KR20140046143A

KR20140046143A - 안약형 백신의 신규 아쥬반트

Info

Publication number: KR20140046143A
Application number: KR1020120112198A
Authority: KR
Inventors: 서경률
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-04-18
Also published as: KR101669142B1

Abstract

본 발명은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 poly(I:C)(Polyinosinic acid-polycytidylic acid)를 안구 접종시 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 수준의 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 세포독성 및 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)는 안약형 인플루엔자 바이러스 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

안약형 백신의 신규 아쥬반트{A novel adjuvant of vaccine for eye-drop vaccination}

본 발명은 poly(I:C)를 안약형 백신 아쥬반트로 사용하는 용도에 관한 것이다.

점막 면역을 강화함에 의한 면역 반응을 유도하는 백신은 감염이 발생하기 이전에 병원체를 표적화하는 효과적인 방법이다(비특허문헌 1 및 2). 점막 백신 접종은, 비경구 백신 접종과 대조적으로, 대부분의 감염성 병원체의 침입의 입구에서 시스템 및 점막 면역 반응, 주로 분비형 IgA(sIgA) 항체들을 모두 유도할 수 있기 때문에 특별히 주목받는다(비특허문헌 3). 백신 개발은 전세계 여행의 시대에서 급속한 질환의 확산에 비해 뒤떨어져 있다. 점막 백신 접종은 투여가 용이하고 특별한 훈련이 요구되지 않으며, 이는 새로운 병원체가 대유행이 되기 이전에 억제하는 전략이다.

이러한 점막 면역의 특징은 유도조직과 실행조직으로 구성되는 점막 면역 경로를 통해 지금까지의 주사제를 통한 면역 유도로는 획득할 수 없었던 점막 조직과 그 분비액 중에 항원-특이적 면역반응을 유도할 수 있다는 점이다. 최근 문제가 되고 있는 대부분의 감염원이 호흡기, 소화기, 생식기 등의 점막을 통해서 침입하는 것을 고려할 때, 그 침입통로에 효과적인 면역방어를 구축하는 일은 매우 중요하다. 이와 같이 점막 면역체계를 이용한 감염 예방 대책의 개발이 최근 많은 주목을 받고 있다.

그러나, 점막 백신 접종의 경우, 주로 분비형 IgA(SIgA) 항체를 통해 면역반응이 유도되는데, 백신 투여 속도가 질병 진행속도를 따라가지 못한다면, 백신 투여를 통한 예방효과가 충분히 발현되지 못할 위험이 있다. 광역 유행성 질환이 대량의 가축에 전염되는 경우, 백신투여를 신속하게 하는 것이 필요하고, 이를 위해서는 특별한 기술이 없이도 용이하게 투여가 가능하고, 동시에 백신 투여의 효과가 충분히 발현될 수 있어야 한다. 그러나, 점막 투여 루트 중의 하나인 비강 접종의 경우 항원이 중추신경계로 침투할 위험이 있어 바람직하지 못하다.

안구 점막은 환경성 항원들 및 대부분의 외부 눈 표면을 차지하는 감염성 물질들에 대한 중요한 침입 부위이기 때문에 점막 백신을 위한 가능한 경로이다(비특허문헌 4-6). 안구 점막의 부분인 결막은 다른 점막 조직과 마찬가지로 면역학적 특징을 가진다. 결막은 상피에 CD8+ T 세포가 있고, 프로프리아층에 CD4+ 및 CD8+ T 세포, B 세포 및 비만세포를 동등한 비율로 있으며, 수지상세포(DC) 및 랑게르한스 세포가 있다(비특허문헌 7 및 8). 이런 결막은 외부 환경에 노출되어 있고 다른 점막 부분의 많은 공통된 면역학적 특징을 공유하고 있는 점막 장벽의 부위이다. 이전 연구에서는 새 및 소 모델에서 아이드롭(eyedrop) 백신 접종에 의한 성공적인 보호를 보였다(비특허문헌 9 및 10). 그러나, 원하는 면역 반응의 유도 메커니즘, 및 결막 및 비강(i.n.) 경로의 시스템적 비교는 아직 설명하지 못하고 있다(비특허문헌 11-13).

지금까지 기존의 인플루엔자 바이러스 백신(influenza virus vaccine) 접종은 피하 및 비강을 통해 접종했으며, 사(死)백신의 눈으로의 접종 후 인플루엔자 바이러스에 대한 면역력 유발은 보고된 바가 없다. 또한 눈을 통한 인플루엔자 바이러스 백신 접종 시 특정 눈에서 보이는 백신 사용에 따른 아쥬반트에 대한 효과와 안전성을 보고한 사례가 없다. 또한, 점막 백신에 가장 좋은 효과를 보이는 아쥬반트인 CT(cholera toxin)는 비강점막 접종 시 CNS 손상과 염증 유발의 단점이 많이 보고되고 있다. 따라서 CT 이외의 CT 만큼 효과적이지만 안전한 안구 점막용 아쥬반트를 개발할 필요가 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 안구 점막용 안약백신 아쥬반트를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 안구 점막에 점안시 poly(I:C)(Polyinosinic acid-polycytidylic acid)가 인플루엔자 바이러스 백신에 대한 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)를 안구 점막용 인플루엔자 바이러스 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트 조성물, 및 상기 아쥬반트를 포함하는 안약형 백신을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트을 제공한다.

또한, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 안약형 백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 백신을 개체의 안구에 투여하는 것을 포함하는 안구 면역을 유도하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 백신, 및 상기 백신의 안구 투여방법, 투여량 또는 투여횟수 등에 관한 설명서를 포함하는 안약형 백신용 키트를 제공한다.

본 발명은 poly(I:C)를 인플루엔자 바이러스 백신의 안구 접종시 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 세포독성 및 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)를 안약형 인플루엔자 바이러스 백신의 유용한 아쥬반트로 사용할 수 있음을 제공한다. 따라서, 본 발명은 지금까지 CT가 점막을 통해 면역성을 유발시키는 아쥬반트 중 가장 효과적인 제재로 알려져 있으나 세포독성을 가지고 염증을 일으키는 부작용을 가지고 있는 문제점이 있었는데, CT를 대신해서 poly(I:C)가 인플루엔자 바이러스를 포함한 다양한 백신의 아쥬반트로 유용하게 사용할 수 있음을 제공한다.

도 1은 BALB/c 마우스 안구 점막에 PBS 또는 OVA 단독, 및 각종 아쥬반트(CT, poly(I:C), MPLA, Alum)를 함께 점안한 후, 혈청 및 점막 조직 세척액에서 OVA 특이적인 항체 생성 증가를 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 BALB/c 마우스 안구 점막에 PBS 또는 OVA 단독, 및 각종 아쥬반트(CT, poly(I:C), MPLA, Alum)를 함께 점안한 후, 혈청 및 점막 조직 세척액에서 HA 특이적인 항체 생성 증가를 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 BALB/c 마우스의 눈에 10 ug poly(I:C)와 0.1 ~ 2 ug의 HA 백신 항원을 2주 간격으로 두 번 안구 점막에 접종한 후 ELISA로 항 HA 항체 생성 효과를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 HA 백신 항원을 1 ~ 30ug poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 안구 점막에 접종한 후 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막 세척액에서 각각의 HA 특이 IgG와 IgA 항체 생성 효과를 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, HA 단독 그룹과 비교하여 '*': p < 0.05, '**': p < 0.01, '***': p < 0.001의 유의성을 나타내고, HA + 1ug poly(I:C) 그룹과 비교하여 '†': p < 0.05의 유의성을 나타내며, 'n.s.'는 두 그룹 간에 유의적 차이가 없는 것을 나타낸다.
도 5는 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 HA 백신 항원을 1 ug 또는 10 ug poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 안구점막 또는 비강점막에 접종한 후, 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막 세척액에서 각각의 HA 특이 IgG와 IgA 항체 생성 효과를 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, HA 단독 그룹과 비교하여 '*': p < 0.05, '**': p < 0.01의 유의성을 나타내고, HA + 1 ug poly(I:C)_eye 그룹과 비교하여 '§': p < 0.05, '§§§': p < 0.001의 유의성을 나타내며, 'n.s.'는 두 그룹 간에 유의적 차이가 없는 것을 나타낸다.
도 6은 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 인플루엔자 A 바이러스 H1N1의 분할 백신 항원을 1 ug 또는 10 ug poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 안구 점막 또는 비강 점막에 접종한 후, 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막 세척액에서 각각의 H1N1 특이 IgG와 IgA 항체 생성 효과를 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, H1N1 단독 그룹과 비교하여, '†': p < 0.05, '††': p < 0.01의 유의성을 나타내고, H1N1 + 1 ug poly(I:C)_eye 그룹과 비교하여 '§': p < 0.05의 유의성, '§§': p < 0.001의 유의성을 나타내며, 'n.s.'는 두 그룹 간에 유의적 차이가 없는 것을 나타낸다.
도 7은 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 PBS, HAs 단독, 및 HAs+poly(I:C)를 각각 안구 점막에 접종한 후, 결막 조직(conjunctival tissue)에서 세포를 얻은 후 CD8α 및 CD11c를 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 세포분포 변화를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스의 눈에 1 ug의 HA 백신 항원 단독, 항원 + 10g poly(I:C), 및 항원 + CT를 각각 안구 점막에 접종한 후, 각 시간별(1h, 6h, 12h, 24h)로 조직에서 총 RNA를 추출한 후에 역전사 RNA로 cDNA를 합성한 다음, 이를 주형으로 사용하여 IL-1alpha와 TNF-alpha의 mRNA 발현 증가 여부를 실시간(real-time) PCR로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 정의한다.

본 발명에서 "백신" 이란 용어는 본원에서, 보통 감염성 인자 또는 감염성 인자의 일부를 포함하는 항원성 현탁액 또는 용액으로서, 체내에 투여할 경우 활성 면역성을 일으키는 것을 일컫는다. 백신을 구성하는 항원성 부분으로는, 미생물체(예를 들어, 바이러스 또는 세균 등) 또는 미생물체로부터 정제된 천연 물질, 합성 또는 유전자 조작 단백질, 펩티드, 다당류 또는 유사 물질이 될 수 있다. 생백신의 예로는, BCG, 천연두 백신, 소아마비, 수두, 홍역, 풍진, 유행성 이하선염, 우역(rinderpest), NDV, 마렉병(Marek's disease) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사백신에는, 백일해, 디프테리아(톡소이드), 파상풍균(톡소이드), 인플루엔자, 일본 뇌염 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "불활성화된 항원" 이란 용어는 감염성이 제거된 항원으로서 백신 항원으로 사용되는 항원을 말한다. 그러한 항원에는, 완전 바이러스 입자인 비리온, 불완전 바이러스 입자, 비리온-구성 입자, 바이러스 비(非)-구성 단백질, 감염을 방지하는 항원, 중화 반응 에피토프 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 상기 "불활성화된 항원" 이란 용어는 감염성은 제거되었으나 면역원성은 보유하는 항원을 말한다. 그런 항원이 백신으로 사용될 때, 이를 "사백신" 이라 부른다. 그런 불활성화된 항원의 예에는, 물리적(예컨대, X-선 조사, 열, 초음파), 화학적(포르말린, 수은, 알코올, 염소) 또는 기타 방법에 의해 불활성화된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "서브유닛 항원" 이란 용어는 자연 발생적 바이러스와 같은 병원체로부터 정제되거나, 또는 합성 또는 재조합 기술로 제조될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고 통상적으로 이용되며, 시판되는 장비, 시약, 벡터 등을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 경우, 서브유닛 항원은 바람직하게는 입자의 표면에 노출된 분자, 예컨대 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 매트릭스(M1, M2), 비-구조물(non-structures, NS), 폴리머라제 (PB1, PB2: 염기성 폴리머라제 1 과 2, 산성 폴리머라제 (PA)), 및 핵 단백질 (NP)이다. HA는 15 종류로 나타나고, NA는 9 종류로 나타난다고 알려져 있으며, 그 종류가 변하면 신균주가 발생될 수 있다.

본 발명에서 "아쥬반트(보강제)" 란 용어는 투여된 면역원과 함께 혼합할 경우, 면역 반응을 증가 내지는 변화시키는 물질을 일컫는다. "아쥬반트(보강제)"란 용어는 항원과 혼합할 경우 항체 생성을 증가시키고, 면역 반응을 증강시키는 물질을 총칭하여 일컫는다. 더 신속하거나, 더 강력한 또는 지속적인 반응을 유발하기 위해서는 아쥬반트를 통상의 백신 항원과 함께 사용할 것이 요구된다. 따라서, 항원 공급이 제한되거나 항원 생산에 비용이 많이 드는 경우에도 아쥬반트가 유용하다. 아쥬반트는 무기물, 박테리아성, 식물성, 합성 물질, 또는 숙주 물질로 분류될 수 있다.

본 발명에서 "CT"란 용어는 비브리오 콜레라에 의해 생성되는 외독소를 말하며, 이는 비브리오 콜레라 감염으로 인한 설사 증상의 원인 물질이다. 콜레라 독소가 효과적인 아쥬반트로 사용되긴 하나, 그 독성 때문에 임상적 적용 방법은 발견되지 않았다. 따라서, CT는 보통 효과적인 백신용 아쥬반트를 찾을 때 양성 대조군으로서 이용된다.

본 발명에서 "Poly(I:C)" 란 용어는 폴리이노신산(pI) 및 폴리시티딜산(pc) 을 포함하는 이중-가닥 RNA를 말한다.

본 발명에서 "점막 투여" 란 용어는 점막을 통한 투여 형태를 말한다. 여기서, 점막은 속이 빈 기관, 특히 척추 동물의 신체 외부와 소통하는 기관의 내벽을 말한다.

본 발명에서 "병원체" 란 용어는 숙주에서 질병 또는 장애를 일으킬 수 있는 유기체를 말한다. 인간 병원체의 예에는, 바이러스, 박테리아, 원생동물, 리케차, 클라미디아, 진균 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 백신으로 효과를 볼 수 있는 병원체에는, 통상적으로 바이러스, 박테리아 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "분비성 IgA 를 생성하기에 충분한 농도" 란 어구는 아쥬반트 또는 백신 그 자체의 능력, 즉 투여 후 면역 반응의 개시시 분비성 IgA를 생성시키는 아쥬반트 또는 백신 그 자체의 농도를 말한다. 상기 농도는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 달성할 수 있다.

본 발명에서 "분비성 IgA" 란 용어는 분비되는 IgA를 일컫는다. IgA는 외분비액 내의 주요 면역글로불린으로서, 점막 표면상의 감염을 막는 데 도움이 된다. 상기 IgA는 타액, 콧물, 및 장, 기관(氣管) 등에서 분비된 체액, 또는 초유에서 풍부하게 발견되지만, 혈청에도 존재한다.

본 발명에서 "투여"란 용어는 본 발명의 백신 또는 이를 함유한 약학적 조성물을 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 치료 대상 숙주에 공급하는 것을 의미한다. 상기 백신 또는 조성물을, 예컨대 혼합 상태로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트 조성물을 제공한다.

상기 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하고, A/New Caledonia/20/99(H1N1), A/Panama/2007/97(H3N2) 또는 B/Shandong/7/97(B)의 인플루엔자 종인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 아쥬반트 조성물 또는 백신은 안구 점막에 투여하는 제형인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 안약형 등과 같이 안구 부위에 투여하는 모든 제형으로 사용 가능하다.

본 발명의 실시예 및 실험예에서는 poly(I:C)를 인플루엔자 바이러스 백신의 안구 점막의 접종시 아쥬반트로 사용하는 경우, CT와 유사한 우수한 항체 생성 증진 효과를 가지고, CT와 달리 세포독성 및 염증반응이 거의 없는 안정성을 가지고 있음을 확인함으로써, poly(I:C)를 안구 점막용 인플루엔자 바이러스 백신의 유용한 아쥬반트로 사용할 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 도 8 참조).

결론적으로, 본 발명은 poly(I:C)가 CT가 가진 문제점인 세포독성이 있고 염증을 유발하는 부작용을 해결할 수 있으므로, CT를 대신하여 인플루엔자 바이러스 백신의 새로운 유용한 아쥬반트로 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 백신에 사용가능한 약학적으로 허용가능한 담체에는, 항산화제, 방부제, 착색제, 방향약, 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전재, 벌킹제(bulking agent), 완충제, 전달용 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 보강제가 포함되나 이제 한정되지 않는다. 통상적으로, 본 발명의 조성물 또는 백신을, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 백신 또는 이의 변형체(modification) 또는 유도체를 포함하는 조성물 형태로 투여한다. 본 발명에 사용되는 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 수용체에 대하여 비독성이고, 바람직하게는 사용량 및 사용 농도에서 불활성이다. 적절한 담체의 예로서, 중화 완충된 생리식염수, 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수를 들 수 있다. 기타 표준 담체, 희석제 및 부형제는 필요에 따라 함유될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 백신의 일반적 제조 방법은 다음과 같을 수 있다. 동물 의약 조성물, 유사 약물, 수산 양식용(aquaculture) 의약 조성물, 식품 조성물 및 미용 조성물 등 또한 공지된 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 등을 약학적으로 허용가능한 담체와 블렌딩하여 안구로 투여할 수 있다.

상기 투여는 분비성 IgA를 생성하기에 충분한 농도로 투여할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 백신은 안구 점막에 투여하는 제형인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 안약형 등과 같이 안구 부위에 투여하는 모든 제형으로 사용 가능하다.

본 발명의 백신의 양은, 사용 목적, 대상 질병(그 종류 등), 환자 연령, 체중, 병력 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 있어서 대상체(또는 환자)의 투여 빈도 또한, 사용 목적, 대상 질병(그 종류, 경중도 등), 환자 연령, 체중, 병력, 경과 등을 고려하여 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 투여 빈도의 예로서, 매일 내지 수개월마다 투여(예를 들어, 매주 내지 매월), 또는 매 전염병 유행기 전에 한 번 투여 등을 언급할 수 있다. 경과를 살피면서 매주 내지 매월 투여를 실시하는 것이 바람직하고, 최소한 약 1 주 간격으로 추가 면역을 실시하는 것이 유리하다. 추가 면역 간격은 약 3주 이상인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 백신의 투여량은 대상체의 연령, 체중, 증상 또는 투여 방법 등에 따라 다르며, 한계가 있는 것은 아니지만, 안구 점막 투여의 경우, 투여량은 0.001 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 1 mg 일 수 있다.

아울러, 본 발명은 i) poly(I:C); 및 ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원을 포함하는 백신(1), 및

상기 백신의 안구로의 투여방법, 투여량 또는 투여횟수 등에 관한 설명서(2)를 포함하는 안약형 백신용 키트를 제공한다.

상기 키트에 있어서, 설명서는 본 발명의 약제 등의 투여 방법 또는 내과의사 또는 환자와 같이 투여를 수행하는 사람, 및 진단을 수행하는 사람(환자일 수 있음)을 위한 진단 등의 방법에 대한 정보를 담고 있는 문서를 포함한다. 상기 설명서는 본 발명의 진단약, 예방약, 약제 등의 투여 절차에 관한 안내를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 본 발명이 실시되는 국가의 감독 기관이 정한 약식에 따라 제조되고, 감독 기관으로부터 승인을 얻었음을 명시할 수 있다. 상기 설명서는 제품첨부서라 불리는 것으로, 보통 서면으로 제공되나 이에 한정되지 않는다. 상기 설명서는, 예컨대 약병에 붙인 필름, 또는 전자 매체(예컨대, 인터넷, 이메일을 통해 제공되는 홈페이지(웹사이트)) 형태로 제공될 수도 있다.

상기 키트에 있어서, 용기에는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의하여 정해진 형식으로 된 통지서가 임의로 부착되어 있을 수 있는데, 이는 정부 기관에 의해 인간에의 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매를 승인함을 명시할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 마우스의 준비

특정 병원체 부재 BALB/c 마우스로서 6-10주령의 마우스들을 준비하였다(Orient Bio, Sungnam, Korea). 모든 마우스는 국제백신연구소(Seoul, Korea)에서 특정 병원체 부재 조건 하에서 실험 동물 시설에 유지시켰고 살균된 음식 및 여과된 수돗물을 자유식으로 제공되었다. 모든 동물 실험은 국제백신연구소(Seoul, Korea)의 동물연구위원회에 의해 승인받았다. 실험 조작 이전에, 마우스를 케타민(100 mg/kg body weight) 및 자일라진 염산염(10 mg/kgbody weight)의 복강(i.p.) 주사에 의해 마취시켰다.

< 실험예 1> 안구 점막에서 poly (I:C)의 아쥬반트로서의 효과 검증

BALB/c 마우스 안구 점막에 OVA(100ug)와 각종 아쥬반트(adjuvants)[CT(2 ug), poly(I:C)(10 ug), MPLA(10 ug), Alum(1 mg)]를 마이크로피페트를 이용하여 2주일에 한 번씩 총 3번 점안한 후, 마지막 점안 후 일주일 뒤 각종 점막 세척액(Tear, Nasal, Fecal, Vaginal)을 획득한 후, ELISA 분석법으로 IgG 및 IgA를 관찰하였다.

이때, 시료의 채취는 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, 혈청(Serum)은 레트로-오비탈 채혈(retro-orbital bleeding)을 통해 획득하였다. 눈물(Tear) 세척 샘플은 눈 마다 10 ml PBS로 세척함에 의해 획득하였다. 배설물(Fecal) 추출물은 0.1% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS에 배설물을 첨가함으로써 획득하였다. 상기 배설물은 볼텍싱에 의해 교반시킨 후, 원심분리한 다음, 상층액을 분석을 위해 채취하였다. 질(Vaginal) 세척 샘플은 100 ml PBS로 세척함에 의해 채취하였다. 마우스를 희생한 다음, 코(nasal) 세척 샘플을 피펫을 이용하여 비강의 내부 입구를 통해 100 ml PBS를 수세함에 의해 획득하였다.

이때, ELISA 분석은 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, ELISA 플레이트(Falcon, Franklin Lakes, NJ)를 OVA(100 mg/ml) 또는 비활성 A/PR/8(5 mg/ml) 또는 LPS(1 mg/ml)를 포함하는 PBS로 코팅시킨 다음, 4℃에서 밤새 인큐베이트시켰다. 블락킹은 1% BSA(Sigma-Aldrich)를 포함한 PBS로 수행하였고, 2배 순차적으로 희석한 샘플을 플레이트에 적용하였다. HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG 또는 IgA 항체(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)를 각 웰에 첨가한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이트시켰다. 칼라 형성을 위해, 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 용액(Moss, Pasadena, MD)을 사용하였다. 그런 다음, 플레이트를 정지 용액(0.5 N HCl)을 첨가한 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 450 nm에서 측정하였다. 항원 특이적인 항체의 탐지가능한 역가(Endpoint titer)는 배경 수준 보다 >0.1 흡광도를 보이는 최종 희석의 역수 log₂ 역가로 나타내었다. 총 IgA 수준의 검출을 위해, 플레이트를 염소 F(ab9)2 항-마우스 Ig로 코팅한 후, HRP-결합된 염소 항-마우스 IgA 항체(Southern Biotechnology Associates)를 검출 항체로서 사용하였다. OVA-특이적인 sIgA 항체 수준의 검출을 위해, 플레이트를 OVA(100 mg/ml)로 코팅한 후, 염소 항-pIgR(R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 HRP-결합된 래빗 항-염소 IgG(Southern Biotechnology Associates)를 검출 항체로서 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, CT를 함께 접종한 그룹에서 가장 많은 항원-특이적인 항체(IgG 및 IgA)를 생성하였음을 확인할 수 있었다. 혈청에서는 CT 접종 그룹 이외에 다른 아쥬반트를 접종한 그룹들에서도 항원-특이적인 IgG 항체가 유의적으로 증가하였다. 그러나, 점막 조직에서의 항원 특이 IgA 항체 분비는 CT를 첨가한 그룹 이외에 poly(I:C)를 접종한 그룹에서만 항체가 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 1). 이를 통해 안구 점막 접종 시 poly(I:C)가 CT 이외의 면역반응 유도에 효과적인 아쥬반트임을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> 인플루엔자 백신으로서 poly (I:C)의 아쥬반트로서의 효과 확인

상기 <실험예 1>과 같은 조건 하에 항원을 OVA에서 인플루엔자 백신(influenza vaccine)으로 사용됐던 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)(CJ, Korea) 으로 대체한 후, 각 아쥬반트들의 항체 생성 증진 효과를 확인하였다.

이때, HA는 TIV(trivalent influenza vaccine)(Biken)의 HA로서 A/New Caledonia/20/99(H1N1), A/Panama/2007/97(H3N2) 및 B/Shandong/7/97(B)의 세 가지 인플루엔자 종을 사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CT 및 poly(I:C)를 접종한 그룹들에서 가장 많은 항체 생성 증진 효과가 확인되었으며, 특히 poly(I:C) 그룹에서는 CT와 비슷한 수준의 항체생성 증진효과를 보였다(도 2). 이를 통해 poly(I:C)가 CT 이외의 안구 점막에서의 인플루엔자 백신 항원 사용시 효과적인 면역 반응을 유도하는 아쥬반트임을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 안구 점막에서의 백신 항원의 적정 투여량 확인

안구 점막에서의 poly(I:C) 아쥬반트와 함께 사용되는 백신의 최소 및 적정 사용량을 확인하기 위해, BALB/c 마우스에 HA 항원의 양을 농도별로 2주 간격으로 두 번 접종한 후 혈청 및 점막조직 세척액에서의 항원 특이 항체 생성 수준을 확인 및 비교하였다.

구체적으로, 백신 항원의 적정 접종량을 확인하기 위해 0.1 ug ~ 2 ug의 HA(CJ, Korea)를 10 ug의 poly(I:C)와 함께 2주 간격으로 두 번 접종한 후 마지막 접종 2주 후 혈청과 점막조직 세척액에서의 항원 특히 IgG 및 IgA 생성량을 ELISA 분석법으로 측정하였다. 이때, 혈청에서는 IgG 항체, 그리고 각 점막 세척액에서는 IgA 항체의 생성량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 혈청에서의 HA 백신 항원-특이적인 IgG 항체 생성량이 항원 단독 접종 그룹에 비해 유의하게 증가한 그룹은 1 ug의 HA 백신 항원을 10 ug의 poly(I:C)와 함께 접종한 그룹뿐이었으며, HA 항원을 0.1 ug 또는 2 ug을 접종한 그룹들은 유의적인 항체 생성 증가가 없었다(도 3).

특히, 1 ug 항원의 두 배를 접종한 그룹인 2 ug HA 항원 접종 그룹에서의 항체 생성 증진 효과가 1 ug HA 항원 접종 그룹에 비해 낮은 것은 HA 백신 제재의 낮은 농도(1 ug/11ul)에 기인한 것으로 추정되었다. 1 ug/11 ul 농도의 백신 항원을 2 ug/head로 접종을 하게 되면 안구점막 백신의 총 부피는 26 ul(항원 22 ul + poly(I:C) 4 ul)가 되며 이는 항원 1 ug을 접종하는 경우(안구점막 백신의 총량: 15 ul)에 비해 poly(I:C)의 양이 절반 가량으로 희석이 됨과 동시에, 마우스의 눈에 방울 형태로 접종이 되는 백신이 부피가 많아짐에 따라 방울의 크기가 커지고 그에 따라 마취에서 깨어난 마우스가 움직일 때 손실되는 양이 15 ul의 백신에 비해 컸을 것이라 추정되었다. 따라서 이에 따라 항원을 2 ug을 접종한 그룹에서는 poly(I:C)의 효과가 반감 또는 상당량 손실되었기에 1 ug의 항원을 접종한 그룹보다 항체 생성 증진 효과가 낮았으리라 추정되었다. 따라서, 이후에 진행되는 실험은 모두 HA 백신 항원을 1 ug으로 고정하여 투여하였다.

< 실험예 4> 안구 점막에서의 poly (I:C) 아쥬반트의 적정 투여량 확인

안구 점막에서의 poly(I:C) 아쥬반트의 최소 및 적정 사용량을 확인하기 위해, BALB/c 마우스에 poly(I:C)의 양을 농도별로 2주 간격으로 두 번 접종한 후 혈청 및 점막조직 세척액에서의 항원 특이 항체 생성 수준을 확인 및 비교하였다.

구체적으로, BALB/c 마우스에 1 ug HA 백신 항원과 함께 1 ug, 10 ug, 30 ug의 poly(I:C)를 각각 눈에 2주 간격으로 두 번 투여한 후 마지막 접종 2주 후에 혈액과 점막 세척액의 HA 특이적인 항체 생성 수준을 ELISA로 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 눈물과 질 세척액의 샘플에서만 1 ug와 10 ug poly(I:C) 투여 그룹 간의 유의적인 IgA 항체 생성 수준 차이가 있었을 뿐 혈액과 나머지 점막 세척액의 poly(I:C)가 투여된 그룹들 간의 유의적인 IgG 또는 IgA 항체 생성 수준의 차이는 없었다(도 4).

이는 소량(1 ug)의 poly(I:C)를 투여하더라도 그 이상의 poly(I:C)를 투여한 것과 비슷한 수준의 항체 생성 증진 효과를 보일 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 아쥬반트로서의 poly(I:C)를 눈으로 백신 접종할 때, 최소한의 효과적인 poly(I:C)의 투여량은 1 ug임을 알 수 있었다. 그리고 10 ug 이상의 poly(I:C)를 투여하더라도 항체 생성 증진 효과는 10 ug poly(I:C)를 투여한 것과 효과가 비슷하며 더 이상의 부가적인 증진 효과는 보이지 못함을 알 수 있었다. 따라서 이후 실험에서는 최적의 아쥬반트성을 발휘하며 이에 따른 효과를 확인하기 위해 10 ug의 poly(I:C)를 투여하였다.

< 실험예 5> 안구 점막 접종과 비강점막 접종에서의 항체 생산 증진 효과 비교

안구 점막에서의 poly(I:C)의 효과를 다른 접종 경로와의 비교를 통한 객관적인 확인을 하고자 하였다. 한편, 비강 접종법은 혈청과 점막 항체 생성을 가장 잘 촉진시킨다고 알려져 있다. 이에, poly(I:C)의 아쥬반트성을 점안 접종법과 비강 접종법 각각의 효과 비교를 통해 확인하였다.

<5-1> HA 백신 항원을 이용한 확인

BALB/c 마우스에 1 ug의 HA 백신 항원에 1 ug 또는 10 ug의 poly(I:C)를 함께 눈과 코에 각각 2주 간격으로 두 번 접종한 후 마지막 접종 2주 후 HA 특이적인 항체를 ELISA로 혈청과 점막 세척액 샘플들에서 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 혈청에서는 비강으로 접종한 그룹들이 점안 접종 그룹들보다 유의적으로 높은 HA-특이적인 IgG 항체 생성 수준을 보였다. 먼저, 점안과 비강 경로로 poly(I:C)를 항원과 같은 양 처리한 그룹 간의 비교 시 비강 접종 그룹에서의 poly(I:C)에 의한 항체 생성 증진 효과가 점안 경로 그룹의 효과보다 큰 것을 알 수 있었다. 그러나, 타액 샘플을 제외한 모든 점막 세척액에서의 HA-특이적인 IgA 항체 생성 수준을 poly(I:C)의 양이 같은 두 그룹들 중 점안접종 그룹과 비강접종 그룹들을 각각 비교하였을 때, 두 접종 경로별 간의 항체 생성 증진효과가 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 5).

<5-2> H1N1 분할 백신 항원을 이용한 확인

또한 poly(I:C)의 아쥬반트 효과를 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 백신이 아닌 비활성 전분할 백신(inactivated whole split vaccine)의 항원을 사용할 경우에도 점안 접종과 비강 접종 간에 유의적 효능의 차이가 없는 지를 확인하기 위해 H1N1 influenza virus A/California/7/2009의 분할 백신을 항원으로 사용하여 점안 및 비강접종을 한 후 poly(I:C)의 아쥬반트성을 확인하였다.

구체적으로, 6 ~ 8주령의 BALB/c mice에 1ug 또는 10ug의 poly(I:C)를 1 ug의 H1N1 분할 백신과 함께 점안 및 비강 경로로 각각 2주 간격으로 두 번 접종한 후, 마지막 접종 2주 후에 혈청 및 점안 세척액 샘플에서 H1N1 분할 백신 항원-특이적인 IgG와 IgA 항체 생성 수준을 각각 ELISA 분석법으로 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 혈청에서는 비강 접종 그룹이 점안 접종 그룹들보다 같은 양의 poly(I:C)를 처리한 그룹에 비해 항원 특이적인 IgG 항체 생성 수준이 더 높았다. 이는 HA-백신과 마찬가지로 poly(I:C)는 비강 접종법에서 점안접종보다 혈청에서의 시스템적 IgG 항체 형성을 더 효과적으로 증진시킨다고 할 수 있겠다. 그러나, 점막 세척액 샘플들에서의 IgA 항체 생성 증진 효과는 거의 대부분의 점막 샘플에서 점안 접종과 비강 접종 간의 경로 특이적 항체 생성 증진 효과의 차이는 없는 것으로 관찰되었다(도 6).

따라서, 이를 통해 poly(I:C) 아쥬반트를 HA 백신 또는 H1N1 분할 백신의 항원과 함께 점안으로 접종하는 것으로도 비강으로 접종한 후 항체생성을 증진시키는 것과 비슷한 효율적인 아쥬반트성을 나타낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 6> Poly (I:C)의 안전성 확인

<6-1> 세포분포 변화 확인

CT는 점막을 통해 면역성을 유발시키는 아쥬반트 중 가장 효과적인 제재이지만 세포독성을 가지고 염증을 일으키는 부작용을 가지고 있다. 그러나 poly(I:C)는 이미 임상에서도 사용될 정도로 안전성이 확인된 아쥬반트이다. 이에 대한 확인을 점안 후, 세포분포 변화로 한 번 더 확인하였다.

구체적으로, 6-8주령의 BALB/c 마우스에에 PBS, 1 ug의 HA 단독, 및 1 ug의 HAs+ 10 ug poly(I:C)를 각각 점안 접종한 후 결막 조직에서 CD8α 및 CD11c 세포를 얻은 후 상기 세포들을 각각 FITC 및 APC로 염색한 다음, 24시간째에 결막 조직에서의 세포변화를 유세포분석기를 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, CT를 접종한 그룹에서는 다른 그룹에서와는 달리 결막 조직이 부어있는 것을 확인하였고, 이에 따른 CD8α+ 세포들이 매우 증가했음을 확인하였다(도 7).

따라서 이를 통해 CT와는 달리 poly(I:C)에서는 접종 후에도 염증이 없는 안전한 아쥬반트임을 확인할 수 있었다. 또한 HAs를 백신으로 사용할 경우에도 PBS 대조군과 차이가 없을 정도로 변화가 없음을 확인하면서 점안용 백신으로 HA 백신이 안전하게 사용될 수 있음도 확인할 수 있었다.

<6-2> 염증성 사이토카인 발현 여부 확인

poly(I:C)를 투여한 후 눈에서의 염증성 사이토카인 발현 여부를 확인하기 위해, HA 백신 항원과 함께 poly(I:C)를 투여한 후 24시간 후에 염증성 사이토카인 의 발현 여부를 확인하였다.

구체적으로, 6-8주령의 BALB/c 마우스에 1 ug의 HA 백신 항원 단독, 항원 + 10 ug poly(I:C), 또는 항원 + CT와 함께 점안접종을 한 후, 각 시간별(1h, 6h, 12h, 24h)로 조직에서 총 RNA를 추출한 다음, 역전사 RNA로 cDNA를 합성하였다. 이를 주형으로 사용하여 IL-1alpha 및 TNF-alpha의 mRNA 발현 증가 여부를 실시간(real-time) PCR로 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, PBS, HA 백신 항원 단독, 및 HA 항원 + poly(I:C)을 처리한 그룹들 모두 IL-1alpha mRNA 및 TNF-alpha mRNA 발현 증가가 유발되지 않았다(도 8).

Claims

poly(I:C)를 포함하는 안약형 백신 아쥬반트(adjuvants).
제 1항에 있어서, 상기 백신은 인플루엔자 바이러스 백신인 것을 특징으로 하는 안약형 백신 아쥬반트.
제 1항에 있어서, 상기 poly(I:C)는 안구 점막 투여시 항체 생성을 증진시키고, 세포독성 및 염증 반응이 없는 것을 특징으로 하는 안약형 백신 아쥬반트.
하기를 포함하는 안약형 백신:
i) poly(I:C); 및
ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.
제 4항에 있어서, 상기 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 안약형 백신.
제 4항에 있어서, 상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 안약형 백신.
하기를 포함하는 백신을 개체의 안구에 투여하는 것을 포함하는 안구 면역의 유도 방법:
i) poly(I:C); 및
ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원.
제 7항에 있어서, 상기 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 안구 면역의 유도 방법.
제 7항에 있어서, 상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 안구 면역의 유도 방법.
하기를 포함하는 안약형 백신용 키트:
A) 하기를 포함하는 안약형 백신:
i) poly(I:C); 및
ii) 병원체의 서브유닛 항원 또는 불활성화된 항원; 및
B) 상기 백신의 안구 점막 투여를 위한 방법, 투여량 또는 투여횟수를 포함한 내용의 설명서.
제 10항에 있어서, 상기 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 안약형 백신용 키트.
제 10항에 있어서, 상기 서브유닛은 인플루엔자 바이러스 서브유닛 HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 안약형 백신용 키트.