KR20140052625A - COLD -INDUCIBLE OsDhn1 GENE AND PROTEIN ENHANCING COLD TOLERANCE - Google Patents

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KR20140052625A
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Abstract

The present invention relates to an OsDhn1 gene and protein which enhance low temperature tolerance. The present invention provides: a composition which includes a gene delivery system with a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a second sequence on a sequence list as an active ingredient, and which enhances the resistance of plants against abiotic stress: a transformed plant cell or a transformed plant in which the composition is introduced; and a production method of the transformed plant cell or the transformed plant.

Description

저온 내성을 증진시키는 저온-유도성 OsDhn1 유전자 및 단백질{Cold -Inducible OsDhn1 Gene and Protein Enhancing Cold Tolerance}Cold-Inducible OsDn1 Gene and Protein Enhancing Cold Tolerance < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 저온 내성을 증진시키는 저온-유도성 OsDhn1 유전자 및 단백질에 관한 것이다.
The present invention relates to low temperature-inducible OsDn1 genes and proteins that promote low temperature tolerance.

한랭, 건조 및 고염(high salinity)과 같은 비생물적 스트레스는 식물의 형태적, 생리적, 생화학적 및 분자적 변화를 야기하며, 최종적으로 식물의 성장 및 생산성에 영향을 주게 된다(Wang et al. 2001). 또한, 이러한 스트레스는 스트레스 내성, 타유전자 발현의 조절 및 스트레스 신호 전달에 중요한 역할을 하는 다양한 유전자의 발현을 유도한다(Ingram and Bartels, 1996; Thomashow, 1999; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Xiong et al., 2002; Shinozaki et al., 2003). 이러한 유전자 중에, LEA(Late Embryogenesis Abundant) 단백질의 2 패밀리군을 암호화하는 디하이드린(dehydrin) 유전자는 종자 발생이나 비생물적 스트레스 하의 영양조직과 같은 탈수 조직에서 발현한다(reviewd by Close, 1996; Allagulova, 2003). 디하이드린 단백질은 세포질, 핵, 미토콘드리아, 액포 및 원형질막 주변부와 같은 다양한 세포 조직에 존재한다(reviewd by Rorat, 2006). 드하이드린이 식물 내에서 어떠한 기능을 하는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았지만, 스트레스 하에 단백질, 효소 활성, 핵산 및 막 구조를 보호하기 위한 분자 샤페론(chaperon)으로 생각되어 왔다(Bray, 1993; Close, 1996; Koag et al., 2003; Peng et al., 2008; Hara et al., 2009).Abiotic stresses, such as cold, dryness and high salinity, cause morphological, physiological, biochemical and molecular changes in plants and ultimately affect plant growth and productivity (Wang et al. 2001). In addition, these stresses induce the expression of various genes that play important roles in stress tolerance, regulation of other gene expression, and stress signaling (Shimano et al., 1999; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; al., 2002; Shinozaki et al., 2003). Among these genes, the dehydrin gene encoding two families of LEA (Late Embryogenesis Abundant) proteins is expressed in dehydrated tissues such as nourishment tissues under seeding or abiotic stress (reviewedd by Close, 1996; Allagulova, 2003). The dihydrin protein is present in various cellular tissues such as the cytoplasm, nucleus, mitochondria, vacuole, and plasma membrane periphery (reviewd by Rorat, 2006). Although the function of dehydrin in plants has not been elucidated yet, it has been thought of as a molecular chaperon to protect proteins, enzyme activities, nucleic acids and membrane structures under stress (Bray, 1993; Close, 1996 ; Koag et al., 2003; Peng et al., 2008; Hara et al., 2009).

지금까지, 피자식물(angiosperms), 겉씨식물(gymnosperms), 양치식물(pteridophytes), 선태식물(bryophytes), 균류(fungi), 조류(algae) 및 남세균(cyanobacteria)과 같은 다양한 생물에서 다수의 다하이드린이 확인되었다(Campbell and Close, 1997; Close 1997; Li et al. 1998; Mtwisha et al. 1998; Shih et al. 2008). 또한, 디하이드린은 RAB16, COR47 및 WCOR410과 같은 다수의 RAB(Responsive to Abscisic acid) 및 COR(Cold-regulated) 단백질을 포함한다(Kusano et al., 1992; Danyluk et al., 1994; Welin et al., 1995; Nylander et al., 2001). 많은 연구에서 디하이드린의 발현이 한랭, 건조 및 염 스트레스와 관련되는 것으로 보고되었다(reviewed by Rorat, 2006). 따라서, 드하이드린 유전자를 이식하여 스트레스 내성 식물을 제조하는 방법이 시도되었다. 예를 들어, 시트러스 디하이드린 유전자인 CuCOR19 및 옥수수 ZmDHN2b를 과발현하는 담배는 한랭 스트레스에 대하여 내성을 나타내었다(Hara et al., 2003; Xing et al., 2011). ERD10, LTI30, RcDhn5DHN -5와 같은 디하이드린 유전자를 과발현한 애기장대는 결빙 및 염과 같은 다양한 비생물적 스트레스에 대하여 내성을 나타내었다(Puhakainen et al., 2004; Brini et al., 2007; Peng et al., 2008).So far, a number of multi-organisms have been developed in a variety of organisms such as angiosperms, gymnosperms, pteridophytes, bryophytes, fungi, algae and cyanobacteria. (Campbell and Close, 1997; Close 1997; Li et al. 1998; Mtwisha et al. 1998; Shih et al. 2008). Also, dihydrins include a number of Responsive to Abscisic acid (RAB) and cold-regulated proteins such as RAB16, COR47 and WCOR410 (Kusano et al., 1992; Danyluk et al., 1994; Welin et al., 1995; Nylander et al., 2001). In many studies, expression of dihydrins has been reported to be associated with cold, dry, and salt stress (reviewed by Rorat, 2006). Therefore, a method of producing a stress tolerant plant by transplanting a dehydrin gene has been attempted. For example, tobacco over-expressing the citrus dihydrine gene CuCOR19 and maize ZmDHN2b showed tolerance to cold stress (Hara et al., 2003; Xing et al., 2011). Arabidopsis overexpressing the dihydrin genes such as ERD10 , LTI30 , RcDhn5, and DHN- 5 showed resistance to various abiotic stresses such as freezing and salting (Puhakainen et al., 2004; Brini et al. 2007; Peng et al., 2008).

디하이드린 유전자를 사용한 벼에서의 이식법은 지금까지 보고되지 않았다. 반면에, 이는 HVA1, PMA1959, PMA80 및 OsLEA3-1과 같은 다른 LEA 단백질을 발현하는 이식 벼가 건조 스트레스에 대한 내성이 증가되는 것으로 보고되었다(Xu et al., 1996; Rohila et al., 2002; Cheng et al., 2002; Xiao et al., 2007). 벼는 인류에게 가장 중요하고 주요한 식용작물이다. 그러므로, 벼에서 스트레스-대응 기작은 스트레스에 대한 내성을 증진시키는데 매우 중요하다. 이를 위해, 벼의 다양한 비생물적 스트레스-대응 유전자에 대한 연구가 필수적이다. 벼의 비생물적 스트레스-대응 유전자 중에서, OsDhn1은 애기장대의 COR47/RD17 및 ERD10, 밀의 WCOR410과 같이 건조-유도 SK3 형 디하이드린을 암호화하는 것을 보고되었다(Lee et al., 2005).
Transplantation in rice using the dihydrin gene has not been reported so far. On the other hand, it has been reported that transgenic rice expressing other LEA proteins such as HVA1 , PMA1959 , PMA80 and OsLEA3-1 are increased resistance to dry stress (Xu et al., 1996; Rohila et al., 2002; Cheng et al., 2002; Xiao et al., 2007). Rice is the most important and major edible crop for mankind. Therefore, the stress-response mechanism in rice is very important in promoting tolerance to stress. To this end, the study of various abiotic stress-responsive genes in rice is essential. Among the abiotic stress-responsive genes of rice, OsDhn1 has been reported to encode dry-induced SK3 type dehydrins such as Arabidopsis COR47 / RD17 and ERD10, wheat WCOR410 (Lee et al., 2005).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 저온 스트레스에 대하여 내성을 증진시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)로부터 스트레스에 의해 유도되는 OsDhn1(Oryza sativa Dehydrin 1) 유전자를 발굴하고 상기 유전자에 의해 형질전환된 식물체가 저온에 대하여 증진된 내성을 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of intensive efforts to discover genes capable of promoting tolerance to cold stress, the present inventors have found that rice ( Oryza sativa Dehydrin 1) gene, which is induced by stress, from sativa , and confirmed that the plant transformed with this gene exhibits enhanced tolerance against low temperature, thereby completing the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 저온에 대한 내성을 증진시키는 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a cold-inducible OsDn1 protein which promotes resistance to low temperatures.

본 발명의 다른 목적은 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a cold-inducible OsDn1 protein.

본 발명의 또 다른 목적은 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.It is yet another object of the present invention to provide a vector comprising a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a cold-inducible OsDn1 protein.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a transformant transformed by the vector of the present invention.

본 발명의 다른 목적은 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a method for producing transgenic plants with enhanced cold stress tolerance.

본 발명의 다른 목적은 저온 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a transgenic plant having low temperature stress tolerance.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하며 식물체에서 과발현되는 경우 상기 식물체에 저온 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 저온-유도성 OsDhn1 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 단백질을 제공한다.
According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a low temperature-inducible OsDn1 protein, which comprises the amino acid sequence of the second sequence of the sequence listing, and which, when overexpressed in the plant, Or more of the amino acid sequence homology.

본 발명자들은 저온 스트레스에 대하여 내성을 증진시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)로부터 스트레스에 의해 유도되는 OsDhn1(Oryza sativa Dehydrin 1) 유전자를 발굴하고 상기 유전자에 의해 형질전환된 식물체가 저온에 대하여 증진된 내성을 나타낸다는 것을 확인하였다.As a result of efforts to discover genes capable of promoting tolerance to cold stress, the present inventors have found that OsDhn1 ( Oryza sativa Dehydrin 1) gene induced by stress from rice ( Oryza sativa ) Showed enhanced resistance to low temperatures.

본 명세서에서 용어 “저온 스트레스”는 저온, 바람직하게는 15℃ 이하, 보다 바람직하게는 12℃ 이하, 가장 바람직하게는 10℃ 이하의 저온에 의한 스트레스를 의미한다.As used herein, the term " cold stress " means stress due to low temperature, preferably 15 DEG C or less, more preferably 12 DEG C or less, and most preferably 10 DEG C or less.

본 발명의 저온-유도성 OsDhn1 단백질은 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내며, 동시에 저온 스트레스에 대한 내성 증진을 할 수 있는 범위 내에서의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 프로그램 (예: ClustalX 및 PROSIS)을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
The low-temperature-inducible OsDhnl protein of the present invention has substantial identity to the above-mentioned amino acid sequence and at the same time is interpreted to include an amino acid sequence within a range capable of enhancing tolerance to cold stress. The above-mentioned substantial identity is determined by aligning the amino acid sequence of the present invention with any other sequence as much as possible, and analyzing the aligned sequence using a program commonly used in the art (for example, ClustalX and PROSIS) Means an amino acid sequence that exhibits at least 80% homology, more preferably at least 90% homology, and most preferably at least 95% homology.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding said cold-inducible OsDn1 protein.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term " nucleic acid molecule " has the meaning inclusive of DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules. In the nucleic acid molecule, the nucleotide which is a basic constituent unit is not only a natural nucleotide, Also included are analogues (Scheit, Nucleotide Analogs , John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990)).

가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열 중 서열번호 99-971의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 프로그램 (예: ClustalX 및 DNASIS)을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
Most preferably, the nucleic acid molecule of the present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 99-971 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The nucleic acid molecules of the present invention that encode the cold-inducible OsDhnl protein are also interpreted to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequences described above. The above-mentioned substantial identity can be determined by aligning the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence as much as possible, and analyzing the aligned sequence using a program commonly used in the art (for example, ClustalX and DNASIS) Means a nucleotide sequence which, in one case, exhibits at least 80% homology, more preferably at least 90% homology, and most preferably at least 95% homology.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 (a) 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된 (operably linked) 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a vector comprising a nucleotide sequence encoding the above cold-inducible OsDn1 protein. According to a preferred embodiment of the present invention, the vector of the present invention comprises (a) a nucleotide sequence encoding a cold-inducible OsDn1 protein and (b) a vector comprising a promoter operably linked to said nucleotide to provide.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.As used herein, the term " operably linked " refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., an array of promoter, signal sequence, or transcription factor binding site) and another nucleic acid sequence, The sequence will control the transcription and / or translation of the different nucleic acid sequences.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this can be found in Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), which is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, p L λ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc. ), A ribosome binding site for initiation of translation and a transcription / translation termination sequence. When E. coli is used as a host cell, E. coli The promoter and operator site of the tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol . , 158: 1018-1024 (1984)) and the left promoter of phage λ (p L λ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, . Ann Rev Genet, 14:. . 399-445 (1980)) may be used as a control region.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.The vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19 which are frequently used in the art, phages such as λgt4λB, λ -Charon,?? Z1, M13, etc.) or a virus (e.g., SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell (for example, a metallothionein promoter) or a mammalian virus Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and HSV tk Promoter) can be used, and generally has a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 저온-유도성 OsDhn1 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.The vector of the present invention may be fused with other sequences to facilitate the purification of the cold-inducible OsDn1 protein expressed therefrom. Fusion sequences include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA). Because of the additional sequence for such purification, proteins expressed in the host are rapidly and easily purified through affinity chromatography.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The vector of the present invention may be a selection marker and may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, And resistance genes for tetracycline.

본 발명의 유전자는 식물에서 분리되었고, 저온 스트레스에 대한 식물체의 내성을 증진하는 작용을 할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.The gene of the present invention has been isolated from plants and has the most favorable utility for plants since it can act to enhance plant tolerance to cold stress. Thus, the vector of the present invention comprises (i) a nucleotide sequence encoding a cold-inducible OsDn1 protein; (Ii) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence of (i) above and acting on plant cells to form RNA molecules; And (iii) a plant expression vector comprising a 3'-non-detoxified site that acts in plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, a promoter suitable for the present invention may be any of those conventionally used in the art for transgenic introduction of a plant, for example, a ubiquitin promoter of corn, a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (nos) promoter, Piguet mosaic virus 35S promoter, water crab basil lipid viral promoter, combellinella yellow mothball virus promoter, ribulose-1, 5-bis- (TPI) promoter, adenine phosphoribosyl transferase (APRT) promoter of Arabidopsis, and the tryptophan synthase promoter of ssRUBISCO, a cysteine triphosphate isomerase (TPI) promoter of Arabidopsis thaliana, do.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the 3'-non-detoxified site causing polyadenylation in accordance with the present invention is derived from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens (nos 3 'end) Bevan et al., Nucleic Acids Researcher , 11 (2): 369-385 (1983)), derived from the Octopine synthase gene of Agrobacterium tumefaciens, the 3 'end of the protease inhibitor I or II gene of tomato or potato, and CaMV 35S Terminator is included.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.
Optionally, the vector additionally carries a gene encoding a reporter molecule (e.g., luciferase and beta -glucuronidase). In addition, the vector of the present invention can be used as a selection marker for a gene resistant to antibiotics (e.g., neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, etc.) (e.g., neomycin phosphotransferase ( npt II ) Gomycin phosphotransferase ( hpt ), etc.).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a transformant transformed by the above-mentioned vector of the present invention.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.A host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner can be any host cell known in the art, and examples include E. coli JM109, E. coli Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, and Bacillus strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, and Salmonella typhimurium, ≪ RTI ID = 0.0 > T. < / RTI > Marcesons and various Pseudomonas spp.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, Saccharomyce cerevisiae , insect cells, human cells (e.g., Chinese hamster ovary, W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell may be carried out by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA , 9: 2110-2114 (1973) , Hanahan, D., J. MoI . Biol . , 166: 557-580 (1997)), one method (Cohen, SN et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA , 9: 2110-2114 (1983)) and electroporation method (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res . , 16: 6127-6145 (1988)). In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection (Capecchi, MR, Cell , 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology , 52: 456 electroporation (Neumann, E. et al, EMBO J., 1:. 841 (1982)), liposome-mediated transfection method (Wong, TK et al, Gene , 10:87 (1980).), DEAE- Dextran treatment (Gopal, Mol . Cell Biol . , 5: 1188-1190 (1985)), and the gene can be introduced into the host cell by Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . , 87: 9568-9572 have.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현되며, 이러한 경우에는 다량의 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 얻게 된다.
The vector injected into the host cell is expressed in host cells, in which case a large amount of cold-inducible OsDn1 protein is obtained.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포 또는 식물 조직을 상기 본 발명의 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a plant cell, comprising: (a) transforming a plant cell or a plant tissue with the vector of the present invention; (b) screening the transformed plant cell or plant tissue; And (c) regenerating the plant from the transformed plant cell or plant tissue to obtain a transformed plant.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 저온 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transgenic plant having low temperature stress tolerance.

본 발명에서 이용되는 익스플랜트로는 식물 세포 또는 식물 조직이며, 식물 조직을 이용하는 경우에는 캘러스를 이용하는 것이 바람직하다.The explant used in the present invention is a plant cell or a plant tissue, and when plant tissue is used, a callus is preferably used.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-중재 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-중재 형질전환이 가장 바람직하다. In the method of the present invention, transformation of plant cells can be carried out according to conventional methods known in the art, including electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. , 1: 841 (1982) ), Particle bombardment (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . , 87: 9568-9572 (1990)) and Agrobacterium-mediated transformation (U.S. Patent Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011) . Of these, Agrobacterium-mediated transformation is most preferred.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Selection of transformed plant cells can be carried out by exposing the transformed culture to a selection agent such as a metabolic inhibitor, an antibiotic and a herbicide. Plant cells that stably contain a marker gene that is transformed and conferring selectative resistance are grown and divided in the above cultures. Exemplary labels include, but are not limited to, hygromycin phosphotransferase gene, glycophosphate tolerance gene and neomycin phosphotransferase (nptII) system.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). Methods for the development or regeneration of plants from plant protoplasts or from various expansions are well known in the art. The development or regeneration of plants containing foreign genes introduced by Agrobacterium can be accomplished according to methods known in the art (U.S. Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 벼, 보리, 밀 및 옥수수와 같은 곡류의 식물체 적용되며, 보다 바람직하게는 벼에 적용되며, 가장 바람직하게는 자포니카 재배종에 적용된다.The method of the present invention is applied to various plants, but preferably applies to crop plants such as rice, barley, wheat and corn, more preferably to rice, and most preferably to Japonica cultivars.

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.In the present invention, a preferred transformation method is carried out using an Agrobacterium system, more preferably Agrobacterium tumefaciens ) -binary vector system.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (ⅰ) 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3‘-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3’-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.In a method of using an Agrobacterium system, a specific embodiment includes the following steps: (a ') introducing Agrobacterium tumefaciens, which can be inserted into the genomic DNA of a plant cell and have the following sequence, Faces ( Agrobacterium tumefaciens ): (i) a nucleotide sequence encoding a cold-inducible OsDn1 protein; (Ii) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence of (i) above and acting on plant cells to form RNA molecules; (Iii) a 3'-non-detoxified site that acts in plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule; (b ') Regenerating the infected explant in a regeneration medium to obtain a transformed plant.

식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).Transformation of plant cells is carried out with Agrobacterium tumefaciens containing Ti plasmids (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983) ).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 및 pGA1991과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); An et al., 1988; 및 Lee et al., 1999). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.More preferably, binary vector systems such as pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611 and pGA1991 are used (An, G. et al., Binary vectors "In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, (Ii) a structural gene operably linked to said promoter, and (iii) a promoter operably linked to said promoter, wherein said promoter is selected from the group consisting of: The vector further carries a gene encoding a reporter molecule (e.g., luciferase and glucuronidase). Examples of promoters used in the binary vector include CaMV 35S But are not limited to, promoters, 1 promoter, 2 promoter and nopaline synthase (nos) promoter.

아그로박테이룸 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테이룸 튜머페이션스의 배양물에 익스플랜트를 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테이룸 튜머페이션스는 식물내로 감염된다.Infection of the explant by Agrobacterium tumefaciens involves methods known in the art. Most preferably, the infection process comprises co-culturing the culture of Agrobacterium tumefaciens with an explant. Whereby Agrobacterium tumefaciens is infected into plants.

아그로박테이룸 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 최종적으로 형질전환 식물체를 형성한다.The explant transformed by Agrobacterium tumefaciens is regenerated in the regeneration medium, which ultimately forms a transgenic plant.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989).)
The transformed plants according to the present invention are confirmed to be transformed by methods known in the art. For example, PCR using DNA samples from tissues of transformed plants can identify foreign genes inserted into the genome of the transgenic plant. Alternatively, Northern or Southern blotting can be performed to confirm the transformation (Maniatis et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 저항성 향상용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물세포 또는 식물체, 그리고 상기 형질전환 식물세포 또는 식물체의 제조방법을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for improving abiotic stress resistance of a plant comprising as an active ingredient a gene carrier comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the second sequence of the sequence listing, A transgenic plant cell or plant, and a method for producing the transgenic plant cell or plant.

(b) 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 건조(drought) 스트레스에 대한 식물체의 저항성 증대에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 하면 상술한 스트레스에 대한 식물체의 저항성이 증가하여 식물체 재배 지역의 한계 극복할 수 있으며, 벼에 적용될 경우 건조 스트레스에 강한 벼의 생산이 가능하여 생산력을 극대화시킬 수 있다.
(b) The nucleotide sequence used in the present invention is involved in increasing the resistance of a plant to drought stress, and when the plant is transformed using the nucleotide sequence, the resistance of the plant to stress is increased, And when applied to rice, it is possible to produce rice which is resistant to drying stress, thereby maximizing the productivity.

도 1은 OsDhn1 과발현 바이너리 벡터(binary vector)의 구성을 나타낸다. OsDhn1 전장을 옥수수(maize) 유비퀴틴 프로모터 하에 바이너리 벡터 pGA1611에 서브클로닝하여 제조한 pSK169이다. Pubi, 옥수수 유비퀴틴 프로모터; P35S, CaMV 35S 프로모터; Tnos, 노팔린(nopaline) 합성효소 유전자의 터미네이터 서열; T7, Transcript 7의 터미네이터 서열; hph, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자; RB(right border sequence) 및 LB(left border sequence), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래 Ti 플라스미드의 오른쪽 경계서열 및 왼쪽 경계서열을 각각 의미한다.
도 2는 형질전환 식물에서 OsDhn1의 노던 블럿 분석 결과를 나타낸다. T1 식물의 총 RNA를 아가로즈 젤에서 분리하고 나일론 막에 블럿하여 방사능 동위원소로 표지된 OsDhn1 프로브로 혼성화한 결과이다. 숫자 및 WT는 각각 형질전환 주 및 야생형을 나타낸다. EtBr(Ethidium Bromide)-염색 rRNA 밴드는 RNA가 동량으로 로딩된 것을 나타낸다.
도 3은 OsDhn1 OX 주의 써던 블럿 분석 결과를 나타낸다. 선별된 과발현주인 2번, 4번 11번 및 22번의 지노믹 DNA 5 ㎍를 HindⅢ로 처리하고 프로브인 옥수수 유비퀴틴 프로모터와 혼성화한 결과이다. HindⅢ 처리된 람다(lambda) DNA 분획의 사이즈 및 위치를 나타낸다.
도 4는 OsDhn1 OX 주의 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 결과를 보여준다. RT-PCR분석은 3 OX 주, NT(non-transgenic segregant; 비형진전환 개체) 및 WT(Wild Type)의 묘목의 cDNA을 주형으로하고 OsDhn1lip9에 대한 프라이머를 이용하여 실시한 결과이다. RAc1(Rice Actin Gene) 및 OseEF -1a(elongation factor gene)을 PCR 대조군으로 사용하였다.
도 5는 클로로필 형광을 통항 OsDhn1 OX 주의 스트레스 내성의 분석 결과를 나타낸다. 형질전환 개체(4번, 11번 및 22번), NT 및 WT의 (a) 7시간동안의 건조 처리; (b) 24시간동안의 4℃ 한랭 처리; (c) 3일 동안의 200 mM NaCl 처리; 및 (d) 3시간 동안의 100 μM MV 처리에 대한 형광 변화를 모니터하였다. 결과값은 4회 이상의 실험을 얻은 ‘평균±표준편차’로 표시하였다. * 표시는 OX 주와 NT의 유의한 차이를 나타내며, #는 OX 주와 WT의 유의한 차이를 나타낸다(스튜던트 t-테스트, P<0.05).
도 6은 건조 처리 후 OsDhn1 OX 주의 대표 화분을 나타낸다. 형질전환 개체(4번 및 11번), NT 및 WT를 7일 동안 물을 주지 않는 건조 스트레스를 처리하고 한달동안 재배한 결과이다.
Figure 1 shows the construction of OsDn1 over-expressed binary vector. OsDhnl < / RTI &gt; full length was subcloned into the binary vector pGA1611 under the maize ubiquitin promoter. P ubi , maize ubiquitin promoter; P 35S , CaMV 35S promoter; Tnos, the terminator sequence of the nopaline synthase gene; T7, Terminator sequence in Transcript 7; hph , hygromycin phosphotransferase gene; RB (right border sequence) and LB (left border sequence), Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens- derived Ti plasmid, respectively.
Figure 2 shows Northern blot analysis of OsDn1 in transgenic plants. Total RNA of T1 plants was isolated from agarose gel, blotted onto nylon membrane, and hybridized with radioactive isotope labeled OsDn1 probe. Numbers and WT represent the transgenic strain and the wild type, respectively. EtBr (Ethidium Bromide) - The stained rRNA band indicates that RNA is loaded in equal amounts.
Fig. 3 shows the Southern blot analysis result of OsDn1OX . 5 ㎍ of genomic DNA of selected 2, 4, 11, and 22 overexpressed hosts were treated with Hind III and hybridized with a probing maize ubiquitin promoter. Indicates the size and location of Hind III treated lambda DNA fractions.
FIG. 4 shows RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) results of OsDhnl OX. RT-PCR analysis was carried out using primers for OsDhn1 and lip9 with cDNA of seedlings of 3 OX strain, NT (non-transgenic segregant) and WT (wild type) as template. RAc1 (Rice Actin Gene) and OseEF- 1a (elongation factor gene) were used as PCR control.
FIG. 5 shows the results of analysis of stress tolerance of the passage OsDn1 OX with chlorophyll fluorescence. (A) 7 hours of dry treatment of transformants (No. 4, No. 11 and No. 22), NT and WT; (b) cold treatment at 4 占 폚 for 24 hours; (c) 200 mM NaCl treatment for 3 days; And (d) Fluorescence changes were monitored for 100 μM MV treatment for 3 hours. The results were expressed as 'mean ± standard deviation' obtained from more than 4 experiments. * Indicates significant differences between OX and NT, and # indicates significant differences between OX and WT (Student t -test, P <0.05).
Figure 6 shows the representative flower of OsDn1OX after drying treatment. The transgenic plants (nos. 4 and 11), NT and WT were treated with 7 days of water-free drying stress and grown for one month.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

재료 및 방법Materials and methods

형질전환 벼 제작Transgenic rice production

OsDhn1 과발현 형질전환 벼를 제작하기 위해, OsDhn1의 전장 cDNA(Genbank accession no. AY786415, 서열목록 제1서열)를 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 조절되는 바이너리 벡터 pGA1611(Kim et al., 2003)의 KpnI 및 SacI 사이트에 삽입하여 클로닝한 다음, 벼 형질전환 벡터인 pSK169를 구축하였다(도 1). OsDhn1 overexpressed transgenic rice plants , Osdhn1 full-length cDNA (Genbank accession no. AY786415, Sequence Listing 1) was transformed into KpnI and SacI (Kim et al., 2003) of binary vector pGA1611 (Kim et al., 2003) controlled by maize ubiquitin promoter Site to construct a rice transformation vector pSK169 (Fig. 1).

자포니카 벼 품종인 동진(Dongjin)은 아그로박테리움-매개 공동배양법에 의해 형질전환 시킨 다음, 40 mg/L 하이그로마이신 B를 포함하는 배지에서 재생시켰다(Hiei et al., 1994; Lee et al., 1999). 재생된 식물을 온실의 논으로 옮긴 다음, 그 씨앗을 각 라인별로 수득하였다. 동형접합 형질전환 라인을 선택하기 위해, Xiong 및 Yang(2003)의 방법을 이용하여 하이그로마이신-B가 포함된 필터 페이퍼 위에서 T2 세대의 씨앗 20개 이상을 발아시켰다. 28℃에서 10일간 배양한 후, 생존한 유모의 숫자를 계수하였고, 이들을 동형접합 라인으로 판정하였다.
The Japonica rice variety, Dongjin, was transformed by Agrobacterium-mediated co-culture and regenerated in media containing 40 mg / L hygromycin B (Hiei et al., 1994; Lee et al. , 1999). The regenerated plants were transferred to the paddy fields of the greenhouse and the seeds were obtained for each line. To select homozygous transformation lines, more than 20 seeds of T2 generation were germinated on a filter paper containing hygromycin-B using the method of Xiong and Yang (2003). After incubation at 28 ° C for 10 days, the number of surviving nannies was counted and determined as homozygous lines.

서던 블롯 및 노던 블롯 분석Southern blot and Northern blot analysis

Chen 및 Roland(1999)의 방법을 이용하여 잎으로부터 유전체 DNA를 분리하였다. DNA(5 μg)는 제한효소(37℃에서 12시간)를 처리하여 절단하고 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동하여 분리한 다음, 진공 이동 시스템(Hoefer, 미국)을 이용하여 하이본드-N 멤브레인(Amersham, 영국)으로 이동시켰다. 노던 블롯 분석을 위해, Tri 시약(Molecular Research Center, 미국)을 이용하여 총 RNA을 분리하였다. 총 RNA(30 μg)을 1.3% 아가로오스 겔에 전기영동한 다음 멤브레인으로 이동시켰다. DNA 및 RNA의 혼성화는 랜덤 프라이밍법(Feinberg 및 Vogelstein, 1983)에 의해 제조된 방사성 동위원소 표지 프로브를 이용하여 수행하였다. 혼성화 후, 멤브레인을 2×SSC, 0.1% SDS로 상온에서 15분, 1×SSC, 0.1% SDS로 상온에서 15분 및 0.1×SSC, 0.1% SDS로 상온에서 15분간 세척하였다. 혼성화 시그널은 이미지 분석기(BAS-1500, Fuji, 일본)로 확인하였으며, HyperfilmTM MP(Amersham, 영국)에 노출시켰다.
Chen and Roland (1999) were used to isolate genomic DNA from leaves. The DNA (5 μg) was digested with restriction enzyme (12 hours at 37 ° C), electrophoresed on 0.8% agarose gel and separated using a high-bond-N membrane (Amersham, UK). For Northern blot analysis, total RNA was isolated using Tri reagent (Molecular Research Center, USA). Total RNA (30 μg) was electrophoresed on 1.3% agarose gel and transferred to the membrane. Hybridization of DNA and RNA was carried out using a radioisotope labeled probe prepared by the random priming method (Feinberg and Vogelstein, 1983). After hybridization, the membrane was washed with 2 x SSC, 0.1% SDS at room temperature for 15 minutes, 1 x SSC, 0.1% SDS at room temperature for 15 minutes, and 0.1 x SSC, 0.1% SDS at room temperature for 15 minutes. Hybridization signals were confirmed with an image analyzer (BAS-1500, Fuji, Japan) and exposed to Hyperfilm TM MP (Amersham, UK).

RT-PCR 분석RT-PCR analysis

RNeasy Mini Plant kit(QIAGEN, 독일)를 이용하여 총 RNA를 분리한 다음, Sprint RT Complete kit(CLONTECH, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. 유전자는 다음의 조건으로 PCR를 수행하여 증폭하였다: 94°C에서 5분, 그 다음 94°C에서 1분, 56°C에서 1분, 및 72°C에서 1분 조건으로 22-40 사이클, 72°C에서 7분. OsDhn1 증폭에 정방향 프라이머 (5’-AGCTCAAACAAGTCAAGAGC-3’) 및 역방향 프라이머( 5’-AAGCACCAAACTAACACACG-3’)가 사용되었고, lip9 증폭에 정방향 프라이머 5’-ATGGCCACTCCTGCTCCC-3’ 및 역방향 프라이머 5’-CCAGCCCAAAACCAATACAA-3’ 가 사용되었다. RT-PCR의 대조군으로서 사용된 벼 액틴 RAc1(McElroy et al. 1990) 및 신장 인자 유전자인 OseEF1-a(Jain et al. 2006)의 증폭에는 RAc1 정방향 프라이머 (5’-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT-3’) 및 RAc1 역방향 프라이머 (5’-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3’), OseEF1-a 정?향 프라이머( 5’-CCACACCTCCCACATTGCCGTC-3’) 및 역방향 프라이머( 5’-ACGACACAGTGCACACAGCGAG-3’)가 각각 사용되었다.
Total RNA was isolated using RNeasy Mini Plant kit (QIAGEN, Germany) and cDNA was synthesized according to manufacturer's instructions using Sprint RT Complete kit (CLONTECH, USA). The gene was amplified by performing PCR under the following conditions: 5 minutes at 94 ° C, then 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 56 ° C, and 1 minute at 72 ° C for 22-40 cycles, 7 minutes at 72 ° C. A forward primer (5'-AGCTCAAACAAGTCAAGAGC-3 ') and a reverse primer (5'-AAGCACCAAACTAACACACG-3') were used for OsDhn1 amplification and a forward primer 5'-ATGGCCACTCCTGCTCCC-3 'and a reverse primer 5'-CCAGCCCAAAACCAATACAA- 3 'was used. RAc1 forward primer (5'-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT-3 ') and RAc1 (Jain et al. 2006) were used for the amplification of rice actin RAc1 (McElroy et al. 1990) and the kidney factor gene OseEF1- Reverse primer (5'-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3 '), OseEF1-a positive primer (5'-CCACACCTCCCACATTGCCGTC-3') and reverse primer (5'-ACGACACAGTGCACACAGCGAG-3 '

스트레스-내성 시험Stress-immunity test

비생물 스트레스-내성을 조사하기 위해 본 발명자들은 형질전환 식물의 엽록소 형광 및 위조(wilting) 비율을 분석하였다. 형광 어세이를 위해 7일된 유묘의 가장 어린 잎을 5 cm 길이로 자른 후, 다음과 같이 스트레스를 유발하였다: (1) 70% 이하의 상대습도에서 7일간 공기건조(가뭄 스트레스); (2) 4℃ 증류수에서 24시간 부유(floating)(한랭 스트레스); 또는 (3) 100 μM 메틸 바이올로겐(methyl viologen, MV) 용액에서 암(dark) 조건으로 12시간 부유시킨 후 70 μmol m-2 sec-1 이하의 광(light) 조건으로 3시간 부유시킴(산화 스트레스). 염분 스트레스를 유도하기 위해 8일된 유묘 전체를 200 mM NaCl 용액에 넣고 3일 후, 엽록소 형광을 측정하였다. 30분간의 암(dark) 적응시간을 거친 후, Plant Efficiency Analyzer (Hansatech, 영국)을 이용하여 형광 시그널을 측정하였다. 광화학계(photosystem)(Genty et al., 1989)을 이용하여 측정한 Fv/Fm 비율을 계산하여 유묘의 손상정도를 평가하였다. 위조를 분석하기 위해 7일된 유묘를 다음의 조건으로 처리하였다: (1) 3일간 물을 주지 않은 다음 7일간 회복시킴; (2) 4℃에서 4일간 정치시킨 다음 6일간 회복시킴; 또는 (3) 100 mM NaCl 용액을 7일간 처리한 다음 7일간 회복시킴. 회복기간 후, 시든 식물체 및 건강한 식물체을 계수하여 대조군과 비교하였다.
To investigate abiotic stress-tolerance, we analyzed chlorophyll fluorescence and wilting ratios of transgenic plants. For the fluorescence assay, the youngest leaves of 7-day old seedlings were cut into 5 cm lengths and then stressed as follows: (1) air drying for 7 days at a relative humidity of 70% or less (drought stress); (2) floating at 4 ° C in distilled water for 24 hours (cold stress); Or (3) suspended in a solution of 100 μM methyl viologen (MV) for 12 hours under dark conditions and floated for 3 hours under light conditions of 70 μmol m -2 sec -1 or less Oxidative stress). To induce salinity stress, 8 days old seedlings were placed in 200 mM NaCl solution and chlorophyll fluorescence was measured 3 days later. After a dark adaptation time of 30 minutes, fluorescence signals were measured using Plant Efficiency Analyzer (Hansatech, UK). The Fv / Fm ratio was measured using a photosystem (Genty et al., 1989) and the degree of seedling damage was evaluated. To analyze forgery, 7 day old seedlings were treated under the following conditions: (1) restored for the next 7 days without water for 3 days; (2) allowed to stand at 4 DEG C for 4 days and then restored for 6 days; Or (3) 100 mM NaCl solution for 7 days and then recovered for 7 days. After the recovery period, dead plants and healthy plants were counted and compared with the control group.

실험결과 Experiment result

OsDhn1 과발현 형질전환 벼의 제작Production of overexpressed transgenic rice plants of OsDhn1

OsDhn1 과발현 벼(OsDhn1 OX)를 제작하기 위해, 구축한 바이너리 벡터(pSK169)는 유비퀴틴 프로모터에 의해 제어되는 OsDhn1 유전자를 포함한다(도 1). 19개 라인의 형질전환 식물체는 아그로박테리움-매개 벼 형질전환을 통해 제작하였고, 그 중 18개 라인은 성숙시켜 씨를 뿌렸다. 그들은 정상 성장 조건 하에서 어떠한 형태학적 변화를 나타내지 않았다. 정상 조건하에서 성장한 T1 식물체의 잎 샘플의 노던 블롯 분석 결과, 18개의 식물체 라인 가운데 15개 라인의 OsDhn1의 발현이 야생형 식물체에 비해 높은 수치를 나타냈다(도 2). OsDhn1에 대한 높은 발현율을 나타낸 2, 4, 11 및 22번 식물체 라인을 선택하여 추가 실험을 수행하였다. 선택한 2, 4, 11 및 22번 식물체 라인에 대해 서던 블롯을 수행한 결과, 각각 8, 2, 3 및 1 카피의 T-DNA 삽입되어 있음을 확인하였다(도 3). 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 발아 시험을 수행하여 동형접합 자손을 선택함으로써 최종적으로 4, 11 및 22번 식물체 라인을 선별하였다.
To construct OsDhn1 overexpressed rice (OsDhn1 OX), the constructed binary vector (pSK169) contains the OsDhN1 gene controlled by the ubiquitin promoter (Fig. 1). Nineteen lines of transgenic plants were produced through Agrobacterium-mediated transgenic transformation, of which 18 lines were matured and seeded. They did not show any morphological changes under normal growth conditions. Northern blot analysis of leaf samples of T1 plants grown under normal conditions showed that 15 lines of 18 lines of OsDhn1 expression were higher than wild-type plants (Fig. 2). Additional experiments were performed by selecting plant lines 2, 4, 11, and 22 that exhibited a high expression rate for OsDhnl. Southern blots were performed on selected plant lines 2, 4, 11, and 22 to confirm that 8, 2, 3, and 1 copies of T-DNA were inserted, respectively (FIG. 3). Germination tests were performed in a medium containing hygromycin to select homozygous offspring, and eventually, line 4, 11 and 22 were selected.

OsDhn1OsDhn1 과발현 식물체에 대한  For overexpressing plants RTRT -- PCRPCR 분석  analysis

선별한 과발현 식물체 라인에 대한 OsDhn1의 과발현은 RT-PCR을 통해 분석하였다. 분석 결과, 4, 11 및 22번 식물체 라인에서 OsDhn1가 강하게 발현되었으나, NT(non-transgenic segregant) 및 야생형(WT, wild type) 대조군에서는 OsDhn1 발현이 확인되지 않았다(도 4). The overexpression of OsDHn1 in selected over-expressing plant lines was analyzed by RT-PCR. The results, 4, 11 and 22 times, but the O sDhn1 strongly expressed in a plant line, NT (non-transgenic segregant) and wild type (WT, wild type) in the control group OsDhn1 Expression was not confirmed (Fig. 4).

또한, lip9의 발현을 분석하였다. OsDhn1의 선택적 스플라이싱 형태로 알려져 있는 lip9은 OsDhn1 단백질에 존재하는 3개의 K-분절 대신 2개의 K-분절을 코딩하고 있다(Lee et al., 2005). lip9의 발현은 OsDhn1 과발현 식물체 및 대조군 식물체에서 큰 차이 없이 비슷한 수준을 나타냈다(도 4). 이러한 결과는 본 발명의 과발현 식물체 라인은 OsDhn1 전장(full length)을 과발현시키며, 세포 내에서 온전한 SK3-타입 Dhn(dehydrin) 단백질을 축적할 수 있다는 것을 나타낸다. OsDhn1 단백질 축적은 항-K 분절 항체를 이용한 면역 블롯을 통해 분석하였다.
The expression of lip9 was also analyzed. Lip9 known as selective splicing form of OsDhn1 are encoding the two segments instead of three K- K- segment present in OsDhn1 protein (Lee et al., 2005) . Expression of lip9 showed the same level without big difference in OsDhn1 overexpression plants and control plants (Fig. 4). These results indicate that the overexpressed plant line of the present invention overexpresses the OsDhn1 full length and accumulates intact SK 3 -type Dhn (dehydrin) protein in the cells. OsDn1 protein accumulation was analyzed by immunoblotting with anti-K segment antibodies.

OsDhn1OsDhn1 과발현 식물체에서 스트레스-내성 평가  Stress-Tolerance Assessment in Overexpressed Plants

OsDhn1 과발현 식물체 라인에 대한 스트레스-내성을 평가하기 위해, 식물체 잎의 클로로필 형광을 측정한 다음 스트레스 조건 하에서 광화학계의 활성을 확인하였다. 정상 성장 조건 하에서 Fv/Fm 비율은 OsDhn1 과발현 식물체 및 대조군 유묘에서 약 0.8로 나타났다. 공기건조에 의한 가뭄 스트레스 하에서 OsDhn1 과발현 식물체 라인 4 및 22의 Fv/Fm 값은 NT 및 WT 대조군에 비해 현저히 높았다. 가뭄 스트레스 처리 5시간 후, WT 및 NT의 Fv/Fm 값은 각각 0.55± 0.08 및 0.57± 0.06으로 감소한 반면, OsDhn1 과발현 식물체 2개 라인의 Fv/Fm 값은 0.69± 0.05 및 0.66± 0.04로 대조군 식물체에 비해 20% 높은 Fv/Fm 값을 나타냈다(도 5a). 또한, 가뭄 스트레스 처리 6시간 및 7시간 후, OsDhn1 과발현 식물체의 Fv/Fm 값은 대조군 식물체와 비교하여 각각 35% 및 26% 높았다. 반면, 한랭 스트레스 처리 동안 OsDhn1 과발현 식물체의 Fv/Fm 값은 대조군과 비교하여 큰 차이를 나타내지 않았다. 한랭 스트레스 처리 24시간 후, WT 및 NT의 Fv/Fm 값은 각각 0.36± 0.02 및 0.40± 0.02로 감소하였고, OsDhn1 과발현 식물체 2개 라인의 Fv/Fm 값은 0.37± 0.02 및 0.37± 0.05로 대조군 식물체와 비슷한 수치를 나타냈다(도 5b). 한랭 스트레스 처리와 마찬가지로 염분 스트레스 및 MV-유도 산화 스트레스에 따른 Fv/Fm 비율은 OsDhn1 과발현 식물체 및 대조군 식물체에서 비슷하게 나타났다(도 5c-5d). OsDhn1 In order to evaluate the stress-tolerance of over-expressing plant lines, chlorophyll fluorescence of plant leaves was measured and the activity of the photochemical system was checked under stress conditions. Under normal growth conditions, the ratio of Fv / Fm was OsDn1 And about 0.8 in overexpressed plants and control seedlings. Under drought stress caused by air drying, OsDhn1 The Fv / Fm values of the overexpressed plant lines 4 and 22 were significantly higher than those of the NT and WT control groups. After 5 hours of drought stress treatment, the Fv / Fm values of WT and NT were decreased to 0.55 ± 0.08 and 0.57 ± 0.06, respectively, whereas OsDhn1 The Fv / Fm values of the two lines of overexpressing plants were 0.69 ± 0.05 and 0.66 ± 0.04, which showed a Fv / Fm value of 20% higher than the control plant (FIG. 5a). In addition, after 6 hours and 7 hours of drought stress treatment, OsDhn1 The Fv / Fm values of the overexpressed plants were 35% and 26% higher than those of the control plants, respectively. On the other hand, during cold stress treatment, OsDhn1 The Fv / Fm values of the overexpressed plants were not significantly different from those of the control group. After 24 hours of cold stress treatment, the Fv / Fm values of WT and NT decreased to 0.36 ± 0.02 and 0.40 ± 0.02, respectively, and OsDhn1 The Fv / Fm values of the two lines of overexpressing plants were 0.37 ± 0.02 and 0.37 ± 0.05, similar to those of the control plants (FIG. 5b). Similar to cold stress treatment, the ratio of Fv / Fm due to salt stress and MV-induced oxidative stress was OsDhn1 Over-expressing plants and control plants (Fig. 5c-5d).

전체 유묘에서 스트레스-내성을 평가하고자 위조(wilting) 분석을 수행하였다. 가뭄 스트레스로서 3일간 물을 주지 않은 다음, 정상 성장 조건에서 회복시켰을 때, OsDhn1 과발현 식물체의 위조율(wilting ratio)은 대조군 식물체보다 낮았다. 3개의 OsDhn1 과발현 식물체 라인의 4번째 잎에 대한 위조율은 각각 7.1%, 62.5% 및 51.3%였으며, 이러한 비율은 대조군 식물체와 비교하여 30% 이상 낮은 수준이다(표 1). OsDhn1 과발현 식물체 4번 라인만이 NT 식물체와 비교하여 현저히 낮은 위조율을 나타냈다. OsDhn1 과발현 식물체 11 및 22번 라인은 NT 식물체보다 낮은 위조율을 보였지만 유의적인 차이를 나타내지 않았다(P<0.05, χ2 시험). 한랭 스트레스 조건에 4일간 노출시키고 정상 성장 조건에서 6일간 회복시킨 다음 측정한 3개의 OsDhn1 과발현 식물체 라인의 3번째 잎에 대한 위조율은 각각 40.0%, 46.2% 및 66.7%였으며, 이러한 결과는 완전히 시든 표현형을 보인 WT 식물체와 비교하여 현저히 낮은 수치이다. 이러한 OsDhn1 과발현 식물체의 위조율은 NT 식물체와는 거의 비슷한 수준이었다.A wilting analysis was performed to assess stress tolerance in whole seedlings. When water was not given for 3 days as a drought stress and then recovered under normal growth conditions, OsDhn1 The wilting ratio of the overexpressed plants was lower than that of the control plants. Three OsDhn1 The rate of streaking on the fourth leaf of the over-expressing plant line was 7.1%, 62.5%, and 51.3%, respectively, and this ratio was lower than that of the control plant by 30% (Table 1). OsDhn1 Only the overexpressed plant line 4 showed a significantly lower stomach rate than the NT plant. OsDhn1 Over-expressing plants lines 11 and 22 showed lower stoichiometry than NT plants but no significant differences (P <0.05, χ 2 test). The cells were exposed to cold stress conditions for 4 days and recovered for 6 days under normal growth conditions. Then, three OsDhn1 The stunning rates for the third leaf of the overexpressed plant line were 40.0%, 46.2% and 66.7%, respectively, and these results are significantly lower than those of the WT plants showing completely seeded phenotype. These OsDhn1 The overcorrection rate of overexpressed plants was almost similar to that of NT plants.

처리process No.4No.4 No.11No.11 No.22No.22 NTNT WTWT 건조dry 2/28
(7.1%)
2/28
(7.1%)
20/32
(62.5%)
20/32
(62.5%)
60/117
(51.3%)
60/117
(51.3%)
58/89
(65.2%)
58/89
(65.2%)
148/148
(100.0%)
148/148
(100.0%)
한랭cold 10/25
(40.0%)
10/25
(40.0%)
12/26
(46.2%)
12/26
(46.2%)
20/30
(66.7%)
20/30
(66.7%)
49/96
(51.0%)
49/96
(51.0%)
117/117
(100.0%)
117/117
(100.0%)
염분salt 66/68
(97.1%)
66/68
(97.1%)
74/75
(98.7%)
74/75
(98.7%)
88/89
(98.9%)
88/89
(98.9%)
116/120
(96.7%)
116/120
(96.7%)
184/184
(100.0%)
184/184
(100.0%)

100 mM NaCl 용액을 처리하여 염분 스트레스를 유도한 후, OsDhn1 과발현 식물체의 위조율을 측정한 결과, OsDhn1 과발현 식물체의 위조율은 NT 및 WT 식물체와 비교하여 큰 차이를 나타내지 않았으며 OsDhn1 과발현 식물체 4번 라인만 예외적으로 WT 식물체보다 3% 낮은 위조율을 나타냈다. After 100 mM NaCl solution was treated to induce saline stress, OsDn1 As a result of measuring the stunning ratio of overexpressed plants, OsDhn1 The overage rate of overexpressed plants was not significantly different from that of NT and WT plants. OsDhn1 Except for line 4 of the overexpressed plants, the rate of overcorrection was 3% lower than that of WT plants.

30일된 OsDhn1 과발현 성숙기 식물체에 가뭄 스트레스(7일간 급수 정지 후 7일간 정상 성장 조건에서 회복)를 유도하고 위조율을 분석한 결과, OsDhn1 과발현 식물체 4번 라인은 시들지 않았으며 대조군 식물체와 비교하여 전체적으로 건강한 표현형을 나타냈다. OsDhn1 과발현 식물체 11번 라인은 약 31%의 위조율을 나타냈으며, NT 및 WT 식물체는 각각 42% 및 54%의 위조율을 나타냈다. 7일간 급수 정지시킨 후 나타난 형질전환 식물체의 대표적인 형태는 도 6과 같다. 상기 결과들을 종합하여 볼 때, OsDhn1의 과발현은 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 내성을 현저하게 향상시킨다.
30-day-old OsDhn1 Drought stress induces overexpression of mature plants (after the water stopped 7 days 7 days recovering in normal growth conditions), and analysis of the above, coordination, OsDhn1 Overexpressed plant line 4 did not decline and showed a wholly healthy phenotype as compared to control plants. OsDhn1 Overexpressed plant line 11 showed a stunning rate of about 31%, while NT and WT plants showed 42% and 54% stunning rates, respectively. Representative forms of the transgenic plants that appeared after stopping watering for 7 days are shown in Fig. Taken together, these results indicate that overexpression of OsDhN1 significantly improves tolerance to drought stress in plants.

논의Argument

Dhn(Dehydrin) 유전자는 라이신-리치 K-분절을 코딩하며, 비생물 스트레스에 대응하여 강하게 발현된다. 이러한 특징 때문에 Dhn은 비생물 스트레스 하에서 세포를 보호하는 역할을 할 것으로 여겨지고 있다. 많은 인 비트로 어세이 및 형질전환 실험을 통해 Dhn의 세포 보호 효과가 확인되고 있다. 그러나, Dhn의 구체적인 역할에 대해서는 알려져 있지 않다(reviewed by Rorat, 2006). 벼 유전체 및 마이크로 어레이 데이터 베이스에 따르면, 벼 유전체는 적어도 8개의 Dhn 유전자를 갖고 있으며, 이들은 비생물 스트레스에 반응하여 강하게 발현된다. 이러한 벼 Dhn 유전자 가운데 OsDhn1은 가뭄-유도 SK3-타입 Dhn을 코딩하는 것으로 알려져 있으며, CBF / DREB1 전사 요소들의 하류 타겟 유전자로 알려진 애기장대 COR47 / RD17ERD10와 높은 유사성을 갖는다고 알려져 있다(Lee et al., 2005). Dip1으로도 알려져 있는 OsDhn1의 발현은 실제로 CBF / DREB1 형질전환 벼에서 증가하며, 이러한 형질전환 벼는 비생물 스트레스에 대해 강한 내성을 나타낸다(Oh et al., 2005; Ito et al., 2006; Xu et al., 2011). 또한, OsDhn1 프로모터는 비생물 스트레스-반응성을 갖는 것으로 추정되는 작용부위요소(cis-acting element)를 포함하며, 강한 가뭄 유도성을 갖는다고 확인되었다(Lee et al., 2005; Yi et al., 2010). The Dhn (Dehydrin) gene encodes a lysine-rich K-segment and is strongly expressed in response to abiotic stress. Because of this feature, Dhn is believed to play a role in protecting cells under abiotic stress. A number of in vitro assays and transfection experiments have confirmed the cytoprotective effect of Dhn . However, the specific role of Dhn is unknown (reviewed by Rorat, 2006). According to the rice genome and microarray database, the rice genome contains at least 8 Dhn genes, which are strongly expressed in response to abiotic stress. These rice Dhn gene of OsDhn1 is drought-induced SK 3 - is known to code the type Dhn, known to have a downstream target genes high similarity with the Arabidopsis COR47 / RD17 and ERD10 known as of the CBF / DREB1 transcription factors (Lee et al ., 2005). The expression of OsDhn1 , also known as Dip1 , is actually increased in CBF / DREB1 transgenic rice plants , and these transgenic rice plants show a strong resistance to abiotic stress (Oh et al., 2005; Ito et al., 2006; Xu et al., 2011). In addition, OsDhn1 It has been confirmed that the promoter contains a cis-acting element which is presumed to have abiotic stress-reactivity and has a strong drought-inducing property (Lee et al., 2005; Yi et al., 2010).

본 발명자들은 스트레스-반응성 및 비생물 스트레스 반응성 전사인자의 상호작용을 고려하여, OsDhn1이 스트레스 반응 및 저항에 역할을 수행할 것이라고 예측하였다. 이러한 예측을 설명하기 위해, 본 발명자들은 OsDhn1 과발현 식물체를 구축하고 이를 이용하여 다양한 분석을 실시하였다. OsDhn1 과발현 식물체에서 OsDhn1의 구성적 발현은 RT-PCR 분석을 통해 확인하였다. OsDhn1의 선택적 스플라이싱 형태인 lip9의 발현은 OsDhn1 과발현 식물체 및 대조군 식물체에서 큰 차이를 보이지 않았다. K-분절은 디하이드린 기능에 있어서 중요한 부위로 여겨지는데, OsDhn1은 3개의 K-분절을 포함하는 반면, lip9은 2개의 K-분절을 포함한다. lip9은 벼 캘러스(Aguan et al., 1991)로부터 처음 확인되었고 OsDhn1은 벼 종피로부터 확인되었는데(Lee et al., 2005), 이러한 사실은 OsDhn1의 세포 내 기능이 lip9와 차이가 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 OsDhn1 과발현 식물체에서 나타나는 선택적 표현형은 OsDhn1의 이소성(ectopic) 과발현에서 전적으로 기인하는 것이다. The present inventors have taken into account the interaction of stress-responsive and abiotic stress-responsive transcription factors and predicted that OsDn1 would play a role in stress responses and resistance. To illustrate this prediction, the present inventors constructed and overexpress OsDn1 overexpressed plants and performed various analyzes. The constitutive expression of OsDhn1 in OsDn1 overexpressed plants was confirmed by RT-PCR analysis. Expression of lip9, an alternative splicing form of OsDhn1 , was not significantly different between OsDn1 overexpressing plants and control plants. The K-segment is considered to be an important site for dihydrin function, OsDhN1 contains three K-segments, while lip9 contains two K-segments. Lip9 was first identified from rice callus (Aguan et al., 1991) and OsDhn1 was identified from rice seedlings (Lee et al., 2005). This fact implies that the intracellular function of OsDhn1 differs from that of lip9 . Thus, the selective phenotype of OsDn1 overexpressing plants of the present invention It is entirely due to the overexpression of ectopic expression of OsDhN1 .

엽록소 형광 및 위조율을 측정 결과, OsDhn1 과발현 식물체는 가뭄 스트레스에 대한 강한 내성을 나타냈다(도 5 및 6, 표 1). 특히, 유묘 단계 및 성숙기에서의 위조율로 평가하였을 때, 가뭄 내성은 유묘 단계에서 보다 성숙기에 더 높게 나타난다. 반면, OsDhn1 과발현 식물체의 위조율은 WT 식물체와 비교하여 다소 낮게 나타났지만, 한랭 스트레스 및 염분 스트레스에 대한 강한 내성은 본 발명의 분석에서 확인되지 않았다(표 1). 이러한 결과들은 OsDhn1이 한랭 또는 염분 스트레스 보다 가뭄 스트레스에 대해서 보호 역할을 한다는 것을 암시한다. 또한, 가뭄 스트레스 조건에서 발현이 증가되는 내재성(endogenous) OsDhn1 유전자는 OsDhn1 유전자의 이소성 과발현과 협력하여 가뭄 내성을 유도하는데 기여할 것이다. 따라서, 가뭄에 의해 발현이 유도되는 내재성 OsDhn1 유전자는 가뭄 내성과 연관되어 있을 것으로 예상된다. As a result of chlorophyll fluorescence and streak rate measurement, OsDn1 overexpressing plants showed strong resistance to drought stress (FIGS. 5 and 6, Table 1). Especially, when evaluated by seedling stage and ripening stage, drought tolerance is higher in mature stage than in seedling stage. On the other hand, the stunning rate of the OsDhn1 overexpressed plants was somewhat lower than that of the WT plants, but the strong tolerance to cold stress and salt stress was not confirmed in the analysis of the present invention (Table 1). These results suggest that OsDhn1 protects against drought stress rather than cold or salt stress. In addition, an endogenous OsDhn1 gene with increased expression under drought stress conditions will contribute to induce drought tolerance in cooperation with ectopic overexpression of the OsDhn1 gene. Therefore, the endogenous OsDhn1 gene, which is induced by drought, is expected to be associated with drought tolerance.

증가된 스트레스-내성을 갖는 디하이드린 과발현 형질전환 식물체에 대해 지금까지 많은 연구들이 보고되고 있다. 그러나, 스트레스 내성에 대한 디하이드린 유전자의 구체적인 기능은 아직 알려지지 않고 있다. 인 비트로 연구들을 통해 디하이드린이 단백질, 지질 및 금속에 결합하며, 라디칼-소거 및 저온보호 효과 등 다양한 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 이러한 활성 가운데, SKn 타입의 디하이드린은 식물체의 저온 적응에 필수적인 것으로 알려져 있다(reviewed by Rorat, 2006). 특히, 밀 WCOR410 및 감귤류 CuCOR19와 같은 SK3 타입 디하이드린의 발현은 한랭 내성과 연관되어 있으며, 이러한 유전자를 포함하는 형질전환 식물체는 증가된 한랭 스트레스 내성을 나타냈다(Danyluk et., 1998; Houde et al., 2004; Yin et al., 2006; Xing et al., 2011). 반면, 본 발명의 OsDhn1 과발현 식물체는 SK3 타입 디하이드린을 코딩하고 있음에도 불구하고 한랭 스트레스에 대해서는 강한 내성을 보이지 않았다. 한랭 스트레스 하에서 OsDhn1 발현은 유묘단계에서 일시적으로 증가되었는데(Lee et al., 2005), 이러한 결과는 OsDhn1 과발현 식물체의 낮은 한랭 스트레스 내성을 설명하는 하나의 이유가 될 수 있다. 한편, 본 발명의 한랭 내성 시험의 실험 조건이 OsDhn1 과발현 식물체에 적합하지 않을 수 있다. 12℃ 한랭 스트레스에 대한 반응으로 성숙기 식물체의 잎 및 꽃에서 OsDhn1의 발현이 증가되었다(Lee et al., 2005). 또한, 본 발명자들은 OsDhn1 과발현 성숙기 식물체의 한랭 스트레스 내성에 대한 실험을 수행하지 않았다. 따라서, 다양한 비생물 스트레스 내성에 대한 OsDhn1의 기능을 다양한 발달 단계의 형질전환 식물체를 이용한 추후 실험을 통해 확인할 필요가 있다. A number of studies have been reported so far on dihydrogen overexpressed transgenic plants with increased stress tolerance. However, the specific function of the dihydrin gene for stress tolerance is not yet known. In vitro studies have shown that dihydrin binds to proteins, lipids, and metals, and has various activities such as radical-scavenging and cold protection. Of these activities, SK n- type dihydrins are known to be essential for plant cold adaptation (reviewed by Rorat, 2006). In particular, the expression of SK 3 type dihydrins such as wheat WCOR410 and citrus CuCOR19 is associated with cold tolerance and transgenic plants containing these genes exhibit increased cold stress tolerance (Danyluk et., 1998; Houde et Yin et al., 2006; Xing et al., 2011). On the other hand, the OsDn1 overexpressed plants of the present invention did not show strong resistance to cold stress, despite SK 3 type dihydrin coding. Under cold stress, OsDhn1 expression was temporarily increased at the seedling stage (Lee et al., 2005), and this result may be one reason for explaining low cold stress tolerance of OsDHn1 overexpressing plants. On the other hand, the experimental conditions of the cold tolerance test of the present invention may not be suitable for OsDn1 overexpressed plants. In response to cold stress at 12 ℃, the expression of OsDhn1 was increased in leaves and flowers of mature plants (Lee et al., 2005). In addition, the present inventors have not conducted an experiment for cold stress tolerance of OsDn1 over-expressing mature plants. Therefore, it is necessary to confirm the function of OsDhn1 for various abiotic stress tolerance through further experiments using transgenic plants at various stages of development.

흔히 비생물 스트레스는 기능 및 구조적으로 단백질을 변성시키는 산화 스트레스를 유발한다(Smirnoff 1998). 따라서, 본 발명자들은 산화 스트레스에 대한 OsDhn1의 역할을 조사하기 위해 메틸 바이올로겐 또는 ROS-생성 화학물질을 처리한 유묘에서 엽록소 형광을 분석함으로써 산화 스트레스 내성을 평가하였다. 실험결과, OsDhn1 과발현 식물체 및 대조군 식물체에서 Fv/Fm 값의 현저한 차이는 나타나지 않았다(도 5d). 이러한 결과는 OsDhn1이 라디칼-소거 활성과 관련이 없다는 것을 의미한다. Abiotic stress often causes oxidative stress that functionally and structurally denatures proteins (Smirnoff 1998). Thus, the present inventors have evaluated the oxidative stress resistance by analyzing chlorophyll fluorescence in the seedlings treated with the Gen ROS- generation or chemical methyl Biology to investigate the role of OsDhn1 for oxidative stress. As a result, there was no significant difference in Fv / Fm values between OsDn1 overexpressed plants and control plants (FIG. 5d). These results indicate that OsDn1 is not involved in the radical-scavenging activity.

결론적으로, 본 발명자들은 OsDhn1을 과발현하는 형질전환 벼가 가뭄 스트레스에 강한 내성을 가지며, OsDhn1 유전자가 벼의 가뭄 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 규명하였다. 분자적 수준에서의 OsDhn1의 기능을 본 발명에서 설명하지는 않았으나, 스트레스 내성은 OsDhn1의 분자 샤페론 기능에 의해 유도된 것으로 예상된다. 스트레스 내성에 대한 OsDhn1의 분자적 기능은 추후 연구를 통해 규명되어야 할 것이다.
In conclusion, the present inventors have found that OsDhn1 overexpressing transgenic rice has a strong resistance to drought stress and OsDhn1 gene plays an important role in rice drought tolerance. Although the function of OsDhNl at the molecular level has not been described in the present invention, it is expected that stress tolerance is induced by the molecular chaperone function of OsDhNl . The molecular function of OsDhn1 to stress tolerance should be clarified through further studies.

참고문헌references

Aguan, K., Sugawara, K., Suzuki, N., and Kusano, T. (1991) Isolation of genes for low-temperature-induced proteins in rice by a simple subtractive method. Plant Cell Physiol . 32, 12851289. Aguan, K., Sugawara, K., Suzuki, N., and Kusano, T. (1991) Isolation of genes for low-temperature-induced proteins in rice by a simple subtractive method. Plant Cell Physiol . 32 , 12851289.

Allagulova, Ch.R., Gilamov, F.R., Shakirova, F.M. and Vakhitov, V.A. (2003) The plant dehydrins: structure and functions. Biochemistry ( Moscow ) 68, 945-951.Allagulova, Ch.R., Gilamov, FR, Shakirova, FM and Vakhitov, VA (2003). The plant dehydrins: structure and functions. Biochemistry ( Moscow ) 68 , 945-951.

Bray, E. A. (1993) Molecular responses to water deficit. Plant Physiol . 103, 1035-1040.Bray, EA (1993) Molecular responses to water deficit. Plant Physiol . 103 , 1035-1040.

Brini, F., Hanin, M., Lumbreras, V., Amara, I., Khoudi, H., Hassairi, A., Pag, M., and Masmoudi, K. (2007) Overexpression of wheat dehydrin DHN-5 enhances tolerance to salt and osmotic stress in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep. 26, 2017-2026.(2007) Overexpression of wheat dehydrin DHN-5 &lt; tb &gt;&lt; tb &gt; ______________________________________ &lt; tb &gt; ______________________________________ &lt; tb &gt; ______________________________________ & enhances tolerance to salt and osmotic stress in Arabidopsis thaliana . Plant Cell Rep . 26 , 2017-2026.

Campbell, S.A., and Close, T.J. (1997) Dehydrins: genes, proteins, and associations with phenotypic traits. New Phytol . 137, 6174.Campbell, SA, and Close, TJ (1997) Dehydrins: genes, proteins, and associations with phenotypic traits. New Phytol . 137 , 6174.

Cellier, F., Con, G., Breitler, J.-C., and Casse, F. (1998) Molecular and physiological responses to water deficit in drought-tolerant and drought-sensitive lines of sunflower. Plant Physiol. 116, 319328.Cellier, F., Con, G., Breitler, J.-C., and Casse, F. (1998) Molecular and physiological responses to water deficit in drought-tolerant and drought-sensitive lines of sunflower. Plant Physiol . 116 , 319328.

Chen, D. H. and Roland, P. C. (1999) A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Mol . Biol . Rep . 17, 53-57.Chen, DH and Roland, PC (1999) A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Mol . Biol . Rep . 17, 53-57.

Cheng, Z., Targolli, J.,Huang, X., and Wu, R. (2002) Wheat LEA genes, PMA80 and PMA1959, enhance dehydration tolerance of transgenic rice (Oryza sativa L.). Mol . Breed . 10, 71-82.(2002) Wheat LEA genes, PMA80 and PMA1959, enhance dehydration tolerance of transgenic rice ( Oryza &lt; RTI ID = 0.0 &gt; sativa L.). Mol . Breed . 10 , 71-82.

Close, T. J. (1996) Dehydrins: Emergence of abiochemical role of a family of plant dehydration proteins. Physiol . Plant. 97, 795-803.Close, TJ (1996) Dehydrins: Emergence of abiochemical roles of a family of plant dehydration proteins. Physiol . Plant . 97 , 795-803.

Danyluk, J., Houde, M., Rassart, , and Sarhan, F. (1994) Differential expression of a gene encoding an acidic dehydrin in chilling sensitive and freezing tolerance gramineae species. FEBS Lett . 344, 20-24.Danyluk, J., Houde, M., Rassart, and Sarhan, F. (1994) Differential expression of a gene encoding an acidic dehydrin in chilling sensitive and freezing tolerance gramineae species. FEBS Lett . 344, 20-24.

Danyluk, J., Perron, A., Houde, M., Limin, A., Fowler, B., Benhamou, N. and Sarhan, F. (1998) Accumulation of an acidic dehydrin in the vicinity of the plasma membrane during cold acclimation of wheat. Plant Cell 10, 623-638.Danyluk, J., Perron, A., Houde, M., Limin, A., Fowler, B., Benhamou, N. and Sarhan, F. (1998) Accumulation of an acidic dehydrin in the vicinity of the plasma membrane during cold acclimation of wheat. Plant Cell 10 , 623-638.

Feinberg, A.P. and Vogelstein, B. (1983) A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal . Biochem . 132, 6-13.Feinberg, AP and Vogelstein, B. (1983) A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal . Biochem . 132, 6-13.

Genty, B., Briantais, J.M. and Baker, N.R. (1989) The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta 990, 8792.Genty, B., Briantais, JM and Baker, NR (1989) The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta 990 , 8792.

Hara, M. (2010) The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signal Behav. 5, 503-508.Hara, M. (2010) The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signal Behav. 5 , 503-508.

Hara, M., Shinoda, Y., Tanaka, Y., and Kuboi, T. (2009) DNA binding of citrus dehydrin promoted by zinc ion. Plant Cell Environ . 32, 532-541.Hara, M., Shinoda, Y., Tanaka, Y., and Kuboi, T. (2009) DNA binding of citrus dehydrin promoted by zinc ion. Plant Cell Environ . 32 , 532-541.

Hara, M., Terashima. S, Fukaya, T. and Kuboi, T. (2003) Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco. Planta 217, 290-298.Hara, M., Terashima. S, Fukaya, T. and Kuboi, T. (2003) Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco. Planta 217, 290-298.

Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., and Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6, 271-282.Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., and Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6 , 271-282.

Houde, M., Dallaire, S., N’Dong, D. and Sarhan, F. (2004) Overexpression of the acidic dehydrin WCOR410 improves freezing tolerance in transgenic strawberry leaves. Plant Biotechnology Journal. 2, 381-387.Houde, M., Dallaire, S., N'Dong, D. and Sarhan, F. (2004) Overexpression of the acidic dehydrin WCOR410 improves freezing tolerance in transgenic strawberry leaves. Plant Biotechnology Journal . 2 , 381-387.

Hu, L., Wang, Z., Du, H., and Huang, B. (2010) Differential accumulation of dehydrins in response to water stress for hybrid and common bermudagrass genotypes differing in drought tolerance. J. Plant Physiol . 167, 103-109.Hu, L., Wang, Z., Du, H., and Huang, B. (2010) Differential accumulation of dehydrins in response to water stress for hybrid and common bermudagrass genotypes. J. Plant Physiol . 167 , 103-109.

Ingram, J., and Bartels, D. (1996) The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu. Rev . Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 47, 277-403.Ingram, J., and Bartels, D. (1996) The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 47 , 277-403.

Ito Y., Katsura K., Maruyama K., Taji T., Kobayashi M., Seki M., Shinozaki K., and Yamaguchi-Shinozaki K. (2006) Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice. Plant Cell Physiol. 47,141-153.(2006) Functional analysis of rice DREB1 / CBF-type transcription factors involved in. Ino Y., Katsura K., Maruyama K., Taji T., Kobayashi M., Seki M., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. cold-responsive gene expression in transgenic rice. Plant Cell Physiol. 47, 141-153.

Jain, M., Nijhawan, A., Tyagi, A.K., and Khurana, J.P. (2006) Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR. Biochem . Biophys . Res . Commun . 345, 646-651.Jain, M., Nijhawan, A., Tyagi, AK, and Khurana, JP (2006) Validation of housekeeping genes as internal control for gene expression in rice by quantitative real-time PCR. Biochem . Biophys . Res . Commun . 345, 646-651.

Kim, S.-R., Lee, S., Kang, H.-G., Jeon, J.-S., Kim, K.-M., and An, G. (2003) A complete sequence of the pGA1611 binary vector. J. Plant Biol . 46, 211-214.Kim, S.-R., Lee, S., Kang, H.-G., Jeon, J.-S., Kim, K.-M., and An, G. (2003) A complete sequence of the pGA1611 binary vector. J. Plant Biol . 46, 211-214.

Koag, M. C., Fenton, R. D., Wilkens, S., and Close, T. J. (2003) The binding of maize DHN1 to lipid vesicles. Gain of structure and lipid specificity. Plant Physiol. 131, 309-316.Koag, MC, Fenton, RD, Wilkens, S., and Close, TJ (2003) The binding of maize DHN1 to lipid vesicles. Gain of structure and lipid specificity. Plant Physiol . 131 , 309-316.

Kusano, T., Aguan, K., Abe, M., and Sugawara, K. (1992) Nucleotide sequence of a rice rab16 homologue gene. Plant Mol . Biol . 18, 127-129.Kusano, T., Aguan, K., Abe, M., and Sugawara, K. (1992) Nucleotide sequence of a rice rab16 homologue gene. Plant Mol . Biol . 18 , 127-129.

Lee, S. C., Jeon, J. S., Jung, K. H., and An, G. (1999) Binary vectors for efficient transformation of rice. J. Plant Biol . 42, 310-316.Lee, SC, Jeon, JS, Jung, KH, and An, G. (1999) Binary vectors for efficient transformation of rice. J. Plant Biol . 42 , 310-316.

Lee, S. C., Lee, M-Y., Kim, SJ., Jun, SH., An, G., and Kim, S-R. (2005) Characterization of a stress-inducible dehydrin gene, OsDhn1, from rice (Oryza sativa L.). Mol . Cells 19, 212-218.Lee, SC, Lee, MY, Kim, SJ, Jun, SH, An, G., and Kim, SR. (2005) Characterization of a stress-inducible dehydrin gene, OsDhn1 , from rice ( Oryza sativa L. ). Mol . Cells 19 , 212-218.

Li, R., Brawley, S.H., and Vakhitov, V.A. (1998) Proteins immunologically related to dehydrins in fucoid algae. J. Phycol . 34, 642650.Li, R., Brawley, SH, and Vakhitov, VA (1998) Proteins immunologically related to dehydrins in the fucoid algae. J. Phycol . 34 , 642650.

Lopez, C.G., Banowetz, G.M., Peterson, C.J., and Kronstad, W.E. (2002) Wheat dehydrin accumulation in response to drought stress during anthesis. Functional Plant Biology 29, 1417-1425.Lopez, CG, Banowetz, GM, Peterson, CJ, and Kronstad, WE (2002) Wheat dehydrin accumulation in response to drought stress during anthesis. Functional Plant Biology 29 , 1417-1425.

Lopez, C.G., Banowetz, G.M., Peterson, C.J., and Kronstad, W.E. (2003) Dehydrin expression and drought tolerance in seven wheat cultivars. Crop Sci. 43, 577582.Lopez, CG, Banowetz, GM, Peterson, CJ, and Kronstad, WE (2003) Dehydrin expression and tolerance in seven wheat cultivars. Crop Sci . 43 , 577582.

McElroy, D., Rothernberg, M.M., Wu, R. (1990) Structural characterization of a rice actin gene. Plant Mol Biol . 14, 163171.McElroy, D., Rothernberg, MM, Wu, R. (1990) Structural characterization of a rice actin gene. Plant Mol Biol . 14, 163171.

Mtwisha, L., Brandt, W., McCready, S., and Lindsey, G.G. (1998) HSP 12 is a LEA-like protein in Saccharomyces cerevisiae. Plant Mol . Biol . 37, 513521.Mtwisha, L., Brandt, W., McCready, S., and Lindsey, GG (1998) HSP 12 is a LEA-like protein in Saccharomyces cerevisiae . Plant Mol . Biol . 37 , 513521.

Nylander, M., Svensson, J., Palva, E. T., and Welin, B. V. (2001) Stress-induced accumulation and tissue-specific localization of dehydrins in Arabidopsis thaliana . Plant Mol. Biol . 45, 263-279.Nylander, M., Svensson, J., Palva, ET, and Welin, BV (2001) Stress-induced accumulation and tissue-specific localization of dehydrins in Arabidopsis thaliana . Plant Mol. Biol . 45 , 263-279.

Oh, S.J., Song, S.I., Kim, Y.S., Jang, H.J., Kim, S.Y., Kim, M., Kim, Y.K., Nahm, B.H., and Kim, J.K. (2005) Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiol. 138, 341-351. Arabidopsis CBF3 / DREB1A and ABF3 in transgenic rice were increased by the increase of rice transgenic rice, tolerance to abiotic stress without stunting growth. Plant Physiol. 138 , 341-351.

Peng, Y., Reyes, J.L., Wei, H., Yang, Y., Karlson, D., Covarrubias, A.A., Krebs, S.L., Fessehaie, A., and Arora, R. (2008) RcDhn5, a cold acclimation-responsive dehydrin from Rhododendron catawbiense rescues enzyme activity from dehydration effects in vitro and enhances freezing tolerance in RcDhn5-overexpressing Arabidopsis plants. Physiol Plant . 134, 583-597.(2008) RcDhn5, a cold acclimation (2008) RcDhn5, a cold acclimation (Ragdon, R., Peng, Y., Reyes, JL, Wei, H., Yang, Y., Karlson, D., Covarrubias, AA, Krebs, SL, Fessehaie, -responsive dehydrin from Rhododendron catawbiense rescues enzyme activity from dehydration effects in vitro and enhances freezing tolerance in RcDhn5- overexpressing Arabidopsis plants. Physiol Plant . 134 , 583-597.

Puhakainen, T., Hess, M. V., M, P., Svenson, J., Heino, P. and Palva, E. T. (2004) Overexpression of multiple dehydrin genes enhances tolerance to freezing stress in Arabidopsis. Plant Mol. Biol. 54, 743-753.Puhakainen, T., Hess, M, P., Svenson, J., Heino, P. and Palva, ET (2004) Overexpression of multiple dehydrin genes enhances tolerance to freezing stress in Arabidopsis . Plant Mol. Biol. 54 , 743-753.

Rohila, J.S., Jain, R.K., and Wu, R. (2002) Genetic improvement of Basmati rice for salt and drought tolerance by regulated expression of a barley Hva1 cDNA. Plant Sci . 163, 525532.Rohila, JS, Jain, RK, and Wu, R. (2002) Genetic improvement of Basmati rice for salt and drought tolerance by a barley Hva1 cDNA. Plant Sci . 163 , 525532.

Rorat T. (2006) plant dehydrins: tissue location, structure and function. Cellular & Molecular Biology Letters 11, 536-556. Rorat T. (2006) plant dehydrins: tissue location, structure and function. Cellular & Molecular Biology Letters 11 , 536-556.

Shih, M.D., Hoekstra, F.A., and Hsing, Y.I.C. (2008) Late embryogenesis abundant proteins. Adv. Bot . Res . 48, 211255.Shih, MD, Hoekstra, FA, and Hsing, YIC (2008) Late embryogenesis abundant proteins. Adv. Bot . Res . 48 , 211255.

Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature: Differences and cross-talk between two stress signaling pathways. Curr . Opin . Plant Biol . 3, 217-223.Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature: Differences and cross-talk between two stress signaling pathways . Curr . Opin . Plant Biol . 3, 217-223.

Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Seki M. (2003) Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Curr . Opin . Plant Biol . 6, 410-417.Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., and Seki M. (2003) Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Curr . Opin . Plant Biol . 6 , 410-417.

Smirnoff, N. (1998) Plant resistance to environmental stress. Curr . Opin . Biotechnol . 9, 214-219.Smirnoff, N. (1998) Plant resistance to environmental stress. Curr . Opin . Biotechnol . 9 , 214-219.

Thomashow, M. F. (1999) Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu . Rev . Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 50, 571-599.Thomashow, MF (1999) Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu . Rev. Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 50, 571-599.

Wang, W.X., Vinocur, B., Shoseyov, O., and Altman, A. (2001) Biotechnology of plant osmotic stress tolerance: physiological and molecular considerations. Acta Hortic 560, 285292. Wang, WX, Vinocur, B., Shoseyov, O., and Altman, A. (2001) Biotechnology of plant osmotic stress tolerance: physiological and molecular considerations. Acta Hortic 560, 285292.

Welin, B. V., Olson, A.,and Palva, E. T. (1995) Structure and organization of two closely related low-temperature-induced dhn/lea/rab-like genes in Arabidopsis thaliana L. Heynh. Plant Mol . Biol . 29, 391-395. Wolin, BV, Olson, A., and Palva, ET (1995) Structure and organization of two closely related low-temperature-induced dhn / lea / rab-like genes in Arabidopsis thaliana L. Heynh. Plant Mol . Biol . 29, 391-395.

Whitsitt, M.S., Collins, R.G., and Mullet, J.E. (1997) Modulation of dehydration tolerance in soybean seedlings. Plant Physiol. 114, 917925.Whitsitt, MS, Collins, RG, and Mullet, JE (1997) Modulation of dehydration tolerance in soybean seedlings. Plant Physiol . 114 , 917925.

Xiao, B., Huang, Y., Tang, N., and Xiong, L. (2007) Over-expression of a LEAgene in rice improves drought resistance under the field conditions. Theor . Appl . Genet . 115, 35-46. Xiao, B., Huang, Y., Tang, N., and Xiong, L. (2007) Over-expression of a LEA gene in rice. Theor . Appl . Genet . 115 , 35-46.

Xing, X., Liu, Y., Kong, X., Liu, Y., and Li, D. (2011) Overexpression of a maize dehydrin gene, ZmDHN2b, in tobacco enhances tolerance to low temperature. Plant Growth Regul . 65, 109118.Xing, X., Liu, Y., Kong, X., Liu, Y., and Li, D. (2011) Overexpression of a maize dehydrin gene, ZmDHN2b , in tobacco enhances tolerance to low temperature. Plant Growth Regul . 65 , 109118.

Xiong, L., Schumaker, K. S., and Zhu, J. K. (2002) Cell signaling during cold, drought, and salt stress. Plant Cell 14, Suppl. S165-183.Xiong, L., Schumaker, KS, and Zhu, JK (2002) Cell signaling during cold, drought, and salt stress. Plant Cell 14, Suppl. S165-183.

Xu, D., Duan, X., Wang, B., Hong, B., Ho, T., and Wu, R. (1996) Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice. Plant Physiol. 110, 249-257.Xu, D., Duan, X., Wang, B., Hong, B., Ho, T., and Wu, R. (1996) Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1 , from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice. Plant Physiol . 110 , 249-257.

Xu, M., Li, L., Fan, Y., Wan, J., and Wang, L. (2011) ZmCBF3 overexpression improves tolerance to abiotic stress in transgenic rice (Oryza sativa) without yield penalty. Plant Cell Rep . 30, 1949- 1957Xu, M., Li, L., Fan, Y., Wan, J., and Wang, L. (2011) ZmCBF3 overexpression improves tolerance to abiotic stress in transgenic rice (Oryza sativa ) without yield penalty. Plant Cell Rep . 30 , 1949-1957

Yi, N., Kim, Y.S., Jeong, M.H., Oh, S.J., Jeong, J.S., Park, S.H., Jung, H., Choi, Y.D., and Kim, J.K. (2010) Functional analysis of six drought-inducible promoters in transgenic rice plants throughout all stages of plant growth. Planta 232, 743-754.Functional analysis of six drought-inducible promoters in yeast, Y., N., Kim, YS, Jeong, MH, Oh, SJ, Jeong, JS, Park, SH, Jung, H., Choi, YD transgenic rice plants throughout all stages of plant growth. Planta 232, 743-754.

Yin, Z., Rorat, T., Szabala, B. M., Ziłkowska, A. and Malepszy, S. (2006) Expression of a Solanum sogarandinum SK3-type dehydrin enhances cold tolerance in transgenic cucumber seedlings. Plant Sci . 170, 1164-1172.
Yin, Z., Rorat, T., Szabala, BM, Ziłkowska, A. and Malepszy, S. (2006) Expression of a Solanum sogarandinum SK 3 -type dehydrin enhances cold tolerance in transgenic cucumber seedlings. Plant Sci . 170 , 1164-1172.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Cold -Inducible OsDhn1 Gene and Protein Enhancing Cold Tolerance <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1117 <212> DNA <213> Orysa sative Dehydrin1 <400> 1 gtcacagctc aaacaagtca agagcgaata gttcttgctg atctgttgtt tgattacttt 60 agttctcgag aggctttagc tgaatccatc gatcgatcat ggaggatgag aggaacacgg 120 agagccacca gggtggcgag gctgcagagc aggtggaggt gaaggacagg ggcctcttcg 180 acaacctcct tggcaggaag aaggacgatc agccggagga gaagaagcat gaggaggagc 240 ttgtcaccgg catggagaag gtctccgtgg aagagccaaa gaaggaggag caccacgccg 300 agggcgagaa gaaggagagc ctcctctcca agctgcaccg atccagctcc agctccagct 360 cgtcgagtga tgaggaagag gaggtgatcg atgacaacgg cgaggtggtc aagaggaaga 420 agaagaaggg gctcaaggag aagatcaagg agaagctgcc cggccacaag gaccatgccg 480 gtgagcatgc tcctccgccc gcggcgacgg gcttccccgc gccggctccg cctgcatccg 540 tggtgacggc cgcgcccacg ccagctcctg ctcccgtggt gactcacggc gatcaccacc 600 acgacaccgc cgtccccgtg gagaagatcg agggtgatca cgccaagacg gaggcgaccc 660 tgccacgtgc acccgaggag gagaagaagg gcttcctcga caagatcaag gagaagctgc 720 ccggcggcca caagaagccg gaagacgcaa ctgctgtgcc gccgccggcc gcctcaccgg 780 ctgctcctgc cactactccg gcgccagcac acccaccgcc ggctacagag gaagtgagca 840 gcccggatgg gaaggagaag aagggtatac tgggcaagat catggagaaa ctgcccggtt 900 accacaaggg ctccggcgag gaagacaaga ccgccgccgc cgccaccggc gagcacaaga 960 gcagcgctta attggggcgt gtgtgagacc aggccatggt tggaatttgg aagtgtttgg 1020 cgtgtgttag tttggtgctt tttctgcact gcagctttgt taagttcgtg tcaagattgg 1080 tcaaggcctg gtcagcgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1117 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Oryza sativa Dehydrin1 <400> 2 Met Glu Asp Glu Arg Asn Thr Glu Ser His Gln Gly Gly Glu Ala Ala 1 5 10 15 Glu Gln Val Glu Val Lys Asp Arg Gly Leu Phe Asp Asn Leu Leu Gly 20 25 30 Arg Lys Lys Asp Asp Gln Pro Glu Glu Lys Lys His Glu Glu Glu Leu 35 40 45 Val Thr Gly Met Glu Lys Val Ser Val Glu Glu Pro Lys Lys Glu Glu 50 55 60 His His Ala Glu Gly Glu Lys Lys Glu Ser Leu Leu Ser Lys Leu His 65 70 75 80 Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Glu Glu Val 85 90 95 Ile Asp Asp Asn Gly Glu Val Val Lys Arg Lys Lys Lys Lys Gly Leu 100 105 110 Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly His Lys Asp His Ala Gly 115 120 125 Glu His Ala Pro Pro Pro Ala Ala Thr Gly Phe Pro Ala Pro Ala Pro 130 135 140 Pro Ala Ser Val Val Thr Ala Ala Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Val 145 150 155 160 Val Thr His Gly Asp His His His Asp Thr Ala Val Pro Val Glu Lys 165 170 175 Ile Glu Gly Asp His Ala Lys Thr Glu Ala Thr Leu Pro Arg Ala Pro 180 185 190 Glu Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro 195 200 205 Gly Gly His Lys Lys Pro Glu Asp Ala Thr Ala Val Pro Pro Pro Ala 210 215 220 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Thr Thr Pro Ala Pro Ala His Pro Pro 225 230 235 240 Pro Ala Thr Glu Glu Val Ser Ser Pro Asp Gly Lys Glu Lys Lys Gly 245 250 255 Ile Leu Gly Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro Gly Tyr His Lys Gly Ser 260 265 270 Gly Glu Glu Asp Lys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly Glu His Lys Ser 275 280 285 Ser Ala 290 <110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Cold-Inducible OsDhn1 Gene and Protein Enhancing Cold Tolerance <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1117 <212> DNA <213> Orysa sative Dehydrin1 <400> 1 gtcacagctc aaacaagtca agagcgaata gttcttgctg atctgttgtt tgattacttt 60 agttctcgag aggctttagc tgaatccatc gatcgatcat ggaggatgag aggaacacgg 120 agagccacca gggtggcgag gctgcagagc aggtggaggt gaaggacagg ggcctcttcg 180 acaacctcct tggcaggaag aaggacgatc agccggagga gaagaagcat gaggaggagc 240 ttgtcaccgg catggagaag gtctccgtgg aagagccaaa gaaggaggag caccacgccg 300 agggcgagaa gaaggagagc ctcctctcca agctgcaccg atccagctcc agctccagct 360 cgtcgagtga tgaggaagag gaggtgatcg atgacaacgg cgaggtggtc aagaggaaga 420 agaagaaggg gctcaaggag aagatcaagg agaagctgcc cggccacaag gaccatgccg 480 gtgagcatgc tcctccgccc gcggcgacgg gcttccccgc gccggctccg cctgcatccg 540 tggtgacggc cgcgcccacg ccagctcctg ctcccgtggt gactcacggc gatcaccacc 600 acgacaccgc cgtccccgtg gagaagatcg agggtgatca cgccaagacg gaggcgaccc 660 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80 Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Glu Glu Val                  85 90 95 Ile Asp Asp Asn Gly Glu Val Val Lys Arg Lys Lys Lys Lys Gly Leu             100 105 110 Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly His Lys Asp His Ala Gly         115 120 125 Glu His Ala Pro Pro Ala Ala Thr Gly Phe Pro Ala Pro Ala Pro     130 135 140 Pro Ala Ser Val Val Thr Ala Ala Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Val 145 150 155 160 Val Thr His Gly Asp His His His Asp Thr Ala Val Pro Val Glu Lys                 165 170 175 Ile Glu Gly Asp His Ala Lys Thr Glu Ala Thr Leu Pro Arg Ala Pro             180 185 190 Glu Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro         195 200 205 Gly Gly His Lys Lys Pro Glu Asp Ala Thr Ala Val Pro Pro Pro Ala     210 215 220 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Thr Pro Ala Pro Ala His Pro Pro 225 230 235 240 Pro Ala Thr Glu Glu Val Ser Ser Pro Asp Gly Lys Glu Lys Lys Gly                 245 250 255 Ile Leu Gly Lys Ile Met Glu Lys Leu Pro Gly Tyr His Lys Gly Ser             260 265 270 Gly Glu Glu Asp Lys Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly Glu His Lys Ser         275 280 285 Ser Ala     290

Claims (8)

서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하며 식물체에서 과발현되는 경우 상기 식물체에 저온 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 저온-유도성 OsDhn1 단백질 또는 상기 단백질과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 단백질.
A low temperature-inducible OsDn1 protein which promotes tolerance to cold stress in the plant when overexpressed in a plant, or a protein that shows an amino acid sequence homology of 80% or more with the protein, when the plant overexpresses the amino acid sequence of the second sequence.
상기 제 1 항의 저온-유도성 OsDhn1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자.
9. A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the cold-inducible OsDn1 protein of claim 1.
제 2 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열 중 서열번호 99-971의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
3. The nucleic acid molecule of claim 2, wherein the nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 99-971 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 제 2 항 또는 제 3 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
3. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 2 or 3.
상기 제 4 항의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
A transformant transformed by the vector of claim 4.
다음의 단계를 포함하는 저온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법:
(a) 식물 세포 또는 식물 조직을 상기 제 4 항의 벡터로 형질전환하는 단계;
(b) 형질전환된 식물세포 또는 식물조직을 선별하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 식물세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
A method for producing a transgenic plant having enhanced cold stress tolerance comprising the steps of:
(a) transforming a plant cell or plant tissue with the vector of claim 4;
(b) screening the transformed plant cell or plant tissue; And
(c) regenerating the plant from the transformed plant cell or plant tissue to obtain a transformed plant.
제 6 항에서 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀 또는 옥수수인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method according to claim 6, wherein the plant is rice, barley, wheat, or corn.
상기 제 6 항 또는 제 7 항의 제조방법에 의해 제조된 저온 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체.A transgenic plant having improved tolerance to cold stress produced by the method of claim 6 or 7.
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Cited By (2)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114645059A (en) * 2022-02-23 2022-06-21 内蒙古农业大学 Caragana korshinskii drought-tolerant gene Chr8.226 and application thereof in preparation of drought-tolerant transgenic plants
CN114645059B (en) * 2022-02-23 2024-05-21 内蒙古农业大学 Caragana microphylla drought-tolerant gene Chr8.226 and application thereof in preparation of drought-tolerant transgenic plants
CN116004652A (en) * 2022-10-11 2023-04-25 吉林农业大学 Cold-resistant gene ZmDHN15 of corn and application thereof

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