KR20140045646A - Composition for pain relief using an extract of litsea japonica or compounds isolated therefrom - Google Patents

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Abstract

Disclosed is a composition for pain relief using a Litsea japonica extract or a compound isolated from the same which is verified to have peripheral and central analgesic effect via an acetic acid-induced writing test, a tail-flick test, and a hot-plate test. [Reference numerals] (1) Solvent fraction (Hex, MC, EtOAc, BuoH, H2O); (3) VLC implementation (Hex, MC, EtOAc, MeOH); (AA) Litsea japonica fruit extract with 70% ethanol (50 g); (BB) Hamabiwalactone B (166 mg, purity 67%); (CC) Hamabiwalactone A (88.6 mg, purity 98% or greater)

Description

까마귀쪽나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물{Composition for Pain Relief Using an Extract of Litsea japonica or Compounds Isolated Therefrom}Composition for Pain Relief Using an Extract of Litsea japonica or Compounds Isolated Therefrom}

본 발명은 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물에 관한 것이다.
The present invention is a crow ( Litsea) japonica ) extract or a composition for analgesic using a compound isolated therefrom.

통증은 실질적인 또는 잠재적인 조직 손상으로 나타나는 감각적이고 정서적인 불유쾌한 경험으로 정의된다(국제통증학회(IASP), 1994). Pain is defined as a sensory and emotional unpleasant experience that manifests itself as a substantial or potential tissue injury (IASP, 1994).

통증은 신경 생리적 기전에 따라 침해성 통증(nociceptive pain)과 신경병증성 통증(neuropathic pain)으로 구분되고 있다(국제통증학회(IASP), 1994). Pain is classified into nociceptive pain and neuropathic pain according to neurophysiological mechanisms (IASP, 1994).

침해성 통증은 화상, 부상, 외·내부의 압력(예컨대, 종양) 등 조직의 실제적 또는 잠재적 손상에 의해서 발생하는 통증으로, 신경 말단(nerve endings)이 활성화되면서 척수, 시상, 대뇌와 같은 일반적인 통증 전달 경로를 거쳐 발생하는 통증을 말한다. 침해성 통증은 체성 통증(somatic pain)과 내장통(visceral pain)으로 구분된다. 체성 통증은 다시 표재성 체성 통증과 심부 체성 통증으로 구분되는데, 표재성 체성 통증은 피부나 점막 부위의 기계적, 화학적, 열 자극에 의해 발생하는 통증을 말하며 국소 부위에 한정되어 나타나고, 심부 체성 통증은 관절, 인대, 근육 또는 근막을 자극함으로써 발생되는 것으로 국소적으로 나타나는 경우는 드물고 통증이 심할 경우 다른 부위로 전파되는 경향이 있어 연관통(referred pain)을 일으키는 경우가 많다. 내장통은 내장에 분포된 통각섬유에 의해 몸 속 깊이 느껴지는 둔한 통증을 말하는데, 내장에 대한 통각 섬유의 분포가 적기 때문에 통증 부위가 미만성으로 명확하지 않고 오심, 구토 등 여러 가지 자율신경 증상을 동반한다. Invasive pain is pain caused by actual or potential damage to the tissue, such as burns, injuries, or external or internal pressures (e.g., tumors). Common pain, such as the spinal cord, thalamus, and cerebrum, as nerve endings are activated Refers to pain that occurs through a route of transmission. Invasive pain is divided into somatic pain and visceral pain. Somatic pain is divided into superficial somatic pain and deep somatic pain. Superficial somatic pain refers to pain caused by mechanical, chemical and thermal stimulation of the skin or mucous membrane area, and is limited to the local area. It is rare to appear locally as a result of stimulating ligaments, muscles or fascia, and when pain is severe, it tends to propagate to other sites, which often causes related pain. Visceral pain refers to dull pain felt deep in the body by the painful fibers distributed in the intestines.The painfulness of the painful fibers is less pronounced due to the less distribution of the painful fibers to the intestines, and it is accompanied by various autonomic symptoms such as nausea and vomiting. .

신경병증성 통증은 신경계 손상이나 신경 기능의 이상에 의해 야기되는 통증으로 정의되며(국제통증학회(IASP), 1994), 대표적인 만성 난치성 통증으로 침해성 통증과는 그 기전이 다른 것으로 알려져 있다(Lancet 1999; 353:1959-64).Neuropathic pain is defined as pain caused by damage to the nervous system or abnormalities of nerve function (IASP, 1994), and is a representative chronic refractory pain that is known to have a different mechanism from invasive pain (Lancet). 1999; 353: 1959-64).

신경병증성 통증은 자발통(spontaneous pain)(통각 수용 자극이 없는 상태에서도 나타나는 통증), 이질통(allodynia)(정상적으로 통증을 유발하지 않는 자극에 의해 유발되는 통증), 통각과민(hyperalgesia)(유해 자극에 의해 과도한 통증 반응을 보이는 현상) 등의 증상을 특징적으로 나타낸다. Neuropathic pain can be caused by spontaneous pain (pain even in the absence of pain accepting stimuli), allodynia (pain caused by stimuli that do not normally cause pain), and hyperalgesia (harmful stimulus). Symptoms of excessive pain response).

신경병증성 통증은 중추형(central type)과 말초형(peripheral type)으로 구분할 수 있으며, 중추 신경병증성 통증은 뇌종양, 뇌출혈, 척수구멍증(syringomyelia), 후천성면역결핍증후군 등과 같이 중추 신경 조직의 손상으로 척수, 뇌간, 시상, 피질을 자극하여 나타나는 통증을 말하며, 말초 신경병증성 통증은 대상포진 후 신경통, 당뇨 신경병증, 복합 부위 통증 증후군 2형 등과 같은 말초 신경계의 이상에 의한 지속적인 통증을 말한다. Neuropathic pain can be classified into a central type and a peripheral type. Central neuropathic pain can be classified into a central nervous system such as a brain tumor, cerebral hemorrhage, syringomyelia, and acquired immune deficiency syndrome. Injury refers to pain caused by stimulation of the spinal cord, brainstem, thalamus and cortex. Peripheral neuropathic pain refers to persistent pain caused by abnormalities of the peripheral nervous system such as neuralgia, diabetic neuropathy and complex site pain syndrome type 2 after shingles. .

침해성 통증은 일반적인 진통용로 완화시킬 수 있다. 코데인, 모르핀, 펜타닐 등의 마약성 진통용나 해열 작용과 진통 작용을 갖는 아세트아미노펜, 비스테로이드성 소염진통용 등의 미마약성 진통용가 침해성 통증에 사용되고 있다.Invasive pain can be alleviated for general analgesia. Narcotic analgesics such as codeine, morphine, and fentanyl, and narcotic analgesics such as acetaminophen and nonsteroidal anti-inflammatory analgesic, which have antipyretic and analgesic effects, are used for invasive pain.

그러나 신경병증성 통증에는 일반적인 진통용보다는 gabapentin 등의 항경련제와 venlafaxine 등의 항우울제가 효과적이다.However, anticonvulsants such as gabapentin and antidepressants such as venlafaxine are more effective for neuropathic pain.

한편, 까마귀쪽나무(Litsea japonica)는 쌍떡잎식물 미나리아재비목 녹나무과의 상록 소교목으로 표고 700 m 이내의 바닷가 및 산기슭에 분포하며, 높이 약 7 m의 나무로서, 7 ~ 10월에 잎겨드랑이에서 겹산형꽃이 차례로 피고, 열매는 핵과로 타원형이며, 다음해 10월에 옅은 자줏빛으로 익는다. On the other hand, crowwood ( Litsea japonica ) is an evergreen sub-tree of the dicotyledonous genus Amphitaceae, distributed on the beach and foothills within 700 m above sea level. It is a 7 m tall tree that blooms from the axils in July to October. The nucleus is oval, and ripens pale purple in October of the following year.

까마귀쪽나무는 여러 종류의 에센셜오일, 지방산, 락톤, 알카로이드, 테르페노이드 등이 발견되었으며(Tanaka 등, 1990; Takeda 등, 1972), 잎으로부터 분리된 플라보노이드 성분인 에피카테친, 아프젤린, 퀘르시트린 및 틸리로사이드 등은 항보체계 활성을 억제한다고 보고되어 있다(Lee 등, 2005). 또한 까마귀쪽나무 잎 추출물은 항암제에 내성을 가지고 있는 세포에서 apoptosis를 유도하여 증식을 억제한다고 보고되어 있으며(Kim et al., Kor. J. Pharmacogn 40(1): 65~69, 2009), 대한민국 공개특허 10-2008-0020738에서는 까마귀쪽나무 잎 추출물이 항염 활성 및 골 대사 관련 인자를 억제한다는 내용이 공개되어 있다. Ravens have been found to contain a variety of essential oils, fatty acids, lactones, alkaloids, and terpenoids (Tanaka et al., 1990; Takeda et al., 1972). The flavonoids from the leaves are epicatechin, aphelin, and quercitrin. And tyloriside and the like have been reported to inhibit the anti- complementary system activity (Lee et al., 2005). It has also been reported that crow leaf extract inhibits proliferation by inducing apoptosis in cells resistant to anticancer drugs (Kim et al., Kor. J. Pharmacogn 40 (1): 65 ~ 69, 2009), Korea Patent Document 10-2008-0020738 discloses that crow leaf extract inhibits anti-inflammatory activity and bone metabolic related factors.

이처럼 현재까지의 연구는 까마귀쪽나무 잎 추출물에 대한 질환 타겟 연구가 대부분이다.As such, most of the studies to date are disease-targeted studies on the extracts of crow's leaves.

본 발명은 Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test로 확인된 까마귀쪽나무 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물의 진통 효과를 개시한다.
The present invention discloses the analgesic effect of crowwood extract or compounds isolated from Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test and Hot-plate Test.

본 발명의 목적은 까마귀쪽나무 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a composition for analgesic using crowberry extract or a compound isolated therefrom.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
Other and further objects of the present invention will be described below.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 까마귀쪽나무 열매의 에탄올, 헥산, 디클로메탄 등에 의한 추출물, 그 추출물의 디클로로메탄 등에 의한 분획물 및 이로부터 분리된 화합물인 하마비와락톤 A(Hamabiwalactone A)와 하마비와락톤 B(Hamabiwalactone B)가 Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test로 통해 진통 효과를 가짐을 확인함으로써 완성된 것이다. 여기서 Acetic acid-induced Writhing test는 통증이 침해성 통증이든 신경병성 통증인지를 불문하고 말초성 통증 억제 물질을 스크리닝에 사용되는 방법이고, Tail-flick Test 및 Hot-plate Test는 통증이 침해성 통증이든 신경병성 통증인지를 불문하고 중추성 통증 억제 물질의 스크리닝에 사용되는 방법이다(Journal of Ethnopharmacology 120:56-62, 2008; European Journal of Pharmacology 587:104-111, 2008; J. of Oriental Neuropsychiatry 19(2):223-230, 2008; 대한침구학회지 28(2):57-67, 2011). The present invention, as confirmed in the following Examples and Experimental Examples, extracts of crowberry fruit by ethanol, hexane, dichloromethane, etc., fractions of the extract by dichloromethane, etc. Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B were tested by the Acetic acid-induced Writhing test, Tail-flick Test, and Hot-plate Test. Here, the Acetic acid-induced Writhing test is a method used for screening peripheral pain inhibitors, whether the pain is invasive or neuropathic pain, and the Tail-flick Test and Hot-plate Test are nerves whether the pain is an invasive pain or not. It is a method used for screening of central pain inhibitors, whether or not it is pathological pain (Journal of Ethnopharmacology 120: 56-62, 2008; European Journal of Pharmacology 587: 104-111, 2008; J. of Oriental Neuropsychiatry 19 (2). : 223-230, 2008; The Journal of Korean Acupuncture Society 28 (2): 57-67, 2011).

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 진통용 조성물은 까마귀쪽나무 열매 추출물, 아래의 [화학식 1]의 하마비와락톤 A 또는 아래의 [화학식 2]의 하마비와락톤 B를 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.The present invention is provided on the basis of the results of the experiment, the composition for analgesic of the present invention is a crow barberry fruit extract, Hamabibi and lactone A of [Formula 1] or Hamabibi and lactone B of [Formula 2] below It is characterized by including as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

[화학식 2](2)

Figure pat00002
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본 명세서에서, "추출물"은 추출 대상인 까마귀쪽나무 열매를 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 부탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 물(증류수), 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 조추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 분획하여 얻어진 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 여기서 추출 방법은 추출 대상인 까마귀쪽나무 열매를 추출 용매에 침지시키는 방법과 추출 대상을 추출 용매로 증류시키는 방법을 포함한다. 침지를 통한 추출 방법에는 냉침, 가온, 초음파, 환류 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매로 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물, 또 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 그럼에도 상기 "추출물"은 바람직하게는 그 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매, 특히 60% 내지 90%의 에탄올 수용액으로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다. 더 바람직하게는 상기 60% 내지 90%의 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어지는 어느 한 분획 용매층의 분획물을 의미한다. 가장 바람직하게는 상기 순차적 분획물 중 아래의 실험예에서 높은 진통 효과를 보이는 것으로 확인된 디클로로메탄층의 분획물을 의미한다. 여기서 "순차적 분획한다"의 의미는 분획 후의 잔여 물층을 계속 사용하여 상기 열거된 순서의 용매로 분획한다는 것이며, 또 여기서 %는 부피 백분율에 의한 농도(v/v) 표현으로서, 당업계에 알려진 바와 같이 일정 부피의 용액 중에 녹아 있는 일정 부피의 용질을 의미한다. 예컨대 30%(v/v)는 용액 100㎖에 용질 30㎖가 용해되어 있다는 것이 된다. 본 명세서의 "추출물"의 의미에는 여과 등을 통하여 정제된 형태의 추출물, 추출 용매가 일부 제거된 액상의 농축된 추출물 그리고 추출 용매가 완전히 제거된 고형상의 추출물이 포함된다. In the present specification, "extract" refers to the extract of the crowberry fruit, such as methanol, ethanol, such as alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, butanol, chloroform, dichloromethane, water (distilled water), or a mixed solvent thereof It is understood as meaning including the crude extract obtained by extraction and the extract obtained by fractionation with the above-listed solvent in the extract. Here, the extraction method includes a method of immersing the crowberry fruit to be extracted in the extraction solvent and a method of distilling the extraction object into the extraction solvent. Extraction method by dipping may be applied to any method such as cold soaking, heating, ultrasonic, reflux. In the case of fractionated extract, the crude extract is obtained by suspending the crude extract in a specific solvent and mixing and standing with a solvent having a different polarity, the extract obtained by suspending the crude extract in a specific solvent and sequentially dividing with a solvent having a different polarity, or It is meant to include a fraction obtained by adsorbing the crude extract on a column packed with silica gel and the like, and using a hydrophobic solvent, a hydrophilic solvent, or a mixed solvent thereof as a mobile phase. Nevertheless, the term "extract" preferably means that the extract is obtained by extraction (immersion or distillation) with water, ethanol or a mixed solvent thereof, especially 60% to 90% aqueous ethanol solution. More preferably, it means a fraction of any one fraction solvent layer obtained by suspending the 60% to 90% ethanol aqueous solution extract in water and sequentially fractionating with hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol. Most preferably, the sequential fraction refers to a fraction of the dichloromethane layer confirmed to have a high analgesic effect in the following experimental example. By "sequential fractionation" here is meant to continue using the remaining water layer after fractionation to fractionate with the solvents in the order listed above, where% is the concentration (v / v) expression by volume percentage, as known in the art. As such, it refers to a volume of solute dissolved in a volume of solution. For example, 30% (v / v) means that 30 ml of the solute is dissolved in 100 ml of the solution. As used herein, the term "extract" includes extracts in a purified form through filtration, concentrated liquid extracts in which the extraction solvent is partially removed, and solid extracts from which the extraction solvent is completely removed.

또 본 명세서에서, "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.In addition, in the present specification, "active ingredient" means a component that can exhibit the desired activity alone or in combination with a carrier which is itself inactive.

또 본 명세서에서, "진통"은 침해성 통증과 신경병증성 통증의 개선 효과를 의미한다. 여기서 "개선"이란 통증의 제거, 완화, 예방을 포함하는 의미이다. In addition, in the present specification, "analgesia" means an effect of improving the invasive pain and neuropathic pain. "Improvement" here means to remove, alleviate, or prevent pain.

본 발명의 진통용 조성물은 그 유효성분을 제형, 배합 목적 등에 따라 진통 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.999 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 진통 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.The analgesic composition of the present invention may include the active ingredient in any amount (effective amount) as long as it can exhibit analgesic activity according to the formulation, formulation purpose, etc., a typical effective amount is 0.001 weight based on the total weight of the composition It will be determined in the range of% to 99.999 weight%. Here, "effective amount" refers to the amount of active ingredient that can exhibit analgesic activity. Such effective amounts can be determined experimentally within the ordinary skill of those skilled in the art.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.The composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition in a specific embodiment.

본 발명의 약제학적 조성물은, 유효성분인 넓미역 추출물을 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 혼합하여 경구투여용 또는 비경구투여용으로 제제화하게 된다.The pharmaceutical composition of the present invention is formulated for oral administration or parenteral administration by mixing the active extract of kaleidoscopic extract as a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, additives and the like.

제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 예는 락토스, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜, 기타 상용되는 것을 포함한다.Examples of pharmaceutically acceptable carriers or excipients include lactose, magnesium stearate, starch, talc, gelatin, agar, pectin, gum arabic, olive oil, sesame oil, cacao butter, ethylene glycol and others commonly used.

경구투여용 고체 조성물의 예는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 포함한다. 이와 같은 고체 조성물에서는 유효성분인 식물 추출물이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 포도당, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미노메타실리케이트 등과 혼합된다. 고체 조성물은, 통상적인 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예를들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유소 글리콜산 칼슘과 같은 붕해제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 물질로 이루어진 필름으로 피복될 수 있고, 경우에 따라서는 2개 이상의 층으로 피복될 수 있다. Examples of the solid composition for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like. In such a solid composition, the plant extract as an active ingredient is mixed with at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminometasilicate, Mixed. The solid composition may contain additives other than an inert diluent, for example, a lubricant such as magnesium stearate, a disintegrant such as calcium cellulose glycolate, a solubilizing agent such as glutamic acid or aspartic acid, according to a conventional method. The tablets or pills may be coated with a film made of a material such as sucrose, gelatin, hydroxypropylmethylcellulose phthalate or the like, if necessary, and may be coated with two or more layers as the case requires.

경구투여용 액체조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 이 조성물은, 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함할 수 있다.The liquid composition for oral administration may contain a generally used inert diluent such as purified water, ethanol, etc., including pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like. The composition may contain, in addition to an inert diluent, a wetting agent, an adjuvant such as a suspending agent, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance, an antiseptic, and the like.

비경구투여용 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 에멀젼화제가 포함된다. 수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 주사용 물 및 주사용 생리식염수가 포함된다. 비수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 에탄올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80® 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은, 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예를 들면, 유당), 용해보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균과 같은 가열멸균, 또는 살균제 배합 등의 통상적인 멸균 방법으로 무균화될 수 있다. 주사제는 용액제제, 또는 사용 시에 용해시켜 사용할 수 있는 동결-건조 제제일 수 있다. 동결-건조를 위한 부형제로는 예를 들면, 만니톨, 글루코스 등의 당알콜이나 당류를 사용할 수 있다.Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsifiers. Examples of aqueous solutions and suspensions include water for injection and physiological saline for injection. Examples of the non-aqueous solution / suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80® and the like. Such a composition may again contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents (for example, lactose), and solubilizing agents (for example, glutamic acid, aspartic acid). These can be sterilized by a conventional sterilization method such as filtration sterilization with a microfiltration membrane, heat sterilization such as high pressure steam sterilization, or sterilizing agent combination. Injections can be solution formulations or freeze-dried preparations which can be used by dissolving in use. Examples of excipients for freeze-drying include sugar alcohols and sugars such as mannitol, glucose and the like.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여방법 또는 비경구 투여방법으로 투여된다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered by an oral administration method or a parenteral administration method.

바람직하기는 비경구 투여방법, 예를 들면, 주사에 의한 투여(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등으로 투여), 경피투여, 경점막투여(경직장투여 등), 경폐투여 등이다. 물론 경구투여방법도 사용될 수 있다.Preferable examples include parenteral administration methods such as administration by injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal administration, transmucosal administration (transrectal administration, etc.) to be. Of course, oral administration methods may also be used.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분의 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 0.005 ㎍/kg ~ l00 mg/kg의 범위이고, 바람직하기는 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg의 범위이다. 그러나 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다. The dosage of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may be determined according to the severity of the disease and the age of the patient, but is generally in the range of 0.005 / / kg to 100 mg / kg, preferably 0.02 / / 5 mg / kg. However, since the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined in view of various related factors such as route of administration, age, sex, weight, and patient's severity of the patient, the dose is limited in any aspect to the scope of the present invention It should not be understood.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 항염증용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an anti-inflammatory composition.

본 발명의 항염증용 조성물은 까마귀쪽나무 열매의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 디클로로메탄층의 분획물을 그 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.The anti-inflammatory composition of the present invention comprises a dichloromethane layer fraction obtained by suspending the water, ethanol or mixed solvent extracts of the crowberry tree in water and sequentially dividing them into hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol. It is characterized by including as an active ingredient.

본 발명의 항염증용 조성물에 있어서, "순차적"의 의미, 유효량 등과 관련해서는 본 발명의 진통용 조성물과 관련하여 설명한 바가 적용될 수 있는 한 그대로 유효하다.In the anti-inflammatory composition of the present invention, the meaning of "sequential", an effective amount, and the like are effective as long as the bar described with respect to the analgesic composition of the present invention can be applied.

본 발명의 항염증용 조성물은 구체적으로 약제학적 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 항염증용 조성물이 약제학적 조성물로 파악될 경우 전술한 본 발명의 진통용 조성물과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하다. The anti-inflammatory composition of the present invention can be understood specifically as a pharmaceutical composition. When the anti-inflammatory composition of the present invention is identified as a pharmaceutical composition, the bar described in relation to the above-mentioned analgesic composition of the present invention is effective as it is.

본 발명의 항염증용 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.The anti-inflammatory composition of this invention can be grasped | ascertained as a food composition in another specific aspect.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.The food composition of the present invention may contain sweetening agents, flavoring agents, physiologically active ingredients, minerals and the like in addition to the active ingredients thereof.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. Sweetening agents may be used in an amount that sweetens the food in a suitable manner, and may be natural or synthetic. Preferably, natural sweeteners are used. Examples of natural sweeteners include sugar sweeteners such as corn syrup solids, honey, sucrose, fructose, lactose and maltose.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등의 형태의 것들이 이용될 수 있다. Flavors may be used to enhance taste or flavor, both natural and synthetic. Preferably, a natural one is used. When using natural ones, the purpose of nutritional fortification can be performed in addition to the flavor. The natural flavor may be obtained from apples, lemons, citrus fruits, grapes, strawberries, peaches, and the like, or may be obtained from green tea leaves, round leaves, jujube leaves, cinnamon, chrysanthemum leaves, jasmine and the like. Also, those obtained from ginseng (red ginseng), bamboo shoots, aloe vera, banks and the like can be used. The natural flavoring agent may be a liquid concentrate or a solid form of extract. Synthetic flavoring agents may be used depending on the case. Synthetic flavoring agents such as esters, alcohols, aldehydes and terpenes may be used.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.Examples of the physiologically active substance include catechins such as catechin, epicatechin, gallocatechin and epigallocatechin, and vitamins such as retinol, ascorbic acid, tocopherol, calciferol, thiamine and riboflavin.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.As the mineral, calcium, magnesium, chromium, cobalt, copper, fluoride, germanium, iodine, iron, lithium, magnesium, manganese, molybdenum, phosphorus, potassium, selenium, silicon, sodium, sulfur, vanadium and zinc can be used.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. In addition, the food composition of the present invention may contain preservatives, emulsifiers, acidifiers, thickeners and the like as needed in addition to the above sweeteners.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. "극미량"이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.Such preservatives, emulsifiers and the like are preferably added in a very small amount as long as they can attain an application to which they are added. By "trace amount" is meant numerically the range of from 0.0005% to about 0.5% by weight based on the total weight of the food composition.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. Examples of the preservative which can be used include calcium sodium sorbate, sodium sorbate, potassium sorbate, calcium benzoate, sodium benzoate, potassium benzoate and EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.Examples of the emulsifier which can be used include acacia gum, carboxymethyl cellulose, xanthan gum, pectin and the like.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.Examples of the acidulant that can be used include acid, malic acid, fumaric acid, adipic acid, phosphoric acid, gluconic acid, tartaric acid, ascorbic acid, acetic acid, and phosphoric acid. Such an acidulant may be added so that the food composition has a proper acidity for the purpose of inhibiting the growth of microorganisms other than the purpose of enhancing the taste.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다. Agents that may be used include suspending agents, sedimentation agents, gel formers, bulking agents and the like.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 관절염 또는 골다공증 예방)을 부가하여 가지도록 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.Further, the herbal composition of the present invention may be added to improve the flavor or palatability and to have other functionalities (for example, arthritis or osteoporosis prevention). Examples of herbal medicines that can be added include mulberry extract, There may be exemplified extracts such as extracts of Pseudomonas spp., Pseudomonas sp. Extract, Mushroom extract, Sambrook extract, Bulb extract, Corn oil extract, Gugija extract, Licorice extract, Angelica keiskei extract, .

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물로 파악할 수 있다.The composition of this invention can be grasped | ascertained as a cosmetic composition in another specific aspect.

본 발명의 항염증용 조성물이 화장료 조성물로서 파악될 경우, 그 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.When the anti-inflammatory composition of the present invention is identified as a cosmetic composition, the cosmetic composition may be prepared in various forms, for example, emulsion, lotion, cream (oil-in-water type, water-in-oil type, multiphase), solution, suspension (Anhydrous and aqueous), anhydrous products (oil and glycol based), gels, masks, packs, powders and the like formulations.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. The composition of the present invention may contain an acceptable carrier in cosmetic formulations other than those containing the active ingredient.

여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.As used herein, the term " acceptable carrier for a cosmetic preparation "refers to a compound or composition that is already known and used in the cosmetic preparation, or a compound or composition to be developed in the future, and has no toxicity that the human body can adapt to when contacted with skin.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다. The carrier may be included in the composition of the present invention in an amount of from about 1% by weight to about 99.99% by weight, preferably from about 50% by weight to about 99% by weight of the composition, based on the total weight thereof.

그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. However, since the ratio depends on the above-mentioned formulation of the cosmetic composition and its specific application site (face or hands) or its preferable application amount, the ratio is limited in any aspect to the scope of the present invention It should not be.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. Examples of the carrier include alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, humectants, moisturizers, viscosifiers, emulsifiers, stabilizers, sunscreens, coloring agents and perfumes.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.The compounds / compositions which can be used as the carrier and which can be used as alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, wetting agents, moisturizers, viscosifiers, emulsions, stabilizers, sunscreens, A person skilled in the art can select and use appropriate substances / compositions.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 알려진 피부 보습 활성 물질, 항아토피 활성 물질, 항여드름 활성 물질, 미백 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.The cosmetic composition of the present invention may further comprise a functional substance such as a skin moisturizing active substance, an anti-atopic active substance, an anti-acne active substance, a whitening active substance, etc., which are known in the art.

본 발명의 항염증용 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.The anti-inflammatory composition of the present invention may be regarded as a soap composition in another specific embodiment.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 유효성분을 포함하여 제조될 수 있다.When the composition of the present invention is identified as a soap composition, the soap composition of the present invention can be prepared by incorporating the active ingredient into a soap base.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.Examples of the soap base material include vegetable oils such as palm oil, palm oil, soybean oil, perm free oil, olive oil and palm kernel oil or animal fats such as tallow, lard, sunshine and fish oil. Examples of the skin moisturizers include glycerin, erythritol, polyethylene glycol , Propylene glycol, butylene glycol, pentylene glycol, hexyl glycol, isopropyl myristate, silicone derivatives, aloe vera, sorbitol and the like. Examples of the emulsifier include natural oils, wax fatty alcohols, hydrocarbons, May be used. As the water softening agent, tetrasodium ethylenediate and the like may be used.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.The soap composition of the present invention may further contain, as an additive, an antibacterial agent, a dispersant, a foam inhibitor, a solvent, a scouring inhibitor, a corrosion inhibitor, a fragrance, a dye, a sequestering agent, an antioxidant and an antiseptic.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 99.999 중량 % 내지 50 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.
In the soap composition of the present invention, the soap base or additive may be included in a content commonly used in the art, wherein the soap base generally comprises from 99.999% to 50% by weight, based on the total weight of the soap composition And the additive may be added in an amount of 1 wt% to 20 wt%.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 까마귀쪽나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 이용한 진통용 조성물을 제공할 수 있다. As described above, according to the present invention can provide a composition for analgesic using a crow bark extract or a compound isolated therefrom.

또한 본 발명에 따르면 까마귀쪽나무 추출물의 디클로로메탄 분획물을 이용한 항염증제 조성물을 제공할 수 있다.In addition, according to the present invention can provide an anti-inflammatory composition using a dichloromethane fraction of the crow bark extract.

본 발명의 진통용 조성물은 약품으로, 본 발명의 항염증제 조성물은 약품, 식품, 화장품 또는 비누로 제품화될 수 있다.
The analgesic composition of the present invention is a drug, the anti-inflammatory composition of the present invention may be commercialized as a drug, food, cosmetics or soap.

도 1은 까마귀쪽 열매 추출물로부터 Hamabiwalactone A 및 Hamabiwalactone B을 분리하는 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 Hamabiwalactone A의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 Hamabiwalactone A의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 Hamabiwalactone B의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 Hamabiwalactone B의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 말초성 진통 억제 효과를 확인하기 위한 Acetic acid-induced writhing test의 결과이다.
도 7은 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 중추성 진통 억제 효과를 확인하기 위한 Tail-flick test의 결과이다.
도 8은 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 중추성 진통 억제 효과를 확인하기 위한 Hot plate test의 결과이다.
도 9는 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함과 특별한 세포독성을 보이지 않음을 보여주는 결과이다.
도 10은 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 PGE2의 생성을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 11은 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여주는 결과이다.
Figure 1 shows a schematic diagram of the process of separating Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B from the crow-side fruit extract.
2 is a 1 H-NMR spectrum of Hamabiwalactone A. FIG.
3 is a 13C-NMR spectrum of Hamabiwalactone A. FIG.
4 is a 1 H-NMR spectrum of Hamabiwalactone B. FIG.
5 is a 13C-NMR spectrum of Hamabiwalactone B. FIG.
Figure 6 is a result of the Acetic acid-induced writhing test to confirm the peripheral analgesic inhibitory effect of the crowberry fruit extract and its dichloromethane fraction, the active ingredients isolated therefrom Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B.
7 is a result of the Tail-flick test to confirm the central analgesic inhibitory effect of the crowberry fruit extract and its dichloromethane fraction, the active ingredient Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B separated therefrom.
8 is a result of a hot plate test for confirming the central analgesic inhibitory effect of the crowberry fruit extract and its dichloromethane fraction, the active ingredients isolated therefrom Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B.
9 is a result showing that the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract inhibits NO production and shows no particular cytotoxicity in a concentration-dependent manner.
10 is a result showing that the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract inhibits the production of PGE 2 in a concentration-dependent manner.
11 is a result showing that the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract inhibits the expression of iNOS and COX-2 in a concentration-dependent manner.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples and Experimental Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples and experimental examples.

<< 실시예Example > > 까마귀쪽나무 열매 추출물의 제조 및 그로부터 Preparation and Extract of Corvus paniculata Fruit HamabiwalactoneHamabiwalactone A와  A and HamabiwalactoneHamabiwalactone B의 분리 및 동정 Isolation and Identification of B

<실시예 1> 까마귀쪽나무 열매 추출물의 제조 Example 1 Preparation of Raven Fruit Extract

제주도 일대의 국내산 까마귀쪽나무 열매를 입수하여 건조시키고, 그 건조된 까마귀쪽 열매 1 kg을 에탄올 70% 10 ~ 20L로 실온에서 2~5회 반복 추출하고 여과한 후 그 여과액을 감압농축하고 동결건조하여 고형상의 추출물을 얻었다.Obtained and dried domestic crow berries in Jeju, 1 kg of dried crow berries were extracted with 70% 10-20 L of ethanol 2-5 times at room temperature, filtered and the filtrate was concentrated under reduced pressure and frozen. It dried and the solid extract was obtained.

<실시예 2> 까마귀쪽나무 열매 70% 에탄올 추출물의 분획물 제조 Example 2 Preparation of Fractions of 70% Ethanol Extract of Raven Fruit

상기 <실시예 1>에서 얻어진 고형상의 추출물 50g을 증류수 2L에 현탁한 후, 각각 동량의 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 노르말 부탄올로 순차적으로 분획한 다음, 감압 농축하여 디클로로메탄 분획물을 얻었다. 50 g of the solid extract obtained in Example 1 was suspended in 2 L of distilled water, and then sequentially fractionated with the same amount of normal hexane, dichloromethane, ethyl acetate, and normal butanol, and then concentrated under reduced pressure to obtain a dichloromethane fraction. .

<실시예 3> 디클로로메탄 분획물로부터 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 분리 및 동정 Example 3 From the Dichloromethane Fraction Isolation and Identification of Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B

상기 <실시예 2>에서 얻어진 디클로로메탄 분획물을 셀라이트(Celite545)가 충진된 Glass Column(5 × 50 cm)에서 컬럼 크로마토그래피(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올)를 수행하여 4개의 분획으로 나누었다. 다음 각각의 얻어진 분획 중 진통효능이 우수한 노르말 헥산 분획을 농축하여 완전 건조 후 실리카겔(silica gel)이 충진된 Glass Column(10 ×3 cm)에서 VLC(Vacuum liquid chromatography)(이동상: 노르말 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 메탄올; 이동상 이동속도 = 60mL/min)를 실시하여 총 18개의 분획으로 나누었다. 그 중 진통효능이 우수한 5번과 7번 분획을 농축하여 완전 건조 후 실리카겔(silica gel)이 충진된 Glass Column(2.5 ×50 cm)에서 컬럼 크로마토그래피(노르말 헥산 : 에틸아세테이트=5:1)를 수행하여 compound 1, 2를 분리하였으며, NMR을 이용하여 구조를 동정하였다.The dichloromethane fraction obtained in Example 2 was subjected to column chromatography (mobile phase: normal hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol) in a glass column (5 × 50 cm) filled with celite (Celite545). Divided into two fractions. In each of the obtained fractions, the normal hexane fraction having excellent analgesic effect was concentrated and completely dried, followed by VLC (Vacuum liquid chromatography) (mobile phase: normal hexane, dichloromethane) in a glass column (10 × 3 cm) filled with silica gel. , Ethyl acetate, methanol; mobile phase moving speed = 60mL / min) was divided into a total of 18 fractions. Among them, the fractions No. 5 and No. 7 having excellent analgesic effect were concentrated, and after complete drying, column chromatography (normal hexane: ethyl acetate = 5: 1) was performed on a glass column (2.5 × 50 cm) filled with silica gel. Compounds 1 and 2 were separated and the structure was identified by using NMR.

Compound 1에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; 1H-NMR (500MHz, CDCl3) : 7.00 (1H, br s, H-3), 6.79 (1H, td, J =15.0, 7.0 Hz, H-7), 6.07 (1H, d, J =15.5 Hz, H-6), 5.01 (1H, br q, J =6.5Hz H-4), 2.16 (2H, td, J =7.0, 2.5Hz, H-15), 2.13(2H, q, J =7.0Hz, H-8), 1.91 (1H, t, J =2.5Hz, H-17), 1.40 (3H, d, J =6.5Hz, H-5), 1.27 (2H, br s, H-9); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 172.2 (C-1), 147.0 (C-3), 138.9 (C-7), 129.6 (C-2), 118.5 (C-6), 84.9 (C-16), 77.1 (C-4), 68.2 (C-17), 33.5 (C-8), 29.4 (C-9), 29.3 (C-10), 29.1 (C-11), 28.9 (C-12, 13), 28.6 (C-14), 19.3 (C-5), 18.5 (C-15)The NMR structure identification results for Compound 1 were as follows: colorless, oily phase; 1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ): 7.00 (1 H, br s, H-3), 6.79 (1 H, td, J = 15.0, 7.0 Hz, H-7), 6.07 (1 H, d, J = 15.5 Hz, H-6), 5.01 (1H, br q, J = 6.5 Hz H-4), 2.16 (2H, td, J = 7.0, 2.5 Hz, H-15), 2.13 (2H, q, J = 7.0 Hz, H-8), 1.91 (1H, t, J = 2.5 Hz, H-17), 1.40 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-5), 1.27 (2H, br s , H-9); 13C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ) 172.2 (C-1), 147.0 (C-3), 138.9 (C-7), 129.6 (C-2), 118.5 (C-6), 84.9 (C-16 ), 77.1 (C-4), 68.2 (C-17), 33.5 (C-8), 29.4 (C-9), 29.3 (C-10), 29.1 (C-11), 28.9 (C-12, 13), 28.6 (C-14), 19.3 (C-5), 18.5 (C-15)

Compound 2에 대한 NMR 구조 동정 결과는 다음과 같다: 무색, 오일상; 1H-NMR (500MHz, CDCl3) : 7.00 (1H, br s, H-3), 6.79 (1H, td, J =14.5, 7.0 Hz, H-7), 6.07 (1H, d, J =16.0 Hz, H-6), 5.80 (1H, ddt, J =17.0, 10.0, 7.0Hz H-16)5.01 (1H, br q, J =7.0Hz H-4), 4.88~4.98 (2H, m, H-17), 2.15(2H, q, J =7.5Hz, H-8), 2.03(2H, q, J =7.0Hz, H-15), 1.40 (3H, d, J =6.5Hz, H-5), 1.25 (2H, br s, H-9); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 172.2 (C-1), 147.0 (C-3), 139.4 (C-16)139.0 (C-7), 129.6 (C-2), 118.5 (C-6), 114.3 (C-17), 77.1 (C-4), 33.9 (C-15), 33.6 (C-8)29.5 (C-9, 10), 29.4 (C-11), 29.2 (C-12), 29.1 (C-13), 28.9 (C-14), 19.3 (C-5)The NMR structure identification results for Compound 2 were as follows: colorless, oily phase; 1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ): 7.00 (1 H, br s, H-3), 6.79 (1 H, td, J = 14.5, 7.0 Hz, H-7), 6.07 (1 H, d, J = 16.0 Hz, H-6), 5.80 (1H, ddt, J = 17.0, 10.0, 7.0 Hz H-16) 5.01 (1H, br q, J = 7.0 Hz H-4), 4.88-4.98 ( 2H, m, H-17), 2.15 (2H, q, J = 7.5 Hz, H-8), 2.03 (2H, q, J = 7.0 Hz, H-15), 1.40 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-5), 1.25 (2H, broad singlet, H-9); 13C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ) 172.2 (C-1), 147.0 (C-3), 139.4 (C-16) 139.0 (C-7), 129.6 (C-2), 118.5 (C-6) , 114.3 (C-17), 77.1 (C-4), 33.9 (C-15), 33.6 (C-8) 29.5 (C-9, 10), 29.4 (C-11), 29.2 (C-12) , 29.1 (C-13), 28.9 (C-14), 19.3 (C-5)

상기 NMR 데이타와 문헌[Phytochemistry. 29(3):857-859, 1990]을 비교 검토 결과, 까마귀쪽나무 열매의 유효 분획인 디클로로메탄 분획물의 compound 1은 상기 [화학식 1]의 Hamabiwalactone A로 확인되었고, compound 2는 상기 [화학식 2]의 Hamabiwalactone B로 확인되었다.
The NMR data and Phytochemistry. 29 (3): 857-859, 1990], the compound 1 of the dichloromethane fraction, which is an effective fraction of the crowberry fruit, was identified as Hamabiwalactone A of [Formula 1], and the compound 2 was represented by [Formula 2] Identified as Hamabiwalactone B.

<< 실험예Experimental Example > > 진통 억제 활성 실험 및 항염증 실험Analgesic inhibitory activity and anti-inflammatory experiment

<실험예 1> 진통 억제 활성 실험 Experimental Example 1 Analgesic Inhibitory Activity Experiment

<실험예 1-1> 말초성 진통 억제 동물실험( Acetic acid - induced writhing test ) Experimental Example 1-1 Peripheral Analgesic Animal Experiment ( Acetic acid - induced writhing test )

본 실험은 까마귀쪽나무 열매 추출물의 진통효과를 알아보기 위한 방법의 하나로 복부 수축 반응을 지표로 하며, 말초신경계의 진통 효력 시험에 주로 사용되는 시험방법이다(J Pharmacol Exp Ther. 2008 Apr;325(1):10-6; J Ethnopharmarcol. 2007 May 22;111(3):476-82; J Pharmacol Exp Ther. 2005 Feb;312(2):726-32).This experiment is one of the methods to examine the analgesic effect of the extract of Ravenberry, which is an indicator of abdominal contraction response and is a test method used mainly for the analgesic effect test of the peripheral nervous system (J Pharmacol Exp Ther. 2008 Apr; 325 ( 1): 10-6; J Ethnopharmarcol. 2007 May 22; 111 (3): 476-82; J Pharmacol Exp Ther. 2005 Feb; 312 (2): 726-32).

실험은 생약(한약) 제제 효력시험 가이드라인의 '통증성 질환에 대한 일반적인 효력 시험'(식품의약품안전청, 2009년 5월)에 기재된 방법을 따랐다. 구체적으로는 다음과 같다.The experiment followed the method described in the General Efficacy Test for Pain Disorders (Food and Drug Administration, May 2009) of the Herbal Drug (Evening Herb) Drug Testing Guideline. Specifically, it is as follows.

실험동물은 5주령 ICR mouse (중앙실험동물, 서울)를 구입하여 1주간 습도 50%, 온도 24~26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다.The experimental animals were purchased from 5 weeks old ICR mouse (Central Experimental Animal, Seoul) and purified at a kennel maintained at a humidity of 50% and a temperature of 24 ~ 26 ℃ for one week. Feed and water were supplied for free intake.

자극물(초산 0.75% 함유 생리 식염수)을 0.1mL/10g body wt의 용량으로 실험 전 12시간 동안 절식시킨 마우스의 복강에 주사로 주입하였으며, 자극물의 주입 60분 전 시료(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)를 경구투여하였다. 자극물이 투입되면 복강 내에서 통증을 유발하여 몸을 뒤틀거나, 뒷다리를 쭉 뻗는 동작 등의 writhing syndrome 반응을 보이게 된다. 총 10분 동안 writhing(몸을 뒤튼 상태로 2초 이상 지속) 횟수를 측정한 결과를 [도 6]에 나타내었다. [도 6]에서 각 색깔·도형별 포인트는 실험동물의 writhing의 숫자이며, 직선(-)은 그 평균값이다. A stimulant (physiological saline containing 0.75% acetic acid) was injected by injection into the abdominal cavity of a mouse fasted for 12 hours before the experiment at a dose of 0.1 mL / 10 g body wt. Dichloromethane fractions and Hamabiwalactone A and B) were orally administered. Injecting irritants can cause pain in the abdominal cavity, causing writhing syndrome reactions, such as twisting the body or stretching the hind legs. The results of measuring the number of writhing (lasting 2 seconds or more with the body twisted) for a total of 10 minutes are shown in FIG. 6. In FIG. 6, each color and shape point is the number of writhing of the experimental animal, and a straight line (-) is the average value.

[도 6]를 참조하여 보면, 시료 비투여군인 대조군의 writhing number에 까마귀쪽나무 열매 추출물과 그 디클로로메탄 분획물, 그로부터 분리된 유효성분인 Hamabiwalactone A와 Hamabiwalactone B의 writhing number가 작은 것을 알 수 있다. Referring to FIG. 6, it can be seen that the writhing numbers of the crowberry fruit extract and its dichloromethane fraction, and the active ingredients Hamabiwalactone A and Hamabiwalactone B, which are separated from the writhing number of the control group, the sample non-administered group, are small.

<실험예 1-2> 중추성 진통 억제 동물시험( Tail - flick test ) <Experimental Example 1-2> Central pain control animal test ( Tail - flick test )

본 실험에서는 꼬리 회피 반응 시험법을 이용하여 중추성 진통 억제 효과를 확인하였다. 급성 통증 모델 중 중추신경계에 작용하는 진통제를 검색할 때 많이 사용하는 방법이다(Peptides. 2005, 26(4):615-9).In this experiment, we used the tail avoidance test to determine the effects of central analgesia. It is widely used in the search for analgesics affecting the central nervous system among acute pain models ( Peptides . 2005, 26 (4): 615-9).

실험은 생약(한약) 제제 효력시험 가이드라인의 '통증성 질환에 대한 일반적인 효력 시험'(식품의약품안전청, 2009년 5월)에 기재된 방법을 따랐다. 구체적으로는 다음과 같다.The experiment followed the method described in the General Efficacy Test for Pain Disorders (Food and Drug Administration, May 2009) of the Herbal Drug (Evening Herb) Drug Testing Guideline. Specifically, it is as follows.

5주령 ICR 마우스를 1주일간 순화시킨 후 각각 무게를 재고 식별이 가능하도록 꼬리에 매직으로 표시를 하였다. 쥐 꼬리의 1/3지점 을 측정해 표시하고, 반응에 영향을 미치지 않도록 빛이 닿지 않는 쪽에 표시를 하였다. 반응시간이 3~4 sec이 되도록 강도를 맞추며, cut off time은 10초 정도로 정하였다(마우스 꼬리의 조직손상 방지). 약물주입은 복강주사로 하였다. 동물의 꼬리 끝을 열판에 올려 놓고 꼬리치기가 일어나기까지의 시간을 측정하여 시료 무처리군과 비교하여 꼬리치기가 일어나기까지의 시간 증가율(TFL change)을 구하였다.Five-week-old ICR mice were allowed to acclimate for one week and then marked with magic on their tails to allow for weight identification and identification. One-third of the tail of the rat was measured and marked, and marked on the side not exposed to light so as not to affect the reaction. The intensity of the reaction was adjusted to 3 to 4 sec, and the cut off time was set to about 10 seconds (prevention of tissue damage of the tail of the mouse). Drug injection was by intraperitoneal injection. The tail tip of the animal was placed on a hot plate, and the time until the tail crest occurred was measured, and the rate of increase of the time until the tail crest occurred (TFL change) was calculated in comparison with the sample-free group.

시료(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)는 실험 시작 60분 전에 경구투여하였다. 시료(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)는 실험 시작 60분 전에 경구투여하였다. Samples (ie crowberry fruit extract, dichloromethane fraction and Hamabiwalactone A and B) were administered orally 60 minutes before the start of the experiment. Samples (ie crowberry fruit extract, dichloromethane fraction and Hamabiwalactone A and B) were administered orally 60 minutes before the start of the experiment.

결과를 [도 7]에 나타내었다. [도 7]을 참조하여 보면 대체로 모든 시료가 농도 의존적으로 진통 억제 효과가 있음을 보여준다.The results are shown in [FIG. 7]. Referring to FIG. 7, it is shown that almost all samples have analgesic inhibitory effects in a concentration-dependent manner.

<실험예 1-3> 중추성 진통억제 동물시험( Hot plate test ) Experimental Example 1-3 Central Analgesic Animal Test ( Hot plate test )

본 실험에서는 Hot plate test를 이용하여 중추성 진통 억제 효과를 확인하였다. Hot plate test는 중추신경계에 작용하는 진통제를 검색할 때 사용하는 방법으로(Anthony W. Bannon, Model of pain :Hot-plate and formalin test in rodents, Current protocol. 1998 March), mouse의 발바닥이 열에 매우 민감하여, 참을 수 없을 정도의 열이 감지되면 뛰거나, 발바닥을 움츠리거나, 핥는 행위를 하는데, hot plate에 접촉할 때부터 뒷발을 털거나 핥을 때까지의 시간(sec)을 측정하는 방법이다. In this experiment, we confirmed the effects of central analgesic using hot plate test. Hot plate test is a method used to detect painkillers acting on the central nervous system (Anthony W. Bannon, Model of pain: Hot-plate and formalin test in rodents, Current protocol . 1998 March) The mouse's sole is very sensitive to heat, so if an unbearable amount of heat is detected, it jumps, shrugs, or licks the foot, from touching the hot plate to shaking or licking the hind paw. It is a method of measuring time (sec).

실험은 생약(한약) 제제 효력시험 가이드라인의 '통증성 질환에 대한 일반적인 효력 시험'(식품의약품안전청, 2009년 5월)에 기재된 방법을 따랐다. 구체적으로는 다음과 같다.The experiment followed the method described in the General Efficacy Test for Pain Disorders (Food and Drug Administration, May 2009) of the Herbal Drug (Evening Herb) Drug Testing Guideline. Specifically, it is as follows.

5주령 ICR 마우스를 구입하여 1주간 순화시킨 후 실험동물의 몸무게를 측정하고, 실험동물을 실험환경에 적응시키기 위하여 15-30 분 정도 두었다. 전열기를 55℃ 혹은 적당한 온도로 미리 조절하였다. 각각의 시험물질(즉 까마귀쪽나무 열매 추출물, 디클로로메탄 분획물 및 Hamabiwalactone A와 B)을 경구투여하고, 시료 경구 투여 60 분 경과 후에, 테스트를 시작하여 뒷발을 털거나 핥을 때까지의 시간을 초(sec) 단위로 측정하였다.Five-week-old ICR mice were purchased and allowed to acclimate for one week, and then weighed and weighed for 15-30 minutes. The heater was preconditioned to 55 ° C. or to an appropriate temperature. Each test substance (ie crowberry fruit extract, dichloromethane fraction and Hamabiwalactone A and B) was orally administered and 60 minutes after the oral administration of the sample, the time from starting the test to shaking or licking the hind paws was measured. sec).

결과를 [도 8]에 나타내었다. [도 8]을 참조하여 보면, 모든 시료 농도 의존적으로 진통 억제 효과를 보임을 알 수 있다.The results are shown in [FIG. 8]. Referring to FIG. 8, it can be seen that all the sample concentration-dependent analgesic effects are shown.

<< 실험예Experimental Example 2>  2> 항염증 실험Anti-inflammatory experiment

<실험예 2-1> LDH 세포독성 시험 Experimental Example 2-1 LDH Cytotoxicity Test

젖산탈수소효소 (Lactate dehydrogenase, LDH)는 대부분의 세포에 존재하는 안정형 세포질 효소로서 원형질막의 손상을 입으면 세포 배양액으로 방출된다. 이에 RAW264.7 세포를 48 well plate에서 24시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물을 농도별로 처리하여 LDH 세포독성검색 키트 (LDH cytotoxicity detection kit, Promega)를 이용해 492 nm에서 효소 활성을 측정하였다.Lactate dehydrogenase (LDH) is a stable cytoplasmic enzyme present in most cells and is released into the cell culture when the plasma membrane is damaged. After culturing RAW264.7 cells in 48 well plates for 24 hours, the dichloromethane fractions of the crowberry fruit extract were treated by concentrations, and the enzyme activity was detected at 492 nm using the LDH cytotoxicity detection kit (Promega). Measured.

결과를 [도 9]에 나타내었다. [도 9]를 참조하여 보면, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 거의 세포독성을 보이지 않음을 보여준다.The results are shown in FIG. 9. Referring to FIG. 9, the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract shows little cytotoxicity.

<실험예 2-2> NO 생성 억제 시험 Experimental Example 2-2 NO Production Suppression Test

항염증 효능을 알아보기 위해 RAW264.7 세포를 48 well plate에서 24시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물과 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 Griess시약 100㎕를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 표준으로 하여 비교하였다.In order to examine the anti-inflammatory effect, RAW264.7 cells were cultured in 48 well plates for 24 hours, and then treated with dichloromethane fraction of L. fruit extract and LPS (1㎍ / ml) for 24 hours. 100 μl of the cell culture supernatant and 100 μl of Griess reagent were mixed and reacted in a 96 well plate for 10 minutes, and the absorbance was measured at 530 nm. The amount of NO produced was compared based on sodium nitrite (NaNO 2 ).

결과를 시료 비처리군과 비교하여 [도 9]에 나타내었다. [도 9]를 참조하여 보면, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다(시료 처리 농도 단위: ㎍/ml, 이하 같음). 또한 상기 <실험예 2-1>의 세포독성 결과를 함께 고려할 경우, 상기 NO 생성 억제 활성이 세포독성에 의한 결과가 아님을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 9 in comparison with the sample untreated group. Referring to FIG. 9, it can be seen that the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract showed NO production inhibitory activity in a concentration-dependent manner (sample treatment concentration unit: μg / ml, as follows). In addition, when considering the results of the cytotoxicity of <Experimental Example 2-1>, it can be seen that the NO production inhibitory activity is not a result of cytotoxicity.

<실험예 2-3> Prostaglandin E2 ( PGE2 ) 생성 억제 시험 Experimental Example 2-3 Prostaglandin E2 ( PGE2 ) production inhibition test

항염증 효능을 알아보기 위해 RAW264.7 세포를 24 well plate에서 18시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물과 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였으며, 세포배양 상등액 분리 후 PGE2 ELISA kit (R&D Systems, Inc, USA)를 이용하여 PGE2를 정량하였다.In order to examine the anti-inflammatory effect, RAW264.7 cells were cultured in a 24 well plate for 18 hours, and then treated with dichloromethane fraction of L. alba extract and LPS (1㎍ / ml) for 24 hours, and cultured supernatant. After separation, PGE2 was quantified using PGE2 ELISA kit (R & D Systems, Inc, USA).

이와 같이 측정한 결과는 다음 도 10에 나타내었다.The measurement results as described above are shown in FIG. 10.

결과를 시료 비처리군과 비교하여 [도 9]에 나타내었다. [도 9]를 참조하여 보면, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 9 in comparison with the sample untreated group. Referring to FIG. 9, it can be seen that the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract shows NO production inhibitory activity in a concentration-dependent manner.

<실시예 2-4> iNOS 및 COX -2 발현 억제 시험 Example 2-4 iNOS and COX- 2 Expression Inhibition Test

RAW264.7 세포를 6 well plate에서 24시간 배양 후, 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물과 LPS (1㎍/ml)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 수집한 세포를 PBS로 세척 후 1ml의 lysis buffer를 첨가하여 lysis시킨 후 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 단백질 부분을 분리하였다. 30 ~ 50㎍의 lysate를 8 ~ 12% SDS-PAGE로 분리하였으며, PVDF membrane (BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. Membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액으로 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 항체 anti-mouse iNOS (1:1000, Santa-Cruz)과 COX-2의 항체 anti-mouse COX-2 (1:1000, Cell signaling)를 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세척하였다. 2차 항체로는 HRP(Horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Co.)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세척하여 ECL 기질 (Amersham Co.)과 1~3분간 반응시켰으며, 그 후 X-ray 필름에 감광하였다.RAW264.7 cells were incubated for 24 hours in 6 well plates, and then treated with dichloromethane fraction of L. fruit extract and LPS (1µg / ml) simultaneously for 24 hours. The collected cells were washed with PBS, lysed by adding 1 ml of lysis buffer, and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes to separate protein portions. The lysate of 30-50 μg was isolated by 8-12% SDS-PAGE, and transferred to PVDF membrane (BIO-RAD) at 200 mA for 2 hours. Membrane blocking was performed for 2 hours at room temperature with TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) solution containing 5% skim milk. iNOS antibody anti-mouse iNOS (1: 1000, Santa-Cruz) and COX-2 antibody anti-mouse COX-2 (1: 1000, Cell signaling) were diluted in TTBS solution and reacted at room temperature for 2 hours before TTBS Washed three times. As a secondary antibody, HRP (Horse radish peroxidase) conjugated anti-mouse IgG (Amersham Co.) was diluted 1: 5000, reacted at room temperature for 30 minutes, washed three times with TTBS and then ECL substrate (Amersham Co.) And reacted for 1 to 3 minutes, after which the X-ray film was sensitized.

결과를 [도 11]에 나타내었다. [도 11]을 참조하여 보면 까마귀쪽나무 열매 추출물의 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함을 보여준다.
The results are shown in [FIG. 11]. Referring to FIG. 11, the dichloromethane fraction of the crowberry fruit extract inhibits the expression of iNOS and COX-2 in a concentration-dependent manner.

Claims (8)

까마귀쪽나무 열매 추출물, 아래의 [화학식 1]의 하마비와락톤 A 또는 아래의 [화학식 2]의 하마비와락톤 B를 유효성분으로 포함하는 진통용 조성물.
[화학식 1]
Figure pat00003

[화학식 2]
Figure pat00004

Ravenberry fruit extract, analgesic composition comprising Hamabi and lactone A of [Formula 1] below or Hamabi and lactone B of [Formula 2] as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]
Figure pat00003

(2)
Figure pat00004

 제1항에 있어서,
상기 까마귀쪽나무 열매 추출물은 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 하나인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
(Ⅰ) 까마귀쪽나무 열매를 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물;
(Ⅱ) 까마귀쪽나무 열매를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물과 디클로로메탄으로 분획하여 얻어진 디클로로메탄층의 분획 추출물; 및
(Ⅲ) 까마귀쪽나무 열매를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 디클로로메탄층의 분획 추출물.
The method of claim 1,
The Ravenberry fruit extract is a composition for analgesic, characterized in that one of the following (I) to (III).
(I) an extract obtained by extracting crowberry fruit with alcohols, acetone, hexane, ethyl acetate, dichloromethane, water or a mixed solvent thereof having 1 to 4 carbon atoms;
(II) a fraction extract of the dichloromethane layer obtained by extracting the crowberry fruit with water, ethanol or a mixed solvent thereof and fractionating the solid extract obtained with water and dichloromethane; And
(III) The dichlorohydride obtained by extracting crowberry fruit with water, ethanol or a mixed solvent thereof and suspending the solid extract obtained in water and then sequentially fractionating with hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol. Fractional extract of methane layer.
제1항에 있어서,
상기 진통은 침해성 통증 또는 신경병증성 통증의 개선 활성인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
The method of claim 1,
The analgesic composition for analgesic, characterized in that the improvement activity of invasive pain or neuropathic pain.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 진통용 조성물.
4. The method according to any one of claims 1 to 3,
The composition for analgesic, characterized in that the pharmaceutical composition.
까마귀쪽나무 열매의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 디클로로메탄층의 분획물을 그 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
For anti-inflammatory comprising the fraction of dichloromethane layer obtained by suspending water, ethanol or mixed solvent extracts of Raspberry fruit in water and sequentially dividing with hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol Composition.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
6. The method of claim 5,
Wherein the composition is a pharmaceutical composition.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
6. The method of claim 5,
The composition is an anti-inflammatory composition, characterized in that the food composition.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
6. The method of claim 5,
The composition is an anti-inflammatory composition, characterized in that the cosmetic composition.
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