 생존의 보다 높은 평형 밀도를 발생시킬 수 있다. 유전자의 프로모터 내의 CpG 부위의 메틸화는 다수의 인간 암에서 발견되는 특징인 침묵 (예를 들어, 종양 억제 유전자의 침묵)으로 이어질 수 있다. 대조적으로, CpG 부위의 저메틸화는 암 세포 내의 종양유전자의 과다발현과 연관된다.

본 발명의 한 측면은 샘플 종양 세포에서 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자의 저메틸화는 종양 세포 성장이 EGFR 억제제를 사용한 억제에 대해 감수성임을 나타내는 것인, EGFR 키나제 억제제에 의한 억제에 대한 종양 세포 성장의 감수성을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 ERBB2 유전자의 메틸화 상태가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 EGFR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 것으로 확인되는 것인, EFGR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자가 EGFR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있을 것으로 확인된 경우에 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제가 투여된다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 EGFR 억제제의 투여 전에 ERBB2 유전자의 저메틸화를 나타내는 암을 갖는 것으로 진단되었고, ERBB2 유전자의 저메틸화는 EGFR 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응성을 나타내는 것인, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 단계 및 ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 요법을 위해 EGFR 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 암 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제, 예를 들어 에를로티닙, 세툭시맙 또는 파니투무맙이 투여된다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포에서 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자 저메틸화는 세포에서 ERBB2의 과다발현을 나타내는 것인, 세포에서 ERBB2 유전자의 과다발현을 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 치료 유효량의 HER2 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 HER2 억제제의 투여 전에 ERBB2 유전자의 저메틸화를 나타내는 암을 갖는 것으로 진단되었고, ERBB2 유전자의 저메틸화는 HER2 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응성을 나타내는 것인, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 단계 및 ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 요법을 위해 HER2 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 암 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자에게 치료 유효량의 HER2 억제제, 예컨대 트라스투주맙 또는 T-DM1이 투여된다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, 메틸화 상태는 ERBB2 유전자의 부분에서 검출된다. 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 유전자의 부분은 예를 들어 인핸서 영역, 또는 인핸서 영역 및 프로모터 영역이다. 한 실시양태에서, 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 유전자의 부분은 서열 1의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 유전자의 부분은 서열 1의 핵산 서열로 이루어진다. 한 실시양태에서, 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 유전자의 부분은 6개 CpG 반복 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 유전자의 부분은 서열 2의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 유전자의 부분은 서열 2의 핵산 서열로 이루어진다.

방법의 특정 실시양태에서, ERBB2 유전자의 메틸화 상태는 ERBB2 유전자 또는 그의 부분이 약 50% 미만 또는 약 20% 미만으로 메틸화된 경우에 저메틸화 상태로 간주된다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, 메틸화 상태는 파이로시퀀싱에 의해 검출된다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, ERBB2 유전자는 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직 또는 신선 동결 조직으로부터의 것이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 ERBB2 유전자는 파이로시퀀싱 전에 예비증폭된다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, 종양 세포가 NSCLC 종양 세포이거나 또는 암이 NSCLC이다.

도 1은 28개의 CpG 메틸화 부위 (서열 1)를 함유하는 ERBB2 인핸서 영역의 핵산 서열 (서열 1)을 보여준다.
도 2는 NSCLC 수술에 의해 절제된 원발성 종양 및 매치된 정상 조직에서의 ERBB2 메틸화 상태의 파이로시퀀싱 분석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은 상피-유사 및 중간엽-유사 NSCLC 세포주에서의 ERBB2 메틸화 상태의 정량적 파이로시퀀싱 분석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4는 택맨(TaqMan) 기반 플루이다임(Fluidigm) 유전자 발현 분석을 이용하는 NSCLC 세포에서의 ERBB2 mRNA의 상대 발현을 보여주는 그래프이다.
도 5는 세포주에서 ERBB2 인핸서 CpG 부위의 메틸화 퍼센트를 도시하는 그래프이다. 세포주는 에를로티닙 치료에 대한 감수성에 의해 정렬된다.
도 6은 NSCLC 수술에 의해 절제된 원발성 종양 및 매치된 정상 조직 내의 6개의 개별 CpG 부위 각각에서의 메틸화 백분율을 보여주는 파이로시퀀싱 분석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 7은 높은 및 낮은 ERBB2-발현 종양 세포에서의 ERBB2 인핸서 영역의 메틸화 퍼센트를 도시하는 그래프이다.
도 8은 기록용 FFPE 슬라이드로부터 유래된 47개의 NSCLC 원발성 종양 샘플에서의 ERBB2의 메틸화 및 상피/중간엽 상태의 파이로시퀀싱 분석을 도시하는 그래프이다.

I. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 업계 용어, 표기 및 다른 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 그 의미를 명료하게 하고/하거나 용이하게 참조하기 위해 본원에 정의되고, 이러한 정의를 본원에 포함시키는 것이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되고 있는 것과 비교하여 실질적인 차이를 나타내는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 당업자에게 널리 이해되고, 종래의 방법, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y]에 기재된 널리 사용되는 분자 클로닝 방법을 이용하여 통상적으로 이용된다. 적절한 경우에, 상업적으로 입수가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 일반적으로 달리 나타내지 않는 한 제조업체가 규정한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행한다.

따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 용도를 기재하기 이전에, 본 발명은 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구축물 및 시약 그 자체로 제한되지 않으며, 이들이 또한 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태만을 기재하기 위한 목적을 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 이 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것으로 이해되어야 한다.

본원에 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 언급되지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다는 것을 주지해야 한다.

본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

동물에서 용어 "암"은 암-유발 세포, 예컨대 제어되지 않은 증식, 불멸성, 전이성 잠재력, 빠른 성장 및 증식률의 전형적인 세포 보유 특성 및 특정의 특징적인 형태적 특성의 존재를 지칭한다. 종종, 암 세포는 종양 형태일 수 있으나, 이러한 세포는 동물 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 또는 독립적 세포, 예컨대 백혈병성 세포로서 혈류에서 순환할 수 있다.

본원에 사용된, "비정상적 세포 성장"은 달리 나타내지 않는 한 정상 조절 메카니즘과는 별개의 세포 성장 (예를 들어, 접촉 억제의 상실)을 지칭한다. 이는, (1) 돌연변이된 티로신 키나제의 발현 또는 수용체 티로신 키나제의 과다발현에 의해 증식하는 종양 세포 (종양), (2) 이상 티로신 키나제 활성화가 발생하는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포, (4) 수용체 티로신 키나제에 의해 증식하는 임의의 종양, (5) 이상 세린/트레오닌 키나제 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양, 및 (6) 이상 세린/트레오닌 키나제 활성화가 발생하는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포의 비정상적 성장을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은 달리 나타내지 않는 한 환자에서 종양의 성장, 종양 전이 또는 다른 암-유발 또는 신생물성 세포를 부분적으로 또는 완전하게 전도시키거나, 완화시키거나, 그의 진행을 억제하거나 또는 방지하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "치료"는 달리 나타내지 않는 한 치료하는 작업을 지칭한다.

어구 "치료하는 방법" 또는 그의 등가물은 예를 들어 암에 적용되는 경우에 동물에서 암 세포의 수를 감소시키거나 제거하도록 또는 암의 증상을 완화시키도록 설계된 작업의 절차 또는 과정을 지칭한다.

암 또는 또 다른 증식성 장애를 "치료하는 방법"은 반드시 암 세포 또는 다른 장애가 실제로 제거되거나, 세포의 수 또는 장애가 실제로 감소되거나 또는 암 또는 다른 장애의 증상이 실제로 완화될 것임을 의미하지는 않는다.

용어 "치료 유효 작용제"는 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 조사되는 조직, 계통, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 조성물을 의미한다.

용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 조사되는 조직, 계통, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 대상 화합물 또는 조합물의 양을 의미한다.

용어 "ErbB1", "HER1", "표피 성장 인자 수용체" 및 "EGFR" 및 "EGFR 키나제"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 그의 자연 발생 돌연변이체 형태 (예를 들어, 문헌 [Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)]에서와 같은 결실 돌연변이체 EGFR)를 비롯하여, 예를 들어 문헌 [Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 개시된 바와 같은 EGFR을 지칭한다. erbB1은 EGFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "EGFR 키나제 억제제" 및 "EGFR 억제제"는 현재 당업계에 공지되어 있거나 앞으로 확인될 임의의 EGFR 키나제 억제제를 지칭하며, 환자에게 투여시에 다르게는 EGFR의 그의 천연 리간드에 대한 결합으로부터 발생하는 임의의 하류 생물학적 효과를 비롯하여 환자에서 EGF 수용체의 활성화와 연관된 생물학적 활성의 억제를 발생시키는 임의의 화학 물질을 포함한다. 이러한 EGFR 키나제 억제제는 환자에서 암을 치료하는 것과 관련된 EGFR 활성화 또는 EGFR 활성화의 임의의 하류 생물학적 효과를 차단할 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 이러한 억제제는 수용체의 세포내 도메인에 직접 결합하여 그의 키나제 활성을 억제함으로써 작용할 수 있다. 대안적으로, 이러한 억제제는 EGF 수용체의 리간드 결합 부위 또는 그의 일부를 점유함으로써 수용체를 그의 천연 리간드에 접근불가능하게 하여 그의 정상적인 생물학적 활성을 방해하거나 또는 감소시킴으로써 작용할 수 있다. 대안적으로, 이러한 억제제는 EGFR 폴리펩티드의 이량체화 또는 EGFR 폴리펩티드의 다른 단백질과의 상호작용을 조절함으로써 작용하거나 또는 EGFR의 유비퀴틴화 또는 새포내이입 분해를 증진시킬 수 있다. EGFR 키나제 억제제는 저분자량 억제제, 항체 또는 항체 단편, 안티센스 구축물, 소형 억제 RNA (즉, dsRNA에 의한 RNA 간섭; RNAi) 및 리보자임을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, EGFR 키나제 억제제는 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 소형 유기 분자 또는 항체이다.

EGF 수용체 기능의 억제제는 요법으로부터 가장 이익을 얻을 가능성이 있는 환자 하위세트를 설명하는 핵심 EGF 수용체 신호전달 경로의 임상적 유용성 및 정의가 중요한 연구 분야가 되었음을 보여준다. 수용체의 고유한 단백질 티로신 키나제 활성을 활성화시키고/거나 하류 신호전달을 증가시키는 돌연변이가 NSCLC 및 교모세포종에서 관찰된다. 시험관내 및 임상 연구는 EGF 수용체 억제에 대한 세포 반응에 있어서 wt EGF 수용체 세포주와 종양 사이의 상당한 가변성을 보여주었으며, 부분적으로는 포스파티딜 이노시톨 3-키나제 경로의 EGF 수용체 비의존성 활성로부터 유래되어, 항-아폽토시스성 세린-트레오닌 키나제 Akt의 연속적 인산화로 이어진다는 것을 보여주었다. PI3-키나제 활성의 대안적 경로에 대한 분자 결정자 및 결과적인 EGF 수용체 억제제 비감수성은 활발하게 연구되는 분야이다. PI3-키나제 경로를 강하게 활성화시키는, 예를 들어 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1 수용체)는 EGF 억제제에 대한 세포 내성과 관련된다. 또한 선택적 EGF 수용체 억제에 대한 비감수성을 매개하는데 있어 PI3-키나제 경로를 통해 생존 신호를 내보낼 수 있는 세포-세포 및 세포-부착 네트워크의 역할은 보다 명확하지 않으며, EGF 수용체 차단에 대한 세포 감수성에 영향을 미치는 것으로 간주될 것이다. 세포외 매트릭스에 대한 부착 또는 세포-세포 접촉의 부재 하에 성장 및 생존 신호를 유지하는 종양 세포의 능력은 세포 이동 및 전이와 관련하여 중요할 뿐만 아니라 세포외 매트릭스가 다시 모델링되고 세포 접촉 억제가 감소된 창상-유사 종양 환경에서 세포 증식 및 생존을 유지하는데 중요하다. 본 발명자들은 이전에 에를로티닙에 대한 NSCLC 세포주의 시험관내 감수성과 상관되는 EMT 유전자 발현 시그너처를 정의하였다 (문헌 [Yauch et al., 2005, Clin Cancer Res 11, 8686-8698]).

표현 "ErbB2" 및 "HER2"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 예를 들어 문헌 [Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) 및 Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986)]에 기재된 바와 같은 인간 HER2 단백질 (진뱅크(Genebank) 등록 번호 X03363)을 지칭한다. 용어 "erbB2"는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를 지칭하고, "neu"는 래트 p185neu를 코딩하는 유전자를 지칭한다.

"ErbB3" 및 "HER3"은 예를 들어 미국 특허 번호 5,183,884 및 5,480,968 뿐만 아니라 문헌 [Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]에 개시된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 용어 "ErbB4" 및 "HER4"는 예를 들어 유럽 특허 출원 번호 599,274; 문헌 [Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); 및 Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]에 개시된 것과 같은 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, WO99/19488 (1999년 4월 22일 공개)에 기재된 것과 같은 그의 이소형 포함)를 지칭한다.

"저메틸화"는 메틸화 가능 CpG 부위의 대부분이 비메틸화된 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 저메틸화는 ERBB2 유전자의 부분에서 메틸화 가능 부위의 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만이 메틸화된 것을 의미한다. 한 실시양태에서, EBB2 유전자의 부분은 ERBB2의 인핸서 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, EBB2 유전자의 부분은 28개의 CpG 메틸화 부위를 함유하는 서열 1의 ERBB2 인핸서 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 저메틸화는 예를 들어 비-종양 세포에서 정상 수준으로 발현되는 ERBB2 유전자에 비해 보다 적은 메틸화 가능 부위가 메틸화된 것을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 저메틸화는 ERBB2 유전자의 인핸서 영역의 CpG 부위 중 어느 것도 메틸화되지 않은 것을 의미한다.

II. 방법 및 조성물

본 발명은 부분적으로 ERBB2 유전자의 저메틸화가 ERBB2의 높은 발현 및 EGFR 키나제 억제제를 사용한 치료에 대한 암의 감수성과 상관된다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 종양의 샘플을 수득하고, 종양 샘플을 분석하여 ERBB2의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2의 메틸화 상태의 검출은 종양 세포 성장이 EGFR 억제제 치료에 의한 억제에 대해 감수성임을 나타내는 것인, 암 환자에서 EGFR 키나제 억제제에 의한 세포 성장 억제에 대한 종양의 감수성을 결정하는 방법을 제공한다.

따라서, 한 실시양태에서, 샘플 종양 세포에서 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자의 저메틸화는 종양 세포 성장이 EGFR 억제제를 사용한 억제에 대해 감수성임을 나타내는 것인, EGFR 키나제 억제제에 의한 억제에 대한 종양 세포 성장의 감수성을 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 암으로부터의 샘플, 예컨대 암성 종양으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 EGFR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 것으로 확인되는 것인, EFGR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 저메틸화 상태에 기초하여 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제가 투여된다.

또한, ERBB2 유전자의 부분에서 저메틸화를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자 서열의 분석된 부분의 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1% 미만의 메틸화는 환자가 치료로부터 보다 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타내는 것인, EGFR 억제제를 사용한 요법으로부터 보다 이익을 얻을 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법이 본원에 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 암으로부터 채취한 샘플, 예컨대 암성 종양의 샘플에서의 ERBB2 유전자의 메틸화 상태에 기초하여 암 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 요법을 선택하는 방법은 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 단계 및 ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우 (메틸화 상태가 저메틸화 상태인 것으로 간주됨)에 요법을 위해 EGFR 억제제를 선택하는 단계를 포함한다. 이어서, 이러한 선택 방법에 기초하여 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제가 투여된다. 일부 실시양태에서, EFGR 억제제는 에를로티닙, 세툭시맙 또는 파니투무맙이다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자가 ERBB2 저메틸화를 특징으로 하는 암을 앓고 있는 경우에 EGFR 억제제를 사용하여 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포, 예컨대 암 세포에서 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로의 결정은 세포에서의 ERBB2의 과다발현을 나타내는 것인, ERBB2 유전자가 상기 세포에서 과다발현되는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

ERBB2 유전자의 과다발현은 이전에 HER2 억제제, 예컨대 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)®, 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)) 및 T-DM1에 대한 반응과 상관되었다. 예를 들어, WO99/31140, US2003/0170234, WO01/89566을 참조한다. 이에 따라, 본 발명의 또 다른 측면은 환자가 ERBB2 저메틸화를 특징으로 하는 암을 특징으로 하는 암을 앓고 있는 경우에 환자를 HER2 억제제를 사용하여 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, ERBB2 유전자의 부분에서 저메틸화를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 서열의 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1% 미만의 메틸화는 개체가 치료로부터 보다 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타내는 것인, HER2 억제제를 포함하는 요법으로부터 보다 이익을 얻을 가능성이 있는 개체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 환자에게 치료 유효량의 HER2 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 HER2 억제제의 투여 전에 ERBB2 저메틸화를 특징으로 하는 암을 갖는 것으로 진단되었고, ERBB2 저메틸화는 HER2 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응성을 나타내는 것인, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, HER2 억제제는 소분자 또는 항체이다. 한 실시양태에서, HER2 억제제는 항체, 예컨대 트라스투주맙 또는 T-DM1이다.

본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 단계 및 ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 요법을 위해 HER2 억제제를 선택하는 단계를 포함하는, 암 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다.

ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 상기 방법의 일부 실시양태에서, 메틸화 상태에 대해 분석된 ERBB2 유전자의 부분은 인핸서 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, ERBB2 유전자의 부분은 인핸서 영역 및 프로모터 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, ERBB2 유전자의 부분은 chr17:37,861,100-37,863,650 (NCBI 구축물 37/hg19)의 염색체 위치에 있거나 그를 포함하는 유전자의 부분이다. 일부 실시양태에서, ERBB2 유전자의 부분은 서열 1에 의해 나타내어진 서열이다. 일부 실시양태에서, ERBB2 유전자의 부분은 서열 1의 6개 CpG 반복 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, ERBB2 유전자의 부분은 서열 2의 6개 CpG 반복 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, ERBB2 유전자의 부분은 정량적 메틸화 특이적 PCR 전에 예비증폭된다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, ERBB2 유전자 또는 유전자의 특정 부분의 메틸화 상태는 ERBB2 유전자 서열의 분석된 부분의 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1% 미만의 메틸화가 검출된 경우에 저메틸화된 것으로 간주된다.

샘플 중 다양한 바이오마커의 존재 및/또는 수준/양은 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 ("FACS"), 매스어레이, 단백질체학, 정량적 혈액 기반 검정 (예를 들어, 혈청 ELISA), 생화학적 효소적 활성 검정, 계내 혼성화, 서던 분석, 노던 분석, 전체 게놈 서열분석, 폴리메라아제 연쇄 반응 ("PCR") (정량적 실시간 PCR ("qRT-PCR") 포함) 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등), RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링 및/또는 유전자 발현의 일련의 분석 ("SAGE") 뿐만 아니라 단백질, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 임의의 다양한 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있으며, 이들 중 다수는 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 이해된다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 멀티플렉스화 면역검정, 예컨대 룰즈 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) ("MSD")로부터 입수가능한 것이 사용될 수 있다.

DNA 메틸화의 평가 방법이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Laird (2010) Nature Reviews Genetics 11:191-203]은 DNA 메틸화 분석의 개관을 제공한다. 일부 실시양태에서, 메틸화를 평가하는 방법은 게놈 DNA를 무작위적으로 전단시키거나 무작위적으로 단편화하는 것, DNA를 메틸화-의존성 또는 메틸화-감수성 제한 효소로 절단하는 것 및 이후에 절단된 또는 절단되지 않은 DNA를 선택적으로 확인하고/거나 분석하는 것을 포함한다. 선택적 확인은 예를 들어 절단된 및 절단되지 않은 DNA를 (예를 들어, 크기에 의해) 분리하는 것 및 절단된 또는 대안적으로 절단되지 않은 관심 서열을 정량화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,186,512를 참조한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제한 효소 소화 후에 무손상 DNA를 증폭시키는 것, 이에 의해 증폭된 구역에서 제한 효소에 의해 절단되지 않은 DNA만을 증폭시키는 것을 포괄할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 10/971,986; 11/071,013; 및 10/971,339를 참조한다. 일부 실시양태에서, 증폭은 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 어댑터가 무작위적으로 단편화된 DNA의 말단에 첨가될 수 있고, DNA가 메틸화-의존성 또는 메틸화-감수성 제한 효소로 소화될 수 있고, 무손상 DNA가 어댑터 서열에 혼성화하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 단계는 DNA의 증폭된 풀에서 특정한 유전자의 존재, 부재 또는 양을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA는 실시간, 정량적 PCR을 이용하여 증폭된다.

일부 실시양태에서, 방법은 게놈 DNA의 집단 내의 표적 서열의 평균 메틸화 밀도를 정량화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 게놈 DNA를 메틸화-의존성 제한 효소 또는 메틸화-감수성 제한 효소와 로커스 내의 잠재적 제한 효소 절단 부위의 적어도 일부 카피가 절단되지 않고 남아있도록 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것; 로커스의 무손상 카피를 정량화하는 것; 및 증폭된 산물의 양을 대조군 DNA의 메틸화의 양을 나타내는 대조 값과 비교하여, 대조군 DNA의 메틸화 밀도에 비해 로커스 내의 평균 메틸화 밀도를 정량화하는 것을 포함한다.

DNA 로커스의 메틸화의 양은 로커스를 포함하는 게놈 DNA의 샘플을 제공하고, DNA를 메틸화-감수성 또는 메틸화-의존성인 제한 효소로 절단한 후에, 무손상 DNA의 양을 정량화하거나 또는 관심 DNA 로커스에서 절단된 DNA의 양을 정량화함으로써 결정될 수 있다. 무손상 또는 절단된 DNA의 양은 로커스를 함유하는 게놈 DNA의 초기 양, 로커스 내의 메틸화의 양, 및 게놈 DNA에서 메틸화된 로커스 내의 뉴클레오티드의 수 (즉, 분획)에 따라 달라질 것이다. DNA 로커스 내의 메틸화의 양은 무손상 DNA 또는 절단된 DNA의 양을 유사하게-처리된 DNA 샘플 내의 무손상 DNA 또는 절단된 DNA의 양을 나타내는 대조 값과 비교함으로써 결정될 수 있다. 대조 값은 메틸화된 뉴클레오티드의 알려지거나 예측된 수를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 대조 값은 또 다른 (예를 들어, 정상, 비-이환) 세포 내의 동일한 로커스 또는 제2 로커스로부터의 무손상 또는 절단된 DNA의 양을 나타낼 수 있다.

로커스의 평균 메틸화 밀도는 메틸화-감수성 또는 메틸화-의존성 제한 효소를 로커스 내의 잠재적 제한 효소 절단 부위의 적어도 일부 카피가 절단되지 않고 남아있도록 허용하는 조건 하에 사용하고, 이후에 남은 무손상 카피를 정량화하고 양을 대조군과 비교함으로써 결정될 수 있다. 메틸화-감수성 제한 효소를 DNA 로커스의 카피와 로커스 내의 잠재적 제한 효소 절단 부위의 적어도 일부 카피가 절단되지 않고 남아있도록 허용하는 조건 하에 접촉시키는 경우에, 남은 무손상 DNA는 메틸화 밀도에 정비례할 것이며, 이에 따라 대조군과 비교하여 샘플 내의 로커스의 상대 메틸화 밀도가 결정될 수 있다. 유사하게, 메틸화-의존성 제한 효소를 DNA 로커스의 카피와 로커스 내의 잠재적 제한 효소 절단 부위의 적어도 일부 카피가 절단되지 않고 남아있도록 허용하는 조건 하에 접촉시키는 경우에, 남은 무손상 DNA는 메틸화 밀도에 반비례할 것이며, 이에 따라 대조군과 비교하여 샘플 내의 로커스의 상대 메틸화 밀도가 결정될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 미국 특허 출원 일련 번호 10/971,986에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 정량적 증폭 방법 (예를 들어, 정량적 PCR 또는 정량적 선형 증폭)을 이용하여 제한 소화 후에 증폭 프라이머에 의해 플랭킹된 로커스 내의 무손상 DNA의 양을 정량화할 수 있다. 정량적 증폭 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 6,180,349; 6,033,854; 및 5,972,602 뿐만 아니라 예를 들어 문헌 [Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves et al., Biotechniques 34(1):106-10, 112-5 (2003); Deiman B et al., Mol Biotechnol. 20(2):163-79 (2002)]에 개시되어 있다.

DNA 메틸화를 검출하기 위한 추가의 방법은 DNA의 비술파이트로의 처리 전에 및 그 후에 게놈 서열분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831 (1992)]을 참조한다. 소듐 비술파이트가 DNA에 접촉한 경우에, 비메틸화 시토신은 우라실로 전환되는 반면, 메틸화 시토신은 변형되지 않는다.

일부 실시양태에서, 비술파이트-전환된 DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 제한 효소 소화가 DNA 메틸화를 검출하는데 이용된다. 예를 들어, 문헌 [Sadri & Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997)]을 참조한다.

일부 실시양태에서, 메티라이트(MethyLight) 검정은 단독으로 또는 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다른 방법과 조합하여 이용된다 (문헌 [Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306 (1999)] 참조). 간략하게, 메티라이트 과정에서 게놈 DNA는 소듐 비술파이트 반응에서 전환된다 (비술파이트 과정은 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시킴). 이어서, 관심 DNA 서열의 증폭을 CpG 디뉴클레오티드에 혼성화하는 PCR 프라이머를 사용하여 수행한다. 오직 비메틸화 DNA의 비술파이트 전환으로부터 발생한 서열 (또는 대안적으로 전환되지 않은 메틸화 서열)에 혼성화하는 프라이머를 사용함으로써 증폭이 프라이머가 혼성화하는 서열의 메틸화 상태를 나타낼 수 있다. 유사하게, 증폭 산물은 비메틸화 (또는 메틸화) DNA의 비술파이트 처리로부터 발생한 서열에 특이적으로 결합하는 프로브로 검출될 수 있다. 원하는 경우에, 프라이머 및 프로브가 둘 다 메틸화 상태를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 메티라이트와 사용하기 위한 키트는 소듐 비술파이트 뿐만 아니라 비술파이트로 처리된 메틸화 및 비메틸화 DNA 사이를 구별하는 프라이머 또는 검출가능하게-표지된 프로브 (택맨 또는 분자 비콘 프로브를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다. 다른 키트 성분은 예를 들어 PCR 완충제, 데옥시뉴클레오티드; 및 열안정성 폴리머라제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, DNA의 증폭에 필요한 시약을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, Ms-SNuPE (메틸화-감수성 단일 뉴클레오티드 프라이머 신장) 반응은 단독으로 또는 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다른 방법과 조합하여 사용된다 (문헌 [Gonzalgo & Jones Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)] 참조). Ms-SNuPE 기술은 DNA의 비술파이트 처리에 이어서 단일-뉴클레오티드 프라이머 신장에 기초하여 특이적 CpG 부위에서의 메틸화 차이를 평가하는 정량적 방법이다. 간략하게, 게놈 DNA는 소듐 비술파이트와 반응하여 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키는 반면 5-메틸시토신은 변하지 않고 남아있다. 이어서, 원하는 표적 서열의 증폭을 비술파이트-전환된 DNA에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 수행하고, 생성된 산물을 단리하여 관심 CpG 부위(들)에서의 메틸화 분석을 위한 주형으로 사용한다.

일부 실시양태에서, 메틸화-특이적 PCR ("MSP") 반응은 단독으로 또는 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다른 방법과 조합하여 이용된다. MSP 검정은 모든 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키나 메틸화 시토신은 전환시키지 않는 소듐 비술파이트에 의한 DNA의 초기 변형, 및 메틸화 대 비메틸화 DNA에 특이적인 프라이머를 사용하는 이후의 증폭을 수반한다. 문헌 [Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, (1996)]; 미국 특허 번호 5,786,146을 참조한다. 일부 실시양태에서, DNA 메틸화는 QIAGEN 파이로마크(PyroMark) CpG 검정 예비설계된 파이로시퀀싱 DNA 메틸화 검정에 의해 검출된다.

일부 실시양태에서, 세포 메틸화 상태가 고처리량 DNA 메틸화 분석을 이용하여 결정되어 EGFR 억제제에 대한 감수성을 결정한다. 간략하게, 게놈 DNA는 당업계의 표준 검정을 이용하여 세포 또는 조직 샘플 (예를 들어, 종양 샘플 또는 혈액 샘플)로부터 단리하고, 소듐 비술파이트 반응에서 전환시킨다 (비술파이트 과정은 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시킴). 비술파이트 전환된 DNA 산물은 당업계의 표준 검정을 이용하여 증폭시키고, 단편화하고, 게놈으로부터 CpG 부위를 함유하는 어레이에 혼성화시킨다. 혼성화 후에, 당업계의 표준 검정을 이용하여 어레이를 영상화하고, DNA 메틸화 상태의 분석을 위해 처리한다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 신선 동결 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 백금 Taq를 사용하는 인비트로젠(Invitrogen) 슈퍼스크립트(Superscript) III 원-스텝 RT-PCR 시스템을 이용하여 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 택맨 기반 검정을 이용하여 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 소듐 비술파이트 반응은 자이모(Zymo) EZ DNA 메틸화 키트를 사용하여 수행한다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA를 증폭시키고, 일루미나 인피늄 휴먼메틸레이션450 비드칩 키트(Illumina Infinium HumanMethylation450 Beadchip Kit)를 사용하여 어레이에 혼성화시킨다. 일부 실시양태에서, 어레이는 일루미나 아이스캔(iScan) 판독기 상에서 영상화된다. 일부 실시양태에서, 영상은 게놈스튜디오(GenomeStudio) 소프트웨어 메틸화 모듈로 처리된다. 일부 실시양태에서, 메틸화 데이터는 바이오컨덕터(Bioconductor) 루미 소프트웨어 패키지를 이용하여 분석된다. 문헌 [Du et al., Bioinformatics, 24(13):1547-1548 (2008)]을 참조한다.

일부 실시양태에서, ERBB2 DNA 메틸화 부위는 비술파이트 서열분석 PCR (BSP)을 이용하여 확인되어 EGFR 억제제에 대한 감수성을 결정한다. 간략하게, 당업계의 표준 검정을 이용하여 게놈 DNA를 세포 또는 조직 샘플 (예를 들어, 종양 샘플 또는 혈액 샘플)로부터 단리하고, 소듐 비술파이트 반응에서 전환시킨다 (비술파이트 과정은 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시킴). 비술파이트 전환된 DNA 산물을 당업계의 표준 검정을 이용하여 비술파이트 전환된 DNA에 특이적이도록 설계된 프라이머 (예를 들어, 비술파이트-특이적 프라이머)를 이용하여 증폭시키고, 숙주 세포로의 형질전환을 위한 벡터에 라이게이션시킨다. 메틸화 부위는 PCR 증폭된 비술파이트 전환된 관심 DNA 산물을 함유하는 숙주 세포를 선택한 후에, DNA 산물을 단리하고 당업계의 표준 검정을 이용하여 서열분석함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 IHC 분석; 예를 들어 ERBB2 발현에 대한 분석을 위해 처리된 FFPE 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 IHC에 의해 ERBB2 발현을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는 FFPE 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 신선 동결 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 백금 Taq를 사용하는 인비트로젠 슈퍼스크립트 III 원-스텝 RT-PCR 시스템을 이용하여 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 택맨 기반 검정을 이용하여 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 소듐 비술파이트 반응은 자이모 EZ DNA 메틸화-금 키트를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA에 특이적이도록 설계된 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 메틸 프라이머 발현 소프트웨어를 이용하여 설계된다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA 산물은 백금 Taq를 사용하는 인비트로젠 슈퍼스크립트 III 원-스텝 RT-PCR 시스템을 이용하여 PCR 증폭된다. 추가 실시양태에서, PCR 증폭된 비술파이트 전환된 DNA 산물은 인비트로젠 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 벡터에 라이게이션된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 단리된 PCR 증폭된 비술파이트 전환된 관심 DNA 산물은 어플라이드 바이오시스템즈 3730x1 DNA 분석기를 이용하여 서열분석한다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA에 특이적이도록 설계된 프라이머는 퀴아젠(Qiagen) 파이로마크 검정 설계 소프트웨어를 이용하여 설계된다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA 산물은 백금 Taq를 사용하는 인비트로젠 슈퍼스크립트 III 원-스텝 RT-PCR 시스템을 이용하여 PCR 증폭된다. 추가 실시양태에서, PCR 증폭된 비술파이트 전환된 DNA 산물은 퀴아젠 파이로마크 Q24를 이용하여 서열분석하고, 퀴아젠 파이로마커 소프트웨어로 분석한다.

일부 실시양태에서, ERBB2 DNA 메틸화 부위가 정량적 메틸화 특이적 PCR (QMSP)을 이용하여 결정되어 EGFR 또는 HER2 억제제에 대한 감수성을 결정한다. 간략하게, 게놈 DNA는 세포 또는 조직 샘플로부터 단리되고, 당업계의 표준 검정을 이용하여 소듐 비술파이트 반응에서 전환된다 (비술파이트 과정은 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시킴). 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 IHC 분석; 예를 들어 ERBB2 발현에 대한 분석을 위해 처리된 FFPE 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 IHC에 의해 ERBB2 발현을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는 FFPE 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 신선 동결 조직이다. 비술파이트 전환된 DNA 산물은 비술파이트 전환된 DNA에 특이적으로 설계된 프라이머 (예를 들어, 정량적 메틸화 특이적 PCR 프라이머)를 사용하여 증폭된다. 비술파이트 전환된 DNA 산물은 정량적 메틸화 특이적 PCR 프라이머로 증폭되고, 당업계의 표준 검정을 이용하여 메틸화를 위해 분석된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 신선 동결 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 백금 Taq를 사용하는 인비트로젠 슈퍼스크립트 III 원-스텝 RT-PCR 시스템을 이용하여 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플로부터 단리된 DNA는 택맨 기반 검정을 이용하여 비술파이트 전환 전에 예비증폭된다. 일부 실시양태에서, 소듐 비술파이트 반응은 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 소듐 비술파이트 반응은 자이모 EZ DNA 메틸화-금 키트를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA에 특이적이도록 설계된 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈 메틸 프라이머 발현 소프트웨어를 이용하여 설계된다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA는 택맨 기반 검정을 이용하여 증폭된다. 일부 실시양태에서, 비술파이트 전환된 DNA는 어플라이드 바이오시스템즈 7900HT 상에서 증폭되고, 어플라이드 바이오시스템즈 SDS 소프트웨어를 사용하여 분석한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 1) 종양 샘플의 IHC 분석에 이어서 2) 단계 1의 IHC 분석에 사용된 종양 조직으로부터 추출된 DNA의 정량적 메틸화 특이적 PCR에 의해 ERBB2 메틸화를 결정하는 방법을 제공한다. 간략하게, IHC 슬라이드로부터의 커버슬립을 2가지 방법 중 하나에 의해 제거한다: 슬라이드를 적어도 15분 동안 동결기에 넣은 후에 현미경 슬라이드의 커버슬립을 면도날을 사용하여 들어올린다. 이어서, 슬라이드를 크실렌 중에 실온에서 인큐베이션하여 마운팅 배지를 용해시킨다. 대안적으로, 슬라이드를 커버슬립이 떨어질 때까지 크실렌 중이 담근다. 이는 수일까지 소요될 수 있다. 모든 슬라이드는 5분 크실렌 (x3) 및 5분 100% 에탄올 (x2)의 탈파라핀화 절차를 통해 수득한다. 조직을 슬라이드에서 면도날로 긁어내고, 프로테이나제 K를 함유하는 조직 용해 완충제에 넣고, 56℃에서 밤새 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에 조직이 여전히 존재하는 경우에, 추가의 10 μl 프로테이나제 K가 첨가될 수 있고, 조직은 또 다른 30분 동안 인큐베이션한다. DNA 추출은 예를 들어 QIAamp DNA FFPE 조직 키트를 이용하여 계속된다. IHC 슬라이드로부터 직접 추출된 DNA는 상기 기재된 바와 같은 QMSP3 프라이머 및 프로브를 사용하는 QMSP 분석에 적용된다.

일부 실시양태에서, 비술파이트-전환된 DNA는 딥 서열분석에 의해 서열분석된다. 딥 서열분석은 서열이 다수회의 판독물인 과정, 예컨대 직접 파이로시퀀싱이다. 딥 서열분석은 희귀 사건, 예컨대 희귀 돌연변이를 검출하는데 이용될 수 있다. 제한된 수의 로커스의 울트라-딥 서열분석은 PCR 산물의 직접 파이로시퀀싱 및 단일 시행의 100개 초과의 PCR 산물의 서열분석에 의해 달성될 수 있다. 서열분석 비술파이트-전환된 DNA에서의 도전은 시토신 잔기의 티민 (우라실) 잔기로의 비술파이트 전환 후에 낮은 서열 복잡성이 발생한다는 것이다. 감소된 대표 비술파이트 서열분석 (RRBS)을 도입하여 DNA 단편의 크기-분획화에 의해 서열분석을 위한 게놈의 일부 영역만을 선택함으로써 서열 중복을 감소시킬 수 있다 (문헌 [Laird, PW Nature Reviews 11:195-203 (2010)]). 표적화는 서열분석 전에 어레이 포획 또는 패드록(padlock) 포획에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 고정된 어레이 상의 또는 용액 하이브리드 선택에 의한 표적화된 포획은 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 라이브러리에 의해 표적화된 서열을 풍부하게 할 수 있으며, 비술파이트 전환 전에 또는 그 후에 수행될 수 있다. 대안적으로, 패드록 포획은 2개의 테터링 프로브의 증가된 어닐링 특성을 조합함으로써 개선된 풍부화 효율을 제공하고, 이후에 범용 프라이머로의 증폭을 제공하여 로커스-특이적 프라이머를 사용한 증폭보다 더 균질한 재현을 허용한다.

추가의 메틸화 검출 방법은 메틸화 CpG 섬 증폭 (문헌 [Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12 (1999)] 참조) 및 예를 들어 미국 특허 공개 2005/0069879; 문헌 [Rein et al., Nucleic Acids Res. 26 (10): 2255-64 (1998); Olek et al., Nat Genet. 17(3): 275-6 (1997); Laird, PW Nature Reviews 11:195-203 (2010)]; 및 PCT 공개 번호 WO 00/70090에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 세포에서 ERBB2의 발현은 세포에서 ERBB2 mRNA를 평가함으로써 결정된다. 세포에서 mRNA의 평가 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대, 하나 이상의 유전자에 특이적인 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대, 하나 이상의 유전자에 특이적인 상보적 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 샘플에서 ERBB2의 발현은 참조 샘플과 비교된다. 예를 들어, 시험 샘플은 종양 조직 샘플일 수 있고, 참조 샘플은 정상 조직 또는 세포, 예컨대 PBMC로부터의 것일 수 있다.

포유동물로부터의 샘플은 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 mRNA에 대해 편리하게 검정될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플에서 표적 mRNA의 수준의 결정 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교 대조 mRNA 서열 수준을 동시에 조사함으로써 결정됨)을 허용하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 표적 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.

본 발명의 임의적인 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플 중의 mRNA, 예컨대 표적 mRNA를 검사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 어레이는 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 그의 발현이 항혈관신생 요법의 증가된 또는 감소된 임상적 이익과 상관되는 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 특정한 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다.

일부 실시양태에 따르면, 존재 및/또는 수준/양은 상기 언급된 유전자의 단백질 발현 수준을 관찰함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바이오마커의 결합을 허용하는 조건 하에 상기 바이오마커에 대한 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것, 및 항체와 바이오마커 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.

특정 실시양태에서, 샘플 내의 바이오마커 단백질의 존재 및/또는 수준/양은 IHC 및 염색 프로토콜을 이용하여 조사된다. 조직 절편의 IHC 염색은 샘플 내의 단백질의 존재를 결정 또는 검출하는 신뢰가능한 방법인 것으로 밝혀졌다. 한 측면에서, 바이오마커의 수준은 (a) 항체를 사용하여 샘플 (예컨대 대상체 암 샘플)의 IHC 분석을 수행하는 것; 및 (b) 샘플에서 바이오마커의 발현을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, IHC 염색 강도는 참조 값에 대해 결정된다.

IHC는 형태 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 부가적 기술과 함께 수행할 수 있다. 2가지 일반적 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정이 이용가능하다. 첫번째 검정에 따르면, 표적 항원에 대한 항체의 결합은 직접 결정된다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 시각화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후에, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우에, 발색 또는 형광 기질을 첨가하여 항원의 시각화를 제공한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.

IHC에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다: (a) 방사성동위원소, 예컨대 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I; (b) 콜로이드성 금 입자; (c) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 입수가능한 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7)과 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 유도체를 포함하는 이에 제한되지는 않는 형광 표지; (d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부의 검토를 제공한다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시타제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다.

효소-기질 조합물의 예는 예를 들어 기질로서 수소 퍼옥시다제와의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO); 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와의 알칼리성 포스파타제 (AP); 및 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)과의 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)를 포함한다. 이들의 일반적 검토를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.

이에 따라 제조된 시료를 탑재하고 이에 커버슬립을 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에 통상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 1+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 특정 실시양태에서, IHC 검정에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 다른 실시양태에서, 약 3 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 한 실시양태에서, 종양 또는 결장 선종으로부터의 세포 및/또는 조직을 IHC를 사용하여 검사하는 경우, 염색은 일반적으로 (샘플 중에 존재할 수 있는 기질 또는 주위 조직에 반대되는 것으로서) 종양 세포 및/또는 조직에서 측정 또는 평가되는 것으로 이해된다.

대안적 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체의 형성에 충분한 조건 하에 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 다수의 방법, 예를 들어 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차에 의해 검출될 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁적 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 다 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.

조직 또는 세포 샘플 중 선택된 바이오마커의 존재 및/또는 수준/양은 또한 기능 또는 활성-기반 검정에 의해 조사될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소인 경우에, 당업계에 공지된 검정을 수행함으로써 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다.

특정 실시양태에서, 샘플은 검정된 바이오마커의 양의 차이 및 사용된 샘플의 품질의 가변성 둘 다, 및 검정 수행 사이의 가변성에 대해 정규화된다. 이러한 정규화는 ACTB와 같은 널리 공지된 하우스키핑 유전자를 비롯한 특정의 일정한 정규화 바이오마커의 수준의 검출 및 혼입에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 정규화는 검정된 유전자 또는 그의 큰 하위세트 모두의 평균 또는 중간 신호에 기초할 수 있다 (전반적 정규화 접근법). 유전자마다, 대상체 종양 mRNA 또는 단백질의 측정된 정규화 양을 참조 세트에서 발견된 양과 비교한다. 한 대상체에서 시험된 종양당 각 mRNA 또는 단백질에 대해 정규화된 발현 수준은 참조 세트에서 측정된 발현 수준의 백분율로서 표현될 수 있다. 분석할 특정한 대상체 샘플에서 측정된 존재 및/또는 발현 수준/양은 이러한 범위 내의 일부 백분위수에 포함될 것이며, 이는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

특정 실시양태에서, 유전자의 상대 발현 수준은 다음과 같이 결정된다:

상대 발현 유전자1 샘플1 = 2 exp (Ct 하우스키핑 유전자 - Ct 유전자1) (Ct는 샘플에서 결정됨).

상대 발현 유전자1 참조 RNA = 2 exp (Ct 하우스키핑 유전자 - Ct 유전자1) (Ct는 참조 샘플에서 결정됨).

정규화된 상대 발현 유전자1 샘플1 = (상대 발현 유전자1 샘플1 / 상대 발현 유전자1 참조 RNA) x 100.

Ct는 임계값 사이클이다. Ct는 반응 내에서 생성된 형광이 임계값 선을 넘는 사이클 수이다.

모든 실험은 다양한 조직 공급원 (예를 들어, 클론테크(Clontech) (캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터의 참조 RNA #636538)으로부터 RNA의 포괄적 혼합물인 참조 RNA에 대해 정규화된다. 동일한 참조 RNA를 각각의 qRT-PCR 실행에 포함시켜서 상이한 실험 실행 사이의 결과의 비교를 허용한다.

한 실시양태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 진단 검정에 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 그렇게 여겨지는 조직 또는 유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 바늘 흡인, 기관지 찰과술에 의해, 또는 객담, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 순환 종양 세포; 예를 혈액, 소변 또는 객담 내의 순환 암 세포를 포함한다. 유전자 또는 유전자 산물은 암 또는 종양 조직으로부터, 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 소변, 객담, 혈청 또는 혈장으로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 산물의 검출에 대해 상기 논의된 것과 동일한 기술이 다른 신체 샘플에도 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 벗겨져서 이러한 신체 샘플 중에 나타날 수 있다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써 이들 암에 관한 간단한 조기 진단을 달성할 수 있다. 또한, 요법의 진행은 이러한 신체 샘플을 표적 유전자 또는 유전자 산물에 대해 시험함으로써 보다 용이하게 모니터링될 수 있다.

특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 단일 샘플 또는 시험 샘플이 수득되는 때보다 하나 이상의 다른 시점에 수득된 동일한 대상체 또는 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 예를 들어, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 시험 샘플이 수득된 때보다 이른 시점에 동일한 대상체 또는 개체로부터 수득된다. 이러한 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 참조 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고 시험 샘플이 암이 전이성이 되었을 때 이후에 수득되는 경우에 유용해질 수 있다.

특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 하나 이상의 건강한 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 정상 조직으로부터 모은 RNA 샘플 또는 대상체 또는 개체가 아닌 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 종양 조직으로부터 모은 RNA 샘플 또는 대상체 또는 개체가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플이다.

본 발명의 방법에서, 조직 샘플은 혈액, 소변, 타액, 대변, 흉막액, 림프액, 객담, 복수, 전립선액, 뇌척수액 (CSF) 또는 임의의 다른 신체 분비물 또는 그의 유도체와 같은 체액 또는 배출물일 수 있다. 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈액의 임의의 유도체를 포함하도록 의도된다. 이러한 체액 또는 배출물 중 종양 상피 또는 중간엽 바이오마커의 평가는 침습적 샘플링 방법이 부적절하거나 불편한 상황에서 때때로 바람직할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 종양 세포는 폐암 종양 세포 (예를 들어, 비소세포 폐암 (NSCLC)), 췌장암 종양 세포, 유방암 종양 세포, 두경부암 종양 세포, 위암 종양 세포, 결장암 종양 세포, 난소암 종양 세포, 또는 하기 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다양한 다른 암으로부터의 종양 세포일 수 있다. 종양 세포는 바람직하게는 고형 종양으로부터의 모든 종양 세포가 그러한 바와 같이, EGFR을 발현하는 것으로 알려지거나 또는 예상되는 유형의 것이다. EGFR 키나제는 야생형 또는 돌연변이체 형태일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 종양은 폐암 종양 (예를 들어, 비소세포 폐암 (NSCLC)), 췌장암 종양, 유방암 종양, 두경부암 종양, 위암 종양, 결장암 종양, 난소암 종양, 또는 하기 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다양한 다른 암으로부터의 종양일 수 있다. 종양은 바람직하게는 모든 고형 종양이 그러한 바와 같이, 그의 세포가 EGFR을 발현하는 것으로 알려지거나 또는 예상되는 유형의 것이다. EGFR은 야생형 또는 돌연변이체 형태일 수 있다.

억제제 및 제약 조성물

본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 EGFR 키나제 억제제는, 예를 들어 퀴나졸린 EGFR 키나제 억제제, 피리도-피리미딘 EGFR 키나제 억제제, 피리미도-피리미딘 EGFR 키나제 억제제, 피롤로-피리미딘 EGFR 키나제 억제제, 피라졸로-피리미딘 EGFR 키나제 억제제, 페닐아미노-피리미딘 EGFR 키나제 억제제, 옥스인돌 EGFR 키나제 억제제, 인돌로카르바졸 EGFR 키나제 억제제, 프탈라진 EGFR 키나제 억제제, 이소플라본 EGFR 키나제 억제제, 퀴날론 EGFR 키나제 억제제 및 티르포스틴 EGFR 키나제 억제제, 예컨대 하기 특허 공개에 기재된 것, 및 EGFR 키나제 억제제의 모든 제약상 허용되는 염 및 용매화물을 포함한다: 국제 특허 공개 번호 WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701 및 WO 92/20642; 유럽 특허 출원 번호 EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063 및 EP 682027; 미국 특허 번호 5,747,498, 5,789,427, 5,650,415 및 5,656,643; 및 독일 특허 출원 번호 DE 19629652. 저분자량 EGFR 키나제 억제제의 추가의 비제한적 예는 문헌 [Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12):1599-1625]에 기재된 임의의 EGFR 키나제 억제제를 포함한다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 저분자량 EGFR 키나제 억제제의 구체적인 바람직한 예는 [6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐) 아민 (또한 OSI-774, 에를로티닙, 또는 타르세바™ (에를로티닙 HCl)로 공지됨; OSI 파마슈티칼스(OSI Pharmaceuticals)/제넨테크/로슈(Roche)) (미국 특허 번호 5,747,498; 국제 특허 공개 번호 WO 01/34574, 및 문헌 [Moyer, J.D. et al. (1997) Cancer Res. 57:4838-4848]); CI-1033 (이전에 PD183805로 공지됨; 화이자(Pfizer)) (문헌 [Sherwood et al., 1999, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 40:723]); PD-158780 (화이자); AG-1478 (캘리포니아 대학); CGP-59326 (노파르티스(Novartis)); PKI-166 (노파르티스); EKB-569 (와이어쓰(Wyeth)); GW-2016 (또한, GW-572016 또는 라파티닙 디토실레이트로 공지됨; GSK); 및 게피티닙 (또한, ZD1839 또는 이레사™로 공지됨; 아스트라제네카(Astrazeneca)) (문헌 [Woodburn et al., 1997, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633])을 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 특히 바람직한 저분자량 EGFR 키나제 억제제는 [6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린-4-일]-(3-에티닐페닐) 아민 (즉, 에를로티닙), 그의 히드로클로라이드 염 (즉, 에를로티닙 HCl, 타르세바™) 또는 다른 염 형태 (예를 들어, 에를로티닙 메실레이트)이다.

항체-기재 EGFR 키나제 억제제는 EGFR 활성화를 그의 천연 리간드에 의해 부분적으로 또는 완전히 차단할 수 있는 임의의 항-EGFR 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체-기재 EGFR 키나제 억제제의 비제한적 예는 문헌 [Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cancer 67:247-253; Teramoto, T., et al., 1996, Cancer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M., et al., 1999, Cancer Res. 15:59(8):1935-40; 및 Yang, X., et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243]에 기재된 것을 포함한다. 따라서, EGFR 키나제 억제제는 모노클로날 항체 Mab E7.6.3 (문헌 [Yang, X.D. et al. (1999) Cancer Res. 59:1236-43]) 또는 Mab C225 (ATCC 등록 번호 HB-8508), 또는 그의 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 적합한 모노클로날 항체 EGFR 키나제 억제제는 IMC-C225 (또한 세툭시맙 또는 에르비툭스(ERBITUX)™로 공지됨; 임클론 시스템즈(Imclone Systems)), ABX-EGF (아브게닉스(Abgenix)), EMD 72000 (머크 카게아아(Merck KgaA), 다름슈타트), RH3 (요크 메디컬 바이오사이언스 인크.(York Medical Bioscience Inc.)) 및 MDX-447 (메다렉스(Medarex)/머크 카게아아)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

다양한 HER2 억제제가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 억제제는 항-HER2 항체를 포함한다. 이러한 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 이들은 또한 소위 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 인간화 항-HER2 항체의 예는 INN 명칭 트라스투주맙 및 페르투주맙으로 공지되어 있다. 트라스투주맙은 상표명 헤르셉틴®으로 제넨테크 인크. 및 에프. 호프만-라 로슈 리미티드(F. Hoffmann-La Roche Ltd)에 의해 시판된다. 트라스투주맙은 뮤린 4D5 항체의 또는 이로부터 유래된 항원 결합 잔기를 갖는 항체 (ATCC CRL 10463, 1990년 5월 24일에 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 20852 메릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301)에 기탁됨)이다. 예시적인 인간화 4D5 항체는 US 5821337에서와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (헤르셉틴®)을 포함한다.

또 다른 적합한 항-HER2 항체는 하기 구조를 갖는 트라스투주맙-MCC-DM1 (T-DM1), 항체-약물 접합체 (CAS 등록 번호 139504-50-0)이다:

여기서, Tr은 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 링커 모이어티 MCC를 통해 연결되는 트라스투주맙이다 (US 5208020; US 6441163). 약물 대 항체 비 또는 약물 부하는 트라스투주맙-MCC-DM1의 상기 구조에서 p로 나타내어지고, 1 내지 약 8의 정수 값의 범위이다. 약물 부하 값 p는 1 내지 8이다. 트라스투주맙-MCC-DM1은 다양하게 부하되고 부착된 항체-약물 접합체의 모든 혼합물을 포함하며, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8개의 약물 모이어티가 항체 트라스투주맙에 공유 부착된다 (US 7097840; US 2005/0276812; US 2005/0166993).

다양한 특성을 갖는 다른 HER2 항체가 문헌 [Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993)]; WO94/00136; [Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992)]; 미국 특허 번호 5,783,186; 및 [Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)]에 기재되어 있다. HER2 항원 및 이에 대해 지시된 항체에 대한 추가의 자세한 사항은 다수의 특허 및 비-특허 공개에 기재되어 있다 (적합한 검토를 위해, 미국 특허 번호 5,821,337 및 WO 2006/044908을 참조함).

본 발명의 방법은 EGFR 및 추가의 표적을 억제하는 화합물로 확장될 수 있다. 이러한 화합물은 본원에서 "이중특이적 억제제"로 지칭된다. 한 실시양태에서, 이중특이적 억제제는 이중특이적 HER3/EGFR, EGFR/HER2, EGFR/ HER4 또는 EGFR c-Met 억제제이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 억제제는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 EGFR 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 2개의 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 이러한 항체는 US 8,193,321, 20080069820, WO2010108127, US20100255010 및 문헌 [Schaefer et al., Cancer Cell, 20: 472-486 (2011)]에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER2/EGFR은 라파티닙/GW572016이다.

추가의 항체-기재 억제제는, 예를 들어 다른 것들 중에서 돼지, 소, 말, 토끼, 염소, 양 및 마우스로부터 선택된 숙주 동물에게 적절한 항원 또는 에피토프를 투여함으로써 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 아주반트는 항체 생산을 증진시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 실시에 유용한 항체가 폴리클로날일 수 있을지라도, 모노클로날 항체가 바람직하다. 모노클로날 항체는 배양물에서 연속적 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 이용하여 제조 및 단리될 수 있다. 생산 및 단리를 위한 기술은 쾰러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)에 의해 처음 기재된 하이브리도마 기술 (문헌 [Nature, 1975, 256: 495-497]); 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030]); 및 EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96])을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

대안적으로, 단일 쇄 항체의 생산을 위해 기재된 기술 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,946,778 참조)을 채택하여 원하는 특이성을 갖는 단일 쇄 항체를 생산할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 항체-기재 억제제는 또한 무손상 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편, 및 F(ab')₂ 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항체 단편을 포함한다. 대안적으로, Fab 및/또는 scFv 발현 라이브러리를 구축하여 (예를 들어, 문헌 [Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281] 참조) 원하는 특이성을 갖는 단편의 신속한 확인을 허용할 수 있다.

모노클로날 항체 및 항체 단편의 생산 및 단리를 위한 기술은 당업계에 널리-공지되어 있으며, 문헌 [Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 및 J. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London]에 기재되어 있다. 인간화 항-EGFR 항체 및 항체 단편은 또한 문헌 [Vaughn, T. J. et al., 1998, Nature Biotech. 16:535-539] 및 여기에 인용된 참고문헌에 기재된 것과 같은 공지된 기술에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 항체 또는 그의 단편이 또한 본 발명을 실시하는데 유용하다.

본 발명에 사용하기 위한 억제제는 대안적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 구축물에 기초할 수 있다. 안티센스 RNA 분자 및 안티센스 DNA 분자를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 mRNA에 결합하여 단백질 번역을 방지하거나 또는 mRNA 분해를 증가킴으로써 세포에서 표적 단백질의 수준을 감소시키고 이에 따라 활성을 감소시켜 상기 표적 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 역할을 할 것이다. 예를 들어, 적어도 약 15개의 염기 및 EGFR 또는 HER2를 코딩하는 mRNA 전사체 서열의 특징적인 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 종래의 포스포디에스테르 기술에 의해 합성될 수 있고, 예를 들어 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 그의 서열이 알려져 있는 유전자의 유전자 발현을 특이적으로 억제하기 위해 안티센스 기술을 이용하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,566,135; 6,566,131; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091; 6,046,321; 및 5,981,732 참조).

소형 억제 RNA (siRNA)는 또한 본 발명에 사용하기 위한 억제제로 기능할 수 있다. 표적 유전자 발현은 종양, 대상체 또는 세포를 소형 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 소형 이중 가닥 RNA의 생산을 유발하는 벡터 또는 구축물과 접촉시킴으로써 감소될 수 있고, 이에 따라 표적 유전자의 발현이 특이적으로 억제된다 (즉, RNA 간섭 또는 RNAi). 그의 서열이 알려져 있는 유전자에 적절한 dsRNA 또는 dsRNA-코딩 벡터를 선택하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Tuschi, T., et al. (1999) Genes Dev. 13(24):3191-3197; Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Hannon, G.J. (2002) Nature 418:244-251; McManus, M.T. and Sharp, P. A. (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747; Bremmelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296:550-553]; 미국 특허 번호 6,573,099 및 6,506,559; 및 국제 특허 공개 번호 WO 01/36646, WO 99/32619 및 WO 01/68836 참조).

리보자임은 또한 본 발명에 사용하기 위한 억제제로서 기능할 수 있다. 리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임 작용의 메카니즘은 상보성 표적 RNA에 대한 리보자임 분자의 서열 특이적 혼성화에 이어서 핵산내부분해 절단 사건을 포함한다. 이에 의해, mRNA 서열의 핵산내부분해 절단을 특이적으로 및 효율적으로 촉매화하는 조작된 헤어핀 또는 해머헤드 모티프 리보자임 분자가 본 발명의 범위 내에서 유용하다. 임의의 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 전형적으로 하기 서열, GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대한 표적 분자를 스캐닝함으로써 처음으로 확인된다. 일단 확인되면, 절단 부위를 함유하는 표적 유전자의 영역에 상응하는 약 15 내지 20개의 리보뉴클레오티드 사이의 짧은 RNA 서열은 올리고뉴클레오티드 서열을 부적합하게 할 수 있는 예측된 구조적 특징, 예컨대 2차 구조에 대해 평가될 수 있다. 후보 표적의 적합성은 또한 예를 들어 리보뉴클레아제 보호 검정을 이용하여 상보적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대한 그의 접근성을 시험함으로써 평가될 수 있다.

억제제로서 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임은 둘 다 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 예를 들어 고체 상 포스포르아마다이트 화학적 합성에 의한 것과 같은 화학적 합성을 위한 기술을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 RNA 분자는 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 전사에 의해 생성될 수 있다. 이러한 DNA 서열은 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터, 예컨대 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터가 혼입된 광범위한 벡터 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 대한 다양한 변형은 세포내 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서 도입될 수 있다. 가능한 변형은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 플랭킹 서열을 해당 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 첨가하거나, 또는 올리고뉴클레오티드 백본 내의 포스포디에스테라제 연결보다 오히려 포스포로티오에이트 또는 2'-O-메틸을 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 치료 방법과 관련하여, 억제제 (예컨대, EGFR 억제제 또는 HER2 억제제)는 제약상 허용되는 담체 및 비-독성 치료 유효량의 EGFR 키나제 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)로 구성된 조성물로서 사용된다.

용어 "제약상 허용되는 염"은 제약상 허용되는 비-독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 지칭한다. 본 발명의 화합물이 산성인 경우에, 그의 상응하는 염은 편리하게는 무기 염기 및 유기 염기를 포함한 제약상 허용되는 비-독성 염기로부터 제조될 수 있다. 이러한 무기 염기로부터 유래된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리 (제2구리 및 제1구리), 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망가니즈 (제2망가니즈 및 제1망가니즈), 칼륨, 나트륨, 아연 등의 염을 포함한다. 특히 바람직한 것은 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 및 나트륨 염이다. 제약상 허용되는 유기 비-독성 염기로부터 유래된 염은 1급, 2급 및 3급 아민 뿐만 아니라 시클릭 아민 및 치환된 아민, 예컨대 자연 발생 및 합성 치환된 아민의 염을 포함한다. 염을 형성할 수 있는 다른 제약상 허용되는 유기 비-독성 염기는 이온 교환 수지, 예를 들어 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N',N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 히드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민 및 트로메타민 등을 포함한다.

본 발명에 사용된 화합물이 염기성인 경우에, 그의 상응하는 염은 편리하게, 무기 및 유기 산을 포함한 제약상 허용되는 비-독성 산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 산은 예를 들어 아세트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포르술폰산, 시트르산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브로민화수소산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤신산, 질산, 파모산, 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산 등을 포함한다. 시트르산, 브로민화수소산, 염산, 말레산, 인산, 황산 및 타르타르산이 특히 바람직하다.

활성 성분으로서 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)을 포함하는 본 발명에 사용된 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 임의의 다른 치료 성분 또는 아주반트를 포함할 수 있다. 다른 치료제는 상기에 열거된 바와 같은, 세포독성제, 화학요법제 또는 항암 작용제, 또는 이러한 작용제의 효과를 증진시키는 작용제를 포함할 수 있다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로가 특정한 숙주, 및 활성 성분이 투여되는 상태의 성질 및 중증도에 의존적일 것이지만, 조성물은 경구, 직장, 국소 및 비경구 (피하, 근육내 및 정맥내 포함) 투여에 적합한 조성물을 포함한다. 제약 조성물은 편리하게는 단위 투여 형태로 제시되고, 제약 업계에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

실제로, 본 발명의 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)은 종래의 제약 배합 기술에 따라 제약 담체와의 친밀한 혼합물에서의 활성 성분으로 조합될 수 있다. 담체는 투여, 예를 들어 경구 또는 비경구 (정맥내 포함) 투여에 바람직한 제제의 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 경구 투여에 적합한 이산 단위, 예컨대 각각 예정량의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카쉐 또는 정제로 제시될 수 있다. 또한, 조성물은 분말, 과립, 용액, 수성 액체 중의 현탁액, 비-수성 액체, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로 제시될 수 있다. 상기 기재된 통상적인 투여 형태 뿐만 아니라, 억제제 화합물 (그의 각각의 성분의 제약상 허용되는 염 포함)은 또한 제어 방출 수단 및/또는 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 조합 조성물은 임의의 제약 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 활성 성분을 하나 이상의 필수 성분을 구성하는 담체와 연관시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 혼합함으로써 제조된다. 이어서, 산물은 원하는 바람직한 외형으로 편리하게 성형될 수 있다.

본 발명에 사용된 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)은 또한 하나 이상의 다른 치료 활성 화합물과 조합하여 제약 조성물에 포함될 수 있다. 다른 치료 활성 화합물은 상기 열거된 바와 같은, 세포독성제, 화학요법제 또는 항암제, 또는 이러한 작용제의 효과를 증진시키는 작용제를 포함할 수 있다.

따라서 본 발명의 한 실시양태에서, 제약 조성물은 항암제와 조합하여 억제제 화합물을 포함할 수 있으며, 여기서 항암제는 알킬화 약물, 항대사물, 미세관 억제제, 포도필로톡신, 항생제, 니트로소우레아, 호르몬 요법, 키나제 억제제, 종양 세포 아폽토시스의 활성화제 및 항혈관신생제로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다.

사용되는 제약 담체는 예를 들어 고체, 액체 또는 기체일 수 있다. 고체 담체의 예는 락토스, 백토, 수크로스, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 스테아르산마그네슘 및 스테아르산을 포함한다. 액체 담체의 예는 당 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일 및 물이다. 기체 담체의 예는 이산화탄소 및 질소를 포함한다.

경구 투여 형태를 위한 조성물의 제조에서, 임의의 편리한 제약 매질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제 등을 사용하여 경구용 액체 제제, 예컨대 현탁액, 엘릭시르 및 용액을 형성할 수 있고; 담체, 예컨대 전분, 당, 미세결정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용하여 경구 고체 제제, 예컨대 분말, 캡슐 및 정제를 형성할 수 있다. 투여의 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐은 고체 제약 담체가 사용되는 바람직한 경구 투여 단위이다. 임의로, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다.

본 발명에 사용되는 조성물을 함유하는 정제는, 임의로 하나 이상의 부속 성분 또는 아주반트와의 압착 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합된 자유-유동 형태, 예컨대 분말 또는 과립의 활성 성분을 적합한 기계에서 압착함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말화된 화합물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조할 수 있다. 각각의 정제는 바람직하게는 약 0.05mg 내지 약 5g의 활성 성분을 함유하고, 각각의 카쉐 또는 캡슐은 바람직하게는 약 0.05mg 내지 약 5g의 활성 성분을 함유한다.

예를 들어, 인간에게 경구 투여하고자 하는 제제는 전체 조성물의 약 5 내지 약 95 퍼센트에서 달라질 수 있는 적절하고 편리한 양의 담체 물질과 배합된 약 0.5mg 내지 약 5g의 활성제를 함유할 수 있다. 단위 투여 형태는 일반적으로 약 1mg 내지 약 2g의 활성 성분, 전형적으로 25mg, 50mg, 100mg, 200mg, 300mg, 400mg, 500mg, 600mg, 800mg 또는 1000mg을 함유할 것이다.

비경구 투여에 적합한 본 발명에 사용된 제약 조성물은 물 중 활성 화합물의 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 계면활성제는, 예를 들어 히드록시프로필셀룰로스를 포함할 수 있다. 분산액은 또한 오일 중 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물에서 제조될 수 있다. 또한, 미생물의 유해한 성장을 방지하기 위해 보존제가 포함될 수 있다.

주사용으로 적합한 본 발명에 사용되는 제약 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액이 포함된다. 또한, 조성물은 이러한 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 형태일 수 있다. 모든 경우에, 최종 주사가능한 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 주사를 위해 효과적인 유동성을 가져야 한다. 제약 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정하여야 하며; 따라서, 바람직하게는 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

본 발명에서의 제약 조성물은 예를 들어 에어로졸, 크림, 연고, 로션, 살포성 분말 등과 같은 국소 사용에 적합한 형태일 수 있다. 또한, 조성물은 경피 장치에 사용하기에 적합한 형태일 수 있다. 이들 제제는 종래의 처리 방법을 통해 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)을 사용하여 제조될 수 있다. 예로서, 크림 또는 연고는 친수성 물질 및 물을 약 5 중량% 내지 약 10 중량%의 화합물과 혼합하여 원하는 점조도를 갖는 크림 또는 연고를 생성함으로써 제조된다.

본 발명을 위한 제약 조성물은 담체가 고체인 직장 투여에 적합한 형태일 수 있다. 혼합물이 단위 용량 좌제를 형성하는 것이 바람직하다. 적합한 담체는 코코아 버터 및 당업계에서 통상적으로 사용되는 다른 물질을 포함한다. 좌제는 편리하게, 조성물을 연화 또는 용융된 담체(들)와 혼합한 후에 금형에서 냉각 및 성형시킴으로써 형성될 수 있다.

상기 언급된 담체 성분 뿐만 아니라, 상기 기재된 제약 제제는 적절한 경우에 하나 이상의 추가의 담체 성분, 예컨대 희석제, 완충제, 향미제, 결합제, 표면-활성제, 증점제, 윤활제 및 보존제 (항산화제 포함) 등을 포함할 수 있다. 또한, 제제가 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 다른 아주반트가 포함될 수 있다. 억제제 화합물 (그의 제약상 허용되는 염 포함)을 함유하는 조성물은 또한 분말 또는 액체 농축물 형태로 제조될 수 있다.

본 발명을 실시하는데 사용되는 화합물에 대한 투여량 수준은 대략 본원에 기재된 바와 같거나 또는 이들 화합물에 대한 업계에서 기재된 바와 같을 것이다. 그러나, 임의의 특정한 환자에 대한 구체적 용량 수준은 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 약물 조합, 및 요법이 시행되는 특정한 질환의 중증도를 비롯한는 다양한 요인에 따라 달라질 것으로 이해된다.

예를 들어 본 발명에 관련된 기술 영역에서 이용가능한 다수의 우수한 매뉴얼 및 교과서 (예를 들어, 문헌 [Using Antibodies, A Laboratory Manual, edited by Harlow, E. and Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (예를 들어, ISBN 0-87969-544-7); Roe B.A. et al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons.(예를 들어, ISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins", 2000, ed. J.Abelson, M.Simon, S.Emr, J.Thorner. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3rd Edition, by Joseph Sambrook and Peter MacCallum, (이전에 마니아티스(Maniatis) 클로닝 매뉴얼) (예를 들어, ISBN 0-87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et al. John Wiley & Sons (예를 들어, ISBN 0-471-50338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (예를 들어, ISBN 0-471-11184-8); 및 Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Acedemic Press, Inc. (예를 들어, ISBN 0-12-213585-7)])에 기재된 바와 같은 또는 분자 생물학에서 실험 방법을 설명하는 것을 다루는 다수의 대학 및 상업적 웹사이트에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 다수의 대안적인 실험 방법이 본 발명의 실시에서 본원에 구체적으로 기재된 것을 성공적으로 대체할 수 있다.

의학 업계의 숙련가는 억제제에 대한 환자의 가능한 반응성의 진단 후에 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 억제제 (예를 들어, EGFR 키나제 억제제, 이중특이적 EGFR 키나제 억제제 또는 HER2 억제제)를 환자에게 투여하는 정확한 방식이 담당의의 판단에 달려 있음을 이해할 것이다. 투여량, 다른 항암제와의 조합, 투여 시기 및 빈도 등을 비롯한 투여 방식은 억제제에 대한 환자의 가능한 반응성의 진단 뿐만 아니라 환자의 상태 및 병력에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 심지어는 억제제의 유형에 비교적 감수성이지 않을 것으로 예상되는 종양을 갖는 것으로 진단된 환자도 이러한 억제제를, 특히 다른 항암제 또는 억제제에 대한 종양의 감수성을 변경시킬 수 있는 작용제와 조합하여 사용하는 치료로부터 여전히 이익을 얻을 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 추가의 항암제와 억제제 (두 성분이 이후에 본원에서 "2종의 활성제"로 지칭됨)"의 공-투여" 및 "를 공-투여하는 것"은 2종의 활성제를 개별적으로 또는 함께 임의로 투여하는 것을 지칭하며, 여기서 2종의 활성제는 조합 요법의 이익을 얻기 위해 설계된 적절한 투여 요법의 일부로 투여된다. 따라서, 2종의 활성제는 동일한 제약 조성물의 일부로 또는 개별 제약 조성물로 투여될 수 있다. 추가의 작용제는 억제제의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여되거나 또는 그의 일부 조합물로 투여될 수 있다. 억제제가 예를 들어 표준 치료 과정 동안 반복된 간격으로 환자에게 투여되는 경우에, 추가의 작용제는 억제제의 각각의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에, 또는 그의 일부 조합물로, 또는 억제제 치료와 관련하여 다른 간격으로, 억제제를 사용한 치료 과정 전에, 그 동안의 임의의 시점 또는 그 후의 단일 용량으로 투여될 수 있다.

억제제는 전형적으로 당업계에 공지되고, 예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO 01/34574에 개시된 바와 같이 환자를 치료하기에 (효능 및 안전성 측면 둘 다로부터) 가장 효과적인 암 치료를 제공하는 투여 요법으로 환자에게 투여될 것이다. 본 발명의 치료 방법을 수행하는데 있어, 억제제는 예를 들어 공개된 임상 연구의 결과에 기초하여, 치료할 암의 유형, 사용할 억제제의 유형 (예를 들어, 소분자, 항체, RNAi, 리보자임 또는 안티센스 구축물), 및 진료의의 의학적 판단에 따라 당업계에 공지된 임의의 효과적인 방식으로, 예컨대 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 피하, 비강내, 안구내, 질, 직장 또는 피내 경로로 투여될 수 있다.

투여되는 억제제의 양 및 억제제 투여 시기는 치료할 환자의 유형 (인종, 성별, 연령, 체중 등) 및 상태, 치료할 질환 또는 상태의 중증도 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 소분자 억제제는 환자에게 1일에 또는 1주에 0.001 내지 100 mg/kg (체중) 범위의 용량으로 단일 또는 분할 투여로 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 01/34574 참조). 특히, 에를로티닙 HCl은 환자에게 1일에 5-200 mg 또는 1주에 100-1600 mg 범위의 용량으로 단일 또는 분할 투여로 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 용량은 150 mg/일이다. 항체-기재 억제제, 또는 안티센스, RNAi 또는 리보자임 구축물은 환자에게 1일에 또는 1주에 0.1 내지 100 mg/kg (체중) 범위의 용량으로 단일 또는 분할 투여로 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 상술한 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 보다 적절할 수 있고, 다른 경우에 훨씬 더 큰 용량이 어떠한 해로운 부작용도 유발하지 않으면서 사용될 수 있으며, 단 이러한 더 큰 용량은 우선 하루에 걸친 투여를 위해 여러 작은 용량으로 분할된다.

억제제 및 다른 추가의 작용제는 동일하거나 상이한 경로에 의해, 매우 다양한 다른 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 억제제는 바람직하게는 경구로 또는 비경구로 투여된다. 억제제가 에를로티닙 HCl (타르세바™)인 경우에, 경구 투여가 바람직하다. 억제제 및 다른 추가의 작용제는 둘 다 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.

억제제는 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 하드 캔디, 분말, 스프레이, 크림, 살브, 좌제, 젤리, 겔, 페이스트, 로션, 연고, 엘릭시르, 시럽 등의 형태로 다양한 제약상 허용되는 불활성 담체와 투여될 수 있다. 이러한 투여 형태의 투여는 단일 또는 다중 용량으로 수행될 수 있다. 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 비-독성 유기 용매 등을 포함한다. 경구 제약 조성물은 적합하게 감미되고/되거나 향미될 수 있다.

억제제는 스프레이, 크림, 살브, 좌제, 젤리, 겔, 페이스트, 로션, 연고 등의 형태로 다양한 제약상 허용되는 불활성 담체와 함께 조합될 수 있다. 이러한 투여 형태의 투여는 단일 또는 다중 용량으로 수행될 수 있다. 담체는 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수성 매질 및 다양한 비-독성 유기 용매 등을 포함한다.

단백질성 억제제를 포함하는 모든 제제는 억제제의 변성 및/또는 분해 및 생물학적 활성의 손실을 방지하도록 선택되어야 한다.

억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO 01/34574에 기재되어 있다. 본 발명의 교시를 고려하여, 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법은 상기 인용된 공개 및 다른 공지된 참고문헌, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18^th edition (1990)]으로부터 명백해질 것이다.

억제제의 경구 투여를 위해, 활성제 중 하나 또는 둘 다를 함유하는 정제는 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제와 함께, 다양한 붕해제, 예컨대 전분 (및 바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 알긴산 및 특정의 복합 실리케이트와 함께, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 인산이칼슘 및 글리신과 같은 임의의 다양한 부형제와 조합된다. 추가로, 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석은 종종 타정의 목적에 매우 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 젤라틴 캡슐에 충전제로 사용될 수 있고, 이와 관련하여 바람직한 물질은 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 엘릭시르가 경구 투여를 위해 바람직한 경우에, 억제제는 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료 뿐만 아니라 바람직한 경우에 유화제 및/또는 현탁화제와, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 그의 다양한 유사 조합과 같은 희석제와 함께 조합될 수 있다.

활성제 중 하나 또는 둘 다의 비경구 투여를 위해, 참깨 또는 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜 중 용액 뿐만 아니라 활성제 또는 그의 상응하는 수용성 염을 포함하는 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 멸균 수용액은 바람직하게는 적합하게 완충되고, 또한 바람직하게는 예를 들어 충분한 염수 또는 글루코스를 사용하여 등장성으로 만든다. 이들 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주사 목적에 적합하다. 유성 용액은 관절내, 근육내 및 피하 주사 목적에 적합하다. 멸균 조건 하의 이러한 모든 용액의 제조는 당업자에게 널리 공지된 표준 제약 기술에 의해 용이하게 달성된다. 단백질성 억제제의 투여에 선택된 임의의 비경구 제제는 억제제의 생물학적 활성의 변성 및 손실을 방지하도록 선택되어야 한다.

추가로, 표준 제약 실시에 따라, 예를 들어 크림, 로션, 젤리, 겔, 페이스트, 연고, 살브 등에 의해, 활성제 중 하나 또는 둘 다를 국소적으로 투여하는 것이 가능하다. 예를 들어, 약 0.1% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 농도로 억제제를 포함하는 국소 제제가 제조될 수 있다.

수의학적 목적을 위해, 활성제는 임의의 형태를 사용하여 상기 기재된 임의의 경로에 의해 동물에게 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 억제제는 캡슐, 볼루스, 정제, 액체 드렌치의 형태로, 주사에 의해 또는 이식물로서 투여된다. 대안적으로, 억제제는 동물 사료와 함께 투여할 수 있고, 이러한 목적을 위해 농축 사료 첨가제 또는 프리믹스가 정상 동물 사료를 위해 제조될 수 있다. 이러한 제제는 표준 수의학 실시에 따라 종래의 방법으로 제조된다.

특히 진단 시험 및 치료제를 사용한 치료의 적용에 관한 의학 분야의 숙련가는 생물학적 시스템이 가변성을 나타내고 항상 전체적으로 예측가능하지 않을 수 있으므로 다수의 우수한 진단 시험 또는 요법이 때때로 비효과적이라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 시험 결과, 환자 상태 및 병력, 그 자신의 경험에 기초하여 개별 환자에게 가장 적절한 치료 과정을 결정하는 것은 궁극적으로 담당의의 판단에 달려 있다. 예를 들어, 심지어는 진단 시험 또는 다른 기준으로부터의 데이터에 기초하여 종양이 EGFR 키나제 억제제에 대해 특히 감수성인 것으로 예측되지 않는 경우라 할지라도, 특히 모든 또는 대부분의 다른 명백한 치료 옵션이 실패한 경우에, 또는 또 다른 치료가 주어졌을 때 약간의 상승작용이 예상되는 경우에 전문의가 환자를 EGFR 억제제로 치료하는 것을 선택하는 경우가 종종 있을 수 있다. 일종의 약물로서의 EGFR 억제제가 다수의 다른 항암 약물, 예컨대 암의 치료에 사용되는 보다 전통적인 화학요법 또는 세포독성제에 비해 비교적 널리 허용된다는 사실은 이를 보다 가능한 옵션으로 만든다.

광고 방법

본 발명은 여기서 또한 ERBB2 저메틸화를 특징으로 하는 일종의 암을 갖는 환자 집단을 치료하기 위해 표적 청중에게 EGFR 또는 HER2 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 촉진하는 것을 포함하는, EGFR 또는 HER2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 조성물을 광고하는 방법을 포함한다.

광고는 일반적으로 광고주가 확인되고 메시지가 제어된, 비-개인적인 매체를 통한 유료 커뮤니케이션이다. 본원의 목적을 위한 광고는 선전, 홍보, 간접 광고, 후원, 인수 및 판촉을 포함한다. 이러한 용어는 또한 본원에서 본 발명을 구입하거나 지지하거나 승인하는 유리한 패턴으로 설득하거나 정보를 제공하거나 프로모션하거나 동기부여하거나 또는 다르게는 행동을 변형시키기 위해 대중에게 호소하도록 고안된 인쇄 커뮤니케이션 매체들 중 임의의 것으로 나타나는, 후원받은 정보성 공시를 또한 포함한다.

본원에서의 진단 방법의 광고 프로모션은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 메시지를 전달하기 위해 사용되는 광고 매체의 예는 방송 매체에서 메시지를 나타내는, 텔레비젼, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷 및 광고판 (광고방송 포함)를 포함한다. 광고는 또한 식품점 카트의 시트, 공항 보도의 벽 및 버스 측면 상의 것들, 통화중 대기 메시지 또는 점포내 PA 시스템에서 들리는 것들, 시각적 또는 청각적 커뮤니케이션이 존재할 수 있는 어디에서든지 있는 것들을 포함한다.

프로모션 또는 광고 수단의 보다 구체적 예는 텔레비전, 라디오, 영화, 인터넷, 예컨대 웹캐스트 및 웨비나, 동시 사용자들에게 도달하도록 의도된 쌍방향 컴퓨터 네트워크, 고정형 또는 전자식 광고판 및 기타 공공 간판, 포스터, 전통적인 또는 전자식 인쇄물, 예컨대 잡지 및 신문, 기타 매스컴, 프레젠테이션 또는 개인적인 접촉 (예를 들어, 이메일, 전화, 인스턴트 메시지, 우편, 택배, 대중, 또는 배달 우편, 개인 방문 등에 의한 접촉)을 포함한다.

사용되는 광고의 유형은 많은 인자, 예를 들어 도달하려는 표적 청중의 성질, 예를 들어 병원, 보험 회사, 진료소, 의사, 간호사 및 환자, 뿐만 아니라 비용 고려사항, 및 의약 및 진단 광고를 규제하는 관련 관할 법률 및 규칙에 따라 결정될 것이다. 광고는 서비스 상호작용에 의해 정의되는 사용자 특성화 및/또는 기타 데이터, 예컨대 사용자 통계 및 지리적 위치를 기초로 하여 개별화 또는 주문제작될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예로부터 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 당업자는 논의된 구체적 방법 및 결과가 단지 이후에 기재되는 특허청구범위에서 보다 자세하게 기재된 바와 같은 본 발명을 예시하는 것으로, 어떠한 방식으로로 이에 제한되는 것으로 간주되지 않는다는 것을 용이하게 알 것이다.

본원에 개시된 모든 특허, 공개 특허 출원 및 다른 참고문헌은 그의 전체내용이 명백하게 본원에 참조로 포함된다.

III. 실시예

실시예 1 - 물질 및 방법

세포주: 모든 NSCLC 세포주는 아메리칸 타입 셀 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 구입하거나 또는 유타주 사우스웨스턴에서 애디 가즈더(Adi Gazdar) 및 존 미나(John Minna)가 제공하였다. 불멸화 기관지 상피 (gBEC) 및 소기도 (gSAC) 세포주는 선택 마커로서 cdk4, hTERT 및 G418을 함유하는 트리시스트론 벡터를 사용하여 제넨테크에서 생성하였다. 트리시스트론 벡터는 hTERT를 함유하는 pQCXIN 백본으로부터 조작하였다. 불멸화 과정은 일부 변형된 이전에 공개된 프로토콜에 기초하였다 (문헌 [Ramirez et al., 2004, Cancer Res 64:9027; Sato et al., 2006, Cancer Res 66:2116]). gBEC 및 gSAC는 이배체 핵형을 가지며, 비-종양발생성이다.

종양 샘플: DNA 메틸화 검정을 제넨테크에서 후원하는 III상 시험인 TRIBUTE에 등록된 환자로부터 수득된 FFPE 생검 물질로부터 단리된 종양 DNA 상에서 수행하여, 1,079명의 병기 IIIB 또는 병기 IV NSCLC 환자 중 카르보플라틴 및 파클리탁셀의 요법과 공동으로 투여된 에를로티닙을 제공받은 환자 (n=539)의 생존을 카르보플라틴 및 파클리탁셀을 단독으로 제공받은 환자 (n=540)와 비교하였다 (문헌 [Yauch et al., 2005, Clin Cancer Res 11:8686]). DNA는 343명의 TRIBUTE 환자 및 112명의 MetMAb 환자의 경우에 이용가능하였다.

게놈 DNA의 탈메틸화: 메틸화 검정에서 음성 대조군용으로 사용된 세포를 10% 태아 소 혈청 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 1640에서 성장시켰다. 세포를 제0일에 4000-9000개 세포/cm2로 시딩하고, 1 μM 5-아자-2'-데옥시시티딘 (시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH) 카탈로그 번호 A3656) 또는 DMSO 대조군 (카탈로그 번호 D2650)으로 제1일, 제3일 및 제5일에 투여하였다. 제6일에 세포를 차가운 포스페이트 완충 염수에서 1회 세척하고, 트리졸 (인비트로젠, 카탈로그 번호 15596018)에서 긁어내어 수확하고, RNA를 위해 추출하거나 또는 나중의 RNA 추출을 위해 신선 동결시켰다.

일루미나 인피늄 메틸화 분석: 각각의 96개의 NSCLC 세포주로부터의 1 μg의 게놈 DNA를 비술파이트-전환시키고, 일루미나 인피늄 450K 메틸화 상에서 분석하였다. 메틸화 데이터를 바이오컨덕터 루미 소프트웨어 패키지를 이용하여 처리하였다 (문헌 [Du et al., 2008, Bioinformatics 24:1547]). 인피늄 450K 플랫폼은 동일한 어레이 상의 인피늄 I 및 II 검정을 포함한다. 인피늄 I 검정은 일부 경우에는 적색 염료에 의해 다른 경우에는 녹색 염료에 의해 보고된 메틸화 상태를 갖는, CpG 로커스당 2가지 비드 유형을 사용한다 (이전 인피늄 27K 플랫폼과 동일함). 인피늄 II 검정은 1종의 비드 유형을 사용하고, 항상 동일한 염료를 사용한 메틸화 상태를 보고하여 염료 특성에 관심을 갖게 한다. 높은 배경 신호를 갖는 1개의 어레이를 버린 후에, 2-단계 정규화 절차를 남은 어레이에 적용하였다. 첫째로, 각각의 어레이에 대해, 색-특성 보정 곡선을 평활 사분위수 정규화 방법을 이용하여 인피늄 I 데이터로부터 추정하였으며; 이어서 이 보정 곡선을 해당 어레이로부터의 모든 데이터에 적용하였다. 둘째로, 어레이를 표준 사분위수 정규화를 모든 색-보정된 신호에 적용함으로써 서로에 대해 정규화하였다.

예비-처리 후에, 메틸화 M-값 (비메틸화된 프로브에 대한 메틸화된 프로브의 log₂ 비) 및 β-값 (로지스틱 변환을 통한 M-값의 0 및 1 범위로의 재척도화)을 둘 다 각각의 샘플에 대해 계산하였다 (문헌 [Du et al., 2010, BMC Bioinformatics 11:587]). 시각화를 위해, β-값의 응집성 계층 군집화를 완전 연관 및 유클리드 거리값을 이용하여 수행하였다. DMR은 먼저 각 세포주의 M-값 (정보를 얻은 CpG 부위에 집중된 500 bp 윈도우)에 대한 이동 평균을 계산한 후에; t-검정을 이용하여 무작위적으로 선택된 10개의 상피-유사 및 10개의 중간엽-유사 세포주의 훈련 세트와 연관된 윈도우 스코어를 대조하여 확인하였다. DMR p-값을 조정하여 오류 발견율을 제어하고 (Benjamini and Hochberg, 1995), 0.01의 컷오프에 비교하였다. 보다 생물학적으로 관련된 현상을 풍부하게 하기 위해, 하류 분석은 오직 그의 평균 윈도우 스코어가 (i) 감수성 세포주와 내성 세포주 사이에 적어도 2의 차이가 나고 (ii) 세포주의 2개의 세트에서 반대 부호를 갖는 차별적으로 메틸화된 영역만을 고려하였다. 최종적으로, 이러한 기준을 모두 만족시키는 인접한 DMR을 이들이 2 kb 미만으로 떨어져 있는 경우에 단일 DMR로 중첩시켰다.

비술파이트 서열분석 및 분석: 후보 유전자의 DNA 메틸화 상태를 확인하기 위해, 2μg 게놈 DNA를 EZ DNA 메틸화-금 키트 (자이모 리서치(Zymo Research))를 이용하여 비술파이트-전환시켰다. 전환된 DNA에 특이적인 프라이머를 메틸 프라이머 발현 소프트웨어 v1.0 (어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 설계하였다. PCR 증폭은 백금 PCR 슈퍼믹스 (인비트로젠)를 사용하여 25-μl 반응에서 1μl의 비술파이트-전환된 DNA로 수행하였다. PCR 열순환 조건은 다음과 같았다: 10분 동안 95℃의 1 초기 변성 사이클, 이어서 30초 동안 94℃, 1분 동안 65℃ 및 매 사이클마다 1℃ 감소, 및 1분 동안 72℃의 10 사이클, 이어서 30초 동안 94℃, 1.5분 동안 55℃ 및 1분 동안 72℃의 30 사이클, 이어서 15분 동안 72℃에서의 최종 신장. PCR 산물을 브로민화에티듐 (인비트로젠)을 함유하는 2% 아가로스 E-겔을 이용하여 전기영동에 의해 분할하고, 플루오르켐(FluorChem) 8900 카메라 (알파 이노테크(Alpha Innotech))를 이용하여 시각화하였다.

PCR 산물을 TOPO TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 제조업체의 지침에 따라 이용하여 pCR4-TOPO 벡터에 라이게이션시켰다. 2μl의 라이게이션된 플라스미드 DNA를 TOP10 컴피턴트 박테리아 (인비트로젠)에 형질전환시키고, 100μl의 형질전환된 박테리아를 50μg/ml 카르베니실린 (테크노바(Teknova))을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 후보 로커스에 대한 세포주당 12개의 콜로니를 50μg/ml 카르베니실린을 함유하는 1 ml의 LB에 접종하고, 37℃의 진탕 인큐베이터에서 밤새 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 96-웰 포맷의 퀴아프렙(Qiaprep) 미니프렙 키트 (퀴아젠)를 이용하여 단리하고, 3730x1 DNA 분석기 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 서열분석하였다. 서열분석 데이터를 시퀀처(Sequencher) v4.5 소프트웨어 및 BiQ 분석기 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 비술파이트-전환된 서열을 먼저 정렬하고, 시퀀처를 이용하여 각각의 후보 로커스에 대한 참조 서열에 트리밍하여 서열 품질을 평가하고 소듐 비술파이트 처리 동안 시토신 전환을 확인하였다. 이어서, 트리밍된 서열을 BiQ 분석기 소프트웨어를 이용하여 개별 CpG 부위에서의 메틸화 상태에 대해 평가하였다.

파이로시퀀싱: 비술파이트-특이적 PCR (BSP) 프라이머를 메틸 프라이머 발현 소프트웨어 v1.0 (어플라이드 바이오시스템즈) 또는 파이로마크 검정 설계 소프트웨어 v2.0 (퀴아젠)을 이용하여 설계하였다. 정방향 또는 역방향 프라이머 상에 5' 비오틴 표지를 갖는 PCR 프라이머를 합성하여 PCR 산물의 스트렙타비딘 세파로스 비드에 대한 결합을 용이하게 하였다. 서열분석 프라이머를 파이로마크 검정 설계 소프트웨어 v2.0 (퀴아젠)을 이용하여 5'-비오틴-표지된 PCR 프라이머의 역 방향으로 설계하였다. 1μl의 비술파이트 변형된 DNA를 백금 PCR 슈퍼믹스 (인비트로젠)를 사용하여 25 μl 반응물에서 증폭시키고, 20μl의 PCR 산물을 파이로마크 Q24 (퀴아젠) 상의 서열분석에 사용하였다. PCR 산물을 스트렙타비딘 세파로스 비드로 10분 동안 인큐베이션한 후에 70% 에탄올, 파이로마크 변성 용액 및 파이로마크 세척 완충제로 세척하였다. 이어서, 변성된 PCR 산물을 0.3μM 서열분석 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 파이로그램을 시각화하고, 서열 품질에 대해 평가하고, 개별 CpG 부위에서의 메틸화 퍼센트를 파이로마크 소프트웨어 버전 2.0.4 (퀴아젠)을 사용하여 결정하였다. 하기 프라이머는 ERBB2 파이로시퀀싱 검정에 사용되는 예시적인 프라이머이다:

ERBB2 파이로시퀀싱 프라이머:

1 정방향: 5'- GGTTTAAGTGGGTTAGGTGTG -3'(서열 3)

1 역방향, 비오틴: 5'-CAATTATAAACATCTAAACCCAAACTACA -3' (서열 4)

1 서열분석: 5'-AGT TTTATGTTTTATGGT TGA-3' (서열 5)

네스티드 정방향: 5'-TAGTTTTATGTTTTATGGTTGATGGTT-3' (서열 6)

네스티드 역방향, 비오틴: 5'- CCAAAACCAACTAACAAAATATATACC -3' (서열 7)

네스티드 서열분석: 5'-TTGGGTAGGTATGTAGG-3' (서열 8)

프로모터 인핸서 활성 루시페라제 리포터 검정: ERBB2 유전자의 차별적으로 메틸화된 영역 (인피늄 검정 프로파일링에 의해 확인됨)의 프로모터 인핸서 활성을 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템 (프로메가(Promega))을 이용하여 평가하였다. ERBB2의 제1 인트론 내의 1791-bp 영역을 제조업체의 지침에 따라 pGL4 루시페라제 리포터 벡터로 클로닝하였다. 세포를 대조군 프로모터 플러스 ERBB2 추정 인핸서 영역으로 형질감염시키고, 루시페라제 활성을 형질감염 24, 48 및 72시간 후의 시점에 표준 발광측정기를 이용하여 측정하였다.

정량적 메틸화 특이적 PCR: 정량적 메틸화 특이적 PCR (qMSP) 검정을 본 발명자들의 후보 스크린에서 에를로티닙-감수성 및 내성 NSCLC 세포주에서 차별적으로 메틸화된 것으로 확인된 유전자좌를 이용하여 설계하였다. 최소 10 ng의 소듐 비술파이트 전환된 DNA를 택맨® 범용 PCR 마스터 믹스, 노 앰프이레이즈(No AmpErase)® UNG (어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 번호 4324018)를 95℃ 10 분에 이어서 50 사이클의 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 순환 조건에서 이용하여 다양한 20X 맞춤 택맨 유전자 발현 검정 (어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 번호 4331348)으로 증폭시켰다. 증폭을 7900HT 시스템 상에서 수행하였고, SDS 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 분석하였다. DNA 함량을 meRNaseP 택맨 검정을 이용하여 정규화하였다.

FFPE 임상 시험 물질의 예비-증폭: 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직으로부터 추출된 pg 양의 DNA의 메틸화 분석을 위한 예비-증폭 방법을 개발하였다. 2 μl (10pg-1ng의 등량) 비술파이트 전환된 DNA를 우선 택맨® 범용 PCR 마스터 믹스, 노 앰프이레이즈® UNG (어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 번호 4324018) 및 95℃ 10분에 이어서 14 사이클의 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 순환 조건을 이용하여 0.1X qMSP 프라이머-프로브 농축물을 포함하는 20 μl 반응물에서 증폭시켰다. 이어서, 1 μl의 예비-증폭된 물질을 95℃ 10분에 이어서 50 사이클의 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 순환 조건으로 제2 PCR 반응물에서 증폭시켰다. DNA 함량을 참조 meRNaseP 택맨 검정으로의 예비-증폭을 이용하여 확인하였고, 오직 meRNaseP에 양성인 샘플만을 qMSP 반응물의 추가의 분석에 포함시켰다. 모든 반응을 이중으로 수행하였다.

실시예 2 - ERBB2 DMR의 저메틸화는 NSCLC 세포주 및 NSCLC 원발성 종양에서 상피-유사 표현형과 상관된다

ERBB2 원종양발생유전자의 엑손 4에 가까운 CpG 부위가 상피 및 중간엽-유사 NSCLC 세포주의 메틸화 프로파일링에 기초하여, 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)으로 확인되었다. 메틸화 프로파일링을 인피늄 메틸화 분석을 이용하여 수행하였고, 메틸화 상태의 검증은 소듐 비술파이트-전환된 DNA의 클로닝된 단편의 직접 서열분석에 의해 검증하였다.

파이로시퀀싱을 이용하여 NSCLC 원발성 종양 및 매치된 정상 조직에서 DMR의 정량적 메틸화 상태를 결정하였다. 정량적 메틸화를 식 % 메틸화 = (C 피크 높이 x 100 /C 피크 높이 + T 피크 높이, 도 2 (6개의 개별 CpG 부위의 평균 메틸화 퍼센트를 나타냄, 스튜던트(Student) t-검정을 이용하여 결정된 p<0.06의 P-값을 가짐)을 사용하는 파이로마크 분석 소프트웨어에 의해 6개의 연속 CpG 부위에서 결정하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, ERBB2의 이러한 유전자내 DMR은 정상 인접한 조직에 비해 저메틸화된 것으로 나타났다.

UCSC 게놈 브라우저를 이용하는 이 영역의 인 실리코 분석은 프로브 cg00459816 (유형 II 일루미나 인피늄 450K 메틸화 어레이 프로브, 염색체 좌표: NCBI 구축물 36/hg18 chr17:35115639 (일루미나, 인크.(Illumina, Inc.), 캘리포니아주 샌 디에고)에서 단일 CpG 부위를 나타냄)에 상응하는 차별적으로 메틸화된 CpG 부위가 잠재적 조절 요소와 중첩된다는 것을 시사한다. 이 영역은 CpG 섬 내에 있지 않고, 특히 GC 풍부하지 않기 때문에, 이 영역을 플랭킹하는 파이로시퀀싱 프라이머를 설계하여 상피-유사 및 중간엽-유사 세포주의 패널에서 그의 메틸화 상태를 결정하였다. 중간엽-유사 세포주 (21개의 중간엽-유사 세포주 중 20개에서 평균 메틸화 ≥70%; P < 0.001)에 비해 16개의 상피-유사 세포주 중 13개에서 저메틸화 패턴 (6개의 CpG 부위의 평균 메틸화 ≤20%)이 관찰되었다. 도 3은 이 분석의 결과를 보여주며, 여기서 데이터는 서열분석된 영역 내의 6개의 연속적 CpG 부위에서의 메틸화의 평균 +/- SD 백분율로 나타낸다.

오직 하나의 중간엽-유사 세포주, H1435가 이 로커스에서 저메틸화되었다. 이러한 예외는 H1435가 EMT 발현 분석에 의해 중간엽-유사 세포주로 확인된 본 발명자들의 이전 관찰에 기초하여 놀라운 것은 아니었다.

실시예 3 - ERBB2 DMR의 저메틸화는 ERBB2 발현과 상관된다

NSCLC 세포주에서 ERBB2 mRNA의 상대 발현 수준을 택맨-기반 플루이다임 유전자 발현 분석을 이용하여 결정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 상피-유사 세포주는 중간엽 유사 세포주보다 유의하게 더 높은 수준의 ERBB2 발현 (P < 0.001)을 나타내었다. ERBB2 로커스의 저메틸화가 세포주에서의 HER2의 보다 높은 발현 및 상피 표현형 둘 다와 매우 상관된다는 발견은 이 영역의 차별적 메틸화가 EGFR 또는 HER2 신호전달의 억제제에 대한 예측 바이오마커로서 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4 - ERBB2 DMR의 저메틸화는 에를로티닙 감수성과 상관된다

ERBB2 저메틸화는 시험관내에서 에를로티닙 감수성과 강하게 상관되며, 이는 그의 에를로티닙 반응의 예측 임상적 바이오마커로서의 잠재성을 나타낸다. 도 5는 ERBB2 저메틸화 및 에를로티닙 감수성 사이의 이러한 상관관계를 나타내는 NSCLC 세포주의 ERBB2 파이로시퀀싱 분석의 결과를 보여준다. 이러한 도 5의 데이터를 에를로티닙 감수성에 대한 6개의 CpG 부위의 메틸화의 평균 +/- SD로 플롯팅하였다. 에를로티닙 IC₅₀ 결정을 위해, 세포를 384-웰 플레이트에서 0.5% FBS를 함유하는 RPMI (검정 배지) 중에 웰당 3x10²개 세포로 사중으로 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 24시간 후에, 세포를 10μM - 1pM 최종 농도의 용량 범위에서 3nM TGFα 및 에를로티닙을 함유하는 검정 배지로 처리하였다. 72시간 후에, 세포 생존율을 셀타이터-글로(Celltiter-Glo) 발광 세포 생존율 검정 (프로메가)을 이용하여 측정하였다. 세포 생존율의 50% 억제를 발생시키는 에를로티닙의 농도를 4-파라미터 곡선 분석으로부터 계산하고, 최소 2회 실험으로부터 결정하였다.

실시예 5 - ERBB2 DMR의 저메틸화는 상피-유사 표현형 FFPE 조직 샘플에 상관된다

신선-동결 샘플은 전형적으로 NSCLC의 진단 동안 또는 폐암 임상 시험의 부분으로 수득되지 않는다. 따라서, 임상 적용을 가능하게 하기 위해, 파이로시퀀싱 검정은 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직으로부터 제한되고 분해된 DNA (통상적으로 <150 bp)를 증폭시킬 수 있어야 한다. 228-bp 파이로시퀀싱 검정을 이용한 ERBB2 DMR 내의 6개의 인접한 CpG 부위의 메틸화 상태 사이의 높은 일치성 때문에 (도 6), 검정을 단지 2개의 CpG 부위를 조사하도록 다시 설계하였다. 이 검정에서, 파이로시퀀싱을 이용하여 NSCLC 세포주에서 DMR의 정량적 메틸화 상태를 결정하였다. 정량적 메틸화를 식 % 메틸화 = (C 피크 높이 x 100 /C 피크 높이 + T 피크 높이)를 사용하는 파이로마크 분석 소프트웨어에 의해 6개의 연속 CpG 부위에서 결정하였다. 도 6은 스튜던트 t-검정을 이용하여 결정된 p<0.06의 P-값과 함께 6개의 개별 CpG 부위의 평균 메틸화 퍼센트를 나타낸다. 상피 또는 중간엽으로의 세포주의 명명은 이전에 20-유전자 플루이다임 유전자 발현 패널을 이용하여 결정하였다.

실시예 6 - ERBB2 DMR의 저메틸화는 NSCLC 원발성 종양에서 상피-유사 표현형과 상관된다

이어서, ERBB2의 메틸화 상태를 유전자 발현 데이터가 또한 이용가능한 42개의 후기 (병기 IIIb/IV) FFPE NSCLC 종양에서 평가하였다. ERBB2 인핸서의 저메틸화는 나중에 1차 화학요법에 계속 실패하게 되는 환자로부터 수득한 생검에서 HER2의 발현과 강하게 상관되며 (P < 0.011), 세포주에서 관찰된 패턴을 요약하였다 (도 7). 저메틸화를 파이로시퀀싱 및 택맨-기반 플루이다임 유전자 발현 분석을 이용하여 결정하였다. 메틸화의 백분율은 2개의 CpG 부위의 평균으로 나타낸다. 중간 컷오프 점을 이용하여 ERBB2-높음 및 ERBB2-낮음 종양으로 나누었다. P 값은 단측 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 이용하여 결정하였다.

기록용 FFPE 슬라이드로부터 유래된 47개의 NSCLC 원발성 종양 샘플에서 ERBB2의 메틸화 및 상피/중간엽 상태의 분석을 수행하였다. ERBB2의 메틸화 상태를 파이로시퀀싱 분석을 이용하여 결정하였다. 상피-유사로 분류된 종양은 ERBB2 인핸서에서 중간엽-유사로 분류된 종양에 비해 저메틸화되었으며 (P < 0.046), 이는 ERBB2 메틸화 상태 및 전체 유전자 발현 표현형 사이의 강한 연관을 나타낸다 (도 8) (데이터는 2개의 CpG 부위의 평균으로 나타낸다. 상피-유사/중간엽-유사 상태는 택맨-기반 플루이다임 유전자 발현 분석으로부터 유래된 스코어를 사용하여 결정하였다. 중간 컷오프 점을 이용하여 상피-유사/중간엽-유사 발현 스코어로 나누었다. P 값은 스튜던트 t 검정을 이용하여 결정하였다).

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. et al. <120> Diagnostic Markers <130> P4755R1-WO <150> US 61/529,917 <151> 2011-08-31 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2551 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcccaaccca gcccagccac cctgccctcc gtagagcctg tggtgtttat cggtggcatt 60 gggagaatta gtgtgtattt atgttggcgt ggggtgtggg gtggatttgt gtgtgtgcag 120 ttaggcctag tggaaggaat gtgggatctg aaggcaggcc agcctgagtt ccagtcctgc 180 ctgttgctca caagctttat gaggcgagag ctaacccctg ccagcctcag ttgtcttctt 240 tgcaagatgg aggttgcagc cccagtctct ggagcatgtt atgcagatcc accgagagtg 300 cctgccaggc acacagtagg tgctcagctc agttactgtg gcggccccca ctccccattg 360 ttgttgtttt cctattgcct ggcggccaca gctggtatcc cttgaaaagg gctacagggg 420 gtggagtcgg accctgcccc agccctgtgg agaccctggg cttgggccag ggcctggggt 480 ctgggcctgc agacagctgt gtctataaag cagctgaagg gctgaggccg ggggaggtcc 540 tggcagcagg gcgttatttt gggcctggcc tgccaccccc agctcctgtt tctcttggga 600 gtctgttggg ggaggaagtg tggggaagag gagggggtgc aagtgggtga ggcatggagt 660 ggggaggcct ccctcaggga catggaccct tgagttctat ttctgttcct ccctcctgtt 720 cctccctctt tgtccttatc tgcctagaga ggtgggaata gaggccattc tgagtatcac 780 taggagacca ccagtttgtg gccactggcc actggcccag gcagggaacc tgggggcttg 840 ccctaccagc ctctcccagc aatctgaagg cagggggtac ctcgtattac cccctaggat 900 ttgaccttag gctccaactt gctgggagag cagtgcctct ggtgtcagac cccaagccag 960 cccttgtgct gtccctgaat ctgcatgtag cctgtgggag gcggagcagt gaccggcagg 1020 aattctgggc agctcaggca cctgtgggcc tgagggtgcc ctctgccccc acccttccga 1080 tctcctgggc aagacacgcc aggtgattca tctcaccaga gcagaaaaac aagttcaact 1140 gggcacttta atctcccctc actggcaggc ctggtgtgag ctgctacccc ggcgcccctc 1200 accaggggtg ctttacctcc tctagtattc ctgaccttag tgggcatttc tggtctcagg 1260 gataccaggc tggggtccaa gtgggccagg tgtggcagtt cagccctatg ccccatggct 1320 gatggctcgc gctgggcagg tatgcagggc tgacgtagtg cctttgtggc agcagtttcg 1380 tggcacacat tctgccagct ggttctggag tcttgccctg aggaggtggc cagggtgagg 1440 gtgccagcgc aggaaccttt ggcgcatgct tcaccctggc ctgggatctg cagcctgggt 1500 ccagatgccc acaactggaa tctgacgctc cttttctctt catgggggac tcccagaggt 1560 ctctgcaatg accagagccc cggttgtccc atgcctcagc tgcaactcca gctgaccctc 1620 cttccccact ctctgggtgg cattacgggg gtgtggatcc cttgccaaga ggttggcatg 1680 tgggtgtgct ggaatggcat agggagaatg caccgagttt gtttgcttgg gagaggggca 1740 gggggtatcc agaagattca tgattcgtca tcgcctctct tgggggattt ttaccccttt 1800 gccctgagtt gtgcctttgg gacaaaggaa gcctttcttt gccagccaac accctgtact 1860 ggcgggcgag ctccccaggg ctggcacgct ggggcagcct ctgaatgcac agggtgggcc 1920 tagtcagaag aagcctttcc cctgaaatcc ctctacttcc caagcacgca agctttctcc 1980 tgctgttaaa cctgcagtgt gcaagggaca tgggcggagg ggtccttcag tcaggcttct 2040 ccctgtctga ggtggcatga cttggagtga gtttggatgg ggtggccagg tctgagaagg 2100 tcccccgcca gtgtcctctg acccatctgc tctctcctgc cagtgtgcac cggcacagac 2160 atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctac 2220 cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagc 2280 ctgtccttcc tgcaggtgag gcccgtgggc aacccagcca ggccctgcct ccagctgggc 2340 tgagccctct gtttacaggt gggtggcaga agaaggtgcc ctgcccttct gtttcctctc 2400 ttgttgtggt ttctcaacca ggaagtcctt tctaacatct aacccccatt cattttactg 2460 cagaatcagt tgactctctc tataacgtgg ctggccgagg tcatgtctgg atgggatgcg 2520 tctgtgtttc cgctaaatct tgtgctctct t 2551 <210> 2 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tctcagggat accaggctgg ggtccaagtg ggccaggtgt ggcagttcag ccctatgccc 60 catggctgat ggctcgcgct gggcaggtat gcagggctga cgtagtgcct ttgtggcagc 120 agtttcgtgg cacacattct gccagctggt tctggagtct tgccctgagg aggtggccag 180 ggtgagggtg ccagcgcagg aacctttggc gcatgcttca ccctggcctg ggatctgcag 240 cctgggtcca gatgcccaca actggaatct gacgctcctt ttctcttcat gggggactcc 300 cagaggtctc tgcaatgacc agagccccgg ttgtcccatg cctcagctgc aactccagct 360 gaccctcctt ccccactctc tgggtggcat tacgggggtg tggatccctt gccaagaggt 420 tggcatgtgg gtgtgctgga atggcatagg gagaatgcac cgagtttgtt tgcttgggag 480 aggggcaggg ggtatccaga a 501 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 3 ggtttaagtg ggttaggtgt g 21 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4 caattataaa catctaaacc caaactaca 29 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 agttttatgt tttatggttg a 21 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 6 tagttttatg ttttatggtt gatggtt 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 7 ccaaaaccaa ctaacaaaat atatacc 27 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 8 ttgggtaggt atgtagg 17

Claims (37)

1. 샘플 종양 세포에서 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자의 저메틸화는 종양 세포 성장이 EGFR 억제제를 사용한 억제에 대해 감수성임을 나타내는 것인, EGFR 키나제 억제제에 의한 억제에 대한 종양 세포 성장의 감수성을 결정하는 방법.
2. 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 ERBB2 유전자의 메틸화 상태가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 EGFR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 것으로 확인되는 것인, EFGR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 암 환자를 확인하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 메틸화 상태를 ERBB2 유전자의 부분에서 검출하는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 인핸서인 방법.
5. 제3항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 인핸서 및 프로모터인 방법.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 6개 CpG 반복 영역을 포함하는 것인 방법.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 서열 2의 핵산 서열로 이루어진 것인 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 약 50% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 약 20% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
11. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 부분의 약 50% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 부분의 약 20% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
13. 제2항에 있어서, 환자가 EGFR 억제제를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있을 것으로 확인된 경우에 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
14. 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 EGFR 억제제의 투여 전에 ERBB2 유전자의 저메틸화를 나타내는 암을 갖는 것으로 진단되었고, ERBB2 유전자의 저메틸화는 EGFR 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응성을 나타내는 것인, 환자에서 암을 치료하는 방법.
15. a. 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것, 및
    b. ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 요법을 위해 EGFR 억제제를 선택하는 것
    을 포함하는, 암 환자를 위한 요법을 선택하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 환자에게 치료 유효량의 EGFR 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, EGFR 억제제가 에를로티닙, 세툭시맙 또는 파니투무맙인 방법.
18. 세포에서 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 ERBB2 유전자 저메틸화는 세포에서 ERBB2의 과다발현을 나타내는 것인, 세포에서 ERBB2 유전자의 과다발현을 결정하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 메틸화 상태를 ERBB2 유전자의 부분에서 검출하는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 인핸서인 방법.
21. 제19항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 인핸서 및 프로모터인 방법.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 6개 CpG 반복 영역을 포함하는 것인 방법.
23. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, ERBB2 유전자의 부분이 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
25. 제18항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 약 50% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
26. 제25항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 약 20% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
27. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 부분의 약 50% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 저메틸화가 ERBB2 유전자의 부분의 약 20% 미만의 메틸화에 의해 나타내어지는 것인 방법.
29. 환자에게 치료 유효량의 HER2 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 HER2 억제제의 투여 전에 ERBB2 유전자의 저메틸화를 나타내는 암을 갖는 것으로 진단되었고, ERBB2 유전자의 저메틸화는 HER2 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응성을 나타내는 것인, 환자에서 암을 치료하는 방법.
30. a. 암 환자의 암으로부터의 샘플로부터 ERBB2 유전자의 메틸화 상태를 검출하는 것, 및
    b. ERBB2 유전자가 저메틸화된 것으로 검출된 경우에 요법을 위해 HER2 억제제를 선택하는 것
    을 포함하는, 암 환자를 위한 요법을 선택하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 치료 유효량의 HER2 억제제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
32. 제31항에 있어서, HER2 억제제가 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-DM1인 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸화 상태를 파이로시퀀싱에 의해 검출하는 것인 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ERBB2 유전자가 포르말린-고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직 또는 신선 동결 조직으로부터의 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, 조직 샘플로부터 단리된 ERBB2 유전자가 파이로시퀀싱 전에 예비증폭된 것인 방법.
36. 제1항에 있어서, 종양 세포가 NSCLC 종양 세포인 방법.
37. 제2항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 NSCLC인 방법.

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