KR20140034753A

KR20140034753A - 칼레빈 ａ의 항-비만 가능성

Info

Publication number: KR20140034753A
Application number: KR1020137021079A
Authority: KR
Inventors: 무하메드 마제에드; 안잘리 판데이
Original assignee: 무하메드 마제에드
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2014-03-20
Also published as: CA2851717A1; RU2013137221A; WO2013109241A1; RU2543334C1; US8933121B2; US8577013B1; KR101702702B1; US20130012579A1

Abstract

본 발명은, 지방생성(adipogenesis)을 저해하는데 있어서 칼레빈 A(Calebin A)의 가능성 및 비만 관리에서 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하게 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체 조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증을 저해하는 것을 포함한다.

Description

칼레빈 Ａ의 항-비만 가능성{ANTI-OBESITY POTENTIAL OF CALEBIN A}

본 출원은, 2011년 1월 10일에 출원된 가출원 제61/431157호의 비-가출원(non-provisional filing)이다.

본 발명은 일반적으로 비만 관리를 위한 약제(medicament)에 관한 것이다. 보다 명확하게, 이는 칼레빈 A(Calebin A)의 항-비만 가능성(anti-obesity potential)에 관한 것이다.

비만은 산업화된 국가에서 가장 일반적인 영양 장애(nutritional disorder)이고, 개발도상국에서 점점 커지는 문제이다. 이는 전세계적인 유행으로서 기재되어 있고, 과체중 및 비만인 개인(25 이상의 BMI)은, 다양한 육체적인 질병 및 우울증, 식이장애 및 낮은 자긍심(low self esteem)과 같은 심리적인 문제에 대한 위험을 증가시킨다. 심장혈관계 질병, 진성당뇨병(diabetes mellitus), 골관절염(osteoarthritis), 폐쇄성 수면무호흡증(obstructive sleep apnea) 및 암과 같은 다양한 질병과 관련되어 있다. WHO는, 전세계적으로 예방할 수 있는 죽음의 10 위의 원인 중의 하나일 수도 있는 것으로 비만을 고려하고 있다.

비만에서, 세포 당 세포질의 트리글리세리드의 증가된 양의 침전(deposition) 및/또는 지방생성의 과정을 통해 새로운 지방 세포(new fat cells)[지방세포(adipocytes))]의 생성 때문에 지방 조직 덩어리(adipose tissue mass)가 증가하고 있다. 지방 세포는, 내부적으로 생산된 지질 방울이 단일의 큰 덩어리(single large mass)로 합져짐으로써 발달된다. 결국, 셀룰라이트는 스킨 피부(skin dermis) 아래의 지방세포의 덩어리(chunk)의 축적 및 증가된 지방생성(enhanced adipogenesis) 때문에 발생된다.

지방생성의 연구는, 사람에서의 이러한 과정의 처리가 비만 및 당뇨병의 책임을 감소시키는 것으로 유도될 수 있는 희망으로 진행되고 있다. 분자의 수준에서, 몇몇의 마커는, 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), TNF-α등과 같은 비만을 치료하는데 타겟이 되고 있다.

약물이 상기 질환에 가능할지라도, 비만 및 이의 관련된 사회-경제적인 결과(its related socio-economic consequences)를 관리하는데 도움을 주기 위해, 안전한 천연의 접근법을 탐구하고, 이에 대한 끊임없는 필요가 있다.

칼레빈 A 는, β-아밀로이드 공격(β-amyloid insult)으로부터 뉴런 세포를 보호하는 것으로 알려져 있고(Park SY et al, J Nat Prod. 2002 Sep; 65(9):1227-31), 약물 저항성 인간 위장 암 세포에서의 MAPK 패밀리 활동성을 조절하고, 아포토시스를 유도한다(Li Y et al, Eur J Pharmacol . 2008 Sep 4; 591(1-3):252-8). Zeng Y et al.(Chem Pharm Bull (Tokyo) 2007 Jun; 55(6):940-3)에는, 두 가지의 신규한 칼레빈 유도체, 4''-(4'''-히드록시페닐-3'''-메톡시)-2''-옥소-3''-부테닐-3-(4'-히드록시페닐)-프로페노에이트 및 4''-(4'''-히드록시페닐)-2''-옥소-3''-부테닐-3-(4'-히드록시페닐-3'-메톡시)-프로페노에이트가 기재되어 있다.

본 발명은, 지방 세포(adipocytes)[지방 세포(fat cells)]의 말기 분화(terminal differentiation) 동안에 지방 축적을 예방하기 위한 칼레빈 A의 가능성 및 비만 관리에서 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하게 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체 조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증을 저해[inhibiting local (adipocyte) and systemic inflammation caused by pro-inflammatory cytokines Tumor Necrosis Factor (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) and Interleukin-1 (IL-1β)]하는 것을 포함한다.

이에 따라서, 칼레빈 A의 항-비만 가능성을 나타내기 위한 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명은 상기의 원리의 목적을 이행하고, 추가적으로 관련된 장점을 제공한다.

본 발명의 요약

본 발명은, 지방 생성(adipogenesis)을 저해하는데 있어서 칼레빈 A의 가능성 및 비만 관리에서의 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은, 포유동물에서 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하기 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증을 저해하는 것을 포함한다.

본 발명의 그 밖의 특성 및 장점은, 본 발명의 원리가 예로서 설명된, 첨부된 도면과 첨부되어 설명된, 하기의 보다 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1 은, 오일-레드-0-염색 방법(Oil-Red-O-Staining method)에 의해 연구된 바와 같이, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 초래된 퍼센트 지방생성 저해(percentage adipogenesis inhibition)의 그래프적인 표현(graphical representation)을 나타낸 것이다.
도 2 는, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 초래된 인간 지방세포(human adipocytes)에서 렙틴 생산의 퍼센트 저해(percentage inhibition)의 그래프적인 표현을 나타낸 것이다. P 수치 * : <0.01; ** : <0.001.
도 3 은, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 초래된 인간 지방세포에서 아디포넥틴 발현의 퍼센트 증가(percentage increase)의 그래프적인 표현을 나타낸 것이다. P 수치 * : <0.01.
도 4 및 5 는, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 초래된 인간 지방세포에서 각각의 TNF-α 발현(P 수치 *: < 0.01; ** : <0.001) 및 IL-6 발현(P value * : < 0.01)의 퍼센트 저해의 그래프적인 표현으로 나타낸 것이다.
도 6 은, 처리된 스위스 알비노 마우스(treated Swiss Albino mice)로부터의 혈청에서 TNF-α 및 IL-1β의 발현에서 칼레빈 A의 다중 투여(multiple dose)의 효과를 그래프적인 표현으로 나타낸 것이다. 동물의 수(No. of animals)= 그룹 당 6 마리, P-수치 : * < 0.01; ** < 0.001 students't' test.
도 7 은, 처리된 스위스 알비노 마우스로부터의 혈청에서 IL-6의 발현에서 칼레빈 A의 다중 투여의 효과를 그래프적인 표현으로 나타낸 것이다. 동물의 수(No. of animals)= 그룹 당 6 마리, P-수치 : * < 0.01; ** < 0.001 students't' test.

본 발명은, 지방세포(adipocytes)[지방 세포(fat cells)]의 말기 분화 동안에 지방 축적을 예방하기 위한 칼레빈 A의 가능성 및 비만 관리에서 이의 적용을 나타낸 것이다. 본 발명은, 비만과 관련된 생화학적 마커를 유리하게 조절하기 위한 칼레빈 A의 가능성을 설명한 것이다. 칼레빈 A의 주목할 만한 생체조절 특성은, 렙틴 생산을 저해하고, 아디포넥틴 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 종양 괴사 인자(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1(IL-1β)에 의해 유발되는 국소(local)(지방세포) 및 전신성 염증을 저해하는 것을 포함한다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 지방생성을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉하는 단계를 포함한다. 다시 말해서, 본 발명은, 포유동물의 지방세포의 말기 분화 동안에 지방의 축적을 예방하는 방법에 관한 것이다. (도 1).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 지방 세포에서 렙틴 발현을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉하는 단계를 포함한다. (도 2).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 지방세포에서 아디포넥틴의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. (도 3).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 지방세포에서 전-염증성 사이토카인 TNF-α 발현을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. (도 4).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 지방세포에서 전-염증성 사이토카인 인터류킨-6 발현을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A와 상기 지방세포를 접촉하는 단계를 포함한다. (도 5).

특정한 실시형태에서, 본원에 나타낸 상기 지방세포는 인간 지방세포이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 포유동물에서 전-염증성 사이토카인의 전신성 발현 유도된 비만을 감소시키는 방법에 관한 것이고(the present invention relates to a method of reducing obesity induced systemic expression of pro-inflammatory cytokines in mammals), 상기 방법은 유효량의 칼레빈 A를, 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 이러한 단란에서 본원에 나타낸 상기 전-염증성 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터류킨-6(IL-6) 및 인터류킨-1β(IL-1β)를 포함한다. [도 6 및 7].

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 비만 관리의 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 유효량의 칼레빈-A를 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 피검자는 포유동물이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 피검자는 인간이다.

항-비만 분자로서 칼레빈 A의 잠재적인 치료 가치는 하기의 본원에 설명된 특정한 실시예를 통해 이해될 수도 있다.

실시예 Ⅰ

칼레빈 A의 심각한 경구 독성( Acute Oral Toxicity )

표 Ⅰ은 칼레빈 A의 심각한 경구 독성을 위해 연구된 파라미터를 나타낸 것이다.

결과 : 2 주까지의 관찰에서 마우스에서 2000 mg/kg p.o.까지 어떠한 사망(mortality)도 관찰되지 않았다.

[표 Ⅰ]

실시예 Ⅱ

지방 생성 배양( adipogenic cultures )의 오일- 레드 -0-염색( Oil - Red -O-Staining) 및 ELISA 에 의한 렙틴 , 아디포넥틴 , TNF -α 및 IL -6의 평가

지방 세포의 말기 분화는, 보다 큰 세포질의 소포(large cytoplasmic vesicles)에서 많은 양의 지질의 축적에 의해 수반된다. 세포 배양에서 지방세포의 분화를 측정하기 위한 일반적인 검정은, 염료 오일 레드-0(Oil Red-O, ORO)로 수행된다. ORO는 지방세포 분화[지방생성(adipogenesis)]의 신뢰할 수 있는 표시자(reliable indicator)인 지용성 선명한 적색이다.

원리:

오일 레드 O(용매 레드 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125, 및 C26H24N4O)가, 파라핀 절편(paraffin section) 상에 몇몇의 리포단백질 및 동결 절편(frozen sections) 상에서 중성 트리글리세리드 및 지질의 염색(staining)을 위해 사용된 용성색소(lysochrome)[지용성 염료(fat-soluble dye)] 디아조 염료(diazo dye)이다. 이는 518(359)nm에서 최대 흡수를 갖는 레드 분말(red powder)의 출현을 갖는다(It has the appearance of a red powder with maximum absorption at 518(359) nm). 오일 레드 0는 Sudan 염색(Sudan staining)에 사용된 상기 염료 중의 하나이다. 유사한 염료는 Sudan III, Sudan IV, 및 Sudan Black B을 포함한다. 상기 염색은, 알코올 고정화(alcohol fixation)가 상기 지질을 제거한 바와 같이, 신선한 샘플 상에서 수행되어야 한다. 오일 레드 0는, 이는 보다 짙은 레드 색깔을 제공하는 바와 같이, Sudan III 및 Sudan IV로 대체로 교체되고, 따라서 상기 염색은 보는 것을 보다 쉽게 한다.

오일 레드 0는 유용성 염료(oil soluble dye)이다. 유용성 염료(Oil soluble dyes)는, 보통의 히드로 알코올성 염료 용매(hydro alcoholic dye solvents)에서 보다, 상기 조직/세포에서 지질 물질에서 상기 염료의 보다 높은 용해도(solubility)를 나타낸다. 이런 이유로, 이는 상기 세포를 짙게 염색할 것이다.

방법론( Methodology ):

3T3-L1 세포 대략 60 X 104 세포는, 70 내지 80 % 합류(confluence)를 얻기 위해 48 내지 72 hrs 동안 접종된다(seeded). 48 hrs 후에, 신선하게 제조된 200 μl의 AIM[지방생성 유도 배지(Adipogenesis induction medium)]이 첨가된다. 72 hrs 후에, 상이한 농도에서의 상기 테스트 화합물과 함께 200 μl의 APM[지방생성 진행 배지(Adipogenesis progression medium)]가 상기 웰에 첨가된다. 상기 세포는, 5 % CO2 및 95 % 공기의 습기있는 대기(humidified atmosphere)(370 C)에서 48 hrs 동안 배양된다. 상기 상청액(supernatant)이 수집되고, ELISA에 의해 렙틴, 아디포넥틴, IL-6 및 TNF-α의 평가를 위해 저장된다. 세포는 100 μl의 10 % 포르말린을 첨가함으로써 고정되고, ORO 염색이 수행된다. OD는 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)에서 492 nm에서 판독된다. 상기 결과는 Graphpad prism 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀ 수치로서 표현된다.

지방생성의 저해의 퍼센트는 하기한 바와 같이 계산된다:

이 식에서,

C - 분화하는/분화하지 않는 세포(differentiating/undifferentiated cells)에서 오일 레드 0의 흡광도(absorbance)

T - 샘플 처리된 분화하는/분화하지 않는 세포에서 오일 레드 0의 흡광도. 렙틴, 아디포넥틴, IL-6 및 TNF-α의 평가는, R&D Systems으로부터의 사용자의 매뉴얼에 따라 수행된다.

참고문헌 :

1. Wu Z, Xie Y, Morrison RF, Bucher NLR, Farmer SR 1998. PPARγinduces the Insulin-dependent Glucose Transporter GLUT4 in the absence of C/EBP□ during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes. J Clin Invest. 101:22-32.

2. A pre-adipose 3T3 cell variant highly sensitive to adipogenic factors & to human growth hormone. LA Salazar-Olivo, F Castro-Munozledo & W Kuri-Harcuch. Department of Cell Biology, Centro de Investigation y de Estudios Avanzados del I.P.N., Mexico D.F., Mexico. Journal of Cell Science, Vol 108, Issue 5 2101-2107.

3. A Nuclear Receptor Atlas: 3T3-L1 Adipogenesis. Mingui Fu, Tingwan Sun, Angie L. Bookout, Micheal Downes, Ruth T. Yu, Ronald M. Evans and David J. Mangelsdorf. Molecular Endocrinology 19 (10): 2437-2450.

4. Aimee D, Kohn etal, JBC, Vol 271, No. 49, pp-31372-31378.

결과 :

도 1은, 오일-레드-0-염색 방법(Oil-Red-O-Staining method)에 의해 연구되는 0.5, 1.0, 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 영향을 받아 각각 32.43 %, 38.59 % 및 35.8 %의 퍼센트 지방 생성 저해를 나타낸 것이다.

도 2 는, 0.5, 1.0, 2.0 ㎍/ml의 농도로 칼레빈 A에 의해 인간 지방세포에서 렙틴 생성의 퍼센트 저해(각각 34.92 %, 41.04 % 및 39.48 %)를 나타낸 것이다. 하기의 사실로부터 비만 관리 흐름(obesity management stems)에 대한 인간 지방세포에서 렙틴의 생성의 저해에 있어서 칼레빈 A의 효과 및 이의 연관성의 중요성(The importance of the effects of Calebin A in inhibiting leptin production in human adipocytes and correlation thereof to obesity management stems from the following facts)[Colorado State University, 내분비 기관의 병리생리학(Pathophysiology of the Endocrine System)을 참고하라].

렙틴은 지방세포에서 대부분 발현되는 단백질 호르몬이다. 이는, 몸무게, 대사(metabolism) 및 생식기능(reproductive function)을 조절하는데 있어서 중요한 효과를 갖는다. 상기 비만(obese)(ob) 유전자에 의해 코드되는(Encoded), 상기 단백질은 질량으로 대략 ~ 16 kDa이다. 정상의 농도에서, 렙틴의 생물학적 기능은, 배고픔, 식욕, 체온의 조절 및 에너지 대사를 조절하는 상기 뇌의 시상하부 중심(hypothalamic centers)에서의 이의 효과에 대부분 귀속된다. 따라서, 비-비만형 개체(non-obese individual)에서 렙틴은, 두 가지 중요한 매커니즘에 의해 체중 손실을 유발할 수 있다 : (ⅰ) 섭식 행동(feeding behavior)을 조절하는 신경펩티드 Y(neuropeptide Y)의 저해를 통해 가장 가능성이 있게 배고픔 및 음식 소비에서의 감소, 및 (ⅱ) 증가된 체온, 산소 소비 및 지방 조직 덩어리의 손실을 통해 에너지 소비에서의 증가. 그러나, 유도된 비만의 실험용 모델(experimental models) 또는 비만의 경우에서와 같이 렙틴의 과잉 분비(excessive secretion)는,비만 피검자가 포만(satiation)을 이루는데 실패하고, 섭식 방식(feeding mode) 상에서 근거로 하는 경향이 있는, 시상하부 중심의 분열된 기능(disrupted functions)을 유도한다. 이런 이유로, 이는 비만에서 과잉 레벨의 렙틴의 효과적인 감소를 유도하기 위해 반드시 해야하고, 칼레빈 A는 도 2에서 나타낸 바와 같은 이러한 영역에서 가능성(promise)을 나타낸다.

도 3은, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의한 인간 지방세포에서 아디포넥틴 발현의 퍼센트 상승(percentage enhancement)(각각 27.12 %, 34.06 % 및 32.8 %)을 나타낸 것이다. 아디포넥틴은 지방세포에 의해 대부분 독점적으로(exclusively) 생산된 사이토카인이고, 지방이 적고(lean) 건강한 개체에 의해 매우 높은 레벨로 발현된다. 그러나, 비만인 개체(Obese individuals)는 이러한 아디포킨(adipokine)의 감소된 레벨을 발현하고, 관동맥성 심장병(coronary heart disease, CAD), 진성 당뇨병 및 고혈압에 걸리기 쉽다.

참고문헌

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3. Iwashima Y, Katsuya T, Ishikawa K, et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension. 2004; 43(6):1318-1323;

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5. Lindsay RS, Funahashi T, Hanson RL, et al. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population. The Lancet. 2002; 360(9326):57-58.

인간 지방세포에서 아디포넥틴의 레벨이 효과적으로 증가됨을, 칼레빈 A 는 나타낸 것이고(도 3), 따라서 비만 관리의 영역에서의 가능성을 나타낸다.

도 4 및 5 는, 0.5, 1.0 및 2.0 ㎍/ml의 농도에서 칼레빈 A에 의한 TNF-α(각각 36.03 %, 40.81 % 및 45.47 %) 및 IL-6 (각각 21.31 %, 32.37 % 및 31.7 %)의 퍼센트 저해를 나타낸 것이다. Bastard JP et al, "Recent Advances in the relationship between obesity, inflammation and insulin resistance", Eur Cytokine Netw. 2006 Mar;17(1):4-12는, 비만이 백색 지방 조직(white adipose tissue, WAT)의 저등급 염증(low-grade inflammation)과 관련됨을 인용하였다. 상기 저자는, 비만에서, WAT 상에서 뿐만 아니라, 상기 몸의 다른 전신 기관(systemic organs) 상에서 TNF-α 및 IL-6와 같은 전-염증성 분자의 증가된 발현에 의해 특징지어짐을 또한 언급하였다. 도 4 및 5 는, 칼레빈 A 가 지방세포에서 TNF-α 및 IL-6 발현을 감소시키는데 효과적이고, 이는 비만에서 국소 및 전신성 염증의 효과를 조절하기 위한 유용한 제제일 수 있음을 나타낸다.

실시예 Ⅲ

칼레빈 A에 의한 전신성 염증의 조절

본 발명자는 또한, 쥣과 호중구 시스템(murine neutrophil systems)에서 세포외 IL-1β 및 세포내 TNF를 억제하기 위해 칼레빈 A의 능력을 지지하기 위한 추가적인 증거를 제시하였다(표 Ⅱ, 표 Ⅲ). 호중구는, 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)와 함께 생체외 TNF-α 다음 자극을 생산하기 위해, 이들의 능력에 대해 테스트된 히스토파퀴 기울기 방법에 의해 분리된다(Neutrophils are isolated by histopaque gradient method tested for their ability to produce in vitro TNF-α following stimulation with Lipopolysaccharide (LPS)). 상기 세포는, 어둠 속에서 피코에리트린(phycoerythrin)(PE)-표지된 항-마우스 TNF-α와 함께 배양되고, 멸균 PBS와 세척된 후에, 샘플은 PBS (pH 7.4)에서 재현탁되고, 흐름 세포계산기(flow cytometer)(BDLSR; Becton Dickinson)에서 직접적으로 수득된다. 형광 트리거(fluorescence trigger)는, 제어된 호중구 개체군(the gated neutrophil populations)[10,000 사건(events)]의 상기 PE(FL1) 파라미터 상에서 놓여진다. 100 ㎍/ml에서의 로리프램(Rolipram)은 이러한 연구에서 TNF-α의 표준 저해제로서 사용되었다. 형광 보상(Fluorescence compensation), 데이터 분석, 및 데이터 제시(data presentation)는 Cell Quest Pro 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 수행되었다.

참고문헌

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[표 Ⅱ]

[표 Ⅲ]

본 발명자는, 처리된 마우스(생체내 모델)로부터의 혈청에서 세포외 TNF-α, IL-1베타[도 6] 및 IL-6[도 7]의 발현을 감소시키기 위해, 칼레빈-A의 능력에서의 연구 데이터를 또한 추가적으로 제시하였다. 6 내지 8 주된 스위스 알비노 수컷 마우스는 12/12h 주야 주기(12/12 h light dark cycle)에서 22 ± 2 ℃에서 유지되었다. 마우스는 6 일 동안 단계별로 다른 투여량(graded doses)(w/v)으로 테스트 약물의 경구 처리를 받은 다음에, Brieva A, Guerrero A, Alonso-Lebrero J L and Pivel JP. 2001에 의해 기재된 방법에 따라 1 mg/kg의 LPS의 정맥내 주사를 받는다. 이무노페론(Inmunoferon), 천연의 기원의 당결합체(glycoconjugate of natural origin)는 LPS-유도된 TNF-α 생산 및 염증성 반응을 저해한다. International Immunopharmacology 1, 1979-1987. 6 마리의 마우스는 각각의 그룹에서 사용되었고, 실험은 세 번 수행되었다. TNF-α, IL-1 베타 및 IL-6 생산은, LPS 주입 후에 90 min, 처리된 마우스로부터의 혈청에서 상업적인 ELISA 키트(R&D Systems)에 의해 평가되었다. 30 mg/kg에서의 로리프램은 표준 약물로서 사용되었다.

도 6 및 7은, 칼레빈 A가 TNF-α, IL-1베타 및 IL-6를 감소시키는데 효과적임을 나타내고, 따라서 상기 화합물은 비만에서 국소 및 전신성 염증의 효과를 조절하는데 유용한 화합물임을 나타낸다.

본 발명은 바람직한 실시형태에 관해 기재되어 있는 있으며, 이는 본 분야의 숙련자에 의해 명확하게 이해될 것이고, 본 발명이 이로 한정되지 않는다. 더 정확히 말하면, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구의 범위와 함께 해석될 것이다.

Claims

유효량의 칼레빈 A(Calebin A)와 지방세포(adipocytes)를 접촉시키는 단계를 포함하는, 지방생성(adipogenesis)을 저해하는 방법.
유효량의 칼레빈 A와 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 지방세포에서의 렙틴 발현(leptin expression)을 저해하는 방법.
유효량의 칼레빈 A와 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 지방세포에서 아디포넥틴(adiponectin)의 발현을 증가시키는 방법.
유효량의 칼레빈 A와 지방세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 지방세포에서 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 유도된 비만을 저해하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 전-염증성 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α)인 것인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 전-염증성 사이토카인은 인터류킨-6(IL-6)인 것인, 방법.
제1항 내지 제4항에 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지방세포는 인간 지방세포인 것인, 방법.
유효량의 칼레빈 A를, 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전-염증성 사이토카인의 전신성 발현(systemic expression) 유도된 비만을 감소시키는 방법.
제8항에 있어서,
상기 전-염증성 사이토카인은 종양 괴사 인자-α(TNF-α)인 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 전-염증성 사이토카인은 인터류킨-6(IL-6)인 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 전-염증성 사이토카인은 인터류킨-1β(IL-1β)인 것인, 방법.
유효량의 칼레빈-A를, 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만 관리(obesity management)의 방법.
제8항 또는 제12항에 있어서,
상기 피검자는 포유동물인 것인, 방법.
제8항 또는 제12항에 있어서,
상기 피검자는 인간인 것인, 방법.