KR20140039151A - 무렌즈 단층 촬영 이미징 장치들 및 방법들 - Google Patents

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KR20140039151A
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아이도간 오즈칸
세한 오머 이시크만
와헤브 비샤라
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미징을 위한 시스템은 이미지 센서; 상기 샘플을 유지하도록 구성된 샘플 홀더 - 상기 샘플 홀더는 상기 이미지 센서에 인접 배치됨 -; 및 부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 포함하는 조명 소스를 포함한다. 상기 조명 소스는 애퍼처, 광섬유 케이블, 또는 상기 조명 소스와 상기 샘플 홀더 사이에 삽입된 광 도파관 중 적어도 하나를 통해 상기 샘플을 조명하도록 구성되고, 상기 조명 소스는 복수의 상이한 각도를 통해 상기 샘플을 조명하도록 구성된다.

Description

무렌즈 단층 촬영 이미징 장치들 및 방법들{LENS-FREE TOMOGRAPHIC IMAGING DEVICES AND METHODS}
관련 출원들
본원은 2011년 1월 6일자로 출원된 미국 특허 가출원 제61/430,465호 및 2011년 5월 16일자로 출원된 미국 특허 가출원 제61/486,685호에 대해 우선권을 주장한다. 우선권은 35 U.S.C.§119에 따라 주장된다. 전술한 특허 출원들은 본 명세서에서 충분히 설명되는 것처럼 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 일반적으로 세포들과 같은 미시적인 구조들의 이미징을 위한 방법들 및 장치들에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 분야는 정적 샘플 내의 또는 미세 유체 환경 내에 흐르는 세포, 세포 소기관, 세포 입자 등과 같은 작은 입자들의 단층 촬영 이미징을 위한 시스템들 및 방법들에 관한 것이다.
광 현미경 검사는 여러 세기 동안 생명 과학 분야에서 대체 불가능한 도구였다. 그럼에도, 그의 설계는 그의 개시 이후에 본질적으로 변경되지 않았는데, 즉 견본의 이미지는 가시화를 위해 눈 또는 디지털 센서 어레이에 의해 검출되기 전에 렌즈들 및 다른 광학 컴포넌트들의 시스템을 통해 확대된다. 더 좋은 해상도 및 콘트라스트로 더 작은 특징들을 분해(resolving)하기 위한 요청은 광 현미경 검사의 능력을 그의 크기 및 복잡성의 증가의 대가로 향상시켰다. 한편, 고도로 소형화된 아키텍처들 내의 생체 샘플들의 빠르고 효율적인 취급 및 처리를 제공하는 미세 유체 및 랩온어칩(lab-on-a-chip) 시스템들과 같은 새로운 기술들이 번성하였다. 그러나, 견본들의 광학적 검사는 여전히 전통적인 광 현미경들에 의해 수행되고 있으며, 이는 일반적으로 미세 유체 시스템들의 스케일에 비해 여러 자릿수의 크기 미스매치를 갖는다. 결과적으로, 소형화된 랩온어칩 플랫폼들과 통합할 수 있는 대안적인 소형 현미경 검사 양식들에 대한 명백한 필요가 존재한다.
새로운 광학 현미경 검사 양식들에 대한 촉구는 소형화 및 미세 유체 통합에 대한 필요에 의해서만 구동되지 않는다. 상당한 시야(FOV) 감소의 대가로 높은 해상도가 달성된다는 사실은 렌즈 기반 이미징의 또 하나의 본질적인 한계이다. 전통적인 광 현미경 검사의 비교적 작은 FOV는 높은 처리량의 현미경 검사가 대단히 요구되는 모델 유기체들의 희귀 세포 이미징 및 광학적 표현형 분석과 같은 여러 중요 문제에 대한 그의 적용에 추가적인 과제들을 발생시킨다.
이러한 전술한 필요들에 대한 상보적인 해법을 제공하기 위해, 소형 온칩 이미징 아키텍처 내에 높은 해상도와 큰 FOV를 결합하는 대안적인 무렌즈 현미경 검사 플랫폼들이 개발되었다. 이러한 양식에서는, 센서의 전체 활성 영역이 이미징 FOV로서 사용되도록 단위 프린지 확대(unit fringe magnification)를 이용하는 부분 간섭성 조명을 이용하여 센서 어레이 상에 미세 물체들의 디지털 인라인 홀로그램들이 기록된다. 센서의 픽셀 크기에 의해 부과되는 해상도 한계를 극복하기 위하여, 샘플의 다수의 서브픽셀 시프트 홀로그램을 획득한 후에 픽셀 초고해상도 기술들을 적용하여 큰 FOV의 양보 없이㎛ 미만의 측방 해상도를 달성한다. 결과적으로, ~0.5의 애퍼처수(NA)를 갖는 현미경 대물 렌즈에 필적하는 측방 이미징 성능이 유사한 해상도를 갖는 대물 렌즈의 FOV보다 두 자릿수 이상 큰 24mm2의 FOV에 걸쳐 달성되었다. 예를 들어, Bishara W. et al., Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Optics Express 18:11181-11191 (2010)을 참고한다.
부분 간섭성 무렌즈 인라인 홀로그래피에서의 픽셀 초고해상도 기술들이 큰 FOV에 걸쳐㎛ 미만의 측방 해상도를 갖는 이미징을 가능하게 하지만, 불행하게도 축방향 해상도는 디지털 인라인 홀로그래피의 고유하게 긴 초점 심도로 인해 훨씬 더 낮다(예를 들어, >40-50㎛). 따라서, 홀로그래픽 재구성이 수치적으로는 상이한 깊이들에 집중될 수 있다는 사실에도 불구하고, 무렌즈 광시야 홀로그래픽 현미경들의 검출 애퍼처수들에 관계없이 이들을 이용하여 ~50㎛보다 가까운 평면들을 섹션화하는 것은 가능하지 않았다. 이러한 본질적인 한계를 해결할 필요가 있다.
같은 취지로, 최근에는, 섹션 이미징을 가능하게 하는 광학 현미경 검사 양식들에 대한 관심이 증가하였다. 일례로서, 인덱스 매칭 겔 내에 잠긴 광학적으로 투명한 견본이 전통적인 렌즈 기반 현미경의 고정 광학 경로에 대해 회전하는 광 투영 단층 촬영법(OPT)이 제안되었으며, 최대 ~1 cm3의 이미징 볼륨 내에서 3개 차원 모두에서 ~10㎛의 등방성 해상도를 제공한다. Sharpe J et al., Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies, Science 296:541-545 (2002)를 참고한다.
또한, 예를 들어 <0.0005 mm3의 상당히 감소된 볼륨에 걸쳐㎛ 미만의 해상도의 세포 이미징을 달성하기 위해 최근에는 높은 NA의 대물 렌즈들의 사용에 의한 OPT의 수정 버전이 구현되었다. Fauver M et al., Three-dimensional imaging of single isolated cell nuclei using optical projection tomography, Optics Express 13:4210-4223 (2005)를 참고한다.
광 회절 단층 촬영법(ODT)은 조명 방향을 변경하거나, 물체를 회전시키거나, 상이한 파장들에서 다수의 이미지를 캡처함으로써 견본의 3D 굴절률 분포를 재구성하기 위해 디지털 홀로그래피를 이용하는 또 하나의 강력한 기술이다. 이러한 단층 촬영 시스템들은 세포들을 일상적으로 이미징하여 잠재적으로 3개 차원 모두에서㎛ 미만의 해상도를 달성할 수 있다. 그러나, 해상도와 이미징 볼륨 간의 균형이 전통적인 현미경 검사와 마찬가지로 이러한 시스템들에도 적용되며, 사용되는 대물 렌즈에 따라 예를 들어 0.04-0.2 mm2의 상당히 감소된 이미징 FOV 및 10-20㎛ 미만의 피사계 심도(DOF)의 대가로 높은 해상도가 달성된다.
동일한 목적을 위해, 또 하나의 이미징 양식, 즉 원통형 렌즈에 의해 생성된 광 시트(light sheet)를 이용하여 형광 샘플 내의 선택 평면들을 연속 조명함으로써 향상된 축방향 해상도를 갖는 3D 이미지를 생성하는 선택 평면 조명 현미경 검사(SPIM)도 도입되었다. Huisken J et al., Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy, Science 305:1007-1009 (2004)를 참고한다. 형광 이미징만으로 제한되는 SPIM은 사용되는 대물 렌즈의 NA 또는 광전자 센서 어레이의 활성 면적에 의해 지시되는 0.04-2 mm2의 범위에 걸치는 FOV에 걸쳐 수 밀리미터까지의 두꺼운 샘플들에서 ~6㎛의 축방향 해상도를 달성한다. 일반적으로, 위에 요약된 바와 같은 이러한 기존의 광학 단층 촬영 플랫폼들은 모두 미세 유체 시스템들을 소형화하고 이들과 통합하기 어려운 비교적 복잡하고 부피가 큰 광학 셋업들에 의존한다. 따라서, 소형 구현에서 높은 해상도 및 큰 이미징 볼륨 양자를 제공하는 대안적인 단층 촬영 현미경 검사 플랫폼이 세포 및 발육 생태학, 신경 과학 및 약품 발견을 포함하는 다양한 분야에서 중요한 이미징 도구 세트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는, ~14 mm2의 큰 FOV는 물론, ~4 mm의 확장된 DOF에 걸쳐 ~2.5-3㎛의 축방향 해상도와 함께 1㎛ 미만의 측방 해상도를 달성하여 ~15 mm3의 온칩 이미징 볼륨을 가능하게 하는 무렌즈 광학 단층 촬영을 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 이러한 무렌즈 광학 단층 촬영 플랫폼은 삼차원(3D)에서의 높은 해상도와 상당히 큰 이미징 볼륨을 통합하여 기존의 광학 계산 단층 촬영 양식들과 비교되지 않는 3D 공간-대역폭 제품을 제공한다.
일 접근법에서는, ~10 nm의 스펙트럼 대역폭을 갖는 부분 간섭성 광원을 회전시켜, (공기 중에서 ±50도에 걸치는) 다수의 각도로부터 샘플 볼륨을 조명하여, 어떠한 렌즈, 레이저 또는 다른 부피가 큰 광학 컴포넌트도 사용하지 않고 각각의 조명 각도에서 물체들의 여러 개의 서브픽셀 시프트 인라인 투영 홀로그램을 기록함으로써 무렌즈 단층 촬영 이미징이 달성된다. 이어서, 서브픽셀 이미지들을 디지털 방식으로 처리하여 각각의 각도 투영의 단일의 고해상도(예를 들어, 픽셀 초고해상도) 홀로그램을 생성한다. 이어서, 고해상도 홀로그램들을 디지털 방식으로 재구성하여, 위상 및 진폭 정보를 획득한 후에 이들을 후방 투영하여 샘플의 단층 사진들을 계산한다.
홀로그램 기록 지오메트리(geometry)의 제한된 공간 및 시간 간섭성은 얼룩 및 다중 반사 간섭 잡음 항들의 감소와 같은, 재구성된 이미지들의 중요한 장점들을 제공한다. 더구나, 지오메트리에서의 단위 프린지 확대는 예를 들어 >40도의 경사 조명 각도들에서도 물체들의 인라인 홀로그램들의 기록을 가능하게 하는데, 이는 프린지 확대를 이용하는 전통적인 간섭성 인라인 홀로그래픽 이미징 스킴들에서는 통상적으로 가능하지 않을 것이다.
경사 조명의 제한된 각도 범위로 인한 아티팩트들을 최소화하기 위해, 실질적으로 직교하는 2개의 축을 따라 광원을 회전시키는 이중 축 단층 촬영 스킴이 채택될 수 있다. 단층 촬영 이미징 성능은 상이한 치수들의 마이크로비드(microbead)들을 이용하는 것은 물론, 야생형 꼬마 선충(wild type C. Elegans)을 이미징함으로써 양자화된다. 양호한 3D 공간 해상도로 큰 볼륨을 탐사함으로써, 이러한 무렌즈 광학 단층촬영 플랫폼은 예를 들어 세포 및 발육 생태학에서의 높은 처리량의 이미징 응용들을 위한 강력한 도구를 제공한다.
일 실시예에서, 샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미징을 위한 시스템은 이미지 센서; 상기 샘플을 유지하도록 구성된 샘플 홀더 - 상기 샘플 홀더는 상기 이미지 센서에 인접 배치됨 -; 및 부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 포함하는 조명 소스를 포함하고, 상기 조명 소스는 애퍼처, 광섬유 케이블, 또는 상기 조명 소스와 상기 샘플 홀더 사이에 삽입된 광 도파관 중 적어도 하나를 통해 상기 샘플을 조명하도록 구성되고, 상기 조명 소스는 복수의 상이한 각도를 통해 상기 샘플을 조명하도록 구성된다.
다른 실시예에서, 샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미지를 획득하는 방법은 상기 샘플을 유지하도록 구성된 샘플 홀더를 부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 방출하는 조명 소스를 이용하여 제1 각도에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 애퍼처 또는 광섬유 케이블 중 적어도 하나를 통과함 -; 상기 샘플 홀더를 광을 방출하는 상기 조명 소스를 이용하여 상이한 각도들에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 상기 애퍼처 또는 광섬유 케이블을 통과함 -; 각각의 각도에서, 상기 샘플 홀더의 반대쪽에 배치된 이미지 센서로부터 복수의 서브픽셀 이미지 프레임을 획득하는 단계; 각각의 각도에서의 상기 서브픽셀 이미지 프레임들을 각각의 각도에 대한 단일의 더 높은 해상도의 홀로그램으로 디지털 방식으로 변환하는 단계; 상기 더 높은 해상도의 홀로그램들로부터 각각의 각도에 대한 투영 이미지들을 디지털 방식으로 재구성하는 단계; 및 상기 샘플 내의 상기 물체의 삼차원 단층 촬영 이미지들을 디지털 방식으로 후방 투영하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미징을 수행하는 방법은 이미지 센서에 인접 배치된 흐름 셀을 통해 샘플을 흐르게 하는 단계; 상기 샘플을 부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 방출하는 조명 소스를 이용하여 제1 각도에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 애퍼처, 광섬유 케이블 또는 광 도파관 중 적어도 하나를 통과함 -; 상기 이미지 센서를 이용하여 상기 제1 각도에서 상기 이동하는 샘플 내의 상기 물체의 복수의 이미지 프레임을 획득하는 단계; 상기 샘플을 상기 조명 소스를 이용하여 하나 이상의 상이한 각도에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 상기 애퍼처, 광섬유 케이블 또는 광 도파관 중 적어도 하나를 통과함 -; 상기 이미지 센서를 이용하여 상기 하나의 이상의 각도에서 상기 이동하는 샘플 내의 상기 물체의 복수의 이미지 프레임을 획득하는 단계; 상기 제1 및 하나 이상의 상이한 각도들에서 획득된 상기 복수의 이미지 프레임으로부터 상기 물체의 초고해상도 투영 홀로그램을 디지털 방식으로 재구성하는 단계; 상기 제1 각도 및 상기 하나 이상의 상이한 각도에서 획득된 상기 초고해상도 투영 홀로그램들에 기초하여 상기 샘플 내의 상기 물체의 복합 투영 이미지들을 디지털 방식으로 재구성하는 단계; 및 상기 복합 투영 이미지들의 필터링된 후방 투영을 통해 상기 샘플 내의 상기 물체의 삼차원 단층 사진들을 디지털 방식으로 재구성하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 휴대용 단층 촬영 이미저는 샘플을 내부에 유지하도록 구성된 샘플 홀더를 포함하는 하우징; 상기 샘플의 제1 측면에 대해 다양한 각도로 상기 하우징 내에 배치된 복수의 부분 간섭성 또는 간섭성 광원 - 상기 복수의 광원 각각은 각각의 도파관들에 결합됨 -; 상기 복수의 광원에 기능적으로(operatively) 접속된 마이크로컨트롤러 - 상기 마이크로컨트롤러는 개별 광원들을 선택적으로 활성화하도록 구성됨 -; 상기 도파관들을 실질적으로 직교하는 방향들로 이동시키도록 구성된 전자기 액추에이터; 및 상기 샘플의 제2 대향 측면에서 상기 하우징 내에 배치된 이미지 센서를 포함한다.
다른 실시예에서, 휴대용 단층 촬영 이미저는 샘플을 내부에 유지하도록 구성된 샘플 홀더를 포함하는 하우징; 상기 샘플의 제1 측면에 대해 다양한 각도로 상기 하우징 내에 배치된 복수의 부분 간섭성 또는 간섭성 광원 - 상기 복수의 광원 각각은 각각의 공간 애퍼처들에 결합됨 -; 상기 복수의 광원에 기능적으로 접속된 마이크로컨트롤러 - 상기 마이크로컨트롤러는 개별 광원들을 선택적으로 활성화하도록 구성됨 -; 상기 공간 애퍼처들을 실질적으로 직교하는 방향들로 이동시키도록 구성된 전자기 액추에이터; 및 상기 샘플의 제2 대향 측면에서 상기 하우징 내에 배치된 이미지 센서를 포함한다.
도 1a는 샘플 내의 하나 이상의 물체의 단층 촬영 이미징을 위한 일 실시예에 따른 시스템을 나타낸다.
도 1b는 내부에 배치된 물체를 갖는 샘플을 포함하는 샘플 홀더를 나타낸다.
도 1c는 조명 소스와 물체(들)를 포함하는 샘플 사이에 옵션으로서 삽입될 수 있는 애퍼처를 내부에 포함하는 공간 필터의 배향을 나타낸다.
도 2는 시스템이 샘플 내의 물체들의 삼차원 단층 촬영 이미지들을 획득하는 방법의 최고 레벨 흐름도를 나타낸다.
도 3은 샘플 내의 하나 이상의 물체의 단층 촬영 이미징을 위한 다른 실시예에 따른 시스템을 나타낸다. 이 실시예에서, 샘플은 흐름 셀을 통해 흐르고 있다.
도 4는 샘플 내의 하나 이상의 물체의 단층 촬영 이미징을 위한 다른 실시예에 따른 시스템을 나타낸다. 이 실시예에서, 시스템은 핸드헬드 또는 휴대용 이미저를 포함한다.
도 5의 (a)는 3개의 각도, 즉 +50도, 0도 및 -50도 각각에 대한 홀로그래픽 기록 조건을 개략적으로 나타낸다. 광원, 투영 이미지 평면 및 홀로그램 평면이 각각의 조건에 대해 도시된다.
도 5의 (b)는 3개의 각도, 즉 +50도, 0도 및 -50도 각각에 대응하는 각도에서 측정된 5㎛ 비드의 대응하는 초고해상도의(더 높은 해상도의) 홀로그램들로부터 절단된 이미지들(b1, b2, b3)을 나타낸다.
도 5의 (c)는 도 5의 (b)의 대응하는 홀로그램들(이미지 b1, b2, b3 각각)을 이용하여 디지털 방식으로 재구성된 무렌즈 투영 이미지들(c1, c2, c3)을 나타낸다. 재구성은 3개의 각도, 즉 +50도, 0도 및 -50도 각각에서 수행되었다.
도 6의 (a)는 광학 접착제(굴절률 ~1.52, Norland NOA65)로 채워진 ~50㎛ 두께의 챔버 내에 무작위로 분포된 5㎛ 멜라민 비드들(굴절률 ~1.8, Corpuscular Inc.)에 대한 이중 축 단층 촬영 재구성 결과들을 나타낸다. 챔버 볼륨 내의 다양한 평면들이 도시된다(a1: 14㎛, a2: 0㎛, a3: 6㎛, a4: 14㎛, a5: 25㎛).
도 6의 (b)는 도 6의 (a)의 대응하는 단층 사진들 내의 동일 평면들에 대한 현미경 이미지들(x40, 0.65NA)을 나타낸다.
도 6의 (c)는 도 6의 (a)(이미지 a3-a5)의 점선 원들에 의해 강조된 관심 있는 줌잉된 영역들(이미지 a6-a8)을 나타내며, 여기서는 2개의 무작위 비드가 z 방향에서 ~20㎛의 중심 대 중심 간격을 갖고 축방향으로 오버랩된다. 이러한 이미지들은 대응하는 현미경 이미지들(이미지 b6 내지 b8) 옆에 표시된다.
도 7의 (a)는 (비드의 중심을 통해 절단한) x-y 평면 내의 z = -3㎛에서의 비드의 재구성된 단면을 나타낸다.
도 7의 (b)는 (비드의 중심을 통해 절단한) y-z 평면 내의 z = -3㎛에서의 비드의 재구성된 단면을 나타낸다.
도 7의 (c)는 (비드의 중심을 통해 절단한) x-z 평면 내의 z = -3㎛에서의 비드의 재구성된 단면을 나타낸다.
도 8의 (a)는 상이한 깊이들에 위치한 3개의 개별 비드에 대한 x-y 단면을 따른 단면 라인 프로파일들을 나타낸다.
도 8의 (b)는 상이한 깊이들에 위치한 3개의 개별 비드에 대한 y-z 단면을 따른 단면 라인 프로파일들을 나타낸다.
도 8의 (c)는 상이한 깊이들에 위치한 3개의 개별 비드에 대한 x-z 단면을 따른 단면 라인 프로파일들을 나타낸다.
도 9의 (a)는 0도의 각도에서 홀로그램 방식으로 기록된 투영 이미지(10㎛ 비드들의 픽셀 초고해상도 홀로그램)를 나타낸다. 비드들은 두꺼운 다층 샘플 내의 상이한 층들에 분포된다. 도 9의 (a)의 상이한 크기들을 갖는 화살표들은 다층 챔버 내의 상이한 층들에 위치한 비드들을 가리킨다.
도 9의 (b)-(e)는 챔버 내의 상이한 깊이들에 대한 단층 사진들을 나타낸다(도 9의 (b): z=3.97 mm, 도 9의 (c): z=1.740 mm, 도 9의 (d): z=730㎛, 도 9의 (e): z=742㎛). 단층 사진들은 이중 축 이미징을 이용하여 얻어졌다.
도 10의 (a)는 ~3.3 mm의 전체 두께를 갖는 4층 챔버 내에 분포된 10㎛ 비드들의 측정된 홀로그램을 나타낸다.
도 10의 (b)는 원하지 않은 깊이들에서 측정된 홀로그램을 재구성하고 전체 홀로그램 필드로부터 그들의 기여를 제거함으로써 디지털 방식으로 추출된 주어진 층(z ~0.7mm에서 층 1) 내의 비드들만의 홀로그램을 나타낸다.
도 10의 (c)는 측정된 다층 홀로그램(도 10의 (a))으로부터 디지털 방식으로 획득된 단일 층 홀로그램(도 10의 (b))을 감산함으로써 획득된 차이 홀로그램을 나타낸다. 도 10의 (c)는 어떠한 가짜 상세도 보이지 않는데, 이는 디지털 추출 프로세스가 측정된 데이터에 아티팩트를 유발하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 11의 (a)는 z=3㎛ 평면에 대응하는 꼬마 선충의 단층 사진을 나타낸다.
도 11의 (b)는 z=2㎛ 평면(b1); z=8㎛ 평면(b2); z=13㎛ 평면(b3)에 대응하는 꼬마 선충의 단층 사진들을 나타낸다.
도 11의 (c)는 현미경 이미지(비교를 위해 X40, 0.65NA)를 나타낸다.
도 11의 (d)는 z= -6㎛ 평면(c1); z=0㎛ 평면(c2); z= +6㎛ 평면(c3)에 대응하는 꼬마 선충의 단층 사진들을 나타낸다.
도 11의 (e)는 비교를 위한 벌레의 중앙 부분의 현미경 이미지(비교를 위해 X40, 0.65NA)를 나타낸다.
도 11의 (f)는 3개의 상이한 조명 각도(θ = 0도, 34도 및 -34도)에서의 꼬마 선충 샘플의 무렌즈 원시(raw) 홀로그램들을 나타낸다.
도 11의 (g)는 도 11의 (f)의 3개의 각도에서의 3개의 재구성된 (초고해상도 홀로그램들)을 나타낸다.
도 12의 (a)는 벌레의 수직 단면에 대응하는 40X 대물 렌즈 현미경 이미지를 나타낸다.
도 12의 (b)는 -34도의 각도에서 취해진 벌레의 진폭 및 위상 재구성 이미지들을 나타낸다.
도 12의 (c)는 0도의 각도에서 취해진 벌레의 진폭 및 위상 재구성 이미지들을 나타낸다.
도 12의 (d)는 +34도의 각도에서 취해진 벌레의 진폭 및 위상 재구성 이미지들을 나타낸다.
도 13의 (a)는 -6㎛의 깊이 슬라이스에서의 꼬마 선충의 단층촬영 광유체 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 50㎛의 길이를 갖는다.
도 13의 (b)는 -3㎛의 깊이 슬라이스에서의 꼬마 선충의 단층촬영 광유체 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 50㎛의 길이를 갖는다.
도 13의 (c)는 -㎛의 깊이 슬라이스에서의 꼬마 선충의 단층촬영 광유체 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 50㎛의 길이를 갖는다.
도 13의 (d)는 +3㎛의 깊이 슬라이스에서의 꼬마 선충의 단층촬영 광유체 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 50㎛의 길이를 갖는다.
도 13의 (e)는 +6㎛의 깊이 슬라이스에서의 꼬마 선충의 단층촬영 광유체 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 50㎛의 길이를 갖는다.
도 13의 (f)는 비교를 위한 꼬마 선충의 10x 현미경 이미지를 나타낸다.
도 14의 (a)는 3개의 각도, 즉 -44도, 0도 및 +44도 각각에 대한 홀로그래픽 기록 조건을 개략적으로 나타낸다. 광원, 투영 이미지 평면 및 홀로그램 평면이 각각의 조건에 대해 도시된다.
도 14의 (b)는 3개의 각도, 즉 -44도, 0도 및 +44도 각각에 대응하는 각도에서 측정된 마이크로비드들의 대응하는 초고도해상도의(더 높은 해상도의) 홀로그램들로부터 절단된 이미지들(b1, b2, b3)을 나타낸다.
도 14의 (c)는 도 14의 (b)의 대응하는 홀로그램들(이미지 b1, b2, b3 각각)을 이용하여 디지털 방식으로 재구성된 무렌즈 투영 이미지들(c1, c2, c3)을 나타낸다. 재구성은 3개의 각도, 즉 -44도, 0도 및 +44도 각각에서 수행되었다.
도 15의 (a)는 2㎛ 직경의 미세 입자에 대한 저해상도(LR) 수직 투영 홀로그램이다.
도 15의 (b)는 동일 입자에 대한 디지털 합성 픽셀 초고해상도(SR) 홀로그램이며, 여기서는 도 15의 (a)에서 통상적으로 언더샘플링(undersampling)되는 훨씬 더 높은 주파수들을 갖는 홀로그래픽 프린지들이 관찰될 수 있다.
도 15의 (c)는 도 15의 (a)에도 도시된 LR 홀로그램을 이용하는 x-y 평면 내의 동일 미세 입자의 재구성된 이미지를 나타낸다.
도 15의 (d)는 도 15의 (b)에 도시된 SR 홀로그램을 이용하는 x-y 평면 내의 미세 입자의 재구성된 이미지를 나타낸다.
도 15의 (e)는 도 15의 (a)의 LR 홀로그램을 재구성함으로써 획득된 미세 입자에 대한 y-z 및 x-z 단면들을 나타낸다.
도 15의 (f)는 도 15의 (b)의 SR 홀로그램을 재구성함으로써 획득된 미세 입자에 대한 y-z 및 x-z 단면들을 나타낸다.
도 16의 (a)-(c)는 y-z, x-z 및 x-y 평면들 각각 내의 미세 입자의 중심을 통한 섹션 이미지들(단층 사진들)을 나타낸다.
도 17의 (a)는 -7㎛의 깊이에서 5㎛의 직경을 갖는 무작위 분포된 마이크로비드들로 채워진 챔버의 무렌즈 계산 단층 사진을 나타낸다. 각각의 이미지들 내의 화살표들은 주어진 깊이에서 초점이 맞은 비드들을 나타낸다.
도 17의 (b)는 0㎛의 깊이에서 5㎛의 직경을 갖는 무작위 분포된 마이크로비드들로 채워진 챔버의 무렌즈 계산 단층 사진을 나타낸다. 각각의 이미지들 내의 화살표들은 주어진 깊이에서 초점이 맞은 비드들을 나타낸다.
도 17의 (c)는 +7㎛의 깊이에서 5㎛의 직경을 갖는 무작위 분포된 마이크로비드들로 채워진 챔버의 무렌즈 계산 단층 사진을 나타낸다. 각각의 이미지들 내의 화살표들은 주어진 깊이에서 초점이 맞은 비드들을 나타낸다.
도 17의 (d)는 16㎛의 깊이에서 5㎛의 직경을 갖는 무작위 분포된 마이크로비드들로 채워진 챔버의 무렌즈 계산 단층 사진을 나타낸다. 각각의 이미지들 내의 화살표들은 주어진 깊이에서 초점이 맞은 비드들을 나타낸다. 점선 직사각형으로 둘러싸인 도 17의 (d)의 삽화는 무렌즈 단층 촬영 및 전통적인 현미경 검사(40X, 0.65NA) 각각에 의한 도 17의 (f) 및 도 17의 (e)의 점선 원들에 의해 표시된 2개의 축방향으로 오버랩된 마이크로비드의 섹션화를 나타낸다.
도 17의 (e)는 32㎛의 깊이에서 5㎛의 직경을 갖는 무작위 분포된 마이크로비드들로 채워진 챔버의 무렌즈 계산 단층 사진을 나타낸다. 각각의 이미지들 내의 화살표들은 주어진 깊이에서 초점이 맞은 비드들을 나타낸다.
도 17의 (f)-(j)는 도 17의 (a)-(e)의 깊이들에 대응하는 깊이들에 대한 현미경 이미지들(40X, 0.65NA)을 나타낸다.
도 18의 (a)는 임의의 비드의 중심을 통하는 줌잉된 단층촬영 이미지를 x 및 y를 따르는 그의 라인 프로파일들과 함께 나타낸다.
도 18의 (b)는 ~6㎛의 축방향 해상도를 암시하는, 도 18의 (a)에서와 동일한 비드에 대한 축방향 라인 프로파일 및 그의 도함수를 나타낸다.
도 19의 (a)는 핸드헬드 이미저를 이용하여 ~3.5 mm의 총 두께를 갖는 4개 층에 걸쳐진 10㎛ 비드들의 (센서 위에 0.7 mm의 고도로 설치된) 다층 챔버에 대해 기록된 홀로그램(0도의 각도)을 나타낸다. 상이한 깊이들에서의 비드들의 홀로그램들이 (센서-칩으로부터의 거리의 함수인 다양한 크기로) 보인다.
도 19의 (b)는 719㎛의 깊이에서의 계산된 단층 촬영 이미지를 나타낸다.
도 19의 (c)는 750㎛의 깊이에서의 계산된 단층 촬영 이미지를 나타낸다.
도 19의 (d)는 1840㎛의 깊이에서의 계산된 단층 촬영 이미지를 나타낸다.
도 19의 (e)는 1851㎛의 깊이에서의 계산된 단층 촬영 이미지를 나타낸다.
도 19의 (f)는 4225㎛의 깊이에서의 계산된 단층 촬영 이미지를 나타낸다.
도 19의 (g)는 도 19의 (a)의 디지털 방식으로 선명화된 홀로그램을 나타내며, 이에 따라 선택된 층(z ~.75mm) 내의 물체들만이 도시된다.
도 19의 (h)는 도 19의 (a)의 디지털 방식으로 선명화된 홀로그램을 나타내며, 이에 따라 선택된 층(z ~1.8mm) 내의 물체들만이 도시된다.
도 19의 (i)는 도 19의 (a)의 디지털 방식으로 선명화된 홀로그램을 나타내며, 이에 따라 선택된 층(z ~4.2mm) 내의 물체들만이 도시된다.
도 20의 (a)는 핸드헬드 장치를 이용하여 획득된 꼬마 촌충 알(H. Nana egg)의 상이한 깊이들에 대한 계산된 단층 촬영 이미지들을 나타낸다. 깊이들은 -8㎛ (a1); 0㎛ (a2); 및 +6㎛ (a3)을 포함한다.
도 20의 (b)는 도 20의 (a)에서 도시된 것과 동일한 깊이들에서의 꼬마 촌충 알의 40X 현미경 이미지들을 나타낸다.
도 1a는 (도 1b에 최상으로 도시된) 샘플(14) 내의 물체(12)의 단층 촬영 이미징을 위한 시스템(10)을 나타낸다. 물체(12)는 세포 또는 생물학적 성분 또는 요소(예로서, 세포 소기관 또는 하부 구조)를 포함할 수 있다. 물체(12)는 다세포 유기체 등도 포함할 수 있다. 대안으로서, 물체(12)는 입자 또는 다른 물체일 수 있다. 도 1a는 이미지 센서(16) 위의 소정 거리에 배치된 이미징될 물체(12)를 나타낸다. 일부 실시예들에서는, 하나 이상의 물체(12)를 포함하는 샘플(14)이 이미지 센서(16)의 광학적으로 투명한 커버 또는 표면(예로서, 유리 커버) 상에 직접 배치된다. 대안으로서, 하나 이상의 물체(12)를 포함하는 샘플(14)은 도 1b에 도시된 바와 같은 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 커버슬립 등과 같은 광학적으로 투명한 샘플 홀더(18) 상에 배치된다.
여하튼, 이미지 센서(16)의 표면은 샘플(14)과 접촉하거나 근접할 수 있다. 일반적으로, 샘플(14) 내의 물체(12)는 이미지 센서(16)의 활성 표면의 수 밀리미터 내에 있다. 이미지 센서(16)는 예를 들어 전하 결합 장치(CCD) 또는 상보형 금속-산화물 반도체(CMOS) 장치를 포함할 수 있다. 이미지 센서(16)는 단색 또는 컬러일 수 있다. 이미지 센서(16)는 일반적으로 9.0㎛ 미만, 더 구체적으로는 5.0㎛ 미만(예를 들어, 2.2㎛ 이하)의 작은 픽셀 크기를 갖는다. 일반적으로, 더 작은 픽셀 크기를 갖는 이미지 센서들(16)은 더 높은 해상도들을 생성할 것이다. 본 명세서에서 설명되는 이미징 방법의 한 가지 이익은 픽셀 크기보다 양호한 공간 해상도를 얻을 수 있다는 것이다.
도 1a를 계속 참조하면, 시스템(10)은 샘플 홀더(18)의 제1 측면(도 1a에 도시된 바와 같은 상측)을 조명하도록 구성되는 조명 소스(20)를 포함한다. 조명 소스(20)는 바람직하게는 공간 간섭성 또는 부분 간섭성 광원이다. 발광 다이오드(LED)가 조명 소스(20)의 일례이다. LED들은 비교적 싸고 내구력이 있으며, 일반적으로 저전력 요구를 갖는다. 물론, 필터를 갖는 크세논 램프와 같은 다른 광원들도 사용될 수 있다. 전구도 조명 소스(20)로서의 하나의 옵션이다. 레이저와 같은 간섭성 광빔도 사용될 수 있다(예로서, 레이저 다이오드). 조명 소스(20)는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 nm의 스펙트럼 대역폭을 갖지만, 스펙트럼 대역폭은 훨씬 더 작거나 클 수 있다. 게다가, 조명 소스(20)는 약 0.1 내지 10,000㎛의 공간 간섭성 직경을 갖는 적어도 부분적으로 간섭성인 광을 포함할 수 있다.
도 1c를 참조하면, 조명 소스(20)와 물체(들)(12)를 포함하는 샘플(14) 사이에 공간 필터(22)가 옵션으로서 삽입될 수 있다. 공간 필터(22)는 조명의 통과를 허용하도록 구성되는 애퍼처(24)(예로서, 공간 애퍼처 또는 핀홀)를 내부에 포함하는 불투명 표면을 포함한다. 애퍼처(24)는 통상적으로 50㎛ 내지 약 100㎛의 범위에 걸치는 직경(D)을 갖는다. 대안으로서, 공간 필터(22)는 도 1a에 도시된 바와 같이 조명 소스(20)의 말단에 통합될 수 있다. 예를 들어, 조명 소스(20)는 도 1a에 도시된 바와 같은 광섬유 또는 다른 광 도파관에 결합될 수 있다. 광섬유와 관련하여, 광섬유는 광이 그 안에서 안내되도록 외면보다 높은 굴절률을 갖는 내부 코어를 포함한다. 이 실시예에서는, 애퍼처(24)를 갖는 별도의 불투명 표면이 필요하지 않다. 대신, 광섬유 자체가 공간 필터(22)로서 동작한다. 이 실시예에서, 광섬유의 코어는 본 명세서에서 설명되는 애퍼처(24)와 동일한 범위 내의 직경을 가질 수 있다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 광섬유 케이블 조명 소스(20)의 말단(공간 필터(22))은 샘플 홀더(18)(또는 샘플(14))로부터 거리 z1에 위치한다. 이미지 센서(16)의 이미징 평면은 샘플 홀더(18)(또는 샘플(14))로부터 거리 z2에 위치한다. 본 명세서에서 설명되는 시스템(10)에서 z2<<z1이다. 예를 들어, 거리 z1은 약 1 cm 내지 약 10 cm 정도일 수 있다. 다른 실시예들에서, 범위는 더 작을 수 있는데, 예를 들어 약 5 cm 내지 약 10 cm일 수 있다. 거리 z2는 약 0.05 mm 내지 2 cm 정도일 수 있지만, 다른 실시예들에서 이 거리 z2는 약 1 mm 내지 2 mm일 수 있다. 시스템(10)에서, 전파 거리 z1은 공간 응집이 물체(12)의 평면에서 발생하는 것을 가능하게 하고, 물체(12)에 의해 산란되는 광이 이미지 센서(16) 상의 무렌즈 인라인 홀로그램을 형성하도록 배경 광과 간섭을 일으키게 한다.
도 1a를 계속 참조하면, 시스템(10)은 시스템(10)에 기능적으로 접속되는 랩탑, 데스크탑 등과 같은 컴퓨터(30)를 포함하며, 따라서 데이터 획득 및 이미지 처리를 위해 더 낮은 해상도의 이미지들(예로서, 더 낮은 해상도 또는 원시 이미지 프레임들)이 이미지 센서(16)로부터 컴퓨터(30)로 전송된다. 컴퓨터(30)는 본 명세서에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 하나의 각도에서 취해진 다수의 서브픽셀(저해상도) 이미지를 취하고 물체들(12)의 단일의 고해상도 투영 홀로그램 이미지를 생성하는 소프트웨어를 동작시키거나 실행하는 하나 이상의 프로세서(32)를 포함한다. 소프트웨어는 또한 진폭 및 위상 정보 양자를 포함하는 물체들(12)의 복합 투영 이미지들을 디지털 방식으로 재구성한다. 이어서, 소프트웨어는 동일 이미지의 홀로그래픽 진폭 및 복원된 위상 양자를 갖고서 복합 투영 이미지들의 필터링된 후방 전파를 통해 물체(들)(12)의 삼차원 단층 사진들을 디지털 방식으로 재구성한다. 재구성된 단층 촬영 이미지들은 예를 들어 디스플레이(34) 등에서 사용자에게 표시될 수 있다. 사용자는 예를 들어 키보드 또는 마우스와 같은 입력 장치(36)를 통해 컴퓨터(30)와 인터페이스하여, 상이한 단층 촬영 이미징 평면들을 선택할 수 있다.
도 1a는 서로 실질적으로 직교하는 제1 및 제2 호들(40, 42)을 나타낸다. 제1 및 제2 호들(40, 42)은 조명 소스(20)가 샘플(14) 내에 포함된 물체들(12)을 조명하는 다양한 각도들을 나타낸다. (가상선으로 표시된) 다양한 이미징 위치들이 제1 및 제2 호들(40, 42)을 따라 도시된다. 일반적으로, 조명 소스(20)는 0도 위치를 나타내는 (도 1a에 도시된 바와 같은) 이미지 센서(16) 위의 상사점을 갖는 -89도 내지 +89도의 범위에 걸치는 각도들에서 이동한다. 일 실시예에서, 조명 소스(20)는 호들(40, 42) 중 하나를 따라 고정 이미지 센서(16)에 대해 이동한다. 대안으로서, 조명 소스(20)가 정지 상태를 유지하는 동안, 이미지 센서(16)가 동일한 각진 조명을 생성하도록 이동할 수 있다. 또 다른 대안에서, 조명 소스(20) 및 이미지 센서(16) 양자는 서로에 대해 이동할 수 있다. 일반적으로, 조명 소스(20)는 샘플(14) 내에 포함된 물체들(12)을 교란시키는 경향이 있으므로 내부에 샘플(14)을 갖는 이미지 센서(16)와 반대로 이동하는 것이 바람직하다. 조명 소스(20) 및/또는 이미지 센서(16)는 조명 소스(20)를 이미지 센서(16)에 대해 다양한 각도로 이동시키는 기계 스테이지, 아암, 슬라이드 등을 포함하는 임의 수의 기계 액추에이터에 의해 이동될 수 있다.
도 1a를 계속 참조하면, 조명 소스(20)는 또한 이미징 평면과 실질적으로 평행한 평면에서 호들(40, 42)을 따라 각각의 각도에서 이동하는 능력을 갖는다. 도 1a의 삽화는 조명 소스(20)의 뱀과 같은 패턴의 이차원(예로서, x 및 y 변위) 이동을 나타낸다. 이러한 방식으로, 조명 소스(20)는 (예로서, 70㎛ 미만의) 비교적 작은 변위의 조그(jog)를 행할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 이미지 센서(16)에 평행한 작은 개별 시프트들은 단일 고해상도 이미지(예로서, 픽셀 초고해상도)를 생성하는 데 사용된다. 예를 들어, x-y 평면에서 호들(40, 42) 상의 각각의 각도 위치에서 9개의 상이한 저해상도(LR) 이미지를 획득하기 위해 3x3 격자가 사용될 수 있다. 도 1c를 참조하면, 조명 소스(20)의 이동에 대한 대안으로서, 애퍼처(24)가 고정 조명 소스(20)에 대해 이동할 수 있다. 예를 들어 스텝퍼 모터, 이동 가능 스테이지, 압전 소자 또는 솔레노이드를 포함하는 임의 수의 기계 액추에이터가 사용될 수 있다.
도 1a는 서로 실질적으로 직교하도록 배치된 호들(40, 42)을 나타낸다. 다른 실시예들에서, 조명 소스(20)는 구 또는 타원면과 같은 삼차원 표면 상의 상이한 각도들에 배치될 수 있다. 물체들(12)은 일반적으로 형상(예로서, 질량 중심)에 의해 정의되는 삼차원 표면의 중심에 가까이 배치된다. 이 실시예에서, 조명 소스(20)는 2개의 수직 호들이 아니라 삼차원 표면의 부분들을 따라갈 수 있다.
도 2는 시스템(10)이 샘플(14) 내의 물체들(12)의 삼차원 단층 촬영 이미지들을 획득하는 방법의 최고 레벨 흐름도를 나타낸다. 샘플들(14)이 샘플 홀더(18) 안에 로딩된 후, 조명 소스(20)는 동작 1000에서 지시되는 바와 같이 제1의 각진 위치로 이동한다. 조명 소스(10)는 샘플(14)을 조명하며, 동작 1100에서 지시되는 바와 같이, 다수의 서브픽셀(LR) 홀로그램 이미지가 획득된다. 이 단계에서, 일 실시예에 따르면, 다수의 서브픽셀 이미지는 조명 소스(10)를 이미지 센서(16)와 대체로 평행한 평면(예로서, x 및 y 평면)에서 이동시킴으로써 획득된다. 이러한 이동은 조명 소스(10)가 제1의 각진 위치에 있는 동안에 발생한다. 예를 들어, 3x3 어레이로 취해지는 9개의 이미지가 제1의 각진 위치에서 취해질 수 있다. 이어서, 동작 1200에서 지시되는 바와 같이, 조명 소스(10)는 다른 각진 위치로 이동한다. 이 상이한 각진 위치에서, 조명 소스(10)는 샘플(14)을 조명하며, 동작 1300에서 지시되는 바와 같이, 다수의 서브픽셀 홀로그램 이미지들이 획득된다. 이 단계에서, 다수의 서브픽셀 이미지는 조명 소스(10)를 이미지 센서(16)와 대체로 평행한 평면(예로서, x 및 y 평면)에서 이동시킴으로써 다시 획득된다. 이어서, 조명 소스(20)는 다른 각진 위치로 다시 이동할 수 있으며, 여기서 동작 1250에서 지시되는 바와 같이 다수의 서브픽셀 홀로그램이 획득된다. 이러한 프로세스는 다수의 상이한 각도에서 이미지들이 획득되도록 임의의 횟수만큼 반복될 수 있다. 예를 들어, 다수의 서브픽셀 홀로그램 이미지가 호들(40, 42)을 따라 취해질 수 있다.
동작 1400에서, 참고로 포함되는 Bishara et al., Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution, Optics Express 18:11181-11191 (2010)에 그 상세들이 개시되어 있는 픽셀 초고해상도 기술을 이용하여, 각각의 각도에서의 다수의 서브픽셀 이미지가 단일의 더 높은 해상도의 홀로그램(SR 홀로그램)으로 디지털 방식으로 변환된다. 먼저, 국소-기울기 기반 반복 알고리즘을 이용하여 이러한 홀로그램들 간의 시프트들이 추정된다. 시프트들이 추정되면, 모든 측정된 시프트된 홀로그램들에 적합한 고해상도 격자가 반복 계산된다. 이러한 반복들에서, 최소화하기 위한 비용 함수가 고해상도 홀로그램 및 대응하는 서브픽셀 시프트된 원시 홀로그램들의 다운샘플링된 버전들 간의 제곱 평균 에러로서 선택된다.
이어서, 동작 1500에서, 각각의 각도에서 복합 투영 이미지들이 디지털 방식으로 재구성된다. 디지털 방식으로 합성된 초고해상도의 홀로그래픽 투영들을 재구성하여, 다양한 조명 각도들에서의 물체들의 무렌즈 투영 이미지들을 획득한다. 경사 조명 각도들을 이용하여 기록된 홀로그램들은 센서 어레이를 향하는 산란된 물체 파동 및 교란되지 않은 기준 파동의 동축 전파로 인해 여전히 인라인 홀로그램들이라는 것이 강조되어야 한다. 결과적으로, 디지털 방식으로 재구성된 이미지들은 쌍둥이 이미지 아티팩트에 의해 오염되며, 이는 검출기 평면 내의 복합 필드의 위상이 기록 프로세스 동안 손실된다는 사실의 표명이다. 정확한 투영 이미지들을 획득하기 위해, 센서에 의해 검출된 복합 필드의 위상의 복원을 가능하게 하는 크기 제한 반복 위상 복원 알고리즘이 이용된다. 위상 복원 알고리즘에 관한 상세들은 Mudanyali et al., Compact, Light-weight and Cost-effective Microscope based on Lensless Incoherent Holography for Telemedicine Applications, Lab Chip 10:1417-1428 (2010)에서 발견될 수 있으며, 이는 본 명세서에서 충분히 설명되는 것처럼 참고로 포함된다.
전통적인 수직 조명 사례와 유사하게, 경사 조명 각도들을 이용하여 기록된 홀로그램들은 홀로그램들을 기록하는 데 사용된 기준 파동의 디지털 복제인 기준 파동과 곱해지며, 이는 센서 법선에 대해 경사진 평면 기준 파동의 이용으로 변환된다. 이러한 재구성 파동의 경사각은 샘플 홀더에서의 광의 굴절로 인해 조명 빔의 경사와 동일하지 않다는 점에 유의해야 한다. 사실상, 투영 홀로그램들에 대한 디지털 재구성 각도는 비율 △d/z2의 역탄젠트를 계산함으로써 결정되며, 여기서 △d는 수직 투영 이미지 내의 물체들의 위치들에 대한 물체들의 홀로그램들의 측방 시프트들을 나타내고, z2는 실험적으로 알려지거나, 수직 홀로그램의 디지털 재구성 거리에 의해 반복 결정된다.
반복 위상 복원을 위해, 복합 필드가 평행한 이미지 검출기 및 물체 평면들 사이에서 디지털 방식으로 앞뒤로 전파된다. 조명에 수직인 평면에서 투영 이미지를 획득하기 위해, 복원된 필드는 또한 경사 방향을 따르는 치수가 cos(θ)에 의해 리스케일링되는 격자 상에서 보간되며, 여기서 θ는 디지털 재구성의 각도이다. 게다가, 투영 이미지들은 단층 사진들의 계산 전에 공통 회전 중심에 대해 정렬되는 것이 필요하다. 이를 달성하기 위해, 이미지 정합 알고리즘에 기초하여 자동화된 2 단계 교차 상관이 구현되었다. 연속적인 조명 각도들(예를 들어, 50도 및 48도)을 이용하여 획득된 투영 이미지들은 서로 매우 유사하므로, 이미지 정합의 제1 단계는 인접하는 각도들에서 획득된 투영 이미지들을 교차 상관시킴으로써 수행된다. 대부분의 경우, 특히 물체가 꼬마 선충과 같은 큰 연결 구조일 때, 이 단계는 성공적으로 정합된 투영들의 세트를 생성한다. 그러나, FOV가 비드들과 같은 분산된 작은 물체들을 포함하는 경우, 인접하는 각도들에 대해서도, 투시 변화로 인한 투영 이미지들의 근소한 차이들은 정합 정밀도를 저하시킬 수 있다. 이 경우, 회전 중심으로도 가정되는 투영 이미지들의 중심에 있는 비드는 투영 이미지들의 중심으로부터 벗어나며, 이는 열악한 이미지 정합을 지시한다. 이어서, 정합의 제2 단계가 제1 단계 후에 이용되며, 여기서 수직 투영 이미지의 중심에 있는 비드는 전역 기준으로 사용되고, 모든 다른 투영 이미지들은 그 특정 비드에 대해 자동으로 정렬된다. 기준 비드는 제1 단계에서 이미 대략 정렬되었으므로, 제2 상관 단계는 절단된 투영 이미지들과 절단된 전역, 즉 수직 투영 이미지를 상관시킴으로써 기준 비드에 대해서만 수행된다.
이러한 무렌즈 기록 스킴에서의 큰 z1/z2 비율은 매질의 굴절률에 가까운 검출 NA를 허가한다. 이러한 시스템 특성은 경사 조명 빔들을 이용한 홀로그램들의 기록에 가장 중요하지만, 광전자 센서 어레이의 설계는 이용할 수 있는 최대각을 제한한다. 광전자 센서 어레이들은 일반적으로 렌즈 기반 이미징 시스템들을 위해 설계되며, 이러한 시스템들에서는 입사 광선들의 각도가 통상적으로 20도-30도를 초과하지 않으며, 그 결과로서 ±50도를 넘는 조명 각도들에서 기록된 홀로그램들은 아티팩트들을 나타내기 시작한다. 이러한 이유로 인해, 2개의 상이한 회전축을 따라, -50도 내지 +50도의 제한된 각도 범위 내에서 실험적인 투영 홀로그램들이 획득되었다. 그러나, 각도 범위는 이보다 클 수 있는데, 예를 들어 -89도 내지 +89도의 각도들 또는 일부 예들에서는 -89도 내지 +89도의 각도들에 걸칠 수 있다.
동작 1600에서 지시되는 바와 같이, 필터링된 후방 투영 알고리즘을 무렌즈 투영 이미지들(위상 및 진폭 양자)에 적용하여 삼차원 이미지들을 생성한다. 푸리에 투영 정리는 상이한 방향들을 따른 물체의 2D 투영들로부터 물체의 3D 전달 함수를 재구성하는 것을 가능하게 한다. 후방 투영 방법에 관한 상세들은 본 명세서에 참고로 포함되는 Radermacher M., Weighted back-projection methods, Electron Tomography: Methods for three dimensional visualization of structures in the cell, (Springer, New York, 2nd ed.) pp. 245-273(2006)에서 발견될 수 있다. 물론, 이 분야의 기술자들에게 공지된 다른 단층 촬영 재구성 방법들도 이용될 수 있다.
따라서, 다수의 서브픽셀(LR) 시프트된 홀로그램들을 이용하여 각각의 조명 각도에 대한 하나의 픽셀 초고해상도(SR) 홀로그램이 디지털 방식으로 합성된 후에, 모든 고해상도 홀로그램들의 홀로그래픽 재구성에 의해 무렌즈 투영 이미지들이 생성된다. 이어서, 동작 1600에서, 이러한 재구성된 무렌즈 투영 이미지들(위상 및 진폭 양자)을 이용하여, 필터링된 후방 투영 알고리즘을 이용하여 미세 물체들의 3D 단층 사진들을 계산한다. 일반적으로 투영 가정으로 참조되는 이러한 기술에 대한 기본적인 요건은 투영 이미지들이 단층 사진들을 계산할 수 있는 물체의 소정 특성의 선형 합계를 나타내야 한다는 것이다. X선 계산 단층 촬영법에서는 전자기 스펙트럼의 해당 부분에서의 무시 가능한 회절로 인해 그러한 조건을 충족시키는 것이 훨씬 더 쉽지만, 광학 분야에서의 계산 단층 촬영법은 약하게 산란시키는 물체들을 필요로 한다. 유사하게, 이러한 무렌즈 광학 단층 촬영 양식은 또한 광자들의 대부분이 단층 사진들의 각각의 스택의 볼륨에 걸쳐 기껏해야 한 번의 산란 이벤트를 경험할 것을 요구한다. 약하게 산란시키는 물체들의 경우, 시스템의 긴 초점 심도와 더불어, 복합 산란 퍼텐셜(potential)이 조명 방향을 따라 추가된다. 결과적으로, 각각의 조명 각도에서의 픽셀 초고해상도 무렌즈 홀로그램들의 홀로그래픽 재구성에 의하여 계산된 복합 투영 이미지들인 입력들을 갖는 필터링된 후방 투영 알고리즘을 적용함으로써 물체의 복합 산란 퍼텐셜의 단층 사진들이 계산될 수 있다.
홀로그램들은 ±50도의 제한된 각도 범위에 대해 기록되므로, 물체의 푸리에 공간 내에는 일반적으로 누락 웨지(wedge)로 알려진 누락 영역이 존재한다. 누락 웨지의 주요 영향은 축방향 해상도의 감소이며, 이는 축방향 해상도를 측방보다 큰 값으로 제한한다. 또한, 측방 평면에서, 링잉(ringing) 아티팩트들은 물론, x-y 평면에서의 포인트 확산 함수(PSF)가 타원형이 되게 하는 조명의 회전 방향을 따른 PSF의 협소화도 관찰된다.
이러한 이미징 아티팩트들을 최소화하기 위해, 이중 축 단층 촬영 스킴이 이용된다. 각각의 경사 방향을 따라 획득된 투영 이미지들을 개별적으로 후방 투영하여, 두 세트의 복합 단층 사진들을 계산한다. 이러한 단층 사진들은 본 명세서에서 충분히 설명되는 것처럼 참고로 포함된 Mastronarde D.N., Dual-Axis Tomography: An Approach with Alignment Methods That Preserve Resolution, Journal of Structural Biology 120:343-352 (1997)에서 주어지는 시퀀스에 따라 푸리에 공간 내에 통합된다. 따라서, 두 세트의 단층 사진들이 데이터를 갖는 영역들이 평균되는 반면, 한 세트만이 그의 푸리에 공간에서 유용한 데이터를 갖는 영역들은 대응하는 단층 사진들의 데이터에 의해 채워진다. 결과적으로, 누락 웨지는 누락 피라미드로 최소화되어, 전술한 제한 각도 단층 촬영 아티팩트들을 줄인다. 물체의 지원 밖에서의 아티팩트들을 더 줄이기 위하여, 수직 투영 홀로그램의 모든 단층 사진들로의 디지털 재구성을 위해 사용되는 마스크가 적용된다. 누락 웨지는 또한 물체의 3D 지원 또는 전달 함수의 연역적 정보에 기초하여 반복 제한 알고리즘들을 구현함으로써 해상도를 향상시키고 아티팩트들을 줄이기 위해 반복적으로 채워질 수 있다.
도 3은 샘플(14) 내의 물체(12)의 단층 촬영 이미징을 위한 시스템(50)의 다른 실시예를 나타낸다. 이 실시예에서, 물체는 벌레, 예로서 꼬마 선충으로 도시되며, 샘플(14)은 흐르는 샘플 볼륨이다. 시스템(50)은 캐리어 유체의 흐름 내에서 이동 물체(12)를 운반하도록 구성되는 흐름 셀(52)을 포함한다. 일 양태에서, 이동 물체(12)는 세포 또는 다른 생체 성분을 포함할 수 있다. 이동 물체(12)는 또한 비생체 입자 등을 포함할 수 있다. 캐리어 유체는 통상적으로 이동 물체가 존재하는 액체이다. 캐리어 유체는 또한 일부 상황들에서는 가스일 수 있다. 이동 물체(12)가 세포일 때, 캐리어 유체는 통상적으로 생리적 융화성 완충 용액 등(예를 들어, 인산염 완충 염수)이다. 흐름 셀(42)은 (본 명세서에서 더 상세히 설명되는 적어도 조명 소스에 대해) 실질적으로 광학적으로 투명한 실질적으로 직선인 삼차원 도관이다. 흐름 셀(52)은 미세 유체 장치들과 관련하여 일반적으로 사용되는 유리, 플라스틱 또는 기타 재료들로 형성될 수 있다. 흐름 셀(52)의 도관은 정사각형 또는 직사각형과 같은 규칙적인 형상의 단면 영역을 가질 수 있다. 이동 물체(12)를 포함하는 흐름 셀(52)의 내부 치수들은 변할 수 있다. 예를 들어, 흐름 셀(52)은 밀리미터 스케일의 높이/폭을 가질 수 있다. 대안으로서, 흐름 셀(52)은㎛ 스케일의 높이/폭을 가질 수 있다. 이와 관련하여, 흐름 셀(52)은 마이크로채널 등을 포함할 수 있다.
이동 물체들(12)은 하나 이상의 펌핑 기술을 이용하여 흐름 셀(52)을 통해 이동하거나 흐른다. 예를 들어, 흐름 셀(52) 내에서 물체들(12)을 포함하는 유체를 펌핑하기 위해 압력 기울기가 형성될 수 있다. 대안으로서, 이동 물체들(12)은 사용되는 흐름 셀(52)의 대향 단부들에서의 전극들에 의한 전기-운동 모션을 이용하여 흐름 셀(52)을 통해 이동할 수 있다. 이와 관련하여, 흐름 셀(52)을 통해 물체들(12)을 이동시키기 위해 임의의 특정 펌핑 양식이 이용될 수 있다. 예들은 주사기 펌프, 유전 영동 기반 전극, 자기 유체 역학 전극 등과 같은 펌프들의 사용을 포함한다.
도 3을 계속 참조하면, 시스템(50)은 흐름 셀(52)의 제1 측면(도 3에 도시된 바와 같은 상측)을 조명하도록 구성되는 조명 소스(54)를 포함한다. 조명 소스(54)는 바람직하게는 공간 간섭성 또는 부분 간섭성 광원이다. 발광 다이오드(LED)가 조명 소스(54)의 일례이다. LED들은 비교적 싸고 내구력이 있으며, 일반적으로 저전력 요구를 갖는다. 물론, 필터를 갖는 크세논 램프와 같은 다른 광원들도 사용될 수 있다. 레이저 또는 전구도 조명 소스(54)로서의 옵션들이다. 조명 소스(54)는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 nm의 스펙트럼 대역폭을 갖지만, 스펙트럼 대역폭은 훨씬 더 작거나 클 수 있다. 게다가, 조명 소스(54)는 약 0.1 내지 10,000㎛의 공간 간섭성 직경을 갖는 적어도 부분적으로 간섭성인 광을 포함할 수 있다.
공간 필터(56)가 도 3에 도시된 바와 같이 조명 소스(54)의 말단에 통합될 수 있다. 예를 들어, 조명 소스(54)는 도 3에 도시된 바와 같은 광섬유 또는 다른 광 도파관에 결합될 수 있다. 광섬유와 관련하여, 광섬유는 광이 그 안에서 안내되도록 외면보다 높은 굴절률을 갖는 내부 코어를 포함한다. 대안으로서, 공간 필터(56)는 도 1c에 도시된 것과 같은 애퍼처(24)를 갖는 불투명 표면을 포함할 수 있다. 공간 필터(56)는 광을 더 응집시키는 역할을 한다.
도 3에 도시된 바와 같이, 이미지 센서(58)가 흐름 셀(52)의 제2의 대향 측에 배치되며, 따라서 흐름 셀(52)은 조명 소스(54)와 이미지 센서(58) 사이에 삽입된다. 이미지 센서(58)는 흐름 셀(52)의 배면에 인접 배치된다. 이미지 센서(58)의 표면은 흐름 셀(52)의 배면에 접촉 또는 근접할 수 있다. 예를 들어, 흐름 셀(52)은 통상적으로 이미지 센서(58)를 커버하는 유리 또는 다른 광학적으로 투명한 층 위에 바로 배치될 수 있다. 이미지 센서(58)는 예를 들어 전하 결합 장치(CCD) 또는 상보형 금속-산화물 반도체(CMOS) 장치를 포함할 수 있다. 이미지 센서(58)는 단색 또는 컬러일 수 있다. 이미지 센서(58)는 일반적으로 9.0㎛ 미만, 더 구체적으로는 5.0㎛ 미만(예를 들어, 2.2㎛ 이하)의 작은 픽셀 크기를 갖는다. 일반적으로, 더 작은 픽셀 크기를 갖는 이미지 센서들(58)은 더 높은 해상도들을 생성할 것이다.
도 3을 계속 참조하면, 조명 소스(54)는 흐름 셀(52)로부터 거리 z1에 위치한다. 이미지 센서(58)의 이미징 평면은 흐름 셀(52)로부터 거리 z2에 위치한다. 본 명세서에서 설명되는 시스템(50)에서 z2<<z1이다. 예를 들어, 거리 z1은 약 1 cm 내지 약 10 cm 정도일 수 있다. 다른 실시예들에서, 범위는 더 작을 수 있는데, 예를 들어 약 5 cm 내지 약 10 cm일 수 있다. 거리 z2는 약 0.05 mm 내지 2 cm 정도일 수 있지만, 다른 실시예들에서 이 거리 z2는 약 1 mm 내지 2 mm일 수 있다. 시스템(50)에서, 전파 거리 z1은 공간 응집이 이동 물체(12)의 평면에서 발생하는 것을 가능하게 하고, 이동 물체(12)에 의해 산란되는 광이 이미지 센서(58) 상의 무렌즈 인라인 홀로그램을 형성하도록 배경 광과 간섭을 일으키게 한다.
도 3에 도시된 바와 같이, 이동 물체들(12)은 흐름 셀(52) 내에서 화살표 A의 방향으로 흐른다. 화살표 A는 흐름 셀(52)의 장축과 실질적으로 평행하다. 흐름 방향 A(따라서, 흐름 셀(52))는 이미지 센서(58)에 대해 약간 경사진다. 이 각도의 정확한 값은 중요하지 않고, 연역적으로 알려질 필요가 없으며, 단지 흐름 셀(52)을 따르는 이동 물체(12)의 흐름이 이미지 센서(22)의 양 축방향 x 및 y에서 시프트 성분을 생성하는 것을 보증한다. 각도는 일반적으로 0이 아닌 각도와 45도 미만 사이에 있어야 한다. 도 1a에 도시된 이전 실시예에서와 같이, 조명 소스(54)는 상이한 각도들에서 흐름 셀(52)을 조명하도록 이동할 수 있다.
도 3을 계속 참조하면, 시스템(50)은 시스템(50)에 기능적으로 접속되는 랩탑, 데스크탑 등과 같은 컴퓨터(30)를 포함하며, 따라서 데이터 획득 및 이미지 처리를 위해 더 낮은 해상도의 이미지들(예로서, 더 낮은 해상도 또는 원시 이미지 프레임들)이 이미지 센서(58)로부터 컴퓨터(30)로 전송된다. 컴퓨터(30)는 본 명세서에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 홀로그래픽 진폭 또는 강도를 포함하는 이동 물체(들)(12)의 이미지를 획득하는 소프트웨어를 동작시키거나 실행하는 하나 이상의 프로세서(32)를 포함한다. 이어서, 컴퓨터(30) 상의 소프트웨어는 이미지의 손실된 위상을 복원한다. 이어서, 동일 이미지의 홀로그래픽 진폭 및 복원된 위상 양자를 갖고서, 소프트웨어는 이동 물체(들)(12)의 더 높은 해상도의 이미지를 재구성한다. 이러한 재구성된 이미지는 예를 들어 디스플레이(34) 등에서 사용자에게 표시될 수 있다. 소프트웨어는 또한 특정 관심 세포들을 이들의 홀로그래픽 시그니처에 기초하여 식별하고 표시할 수 있다.
흐름 셀(52)을 통해 흐르는 이동 물체들(12)은 이미지 센서(58)를 이용하여 이미징된다. 구체적으로, 각도 오프셋된 이미지 센서(58)를 이용하여 복수의 저해상도 홀로그래픽 이미지 프레임이 획득된다. 시스템 이미징 지오메트리의 단위 프린지 확대로 인해, 이미지 센서(58)에서의 픽셀 크기에 따라, 획득된 홀로그램들은 언더샘플링될 수 있다. 한편, 흐름 동안에 각각의 무렌즈 물체 홀로그램은 시간의 함수로서 상이한 서브픽셀 시프트들을 갖도록 샘플링되므로, 픽셀 초고해상도 알고리즘을 이용하여, 센서의 물리적 픽셀 크기(예로서, >2㎛)보다 훨씬 작은 예를 들어 ≤0.5㎛의 유효 픽셀을 갖는 고해상도 홀로그램을 디지털 방식으로 합성할 수 있다. 따라서, 시스템(50)은 흐름 셀(52) 내의 이동 물체(12)의 흐름을 이용하여, 홀로그램 샘플링을 위해 더 작은 픽셀들을 디지털 방식으로 생성한다. 그러한 초고 해상도 디지털 인라인 홀로그램은 쌍둥이 이미지 아티팩트의 검사 후에 이동 물체들(12)의 고해상도 무렌즈 이미징을 가능하게 한다.
도 3은 조명 소스(54)가 상이한 각도들로부터 흐름 셀(52)을 이미징하도록 이동할 수 있는 호(59)를 나타낸다. (가상선으로 도시된) 다양한 이미징 위치들이 호(59)를 따라 도시된다. 일반적으로, 조명 소스(54)는 0도 위치를 나타내는 (도 3에 도시된 바와 같은) 이미지 센서(58) 위의 상사점을 갖는 -89도 내지 +89도의 범위에 걸치는 각도들에서 이동한다. 시스템(50)은 이전 실시예에서와 같이 이미지들의 처리 및 분석을 위한 소프트웨어를 실행하는 데 사용되는 적어도 하나의 프로세서(32)를 내부에 갖는 컴퓨터(30)를 더 포함한다. 결과들을 표시하고 컴퓨터(30)와 인터페이스하기 위해 모니터(34) 및 입력 장치(36)가 컴퓨터(30)에 접속될 수 있다.
도 3의 실시예는 도 2에서 설명된 것과 동일한 방식으로 동작한다. 차이는 동작 1100에서 이미지 센서(58)와 평행한 평면에서 조명 소스(54)를 x-y 방향으로 이동시킬 필요가 없다는 점이다. 이러한 동작은 물체들(12)의 홀로그램들의 시프트를 자체적으로 제공하는 흐르는 물체(12)로 인해 필요하지 않다.
도 4는 샘플(14) 내의 물체(12)의 단층 촬영 이미징을 위한 시스템(60)의 다른 실시예를 나타낸다. 이 실시예에서, 시스템(60)은 하우징(64)을 포함하는 핸드헬드 또는 휴대용 이미저(62)를 포함한다. 하우징(64)은 단단한 플라스틱 또는 금속 재료로 형성될 수 있으며, 휴대용 이미저(62)의 다양한 컴포넌트들을 넣거나 수용하는 데 사용된다. 하우징(64)은 복수의 LED를 포함하는 조명 소스(66)를 그 안에 포함한다. 도 4에는 24개의 그러한 LED가 도시되지만, 더 많거나 적을 수도 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, LED 조명 소스들(66) 각각은 하우징(64)의 아치형 내면을 따라 배열된다. 각각의 LED는 광섬유(68)에 맞대기(butt) 결합된다.
각각의 광섬유(68)는 도파관의 역할을 하며, 광섬유들(68)의 어레이는 도 4에 도시된 바와 같이 호를 따라 타일화된다. 이러한 스킴에서, 각각의 광섬유 코어의 직경은 ~0.1 mm이므로, 집광 렌즈 또는 임의의 다른 광 결합 도구가 필요하지 않으며, 이는 각각의 LED의 그의 대응하는 광섬유 단부에 대한 맞대기 결합을 상당히 간단하고 기계적으로 강하게 한다. 조명 소스(66)의 시간적 간섭성을 증가시키기 위하여, LED들의 스펙트럼이 옵션인 간섭 기반 컬러 필터(70)를 이용하여 ~10 nm(~640 nm에 중심을 가짐) 아래로 협소화될 수 있다. 각각의 광섬유(68)의 대향 단부들(단부는 LED에 맞대기 결합되지 않음)은 공통 호 형상 브리지(72) 상에 설치된다. 따라서, 각각의 광섬유(68)는 호 형상 브리지(72)를 따라 상이한 각도로부터 샘플을 조명할 수 있다. 이전 실시예들과 달리, 조명 소스를 각각의 상이한 각도로 이동시킬 필요가 없다. 여기서, 후술하는 바와 같이, 다양한 각도에서 샘플을 조명하는 개별 LED들이 턴온된다. 플라스틱으로 형성될 수 있는 호 형상 브리지의 양 단부에는 자석들(74)이 설치된다. 자석들(74)은 네오디뮴 자석들과 같은 희토류 자석들을 포함할 수 있다. 이미저(62)는 각각의 자석에 인접 설치된 코일들(76)을 포함한다. 코일들(76)은 활성화 시에 브리지(72)를 옮기고 광섬유들(68)의 단부들 모두를 동시에 이동시키는 전자기력을 생성하는 DC 전류 소스에 결합된다. 이와 관련하여, 자석들(74)을 갖는 호 형상 브리지(72) 및 관련 코일들(76)은 전자기 액추에이터의 역할을 한다. 코일들(76) 및/또는 자석들(74)은 그의 대응하는 코일(76)이 활성화될 때 직교 변위를 생성하도록 배치된다. 따라서, 광섬유들(68)의 단부들의 변위는 x 및 y 방향들 모두에서 발생한다. 코일들(76)은 이들의 원통 축들이 자석들의 자화 벡터와 정렬되도록 배치된다.
이미저(62)에 급전하기 위해 배터리(도시되지 않음)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 수일 동안의 단층 촬영 현미경의 계속적인 사용을 위해 교체할 필요 없이 광섬유들을 작동시키기 위해 (예를 들어, 3000 mA h의 용량을 갖는) 표준 알카라인 배터리들이 사용될 수 있다. 대안으로서, 이미저(62)는 외부 전원에 의해 급전될 수 있다.
이미저(62)는 하우징(64) 내에 마이크로컨트롤러(78)를 더 포함한다. 마이크로컨트롤러(78)는 조명 소스(66)를 구성하는 LED들의 점화를 제어하는 데 사용된다. 예를 들어, 마이크로컨트롤러(78)는 각각의 개별 LED를 적절한 시간에 활성화 또는 트리거링할 수 있다. 일례로서, LED들은 브리지(72)를 따라 순차적으로 활성화될 수 있다. 마이크로컨트롤러(78)는 코일들(76)의 작동을 제어하는 데에도 사용될 수 있다.
도 4를 계속 참조하면, 이미저(62)는 하우징(64)의 안팎으로 이동할 수 있는 샘플 홀더(80)를 포함한다. 하나 이상의 물체(12)를 포함하는 샘플(14)(도 1b 참조)이 샘플 홀더(18) 상에 로딩되고 샘플 홀더(80) 내에 배치된다. 이어서, 샘플 홀더(80)는 장치 내로 푸시되고, 여기서 샘플(14)은 조명 소스(66)의 광 경로 내에 배치된다. 이미저(62)는 또한 이미지 센서(82)를 포함한다. 이미지 센서(82)는 이전 실시예들과 관련하여 설명되는 바와 같이 CMOS 또는 CCD를 포함할 수 있다.
시스템(60)은 이전 실시예에서와 같이 이미지들의 처리 및 분석을 위한 소프트웨어를 실행하는 데 사용되는 적어도 하나의 프로세서(32)를 내부에 갖는 컴퓨터(30)를 더 포함한다. 모니터(34) 및 입력 장치(36)가 컴퓨터(30)에 접속되어 결과들을 표시하고 컴퓨터(30)와 인터페이스할 수 있다. 컴퓨터(30), 모니터(34) 및 입력 장치(36)는 이전 실시예들에서와 동일하거나 유사한 방식으로 동작한다.
실험 1 - 제1 실시예
도 1a에 도시된 실시예는 무렌즈 광학 단층 촬영법을 위해 사용되어, ~14 mm2의 큰 FOV는 물론, ~4 mm의 확장된 DOF에 걸쳐 ~2.5-3㎛의 축방향 해상도와 함께 <1㎛의 측방 해상도를 달성하여, ~15 mm3의 온칩 이미징 볼륨을 가능하게 하였다. 이러한 무렌즈 광학 단층 촬영법은 3D에서의 고해상도와 상당히 큰 이미징 볼륨을 통합하여, 기존의 광학 계산 단층 촬영 양식들과 비교되지 않은 3D 공간 대역폭 제품을 제공한다.
~10 nm의 스펙트럼 대역폭을 갖는 부분 간섭성 광원을 회전시켜, (공기 중에서 ±50도에 걸치는) 다수의 각도로부터 샘플 볼륨을 조명하여, 어떠한 렌즈, 레이저 또는 다른 부피가 큰 광학 컴포넌트도 사용하지 않고 각각의 조명 각도에서 칩 상의 물체들의 여러 개의 서브픽셀 시프트 인라인 투영 홀로그램을 기록함으로써 무렌즈 단층 촬영 이미징이 달성된다. 홀로그램 기록 지오메트리의 제한된 공간 및 시간 간섭성은 얼룩 및 다중 반사 간섭 잡음 항들의 감소와 같은, 재구성된 이미지들의 중요한 장점들을 제공한다. 더구나, 이러한 지오메트리에서의 단위 프린지 확대는 예를 들어 >40도의 경사 조명 각도들에서도 물체들의 인라인 홀로그램들의 기록을 가능하게 하는데, 이는 프린지 확대를 이용하는 전통적인 간섭성 인라인 홀로그래픽 이미징 스킴들에서는 통상적으로 가능하지 않을 것이다.
단층 사진들에서의 제한 각도 아티팩트들을 제거하기 위해, 도 1a에 도시된 바와 같이 2개의 직교 방향으로 조명 소스를 순차적으로 회전시킴으로써 이중 축 단층 촬영 스킴이 이용된다. 픽셀 초고해상도를 수행하고, 따라서 각각의 투영 이미지에 대해㎛ 미만의 측방 해상도를 달성하기 위해, 서로에 대해 (x-y 평면에서) 서브픽셀 시프트된 다수의 무렌즈 인라인 홀로그램이 모든 조명 각도에서 획득된다(도 1a의 삽화 참조). 고해상도(SR) 투영 홀로그램들(각각의 조명 각도에 대해 하나씩)의 세트가 픽셀 초고해상도 알고리즘을 이용하여 디지털 방식으로 합성되면, 하이브리드 필터링 후방 투영 방법을 이용하여, 물체들의 최종 단층 사진들을 생성한다. 따라서, 초고해상도 투영들이 먼저 디지털 방식으로 재구성된 후에 후방 투영되어, 샘플의 산란 퍼텐셜의 볼륨 이미지들이 얻어진다.
이러한 결과들은 (1) 광학 단층 촬영 이미징이 무렌즈 온칩 이미징으로 확장되었고, (2) 이중 축 단층 촬영법이 전자기 스펙트럼의 광학 부분에 적용되었고, (3) 픽셀 초고해상도 기술들이 광학 단층 촬영 이미징에 적용된 최초를 구성한다. 어떠한 렌즈 또는 레이저와 같은 어떠한 간섭성 소스도 사용하지 않고, 제공되는 무렌즈 단층 촬영 이미징 스킴은 이중 축 단층 촬영 스킴을 이용하여 ~15 mm3의 큰 이미징 볼륨에 걸쳐 <1㎛ x <1㎛ x ~2.5-3㎛의 공간 해상도를 달성한다. 이미징 볼륨은 단일 축 투영 데이터만이 사용되는 경우에 ~15%의 축방향 해상도 감소의 대가로 ~30 mm3으로 증가한다. 큰 이미징 볼륨에 걸쳐 양호한 공간 해상도를 제공함으로써, 무렌즈 광학 단층 촬영법은 일반적으로 예를 들어 세포 및 발육 생태학에서의 높은 처리량의 이미징 응용들에 매우 유용할 수 있다.
이 실험에서 사용되는 무렌즈 단층 촬영 이미징 셋업에서, 센서(Aptina MT9P031STC, 5 메가픽셀, 2.2㎛ 픽셀 크기)로부터 약 z1 = 70 mm 떨어져 위치하는 광원은 챔버 높이에 따라 예를 들어 z2 = 0.5-4 mm의 범위에 걸치는 센서 표면까지의 거리를 갖는 물체들의 인라인 홀로그램들을 기록하기 위한 부분 간섭성 조명을 제공한다. 실험의 유연성을 위해, 단색화 장치를 사용하여, 500 nm 주위에 중심을 갖는 ~10 nm 대역폭을 갖는 조정가능 광대역 조명을 제공하였다. 직경 0.05-0.1 mm의 애퍼처를 통해 필터링되고, z1 = 70 mm의 거리를 이동한 후에, 조명 빔은 개별 물체들의 인라인 홀로그램들의 기록을 가능하게 하는 공간 응집 직경 <0.5-1 mm를 획득한다. 모터로 구동되는 스테이지를 이용하여, 센서 어레이의 중심에 원점을 갖는 호를 따라 광원을 회전시킴으로써 다중 각도 조명이 달성된다. 큰 z1/z2 비율로 인해, 이러한 정렬은 어렵지 않으며, 셋업의 강건성이 유지된다.
모든 조명 각도에서, 픽셀 초고해상도를 구현하기 위해 일련의 서브픽셀 시프트된 홀로그램들이 기록되며(도 2의 동작 1400), 이는 모터로 구동되는 선형 스테이지를 이용하여 광원을 ~70㎛의 스텝 크기들(총 9개 이미지)을 이용하여 센서 표면에 평행한 평면 내의 3x3 격자 내의 개별 위치들로 선형 이동시킴으로써 달성된다. 큰 z1/z2 비율로 인해 소스 평면에서의 그러한 큰 시프트들은 홀로그램 평면에서의 서브픽셀 시프트들에 대응한다는 점에 유의한다. 이러한 서브픽셀 시프트들의 정확한 값들은 중요하지 않으며, 사실상 이들의 값들은 원시 홀로그램들이 조명 각도의 함수로서 경험하는 측방 시프트들의 양으로부터 디지털 방식으로 추정된다.
대부분의 디지털 센서 어레이들은 센서 표면 법선으로부터 측정되는 입사 광선들의 각도가 20도-30도를 초과하지 않는 렌즈 기반 이미징 시스템들에서 동작하도록 설계되므로, 큰 k-벡터들을 갖는 입사 파동들은 증가된 아티팩트들 및 감소된 SNR과 더불어 샘플링된다. 따라서, 시스템의 검출 NA가 짧은 z2로 인해 매질의 굴절률에 도달할 수 있더라도, ±50도 위의 각도들에 대해 재구성된 투영 이미지들은 아티팩트들을 보이는 것으로 관측되었으며, 단층 촬영 재구성을 위해 이러한 투영들을 포함하는 것은 최종 이미지 품질을 향상시키는 것이 아니라 저하시킬 수 있다. 결과적으로, 투영들은 2도의 각도 증분과 더불어 ±50도의 경사 범위 내에서만 획득된다.
제한 각도 단층 촬영법의 아티팩트들을 줄이기 위해, 이중 축 단층 촬영 스킴이 이용되었다. 따라서, 하나의 축을 따른 투영들의 기록의 완료 후에, 샘플이 위에 설치된 센서는 직교하는 방향을 따라 투영들의 제2 세트를 기록하기 위해 컴퓨터 제어 회전 스테이지를 이용하여 90도 회전된다. 맞춤 개발된 LabView 인터페이스를 이용하여, 데이터 획득 프로세스를 자동화하며, 총 918개의 넓은 FOV 무렌즈 홀로그램이 기록된다. 하나의 축을 따라 459개 투영의 세트를 획득하는 데에는 ~4 fps의 프레임 레이트를 이용하여 ~5분 걸리며, 이는 더 빠른 프레임 레이트의 센서를 이용함으로써 크게 개선될 수 있다.
도 5의 (a)는 3개의 각도, 즉 +50도, 0도 및 -50도 각각에 대한 홀로그래픽 기록 조건을 개략적으로 나타낸다. 각각의 조건에 대해 광원, 투영 이미지 평면 및 홀로그램 평면이 도시된다. 도 5의 (b)는 3개의 각도, 즉 +50도, 0도 및 -50도 각각에 대응하는 각도에서 측정된 5㎛ 비드의 대응하는 초고해상도의(더 높은 해상도의) 홀로그램들로부터 절단된 이미지들(b1, b2, b3)을 나타낸다. 개별 비드들의 홀로그램들은 예상대로 타원 형상을 갖는데, 그 이유는 검출 평면이 빔 전파에 수직이 아니기 때문이다. 도 5의 (c)는 도 5의 (b)의 대응하는 홀로그램들(이미지 b1-b3)을 이용하여 디지털 방식으로 재구성된 무렌즈 투영 이미지들을 나타낸다. 투시 교정 후에, 재구성된 비드들의 원 형상에 의해 나타난 바와 같이 타원형이 제거된다. 재구성된 투영 이미지들은 회전 중심인 것으로 가정되는 이미지들의 중심에서 비드에 대해 정합한다.
무렌즈 단층 촬영 시스템을 특성화하기 위하여, 상이한 치수들의 마이크로비드들을 이용한 일련의 실험들이 수행되었다. 도 6의 (a)는 광학 접착제(굴절률 ~1.52, Norland NOA65)로 채워진 ~50㎛ 두께의 챔버 내에 무작위로 분포된 5㎛ 멜라민 비드들(굴절률 ~1.8, Corpuscular Inc.)에 대한 이중 축 단층 촬영 재구성 결과들을 나타낸다. 계산되는 단층 사진들은 -14㎛ 내지 25㎛의 범위에 걸치는 다양한 평면들에서 계산된다. 현미경 비교 이미지들(도 6의 (b))을 얻는 데 사용된 대물 렌즈(40X, 0.65NA)의 FOV를 매칭시키기 위하여, 훨씬 더 큰 FOV의 ~14 mm2 이미지로부터 절단된 관심 있는 작은 영역에 대해서만 그래픽 처리 유닛(NVidia, Geforce GTX 480)을 이용하여 <3분 내에 단층 사진들이 계산되었다. 도 6의 (a) 및 (b)의 화살표들은 주어진 층에서 초점이 맞은 비드들을 가리킨다. 도 6의 (a)(이미지 a1-a5)는 도 6의 (b)(이미지 b1-b5)에 제공되는 그들의 대응하는 현미경 비교들과 함께, 초점을 벗어난 비드들이 단층 사진들 내에서 성공적으로 거절되고, 초점이 맞은 비드들만이 재구성된 이미지들 내에 나타난다는 것을 보여준다. 단층 촬영 이미징 성능을 더 설명하기 위해, 도 6의 (c)(이미지 a6-a8)는 도 6의 (a)(이미지 a3-a5)의 점선 원들에 의해 강조된 관심 있는 줌잉된 영역을 나타내며, 여기서는 2개의 무작위 비드가 z 방향에서 ~20㎛의 중심 대 중심 간격을 갖고 축방향으로 오버랩된다. 이러한 이미지들은 대응하는 현미경 이미지들(이미지 b6 내지 b8) 옆에 표시된다. 이러한 재구성 결과들로부터, 오버랩된 비드들이 서로로부터의 최소한의 초점 이탈 오염과 더불어 그들의 대응하는 깊이들에서 성공적으로 분해된다는 것이 명백하며, 도 6의 (c)(이미지 a7)에 도시된 중간 슬라이스는 무시 가능한 가짜 상세들을 가지며, 이는 이러한 축방향으로 오버랩된 영역의 성공적인 섹션화를 지시한다. 이러한 결과들은 도 6의 (b)(이미지 b1-b5) 및 도 6의 (c)(이미지 b6-b8)에 도시된 그들의 대응하는 현미경 이미지들에 의해 검증되는 바와 같이 그들의 검출 애퍼처수 또는 조명 소스의 응집 특성들에 관계없이 정규 인라인 홀로그래피 스킴들의 범위를 넘는 섹션 이미징 능력을 증명한다.
도 6의 (a)-(c)의 결과들은 비교적 작은 FOV에 걸쳐 증명되었지만, 동일한 원시 홀로그래픽 데이터 세트로부터 모두 계산될 수 있는 FOV 내의 상이한 영역들에 대한 여러 단층 사진을 디지털 방식으로 결합함으로써 전체 이미징 볼륨의 단층 사진들이 얻어질 수 있다. 센서의 에지들에 가까운 물체들의 홀로그램들은 큰 조명 각도들에서 활성 영역 밖에 있으므로, 유효 FOV는 (CMOS 센서 칩의 활성 영역인) 24 mm2으로부터 ~14 mm2으로 감소한다.
단층 촬영 현미경의 이미징 특성들을 더 조사하기 위해, 광학 접착제 내에 분포된 2㎛ 직경의 비드들이 이미징되었다. 도 7의 (a)-(c)는 비드의 중심을 통해 각각 절단한 x-y, y-z 및 x-z 평면들 내의 재구성된 단면들을 나타낸다. 도 7의 (a)의 재구성된 비드의 원 형상에 의해 나타나는 바와 같이, 이중 축 단층 촬영 스킴은 제한 각도 단일 축 단층 촬영법에서 통상적으로 관찰되는 x-y 평면에서의 연장 아티팩트를 제거한다. 한편, 동일 비드의 재구성은 센서 평면의 법선에 대해 ±50도보다 큰 각도들에서의 누락된 영상들로 인해 여전히 축방향 연장을 보인다. 도 8의 (a)-(c)는 상이한 깊이들에 위치한 3개의 개별 비드에 대한 x, y 및 z를 따른 단면 라인 프로파일들을 나타낸다. z=3㎛에서의 비드에 대해, 중심을 통한 라인 프로파일들에 대한 FWHM 값들은 x, y 및 z 차원들 각각을 따라 2.3㎛, 2.2㎛ 및 5.5㎛이다. 깊이 z = -9㎛ 및 z = 4㎛에서의 다른 비드들에 대해 유사한 결과들이 얻어졌으며, 이는 가시화된 볼륨의 상이한 깊이들에서 동일한 이미징 성능이 유지된다는 것을 나타낸다.
넓은 FOV에 걸쳐 물체들의 3D 이미징을 가능하게 하는 것에 더하여, 플랫폼은 또한 그의 무렌즈 단위 확대 지오메트리로 인해 전통적인 현미경 대물 렌즈를 사용하는 이미징 시스템들에 비해 상당히 확장된 DOF를 갖는다. 큰 DOF를 증명하기 위해, ~1 mm 간격으로 적층된(즉, 3.3 mm의 총 두께를 갖는) 4개의 층을 갖는, 10㎛ 비드들로 구성된 다층 챔버가 이미징되었다. 이어서, 챔버는 센서 활성 영역 위로 상승되고, 가장 먼 층이 센서 칩으로부터 ~4 mm 떨어져 배치된다. 공기 중에서 ±50도에 걸치는 조명 각도에 대해, 14mm2 x 3.3mm의 볼륨에 대응하는 전체 단층 촬영 데이터가 이중 축 이미징을 이용하여 ~10분에 걸쳐 획득된다. (각각의 조명 각도에서의 9개의 서브픽셀 시프트된 홀로그램을 포함하는) 이러한 원시 데이터가 획득되면, 각각의 깊이 층에 대한 개별 단층 사진들이 계산된다. 이어서, 이러한 단층 사진들은 이제 ~4mm의 DOF를 갖는 단일 볼륨 이미지로 디지털 방식으로 결합된다. 홀로그램 방식으로 기록된 투영들의 세트 - 이들 중 하나가 도 9의 (a)에 도시됨 -는 두꺼운 샘플의 전체 3D 볼륨 정보를 포함하며, 도 9의 (a)의 상이한 크기의 화살표들은 다층 챔버 내의 상이한 층들에 위치하는 비드들을 가리킨다. 도 9의 (b)-(e)는 챔버 내의 상이한 깊이들(도 9의 (b): z=3.97mm, 도 9의 (c): z=1.740mm, 도 9의 (d): z=730㎛, 도 9의 (e): z=742㎛)에 대한 홀로그램들을 나타낸다.
그러한 큰 DOF의 단층 촬영 재구성에 대한 하나의 중요한 과제는 사실상 각각의 조명 각도에서의 픽셀 초고해상도의 구현이다. 상당히 떨어진 깊이들에 위치하는 입자들/물체들의 원시 홀로그램들은 상이한 시프트들을 생성할 것이므로, 그들의 홀로그램들이 검출기 평면에서 오버랩되는 경우, 픽셀 초고해상도의 맹목적인 실현은 오버랩된 입자 홀로그램들 중 적어도 일부에 대해 에러들을 생성할 것이다. 이러한 문제를 완화하기 위하여, 상이한 층들의 원시 홀로그램들이 서로로부터 필터링되었으며, 따라서 상이한 깊이 층들의 무렌즈 홀로그램들에 대해 개별적으로 픽셀 고해상도가 적용될 수 있다. 두꺼운 샘플들 내의 축방향으로 오버랩된 물체들에 대한 초고해상도 홀로그래픽 투영들을 계산하는 것은 >200-300㎛의 축방향 간격을 갖는 물체들의 홀로그램들이 센서 칩에 걸쳐 상당히 상이한 양들로 시프트된다는 사실로 인해 추가적인 디지털 처리를 필요로 한다. 결과적으로, 광원을 시프팅함으로써 얻어지는 원시 홀로그램들은 동일한 2D 원시 홀로그램의 이동 버전들이 아니라 본질적으로 상이한 이차원 함수들이며, 이는 픽셀 초고해상도 기술에 대해 충족될 요건이다. 결과적으로, 주어진 조명 각도에서의 단일 초고해상도 투영 홀로그램이 전체 샘플 깊이에 대해 계산되지 못한다. 대신에, 각각의 깊이 층에 대해 개별 초고해상도 홀로그램들이 계산된다. 이를 달성하기 위해, 도 10의 (a)의 측정된 홀로그램과 같은 측정된 홀로그래픽 투영들이 삭제될 각각의 깊이에서 디지털 방식으로 재구성되며, 재구성된 물체들은 물체들의 지원 내에서 0이고 그 밖에서 1인 이진 마스크와의 승산에 의해 홀로그램 필드로부터 제거된다. 두꺼운 볼륨 내에서 제거될 모든 층들에 대해 이러한 동작을 연속 수행함으로써, 도 10의 (b)에 도시된 바와 같이, 관심 있는 층에 대해서만 디지털 홀로그램이 얻어진다. 원하지 않는 층들에 대해서만 마스킹 동작이 적용되므로, 관심 있는 층에 대한 오리지널 홀로그램과 디지털 방식으로 도출된 홀로그램 간의 차이를 나타내는 도 10의 (c)에 도시된 바와 같이, 관심 있는 층에 대한 홀로그램에는 어떠한 아티팩트도 발생하지 않는다. 짧은 깊이 범위(<200-300㎛)에 대한 시프트된 홀로그램들이 디지털 방식으로 획득되면, 특히 이전 섹션에서 설명된 바와 같은 관심 있는 깊이 층에 대해 초고해상도 홀로그램이 계산될 수 있다.
생명 과학 분야에서의 응용들에 대한 무렌즈 단층 촬영 현미경의 성능을 증명하기 위하여, 야생형 꼬마 선충 벌레가 탈이온수 내에서 L4 스테이지(~650㎛의 길이)에서 이미징되었다. 이미징 프로세스 동안 바람직하지 않은 움직임을 피하기 위해 벌레는 4mM 레바미솔(Sigma Aldrich L9756)을 이용하여 일시적으로 고정되었다. 데이터 획득 동안 벌레가 y축에 평행하게 정렬되므로, x축을 따른 경사들에 의해 얻어진 투명들만을 이용하여 벌레의 단층 사진들을 계산하였으며, 이는 단일 GPU를 이용하여 ~4분 걸렸다. 도 11의 (a)는 z=3㎛ 평면에 대응하는 전체 벌레를 통한 슬라이스를 나타낸다. 벌레는 센서 표면에 대해 면 밖으로 약간 경사지고 그의 전면이 ~8㎛ 상승된 상태에서 관찰되었으며, 그 결과로서 전체 벌레를 통한 단일 슬라이스는 동물에 걸친 상세들을 동일한 선명도로 나타내지 못한다. 도 11의 (b)(이미지 b1-b3)는 z=2㎛, z=8㎛ 및 z=13㎛ 평면들 각각에서의 벌레의 전방 영역을 통한 3개의 재구성된 깊이 섹션들을 나타낸다. 도 11의 (c)의 이미지 b4는 비교를 위한 현미경 이미지(x40, 0.65 NA)를 나타낸다. 이들 도면에 도시된 바와 같이, <5㎛의 외경을 갖는 긴 원통 구조인 벌레의 인두관은 z=8㎛ 평면에서 선명하게 보이는 반면(이미지 b2), 인두의 중심으로부터 떨어진 깊이들에서는 빠르게 사라진다. 도 11의 (d)(이미지 c1-c3)는 또한 동일 벌레의 중심 및 전방 영역들을 통한 상이한 깊이들에서의 단층 사진들을 나타낸다. 도 11의 (e)(이미지 c4)는 비교를 위한 현미경 이미지를 나타낸다. 이러한 모든 결과들에서, 상이한 섹션들에서의 특이한 상세들의 출현이 명확히 관찰될 수 있으며, 이는 검출 애퍼처수 또는 응집 특성에 관계없이 정규 인라인 홀로그래픽 재구성들로는 달성할 수 없는 상당히 향상된 섹션화 능력을 증명한다. 그의 큰 이미징 볼륨과 더불어, 이들 결과는 높은 처리량의 이미징이 가장 중요한 꼬마 선충 및 제브라피쉬와 같은 광학적으로 접근 가능한 모델 유기체들의 온칩 이미징 및 스크리닝에 대한 무렌즈 단층 촬영 플랫폼의 잠재력을 보여준다.
무렌즈 단층 촬영 이미징 시스템은 ~14mm2의 넓은 FOV 및 ~4mm의 긴 DOF를 <1㎛의 측방 해상도 및 ~2.5-3㎛의 축방향 해상도로 탐사할 수 있는 고유 현미경 검사 양식을 제공한다. 이러한 결과들은 표준 20X 대물 렌즈들(NA ~0.4, FOV < 1mm2)에 필적하는 분해능, 그러나 >104배 더 큰 이미징 볼륨을 암시한다. 이것은 플랫폼이 3D 모델 동물 이미징과 같은 높은 처리량의 이미징 및 스크리닝 응용들에 특히 적합하게 한다. 또한, 이미징 볼륨은 ~3-3.5㎛의 더 낮은 축방향 해상도의 대가로 단일 축 데이터 세트를 이용하여 획득된 투영들을 이용함으로써 ~30mm3으로 증가될 수 있다는 점에 유의한다.
그러한 넓은 FOV 및 확장된 DOF에 걸쳐 온칩 단층 촬영 이미징을 달성하는 것을 가능하게 하는 무렌즈 비간섭성 홀로그래피 스킴의 여러 고유 양태가 존재한다. 예를 들어, ~20-100의 큰 z1/z2 비율을 선택하는 것은 단위 확대를 이용하는 홀로그래픽 이미징을 가능하게 하며, 이는 이러한 이미징 양식에 대해 큰 FOV를 제공한다. 이러한 단위 확대 및 센서 칩에서의 픽셀 크기에 의해 지시되는 제한된 홀로그램 해상도는 이미징 FOV에서의 트레이드 오프(trade off) 없이 0.4-0.5까지 측방 애퍼처수를 증가시키는 픽셀 초고해상도 접근법에 의해 상쇄된다. 이러한 큰 z1/z2 비율은 또한 통상적으로 큰 조명 애퍼처들(예로서, >50㎛)의 사용을 가능하게 하며, 이는 어떠한 광 결합 광학 기구, 어려운 정렬 또는 달성 가능한 해상도에서의 트레이드 오프에 대한 필요 없이 조명 부분을 상당히 간소화한다. 결과적으로, 셋업을 불필요하게 복잡하게 하고 샘플을 교란하는 물체의 회전을 필요로 하는 것이 아니라 광원을 경사지게 함으로써 투영들이 쉽게 획득된다. 더욱이, 광학 기구의 간소함 및 무렌즈 셋업의 비정렬 구조는 또한 이중 축 단층 촬영법의 간단한 구현을 가능하게 하는데, 이는 광원 또는 (샘플이 위에 설치된) 센서의 경사-축이 90도 회전되어 2개의 직교하는 방향을 따라 투영들을 획득할 수 있기 때문이다.
무렌즈 단층 촬영 스킴의 다른 고유 양태는 부분 간섭성 광을 시간적으로 그리고 공간적으로 이용하는 것이다. 조명의 스펙트럼 폭은 ~500nm의 중심 파장을 갖는 ~10nm이며, 이는 응집 길이를 <10㎛로 제한한다. 이러한 비교적 짧은 응집 길이는 기술에 대해 어떠한 제한도 부과하지 않으며, 사실상 2개의 주요 잡음 소스, 즉 얼룩 및 다중 반사 간섭 잡음 항들을 크게 줄인다. 후자 항은 특히 경사진 각도들에서의 레이저 조명 하에서의 폐해이었을 것이다. 게다가, 그러한 제한된 응집 길이는 또한 상이한 깊이들의 서로의 크로스토크를 일부 제거한다. 그러한 상호 간섭 항들은 바람직하지 않으며, 사실상 임의의 홀로그래픽 재구성 스킴에서 완전히 무시된다. 동일한 상호 간섭이 주어진 깊이 층 내에서도 발생한다. 즉, 샘플 볼륨 내의 산란 중심들은 실제로 검출기 평면에서 서로 간섭하며, 이는 홀로그래픽 재구성(예를 들어, 쌍둥이 이미지 제거)과 관련되는 한은 다시 한 번 아티팩트의 소스이다. 제한된 공간 간섭성은 또한 물체들의 개별 홀로그램들을 기록할 만큼 충분히 크지만 전체 이미징 FOV보다는 상당한 작은 공간 응집 직경(예로서, <0.5-1mm)을 선택함으로써 이러한 문제를 완화하는 것을 돕는다. 이러한 공간 응집 직경은 조명 애퍼처(예로서, 0.05-0.1mm)를 변경함으로써 또한 소스 애퍼처와 샘플 볼륨 사이의 거리를 변경함으로써 이러한 지오메트리에서 엔지니어링하기에 상당히 간단하다.
실험 2 - 제2 실시예
이 실험에서, 도 3의 실시예는 미세 유체 채널 내에서 흐르는 견본의 3D 이미징을 수행할 수 있는 광유체 단층 촬영 현미경으로서 테스트되었다. 이러한 광유체 무렌즈 이미징 양식에서, 센서로부터 ~50mm 떨어져 배치된 공간 비간섭성 광원(~0.05-1.0mm 직경의 애퍼처에 의해 필터링되고 ~10nm 스펙트럼 대역폭 및 600nm 중심 파장을 가짐)을 이용하여, 광전자 센서 어레이(Aptina MT9P031STC, 5 메가픽셀, 2.2㎛ 픽셀 크기)에 의해 샘플의 디지털 인라인 홀로그램들이 기록된다. 홀로그램들이 획득되는 동안, 물체들은 도 3에 도시된 바와 같이 x-y 평면에서 약간 경사지게 센서 상에 직접 배치된 마이크로채널을 따라 전기-운동 흐름에 의해 구동된다. 이러한 경사각의 정확한 값은 중요하지 않고, 연역적으로 알려질 필요가 없으며, 이는 단지 마이크로채널을 따르는 물체의 흐름이 x 및 y 양자에서 시프트 성분을 생성하여 픽셀 초고해상도를 통한 더 높은 해상도의 홀로그램들의 디지털 합성을 가능하게 하는 것을 보증한다. 홀로그래픽 광유체 현미경 검사 플랫폼은 단위 프린지 확대를 이용하는 그의 고유한 홀로그램 기록 지오메트리로 인해, 도 3에 도시된 바와 같은 다수의 조명 각도를 이용하여 흐르는 물체들의 이미징을 가능하게 하며, 이는 광학 계산 단층 촬영법을 달성하기 위한 열쇠이다.
단층 촬영 이미징을 위한 다중 각도 조명은 전통적인 광유체 현미경 검사 아키텍처들에서는 가능하지 않은데, 그 이유는 더 높은 조명 각도들에서는 동일 물체의 상이한 단면들의 투영 이미지들이 물체와 애퍼처/센서 평면들 사이의 거리 증가 및 회절로 인해 해상도를 잃기 시작하기 때문이다. 이러한 광유체 단층 촬영 플랫폼에서는, 샘플이 엄밀히 센서 어레이 위로 흐르는 동안, (예를 들어, θ = -50도: +50도에 걸치는) 각각의 조명 각도에서 여러 투영 홀로그램(즉, 15개 프레임)이 기록된다. 이어서, 이러한 더 낮은 해상도(LR)의 무렌즈 홀로그램들은 픽셀 초고해상도 기술들을 이용하여 단일 초고해상도(SR) 홀로그램으로 디지털 방식으로 합성되어, 주어진 조명 방향에 대응하는 각각의 투영 홀로그램에 대해 <1㎛의 측방 해상도가 달성된다. 이러한 SR 투영 홀로그램들은 동일 물체의 복합 투영 이미지들을 얻기 위해 디지털 방식으로 재구성되며, 이어서 이 이미지들은 물체들의 단층 사진들을 계산하기 위해 필터링된 후방 투영 알고리즘을 이용하여 후방 투영될 수 있다.
야생형 꼬마 선충 벌레가 미세 유체 채널 내에서 흐르는 동안 θ = -50도: +50도에 걸쳐 2도씩 이산적으로 증가하는 다양한 조명 각도들에서 순차적으로 이 벌레를 이미징하는 실험이 수행되었다. 이러한 실험들에서, 실험들에 사용되는 CMOS 센서 칩의 설계는 조명의 최대 유용 각도를 궁극적으로 제한한다. 대부분의 디지털 센서들은 렌즈 기반 이미징 시스템들에서 동작하도록 설계되며, 따라서 ±50도보다 큰 조명 각도들에서 기록된 홀로그램들은 아티팩트들을 나타낸다. 이러한 이유로 인해, 각도 범위를 ±50도로 제한하였다. 각각의 조명 각도에서, 흐르는 물체에 대해 ~15개의 홀로그래픽 프레임들이 (<3초 내에) 캡처되어, 전기-운동 흐름 조건하에서 단층 사진당 ~2.5분의 전체 이미징 시간이 걸렸다. 이러한 조명 각도들은 광원을 유지하는 컴퓨터 제어 회전 스테이지에 의해 자동으로 생성되며, 이들은 x-y 평면에 위치하는 검출기 어레이에 대한 x-z 평면 내의 소스의 회전을 정의한다. 이러한 셋업을 이용하여 기록된 일부 예시적인 LR 홀로그램들이 도 11의 (f)에 도시되어 있다. 예상대로, 경사 조명들(θ = ±34도)에 대해, x를 따른 홀로그램들의 범위는 θ = 0도의 경우에 비해 더 넓다. 마이크로채널 내에서의 벌레의 흐름 동안에 벌레의 서브픽셀 시프트들을 이용함으로써, 도 11의 (g)에 또한 도시된 바와 같이, 각각의 조명 각도에서 샘플에 대해 초고해상도 홀로그램들이 합성된다. 즉, 도 2의 동작 1400에서 지시된 바와 같이, 단일의 더 높은 해상도의 이미지를 생성하기 위해 다수의 서브픽셀 이미지들이 사용된다. 이러한 SR 홀로그램들은 원시 홀로그램들에서 언더샘플링되는 더 미세한 프린지들을 나타낸다.
디지털 홀로그래픽 재구성을 통해 샘플의 복합 투영 이미지들을 획득하기 위해, 합성된 SR 홀로그램들은 경사진 기준 파동과 디지털 방식으로 승산된다. 이러한 재구성 파동의 경사각은 미세 유체 챔버에서의 광의 굴절로 인해 광원의 기울기와 동일하지 않다. 대신, 투영 홀로그램들에 대한 디지털 재구성 각도(θ)는 비율 △d/z2의 역탄젠트를 계산함으로써 결정되며, 여기서 △d는 수직 투영 이미지 내의 물체들의 위치들에 대한 물체들의 홀로그램들의 측방 시프트들을 나타내고, z2는 실험적으로 알려지거나, 수직 투영 홀로그램의 디지털 재구성 거리에 의해 결정될 수 있다. 경사 조명 각도들의 사용에도 불구하고, 기록된 홀로그램들은 여전히 인라인 홀로그램들이며, 이는 기준 파동 및 물체 파동이 동축으로 전파되기 때문이라는 점에 유의해야 한다. 결과적으로, 물체 지원 제약에 기초하는 반복 위상 복원 알고리즘을 이용하여, 물체를 통해 전송되는 복합 필드를 재구성한다. 이러한 반복들 전반에서, 광 필드는 평행한 홀로그램 및 물체 평면들 사이에서 앞뒤로 전파된다. 반복들이 수렴하면, 조명 각도에 수직인 평면에서의 복합 필드의 투영은 경사 방향을 따른 치수가 cos(θ)에 의해 리스케일링되는 격자 상에서 복원 필드를 보간함으로써 획득된다. 예시적인 재구성들이 θ = ±34도 및 0도에 대해 도 12의 (a)-(d)에 도시되며, 이는 홀로그래픽 광유체 현미경 검사 플랫폼의 다중 각도 초고해상도 이미징 성능을 증명한다. SR 홀로그램을 계산하고, ~15번의 반복 내에서 이미지를 반복적으로 재구성하는 전체 프로세스는 그래픽 처리 유닛(GPU - NVidia Geforce GTX 480) 상의 병렬 CUDA 기반 구현을 이용하여 0.25초 미만이 걸린다.
약하게 산란하는 물체들에 대해, (도 12의 (a)-(d)에 도시된 바와 같은) 디지털 홀로그래픽 재구성을 통해 획득된 복합 필드는 조명의 방향을 따르는 물체의 복합 전달 함수(위상, 흡수 또는 산란 퍼텐셜)의 투영을 나타낸다. 따라서, 물체의 3D 전달 함수는 모든 복합 투영 이미지들(즉, θ = -50도: 2도: 50도에 대한 51개의 초고해상도 이미지)이 입력으로 사용되는 필터링된 후방 투영 알고리즘을 이용하여 단층 사진의 형태로 계산될 수 있다. 도 13의 (a)-(e)는 벌레의 여러 깊이 섹션이 제공되는 꼬마 선충 샘플의 무렌즈 광유체 단층 사진을 나타낸다. 도 13의 (f)는 10X 현미경 이미지를 나타낸다. 그러한 단층 촬영 이미징 스킴은 특히 홀로그래픽 재구성 양식들에 고유한 공지된 초점 심도 문제를 완화하며, 상당히 향상된 축방향 해상도를 갖는 광유체 단층 촬영 이미징을 가능하게 한다. (SR 홀로그램들의 합성 및 필터링된 후방 투영을 포함하는) 이러한 전체 단층 촬영 재구성 프로세스는 단일 GPU를 이용하여 3.5분 미만이 걸리며, 이는 여러 GPU를 병렬로 사용함으로써 크게 개선될 수 있다. 이러한 단층 촬영 재구성 결과들에 기초하여, 벌레의 전달의 진폭의 축방향 라인 프로파일의 반치폭(FWHM)은 ~30㎛로서 측정되었으며, 이는 꼬마 선충 샘플의 통상적인 두께와 잘 맞는다. 단층 사진들을 계산하지 않고, 단일 초고해상도 수직 무렌즈 홀로그램(θ = 0도)을 이용한 동일 축방향 FWHM은 ~1mm이었으며, 이는 다수의 투영을 이용한 초점 심도의 개선을 명확히 증명한다. 무렌즈 홀로그램들에 고유한 긴 초점 심도는 사실상 확장된 피사계 심도에 대한 투영 근사화를 충족시키는 것을 도와서, 꼬마 선충과 같은 약하게 산란하는 샘플들의 단층 촬영 이미징을 가능하게 한다.
기록될 수 있는 홀로그램들의 제한된 각도 범위로 인해, 물체의 푸리에 공간 내에서는 일반적으로 "누락 웨지"로서 알려진 누락 영역이 존재한다. 누락 웨지의 가장 중요한 효과는 축방향에서의 PSF의 연장이며, 이는 축방향 해상도를 이 예에서 ~3㎛일 것으로 추정되는 측방 해상도보다 큰 값으로 제한한다. 그러한 아티팩트들의 감소는 물체의 3D 지원에 기초하여 반복 제한 알고리즘들을 구현함으로써 또는 물체 함수의 3D 푸리에 공간 내의 누락 영역을 반복적으로 채우는 것을 가능하게 하는 물체의 전달 함수에 대한 연역적 정보를 이용함으로써 달성될 수 있다.
실험 3 - 제3 실시예
실험 3은 칩 상의 물체들의 깊이 섹션화를 달성할 수 있는 현장 휴대용 무렌즈 단층 촬영 현미경에 관련된다. 단지 ~110g의 무게를 갖는 이러한 소형 무렌즈 광학 단층 촬영 현미경은 부분 간섭성 디지털 인라인 홀로그래피에 기초하며, 칩 상의 ~20mm3의 큰 샘플 볼륨을 탐사하는 ~20mm2의 큰 FOV 및 ~1mm의 피사계 심도(DOF)에 걸쳐 <7㎛의 축방향 해상도를 달성할 수 있다. DOF를 ~4mm로 확장함으로써, 이미징 볼륨은 또한 공간 해상도의 감소의 대가로 ~80mm3으로 증가될 수 있다.
이러한 현장 휴대용 무렌즈 단층 촬영 플랫폼에서, 상당한 향상된 3D 공간 해상도를 가능하게 하는 주요 팩터들은 (i) 단층 촬영 이미징을 위해 다양한 조명 각도들을 이용하여 물체들의 다수의 디지털 인라인 홀로그램을 기록하고, (ii) 각각의 관찰 각도에서 무렌즈 홀로그램들의 측방 해상도를 크게 증가시키기 위해 픽셀 초고해상도를 구현하는 것이다. 이러한 단층 촬영 온칩 현미경의 구현을 위해, 24개의 발광 다이오드(각각 <0.3USD의 가격을 가짐)가 도 4에 도시된 바와 같이 호를 따라 경사진 광섬유 도파관들의 어레이에 개별적으로 맞대기 결합된다. 각각의 광섬유는 ~0.1mm의 코어 직경 및 ~14mm의 길이를 갖는다. 광섬유들은 호를 따라 설치되며, 따라서 이들은 ~4.1도의 증분과 더불어 ±50도의 범위 내의 상이한 각도들로부터 샘플을 조명한다. 이러한 스킴에서는, 각각의 광섬유 코어의 직경이 ~0.1mm이므로, 집광 렌즈 또는 임의의 다른 광 결합 도구가 필요하지 않으며, 이는 각각의 LED의 그에 대응하는 광섬유 단부에 대한 맞대기 결합을 상당히 간단하고 기계적으로 강하게 한다. 조명 소스의 시간적 간섭성을 증가시키기 위해, 광섬유 어레이의 지오메트리(~10mm x 5mm)와 매칭되는 구분 호(piecewise arc) 상에 설치된 6개의 간섭 기반 컬러 필터(총 <50USD의 비용, Edmund Optics)를 이용하여 LED들의 스펙트럼을 ~10nm(~640nm에 중심을 가짐)로 좁혔다. 이는 이러한 컬러 필터들 상의 거의 수직인 광 입사를 보증한다. 이러한 스펙트럼 필터링 후에 조명 빔의 응집 길이는 ~30㎛로 증가되며, 이는 센서 칩 표면으로부터 최대 ~1mm의 물체 높이에 대해 ~0.3-0.4의 애퍼처수(NA)를 이용하여 홀로그램들을 획득하는 것을 가능하게 한다.
다수의 각도로부터 무렌즈 투영 홀로그램들을 기록하기 위하여, LED들은 저가의 마이크로컨트롤러(Amtel ATmega8515, 개당 ~3 USD)에 의해 순차적으로 그리고 자동으로 턴 온/오프된다. 광섬유 단부들로부터 z1 = ~60mm 떨어져 배치된 디지털 센서 어레이(Aptina MT9P031STC, 5 메가픽셀, 2.2㎛ 픽셀 크기)가 무렌즈 현미경의 일측으로부터 삽입된 샘플 트레이(tray)를 통해 로딩된 (센서 칩의 활성 영역까지 z2<5mm 거리를 갖는) 물체들의 무렌즈 투영 홀로그램들을 기록한다(도 4 참조). 각각의 조명 각도에서, 일련의 서브픽셀 시프트된 홀로그램들이 디지털 픽셀 초고해상도를 구현하기 위해 기록된다. 이러한 목적을 위해, 모든 광섬유들은 양 단부에 네오디뮴 자석들을 갖는 공통 호 형상 브리지 상에 설치된다. 이러한 자석들을 가로질러 설치된 코일들을 DC 전류를 이용하여 구동함으로써, 플라스틱 브리지를 작동시키고 모든 광섬유 단부들을 동시에 이동시키는 전자기력이 생성된다. 이러한 광섬유들은 ~500㎛ x ~500㎛ 격자 내의 10-15개의 상이한 위치로 시프트되며, 각각의 위치에 대해 ~20-24개의 홀로그래픽 투영들의 새로운 세트가 획득된다. 소스 평면에서의 그러한 큰 시프트들은 큰 z1/z2 비율로 인해 홀로그램 평면에서의 훨씬 더 작은 시프트들에 대응한다는 점에 유의한다. 더 중요하게, 이러한 시프트들은 정확하거나 반복 가능할 필요가 없는데, 이는 거의 임의의 시프트들이 픽셀 초고해상도를 달성하는 데에 동일하게 유용하기 때문이다. 또한, 이러한 시프트들에 대한 사전 지식이 필요하지 않은데, 이는 이러한 정보가 획득된 무렌즈 홀로그램들의 시퀀스를 처리함으로써 정확하게 획득될 수 있기 때문이다. LabView(National Instruments) 기반 자동 노출 소프트웨어를 이용하여, 24개 이미지의 세트가 4 프레임/초에서 ~6초 안에 획득될 수 있으며, 이는 예를 들어 >15-20 fps의 더 높은 프레임 레이트를 갖는 센서를 이용하여 크게 고속화될 수 있다.
홀로그램 기록 지오메트리에서의 큰 z1/z2 비율이 ±90도에 가까운 각도들에서 홀로그램들의 기록을 가능하게 한다는 사실에도 불구하고, 디지털 센서 어레이 자체의 설계는 단층 촬영 현미경에서 사용될 수 있는 조명 각도들의 실제 범위를 제한한다. 대부분의 디지털 센서 어레이들은 렌즈들을 이미징 요소들로서 사용하는 이미징 시스템들을 위해 설계되며, 결과적으로 센서 표면 법선으로부터 측정되는 입사 광선들의 각도는 통상적으로 20도-30도보다 작다. 따라서, 설계에 의해 이러한 광전자 센서들의 감도는 50도보다 큰 입사 각도들에 대해 빠르게 저하되며, 수차가 커진다. 따라서, 홀로그램 기록 지오메트리가 더 높은 각도들(예로서, 70도-80도)의 사용을 허가하는 경우에도, 이러한 특정 단층 촬영 현미경 검사 셋업에 대해 조명 각도 범위를 ±50도로 제한한다.
전술한 바와 같이, 다중 각도 조명에 사용되는 광섬유들은 전자기력에 의해 작동될 때 모든 광섬유들과 함께 움직이는 공통 호 형상 경량 브리지(~1.7g)에 접속된다. 이러한 광섬유 케이블들의 다른 단부들은 기계적으로 고정되며, 개별적으로 어드레스되는 LED들에 맞대기 결합된다. 따라서, 전체 구조는 모든 광섬유들이 집합적으로 스프링의 역할을 하고 브리지가 질량 부하인 스프링-질량 시스템으로서 모델링될 수 있다.
이러한 구조의 설계를 위해 고려될 필요가 있는 여러 중요한 사양이 존재하는데, 즉 (1) 기구의 폼팩터(form factor)를 작게 유지하기 위해, 액추에이터의 전체 구조는 가능한 한 작아야 하고; (2) 구조는 작은 외부 교란이 이미지 획득 동안 광섬유 첨단들을 임의로 움직이지 못하도록 - 그렇지 않을 경우에는 기록되는 홀로그램들의 블러링(blurring)을 유발함 것임 - 자체적으로 단단하게 유지될 만큼 충분히 강해야 하고; (3) 구조가 외부 진동들의 결합으로 인해 움직이지 않도록 - 이것은 또한 광섬유 단부들이 오랜 기간 동안 스윙하지 않고 빠르게 정상 상태 변위에 도달하는 것을 도움 - 구조의 최저 진동 모드의 자연적인 기계 공진 주파수가 가능한 한 높아야 하고; (4) 현장 사용을 위한 표준 배터리들을 이용하여 공급될 수 있는 적당한 전류 및 전압 값들을 이용하여 충분한 작동이 이루어져야 한다. (1), (2) 및 (3)은 광섬유들을 짧게 유지함으로써 달성될 수 있고, 이는 구조를 작고 강하게(또한 공진 주파수들을 증가시킴) 하지만, 이것은 불행하게도 필요한 전자기력의 상당한 증가를 요구하며, 따라서 높은 전력 소비를 유발할 것이다.
이러한 기계 시스템을 더 양호하게 분석하기 위해, 구조의 강도(k)를 다음과 같이 나타낼 수 있도록 각각의 광섬유 도파관이 원통형 단면을 갖는 외팔보로서 작용하는 간단한 모델을 가정한다.
Figure pct00001
여기서, E는 실리카 광섬유의 영률이고(E=72GPa), r은 광섬유의 반경이고(r = ~62.5㎛), L은 광섬유들의 길이이다. 이러한 무렌즈 단층 촬영 현미경 설계에서는, 플라스틱 브리지와 광섬유들의 고정 단부 사이의 거리인 L=14mm의 광섬유 길이가 선택되었다. 이러한 광섬유들이 N=24개의 광섬유들의 묶음 시스템을 형성하는 병렬 스프링들로서 작용하는 것으로 가정하면, 다음과 같이 구조의 기계 주파수를 계산할 수 있다.
Figure pct00002
식 2는 m=1.7g의 측정된 질량이 플라스틱 브리지 및 2개의 자석에 대해 사용될 때 f0 ~24Hz의 예상 값을 산출한다. 이러한 계산에 따르면, 힘이 인가될 때 광섬유들에 대한 정상 상태 변위에 도달하기 위한 시간은 예를 들어 ~45의 품질 팩터를 가정할 때 ~300ms로서 추정될 수 있다. 광섬유들의 실제 안정 시간은 짧아서 이러한 계산들을 지원한다. 더구나, 실험들 동안, 외부 교란으로 인해 어떠한 바람직하지 않은 광섬유 어레이의 스윙도 관찰되지 않았으며, 전체 구조는 매우 강건하고 튼튼하여 현장 사용에 적합해진다.
조명 광섬유들의 전자기 작동을 달성하기 위하여, 2개의 네오디뮴 자석이 플라스틱 브리지의 각각의 단부에 설치되었다. 이들 자석 중 하나는, 그를 가로질러 ~1-2mm 거리로 설치된 코일에 DC 전류가 인가될 때, 전자기력이 호의 방향을 따라 광섬유들을 이동시키도록 정렬된다. 다른 자석은 그의 대응하는 코일이 작동될 때 직교 변위를 생성하도록 배치된다. 따라서, x 및 y 양 방향에서의 광섬유 단부들의 변위들은 샘플들의 초고해상도 투영 홀로그램들을 생성하도록 달성될 수 있다. 이러한 코일들은 이들의 원통 축들이 자석들의 자화 벡터와 정렬되도록 배치된다. 이러한 구성에서, 자석들 상에 생성되는 힘(Fmag)은 다음과 같이 계산될 수 있다.
Figure pct00003
여기서, S는 자석의 원통 단면적(m2의 단위)이고, M은 자화(테슬라 단위)이고, Hz1 및 Hz2(A/m 단위)는 자석의 상부 및 하부 각각에서의 자기장 강도의 축방향 성분들이다. 식 3이 시사하는 바와 같이, 생성되는 힘은 자석의 두 단부에 걸치는 자기장 차이(△Hz)에 직접 비례하며, 인가되는 전류의 극성에 따라 원통 축을 따라 자석을 당기거나 미는 데 사용될 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 이미징될 샘플은 휴대용 단층 촬영 현미경의 일측으로부터 삽입된 샘플 트레이를 이용하여 센서 어레이의 상부에 배치된 표준 커버 유리 상에 배치될 수 있다. 샘플은 광원에 대한 그의 거리(~60mm)에 비해 센서 어레이의 활성 영역에 훨씬 더 가까우므로(<4-5mm), 물체들의 무렌즈 홀로그램들은 예를 들어 통상의 10X 대물 렌즈의 FOV보다 >20배 큰 예를 들어 ~24mm2의 넓은 FOV에 걸쳐 기록될 수 있다. 이어서, 저가의 마이크로컨트롤러를 사용하여, (한 번에 하나씩) LED들을 자동으로 그리고 순차적으로 스위치 온하여 ±50도의 각도 범위 내에서 샘플의 무렌즈 투영 홀로그램들을 기록한다.
각각의 조명 각도에서 공간 해상도를 향상시키기 위한 초고해상도(SR)를 수행하기 위해, 광섬유 도파관 단부들은 전자기 작동을 통해 작은 양들만큼(<500㎛) 기계적으로 변위된다. 이러한 스킴에서, 광섬유들은 저가 네오디뮴 자석들이 양 단부에 부착된 공통 브리지(반경: 3.1mm, 길이: 6.2mm)에 접속된다. 소형의 원형 전기 코일들(반경: 5mm, 높이: 5mm)이 플라스틱 하우징 내에 설치되며, 자석들을 전자기적으로 작동시켜, x 및 y 양 방향을 따르는 모든 광섬유들의 동시 시프트를 유발하는 데 사용된다.
이러한 광섬유 단부들에 대한 변위의 정확한 양은 사전에 알려지거나 심지어 반복 가능하거나 정확히 제어될 필요가 없다. 사실상, 각각의 광섬유 단부의 개별 변위는 획득된 무렌즈 홀로그램 시퀀스를 이용하여 디지털 방식으로 계산될 수 있다. DC 전류를 이용하여 코일들을 구동함으로써 광섬유들이 새로운 위치로 시프트되면, 무렌즈 투영 홀로그램들의 새로운 세트가 기록되며, 이들 각각은 센서 어레이에 대해 2D에서 약간 시프트된다. 최대 광섬유 변위(즉, <500㎛)를 위해, 전기-코일(50Ω) 양단에 인가되는 ~4 볼트의 전위차와 함께 80mA의 최대 전류가 요구된다. 단층 촬영 현미경의 적어도 수일간의 연속 사용을 위해 교체할 필요 없이 표준 알칼라인 배터리들(예를 들어, 3000mAh의 용량을 가짐)이 광섬유들을 작동시키는 데 사용될 수 있다.
전술한 셋업을 이용하여, 10-15개의 투영 홀로그램을 각각의 조명 각도에서 기록하여, 주어진 조명 각도에 대한 하나의 SR 홀로그램을 디지털 방식으로 합성한다. 도 14의 (a)는 3개의 상이한 각도(-44도, 0도 및 +44도)에 대한 홀로그램 기록 지오메트리를 나타낸다. 도 14의 (b)는 도 14의 (a)의 각각의 대응하는 각도에서 획득된 대응하는 픽셀 초고해상도(SR) 투영 홀로그램들을 나타낸다. 이러한 무렌즈 SR 홀로그램들은 도 14의 (c)에 도시된 샘플들의 투영 이미지들을 획득하기 위해 디지털 방식으로 재구성된 후에, 센서 칩 상에 위치하는 물체들의 단층 사진들을 계산하기 위해 필터링된 후방 투영 알고리즘을 이용하여 함께 통합될 수 있다.
각각의 조명 각도에서 기록된 시프트된 홀로그램들은 더 높은 공간 해상도를 갖는 투영 홀로그램들을 합성하기 위해 디지털 방식으로 처리된다. 이것은 도 2의 동작 1400으로 도시된다. 이어서, 이러한 디지털 방식으로 합성된 초고해상도 홀로그램들은 물체들의 무렌즈 투영 이미지들을 획득하기 위해 빠르게 재구성된다. 경사 조명 각도들의 사용에도 불구하고, 물체 파동 및 교란되지 않은 기준 파동은 동축으로 전파되며, 각각의 무렌즈 홀로그램은 여전히 인라인 홀로그램이다. 쌍둥이 이미지 아티팩트들을 제거하고, 기록된 광학 필드 강도의 위상을 복원하기 위해, 반복 위상 검색 알고리즘이 이용되며, 이러한 반복들 동안에 물체 지원을 제약으로 이용하여 검출기 및 물체 평면들 사이에서 홀로그램 필드가 앞뒤로 전파된다. 전통적인 홀로그래픽 재구성과 유사하게, 기록된 홀로그램은 홀로그램들을 기록하는 데 사용된 기준 파동의 디지털 사본인 재구성 파동과 디지털 방식으로 승산되어야 한다. 따라서, 반복 위상 복원 단계들 이전에, 홀로그램들은 먼저 θrec의 각도로 경사진 평면 파동과 승산된다. 이러한 재구성 파동의 경사각(θrec)은 샘플 챔버 내에서의 광의 굴절로 인해 조명 광섬유의 물리적 기울기와 동일하지 않다는 점에 유의하는 것도 중요하다. 사실상, θrec은 비율 △d/z2의 역탄젠트를 계산함으로써 결정되며, 여기서 △d는 수직 투영 홀로그램 내의 원시 홀로그램들의 위치들에 대한 원시 홀로그램들의 측방 시프트를 나타내고, z2는 실험적으로 알려지거나, 수직 홀로그래픽 이미지들의 디지털 재구성 거리에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로 10-20번의 반복 내에 수렴이 달성되며, 이어서 검출기에 평행한 물체 평면 내의 광학 필드가 획득된다. 그럼에도, 이러한 필드는 조명의 방향에 수직인 투영 이미지를 획득하기 위해 회전되는 것이 필요하다. 이를 달성하기 위해, 복원된 필드는 조명 경사의 방향을 따라 cos(θ)에 의해 리스케일링되는 새로운 격자 상에서 보간되며, 이는 복원된 필드를 효과적으로 스퀴즈(squeeze)하고, 대응하는 각도에 대한 투영 이미지를 제공한다.
각각의 조명 각도에서의 투영 이미지들이 계산되면, 이들은 단층 사진들을 계산하기 전에 공통 회전 중심에 대해 정합되는 것이 필요하다(예를 들어, 3개의 투영 이미지가 중심에 있는 비드에 대해 정렬된 도 14의 (c)(이미지 c1-c3)를 참고한다). 이것은 자동화된 2 단계 교차 상관 알고리즘을 구현함으로써 달성된다. 제1 단계에서, 인접 각도들에 대한 투영 이미지들은 이러한 인접 투영들(예로서, 42도와 46도; 46도와 50도)의 관심 있는 전체 영역을 교차 상관시킴으로써 서로 정렬된다. 연속하는 각도들에 대한 투영 이미지들은 서로 매우 유사하므로, 이러한 동작은 근사 초기 정렬을 제공한다. 그러나, 이러한 정합은 관찰 각도의 함수로서의 장면의 근소한 변화들로 인해 완전하지 않다. 제2 정밀 정렬 단계에서, 투영 이미지들 중 하나가 전역 기준 이미지로서 선택되고, 모든 투영 이미지들이 이 기준 이미지에 대해, 그러나 이번에는 투영들 내의 관심 있는 더 작은 영역을 이용하여 정합된다. 이러한 제2 단계는 마이크로 비드들과 같은 분산된 작은 물체들의 이미지들을 정렬할 때 특히 필요하다.
(본 명세서에 참고로 포함되는 Radermacher M. 공보에 더 상세히 설명된) 필터링된 후방 투영 알고리즘을 이용하여, 물체들의 무렌즈 투영 이미지들로부터 물체들의 단층 사진들을 계산한다. 이러한 접근법의 타당성을 위한 기본적인 요구는 투영 이미지들이 단층 사진들이 계산되고 있는 물체의 특성(예를 들어, 위상, 흡수, 산란 강도 등)의 선형 합계를 나타내야 한다는 것이다. 이것은 일반적으로 약하게 산란하는 물체들에 의해 충족되며, 이 경우에 입사 광자들의 대부분은 물체의 볼륨에 걸쳐 기껏해야 한 번의 산란 이벤트를 경험한다.
약하게 산란하는 물체가 |s(xθ, yθ, zθ)|<<1을 충족시키는 복합 산란 함수 s(xθ, yθ, zθ)에 의해 표현되고, 여기서 (xθ, yθ, zθ)는 z축이 특정 투영 각도에서 조명 각도의 방향과 정렬되는 좌표계를 정의한다. 이 경우, 홀로그램에 대한 교차 간섭 항들의 기여는 실제 홀로그래픽 헤테로다인 항들에 비해 무시 가능할 것이다. 이러한 가정은 3D 응집 필터의 역할을 하는, 시스템의 (응집 직경보다 큰 측방 간격을 갖는 물체들 사이의 크로스토크를 최소화하는) 낮은 공간 간섭성 및 (응집 길이보다 긴 간격을 갖는 상이한 층들 사이의 크로스토크를 최소화하는) 낮은 시간 간섭성에 의해 더 검증된다. 결과적으로, (예로서, △z ~±25㎛에 걸치는) 단일 단층 사진 볼륨 내의 각각의 투영 이미지에 대해, 홀로그램 방식으로 재구성된 이미지 콘트라스트는 ∫|s(xθ, yθ, zθ)|·dzθ에 의해 주어지는 산란 강도 함수의 선형 합계를 산출할 것이다. 이러한 결론은, 디지털 인라인 홀로그래피 스킴들의 검출 애퍼처수들에 관계없이 이들이 일반적으로 매우 긴 초점 심도를 가지며, 그 결과로서 주어진 zθ 방향을 따르는 산란 계수들이 적절한 쌍둥이 이미지 제거 단계들 후에 선형적으로 합산되도록 근사화될 수 있다는 사실에 의해 더 정당화된다. 결과적으로, 물체의 산란 강도의 단층 사진들은 다양한 조명 각도들에서 획득된 픽셀 초고해상도 무렌즈 단층 사진들의 홀로그래픽 재구성에 의해 계산된 투영 이미지들을 입력들로서 갖는 필터링된 후방 투영 알고리즘을 적용함으로써 계산될 수 있다.
현장 휴대용 무렌즈 단층 촬영 현미경의 성능을 검증하기 위하여, 상이한 치수들의 마이크로 비드들은 물론, 전염성 기생 편형 동물인 꼬마 촌충 알도 이미징되었다. 렌즈, 레이저 또는 다른 고가의 광학 기계 컴포넌트를 사용하지 않고도, 제공되는 무렌즈 단층 촬영 현미경은 <7㎛의 축방향 해상도를 갖는 섹션 이미징을 제공하면서도, ~20mm3의 큰 이미징 볼륨에 걸쳐 각각의 투영 이미지의 NA를 ~0.3-0.4까지 증가시킬 수 있는 픽셀 초고해상도를 구현한다. 더구나, 이러한 볼륨은 공간 해상도 감소의 대가로 ~80mm3(~4mm의 DOF에 대응함)까지 확장될 수도 있다. 그러한 큰 이미징 볼륨에 걸쳐 양호한 공간 해상도를 제공하는 이러한 소형 경량(~110g)의 비용 효과적인 무렌즈 단층 촬영 현미경은 원격 위치들에서의 원격 의약 처방 및 높은 처리량의 이미징 응용들을 위한 귀중한 도구를 제공할 수 있다.
도 15의 (b)는 2㎛ 직경의 미세 입자의 디지털 방식으로 합성된 픽셀 초고해상도(SR) 홀로그램을 나타내며, 여기서는 이제 도 15의 (a)에 도시된 더 낮은 해상도(LR)의 원시 홀로그램에 비해 훨씬 더 높은 공간 주파수들을 갖는 홀로그래픽 프린지들이 관찰될 수 있다. 이러한 증가된 애퍼처수((NA)의 결과로서, SR 홀로그램들을 이용하여 재구성된 이미지들은 (SR을 이용하여) 2㎛ 비드가 그의 실제 크기에 훨씬 더 가깝게 이미징된 도 15의 (c) 및 15d의 시각적 비교에 의해 나타나는 바와 같이 더 높은 측방 해상도를 보인다.
이어서, 도 15의 (a) 및 15b 각각에 도시된 LR 및 SR 홀로그램들에 대응하는 재구성된 깊이(z) 프로파일들이 조사되었다. 여러 상이한 깊이(z) 값에서 도 15의 (a)의 LR 무렌즈 홀로그램을 디지털 방식으로 재구성함으로써, 동일한 2㎛ 입자에 대응하는 도 15의 (e)(이미지 a1 및 a2)에 도시된 y-z 및 x-z 프로파일들을 획득할 수 있다. 이러한 결과들에서, z 방향을 따른 확장은 깊이 섹션화에 대한 단일 LR 홀로그램의 한계를 나타낸다. 이러한 한계는 도 15의 (f)(이미지 b1 및 b2)에 도시된 바와 같은 SR 무렌즈 홀로그램을 이용하여 일부 개선된다. 한편, SR을 이용하는 애퍼처수 개선에도 불구하고, 이것은 예를 들어 ~45㎛ 이상의 축방향 해상도를 갖는 물체들의 섹션 이미징을 여전히 허용하지 않는다.
이러한 기본적인 축방향 해상도 한계를 완화하기 위하여, 도 16의 (a)-(c)에 도시된 바와 같은 동일 미세 입자의 단층 사진을 생성하기 위해 ±50도 범위에 걸치는 ~20개의 조명 각도에 대해 합성되는 무렌즈 SR 홀로그램들이 사용되었다. 도 16의 (a)-(c)에 제공되는 이러한 결과들은 현장 휴대용 무렌즈 단층 촬영 현미경이 축방향 해상도를 크게 개선한다는 것을 지시하며, 이는 비드 이미지의 단축된 초점 심도에 의해 관찰될 수 있다. 현장 휴대용 단층 촬영 현미경은 단일 LR 홀로그램 및 단일 SR 홀로그램 각각을 이용하여 달성될 수 있는 것에 비해 축방향 해상도를 >13X 및 ~6-7X의 팩터만큼 개선한다.
현장 휴대용 무렌즈 단층 촬영 현미경의 깊이 섹션화 능력을 더 증명하기 위하여, 광학 접착제(굴절률 ~1.52, Norland NOA65)로 채워진 ~50㎛ 두께의 챔버 내에 무작위로 분산된 5㎛ 직경의 둥근 마이크로 비드들(굴절률 ~1.68, Corpuscular Inc.)이 이미징되었다. 도 17의 (a)-(e)는 비교 목적(도 17의 (f)-(j))을 위해 사용되는 40X 대물 렌즈(NA: 0.65)의 FOV와 매칭되도록 훨씬 더 큰 이미지 영역으로부터 디지털 방식으로 절단된 관심 있는 작은 영역에 대한 단층 촬영 재구성 결과들을 나타낸다. 전체 챔버 깊이에 대한 무렌즈 단층 사진들은 그래픽 처리 유닛(NVidia, Geforce GTX 480)을 이용하여 <1분 내에 계산되었다. 도 17의 (a)-(e)의 화살표들은 이미지의 대응하는 깊이 층에서 초점이 맞은 마이크로 비드들을 나타내며, 이들은 또한 도 17의 (f)-(j)에 도시된 바와 같은 동일한 깊이들에서 획득되는 전통적인 현미경 이미지들을 이용하여 교차 검증될 수 있다. 단층 촬영 이미징 성능을 더 정량화하기 위하여, 도 18의 (a)는 동일 FOV 내에 위치하는 임의의 마이크로 비드에 대한 x 및 y 라인 프로파일들을 나타내며, 여기서 입자의 반치폭(FWHM)은 x 및 y 방향들 각각을 따라 ~5㎛ 및 ~5.5㎛로서 계산될 수 있으며, 이는 그의 직경(5㎛)과 매우 양호하게 매칭된다. (z 방향을 따른) 동일 비드 단층 사진의 축방향 라인 프로파일은 도 18의 (b)에 도시된 바와 같이 ~12.9㎛의 FWHM을 갖는다. 다중 각도 조명 및 단층 촬영 디지털 재구성을 이용하지 않고, 단일 SR 홀로그램만을 이용하여 계산되는 동일 미세 입자의 이미지는 인라인 홀로그래픽 이미징 플랫폼에 대해 그의 긴 초점 심도로 인해 예상되는 >75㎛의 축방향 FWHM을 가질 것이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 도 18의 (b)(즉, 라인 프로파일)에 도시된 축방향 라인 프로파일의 일차원 공간 도함수를 취함으로써, z 방향을 따른 단층 촬영 현미경의 포인트 확산 함수의 FWHM은 ~6㎛로 추정될 수 있다(도 18의 (b)의 도함수 곡선 참조).
도 4에 도시된 무렌즈 홀로그램 기록 지오메트리는 특히 높은 처리량의 이미징 요구에 대해 여러 장점들을 가지며, 따라서 긴 피사계 심도(예로서, ~1.4mm) 및 넓은 시야(예로서, ~20mm2) 양자를 달성한다. 특히, 무렌즈 홀로그래픽 투영들이 관심 있는 임의의 깊이에서 재구성될 수 있으며, 이어서 공간 수차를 유발하지 않고 그 깊이 영역 주위에서 단층 사진들이 계산될 수 있다. 이러한 접근법은 긴 피사계 심도 내의 관심 있는 임의의 영역, 따라서 큰 이미징 볼륨의 3D 이미징을 가능하게 한다.
이러한 능력을 구체적으로 증명하기 위해, 광학 접착제 내에 삽입된 10㎛ 비드들로 구성된 다층 챔버(사이에 ~1mm의 간격, 즉 ~3-5mm의 총 두께를 갖도록 함께 적층된 4개 층)가 이미징되었다. 이러한 두꺼운 물체는 센서 칩의 활성 영역으로부터 ~0.7mm 떨어져 배치되며, 그의 가장 먼 층은 센서 평면으로부터 z ~4.2mm에 배치된다. 도 19의 (a)는 0도의 각도에서의 다층 챔버의 기록된 홀로그램을 나타낸다. 도 19의 (b)-(f)는 이러한 두꺼운 물체 내의 상이한 층들의 계산된 단층 사진들을 나타내며, 이는 긴 DOF 내에서의 무렌즈 단층 촬영 접근법의 광학 섹션화 능력을 증명한다. 이어서, 상이한 층들에서 계산된 그러한 개별 단층 사진들을 디지털 방식으로 통합함으로써 전체 DOF 및 물체 볼륨의 단층 사진들이 획득될 수 있다. (센서로부터 ~4.2mm 떨어진) 가장 먼 층 내의 물체들의 무렌즈 홀로그램들은 40도 위 및 -40도 아래의 조명 각도들에 대해 센서 활성 영역 밖으로 시프트되며, 그 결과로서 각도 범위는 최상위 층에 대해서만 ±40도로 제한되었다. 두꺼운 또는 다층 챔버들의 단층 촬영 이미징을 위한 픽셀 고해상도 스킴의 디지털 구현은 추가적인 신호 처리를 필요로 하는데, 이는 상당히 다른 깊이들에 위치하는 물체들이 센서 평면에서 그들의 대응하는 홀로그램들의 측방 시프트들의 큰 변화들을 나타내기 때문이다. 이러한 문제를 처리하기 위하여, 주어진 깊이의 층에 대해(즉, 다른 층들과 무관하게) 초고해상도 홀로그램들을 명확히 계산할 수 있는 반복 알고리즘이 사용되었다. 도 19의 (g)-(i)는 상이한 깊이들(도 19의 (g): z = ~0.75mm; 도 19의 (h): z = ~1.8mm; 도 19의 (i): z = ~4.2mm)에 대한 SR 홀로그램들을 나타낸다.
전술한 바와 같이, 예를 들어 <200-300㎛의 높이 내에 물체들이 분산되는 챔버에 대해, 모든 물체들의 홀로그램들은 주어진 소스 시프트에 대해 거의 동일하게 시프트된다. 따라서, 모든 서브픽셀 시프트된 홀로그램들 내의 측정된 데이터를 충족시키는 단일 SR 홀로그램이 합성될 수 있다. 그러나, 두꺼운 또는 다층 챔버들의 경우, >200-300㎛만큼 축방향으로 분리된 물체들의 무렌즈 홀로그램들은 상당히 다른 양들만큼 시프트되며, 상이한 소스 시프트들에 대한 기록된 홀로그램들은 상이하게 보인다. 결과적으로, 모든 시프트된 홀로그램들을 충족시키기 위한 단일 SR 홀로그램이 계산될 수 없다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 홀로그램 강도로부터 원하지 않는 층들을 디지털 방식으로 제거함으로써 원하는 층들에 대한 정보만을 갖는 새로운 홀로그램들이 획득될 수 있다. 이를 달성하기 위하여, 도 19의 (a)에서와 같이 두꺼운(또는 다층) 챔버에 대한 무렌즈 홀로그램이 원하지 않는 층들에서 재구성되며, 그러한 층들에 초점이 맞추진 물체들은 이진 마스킹 동작을 이용하여 홀로그램 필드로부터 제거된다. 원하는 층 외의 모든 층들을 연속 제거하는 것은 특히 관심 있는 깊이 층에 대한 측정된 데이터에 충실한 새로운 디지털 방식으로 선명화된 홀로그램을 생성한다. 센서에 더 가까운 층들을 제거하는 것은 선명화된 홀로그램에 찌꺼기들을 남길 수 있지만, 이러한 찌꺼기들은 매우 약하므로 어떠한 문제를 일으키지 않으며, 원하는 층에 대한 홀로그램들은 여전히 처음 측정된 원시 홀로그래픽 데이터와 완전히 일치한다. 마지막으로, 상이한 서브픽셀 시프트들을 갖는 이러한 새로운 홀로그램들이 관심 있는 주어진 층에 대해 획득되면, 그 깊이 층의 SR 홀로그램이 성공적으로 계산될 수 있다. 도 19의 (g)-(i)는 상이한 깊이들에서의 디지털 방식으로 선명화된 SR 홀로그램들을 나타낸다.
생물 의학에서의 잠재적인 응용들에 대한 현장 휴대용 무렌즈 단층 촬영 현미경의 성능을 검증하기 위하여, 꼬마 촌충 알이 이미징되었다. 꼬마 촌충 알은 ~40㎛ 직경의 대략 둥근 구조를 갖는 사람들의 전염성 기생 편형 동물이다. 무렌즈 인라인 홀로그래피의 긴 피사계 심도로 인해, 이 알의 광학적 섹션화는 임의의 주어진 조명 각도에서 그의 기록된 홀로그램을 재구성하는 것만으로는 가능하지 않다. 그러나, 도 20의 (a)에 나타난 바와 같이, (도 4에 도시된) 단층 촬영 핸드헬드 현미경을 이용하여 이 기생 알의 개별 깊이 섹션들(이미지 a1, a2, a3)이 생성되어, 각각의 깊이 층에서의 독특한 상세들/특징들을 나타낼 수 있다. 비교 목적을 위해, 도 20의 (a)에서 발견된 것과 동일한 깊이 위치들에서의 40X 현미경 이미지들이 도 20의 (b)에 도시된다.
실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 명세서에서 개시되는 본 발명의 개념들의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경들이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명(들)은 아래의 청구항들 및 이들의 균등물들 외에는 한정되지 않아야 한다.

Claims (35)

  1. 샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미징을 위한 시스템으로서,
    이미지 센서;
    상기 샘플을 유지하도록 구성된 샘플 홀더 - 상기 샘플 홀더는 상기 이미지 센서에 인접 배치됨 -; 및
    부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 포함하는 조명 소스
    를 포함하고,
    상기 조명 소스는 애퍼처(aperture), 광섬유 케이블, 또는 상기 조명 소스와 상기 샘플 홀더 사이에 삽입된 광 도파관 중 적어도 하나를 통해 상기 샘플을 조명하도록 구성되고, 상기 조명 소스는 복수의 상이한 각도를 통해 상기 샘플을 조명하도록 구성되는 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조명 소스는 고정된 샘플 홀더에 대해 이동 가능한 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 홀더는 고정된 조명 소스에 대해 이동 가능한 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 샘플 홀더는 미세 유체 흐름 셀(microfluidic flow cell)을 포함하는 시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 샘플 홀더는 상기 이미지 센서에 대해 경사진 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 상이한 각도는 약 -89도와 +89도 사이의 범위에 걸치는 시스템.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 상이한 각도는 실질적으로 직교하는 축들을 따르는 각도들을 포함하는 시스템.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 상이한 각도에서의 조명으로부터 획득된 이미지들에 기초하여 상기 샘플의 삼차원 이미지를 재구성하도록 구성된 적어도 하나의 디지털 프로세서를 더 포함하는 시스템.
  9. 제1항에 있어서,
    이미징 평면과 실질적으로 평행한 평면에서 애퍼처, 광섬유 케이블 또는 광 도파관 중 적어도 하나를 이동시키기 위한 수단을 더 포함하는 시스템.
  10. 제1항에 있어서,
    이동시키기 위한 수단은 스텝퍼 모터, 이동 가능 스테이지, 압전 요소 및 솔레노이드 중 적어도 하나를 포함하는 시스템.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 각도는 삼차원 형상의 표면을 따르는 상이한 각도들을 포함하는 시스템.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 형상은 구 또는 타원체를 포함하는 시스템.
  13. 샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미지를 획득하는 방법으로서,
    상기 샘플을 유지하도록 구성된 샘플 홀더를 부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 방출하는 조명 소스를 이용하여 제1 각도에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 애퍼처 또는 광섬유 케이블 중 적어도 하나를 통과함 -;
    상기 샘플 홀더를 상기 조명 소스를 이용하여 상이한 각도들에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 상기 애퍼처 또는 광섬유 케이블을 통과함 -;
    각각의 각도에서, 상기 샘플 홀더의 반대쪽에 배치된 이미지 센서로부터 복수의 서브픽셀 이미지 프레임을 획득하는 단계;
    각각의 각도에서의 상기 서브픽셀 이미지 프레임들을 각각의 각도에 대한 단일의 더 높은 해상도의 홀로그램으로 디지털 방식으로 변환하는 단계;
    상기 더 높은 해상도의 홀로그램들로부터 각각의 각도에 대한 투영 이미지들을 디지털 방식으로 재구성하는 단계; 및
    상기 샘플 내의 상기 물체의 삼차원 단층 촬영 이미지들을 디지털 방식으로 후방 투영하는 단계
    를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    각각의 각도에서, 이미지 센서로부터 복수의 서브픽셀 이미지 프레임을 획득하는 단계는 상기 이미지 센서에 실질적으로 평행한 평면에서 상기 조명 소스, 애퍼처 또는 광섬유 케이블 중 적어도 하나를 측방으로 이동시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    복수의 각도는 단일 평면 내의 복수의 각도를 포함하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    복수의 각도는 서로 실질적으로 직교하는 2개의 평면 내의 복수의 각도를 포함하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    복수의 각도는 삼차원 형상의 표면을 따르는 상이한 각도들을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 형상은 구 또는 타원체를 포함하는 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    각각의 각도에서의 상기 서브픽셀 이미지 프레임들을 각각의 각도에 대한 단일의 더 높은 해상도의 홀로그램으로 디지털 방식으로 변환하는 단계; 상기 더 높은 해상도의 홀로그램들로부터 각각의 각도에 대한 투영 이미지들을 디지털 방식으로 재구성하는 단계; 및 상기 샘플 내의 상기 물체의 삼차원 단층 촬영 이미지들을 디지털 방식으로 후방 투영하는 단계는 적어도 하나의 프로세서에 의해 수행되는 방법.
  20. 샘플 내에 포함된 물체의 삼차원 이미징을 수행하는 방법으로서,
    이미지 센서에 인접 배치된 흐름 셀을 통해 샘플을 흐르게 하는 단계;
    상기 샘플을 부분 간섭성 광 또는 간섭성 광을 방출하는 조명 소스를 이용하여 제1 각도에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 애퍼처, 광섬유 케이블 또는 광 도파관 중 적어도 하나를 통과함 -;
    상기 이미지 센서를 이용하여 상기 제1 각도에서 이동하는 샘플 내의 상기 물체의 복수의 이미지 프레임을 획득하는 단계;
    상기 샘플을 상기 조명 소스를 이용하여 하나 이상의 상이한 각도에서 조명하는 단계 - 상기 광은 상기 샘플을 조명하기 전에 상기 애퍼처, 광섬유 케이블 또는 광 도파관 중 적어도 하나를 통과함 -;
    상기 이미지 센서를 이용하여 상기 하나의 이상의 각도에서 상기 이동하는 샘플 내의 상기 물체의 복수의 이미지 프레임을 획득하는 단계;
    상기 제1 각도 및 하나 이상의 상이한 각도들에서 획득된 상기 복수의 이미지 프레임으로부터 상기 물체의 초고해상도 투영 홀로그램을 디지털 방식으로 재구성하는 단계;
    상기 제1 각도 및 상기 하나 이상의 상이한 각도에서 획득된 상기 초고해상도 투영 홀로그램들에 기초하여 상기 샘플 내의 상기 물체의 복합 투영 이미지들을 디지털 방식으로 재구성하는 단계; 및
    상기 복합 투영 이미지들을 상기 샘플 내의 상기 물체의 삼차원 단층 사진들로 디지털 방식으로 재구성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 복합 투영 이미지들은 상기 복합 투영 이미지들의 필터링된 후방 투영을 통해 삼차원 단층 사진들로 디지털 방식으로 재구성되는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 흐름 셀은 이미징 센서 어레이에 대해 경사진 방법.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 제1 각도 및 하나 이상의 상이한 각도들은 약 -89도와 +89도 사이의 범위 내에 있는 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 제1 각도 및 하나 이상의 상이한 각도들은 흐름 방향에 대해 약간 경사진 호를 따라 위치하고, 약 -89도와 +89도 사이의 범위 내에 있는 방법.
  25. 제20항에 있어서,
    상기 제1 각도 및 하나 이상의 상이한 각도들은 흐름 방향에 대해 수직인 호를 따라 위치하고, 약 -89도와 +89도 사이의 범위 내에 있는 방법.
  26. 제20항에 있어서,
    상기 하나 이상의 상이한 각도들은 삼차원 형상의 표면을 따르는 상이한 각도들을 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 형상은 구 또는 타원체를 포함하는 방법.
  28. 휴대용 단층 촬영 이미저로서,
    샘플을 내부에 유지하도록 구성된 샘플 홀더를 포함하는 하우징;
    상기 샘플의 제1 측면에 대해 다양한 각도로 상기 하우징 내에 배치된 복수의 부분 간섭성 또는 간섭성 광원 - 상기 복수의 광원 각각은 각각의 도파관들에 결합됨 -;
    상기 복수의 광원에 기능적으로(operatively) 접속된 마이크로컨트롤러 - 상기 마이크로컨트롤러는 개별 광원들을 선택적으로 활성화하도록 구성됨 -;
    상기 도파관들을 실질적으로 직교하는 방향들로 이동시키도록 구성된 전자기 액추에이터; 및
    상기 샘플의 제2 대향 측면에서 상기 하우징 내에 배치된 이미지 센서
    를 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 도파관들과 상기 샘플 사이에 삽입된 컬러 필터를 더 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 하우징 내에 배치된 하나 이상의 배터리들을 더 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 복수의 부분 간섭성 광원은 LED들 또는 레이저 다이오드들을 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  32. 휴대용 단층 촬영 이미저로서,
    샘플을 내부에 유지하도록 구성된 샘플 홀더를 포함하는 하우징;
    상기 샘플의 제1 측면에 대해 다양한 각도로 상기 하우징 내에 배치된 복수의 부분 간섭성 또는 간섭성 광원 - 상기 복수의 광원 각각은 각각의 공간 애퍼처들에 결합됨 -;
    상기 복수의 광원에 기능적으로 접속된 마이크로컨트롤러 - 상기 마이크로컨트롤러는 개별 광원들을 선택적으로 활성화하도록 구성됨 -;
    상기 공간 애퍼처들을 실질적으로 직교하는 방향들로 이동시키도록 구성된 전자기 액추에이터; 및
    상기 샘플의 제2 대향 측면에서 상기 하우징 내에 배치된 이미지 센서
    를 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 공간 애퍼처들과 상기 샘플 사이에 삽입된 컬러 필터를 더 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 하우징 내에 배치된 하나 이상의 배터리들을 더 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
  35. 제32항에 있어서,
    상기 복수의 부분 간섭성 광원은 LED들 또는 레이저 다이오드들을 포함하는 휴대용 단층 촬영 이미저.
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