KR20140056475A - Method for mass production of recombinant protein of antibacterial peptide beta-defensin 3 and homologs thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타 디펜신 펩타이드 생산시 숙주를 보호하면서 동시에 대량 생산할 수 있는 방법 및 그에 관한 베타 디펜신 생산용 배지 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for mass production of an antimicrobial peptide beta -
인간 베타 디펜신 (beta-defensin) 펩타이드 (peptide)는 피부 및 다양한 신체 조직이 발현하는 천연의 항균 펩타이드 (anti-microbial peptide)로 생체 면역 체계에 가장 중요한 선천성 면역계(innate immune system)를 구성한다. 특히 베타 디펜신들은 다양한 상피세포(epithelial cells)에서 발현되며, 이러한 펩타이드들의 정상적 발현은 피부 및 상피세포에 정상적 미생물천이를 유지 및 조절하는 기능을 수행한다. 이러한 조절성 항균펩타이드들의 발현이 감소되면 비정상적인 미생물 천이가 유발되고, 이는 다양한 피부질환 및 접촉성 피부염의 고착화 혹은 만성화의 원인이 되기도 한다. 특히 인간 베타 디펜신-2와 -3의 감소가 아토피 피부염 환자의 병변 부위에서 아토피 피부염의 만성화의 중요한 원인이라고 보고되고 있다. 베타 디펜신은 수십 개의 아미노산으로 구성되는 단일의 폴리펩타이드로 6개의 시스테인 (cysteine) 잔기가 분포되어 3개의 이황화결합 (disulfide bond)에 의한 특이적인 구조를 가지고 있다. 이러한 베타 디펜신들은 수개의 중합체 (polymerization)를 이루어 미생물 세포막에 치명적인 구멍 (pore)을 형성하여 사멸작용을 나타낸다. 현재까지 다양한 분자생물학적 연구개발에 의해 수개의 인간 베타 디펜신들이 보고되었으며, 그 중 베타 디펜신-1, -2, 그리고 -3이 피부 세포에 중요하다고 알려져 있다. 본 발명자들은 인간 베타 디펜신의 항균활성에 필수적인 3개의 시스테인 간 구조를 동일하게 갖고 있으며 지금까지 보고되지 않은 새로운 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 존재를 인간 피부세포로부터 확인하고, 이 유전자를 클로닝한 후, 특징화하였으며, 재조합 단백질로 발현하여 항균활성을 확인하고 이러한 신규 펩타이드가 향후 아토피 피부염을 비롯한 다양한 피부 개선용 화장품, 의약외품 및 의약소재로 사용할 수 있음을 특허 등록하였다 (특허문헌 1). The human beta-defensin peptide is a natural anti-microbial peptide that expresses skin and various body tissues and constitutes the most important innate immune system in the living body's immune system. In particular, betadifenes are expressed in a variety of epithelial cells, and normal expression of these peptides functions to maintain and regulate normal microbial transitions in skin and epithelial cells. Decreasing the expression of these modulatory antimicrobial peptides leads to abnormal microbial transitions, which can lead to the fixation or chronicization of various skin diseases and contact dermatitis. Particularly, the decrease in human beta -diphenes-2 and -3 is reported to be an important cause of chronicity of atopic dermatitis in lesions of atopic dermatitis patients. BetaDiphenes is a single polypeptide consisting of several tens of amino acids, with six cysteine residues distributed and has a specific structure due to three disulfide bonds. These beta -diphenes are polymerized to form lethal pores in the microbial cell membrane, resulting in death. To date, several human beta-diphenes have been reported by a variety of molecular biological research and development, among which beta -diphenesin-1, -2, and -3 are known to be important for skin cells. The present inventors have confirmed the existence of a new beta-
그러나 재조합단백질로 인간 베타 디펜신을 생산하는 경우 발현 숙주에 대한 killing effect 때문에 높은 효율의 재조합단백질 생산이 어려워 상용화에 걸림돌이 되었다. However, in the case of producing human betadiphene as a recombinant protein, production of recombinant protein with high efficiency was hindered due to the killing effect on the expression host.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위하여, 배양 후 IPTG 발현 시 높은 농도의 유 및 무기염류를 혼합 첨가하여 발현 수율을 높이는 방법과 높은 rpm의 shaking 혹은 aeration을 통해 발현 수율을 높이는 방법들을 개발하였으며, 이러한 방법들을 활용하여 그렇지 않은 경우보다 최대 5배 이상의 숙주 보호와 발현 증대를 획득하여 본 발명을 완성하였다.In order to solve the above problems, the present inventors have developed a method of increasing the expression yield by mixing a high concentration of oil and inorganic salts when expressing IPTG after culturing and a method of increasing the expression yield by shaking or aeration at a high rpm Using these methods, the host protection and expression increase of up to 5 times higher than those not obtained were obtained to complete the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 베타 디펜신 단백질의 대량 생산방법 및 베타 디펜신 단백질 생산용 배지 조성물을 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for mass production of beta -dipenesin protein and a medium composition for beta-adrenergic protein production.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 형질전환 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing a recombinant protein using a transforming microorganism,
MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. Adding MgCl2 and CaCl2 to a culture medium for producing a recombinant protein, and culturing the transformed microorganism.
본 발명에 있어서, 상기 MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1 ~ 5중량부 및 0.1 ~ 5중량부를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the MgCl 2 and CaCl 2 may be added in an amount of 0.1 to 5 parts by weight and 0.1 to 5 parts by weight, respectively, based on 100 parts by weight of the culture medium.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 추가할 수 있다. In the present invention, KCl may be further added to the medium.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 베타 디펜신 3 및 그 유사체이다. In the present invention, the recombinant protein is
본 발명에 있어서, 상기 배지에 IPTG(Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) may be added to the culture medium to culture the transformed microorganism.
본 발명은 또한, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호 하는방법을 제공한다.The present invention also provides a method for protecting a transforming microorganism from apoptosis, which comprises culturing a transforming microorganism by adding MgCl 2 and CaCl 2 to a culture medium for producing a recombinant protein.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 추가할 수 있다. In the present invention, KCl may be further added to the medium.
본 발명은 또한, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산용 배양 배지 조성물을 제공한다.The present invention also provides a culture medium composition for producing a recombinant protein comprising MgCl 2 and CaCl 2 .
본 발명에 있어서, 상기 MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1 ~ 5중량부 및 0.1 ~ 5중량부인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the MgCl 2 and CaCl 2 may be 0.1 to 5 parts by weight and 0.1 to 5 parts by weight, respectively, based on 100 parts by weight of the culture medium.
본 발명에있어서, 상기 배지에 KCl을 추가할 수 있으며, 배지 100중량부에 대하여 0.1~5중량부로 포함할 수 있다. In the present invention, KCl may be added to the culture medium, and the content may be 0.1 to 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the culture medium.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질 생산용 배양 배지는 트립톤, NaCl, 및 효모 추출물을 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the culture medium for producing the recombinant protein may be a medium containing tryptone, NaCl, and yeast extract.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 LB 배지 또는 2x YTA 배지일 수 있다.In the present invention, the medium may be LB medium or 2x YTA medium.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the microorganism may be E. coli.
본 발명은 또한, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산시 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호하기 위한 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for protecting a transformed microorganism from apoptosis in the production of a recombinant protein comprising MgCl 2 and CaCl 2 .
본 발명에 있어서, 상기 MgCl2 및 CaCl2는 조성물 100중량부에 대하여 각각 0.1 ~ 5중량부 및 0.1 ~ 5중량부인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, MgCl 2 and CaCl 2 may be 0.1 to 5 parts by weight and 0.1 to 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 추가적으로 더 포함할 수 있으며, 비율은 조성물 100중량부에 대하여 0.1~5 중량부이다. In the present invention, the culture medium may further include KCl in an amount of 0.1 to 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition.
본 발명에 있어서, 상기 각각의 염들을 바람직하게는 동일한 비율로 포함하는 것도 좋다. In the present invention, it is also preferable that each of the salts is contained preferably in the same ratio.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 KCl, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양시, 배양물을 400~500rpm으로 회전하면서 진탕 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the method may include culturing the transformed microorganism by adding KCl, MgCl 2, and CaCl 2 to a culture medium for producing a recombinant protein, and culturing the culture while shaking the culture at 400 to 500 rpm .
본 발명에 있어서, 상기 배양물에 외부 공기를 제공하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the culture may be provided by supplying external air to the culture.
본 발명에 따른 방법 및 배지 조성물을 이용하면, 종래에 숙주세포를 이용한 재조합 단백질 생산시 발생하는 숙주세포 사멸(killing-effect)로부터 숙주세포를 보호함으로써, 단백질 발현 증대를 획득할 수 있다. Using the method and media composition according to the present invention, it is possible to obtain an increase in protein expression by protecting a host cell against host killing-effect which occurs in the production of a recombinant protein using a host cell.
도 1은 본 발명에 따른 베타 디펜신 3H(homolog) 유사체 발현시 숙주 균체량에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 2는 1mM IPTG 5시간 유도된 베타 디펜신 3H의 숙주 단백질 내 발현 비율을 확인한 결과이다.
도 3은 다양한 염처리를 통한 베타 디펜신 3H 발현으로부터 숙주세포의 세포 사멸 보호효과를 확인한 그래프이다.
도 4는 다양한 염처리가 베타 디펜신 3H 발현 비율에 영향을 미치는지 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 다양한 rpm 조건을 가지는 진탕 배양 및 외부 공기 주입에 따른 숙주 세포 사멸 보호효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 베타 디펜신 3 유사체 클로닝시의 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다. FIG. 1 is a graph showing the effect of the present invention on the amount of host cells when expressing beta -
FIG. 2 shows the results of confirming the expression ratio of beta -
FIG. 3 is a graph showing the effect of protecting the apoptosis of host cells from beta -
FIG. 4 shows the result of confirming whether or not the various salt treatments affect the beta -
FIG. 5 is a graph showing the protective effect of host cell death by shake culture and external air injection with various rpm conditions.
FIG. 6 shows a cleavage map of an expression vector at the time of cloning of a betadiphenesin analog according to the present invention.
본 발명은, 일 관점에서, 형질전환 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention provides a method for producing a recombinant protein using a transforming microorganism, comprising the step of adding MgCl 2 and CaCl 2 to a culture medium for producing a recombinant protein to culture the transforming microorganism .
본 발명에 있어서, 상기 배양 배지에 KCl을 더 포함할 수 있다. In the present invention, the culture medium may further contain KCl.
본 발명은 또한, 다른 관점에서, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호 하는방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention also relates to a method for protecting a transforming microorganism from apoptosis, which comprises culturing a transforming microorganism by adding MgCl 2 and CaCl 2 to a culture medium for producing a recombinant protein.
본 발명에 있어서, 상기 배양 배지에 KCl을 더 포함할 수 있다. In the present invention, the culture medium may further contain KCl.
본 발명에서의 형질전환 미생물을 이용한 재조합 단백질 생산방법은, 일반적으로 본 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 숙주세포를 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산할 시에, 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 벡터를 숙주세포 (예컨대, 대장균 등)에 형질전환 시킨 후, 이러한 형질전환된 미생물을 배양 배지에 배양하여 목적 단백질을 수득하는 방식을 의미한다.The method for producing a recombinant protein using the transforming microorganism according to the present invention includes a gene encoding a desired protein or peptide when a recombinant protein is mass produced using host cells as generally known in the art Means a method of transforming a recombinant vector into a host cell (such as Escherichia coli), and then culturing the transformed microorganism in a culture medium to obtain a target protein.
특히, 대장균의 경우, 대장균의 빠른 증식, 높은 발현 수율의 장점으로 인해 우수한 재조합 단백질 발현시스템으로 이용되고 있다. 그러나, 이러한 목적 단백질이 항균 펩타이드인 경우에, 축적된 단백질 산물이 생산 숙주세포에도 독성을 보일 가능성이 높고, 발현 산물의 독성을 피하기 위해 생산 숙주는 수용액(soluble) 상 단백질을 생산하는 대신 변성된 봉입체 (inclusion body) 단백질로 생산할 가능성이 높다. 또한, 발현 산물의 독성을 피하기 위해서는 생산 숙주는 증대된 단백질 가수분해 활성으로 목적 단백질을 분해할 가능성이 높다는 한계점이 존재한다.In particular, Escherichia coli has been used as an excellent recombinant protein expression system because of the advantages of high proliferation and high expression yield of E. coli. However, when the target protein is an antimicrobial peptide, the accumulated protein product is highly likely to be toxic to the production host cell, and in order to avoid the toxicity of the expression product, the production host is not a soluble protein, It is likely to produce inclusion body proteins. Further, in order to avoid the toxicity of the expression product, there is a limitation that the production host has a high possibility of decomposing the target protein due to the increased protein hydrolysis activity.
이러한 한계점을 극복하기 위해 기존에는 대장균에서 잘 발생되지 않는 코돈을 대장균에서 흔히 발생되는 코돈으로 대체하거나, 수용액상 발현을 증대시킬 수 있는 다른 단백질과 융합 단백질(fusion protein) 형태로 생산하거나, 혹은 목적 단백질을 여러개 연결적으로 반복시켜(tendem repeat) 발현 정도를 증가시키는 방법들도 이용되어 왔다. In order to overcome these limitations, codons which are not generated in Escherichia coli in the past may be replaced with codons commonly found in Escherichia coli, or produced in the form of other proteins and fusion proteins capable of increasing aqueous phase expression, Several methods have been used to increase the expression level by repeatedly repeating the protein (tendem repeat).
본 발명자들은, 특히, 베타 디펜신 3 유사체 생산시에 발현 숙주에 대한 높은 세포사멸효과(killing effect) 때문에 재조합 단백질 생산이 어려웠던 점을, 특정 염의 처리와 특정 rpm에서의 진탕 배양 및 외부 공기 주입을 통해 해소하고자 했다. The inventors found that the production of recombinant proteins was difficult due to a high killing effect on the expression host during the production of the beta -diphenes-3 analogue, .
구체적으로, 목적 단백질 생산시에는, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 전배양한다. 이때 전배양 조건은, 하기 실시예에 나타난 것으로 제한되지는 않으나, 예컨대 항생제 함유된 LB 배지에서 하룻밤 정도 배양할 수 있다. Specifically, at the production of the target protein, the transformed microorganism transformed with the vector containing the gene encoding the target protein is pre-cultured. At this time, the pre-culture conditions are not limited to those shown in the following examples, but they can be cultured for example overnight in LB medium containing antibiotics.
상기 LB 배지 이외에도 2x YTA 배지를 사용할 수 있다. In addition to the LB medium, 2x YTA medium may be used.
이렇게 전배양한 후에, 동일한 조성의 배지에서 진탕 배양 후에, 목적 단백질의 생산 수율을 높이기 위해, IPTG를 첨가할 수 있다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, IPTG를 첨가하는 경우 목적 단백질의 발현 수율은 증가되지만, 형질전환된 미생물의 균체량이 상당히 감소하게 된다. IPTG 처리는 0.5~2mM을 처리하고, 처리후 3~8 시간을 배양함으로써 induction하여 발현을 유도하는 것이 목적 단백질 생산 수율 극대화를 위해 적절할 것이다. After this pre-culture, IPTG may be added after shake culture in a medium of the same composition to increase the production yield of the target protein. As shown in the following examples, when IPTG is added, the expression yield of the target protein is increased, but the amount of the transformed microorganism is significantly reduced. The IPTG treatment may be induced to induce expression by treating 0.5 to 2 mM and culturing for 3 to 8 hours after the treatment, so that the yield of the target protein production may be maximized.
이러한 숙주세포의 세포 사멸 효과를 막기 위해서, 본 발명에서는, KCl, MgCl2, 및 CaCl2를 추가적으로 처리하였다. 이러한 염들의 처리는, IPTG를 배양 배지에 처리 전, 또는, IPTG와 동시에 배양배지에 처리, 또는 IPTG를 배양배지에 처리한 후에 처리할 수 있다. In order to prevent the apoptotic effect of such host cells, KCl, MgCl2, and CaCl2 were additionally treated in the present invention. Treatment of these salts may be effected either before treatment of the IPTG in the culture medium, or simultaneously with the culture medium with IPTG, or after treating the IPTG with the culture medium.
다만 IPTG와 염의 처리 간격이 10분내 인 것이 바람직하며, 처리 후에는 5시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. However, it is preferable that the treatment interval with IPTG is within 10 minutes, and it is preferable to culture for 5 hours after the treatment.
또한, 본 발명에서는, 상기 방법에서 IPTG와 염 처리 후에 진탕 배양을 3 시간 내지 8시간동안 수행함으로써 숙주세포 사멸로부터의 보호와 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있다. Further, in the present invention, in the above method, shaking culture after IPTG and salt treatment is carried out for 3 hours to 8 hours to protect against host cell death and mass production of target protein.
또한, 본 발명에서는, 상기 방법에서 외부에 공기를 주입함으로써 숙주세포 사멸로부터의 보호와 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있다. 구체적인 조건은, 이에 제한되는 것은 아니나, 에어스톤 및 제균용 필터를 포함한 기포 발생기를 이용해 분당 5~10L의 공기를 목적 단백질을 유도하는 5시간 동안 공급한다. In addition, in the present invention, air can be injected to the outside in the above-described method to protect against host cell death and mass production of the target protein. Specific conditions include, but are not limited to, 5 to 10 L of air per minute using a bubble generator including an air stone and a filter for sterilization for 5 hours to induce the target protein.
본 발명에 있어서, 숙주세포로 이용될 수 있는 미생물로는 대장균일 수 있따.In the present invention, the microorganism that can be used as a host cell may be Escherichia coli.
본 발명에 있어서, 상기 KCl, MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1 내지 5중량부를 첨가할 수 있다. In the present invention, 0.1 to 5 parts by weight of KCl, MgCl 2 and CaCl 2 may be added to 100 parts by weight of the culture medium.
상기 세가지 염이 동일한 비율로 포함될 수도 있다. These three salts may be contained in the same ratio.
이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 상기 범위 이상에서도 동등 또는 그 이상의 단백질 생산 효과를 낼 수 있다. Such a ratio is merely a preferable range, and the protein production effect equivalent to or higher than the above range can be obtained.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 베타 디펜신 (beta-defensin) 또는 그 유사체인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the recombinant protein may be characterized by being beta-defensin or the like.
본 발명에 있어서, 상기 베타 디펜신은 본 출원시 이전에 기술분야에 널리 알려져 있는 물질로, 본 발명의 명세서 배경기술에도 설명된 바 있으며, 특히, 본 발명에서는 베타 디펜신 -1, 베타 디펜신-2, 베타디펜신-3, 베타디펜신-4, 또는 그 유사체(homolog)일 수 있다. 여기서, 유사체란, 인간 베타 디펜신 -1, 2, 3, 4와 동일한 항균활성 구조(세개의 시스테인간 결합구조)를 갖고 높은 서열 상동성(10, 15, 20, 50 내지, 60 내지, 62, 70 내지, 80 내지 ~99.9%)을 보이는 유사체를 의미한다. In the present invention, the beta -dipensin has been previously known in the art and has been described in the background of the present invention. In particular, in the present invention, beta -dipensin-1, 2, betadipenin-3, betadipenin-4, or a homolog thereof. Here, an analogue has the same antimicrobial activity structure (three cysteine bond structures) as human beta -dipenesin-1, 2, 3 and 4 and has high sequence homology (10,15,20,50-60, , 70 to 80% to 99.9%).
본 발명에 있어서, 상기 베타디펜신 - 3 의 유사체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. In the present invention, the analog of betadifenin-3 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 IPTG(Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 형질전환 미생물을 배양할 수 있다. In the present invention, the transformed microorganism can be cultured by adding IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) to the medium.
본 발명은 또 다른 관점에서, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산용 배양 배지 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a culture medium composition for producing a recombinant protein comprising MgCl 2 and CaCl 2 .
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 추가적으로 더 포함할 수 있다. In the present invention, the medium may further include KCl.
본 발명에 있어서, 상기 KCl, MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1~5중량부, 0.1~5중량부 및 0.1~5중량부인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산용 배양 배지 조성물이다.In the present invention, the KCl, MgCl 2 and CaCl 2 are 0.1 to 5 parts by weight, 0.1 to 5 parts by weight and 0.1 to 5 parts by weight, respectively, with respect to 100 parts by weight of the culture medium. to be.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질 생산용 배양 배지는 트립톤, NaCl, 및 효모 추출물을 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the culture medium for producing the recombinant protein may be a medium containing tryptone, NaCl, and yeast extract.
본 발명은 또한, 다른 관점에서, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산시 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호하기 위한 조성물에 관한 것이다. The present invention also relates, in another aspect, to a composition for protecting a transforming microorganism from apoptosis in the production of a recombinant protein comprising MgCl 2 and CaCl 2 .
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 포함할 수 있다. In the present invention, the medium may further include KCl.
본 발명에 있어서, 상기 KCl, MgCl2 및 CaCl2는 조성물 100중량부에 대하여 각각 0.1~5중량부이다. In the present invention, the KCl, MgCl 2 and CaCl 2 are each 0.1 to 5 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition.
본 발명에 있어서, KCl, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양시, 배양물을 400~500rpm으로 회전하면서 진탕 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, when the transformed microorganism is cultured by adding KCl, MgCl 2 and CaCl 2 to a culture medium for producing recombinant proteins, the culture may be shake-cultured while being rotated at 400 to 500 rpm.
본 발명에 있어서, 상기 배양물에 외부 공기를 제공하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the culture may be provided by supplying external air to the culture.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for illustrating the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
인간 베타 디펜신 3 유사체 생산에 따른 숙주세포 Kiinge effect 확인 Identification of host cell Kiingea effect by production of human beta-
(1) 6His-tag를 갖는 발현 벡터 클로닝(1) Expression vector cloning with 6His-tag
클로닝된 새로운 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)를 재조합 단백질로 발현하기 위한 발현벡터로의 클로닝은, 대한민국 등록특허 10-0991293호의 등록공보에 기재된 제조과정을 기반으로 하여, 다음과 같이 수행하였다. 우선 유전자 서열(서열번호 2로 확인된 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)의 cDNA 서열을 바탕으로 sense와 antisense의 각각 말단에 BamH I과 Nde I 제한효소 인식서열을 함유하는 프라이머를 디자인하고, 상기의 정제된 TA cloning 플라스미드를 주형으로하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물을 agarose gel에서 정제한 후, BamHI과 NdeI 제한효소들로 동시 절단하였다. 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)를 pET-41b(+) 단백질 발현용 벡터로 클로닝하기 위하여 pET-41b(+) 벡타를 역시 BamHI과 NdeI 제한효소들로 동시 절단하였다. 이 제한효소 처리 산물을 agarose gel 전기영동 후 제한효소 절단이 확인된 벡터들만을 gel extraction으로 분리 정제하였다. 상기에서 제한 효소 동시 처리 후 준비된 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)와 pET-41b(+) 단백질 발현용 벡터를 1:1 몰비로 ligation하여 BL21에 형질전환 하였다. 형질전환 시킨 후 kanamycin이 100 ug/ml 농도로 첨가된 LB agar plate에 도말하한 다음 37에서 배양하였다. 잘 자란 콜로니들을 골라 동일 농도의 kanamycin이 함유한 LB배지 10 ml에 접종한 후 37에서 하룻밤 배양하였다. 배양액에서 플라스미드를 정제하고, 정제된 플라스미드를 주형으로 하여 다시 sense primer와 anti-sense primer(서열번호 3 및 서열번호 4) The cloning of a cloned new human beta-
sense primer: 5'-AGTTATTTGAGGAATTCCAC (서열번호 3), sense primer: 5'-AGTTATTTGAGGAATTCCAC (SEQ ID NO: 3),
antisense primer: 5'-TTATTTCTTTCTTCGGCAGCA (서열번호 4)antisense primer: 5'-TTATTTCTTTCTTCGGCAGCA (SEQ ID NO: 4)
를 사용한 PCR에서 정확한 PCR product를 보이는 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니를 적절히 길러 glycerol을 첨가하여 발현 균주 stock을 만들고, 본 항균 단백질을 생산하는 종균으로 사용하였다. 단백질 발현용 pET-41b(+) 벡터로의 클로닝을 위한 발현벡터의 개열지도는 도 6과 같다.Were used to select colonies showing the correct PCR products. The colonies were grown properly and glycerol was added to produce expression strains. The strain was used as a strain producing this antimicrobial protein. The cleavage map of the expression vector for cloning into the pET-41b (+) vector for protein expression is shown in Fig.
(2) 단백질 고효율 생산을 위한 염 처리(2) Salt treatment for high protein production
상기 (1)에서 얻어진 6X histidine tag를 갖는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 함유하는 발현벡터를 갖는 BL21(DE3)를 100 ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 10ml에 접종한 후 30에서 하룻밤 배양하였다(전배양 하였다). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 (조성 tryptone 20 g/liter, NaCl 20 g/liter, yeast extract 10 g/liter) 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660 nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 30도에서 5시간 추가로 배양하였다. BL21 (DE3) having an expression vector containing human beta-
(3) 인간 베타 디펜신 3 유사체의 발현시 숙주 killing 효과 확인(3) Confirmation of host killing effect in expression of human betadiphene-3 analogue
(2)에서 설명된 바와 같이, 2X LBK 배지에서 1mM IPTG로 30도 5시간 발현 유도하는 조건을 바탕으로 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H) 발현 유도가 숙주 E. coli의 생존에 미치는 독성의 정도를 확인하였다. As described in (2), induction of human beta-
발현 유도 직후 (0.1hrs)와 발현 유도 5시간 후 배양 배지의 optical density (at 600nm)를 비교한 결과, 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 유도하기 위해 IPTG를 첨가한 0.1시간 후는 첨가 직전 보다 2% 감소한 98%의 흡광도를 보였으며, 유도 5시간 후는 유도에 의해 발현된 beta-defensin 3H의 숙주 killing effect에 의해 유도 직전의 흡광도에서 14% 감소한 약 86%의 흡광도를 보였다. IPTG를 처리하지 않고 동일한 조건에서 5시간 추가 배양한 대조군에서는 흡광도가 318%로 3배 이상 증가함을 고려하면 beta-defensin 3H 발현에 의한 숙주 균체량 감소를 확인할 수 있었다 (도 1). 비록 재조합단백질 생산 수율을 감소시키는 목적단백질, 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 숙주 killing effect는 확인되었으나 생존한 숙주 균체량으로 부터 목적단백질 발현 비율을 확인한 결과 비교적 높은 양의 beta-defensin 3H가 발현되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 2).
The optical density (at 600 nm) of the culture medium after 5 h of induction of expression (0.1 hrs) and induction of expression was compared with 0.1 h after IPTG was added to induce human beta-
인간 베타 디펜신 3 유사체 고발현을 위한 염 처리 Salt treatment for human Betadiphene-3 analogue high expression
(1) 상기 실시예 1에서의 인간 베타 디펜신 3 유사체의 생산에 있어서, 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 30도에서 5시간 추가로 배양하였다. (1) IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) corresponding to a final concentration of 1 mM was added in the production of human betadiphene-3 analogues in Example 1, followed by further incubation at 30 DEG C for 5 hours .
이때 다양한 염의 처리를 통해 목적 단백질인 beta-defensin 3H의 killing effect를 감소시키고 숙주 보호 효과를 유도하기 위하여 IPTG 처리와 함께 적게는 1 ~ 3% 농도 까지의 다양한 조합(표 1)의 염을 처리한다. 추가적으로 12시간 목적 단백질 생산을 유도하면서 1시간 단위로 600nm에서 흡광도를 측정하여 다양한 염의 처리가 발현 숙주의 생존에 미치는 영향을 분석하였다.
In order to reduce the killing effect of the target protein, beta-
(2) 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 발현 비율에는 영향을 주지 않으며 숙주 killing effect가 감소되는 조건을 탐색하기 위해, 1%씩 각각의 염을 단일 혹은 혼합하는 방식으로 2X LB배지에 들어있지 않은 세 가지 상이한 염들을 조합하여 실험한 결과, 다양한 염의 혼합 처리가 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 숙주 사멸 효과를 크게 낮출 수 있음을 확인하였다 (표 1 및 도 3).(2) To investigate the conditions that do not affect the rate of expression of the human beta-
상대 숙주 생육도 (흡광도) 비율 (%)IPTG treatment group (non-salt treatment)
Relative host viability (absorbance) ratio (%)
구체적으로, 표 1에서 볼 수 있듯이 3종류의 염을 혼합하여 사용하는 경우가 단독으로 사용하는 경우보다 높은 숙주 보호 효과를 확인할 수 있었으며, CaCl2 1%와 MgCl2 1%를 혼합하는 경우와 세종류의 염 모두를 1%씩 혼합하는 경우에서 가장 높은 238±12 %와 245±15 %의 균체가 생존하여 가장 높은 숙주 보호 효과를 확인할 수 있었다 (도 3). 그리고 숙주 보호 효과로 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 숙주 killng effect를 감소시키는 염의 첨가가 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H) 발현 비율 자체에 미치는 영향을 조사하기 위하여 IPTG 발현 이후 동일한 균체량을 샘플로 하여 SDS-PAGE로 조사하였다. Induction 직전 숙주 단백질에서는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 거의 찾아 볼 수 없지만 5시간 induction에서는 크게 증가함을 확인하였다. 다양한 염처리 방법에 따른 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 발현 비율의 차이는 확인되지 않았다 (도 4)
Specifically, as shown in Table 1, when a mixture of three kinds of salts was used, the effect of protecting the host was confirmed higher than that of the case of using alone, and the case of mixing 1% of
인간 베타
실시예 1에서 제조된 6X histidine tag를 갖는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 함유하는 발현벡터를 갖는 BL21(DE3)를 100 ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 10ml에 접종한 후 30에서 하룻밤 배양하였다(전배양 하였다). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 (조성 tryptone 20 g/liter, NaCl 20 g/liter, yeast extract 10 g/liter) 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660 nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG를 첨가하여 30도에서 5시간 추가로 배양하였다. 이때 가장 우수한 숙주 보호 효과를 보이는 염 조합인 KCl 1% + CaCl2 1% + MgCl2 1%를 첨가하였다. 추가적으로 12시간 목적 단백질 생산을 유도하면서 flask shaking의 경우 100 rpm, 200 rpm, 300 rpm, 400 rpm, 그리고 500 rpm의 조건으로 aeration을 증가시켜 숙주 보호 효과를 비교하였다. 외부에서 강제 배기 형태의 aeration의 효과를 실험하기 위하여 미세한 기포의 생성을 위해 에어스톤 및 제균용 filter를 장착한 기포발생기를 설치하고 단백질을 발현하는 5시간 동안 분당 5L의 공기를 제공하여 그 효과를 비교하였다. BL21 (DE3) having an expression vector containing human beta-
더욱 숙주 killing effect를 감소시켜 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 생산 수율을 증대시키기 위하여, 단백질 발현 및 배양 조건의 주요한 인자인 aeration이 미치는 영향을 다양한 rpm 조건에서 시험하였다. 과도한 aeration의 예로 공기발생기를 활용해 외부에서 직접 aeration을 하는 경우도 그 효과를 확인하였다 (도 5). 실험 결과, 본 배양 induction 과정에서 rpm을 높일 수 록 숙주에 대한 보호 효과가 있음을 확인하였으며, KCl 1% + CaCl2 1% + MgCl2 1%의 처리와 같이 적용할 경우 400rpm, 500rpm, 그리고 외부에서 과도한 양의 aeration을 가하는 조건들에서 대조군 대비 5배 이상의 숙주 보호효과를 유발할 수 있음을 확인하였다.
In order to further increase the production yield of human beta-
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the invention is not limited thereby. It will be obvious. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> BIO FD&C <120> Method for mass production of recombinant protein of antibacterial peptide beta-defensin 3 and derivatives thereof <130> 2012-10 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> beta defensin 3 derivative <400> 1 Met Ser Tyr Leu Arg Asn Ser Thr Ser Leu Val Arg Val Pro Lys Ala 1 5 10 15 Phe Leu Lys Pro Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Ile Ala Gly His Gly 20 25 30 Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 35 40 45 Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly Lys 50 55 60 Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 65 70 75 <210> 2 <211> 231 <212> DNA <213> beta defensin 3 derivative <400> 2 agttatttga ggaattccac aagccttgta cgtgtaccaa aagccttcct aaaacctttc 60 cgtgtgtgct gttttgtcat tgcaggtcat ggaggaatca taaacacatt acagaaatat 120 tattgcagag tcagaggcgg ccggtgtgct gtgctcagct gccttccaaa ggaggaacag 180 atcggcaagt gctcgacgcg tggccgaaaa tgctgccgaa gaaagaaata a 231 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 agttatttga ggaattccac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 4 ttatttcttt cttcggcagc a 21 <110> BIO FD & C <120> Method for mass production of recombinant protein of antibacterial peptide beta-defensin 3 and derivatives thereof <130> 2012-10 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> beta defensin 3 derivative <400> 1 Met Ser Tyr Leu Arg Asn Ser Thr Ser Leu Val Arg Val Val Lys Ala 1 5 10 15 Phe Leu Lys Pro Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Ile Ala Gly His Gly 20 25 30 Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Val Gly Gly 35 40 45 Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly Lys 50 55 60 Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 65 70 75 <210> 2 <211> 231 <212> DNA <213> beta defensin 3 derivative <400> 2 agttatttga ggaattccac aagccttgta cgtgtaccaa aagccttcct aaaacctttc 60 cgtgtgtgct gttttgtcat tgcaggtcat ggaggaatca taaacacatt acagaaatat 120 tattgcagag tcagaggcgg ccggtgtgct gtgctcagct gccttccaaa ggaggaacag 180 atcggcaagt gctcgacgcg tggccgaaaa tgctgccgaa gaaagaaata a 231 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 agttatttga ggaattccac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 4 ttatttcttt cttcggcagc a 21
Claims (14)
MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법. A method for producing a recombinant protein using a transforming microorganism,
By the addition of MgCl 2 and CaCl 2 in the culture media for recombinant protein production method comprising the step of culturing a transformed microorganism.
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