KR20140043891A

KR20140043891A - 스태킹 핵산 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20140043891A
Application number: KR1020137028383A
Authority: KR
Inventors: 우프 베스트 쉬네이더; 곰 리스비; 니콜라제이 댐 미켈슨
Original assignee: ?티백트 에이/에스
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2014-04-11
Also published as: JP2014512175A; WO2012130238A1; EP2691524A1; SG193410A1; CN103502452A; AU2012237600A1; US20140065676A1; MX2013011060A; BR112013024618A2

Abstract

본 발명은 핵산의 포착 및/또는 검출, 핵산의 증폭, 및 핵산의 시퀀싱과 같은 분자생물학적 기법에 유용한, 새로운 변형된 올리고뉴클레오타이드 단량체를 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드 단량체는 역평행 듀플렉스(duplex)의 주홈(major groove)에서 인터칼레이팅할 수 있는 인터칼레이터(intercalator)를 포함한다.

Description

스태킹 핵산 및 이의 사용 방법{STACKING NUCLEIC ACID AND METHODS FOR USE THEREOF}

핵산의 검출, 증폭 및 시퀀싱은 분자생물학, 연구 및 임상 진단에서 중요한 방법들이다. 이들 방법에서 중요한 시약은 프라이머 및/또는 프로브로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하는 뉴클레오사이드 삼인산이다.

PCR 주형, 프라이머 및 프로브로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드에서 가장 중요한 것은 상보성 핵산에 대한 이들의 서열 특이성과 또한 이들의 친화성이다. 이러한 특징들은 올리고뉴클레오타이드에 내인성인 인자들과 올리고뉴클레오타이드에 외인성인 인자들에 의해 조정될 수 있다. 내인성 인자는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 핵산 서열의 조성물이다. 또한, 비-천연성 뉴클레오타이드 또는 백본의 변형 적용도 내인성 인자이다. 그러나, 이용가능한 비-천연성 뉴클레오타이드 및 백본 단위의 수는 제한되어 있다. 따라서, 분자생물학 방법에서 사용할 수 있는 새로운 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드에 대한 필요성이 존재한다.

특허 출원 제WO 2006/125447 호는, 화학식 Z의 트리플렉스 형성 단량체(triplex forming monomer) 단위를 기술하고 있으며, 이중가닥 핵산과의 트리플렉스 형성과 관련하여, 트리플렉스 형성 단량체 단위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 선호할만한 특징들을 기술해 놓았다. 트리플렉스 형성 특징을 토대로, 전술한 특허 출원의 발명자들은 검출, 진단 및 치료에 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것을 제한하였다. 이러한 용도에 관한 어떠한 상세한 설명이나 데이터는 제공하지 않았다.

Filichev 등 (Filichev VV, 2005)은 제WO 2006/125447 호와 동일한 트리플렉스 형성 단량체 단위를 기술하고 있으며, 트리플렉스 형성 단량체 단위의 병합을 통한 평행한 듀플렉스 및 평행한 트리플렉스의 안정화를 확인하였다. 더욱이, 이들은 트리플렉스 형성 단량체 단위를 올리고뉴클레오타이드에 삽입한 경우, 본래의 올리고뉴클레오타이드와 비교해 왓슨-크릭형 RNA/DNA 및 DNA/DNA 듀플렉스의 불안정성을 확인하였다.

제WO 2006/125447 호에서 기술한 트리플렉스 형성 단량체는, 상기 단량체가 폴리머라제에 대한 기질로서 작용할 수 없기 때문에, 폴리머라제를 이용하여 올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합되도록 조정할 수가 없다. 더욱이, 제WO 2006/125447 호에서 기술한 트리플렉스 형성 단량체는 전사 또는 복제 시 주형으로서 작용할 수 없음이 밝혀진 바 있다. 즉, 폴리머라제가 주형에 있는 트리플렉스 형성 단량체와 만나면, 상기 폴리머라제는 RNA 또는 DNA 합성을 계속할 수 없다.

Ahmadian and Donald E. Bergstrom 2008, "5-Substituted Nucleosides in Biochemistry and Biotechnology." In Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnoloy and Medicine, P. Herdewijn, ed. Wiley-VCH, Weihheim, 2008, pp 251-276. AK Todd, A Adams, JH Thorpe, WA Denny, LPG Wakelin and CJ Cardin, J. Med. Chem. 1999, 42, 536-540. Garcia, J.; Fernandez, S.; Ferrero, M.; Sanghvi, Y. S.; Gotor, V. Building Blocks for the Solution Phase Synthesis of Oligonucleotides: Regioselective Hydrolysis of 3',5'-Di-O-levulinylnucleosides Using an Enzymatic Approach. J. Org. Chem. (2002), 67, 4513-4519. K Sonogashira, Y Tohda and N Hagishara, Tetrahedron Lett.1975, 16, 4467-4470. MS Motawia, AE-S Abdel-Megied, EB Pedersen, CM Nielsen and P Ebbesen, Acta Chem. Scand. 1992, 46, 77-81; AE-S Abdel-Megied, EB Pedersen and C Nielsen, Monatshefte Chem. 1998, 129, 99-109. Sanghvi, Y.S., Guo, Z., Pfundheller, H.M. and Converso, A. Improved Process for the Preparation of Nucleosidic Phosphoramidites Using a Safer and Cheaper Activator. Org. Process Res. Dev. 4, 175-181 (2000). VV Filichev and EB Pedersen, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 14849-14858; VV Filichev, IV Astakhova, AD Malakhov, VA Korshun and EB Pedersen, Nucl Acids Symp. Ser. 2008, 52, 347-348.

제1 측면에서, 본 발명은 하기 구조를 가진 변형된 올리고뉴클레오타이드 단량체 SNA (스태킹 핵산)를 제공한다:

X-B-L-I

-상기 식에서,

-X는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 백본으로 병합될 수 있는 백본 단량체 단위이며,

-B는 뉴클레오베이스(nucleobase), 피리미딘 또는 퓨린 유사체, 또는 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 헤테로사이클릭 시스템이며,

-L은 링커(linker)이고,

-I는 하나 이상의 본질적으로 편평한 공액 시스템(essentially flat conjugated system)을 포함하는 인터칼레이터(intercalator)이다.

바람직한 실시 양태에서, 상기 SNA 단량체는 B와 L 사이 또는 L과 I 사이에 컨쥬게이터 K를 포함한다:

X-B-K-L-I

X-B-L-K-I.

SNA 단량체는 상기 인터칼레이터 I가 역평행 듀플렉스(duplex)의 주홈(major groove)에서 인터칼레이팅할 수 있도록 구축될 수 있으며, 상기 SNA 단량체는 상기 듀플렉스의 가닥들 중 한 가닥의 일부(part)이다. 이런 식으로, 상기 SNA 단량체는 역평행한 듀플렉스 형성을 안정화시켜서, 상보성 서열에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다.

SNA 단량체는 핵산의 포착 및/또는 검출, 핵산의 증폭, 및 핵산의 시퀀싱과 같은 분자생물학적 기법에 유용하다. 따라서, 본 발명의 다른 측면들은 본 발명의 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 병합에 맞게 조정된 단량체, 및 본 발명의 단량체와 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.

도 1. 인터칼레이팅되는 관능화된 아크리딘 모이어티를 포함하는 pdb 엔트리 367d의 구조.
도 2. 피렌 단위로 인터칼레이팅된 TTAGGG 삼량체 DNA 듀플렉스의 개관도.
도 3 . 피렌 단위를 포함하는 인터칼레이션 부위(intercalation site)의 클로즈-업.
도 4 a) 내지 4 e). 센스 가닥에 탄소수 1 내지 5의 링커가 연결되어 있는 티미딘을 이용하여, 50 K에서 10 ns로 MD한 후 수득한 구조의 개관도.
도 5 a) 내지 5 e). 안티센스 가닥에 탄소수 1 내지 5의 링커가 연결되어 있는 티미딘을 이용하여, 50 K에서 10 ns로 MD한 후 수득한 구조의 개관도.

SNA 단량체

X-B-L-I

-상기 식에서,

-B는 뉴클레오베이스, 피리미딘 또는 퓨린 유사체, 또는 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 헤테로사이클릭 시스템이며,

-L은 링커이고,

-I는 하나 이상의 본질적으로 편평한 공액 시스템을 포함하는 인터칼레이터이다.

X-B-K-L-I

X-B-L-K-I.

SNA 단량체는, 상기 SNA 단량체가 듀플렉스의 가닥들 중 한 가닥의 일부인 경우, 인터칼레이터 I가 역평행 듀플렉스의 주홈에서 인터칼레이팅할 수 있도록 구축될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 SNA 단량체는 역평행한 듀플렉스 형성을 안정화하여, 상보성 서열에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시 양태에서, 효소적으로 병합할 수 있는 SNA 단량체를 제공하는 것이 목적이며, L은 뉴클레오베이스 B에서 역평행 듀플렉스의 주홈까지 이를 수 있다. 적절한 디자인의 L을 이용하면, L은 뒤로 구부러지게 하여, I가 역평행 듀플렉스에 인터칼레이팅되게 할 수 있다. I가 역평행 듀플렉스에 위치하게 되면, 상기 역평행 듀플렉스는 안정화되지만, 바람직하게는 상기 인터칼레이터 I는 SNA 단량체가 위치하는 올리고뉴클레오타이드의 효소적 인지(enzymatic recognition)나, SNA 단량체가 올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합되는 것을 방해하지 않는다.

링커 L

링커 L의 길이는 바람직하게는 30 Å 이하, 25 Å 이하, 20 Å 이하, 19 Å 이하, 18 Å 이하, 17 Å 이하, 16 Å 이하 및 15 Å 이하, 3Å 이상, 4Å 이상, 5Å 이상, 6Å 이상, 7Å 이상, 8Å 이상, 9 Å 이상, 및 10 Å 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

보다 바람직하게는, 상기 링커의 길이는 1 Å 내지 30 Å, 3 Å 내지 20 Å, 가장 바람직하게는 5 Å 내지 15 Å, 6 Å 내지 15 Å, 7 Å 내지 15 Å, 8 Å 내지 15 Å, 9 Å 내지 15 Å. 및 10 Å 내지 15 Å이다.

이들 길이는 인터칼레이터 I가 듀플렉스의 주홈에서 인터칼레이팅할 수 있도록 한다는 점에서, 특히 선호된다. 즉, 본 발명의 SNA 단량체가 올리고뉴클레오타이드에 삽입될 때, 상보성 핵산에 대한 상기 올리고뉴클레오타이드의 친화성 및/또는 특이성이 증가하는 것이 바람직하다.

상기 SNA가 컨쥬게이터를 포함하지 않으며 X-B-L-I로 표시할 수 있는 경우, 링커 L의 바람직한 실시 양태는 하기이며:

-CH₂O(CH₂)_n-

- 상기 식에서, n은 1 내지 10, 보다 바람직하게는 2 내지 8, 3 내지 7이며, 가장 바람직하게는 n은 5 또는 6이다.

마찬가지로, 상기 링커는 또한, 상기 SNA 단량체, X-B-L-I인 X-B-CH ₂ O ( CH ₂ ) _n -I의 일부분으로서 기술될 수 있으며, 링커는 볼드체로 나타내었다.

상기 SNA 단량체가 컨쥬게이터를 포함하며 X-B-K-L-I로 표시할 수 있는 경우, 링커 L의 바람직한 실시 양태는 하기이며:

-(CH₂)_nNHCO(CH₂)_mCO-

- 상기 식에서, n은 1 내지 5이며, m은 1 내지 5로, 예컨대 n은 1 내지 4, m은 1 내지 4, n은 1 내지 3, m은 1 내지 3이며, 보다 바람직하게는 n은 1, m은 2이다.

마찬가지로, 상기 링커는 또한, 상기 SNA 단량체, X-B-K-L-I인 X-B-K-(CH ₂ ) _n NHCO(CH ₂ ) _m CO-I의 일부분으로서 기술될 수 있으며, 링커는 볼드체로 나타내었다.

SNA 단량체가 컨쥬게이터를 포함하며 X-B-L-K-I로 표시할 수 있는 경우, 링커 L의 바람직한 실시 양태는 하기이며:

-(CH2)_m-O-(CH2-)_n　

- 상기 식에서, m 및 n은 각각 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5이다. 보다 더 바람직하게는, m은 1이고, n은 1 내지 10, 1 내지 5이며, 가장 바람직하게는 n은 3 또는 4이다.

또한, 상기 링커는 상기 SNA 단량체, X-B-L-K-I인 X-B-( CH2 ) _m -O-( CH2 -) _n -K-I의 일부분으로서 표시할 수 있으며, 링커는 볼드체로 나타내었다.

다른 링커들:

관련된 다른 링커들은 예를 들어, Ahmadian & Bergstrom M. (Ahmadian and Donald E. Bergstrom 2008, "5-Substituted Nucleosides in Biochemistry and Biotechnology." In Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnoloy and Medicine, P. Herdewijn, ed. Wiley-VCH, Weihheim, 2008, pp 251-276.)에 기술된 것들이며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

L의 위치

B가 퓨린인 경우, 링커 L은 바람직하게는 상기 퓨린의 6번 또는 7번 위치에 연결된다. 가장 바람직하게는, 7번 위치에 연결된다.

마찬가지로, B가 피리미딘인 경우, 링커는 바람직하게는 5번 또는 6번 위치에 연결된다. 가장 바람직하게는, 5번 위치에 연결된다.

DNA 및 RNA 폴리머라제가 특히 이들 위치에서 뉴클레오베이스의 변형을 용인할 수 있기 때문에, 이들 링커의 위치가 특히 선호된다. 즉, 폴리머라제는 전술한 위치에서 변형된 뉴클레오타이드를 DNA 또는 RNA 합성의 기질로서 종종 사용할 수 있다. 이러한 일례는 피리미딘의 5번 위치에 비오틴 기가 공액되어 있는 뉴클레오타이드 트리포스페이트이다. 마찬가지로, 이들 위치에서 변형된 SNA 트리포스페이트는 폴리머라제에 대한 기질이 된다는 면에서 바람직할 것이다.

컨쥬게이터 K

언급한 바와 같이, 바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 SNA 단량체는 컨쥬게이터 K를 포함한다. 본 문맥에서, 컨쥬게이터라는 용어는, K가 인터칼레이터 또는 뉴클레오베이스의 것들과 겹쳐지는 p-오비탈을 포함함을 의미한다. K는 탄소수 2 내지 12의 알케닐, 탄소수 2 내지 25의 알키닐, 또는 다이아조, 또는 25개 이하의 탄소 및/또는 질소 원자의 길이를 가진 이들의 조합 뿐만 아니라 모노사이클릭 방향족 고리시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 실시 양태에서, K는 아세틸렌 또는 반복성 아세틸렌이다.

가장 바람직하게는, K는 에티닐이다.

K-I의 바람직한 실시 양태

바람직한 실시 양태에서, K-I는 에티닐-아릴이며, 바람직하게는 에티닐 아릴은 1-에티닐피렌이다.

K-L의 바람직한 실시 양태

K-L의 바람직한 실시 양태는 하기이며:

C≡C-(CH₂)_nNHCO(CH₂)_mCO

- 상기 식에서, n은 1 내지 5이며, m은 1 내지 5로, 예컨대 n은 1 내지 4, m은 1 내지 4, n은 1 내지 3, m은 1 내지 3이며, 보다 바람직하게는, n은 1, m은 2이다.

또한, K-L은 SNA 단량체, X-B-K-L-I인 X-B-C≡C-( CH ₂ ) _n NHCO ( CH ₂ ) _m CO-I의 부분으로서 기술될 수 있으며, 링커는 볼드체로 나타내었다.

L-K의 바람직한 실시 양태

L-K의 바람직한 실시 양태는 하기이며:

(CH₂)_m-O-(CH₂)_n-C≡C

- 상기 식에서, m 및 n은 각각 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5이다. 보다 더 바람직하게는, m은 1이고 n은 1 내지 10, 1 내지 5이며, 가장 바람직하게는 n은 3 또는 4이다.

SNA 단량체인 X-B-L-K-I의 일부로서 기술되는 경우, L-K는 볼드체로 나타내었다:

X-B-( CH ₂ ) _m -O-( CH ₂ ) _n -C≡C-I.

B의 바람직한 실시 양태

B는 바람직하게는 하기 구조 1 내지 20으로 예시되는 바와 같은 피리미딘 또는 퓨린으로, B는 SNA 단량체의 부분으로서 표시되어 있다:

- 상기 식에서,

-Y = O 또는 S, 및

-R₁은 L-I, K-L-I 또는 L-K-I이다.

L-I, K-L-I 및 L-K-I의 특히 바람직한 버전은 전후에 기술되어 있다.

따라서, B는 바람직하게는 구조 1 내지 20에서 예시된 B 구조들의 군으로부터 선택된다.

인터칼레이터 I

본 발명의 SNA 단량체의 인터칼레이터 I는 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 뉴클레오베이스와 공동-스태킹(co-stacking)할 수 있는 하나 이상의 본질적으로 편평한 공액 시스템을 포함한다.

바람직한 실시 양태에서, I는 바이사이클릭 방향족 고리시스템, 트리사이클릭 방향족 고리시스템, 테트라사이클릭 방향족 고리시스템, 펜타사이클릭 방향족 고리시스템 및 이들의 헤테로방향족 유사체 및 이들의 치환기의 군으로부터 선택된다.

I의 특히 바람직한 실시 양태는 피렌, 페난트로이미다졸 및 나프탈이미드이다:

본 발명의 바람직한 단량체 L-K-I, K-L-I, L-I

전술한 설명에서 알 수 있듯이, 링커 L, 선택적인 컨쥬게이터 K 및 인터칼레이터 I는 여러 가지 방식으로 조합되어, 본 발명의 바람직한 단량체를 형성할 수 있다. 예시할 만한 조합의 합성은 실시예 부문에 나와 있다.

제2 측면

본 발명의 제2 측면은 올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합할 수 있는 제1 측면의 SNA 단량체이다. 이러한 측면에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 단량체는 전형적으로 뉴클레오타이드 트리포스페이트일 것이다.

제3 측면

본 발명의 제3 측면은 표준 올리고뉴클레오타이드 합성으로 올리고뉴클레오타이드로 병합할 수 있는 제1 측면의 SNA 단량체이다. 이러한 측면에서, 상기 올리고뉴클레오타이드 단량체는 전형적으로 뉴클레오사이드 포스포아미다이트(phosphoramidite)일 것이다.

제4 측면

본 발명의 제4 측면은 상기 제1 측면의 SNA 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드의 (다른) 단량체들은 DNA 또는 RNA 단량체이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 (본 발명의 제2 측면의) 올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합할 수 있는 SNA 단량체를 이용해 효소적으로 합성될 수 있거나, 또는 상기 올리고뉴클레오타이드는 표준 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 (본 발명의 제3 측면의) 표준 올리고뉴클레오타이드 합성으로 올리고뉴클레오타이드로 병합할 수 있는 SNA 단량체를 이용해 합성될 수 있다.

제5 측면

본 발명의 제5 측면은 예를 들어, 시퀀싱 또는 PCR에서 폴리머라제에 대한 기질로서의, (본 발명의 제2 측면의) 효소적으로 병합할 수 있는 SNA 단량체의 용도이다.

제6 측면

본 발명의 제6 측면은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머 또는 주형으로서의, (본 발명의 제4 측면에서 기술된) SNA 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용도이다.

제7 측면

본 발명의 제7 측면은:

a. 주형 핵산을 제공하는 단계,

b. 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계,

c. 폴리머라제를 제공하는 단계,

d. 뉴클레오타이드 트리포스페이트 혼합물을 제공하는 단계,

e. 단계 a 내지 d의 성분들을 혼합하고, 상기 프라이머가 상기 주형에 어닐링될 수 있는 조건을 제공하는 단계,

f. 프라이머 연장을 허용하는 조건 하에, 상기 주형에 어닐링된 상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 연장하는 단계를 포함하는 방법으로서,

- 상기 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 SNA 단량체를 포함하며, 및/또는

- 상기 주형 핵산은 SNA 단량체를 포함하며, 및/또는

- 상기 뉴클레오타이드 트리포스페이트 혼합물은 (본 발명의 제2 측면에서 기술된) 올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합할 수 있는 SNA 단량체를 포함한다.

바람직한 실시 양태에서, 상기 방법은:

g. 단계 f의 제1 연장 산물과 상보성인 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계,

h. 상기 단계 f의 산물을 변성하는 단계,

i. 프라이머 연장을 허용하는 조건 하에, 상기 제1 연장 산물에 어닐링된 상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 연장하는 단계를 추가로 포함한다.

일 실시 양태에서, 상기 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 SNA 단량체를 포함한다.

실시예

실시예 1: 분자 모델링을 토대로 한, 티미딘 -1- 에티닐피렌 컨쥬게이트

결과 및 토의 : 아크리딘과 DNA 간의 전형적인 인터칼레이션의 구조물은 www.pdb.org (ID 367D) (AK Todd, A Adams, JH Thorpe, WA Denny, LPG Wakelin and CJ Cardin, J. Med. Chem. 1999, 42, 536-540)에서 입수하였다. 이 구조물은 피렌 모이어티를 위치시키는 데 사용한, 인터칼레이팅된 아크리딘 절편 (도 1)을 포함한다. 피렌 단위의 병합을 모델링하기 위해, 3회 반복 구조인 (TTAGGG)₃가 있는 DNA 헥사데카머(hexadecamer)를 소위 B-DNA 구조로 구축하였다.

이들 2가지 구조물에서, 피렌이 인터칼레이팅된 새로운 TTAGGG 삼량체를 구축하였으며, 분자역학을 이용해 에너지를 최소화하였다. 인터칼레이션 부위를 라이닝(lining)하는 4개의 뉴클레오타이드는 볼드체로 나타내었으며, 참고로 상부 가닥을 "센스"로 하부 가닥을 "안티센스"로 지정하였다:

5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' (센스 가닥)

3'-AATCCCAATCCCAATCCC-5' (안티센스 가닥)

생성되는 구조는 잘 알려져 있으며, 듀플렉스 구조를 안정화시켰으며 (도 2), 상세히 살펴보면, 수소 결합이 모두 유지되어 있음이 명확하였다 (도 3).

피렌 단위를 DNA 가닥에 연결하기 위해, 본 발명자들은 메틸기 대신에 CH₂OH가 있는 티미딘의 변이체인 5-(하이드록시메틸)우라실을 출발점으로서 사용할 수 있을 것이라 생각한다. 피렌은 알킨기를 여전히 포함해야 하므로, 본 발명자들은 뉴클레오베이스의 산소와 알킨-피렌 단위 사이의 링커에 탄소수 1 내지 5의 새로운 구조를 구축하였다. 상기 구조가 가진 고유의 키랄성(chirality)으로 인해, (도 3의 피렌 하부의) 센스 가닥 또는 (도 3의 피렌 상부의) 안티센스 가닥에 있는 티미딘에 부착이 이루어졌는지에 따라 길이 차이가 난다. 구축물을 수동적으로 구성하는 동안에 상기 구조물에 바람직하지 못한 상호작용이 도입되는 것을 피하기 위해, 일련의 짧은 분자 동력학(MD) 시뮬레이션을 수행하였다. 상기 시뮬레이션은 50 K, 100 K, 150 K, 200 K, 250 K 및 300 K로 설정된 온도로 10 ps동안 진행하였다. 모든 구조물은 더 높은 온도에서는 초기의 나선형 기하학에서 상당히 벗어났으므로, 본 발명자들은 50 K에서 시뮬레이션한 후 수득한 구조물을 사용하기로 선택하였다.

도 4는 센스 가닥의 변형된 뉴클레오베이스와 함께, 탄소수 1 내지 5의 스페이서 (도 4a 내지 4e)를 사용한, 연결되지 않은 피렌 단위와 연결된 피렌 단위 사이의 인터칼레이션 부위의 겹침(overlay)을 보여주는 것이다. 본 발명자들은 나선의 보다 떨어진 영역에 변화의 영향이 미치는 것을 피하기 위해, 구조물의 조사 시, 인터칼레이션 부위에 가장 근접한 8개의 뉴클레오타이드의 중첩을 이용하기로 선택하였다.

이들 구조에서, 3-탄소 및 4-탄소 링커 (n=3 및 n=4, 도 3) 둘 다, 연결되지 않은 피렌 단위와 연결된 피렌 단위가 중첩될 수 있는 비구속된(unstrained) 기하학을 달성할 수 있다는 것이 명백하다. 따라서, 3-메틸렌 스페이서 또는 4-메틸렌 스페이서는 센스 가닥에서 컨쥬게이트 티미딘의 인터칼레이션에 최적인 것으로 보인다.

유사한 방식으로, 본 발명자들은 (안티센스 가닥의 변형된 뉴클레오베이스와 함께) 피렌 단위 "위의" 티미딘에서 링크를 만들었으며, 하기 구조물을 수득하였다 (도 5 a-e).

피렌 단위 "위에" 위치한 티미딘을 사용하는 경우, 링커들 중 어느 것도 완전히 비구속된 기하학을 달성할 수 없었다. 관능화된 티미딘의 산소를 알키닐 링커에 연결하는 데 필요한 180° 회전을 하는 데 있어서, 본 연구에서 사용된 가장 긴 5-탄소 사슬이 최적인 것으로 보인다.

전술한 모델링 데이터는, 이상적인 구축은 센스 가닥의 티미딘의 자리에서 올리고뉴클레오타이드에 병합된, 에티닐피렌과 (5-하이드록시메틸)우라실 간의 3-메틸렌 또는 4-메틸렌 스페이서일 것임을 제안한다.

합성

4-탄소 스페이서를 이용한 1-에티닐피렌-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 가능한 합성을 도식 1에 나타낸다.

산성 조건 하에, 시판의 5-(하이드록시메틸)우라실을 헥스-5-인-1-올 (이 또한 시판됨)로 알킬화할 수 있으며 (MS Motawia, AE-S Abdel-Megied, EB Pedersen, CM Nielsen and P Ebbesen, Acta Chem. Scand. 1992, 46, 77-81; AE-S Abdel-Megied, EB Pedersen and C Nielsen, Monatshefte Chem. 1998, 129, 99-109), 1-브로모피렌을 이용한 소노가시라 커플링(Sonogashira coupling) (K Sonogashira, Y Tohda and N Hagishara, Tetrahedron Lett.1975, 16, 4467-4470)으로 인터칼레이터를 도입한다. 피리미딘다이온의 비스-실릴화는 TMSOTf에 의해 매개되는 2-데옥시 리보오스 트리아세테이트의 당화를 일으킨다 (MS Motawia, AE-S Abdel-Megied, EB Pedersen, CM Nielsen and P Ebbesen, Acta Chem. Scand. 1992, 46, 77-81; AE-S Abdel-Megied, EB Pedersen and C Nielsen, Monatshefte Chem. 1998, 129, 99-109). 바람직하지 못한 α-아노머로부터 β-아노머를 분리한 후, 2개의 아세틸기를 제거할 수 있으며, 이어서 1차 알콜의 보호를 위해 DMT 기를 도입하고, 포스포아미데이트로서 3-위치를 활성화할 수 있다.

제안한 합성 경로는 모두 7단계로, 관리가능한 작업이어야 한다.

도식 1. 포스포아미데이트 피렌-티미딘 컨쥬게이트의 제안된 합성

결론

인터칼레이팅 피렌을 이용한 짧은 (18 bp) DNA 이중 나선의 모델링 연구로, 변형된 티미딘 염기에 공액된 피렌 단위를 가진 듀플렉스에 대한 최상의 디자인이 센스 가닥의 1-에티닐피렌에 부착된 단순 3-탄소 또는 4-탄소 스페이서인 것으로 확인하였다. 더욱이, 변형된 티미딘 염기와 피렌 사이에 4-탄소 스페이서를 가진 올리고뉴클레오타이드를 병합하기 위해 포스포아미데이트를 제공하는 7-단계 합성 경로를 나타내었다.

실시예 2

본 발명의 다른 예시적인 단량체의 합성

도식-1:

4-옥소-4( 피렌 -1-일)-부티르산 (2):

AlCl₃ (26.6g, 199.86m.moles)를 0℃에서 니트로벤젠 (1000 ㎖) 중 석신산 무수물 (10 g, 99.93 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 이어서 화합물-1 (20.2 g, 99.93 mmol)을 동일 온도에서 첨가한 다음, 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC로 모니터링하였으며; TLC는 출발 물질이 완전히 사라진 것을 보여준다. 상기 반응 혼합물을 25% 빙냉 염산 용액 600 ㎖에 부었다. 황색의 고체 화합물을 여과하고, 완전히 건조하였다. 산물을 EtOH로부터 결정화하여, 화합물-2 (21.8 g, 72%)를 황색 고체로서 수득하였다.

N-프로필-옥소- 피렌 부티르산 아미드 (4):

DIPEA (18.6 ㎖, 132.48 mmol)를 실온에서 질소 분위기 하에 건조 DMF (70 ㎖) 및 1,2-다이클로로에탄 (50 ㎖) 중 화합물-2 (10 g, 33.11 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 0℃에서 냉각시킨 후, EDC.HCl (6.3 g, 33.11 mmol)과 이어서 HOBt (5.1 g, 33.11 mmol)를 질소 분위기 하에 로트 와이즈(lot wise) 첨가하였다. 화합물-3 (2.3 ㎖, 33.11 mmol)을 0℃에서 질소 분위기 하에 사기 혼합물에 적가하였다. 그 후, 상기 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였으며, 출발 물질은 사라졌다. 이후, 물 500 ㎖을 상기 반응 혼합물에 첨가하여, 산물을 침전시켰다. 침전물을 여과하고, 고체 화합물을 헥산 중 20% 에틸 아세테이트로 세정하였다. 황색의 고체 화합물을 P₂O₅로 건조하여, 화합물-4 (7.1 g, 63%)를 황색 고체로서 수득하였다.

피렌 -옥소 아미드 dU (6):

화합물-4 (3.9 g, 11.43 mmol)를 실온에서 질소 분위기 하에 건조 THF (100 ㎖) 중 화합물-5 (5 g, 7.62 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 트리에틸아민 (4.3 ㎖, 30.48 mmol)을 첨가하였다. 그런 다음, 상기 용액에 30분 동안 질소 가스를 살포하여 탈기시키고, Pd (PPh₃)₂Cl₂ (535 mg, 0.762 mmol)를 첨가한 후, 다시 15분 동안 탈기시키고, 마지막으로 CuI (72 mg, 0.381 mmol)를 첨가한 후, 상기 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트 패드(celite pad)를 통해 여과하고, 상기 여과물을 감압 하에 증발시키고, 화합물을 DCM에 용해시킨 후, 물과 염수 용액으로 세정하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 하에 건조하고, 여과한 후, 감압 하에 증발시켰다. 조(crude) 화합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (60-120메쉬, 헥산 중 50-60% EtOAc)로 정제하여, 황색의 고체 화합물-6 (5.5 g, 83%)을 수득하였다.

단계 4:

피렌 -옥소-5'- DMT - 아미다이트 dU (7):

화합물-6 (1.2 g, 1.38 mmol)을 질소 분위기 하에 건조 톨루엔으로 2회 동시-증발(co-evaporation)시키고, 고압 진공 하에 건조한 후, 건조 DCM 20 ㎖에 용해시키고, 1-H-테트라졸 (126 mg, 1.79 mmol)을 첨가한 후, 질소 분위기 하에 실온에서 Phos 시약 (0.6 ㎖, 1.79 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, DCM/헥산으로 2회 침전시키고; 마지막으로 점성의 고체 화합물을 DCM에 용해시킨 후, 로타베이퍼(rotavapor) 하에 증발시키고, 고 진공 하에 건조하여, 화합물-7 (850 mg, 61%)을 옅은 색의 고체로서 수득하였다.

5',3'- 다이아세틸 - dT (2):

화합물-1 (100 g, 412.83 mmol)의 용액을 건조 피리딘 (1500 ㎖)에 용해시키고, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 이 교반된 현탁액에, 아세트산 무수물 (156 ㎖, 1651.32 mmol)을 질소 분위기 하에 15분 내지 20분 동안 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하여, 맑은 용액 (pH는 중성이었음)을 수득하였다. 상기 반응 혼합물을 TLC (80% EtOAc/헥산)로 모니터링하였다. TLC는, 출발 물질 중 대부분이 사라짐을 보여준다. 상기 반응물을 0℃로 냉각시키고, 메탄올 206 ㎖로 켄칭(quenching)하였다. 상기 피리딘 중 대부분을 감압 하에 제거하고, 조 화합물을 물 (1000 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (1000 ㎖)에 용해시키고, 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc (250 ㎖ X 2회)로 추출한 다음, 조합된 유기층을 2N HCl (200 ㎖), 포화 NaHCO₃ (250 ㎖), 물 (250 ㎖ X 2회) 및 염수 (250 ㎖)로 세정하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 조 (점성) 화합물을 30% 에틸 아세테이트/헥산 (500 ㎖ X 2회)으로 침전시켜, 백색의 결정질 고체를 수득하였다. 추가로 정제하지 않은 채, 상기 화합물을 다음 단계에 사용하였다. 산물을 ¹HNMR 및 MS에 의해 특징지었다.

수율: 124g (92%).

76 SPL02211 -02.

5- 하이드록시메틸 - 5',3'- O - 다이아세틸 -2'- 데옥시우리딘 (4):

화합물-2 (19 g, 58.22 mmol)를 무수 벤젠 (50 ㎖)으로 동시증발시키고, 건조 벤젠 300 ㎖을 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 110℃로 10분 동안 서서히 가열하고, NBS (12.6 g, 71.03 mmol) 및 AIBN (513 mg)을 상기 용액에 첨가하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하고, 출발 물질은 사라졌다. 상기 반응 혼합물을 가열 조건 하에 여과하고, 감압 하에 용매를 증발시켜, 화합물-3 (23 g의 가미(gammy) 고체 화합물)을 수득하였다. 조 화합물-3 (23 g)을 1,4-다이옥산 150 ㎖에 용해시키고, 상기 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 그런 다음, NaHCO₃ (7.6 g)를 물 150 ㎖에 용해시키고, 0℃에서 상기 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 4-5% MeOH)로 정제하여, 화합물-4 (2개의 단계로부터 9 g, 45.2%)를 담황색 고체로서 수득하였다.

74 & 75 SPL02211 -02.

5- 메틸하이드록시 - 피렌 - 헥산 - 5',3'- O - 다이아세틸 -2'- 데옥시우리딘 (5):

실온에서 질소 분위기 하에 화합물-4 (3.0 g, 8.77 mmol) 및 화합물-12 (2.1 g, 7.01 mmol)의 용액을 건조 톨루엔에 용해시켰다. 그런 다음, B(C₆F₅)₃ (449 mg, 0.87 mmol)를 질소 분위기 하에 반응 혼합물에 적가한 후, 상기 혼합물을 110℃에서 5시간 동안 환류하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하고, 출발 물질은 사라졌다. 이 후, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 물 (50 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (50 ㎖)에 용해시키고, 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc (25 ㎖ X 2회)로 추출한 후, 조합된 유기층을 물 (20 ㎖)과 염수 (25 ㎖)로 세정하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 후, 감압 하에 증발시켰다. 점성 액체 화합물-5 (4.0 g)를 다음 단계에 사용하였다. 상기 화합물을 LCMS로 특징지었다.

40 SPL02211 -03.

5- 메틸하이드록시 - 피렌 - 헥산 -2'- 데옥시우리딘 (6):

화합물-5 (4.0 g)를 MeOH.NH₃ 용액 60 ㎖에 용해시키고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 조 화합물을 EtOAc (60 ㎖)로 희석시킨 후, 유기층을 물 (10 ㎖)과 염수 (10 ㎖)로 세정하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 후, 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 실리카 겔 (60-120 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, DCM 중 5% MeOH로 용출하여, 화합물-6 (2개 단계로부터 410 mg, 8%)을 황백색 고체로서 수득하였다.

42 SPL02211 -03.

5- 메틸하이드록시 - 피렌 - 헥산 -5',3'- O - lev 2'- 데옥시우리딘 (7):

화합물-6 (25 mg, 0.04 mmol)을 질소 분위기 하에 건조 DCM에 용해시키고, 용액을 0℃에서 냉각시켰다. 그런 다음, DCC (11 mg, 0.05 mmol), HOBt (6 mg, 0.04 mmol)와 이어서 레불린산 (0.01 ㎖, 0.09 mmol)을 첨가하였다. 마지막으로, DMAP (촉매량)를 첨가하였다. 이 후, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하고, 출발 물질은 사라졌다. 상기 반응물을 DCM으로 희석시키고, 유기층을 물 (10 ㎖ X 2회)과 염수 (10 ㎖)로 세정하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과한 다음, 감압 하에 용매를 증발시켜, 화합물-7 (26 mg)을 황백색 고체로서 수득하였다.

56 SPL02211 -03.

5- 메틸하이드록시 - 피렌 - 헥산 -5'- O - lev 2'- 데옥시우리딘 (8):

1,4-다이옥산 (0.35 ㎖) 중 화합물-7 (0.2 mmol)의 용액에 0.15 M 포스페이트 완충액 pH 7 (1.65 ㎖) 및 리파제 (CAL-A 또는 PSL-C; 1:1 w/w)를 첨가한다. 반응을 TLC (10% MeOH/CH₂Cl₂)로 모니터링하면서, 혼합물을 6시간 내지 10시간 동안 흔든다 (250 rpm). 3'-O-레부니닐기의 선택적인 가수분해가 완료할 때, 효소를 여과하고, CH₂Cl₂로 세정한다. 조합된 여과물을 농축시키고, 크로마토그래피 정제 후의 잔류물은 화합물 8을 백색 고체로서 제공한다.

참조문헌: Garcia, J.; Fernandez, S.; Ferrero, M.; Sanghvi, Y. S.; Gotor, V. Building Blocks for the Solution Phase Synthesis of Oligonucleotides: Regioselective Hydrolysis of 3', 5'-Di-O-levulinylnucleosides Using an Enzymatic Approach. J. Org . Chem . (2002), 67, 4513-4519.

5- 메틸하이드록시 - 피렌 - 헥산 -5'- O - lev -2'- 데옥시우리딘 -3'- O - 아미다이트 (9):

건조 CH₂Cl₂ (2.5 ㎖) 중 화합물-8 (1 mmol)의 교반된 용액에 인산화 시약 (1.2 mmol) 및 활성화제 (Py.TFA 또는 DCI; 1.2 mmol)를 첨가하였다. 반응을 TLC (10% MeOH/CH₂Cl₂)로 모니터링하면서, 혼합물을 1시간 내지 3시간 동안 교반한다. 인산화가 완료하였을 때, 용액을 농축시키고, 크로마토그래피 정제 후의 잔류물은 화합물 9를 백색 고체로서 제공한다.

참조문헌: Sanghvi, Y.S., Guo, Z., Pfundheller, H.M. and Converso, A. Improved Process for the Preparation of Nucleosidic Phosphoramidites Using a Safer and Cheaper Activator. Org. Process Res. Dev. 4, 175-181 (2000).

피렌 - 헥신 -1-올 (11):

화합물-10 (10 g, 35.31 mmol)의 용액을 THF/Et₃N (600 ㎖ 1:1)에 용해시키고, 상기 용액에 30분 동안 질소를 살포하여 탈기한 다음, Pd (PPh₃)₂Cl₂ (1.2 g, 1.76 mmol), CuI (336 mg, 1.76 mmol)를 첨가하고, 15분 동안 질소를 살포하여 탈기한 후, 마지막으로 헥신-1-올 (11.7 ㎖, 105.94 mmol)을 첨가하고, 10분 동안 질소를 살포하여 탈기한 다음, 축합기를 플라스크에 장착하고, 상기 반응 플라스크를 예열한 오일조(oil bath) (80℃)에 침지시켰다. 8시간 동안 반응을 진행시키고, 용매를 진공 하에 제거하여, 잔류물을 수득하고, 이를 EtoAc에 용해시키고, 1N HCl로 세정, 물로 3회 세정, 마지막으로 염수로 세정하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한 후, 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 실리카 겔 (60-120 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, EtOAc/헥산 (20-25%)으로 용출하여, 피렌-헥신-1-올을 담황색 고체 [화합물-11] (9.5 g, 90%)로서 수득하였다.

33 SPL02211 -02.

피렌 - 헥산올 (12):

피렌-헥신-1-올 (10 g)을 파르 병(Parr bottle)에 놓고, MeOH (300 ㎖)에 용해시키고, 용기를 질소로 10분 동안 플러싱(flusing)하였다. 10% Pd-C (1.2 g)를 첨가하였다. 반응 용기를 연속해서 진공처리하고, 결국 수소로 2회 가압한 다음, 100 psi의 수소압을 유지시키고, 현탁액을 실온의 암실에서 16시간 동안 흔들었다. 셀라이트를 통한 여과에 의해 촉매를 제거하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 (30% 헥산 중 EtOAc) 상에서의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 화합물-12 (7.5 g, 74%)를 황백색 고체로서 수득하였다.

88 SPL02211 -02.

도식 3:

화합물-4까지의 합성 프로토콜은 도식-2를 참조한다.

5- 하이드록시메틸 - 피렌 -펜탄-5',3'-O- 다이아세틸 -2'- 데옥시우리딘 (13):

실온에서 건조 톨루엔 중 화합물-4 (5.0 g, 14.61 mmol) 및 화합물-19 (3.4 g, 11.69 mmol)의 현탁액에, B(C₆F₅)₃ (748 mg, 1.46 mmol)을 질소 분위기 하에 반응 혼합물에 첨가한 다음, 상기 혼합물을 110℃에서 5시간 동안 환류하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하고, 출발 물질은 사라졌다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 물 (50 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (50 ㎖)로 용해시키고, 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc (25 ㎖ X 2회)로 추출한 다음, 조합된 유기층을 물 (20 ㎖)과 염수 (25 ㎖)로 세정하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 감압 하에 증발시켰다. 점성 액체 화합물-13 (g)을 다음 단계에 사용하였다.

47 SPL02211 -03.

5- 하이드록시메틸 - 피렌 -펜탄-2'- 데옥시우리딘 (14):

화합물-13 (2.0 g)을 MeOH.NH₃ 용액 30 ㎖에 용해시키고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 조 화합물을 EtOAc (30 ㎖)로 희석시킨 후, 유기층을 물 (15 ㎖)과 염수 (15 ㎖)로 세정하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 후, 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 실리카 겔 (60-120 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후, DCM 중 5% MeOH로 용출하여, 황백색 고체 화합물의 화합물-14 (200 mg)를 수득하였다.

5- 하이드록시메틸 - 피렌 -펜탄-5',3'-O- lev 2'- 데옥시우리딘 (15):

화합물-14 (25 mg, 0.046 mmol)를 질소 분위기 하에 건조 DCM에 용해시키고, 0℃에서 교반한다. 그런 다음, DCC (11 mg, 0.05 mmol), HOBt (6 mg, 0.05 mmol) 및 레불린산 (0.01 ㎖, 0.09 mmol)을 차례대로 첨가한다. 마지막으로, DMAP (cat)를 첨가한다. 그런 다음, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하고, 출발 물질은 사라진다. 반응물을 DCM으로 희석시키고, 유기층을 물 (10 ㎖ X 2회)과 염수 (10 ㎖)로 세정하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조시킨 다음, 여과하고, 감압 하에 용매를 증발시켜, 화합물-15 (26 mg)를 황백색 고체로서 수득한다.

참조문헌: Garcia, J.; Fernandez, S.; Ferrero, M.; Sanghvi, Y. S.; Gotor, V. Building Blocks for the Solution Phase Synthesis of Oligonucleotides: Regioselective Hydrolysis of 3',5'-Di-O-levulinylnucleosides Using an Enzymatic Approach. J. Org . Chem . (2002), 67, 4513-4519.

피렌 - 펜틴 -1-올 (18):

화합물-10 (10 g, 35.316 mmol)의 용액을 THF/Et₃N (600 ㎖ 1:1)에 용해시키고, 용액에 30분 동안 질소를 격벽 살포(sparging septum)하여 탈기시킨 다음, Pd (PPh₃)₂Cl₂(1.2 g, 1.76 mmol), CuI (336 mg, 1.76 mmol)를 첨가하고, 15분 동안 질소를 격벽 살포하여 탈기시키고, 마지막으로 펜틴-1-올 (9.8 ㎖, 105.94 mmol)을 첨가하고, 10분 동안 질소를 살포하여 탈기시킨 후, 축합기를 플라스크에 장착하고, 상기 반응 플라스크를 예열한 오일조 (80℃)에 침지시켰다. 8시간 동안 반응을 진행시키고, 용매를 진공 하에 제거하여, 잔류물을 수득하고, 이를 EtoAc에 용해시키고, 1N HCl로 세정, 물로 3회 세정, 마지막으로 염수로 세정하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한 후, 감압 하에 증발시켰다. 조 화합물을 실리카 겔 (60-120 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, EtOAc/헥산 (20-25%)으로 용출하여, 화합물-18 (9 g, 90%)을 담황색 고체로서 수득하였다.

34 SPL02211 -02.

피렌 -펜탄올 (19):

화합물-18 (8.6 g)을 파르 병에 놓고, MeOH (250 ㎖)에 용해시키고, 용기를 질소로 10분 동안 플러싱하였다. 10% Pd-C (900 mg)를 첨가하였다. 반응 용기를 연속해서 진공처리하고, 결국 수소로 2회 가압한 다음, 100 psi의 수소압을 유지시키고, 현탁액을 실온의 암실에서 16시간 동안 흔들었다. 셀라이트를 통한 여과에 의해 촉매를 제거하였다. 여과물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 (30% 헥산 중 EtOAc) 상에서의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 화합물-19 (6 g, 69%)를 황백색 고체로서 수득하였다.

POSPL02211 -02.

Claims

하기 구조를 가지는 변형된 올리고뉴클레오타이드 단량체 SNA:
X-B-L-I
-상기 식에서,
-X는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 유사체의 백본으로 병합될 수 있는 백본 단량체 단위이며,
-B는 뉴클레오베이스(nucleobase), 피리미딘 또는 퓨린 유사체, 또는 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 헤테로사이클릭 시스템이며,
-L은 링커(linker)이고,
-I는 하나 이상의 본질적으로 편평한 공액 시스템(essentially flat conjugated system)을 포함하는 인터칼레이터(intercalator)이며,
상기 링커의 길이는 5 Å 내지 15Å 인, 변형된 올리고뉴클레오타이드 단량체 SNA.
제1 항에 있어서,
B와 L 사이 또는 L과 I 사이에 컨쥬게이터 K를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 단량체:
X-B-K-L-I
X-B-L-K-I.
제1 항에 있어서,
하기로 기술되는 것을 특징으로 하는, X-B-L-I 단량체:
X-B-CH₂O(CH₂)_n-I
(상기 식에서, n은 5 또는 6임).
제2 항에 있어서,
하기로 기술되는 것을 특징으로 하는, X-B-K-L-I 단량체:
X-B-K-(CH₂)_nNHCO(CH₂)_mCO-I
(상기 식에서, n은 1 내지 3이고, m은 1 내지 3임).
제2 항에 있어서,
하기로 기술되는 것을 특징으로 하는, X-B-L-K-I 단량체:
X-B-(CH2)_m-O-(CH2-)_n-K-I
(상기 식에서, m은 1이고, n은 3 또는 4임).
제2 항, 제4 항, 또는 제5 항 중 어느 한 항에 있어서,
K가 에티닐인 것을 특징으로 하는, 단량체.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서,
X-B가 DNA 또는 RNA 단위인 것을 특징으로 하는, SNA 단량체.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합할 수 있는 것을 특징으로 하는, SNA 단량체.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
표준 올리고뉴클레오타이드 합성으로 올리고뉴클레오타이드로 병합할 수 있는 것을 특징으로 하는, SNA 단량체.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 따른 SNA 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
폴리머라제에 대한 기질로서의, 제8 항에 따른 효소적으로 병합할 수 있는 SNA 단량체의 용도.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머 또는 주형으로서의, 제10 항에 따른 SNA 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용도.
a. 주형 핵산을 제공하는 단계,
b. 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
c. 폴리머라제를 제공하는 단계,
d. 뉴클레오타이드 트리포스페이트 혼합물을 제공하는 단계,
e. 단계 a 내지 d의 성분들을 혼합하고, 상기 프라이머가 상기 주형에 어닐링될 수 있는 조건을 제공하는 단계,
f. 프라이머 연장을 허용하는 조건 하에, 상기 주형에 어닐링된 상기 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 연장하는 단계를 포함하는 방법으로서,
- 상기 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드가 SNA 단량체를 포함하며, 및/또는
- 상기 주형 핵산이 SNA 단량체를 포함하며, 및/또는
- 상기 뉴클레오타이드 트리포스페이트 혼합물이, 올리고뉴클레오타이드로 효소적으로 병합할 수 있는 SNA 단량체를 포함하는, 방법.
제13 항에 있어서,
g. 단계 f의 제1 연장 산물과 상보성인 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
h. 상기 단계 f의 산물을 변성하는 단계,
i. 프라이머 연장을 허용하는 조건 하에, 상기 제1 연장 산물에 어닐링된 상기 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 연장하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.