KR20140056949A - 포유동물 정원 줄기세포의 장기 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 정원 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 돼지 정소로부터 분리한 정소세포를 30 내지 40℃의 온도조건에서 저온배양하여 체외에서 3개월 이상 장기배양할 수 있는 방법을 제공함으로써, 포유동물의 정소로부터 정원 줄기세포를 간편한 방법으로 분리 및 정제하여 장기간 체외에서 높은 생존율을 유지하면서 배양할 수 있을 뿐만 아니라 배양된 포유동물 정원 줄기세포를 수득할 수 있는 효과가 있다.

Description

포유동물 정원 줄기세포의 장기 배양방법{METHOD FOR CULTURING MAMMAL SPERMATOGONIAL STEM CELLS}

본 발명은 포유동물 정원 줄기세포의 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지 정소로부터 분리한 정소세포를 30 내지 40℃의 온도조건에서 저온배양하여 체외에서 3개월 이상 장기배양할 수 있는 방법에 관한 것이다.

정자형성 과정은 수컷 정소의 정원세포가 분열과 분화 그리고 세포사멸화 과정을 거치면서 정자를 형성하는 과정이다. 따라서, 정자형성 과정은 매우 복합하면서 조직화되고 효율적인 생산체계를 갖는다. 포유동물의 정자형성 과정은 세정관(seminiferous tubule)과 간질세포(interstitial cell)의 복잡한 방식으로 상호작용하면서 이루어진다. 한편, 정원 줄기세포는 자기 재생(self-renewal)과 정자를 생산할 수 있는 능력을 갖는다. 쥐의 경우 하나의 정원 줄기세포가 정모세포(spermatocyte)로 되는데 약 10번의 분열을 한다. 즉, 1개의 줄기세포(stem cell)가 1024개의 정모세포(spermatocytes)가 되고 일련의 감수분열을 거치면 4096개의 정자(spermatozoa)가 형성되는 것이다. 물론 이중 75 내지 90%는 세포사멸화(apoptosis) 과정을 통해 사라진다.

분리한 생식세포를 이용하여 체외에서 정자형성과정을 제현하려는 시도들이 있었으나 대부분 성공하지 못하였으며, 생쥐의 미성숙 생식세포를 세르톨리 세포(sertoli cell)와 공배양하여 반수체의 정자세포(spermatid)로 분화하는데 성공하였으나(Rassoulzadegan 등, 1993), 아직도 체외에서의 정자형성은 기술적인 한계가 있다. 정원세포 분리는 제한적이고, 배양시 많은 정원세포가 죽기 때문에 정원세포의 배양이 어려우며, 특히 정원 줄기세포와 분화된 정원세포간의 구별이 가능한 형태학적, 생화학적인 마커가 없다는 것이 가장 큰 어려움이다(Nagano 등, 1998; van Pelt 등, 2002).

이에 본 발명자 들은 돼지 정자세포 유래 생식세포 및 배양체계를 확립하고 돼지 정원 줄기세포의 저온배양법에 의한 장기체외배양에 성공함으로서 본 발명을 완성하게 되었다.

한편, 줄기세포 체외배양과 관련된 종래기술로는 한국공개특허 제10-2011-0076264호(인간 태반 유래지지 세포를 이용한 생쥐 배아줄기세포의 배양방법 및 그 배양 배지), 한국공개특허 제10-2005-0081524호(양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법) 등이 있다.

본 발명자는 돼지 정소로부터 분리한 정소세포를 저온배양하여 정원 줄기세포의 생성 및 확립됨을 실험적으로 확인하였고, 저온배양법에 의해 확입된 정원 줄기세포의 장기 체외배양에 성공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 포유동물 정원 줄기세포를 체외에서 장기간 배양할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

또한, 포유동물 정원 줄기세포의 체외 장기배양을 통해 수득하는 정원 줄기세포주를 제공하는데 본 발명의 다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포유동물 정원 줄기세포를 3개월 이상 장기 배양하는 방법을 제공한다.

(1) 포유동물의 정소를 수득하는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의해 수득된 정소의 조직에 콜라게나제(collagenase), 디엔에이 가수분해 효소(Dnase), 콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor) 및 히알루로니다아제(hyaluronidase)로 1차 처리한 후, 콜라게나제(collagenase), 디엔에이 가수분해 효소(Dnase) 및 콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)로 2차 처리하여 정소세포를 분리하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 분리된 정소세포를 stempro 34 배지를 사용하여 30 내지 40℃에서 저온배양하는 단계; 및(4) 상기 (3)단계에서 배양된 정소세포에서 생성된 정원 줄기세포를 확인하는 단계.

상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 한다.

상기 (2)단계에서 효소 처리는 1차, 2차 각각 5 내지 10분간 처리하는 것을 특징으로 한다.

상기 (3)단계에서 배지는 knock out serum replacement(SR), GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor, LIF(leukaemia inhibitory factor), bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 체외 배양된 포유동물 정원 줄기세포주 및 돼지 정원줄기세포주를 제공한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 돼지 정소로부터 분리한 정소세포를 30 내지 40℃의 온도조건에서 저온배양하여 3개월 이상의 장기 체외배양을 할 수 있는 배양방법을 제공함으로써, 포유동물의 정소로부터 정원 줄기세포를 간편한 방법으로 분리 및 정제하여 체외에서 높은 생존율을 유지하면서 배양할 수 있는 효과가 있다. 또한, 상기 배양방법에 의해 배양된 포유동물 정원 줄기세포주를 수득할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 5일령 및 180령 돼지 정소의 조직학적 분석결과.
도 2 는 5일령 정소와 180일 정소에서의 PGP9.5 발현 분석 결과.
도 3 은 정소 유래 세포에서의 생식세포 마커 발현을 확인한 결과.
도 4 는 다양한 온도조건을 이용한 돼지 정원 줄기세포주를 확립한 결과.
도 5 는 돼지 정소 유래 세포의 온도별 성장곡선을 나타낸 그래프.
도 6 은 다양한 온도조건에서의 정원 줄기세포군집수를 확인한 그래프.
도 7 은 다양한 온도조건에서의 세포주기를 확인한 결과.
도 8 은 다양한 온도조건에서의 세포 증식력을 확인한 그래프.
도 9 는 다양한 온도조건에서으 돼지 정원 줄기세포의 특징을 분석한 결과.
도 10 은 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포의 RNA 발현을 확인한 결과.
도 11 은 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포의 단백질 발현을 확인한 결과.
도 12 는 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포의 면역 염색한 결과.
도 13 은 돼지 정원 줄기세포주의 염색체를 분석한 결과.
도 14 는 mRFP가 발현하는 돼지 정원 줄기세포를 이식한 면역결핍 마우스의 세정관을 나타낸 사진.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 5일령 돼지 정소와 180일령 돼지 정소의 조직학적 분석 및 정원 줄기세포 마커 발현 비교

5일령 과 180일령 돼지 정소를 H&E staining 을 통해 염색한 후 관찰한 결과 5일령 돼지 정소는 세정관 형성은 완성 되었으나 정원 줄기세포들이 아직까지 세정관의 중심부쪽에 존재 하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 180령 돼지 정소에서는 정조세포, 정자세포, 정자 등의 많은 생식 세포가 관찰 되었으나 5일령 돼지 정소에서는 도 1.에 나타낸 바와 같이 세정관 안에 세르톨리 세포와 정조세포(정원 줄기세포)만 존재하는 것을 확인하였다.

한편, 돼지 정원 줄기세포 마커인 PGP9.5를 염색해본 결과 5일령 정소에서는 H&E staining 결과와 마찬가지로 세정관의 rumen에서 PGP9.5를 발현하는 세포들이 발견 되었으며 180일령 돼지 정소 에서는 base membrane 부위에서 특이 적으로 발견되었다(도 2). 이러한 결과는 PGP9.5 가 돼지에 있어서는 정원 줄기세포 마커라고 할 수 있다.

실험예 2. 5일령 돼지 정소 세포의 생식 세포 마커 발현 확인

(1) 5일령 정소를 농장으로부터 수거한 후 돼지 정소를 둘러싸고 있는 막을 제거한 다음 세정관과 간질 조직을 포함한 돼지 정소를 e-tube 담아 가위를 이용해 잘게 잘랐다. collagenase 0.0005g/ml, Dnase 0.00001g/ml, Soybean trypsin inhibitor 0.0001g/ml, Hyaluronidase 0.0001g/ml의 효소로 37℃에서 5 내지 10분간 1차 처리한 다음 원심분리하여 상기 효소를 제거하였다.

상기 1차 처리시 사용되었던 효소를 제거한 후에 collagenase 0.005g/ml, Dnase 0.00001g/ml, Soybean trypsin inhibitor 0.0001g/ml의 효소로 37℃에서 5 내지 10분간 2차 처리한 다음 원심분리하여 2차 처리시 사용되었던 효소를 제거한 후 Red Blood Ccell lysis buffer를 5분간 처리하여 RBC를 제거하였다.

(2) 상기와 같이, 5일령 돼지 정소를 효소를 이용하여 분리한 후 생식세포 마커 발현을 확인한 결과 도 3.에 나타난 바와 같이, PGP9.5, PLZF, DAZL 의 발현이 거의 비슷한 비율의 세포에서 발견되었으며 세르톨리 세포 마커인 GATA4와 레디히 세포 마커인 LHR를 발현 하는 세포를 확인하였다.

실험예 3. 다양한 온도조건을 이용한 돼지 유래 정원 줄기세포 확립.

31℃, 34℃, 37℃ 조건에서 Stempro 34 배지를 이용하여 상기 실험예 2.에 의한 효소에 의해 분리된 5일령 돼지의 정소 세포를 배양한 결과 각각의 온도 조건에서 정원 줄기세포 군집을 관찰하였다. 한편, 배양조건은 다음과 같다.

ⅰ) 10% knock out serum replacement (SR) 가 첨가된 PBS solution을 이용하여 효소를 제거한 후 Stempro 34 media 에 배양하였다(Stempro34 medium, 1% knock out SR, 10ng/ml GDNF[glial cell line-derived neurotrophic factor], 10ng/ml bFGF[basic fibroblast growth factor], 1000 iu LIF[leukaemia inhibitory factor], 20ng/ml EGF[epidermal growth factor]).

ⅱ) 30 내지 40℃ 사이에서 배양하며 각각의 온도 조건에 따라 3-7일 간격으로 계대 배양하였다. 계대 배양 시 0.005%Trypsin-EDTA 를 사용여 세포를 플라스틱 디쉬에서 떼어낸 후 새로운 디쉬로 옮겨주었다.

그 결과 도 4.에서 알 수 있듯이, 각각의 온도 조건별로 정원 줄기세포의 모양과 생성시점에 큰 차이를 보였고, 31℃ 조건에서는 5일령, 34℃ 조건에서는 4일령, 37℃ 조건에서는 3일령에 정원 줄기세포 군집을 처음 관찰할수 있었다. 온도가 낮을수록 군집이 빽빽하고 둥근 모양을 보였다.

한편, 도 5.에서 알 수 있듯이, 세가지 온도 조건별 세포수 증식을 확인해 본 결과 온도가 높아질수록 세포의 증식이 빨라졌으며 전체 세포의 수가 2배가 되는 시점에 정원 줄기세포 군집이 나타나는 것을 확인 할 수 있었고, 각각의 온도 조건에서 정원 줄기세포 군집 수를 확인한 결과 37℃ 에서는 3일령 처음 정원 줄기세포 군집이 생긴 후 군집수에 변화가 없었으나, 34℃, 31℃ 조건에서는 날짜가 지날수록 꾸준히 정원 줄기세포주 군집이 늘어나는 것을 확인 하였고 전체 군집 수도 37℃ 조건에 비해 20% 이상 상승 하는 것을 보여주었다(도 6).

또한, 도 7.에 나타낸 바와 같이, 31℃, 34℃, 37℃에서의 정원 줄기세포와 feeder 세포의 세포 주기를 확인한 결과 정원 줄기 세포군집이 생기는 시점에서는 모든 조건에서 feeder 세포에서 많은 수의 세포들이 분열 하고 있으며 계대를 넘길 시기에는 34℃와 37℃에서는 feeder 세포의 분열이 정원 줄기세포의 분열보다 많이 일어 났고 많은 세포들이 G0 시기에 정지해 있었으나 31℃ 조건에서의 정원 줄기세포는 계대를 넘길 시기에도 계속해서 분열하고 있음을 확인하였다.

동일한 조건에서 세포 증식력을 확인한 결과 온도가 올라 갈수록 세포 증식력은 상승 하였으나 정원 줄기세포와 feeder 세포의 증식력 차이 역시 커지는 것을 확인하였고(도 8), 다양한 조건에서 형성된 돼지 정원 줄기세포주를 AP 염색을 한 결과 온도가 내려갈수록 AP 염색이 진해 지는 것을 확인 하였고 RT-PCR 결과 정원 줄기세포 마커인 PGP9.5와 PLZF 의 발현이 온도가 높아질수록 감소하는 것을 확인하였으며, 미분화 마커인 OCT4와 NANOG의 발현이 31℃에서 특이적으로 나타났다. WB(western blotting)을 통해 단백질 발현을 확인한 결과 온도가 올라갈수록 PLZF, PGP9.5, OCT4의 발현이 감소 하는 것을 확인하였다(도 9). 이러한 결과를 바탕으로 31℃ 배양 조건에서 돼지 정소유래 정원 세포를 3개월 이상 체외 배양에 성공하였다.

실험예 4. 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포의 특성 분석

31℃ 조건에서 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포를 RT-PCR 방법을 통해 마커 발현을 확인해본 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 정원 줄기세포 마커인 PGP9.5와 PLZF 의 발현이 정소에 비해 높게 나타 났으며 분화된 생식세포의 마커인 KIT의 발현은 상대적으로 낮게 나타나는 것을 확인하였다. 또한 미분화 마커인 OCT4, NANOG, THY-1의 발현이 정소 조직에서보다 특이 적으로 높게 발현 하였으며 레디히 세포 마커인 LHR의 발현은 매우 적게 나타났다.

Western blotting을 이용하여 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포의 단백질 발현을 확인한 결과 도 11.에서 알 수 있듯이 PGP9.5, PLZF, OCT 의 발현이 5일령 그리고 180일령 돼지 정소조직에서 보다 특이적으로 높게 발현됨을 확인하였다.

면역 염색을 통해 기존에 알려진 돼지 정원 줄기 세포 마커인 PGP 9.5와 DBA lectin 발현을 확인 한 결과 도 12.에서 알 수 있듯이, 돼지 정원 줄기 세포 군집에서 특이적으로 발현됨을 확인 하였고, 세르톨리 세포 마커인 GATA4와 레디히세포 마커인 LHR는 발현하지 않음을 확인하였다.

1달 이상 체외 배양된 돼지 유래 정원 줄기세포주의 염색체를 분석한 결과 는 도 13.에 도시한 바와 같이, 38, XY 의 정상 karyotype 을 보였으며 염색체의 교차, 손실 또한 발견되지 않았다.

또한 돼지 정원 줄기세포내로 렌티 바이러스를 이용하여 외래 유전자인 mRFP를 도입한 후 면역 결핍 마우스의 정소로 이식한 결과, 이식 6주후 이식된 돼지 정원 줄기세포가 정조 세포가 존재하고 있는 부위인 세정관의 basal membrane 으로 이동하여 생착한 것을 확인하였다(도 14).

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

1. 다음의 단계를 포함하는 포유동물 정원 줄기세포를 3개월 이상 장기 배양하는 방법:
   (1) 포유동물의 정소를 수득하는 단계;
   (2) 상기 (1)단계에 의해 수득된 정소의 조직에 콜라게나제(collagenase), 디엔에이 가수분해 효소(Dnase), 콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor) 및 히알루로니다아제(hyaluronidase)로 1차 처리한 후, 콜라게나제(collagenase), 디엔에이 가수분해 효소(Dnase) 및 콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)로 2차 처리하여 정소세포를 분리하는 단계;
   (3) 상기 (2)단계에 의해 분리된 정소세포를 stempro 34 배지를 사용하여 30 내지 40℃에서 저온배양하는 단계; 및
   (4) 상기 (3)단계에서 배양된 정소세포에서 생성된 정원 줄기세포를 확인하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 배양방법.
   
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 (2)단계에서 효소 처리는 1차, 2차 각각 5 내지 10분간 처리하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 (3)단계에서 배지는 knock out serum replacement(SR), GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor, LIF(leukaemia inhibitory factor), bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor)를 포함하는 하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
   
5. 제1항의 방법에 의해 체외 배양된 포유동물 정원 줄기세포주.
   
6. 제2항의 방법에 의해 체외 배양된 돼지 정원 줄기세포주.
   
   
   

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