KR20140044053A - 대황의 메탄올 추출물을 이용한 미생물 바이오필름 형성 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대황의 메탄올 추출을 미생물의 바이오필름 형성을 억제하는 유효성분으로 이용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 이용하는 대황는 안전한 약용 식물로써 식품을 포함한 다양한 용도에 안전한 미생물 바이오필름 형성억제 방법을 제공한다.

Description

대황의 메탄올 추출물을 이용한 미생물 바이오필름 형성 억제제 {Extracts from Rheum palmatum using methanol for inhibition of biofilm formation of microbes}

본 발명은 미생물의 바이오필름(biofilm) 형성을 억제하기 위한 방법으로 대황의 메탄올 추출물을 이용하는 것에 관한 것이다.

미생물은 자연계의 거의 모든 곳에 존재하며, 생태계에서 물질의 순환에 중요한 역할을 수행하는 필수 불가결한 존재이나 원하지 않는 장소나 시기에 원하지 않는 미생물이 존재함에 따라 많은 경제적 손실을 유발하고 있다. 미생물에 의한 가장 심각한 문제는 인체나 작물, 가축에 질병을 일으켜 경제적 손실뿐 아니라 생명까지 위협한다는 점이다.

원하지 않는 미생물의 오염과 성장을 제어하기 위한 다양한 방법이 개발되고 있으며, 미생물을 제어하기 위한 강력한 방법으로서 미생물만을 선택적으로 사멸시키거나 성장을 억제하는 항생제를 이용하고 있다. 그러나, 항생제의 남용은 항생제 내성균의 출연을 초래하여 절박하게 항생제의 사용을 원하는 상황에서는 효과적으로 이용할 수 없는 상황이 발생하고 있어서, 기존의 항생제와는 다른 새로운 작용기작을 이용하는 미생물 생장조절물질이 절실히 필요한 실정이다. 원하지 않는 미생물의 오염을 방지하기 위한 최선의 방법은 오염과 성장의 초기단계에서 미생물의 성장을 조절하는 것이다.

미생물이 액체 상에서 자라는 경우에는 오염된 액체를 제거함으로써 쉽게 오염원을 제거할 수 있으나, 일반적으로 미생물은 실험실에서와 같이 배지에 균일하게 자라지 않으며 용기의 표면에 부착하여 군집생활을 하거나, 액체 배지의 표면에 막(이를 '바이오필름'이라 함)을 형성한다. 바이오필름은 전단력, 열 등의 물리적 스트레스에 대한 보호 작용을 미생물에 부여하며, pH, 항생제, 과산화수소, 하이포클로라이트(hyphochlorite)와 같은 미생물을 사멸시키는 화합물의 전달을 방해하여 바이오필름 내부에 존재하는 미생물을 보호한다. 바이오필름 안에서 생장하는 미생물은 자체의 생리가 변하여 일반적인 미생물보다 다양한 스트레스에 대한 내성을 보유하므로 바이오필름을 형성한 미생물은 제거하기가 어려우며, 미생물 오염의 주요원인을 제공한다. 따라서, 바이오필름의 형성을 억제하면 원하지 않는 미생물의 오염을 쉽게 제거할 수 있다. 또한, 바이오필름의 형성을 억제하여 오염된 미생물의 대부분을 쉽게 제거한다면 추가적인 살균이나 멸균에서 그 효율을 극대화시킬 수도 있다. 또한, 미생물의 생장에는 영향을 주지 않고 바이오필름의 형성만 억제한다면 내성 균주에 대한 선택성이 없으므로 내성 균주의 출현을 상당부분 차단될 것으로 예상한다.

따라서 미생물의 바이오필름 형성을 억제한다면 미생물에 의한 오염을 최소화하여 경제적 피해를 줄일 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 필요성으로부터 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 대황의 메탄올 추출물을 이용하여 미생물의 바이오필름 형성을 억제하기 위해 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 대황를 메탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물 바이오필름 형성 억제제를 제공한다.

상기 방법에서 메탄올과 비슷한 용매를 사용하여 추출하거나 분획할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물 바이오필름 형성 억제 효과의 기능성 식품을 제공한다.

상기 방법에 의해 제조된 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물 바이오필름 형성 억제 효과의 위생용 청결제를 제공한다.

상기 방법에 의해 제조된 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물 바이오필름 형성 억제 효과의 보존제을 제공한다.

대황는 한약재로써 오랜 세월 동안 섭취되어 와서 인체에 안전하며 본 발명에서는 기존에 알려지지 않은 새로운 기능성인 미생물의 바이오 필름 형성 억제 효과를 제시함으로써 이를 이용하여 다양한 제품을 개발하여 새로운 경제적 이익을 창출할 수 있다.

도 1은 대황 추출물을 14.18 g/L로 처리했을 때 충치의 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 바이오 필름의 형성을 억제하는 효과로 바이오 필름의 형성이 상당히 감소하는 것을 관찰하였다.
도 2은 대황 추출물을 14.18 g/L로 처리했을 때 식중독 균인 요시니아 (Yersinia enterocolitica)의 바이오 필름의 형성을 억제하는 효과로 바이오 필름의 형성이 전혀 관찰되지 않았다.
도 3는 대황 추출물을 14.18 g/L로 처리했을 때 벼의 흰잎마름병의 원인균주인 잔토모나스 오리제 (Xanthomonas oryzae)의 바이오 필름의 형성을 억제하는 효과로 바이오 필름의 형성이 전혀 관찰되지 않았다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 대황 100g당 1,500 ml의 메탄올로 상온에서 12 시간 담가두어 추출한 후, 농축, 건조한 하고 물에 적당한 양을 녹여 이용한다.

상기 방법에서 사용되는 추출 용매는 물을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 메탄올을 이용하는 것이다.

상기 방법에 의해 제조된 대황의 메탄올 추출물을 유효성분으로 하는 미생물 바이오 필름형성 억제제

[실시예]

1. 대황 추출물의 제조

대황 100g당 1,500 ml의 메탄올로 상온에서 12 시간 담가두어 추출한 후, 이를 농축하고 건조한다. 얻은 추출물을 농축, 건조한 후 물에 적당한 양을 녹여 이용한다.

2. 본 실시 예에서 이용되는 배지의 조성은 다음과 같다.

YGC 배지 (100 ml )

Glucose 5 g

Yeast extracts 0.5 g

CaCO₃ 1.25 g

Agar 1.5 g

Water make up 100 ml

210 배지 (100 ml )

Sucrose 0.5 g

Casein hydrolysates 0.8 g

Yeast extracts 0.4 g

K₂HPO₄ 0.3 g

MgSO₄7H₂O 30 mg

Water make up 100 ml

XOM2 배지( pH 6.5)

L-methionine 670 uM

Na-glutamateH₂O 10 mM

KH₂PO₄ 14.7 mM

MnSO₄ 40 uM

Fe(III)-EDTA 240 uM

MgCl₂ 5 mM

D-xylose 0.18%

TYE 배지 (100 ml )

Tryptone 1 g

Yeast extracts 0.5 g

(Agar) 1.5 g

Water make up to 100 ml

M63 배지 (100 ml )

5x M63 medium 80 ml

20% Glucose 1 ml

20% MgSO₄ 0.1 ml

Water make up to 100 ml

5x M63 (100 ml )

KH₂PO₄ 1.5 g

K₂HPO₄ 3.5 g

(NH₄)₂SO₄ 1 g

FeSO₄ (1 mg/ml) 0.25 mL

BHI 배지 (100 ml )

Brain Heart Infusion 3.7 g

(Agar) 1.5 g

Water make up to 100 ml

BHI +1% Sucrose 배지 (100 ml )

Brain Heart Infusion 3.7 g

Sucrose 1.0 g

Water make up to 100 ml

3. 바이오필름 형성 정량법

본 발명에서는 바이오필름의 형성을 측정하고자 폴리비닐클로라이드 재질의 96웰(well)의 마이크로플레이트 (microplate)을 이용하여 각 웰당 100ul의 배지에 미생물을 600nm의 파장에서 0.05의 흡광도를 갖는 양만큼 접종하여 미생물의 생육온도에서 일정시간 정치 배양하여 바이오필름을 형성하였고 바이오필름의 양을 정량하기 위해서 미생물 배양 후, 상등액이 제거된 마이크로플레이트에 1%의 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액 100㎕를 15분간 노출 후, 물로 잉여 크리스탈 바이올렛을 제거하고, 바이오필름에 의해 제거되지 않은 크리스탈 바이올렛을 95% 에탄올 100㎕를 가해 용출시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 595 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

4. Yersinia enterocolitica의 바이오필 름형성

동결 건조된 Yersinia enterocolitica를 TYE plate에 streaking 한 후 26도의 온도에서 2일간 배양한다. 5 ml의 TYE 배지에 접종한 후 test tube에서 26도의 온도에서 250 rpm으로 2일간 배양한다. 배양약의 세포 농도를 Abs600으로 측정한다. 96-well의 microplate에 M63 배지를 100 ul씩 놓는다. 측정된 세포 농도 값을 이용하여 Abs600 = 0.05가 되도록 접종한다. 26도의 온도에서 6시간이나 24시간 배양 후 crystal violet을 이용하여 바이오 필름의 양을 측정한다.

5. Xanthomonas oryzae의 바이오필름 형성

동결 건조된 Xanthomonas oryzae를 YGC plate에 streaking 한 후 28도의 온도에서 2일간 배양한다. 5 ml의 210 배지에 접종한 후 test tube에서 28도의 온도에서 250 rpm으로 2일간 배양한다. 배양약의 세포 농도를 Abs600으로 측정한다. 96-well의 polyvinyl chloride (PVC) microplate에 XOM2 배지를 100 ul씩 놓는다. 측정된 세포 농도 값을 이용하여 Abs600 = 0.05가 되도록 접종한다. 28도의 온도에서 6시간이나 24시간 배양 후 crystal violet을 이용하여 바이오 필름의 양을 측정한다.

6. Streptococcus mutans의 바이오필름 형성

동결 건조된 Streptococcus mutans를 BHI plate에 streaking 한 후 37도의 온도에서 2일간 배양한다. 5 ml의 BHI 배지에 접종한 후 test tube에서 37도의 온도에서 shaking 없이 1일간 배양한다. 배양액의 세포 농도를 Abs600으로 측정한다. PVC 96-well의 microplate에 BHI+1% Sucrose 배지를 100 ul씩 놓는다. 측정된 세포 농도 값을 이용하여 Abs600 = 0.05가 되도록 접종한다. 37도의 온도에서 6시간이나 24시간 배양 후 crystal violet을 이용하여 바이오 필름의 양을 측정한다.

7. 본 발명에서 제시한 대황 추출물을 이용한 미생물 바이오필름의 형성억제 실험

앞서 제조한 대황 추출물을 첨가하여 Streptococcus mutans , Yersinia enterocolitica, Xanthomonas oryzae의 바이오필름 형성 정도의 변화 결과는 도 1에서 도 3에 나타내어 있다.

Claims (2)

1. 대황로부터 메탄올로 물질을 추출하여 얻은 추출물을 유효성분으로 함유하는 미생물 바이오필름 형성억제용 조성물
   1) 100 g의 대황를 잘게 부순 뒤, 1,500 ml의 메탄올로 상온에서 12시간 정치하여 추출한다.
   2) 이를 농축하고 건조하여 분말화 한다.
   3) 분말화 된 제제를 미생물의 바이오필름 형성억제제를 위한 유효성분으로 이용한다.
2. 청구항 1에 있어서 메탄올에 제한하지 않으며 이와 유사한 용매를 이용한 대황 추출물

Images