KR20140032278A - 융합 펩타이드형 종양 억제제, 종양 진단제 및 그 제조방법 - Google Patents

융합 펩타이드형 종양 억제제, 종양 진단제 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

세포막 투과성이 우수한 융합 펩타이드형 종양 억제제, 종양 진단제 및 그 제조방법이 제공된다. 상기 종양 억제제는 서열 번호 3(cRGDyK-S-S-CPLHSpT)의 아미노산 서열을 가지진다. 여기서, 상기 종양 억제제는 PLHSpT 펩타이드(Pro-Leu-His-Ser-p-Thr, 서열 번호 1)와 cRGDyK 펩타이드(cyclic Arg-Gly-Asp- D-Tyr-Lys, 서열 번호 2)가 이황화 결합으로 연결된 융합 펩타이드인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은, 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 검출 가능한 표지(標識)가 결합된 종양 진단제를 제공한다.

Description

융합 펩타이드형 종양 억제제, 종양 진단제 및 그 제조방법{Fused peptide type tumor inhibitor, tumor diagnosing agent and method for preparing the same}
본 발명은 융합 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세포막 투과성이 우수한 융합 펩타이드형 종양 억제제, 종양 진단제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
폴로형 키나아제 1(Polo-like kinase 1, Plk1)은, 세포의 유사분열(有絲分裂, mitosis) 과정에서 세포주기(cell cycle progression)의 조절인자(regulator)로서, C-말단 폴로-박스 도메인(polo-box domain, PBD)이라고 불리는, 키나아제 활성을 조절하는 특징적인 결합부위(binding motif)를 가진다. Plk는 많은 종류의 종양(tumor, cancer cell)에서 과발현되므로(overexpressed), 암세포의 유사분열 억제 표적(antimitotic target)으로 고려되고 있다. 인간 Plk1의 폴로-박스 도메인(PBD)에 대한 강력하고 선택적인 억제제로서, Pro-Leu-His-Ser-p-Thr 포스포펩타이드(PLHSpT phosphopeptide, 서열 번호 1, 여기서, p-Thr은 인산화된(Phosphorylated, PO3H2 -) Thr을 나타낸다)가 알려져 있으며, 상기 PLHSpT 펩타이드는 암세포에서 유사분열을 중지시키고, 세포 사멸(apoptotic cell death)을 유도한다. 즉, PLHSpT 펩타이드는, 암세포에서 특이적으로 많이 발현되는 Plk-1 키나아제의 활성 조절 영역인 PBD 도메인에 강력히 부착되어 암세포의 세포분열을 억제한다(미국특허공개 20110104713호; Nat Struct Mol Biol. 2011 Apr, 18 (4):516 ; Nat Struct Mol Biol 2009, 16: 876-82 참조). 이와 같이, PLHSpT 펩타이드는 항암 효과가 우수하지만, 암세포(HeLa 세포 등)의 세포막(membrane)을 투과하지 못하므로(즉, 세포 내로 침투되지 못하므로), 항암 효과를 얻기 위해서는, 상기 펩타이드를 암세포로 직접 마이크로 주입(micro-injection)하여야 한다. 따라서, PLHSpT 펩타이드 그 자체로는 실용적인 항암제(cancer drug)로 사용되기 어려운 단점이 있다.
본 발명의 목적은, 세포막 투과성이 낮은 종래의 PLHSpT 펩타이드의 단점을 극복하여, 세포막을 투과성이 우수하며, 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 융합 펩타이드형 종양 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 암세포와 특이적으로 결합함으로써, 종양 영상을 획득할 수 있는 종양 진단제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 종양 억제제 및 종양 진단제의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 하기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 종양 억제제을 제공한다.
[서열 번호 3]
cRGDyK-S-S-CPLHSpT
여기서, 상기 종양 억제제는 PLHSpT 펩타이드(Pro-Leu-His-Ser-p-Thr, 서열 번호 1)와 cRGDyK 펩타이드(cyclic Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys, 서열 번호 2)가 이황화 결합으로 연결된 융합 펩타이드인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 검출 가능한 표지(標識)가 결합된 종양 진단제를 제공한다. 또한, 본 발명은, cRGDyK 펩타이드의 라이신(lysine) 측쇄에 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)를 결합시켜, SPDP-활성화된 cRGDyK를 제조하는 단계; 및 상기 SPDP-활성화된 cRGDyK를 CPLHSpT 펩타이드의 N-말단 시스테인(cysteine)에 결합시키는 단계를 포함하는, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 융합 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 종양 억제제는 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro)에서 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며, 방사선 입자로 라벨되어(radiolabeled) 종양의 진단을 위한 방사선 추적자로 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 융합 펩타이드형 종양 억제제가 체내에서 항암 효과를 나타내는 과정을 설명하기 위한 추정 모식도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 펩타이드의 합성 과정을 보여주는 도면.
도 3a는 인간 자궁경부암 세포를 cRGDyK, PLHSpT, cRGDyK-Asp-CPLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSPT로 처리한 후, 세포 생존율(cell viability)을 평가한 결과를 보여주는 그래프.
도 3b는 인간 교아종 세포 및 인간 자궁경부암 세포를 cRGDyK, PLHSpT, 및 cRGDyK-S-S-CPLHSPT로 처리한 후, 세포의 형태(morphology)를 보여주는 사진(배율: 200).
도 3c는 인간 자궁경부암 세포에 형광물질(FITC) 처리된 PLHSpT 및 cRGDyK- S-S-CPLHSpT를 첨가하고, 또한 인간 자궁경부암 세포의 세포핵을 DAPI로 염색한 다음, 세포의 PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT 흡수율을 형광현미경으로 관찰한 사진.
도 4a는 인간 교아종 세포 및 인간 자궁경부암 세포를 PLHSpT 및 cRGDyK-S- S-CPLHSpT로 처리한 후, Plk-1 키나아제 억제효과를 측정한 결과를 보여주는 그래프.
도 4b는 인간 교아종 세포 및 인간 자궁경부암 세포를 PLHSpT 및 cRGDyK-S- S-CPLHSpT로 처리한 후, 시간의 경과에 따른 Plk-1 키나아제 억제효과의 변화를 보여주는 그래프.
도 4c는 인간 교아종 세포 및 인간 자궁경부암 세포를 PLHSpT 및 cRGDyK-S- S-CPLHSpT로 처리한 후, 중심체(centrosome) 및 방추체(spindle) 상태를 보여주는 형광 현미경 사진.
도 5a는 인간 교아종 세포 및 인간 자궁경부암 세포를 cRGDyK, PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리한 후, PARP 분리도를 웨스턴 블롯으로 분석한 사진.
도 5는 인간 자궁경부암 세포를 FITC-cRGDyK, FITC-PLHSpT 및 FITC-cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리한 후, 세포 사멸을 FACS 분석한 결과를 보여주는 그래프.
도 6a는 종양 마우스를 PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처치한 후, 종양의 크기 변화를 보여주는 그래프.
도 6b는 종양 마우스를 PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처치한 후, 19일 후 종양 사진.
도 6c는 종양 마우스를 PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처치한 후, 19일 후 종양 조직을 염색한 결과를 보여주는 사진.
도 7은 종양 마우스를 PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처치한 후, 종양 조직을 Annexin V 및 프로피디윰 아이오다이드(PI)로 착색하여, 종양 세포의 사멸을 검출한 사진.
도 8a는 인간 교아종 세포 및 인간 자궁경부암 세포를 방사선 표지된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처치한 후, 시간 경과에 따른 세포 결합력을 평가한 결과를 보여주는 그래프.
도 8b는 종양 마우스를 방사선 표지된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처치한 후, 시간 경과에 따른 PET 스캐닝 결과를 보여주는 사진.
도 8c는 종양 마우스를 방사성 추적자(방사선 표지된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT)로 처치한 후, 방사성 추적자의 생체 내 분포를 보여주는 그래프.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 융합 펩타이드형 종양 억제제는 폴로형 키나아제 1(Plk1)의 폴로-박스 도메인(PBD)을 표적(targeting)으로 하는 종래의 암 치료제(cancer drug)를 개선한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 종양 억제제는, 하기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것으로서, 항암 효과를 가진 PLHSpT 펩타이드(Pro-Leu-His-Ser-p-Thr, 서열 번호 1)와 암세포를 특이적 및 선택적으로 표적화할 수 있는 cRGDyK 펩타이드(cyclic Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys, 서열 번호 2)를, 시스테인(cysteine, C)를 매개하여, 이황화 결합(disulfide bond)으로 연결시킨 것이다.
[서열 번호 3]
cRGDyK-S-S-CPLHSpT
상기 서열 번호 3의 종양 억제제는, Plk-1 키나아제의 활성을 억제하여 항암 효과를 나타내는 PLHSpT 펩타이드에, 인테그린 수용체 특이적 표적화와 세포내 이행(cell internalization)을 가능하게 함으로서, 암세포를 선택적으로 표적화할 수 있는 cRGDyK 펩타이드를 융합(결합)시킨 PLHSpT 유도체로서, 항암 효과가 우수할 뿐 만 아니라, 융합된 RGD 부분에 의해, 세포 내로 용이하게 이행(internalization) 또는 삽입되는 특징을 가진다. 본 발명에 따른 종양 억제제는, 상기 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 펩타이드 뿐만 아니라, 항암 효과 및 세포 내 이행성을 가지는 한, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 일부가 통상의 수법으로 치환, 결실 또는 변형된 변이체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
아르기닌-글리신-아스파테이트(arginine-glycine-aspartate, RGD) 펩타이드는 암세포에서 발현량이 증가하는 αvβ3 인테그린 수용체(integrin receptor) 억제제이다(Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis. Science 1994, 264: 569-71; Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v integrins. Science 1995, 270: 1500-2). 상기 αvβ3 인테그린은 고형 종양의 혈관계(vasculature)에 일반적으로 위치하는 세포 접착 단백질(cell adhesion protein)로서, 종양의 신생 혈관 형성 과정(angiogenesis)에서 발현된다. 따라서, αvβ3 인테그린은 종양을 표지하는(targeting) 유용한 바이오마커의 하나이다(Reevaluation of P-selectin and alpha 4 integrin as targets for the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2006, 176: 6225-34). 상기 RGD 시퀀스를 포함하는 펩타이드(αvβ3 인테그린 억제제 등)는, 종양 특이성 및 선택성 때문에, 종양의 이미지화를 통한 종양 진단용 조영제로서 사용되고 있으며, 높은 αvβ3 인테그린 결합력을 가지며, 세포막(cell membrane)을 통하여 세포 내부로 이행하는(internalized) 특성을 가지는 수용체 표적 펩타이드(receptor targeting peptide)이다(Nucl Med Biol 2004, 31:179-89; Bioconjug Chem 2004, 15: 41-9; Cancer Res 2002, 62: 6146-51). 이황화 결합(disulfide bond, -S-S-)에 기초한 약제 융합(bioconjugation)은 의약 전달 시스템에서 사용되는 약제의 결합 방식이다. 본 발명의 펩타이드 융합에 사용되는 이황화 결합은, 세포막을 통하여, 세포질(cytosol)로 약제 전달을 촉진하도록 가역적으로 결합-분리되어, 종양 특이적으로 분리되는(tumor specific cleavable) 특성을 가진다. 따라서, 본 발명의 융합 펩타이드에 있어서는, 세포의 목표 지점에 정확히 부착되어, 세포 내부로 이행한 다음 분리되어, 세포 내부 공간으로 약제를 방출하도록, 이황화 공유 결합이 사용된다.
도 1은 본 발명에 따른 융합 펩타이드형 종양 억제제가 체내에서 항암 효과를 나타내는 과정을 설명하기 위한 추정(hypothetical) 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 융합된 펩타이드(cRGDyK-S-S-CPLHSpT)는 αvβ3 인테그린 수용체(integrin receptor)를 매개하여(mediated) 세포막을 통과한 다음, 세포 내에서 효소(enzyme)에 의해 이황화 결합이 분리되어(enzymatic cleavage), 유리(free) CPLHSpT를 생성한다. 유리 CPLHSpT 펩타이드는 세포핵의 결합 위치(nuclear binding site)인 PBD 도메인으로 이송 및 결합되어, 세포 유사분열을 억제함으로서, 항암 효과를 나타낸다. 이를 좀 더 구체적으로 살펴보면, 본 발명의 cRGDyK-융합 펩타이드가 특정 종양으로 공급되면, αvβ3 인테그린 수용체(integrin receptor)와 결합하여 세포 내로 이동한다. 세포 내에서, 용합 펩타이드의 이황화 결합이 분리되어 CPLHSpT 포스포펩타이드와 cRGDyK 펩타이드가 분리되는 것으로 생각된다. 분리된 CPLHSpT 포스포펩타이드는 plk1의 PBD와 결합하여, 암세포 증식을 효과적으로 억제한다. 반면, 세포막 투과성이 불충분한 PLHSpT 펩타이드 또는 분리되지 않는 융합 펩타이드를 사용한 경우에는 암 세포의 증식 억제 효과를 보이지 않았다(실험예 1 참조). 따라서, PLHSpT 펩타이드 성분이 PBD를 억제하기 위해서는, PLHSpT 펩타이드 성분을 세포 내로 유도할 수 있는 분리 가능한 링커(cleavable linker)가 필요함을 알 수 있다.
본 발명에 따른 융합 펩타이드(PLHSpT 유도체)는, 암세포에서 발현이 증가하는 폴로형 키나아제 1(Plk1)의 PBD 도메인에 부착됨으로써, Plk-1 키나아제의 활성 및 암세포의 세포 분열을 억제하며, 암세포 및 종양 조직의 세포 사멸 기작(mechanism)에 의해 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 융합 펩타이드에 있어서는, PLHSpT의 세포 내 이행(전달)이 자발적이며, 세포 내로 이행된 PLHSpT에 의해 암세포의 진단과 치료가 효과적으로 수행되므로, 종양 표적의 선택성이 우수하다. 또한, 본 발명의 융합 펩타이드는 생체 내 독성이 작으므로, 암 치료제(항암제)로서 유용하며, 특히, 인간 신경교아종, 자궁경부암 등에서 우수한 진단 및 항암 효과를 나타낸다. 본 발명에 따른 융합 펩타이드는, 수용체를 매개하여(receptor mediated) 세포막을 투과하는 표적화된 약물 전달체(targeted drug delivery system)이다.
다시, 도 1을 참조하면, 분리된 잔기(cRGDyK 및 CPLHSpT)는 암세포 내에 갇혀 있으므로, 분리된 잔기가 방사선 입자로 라벨되어 있으면(radiolabeled), 암세포의 위치를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 펩타이드에 검출 가능한 표지(標識)를 결합(부착 또는 변성)시키면, 생체 내에 존재하는 암세포를 직접적으로 이미지화하여, 암(종양)을 효과적으로 진단할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 융합 펩타이드는 검출 가능한 표지와 결합됨으로서, 종양 진단제(종양 표적 방사성 추적자)로서 사용될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지(標識)로는 방사성 동위원소(예를 들면, 68Ga, 18F, 123I, 124I, 64Cu 111In 등), 형광발광체 등을 예시할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 상기 검출 가능한 표지는 NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid) 등의 매개(bridging) 화합물을 통하여, 상기 융합 펩타이드에 결합될 수도 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 융합 펩타이드를 방사성 동위원소로 표지시키고, 종양이 이식되어 있는 동물 꼬리 정맥에 주사한 다음, 양전자 단층촬영(positron emission tomography, PET) 등의 적절한 검출장치를 이용하여 방사성 동위원소를 검출하면, PET 영상으로부터, 체내에 분포하는 암세포의 이미지(종양 영상)를 획득할 수 있다. 본 발명에 따른 융합 펩타이드는, 방사성 동위원소 외에도, 형광발광체 등의 검출 가능한 다양한 다른 표지(標識)와 결합될 수 있으며, 또한, PET 외에도, 결합된 표지를 검출할 수 있는 다른 검출 장치로 종양의 광학 이미지를 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 융합 펩타이드는, 낮은 농도로 사용되는 경우에도, 종양의 진단 효과가 우수하다. 본 발명에 따른 융합 펩타이드는 Plk1의 PBD를 표적(targeting)으로 하므로, 68Ga 등으로 표지함으로서, 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 종양의 진단 및 확인에 유용하다.
본 발명에 따른 융합 펩타이드는 통상의 다양한 합성 방법으로 제조될 수 있다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 펩타이드의 합성 과정을 보여주는 도면이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 펩타이드(cRGDyK-S-S- CPLHSPT)를 합성하기 위해서는, 고체상 레진(solid-phase resin)에 필요로 하는 아미노산을 순차적으로 첨가하는 등의 방법으로, CPLHSpT 펩타이드를 준비한다. 한편, cRGDyK 펩타이드의 라이신(lysine) 측쇄에 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyl dithio)-propionate, SPDP)를 결합(conjugate)시켜, SPDP-활성화된 cRGDyK를 준비한다. 상기 SPDP-활성화된 cRGDyK를 상기 CPLHSpT 펩타이드의 N-말단 시스테인(cysteine)에 결합시키면 cRGDyK-S-S-CPLHSpT를 합성할 수 있다. 이와 같이, 이종 작용기를 가지는 결합제(heterobifunctional linker)로서 SPDP를 사용하여, cRGDyK의 라이신 잔기와 CPLHSpT의 시스테인 부분을 이황화 결합으로 연결시킨다. 이러한, 고체상(solid- phase) 펩타이드 반응에 의해, 서로 다른 기능을 가지는 2종의 펩타이드를 결합시키면, 펩타이드의 유기 합성에 수반되는 여러 가지 단점들을 회피할 수 있다.
이와 같이 합성된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT 융합 펩타이드에 통상의 방법으로 검출 가능한 표지(標識)를 부착하여, 방사성 추적자, 즉, 종양 진단제를 제조할 수 D있다. 예를 들면, cRGDyK-S-S-CPLHSpT 융합 펩타이드와 SCN-Bz-NOTA (2-(p-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triaceticacid, NOTA = 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)를 반응시켜, NOTA-cRGDyK-S-S- CPLHSpT를 합성하고, 상기 NOTA-결합된 펩타이드를 68Ga 등의 표지로 표지하여, 종양 진단을 위한 방사성 추적자를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 1종 이상의 담체와 함께 조성물로서 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀, 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 제제화될 수 있다. 본 발명에 따른 융합 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하지만, 예를 들어, 일일 투여량은 약 0.01 내지 500 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 50 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은, 서열 번호 3의 아미노산 서열(그 변이체를 포함한다)을 가지는 펩타이드를 유효성분으로서, 인간 또는 동물에 투여하는 종양의 치료 또는 억제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열(그 변이체를 포함한다)을 가지는 펩타이드를 검출 가능한 표지(標識)와 결합시킨 종양 진단제를 인간 또는 동물에 투여하고, 이를 검출하는 종양의 진단 방법을 제공한다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] cRGDyK-S-S-CPLHSPT 펩타이드의 합성
(1) 표준 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) 고체상(solid-phase) 프로토콜에 따라, 링크 아미드 레진(Rink amide resin)에 합성하고자 하는 아미노산을 순서대로 넣고, DMF(dimethyl formamide) 용액 속에서 반응시켜, CPLHSpT 펩타이드를 합성하였다(도 2 참조). 이때 펩타이드 결합 시약(coupling reagent)으로서, 4 당량의 HOBt (hydroxybenzotriazole), HBTU(O-benzotriazole-N,N,N,N' -tetramethyl uronium-hexafluoro-phosphate) 및 DIEA(diisopropylethylamine)를 넣고 반응을 수행하였다. 반응 후에는, TFA(trifluoroacetic acid) 용액으로 처리하여 레진(resin)과 펩타이드를 분리하고(cleavage), HPLC(high-performance liquid chromatography)를 이용하여, 수득된 펩타이드들로부터, 목적하는 펩타이드를 분리 정제하였다. MALDI-TOF 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)으로, 분리 정제된 펩타이드의 질량(mass)을 확인한 결과, CPLHSpT 펩타이드의 m/z = 736.3 이었다. 이와 유사하게 PLHSpT 펩타이드를 제조하였으며, 제조된 PLHSpT 펩타이드의 m/z = 632.62 이었다.
(2) DMSO(dimethyl sulfoxide) 용매 및 염기성 조건(DIEA)에서, 보호된-cRGDyK (62.5 mg, 63.5 mmoL, FutureChem사 제품, 한국)의 라이신(lysine) 측쇄에 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyl dithio)-propionate, SPDP; 25 mg, 80.0 mmoL)를 결합(conjugate)시켜, SPDP-활성화된 cRGDyK를 준비하였다. MALDI-TOF 질량 분석법으로, 분리 정제된 SPDP-활성화된 cRGDyK의 질량(mass)을 확인한 결과, m/z = 1181.60 이었다. DMF 용매 속에서, 상기 SPDP-활성화된 cRGDyK (37 mg, 31.3 mmoL)을 Fmoc-CPLHSpT (77 mg, 50.0 mmoL)의 N-말단 시스테인(cysteine)에 결합시켜 cRGDyK-S-S-CPLHSpT를 합성하였다. MALDI-TOF 질량 분석법으로, 분리 정제된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 질량(mass)을 확인한 결과, m/z = 1440.57 이었다.
[실시예 2] 68 Ga-표지된 방사성 추적자 합성
합성된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT(14 mg, 9.72 mmol) 및 SCN-Bz-NOTA (2-(p-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid trihydrochloride, NOTA = 1,4,7-triazacyclononane-N,N',N"-triacetic acid, 6 mg, 10.72 mmol)를 0.1 M 소듐 카보네이트 버퍼(pH 9.5)에서 반응시켜, NOTA-cRGDyK-S-S-CPLHSpT를 합성하고, HPLC로 정제 분리하였다. MALDI-TOF 질량 분석법으로, 분리 정제된 펩타이드의 질량(mass)을 확인한 결과, m/z = 1890.08 이었다. 상기 NOTA-결합된(conjugated or activated) 펩타이드를 68Ga으로 표지하여, 종양 진단을 위한 새로운 방사성 추적자를 제조하였다. 구체적으로, 68Ge/68Ga 생성기(generator system)로부터 68Ga를 용리(elute)하여 얻은 다음, 얻어진 68Ga 용액(74 MBq, 0.1N HCl 용액 0.8 mL)을 상기 NOTA-결합된 펩타이드(NOTA-cRGDyK-S-S-CPLHSpT)에 첨가하였다. 0.5 M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, 0.3 mL)을 넣어, 반응액의 pH를 6.0 내지 6.5로 조절하고, 실온에서 10 내지 20분 동안 반응시킨 다음, 반응 혼합물을 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 방법으로 분리 정제하여, 방사성 동위원소 68Ga가 표지된(labeled) 방사성 추적자(Radioligand compound) 화합물 68Ga-NOTA-cRGDyK-S-S-CPLHSpT를 얻었다. 반감기를 고려한(decay-corrected) 방사성 추적자 68Ga-NOTA-cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 수율은 대략 20 ~ 35% 였다. 68Ga는 68Ge/68Ga 생성기로부터 얻어지므로, 고가의 사이클로트론(cyclotron)을 사용하지 않고도, PET 스캐닝에 사용되는 방사성 동위원소(radioisotope)를 경제적으로 제조할 수 있다.
[실험예 1] cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 약효평가(XTT assay)
인간 자궁경부암(cervical cancer) 세포(HeLa 세포)를 96 웰 플레이트(well plate)에 각 웰(well) 당 1 x 103의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지, 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1X 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 용액을 사용하였다. 배양된 세포를 FBS가 포함되지 않은 배양액으로 세척한 다음, 각 웰(well)에, cRGDyK, PLHSpT, cRGDyK-Asp-CPLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSPT를 각각 1 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 및 100 μM의 농도로 첨가하고, 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 세포 증식 시약(Cell Proliferation Reagent)으로서 10 % XTT 용액(Sigma-Aldrich, 미국)을 첨가하고 4시간 동안 추가로 반응시켰다.
반응 후, 475 nm 파장에서 각 웰(well)의 발색 강도를 측정하여, 세포 생존율(cell viability)을 평가한 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 다른 펩타이드(cRGDyK, PLHSpT, cRGDyK-Asp-CPLHSpT)를 첨가한 경우와 비교하여, cRGDyK-S-S-CPLHSPT(도 3a의 1) 을 첨가한 경우, 종양 세포 생존율이 현저히 감소하였다. 특히, 75 μM 이상의 농도로 cRGDyK-S-S-CPLHSPT를 처리하였을 때, 종양세포의 생존율이 50% 이하로 나타났다. 한편, PLHSpT와 RGD가 Asp로 결합되어(linked) 분리되지 않는 cRGDyK-Asp-CPLHSpT 펩타이드의 경우, HeLa 종양 세포의 생존율이 비교군(PLHSpT)과 유사한 정도로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 펩타이드가 세포내 이동 특성과 암세포 증식 억제 특성이 우수함을 확인할 수 있다.
[실험예 2] cRGDyK-S-S-CPLHSPT의 약효평가 (Morphological assay)
인간 교아종 세포(human glioma cell, U87MG 세포) 및 인간 자궁경부암 세포(HeLa 세포)를 96 웰 플레이트(well plate)에 각 웰(well) 당 1 x 103의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM 배지, 10% FBS 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 용액을 사용하였다. 배양된 세포를 FBS가 포함되지 않은 배양액으로 세척한 다음, 각 웰(well)에, cRGDyK, PLHSpT, 및 cRGDyK-S-S-CPLHSPT를 각각 50 μM의 농도로 첨가하고, 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 새로운 배양액으로 교체하고, 광학현미경(IX81, Olympus Inc.)으로 각 세포를 관찰하였으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, cRGDyK-S- S-CPLHSPT로 처리한 경우(도 3b의 1), U87MG 및 HeLa 종양 세포가 급격히 데미지를 받아 세포의 형태(Morphology)가 원래의 세포 모양이 아닌, 세포 사멸의 단계의 형태를 나타내었다. 반면, cRGDyK 및 PLHSpT로 처리한 경우, 세포 사멸의 단계의 형태가 나타나지 않았다.
[실험예 3] 형광물질이 결합된 cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 세포 내 전달 효능 평가(형광 현미경)
인간 자궁경부암 세포(HeLa 세포)를 24 웰(well)에 각각 5 x 104의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM 또는 RPMI1640 배지, 10% FBS 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 용액을 사용하였다. 한편, PLHSpT 및 cRGDyK-S- S-CPLHSpT를 형광물질(FITC, 6-[fluorescein-5(6)-carboxamido]hexanoic acid)로 처리하여, 광학 프로브 물질(Optical probe, green)인 FITC-PLHSpT 및 FITC-cRGDyK-S-S-CPLHSpT를 제조하였다. 상기 배양된 세포를 각각 50 μM의 FITC-PLHSpT 및 FITC-cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리하고, 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 새로운 배양액으로 교체하고, 형광현미경 (fluorescence microscope IX81, Olympus Inc.)으로 각 세포를 관찰하였으며, 그 결과를 도 3c에 나타내었다. 또한, 배양된 세포의 세포핵(cell nuclei)을 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, blue)로 염색하고, 형광현미경 (IX81, Olympus Inc.)으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 3c에 함께 나타내었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, PLHSpT는 HeLa 종양 세포 내로 거의 섭취(uptake)되지 않는 반면, 융합 cRGDyK-S-S-CPLHSpT(도 3c의 1)는 HeLa 종양 세포 내로의 섭취가 확연히 증가하였다. 상기 결과로부터, cRGDyK의 결합으로 인하여 PLHSpT의 세포 내 섭취능이 증가함을 확인할 수 있다.
[실험예 4] cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 Plk-1 키나아제 억제효과 분석
인간 교아종 세포(U87MG 세포) 및 인간 자궁경부암 세포(HeLa 세포)를 각각 6 웰(well)에 각 웰(well) 당 5 x 104의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM 또는 RPMI1640 배지, 10% FBS 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 용액을 사용하였다. 배양 후, 각 웰(well)에, PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT를 각각 25 μM (U87MG) 및 50 μM(HeLa 세포)의 농도로 첨가하고, 24시간 동안 반응시켰다. 반응액을 PBS(phosphate buffer saline) 버퍼로 3차례 수세하고, Plk-1 키나아제 에세이 키트(CycLex Polo-like kinase 1 Assay/Inhibitor Screening Kit, MBL Inc., 일본)를 사용하여 키나아제 억제효과(A450: 450 nm에서의 흡광도)를 측정하였으며, 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 인간 U87MG 및 HeLa 암세포에 있어서, PLHSpT를 처리한 경우에 비해, cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리한 경우, Plk-1 키나아제 활성이 현저히 억제되었다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 인간 HeLa 및 U87MG 암세포를 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리한 경우, Plk-1 키나아제 활성은 시간의 경과에 따라 감소하다가, 24시간 이후에는 일정하게 유지되었다.
[실험예 5] cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 세포분열에 미치는 효과
인간 교아종 세포(U87MG 세포) 및 인간 자궁경부암 세포주(HeLa 세포)를 각각 6 웰(well)에 각 웰(well) 당 5 x 104의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM 또는 RPMI1640 배지, 10% FBS 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 용액을 사용하였다. 배양된 세포를 각각 50 μM의 FITC-PLHSpT 및 FITC-cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리하고, 12시간 동안 반응시켰다. 반응액을 PBS (phosphate buffer saline) 버퍼로 3차례 수세하고, 4 % PFA(paraformaldehyde)로 30 분간 고정한 다음, PBS 버퍼로 다시 3번 수세하였다. 다음으로, 반응액을 Plk-1 항체, DAPI 용액 및 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, PI) 용액으로 염색하고, 수세한 다음, 형광현미경 (IX81, Olympus Inc.)으로 각 세포의 분열 상태를 관찰하였으며, 그 결과를 도 4c에 나타내었다. 도 4c에 나타낸 바와 같이, cRGDyK-S-S-CPLHSPT로 처리된 세포는 다극 방추체(multipolar spindles) 및 오정렬된 염색체(misaligned chromosomes)를 가지며, 세포의 분열단계 중 유전자의 분열 단계를 지속시킴으로써, 종양 세포의 분화를 억제하였다. 따라서, cRGDyK-S-S- CPLHSPT는 Plk-1 활성을 억제시킴으로써, 세포 증식에 관여하는 신호 전달을 차단하여, 암세포의 증식을 억제함을 알 수 있다.
[실험예 6] cRGDyK-S-S-CPLHSpT의 세포 사멸 효과
(1) 웨스턴 블롯 에세이(Western blot assay)
인간 교아종 세포(U87MG 세포) 및 인간 자궁경부암 세포(HeLa 세포)를 각각 6 웰(well)에 각 웰(well) 당 2.5 x 104의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM 또는 RPMI1640 배지, 10% FBS 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 용액을 사용하였다. 배양된 세포를 각각 10 μM 농도의 cRGDyK, PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리하고, 24 시간 및 48 시간 동안 반응시켰다. 각각의 펩타이드로 처리된 종양 세포의 세포 사멸(apoptosis)을 확인하기 위하여, 각각의 종양 세포에 있어서, 세포 사멸 인자인 폴리(ADP-리보오스)폴리머라제(poly(ADP- ribose) polymerase, PARP)의 분리(cleavage) 패턴을 확인하였다. 구체적으로, PRO-PREP Protein Extraction Solution(iNtRON Biotech. Inc., 한국)을 이용하여, 배양된 종양 세포로부터 단백질을 추출한 다음, 추출된 단백질을 겔전기영동(gel electrophoresis)하고, 폴리비닐리덴플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인(membrane)에 이전하고, 항-PARP(anti-poly(ADP-ribose) polymerase, anti-PARP) 항체를 이용하여, 폴리(ADP-리보오스)폴리머라제(PARP)를 검출하였으며, 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 세포 사멸 인자 PARP는 세포사멸 과정에서 분리된(cleaved) PARP로 되므로, 분리된 PARP(PARP의 인산화율)를 정량함으로서, 세포 사멸의 정도를 확인할 수 있다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, PLHSpT로 처리한 종양 세포에 비해서, cRGDyK-S-S-CPLHSpT(도 5a의 1)로 처리한 종양 세포(U87MG 및 HeLa)에서, PARP의 분리도(cleavability)가 확연히 증가하였다. 특히, HeLa 세포에 있어서는, 24 시간 동안 반응시킨 경우에 비해서, 48 시간 동안 반응시킨 경우, PARP의 분리도가 증가하였다. 따라서, cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 처리한 U87MG 및 HeLa 세포의 세포 사멸이 시간 경과에 비례하는 PARP 분리(cleavage)에 의하여 확인되었다.
(2) FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석
인간 자궁경부암 세포(HeLa 세포)를 6 웰(well)에 각 웰(well) 당 5 x 104의 세포수로 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 배양액으로는 DMEM 또는 RPMI1640 배지, 10% FBS 및 1X 페니실린/스트렙토마이신 용액을 사용하였다. 배양된 세포를 FITC-cRGDyK, FITC-PLHSpT 및 FITC-cRGDyK-S-S-CPLHSpT로 각각 50 μM의 농도로 처리하고, 24 시간 및 48 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세포를 떼어내고, PBS로 3차례 수세 후, 4 % PFA(paraformaldehyde)로 30분간 고정하였다. 다음으로, FACS (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, 미국)를 이용해서 형광물질이 들어간 세포를 분석(FACS analysis)하였으며, 그 결과를 도 5b에 나타내었다. 도 5b에 있어서, 세포 사멸은 annexin V 및 PI 염색으로 측정되었으며, PBS가 대조군으로 사용되었다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 종양 세포의 세포 사멸 정도를 FACS 분석(analysis)를 통해 정량한 결과, 24 시간 반응 후, 세포 사멸 정도가 현저히 증가하였다.
[실험예 7] 체내에서의 cRGDyK-S-S-CPLHSpT 항암 효과
(1) 인간 자궁경부암 세포(HeLa 세포) 2 x 107 개를 Balb/c 누드(nude) 마우스의 표피에 주사하여 암을 유발하였다. 유발된 암의 폭 및 높이가 각각 7 mm 정도 되었을 때, PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT을 4 mg/kg의 농도로 3일 간격으로 15일간 마우스 꼬리 혈관에 주사하고, 그 후 19일 동안 암의 크기를 분석하였으며, 그 결과를 도 6a에 나타내었고, 관찰 시작 후 19일 후 종양의 사진을 도 6b에 나타내었다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, cRGDyK-S-S-CPLHSpT(도 6a의 1)을 주사한 결과 종양 조직의 성장이 현저히 억제된 반면, 아무것도 처리하지 않은 대조군(control)과 PLHSpT를 처리한 비교군에서는 암 조직이 지속적으로 성장하였다. 또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, cRGDyK-S-S-CPLHSpT(도 6a의 1) 처리된 마우스의 종양 크기는 PLHSpT 펩타이드로 처리된 마우스의 종양 크기에 비해서, 5배 정도 종양의 성장이 억제되었다. 또한, PLHSpT 및 cRGDyK-S-S-CPLHSpT을 주사하고 19일 후, 종양 조직을 5 μm 두께로 자르고, 헤마토실린-에오신 염색 프로토콜(Hematoxylin and Eosin(H&E) staining protocol)에 따라 종양 조직을 염색하였으며, 그 결과를 도 6c에 나타내었다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, cRGDyK-S-S-CPLHSpT은 종양 세포 증식(proliferation)을 억제하고, 세포 사멸을 촉진시킨 반면, PLHSpT로 처리된 종양 세포는 대조군(controls)과 마찬가지로 성장을 지속하였다.
(2) 상기 마우스 종양 세포의 세포 사멸을 확인하기 위하여, 상기 종양 조직을 FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit (Sigma-Aldrich, 미국)로 착색(green)하고(사멸 세포 검출), 세포핵(nucleus)의 DNA를 식별하기 위하여, 상기 종양 조직을 프로피디윰 아이오다이드(propidium iodide, PI, 세포핵의 DNA 검출)로 착색(red)하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 있어서, 사멸되지 않은 세포(Non-apoptotic cells)는 초록색 및 붉은색 형광이 약하거나 없는 것으로 표시되었고, 초기 사멸 세포는 오렌지색 또는 붉은색이 약하게 표시되고(녹색 형광이 약하거나 없음), 후기 사멸 세포 및 괴사 세포(necrotic cells)는 붉은색 형광만으로 표시된다. 도 7에 도시된 바와 같이, 대조군(control) 및 PLHSpT 처리된 조직에서는 Annexin V 양성 부분이 매우 작은 반면, 본 발명의 융합 펩타이드로 처리된 조직에서는 Annexin V 양성 부분이 매우 크므로(붉은색 또는 오렌지색), 본 발명의 융합 펩타이드가 세포 사멸에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
[실험예 8] 방사성 추적자의 생체외(In vitro) 및 생체내(in vivo) 시험
(1) 생체외(In vitro) 시험
실시예 2에서 합성한 68Ga-표지된 방사성 추적자(방사선으로 표지된 펩타이드, 68Ga-NOTA-cRGDyK-S-S-CPLHSpT)를 이용하여 종양을 진단하기 위하여, αvβ3 인테그린-양성(integrin-positive) 인간 교아종(U87MG) 세포 및 인간 자궁경부암(HeLa) 세포를 이용하였다. HeLa 세포는 10% FBS, 50 mg/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타민(glutamine)을 포함하는 DMEM 배지에서 배양되었고, U87MG 세포는 10% FBS 및 50 mg/mL 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 상기 세포들을 24-웰(well) 플레이트에 1 x 105 cells/well의 농도로 첨가하고, 상기 방사성 추적자와 함께 30, 60 및 120 분 동안 방치한 다음, 방사성 추적자의 생체 외(in vitro) 세포 결합력(cell binding affinity)을 평가하여, 그 결과를 도 8a에 나타내었다. 세포의 방사성 활성(radioactivity)은 NaI(Tl) γ 카운터(counter)로 측정하였다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, HeLa 암세포에 있어서, 30, 60 및 120 분에서의 종양 흡수율은 각각 전체 흡수율의 1.51 ± 0.03, 2.10 ± 0.13 및 3.10 ±0.20 % 이었다. U87MG 암세포에 있어서, 30, 60 및 120 분에서의 종양 흡수율은 각각 전체 흡수율의 1.49 ± 0.10, 1.35 ± 0.22 및 2.82 ± 0.15 %이었다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 암세포에서 방사성 추적자의 흡수율은 시간에 따라 증가하며, 이 결과는 방사성 추적자가 αvβ3 인테그린 수용체에 특이적으로 결합함을 의미한다.
(2) 생체내(in vivo) 시험
종양 마우스(tumor-bearing mice)에 있어서, 방사성 추적자의 PET 이미지를 얻기 위하여, 1 x 106개의 인간 교아종 세포(human brain glioma cancer cell, U87MG 세포)를 Balb/c 누드 마우스에 피하 주사하였다. 3주 후에 상기 마우스의 꼬리 정맥에 7.18 MBq의 방사성 추적자(68Ga-NOTA-cRGDyK-S-S- CPLHSpT)를 주입하고, 방사성 추적자 주입 후 30, 60 및 120분 후에 20분 동안 PET 스캐닝을 수행하여, 생체 내(in vivo) 68Ga-NOTA-cRGDyK-S-S-CPLHSpT 방사성 추적자 프로파일(PET 이미지)을 얻었으며, 그 결과를 도 8b에 나타내었다(화살표는 U87MG 종양을 나타낸다). 도 8b에 나타낸 바와 같이, 방사성 추적자의 흡수율은, 방사선 추적자 주입 후 1 시간 후에, 간 및 신장에서 최대였다.
종양 마우스에 있어서, 방사성 추적자의 생체 내 분포(biodistribution)를 확인하기 위하여, 1 x 106개의 U87MG 세포를 누드 마우스에 피하 주사하고, U87MG 세포 주사 후 20일 후, 종양 마우스의 꼬리 정맥에 3.7 MBq의 방사성 추적자를 주입하였다. 방사성 추적자 주입 후, 30, 60 및 120분에 마우스를 희생시켜, 장기(혈액, 뼈, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 종양 및 뇌) 샘플을 얻고, γ 카운터를 이용하여 각 장기의 방사성 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 8c에 나타내었다. 상기 방사성 활성은 조직 1그램 당 주입량(injected dose, ID)의 %로 나타내었다. 도 8c에 나타낸 바와 같이, 생체 내 분포(biodistribution) 연구에서, 방사선 표지된 단백질의 최대 흡수는 간 및 신장에서 관찰되었다.
방사성 추적자의 흡수율는 다른 조직보다 종양 조직에서 약간 높았으며, 주입 후 1시간 후에 최대였다. 종양의 방사선 추적자 흡수율은, 주입 후 30, 60 및 120 분에, 각각 1.02 ± 0.25, 3.40 ± 1.10 및 0.62 ± 0.05 %ID/g 이었고, 조직에 대한 종양의 방사선 추적자 흡수 비율(tumor-to-tissue ratio)은, 방사선 추적자 주입 후 30, 60 및 120분에 각각 2.55, 3.03, 및 1.81,이었다. 이상의 결과로부터, 방사선 추적자의 생체 내 분포는 PET 분석 결과와 상관 관계가 있음을 확인할 수 있다.
본 발명은, Biomaterials(Volume 33, Issue 29, Pages 6915-6925, journal homepage: www.elsevier.com/locate/biomaterials)에 "In vivo tumor imaging using polo-box domain of polo-like kinase 1 targeted peptide"이라는 제명으로, 2012. 06. 22 접수되어, 온라인(web) 공개되었으며, 상기 논문의 모든 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
<110> Korea Basic Science Institute <120> Fused peptide type tumor inhibitor, tumor diagnosing agent and method for preparing the same <130> PD10366 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> inhibitor for polo box domain of Polo-like kinase <400> 1 Pro Leu His Ser Thr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide for cell internalization <400> 2 Arg Gly Asp Tyr Lys 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tumor inhibitor <400> 3 Arg Gly Asp Tyr Lys Cys Pro Leu His Ser Thr 1 5 10

Claims (7)

  1. 하기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 종양 억제제.
    [서열 번호 3]
    cRGDyK-S-S-CPLHSpT
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 종양 억제제는 PLHSpT 펩타이드(Pro-Leu-His-Ser-p-Thr, 서열 번호 1)와 cRGDyK 펩타이드(cyclic Arg-Gly-Asp- D-Tyr-Lys, 서열 번호 2)가 이황화 결합으로 연결된 융합 펩타이드인 것인, 종양 억제제.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 종양은 인간 신경교아종 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 종양 억제제.
  4. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 검출 가능한 표지(標識)가 결합된 종양 진단제.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소 및 형광발광체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 종양 진단제.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 검출 가능한 표지는 매개 화합물을 통하여 결합되는 것인, 종양 진단제.
  7. cRGDyK 펩타이드의 라이신(lysine) 측쇄에 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)를 결합시켜, SPDP-활성화된 cRGDyK를 제조하는 단계; 및
    상기 SPDP-활성화된 cRGDyK를 CPLHSpT 펩타이드의 N-말단 시스테인(cysteine)에 결합시키는 단계를 포함하는, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 융합 펩타이드의 제조방법.
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