KR20140021534A - 백신으로서의 재조합 마이코박테리움 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백신으로서 사용하기 위한 재조합 마이코박테리움 세포에 관한 것이다.

Description

백신으로서의 재조합 마이코박테리움{Recombinant mycobacterium as a vaccine}
본 발명은 백신으로서 사용하기 위한 재조합 마이코박테리움 세포에 관한 것이다.
매년 2백만 명에 달하는 사람들이 결핵 (Tuberculosis, TB)으로 사망한다 (1). 결핵에 대해 유일하게 이용 가능한 백신은 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) 바실러스 칼메트-게린 (Bacillus Calmette-Guerin, BCG) 이며, 이는 1921년에 처음으로 인간에게 사용되었다 (2). 지금까지, 40억 용량의 BCG가 투여되어 왔고, 이는 BCG를 세계적으로 가장 널리 이용되는 인간 백신이 되게 하였다. 그러나, 여전히 결핵을 근절하지 못하고 있다. BCG 백신 접종은 유아의 결핵 뇌수막염 (tuberculous meningitis) 및 속립성 결핵 (miliary TB)을 예방한다. 그러나, 다른 형태의 결핵, 특히 청소년 및 성인의 폐결핵으로부터의 보호는 메타-분석에 의해서 강조된 바와 같이 결정적이 아니며, 성인의 0-80% 범위에서 보호 효능을 나타냈다 (5). 그러므로, 결핵에 대한 새로운 백신이 시급하게 필요하다. 현재, 임상 시험에서 결핵에 대한 새로운 백신접종 전략은 표준적인 BCG를 대체하기 위한 재조합 BCG 뿐만 아니라 서브유닛 백신 (subunit vaccine)과 BCG 프라임 (prime)을 추가접종 (booster)하기 위한 복제-불가능 바이러스성 벡터-기반의 백신을 포함한다 (6) (7).
방어의 근본적인 면역학적 기전의 확인은 결핵 예방을 위한 새로운 백신접종 전략의 합리적인 설계를 용이하게 할 수 있다. 게다가, 이러한 전략은 임상 결핵 백신 효능 시험에서 임상 결과들의 대리 결과변수 (surrogate endpoint)를 밝혀낼 수 있는, 방어적인 면역성을 나타내는 바이오마커를 밝혀낼 수 있었고, 이에 따라 그들의 기간을 단축시킬 뿐만 아니라 병행 시험에서 많은 숫자의 백신 후보들의 시험을 용이하게 하였다. 그러한 바이오마커들을 정의하기 위하여, 새롭게 감염된, 건강한 접촉자인 결핵 환자, 및 BCG-백신을 접종한 유아들에 초점을 맞춘 관찰연구들을 시작하였다 (8). 결핵에 대한 면역 반응에 관한 광범위한 연구에도 불구하고, 방어적인 기억의 기본적인 요소는 아직 설명해야 한다. BCG 백신접종 후, 항원-특이적인 기억 CD4 T 세포들은 면역지배적인 항원의 결핍으로 인하여 검출하기가 힘들다. 현재, 가장 널리 사용되는 바이오마커는 IFNγ를 생산하는 CD4 T 세포의 증가된 빈도에 기초한다. 증가하는 증거가 결핵에서의 방어의 상관변수로서 IFNγ의 값에 의문을 준다 (9, 10). 의심할 여지없이 IFNγ는 MTB에 대한 방어에서 중요한 역할을 수행하나 (11), IFNγ의 측정 단독으로는 방어적인 면역성의 신뢰할만한 마커로서 더 이상 생각할 수 없다.
포식용해소체 탈출 (phagolysosomal escape) 도메인을 발현하는 재조합 BCG 균주는 WO99/101496에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 포식용해소체 탈출 도메인은 식포 (phagosome)의 막에 구멍을 뚫음으로써 균주가 감염된 숙주 세포의 식포로부터 탈출할 수 있게 한다. 최적의 포식 탈출 활성을 위한 산성 포식 pH를 제공하기 위하여, 요소분해효소 (urease)-결핍 재조합 균주가 개발되었다. 이 균주는 WO2004/094469에 개시되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 포함된다.
리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes)의 막을 뚫는 리스테리오리신 (listeriolysin) (Hly)을 발현하고 요소분해효소 C가 결여된 재조합 Δu r eC Hly + rBCG (rBCG) 균주가 전임상 모델에서 부모 BCG (pBCG)와 비교하여 MTB에 의한 가스 발생성 시험접종 (aerogenic challenge)에 대한 더욱 우수한 방어를 유도한다 (12). 이 백신 구성은 1기 임상시험에서 안전성과 면역원성을 성공적으로 입증했으며 (US 61/384,375), 이외 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 발명에서는, rBCG와 pBCG가 뚜렷한 Th1 면역 반응을 유도하는 한편, 단지 rBCG만이 추가로 현저한 Th17 반응이 있는 것으로 나타났다. 또한, rBCG-백신접종된 마우스의 MTB 감염시 폐로 항원-특이적인 T 림프구를 더욱 빨리 동원 (recruitment)하는 것을 관찰하였다. 이러한 T 세포는 재자극 후 풍부한 Th1 사이토카인 (cytokine)을 생산하였다. rBCG의 우수한 방어적인 효능은 분명하게 IL17에 의존적이었다. pBCG 백신접종이 아닌, rBCG 후의 증가된 IL17 생산은 1기 임상시험 동안 건강한 지원자들에게서 또한 관찰되었다. 본 발명자들의 발견은 결핵과 다른 질병들에 대한 향상된 백신접종 전략에 대한 마커로서 일반적인 면역원성 경로를 규명한다.
본 발명의 청구 대상은 Th17 면역 반응을 생성시키기 위한 백신으로 사용하기 위한 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 마이코박테리움 세포이다:
(a) 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인, 및
(b) 포식용해소체 탈출 도메인.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 Th17 면역 반응을 생성시키는 방법이다:
(a) 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인, 및
(b) 포식용해소체 탈출 도메인.
바람직한 구현예에서, 백신은 생 (live) 재조합 마이코박테리움 세포이며, 이는 (a) 면역반응을 이끌어낼 수 있는 도메인 및 (b) 포식용해소체 탈출 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 면역반응을 이끌어 낼 수 있는 도메인은 바람직하게는 병원균 또는 이의 면역원성 단편으로부터의 면역원성 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 또 다른 구현예에서, 백신은 비활성화된 전체 병원균 세포 또는 세포 분획 기반의 백신이다.
마이코박테리움 세포는 바람직하게는 엠. 보비스 (M. bovis) 세포, 엠 투버쿨로시스 (M. tuberculosis) 세포, 특히 약독화된 엠. 투버쿨로시스 (M. tuberculosis) 세포 또는 다른 마이코박테리아, 예를 들어, 엠. 마이크로티 (M. microti), 엠. 스메그마티스 (M. smegmatis), 엠. 카네티 (M. canettii), 엠. 마리늄 (M. marinum), 엠. 포투이튬 (M. fortuitum)이다. 더 바람직하게는, 세포는 재조합 엠. 보비스(BCG) 세포이며, 특히 균주 데니쉬 프라그 서브타입 (strain Danish subtype Prague)으로부터의 재조합 엠. 보비스 세포이다 (43). 특히 바람직한 구현예에서, 백신은 재조합 요소분해효소-결핍의 마이코박테리움 세포이다. 특히 바람직한 구현예에서는, 예를 들어, 선택 마커 유전자에 의해 파괴된 ureC 유전자를 포함하는 자살 벡터를 구축하고, 타겟 세포를 상기 벡터로 형질전환시킨 후, 요소분해효소 음성 표현형을 갖는 선택 마커-양성 세포를 스크리닝함으로써, 마이코박테리움 세포의 ureC 서열이 비활성화된다 (ΔUrec). 가장 바람직하게는, 세포는 rBCG ΔUrec::Hly+::Hyg+로 특징지워지는 재조합 BCG 균주 데니쉬 서브타입 프라그이다.
면역반응을 이끌어 낼 수 있는 도메인은 바람직하게는 엠. 보비스 (M. bovis), 엠. 투버쿨로시스 (M. tuberculosis) 또는 엠. 레프라에 (M. leprae)로부터의 면역원성 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 9개의 아미노산, 및 예를 들어 20개까지의 아미노산의 길이를 가지는 이의 면역원성 단편으로부터 선택된다. 적합한 항원의 구체적인 예로는 엠. 투버쿨로시스로부터의 Ag85B (p30), 엠. 보비스 BCG로부터의 Ag85B(α-항원), 엠. 투버쿨로시스로부터의 Ag85A, 및 엠. 투버쿨로시스로부터의 ESAT-6 및 이의 단편이 있다. 다른 구현예에서, 면역반응을 이끌어낼 수 있는 도메인을 비-마이코박테리움 폴리펩티드로부터 선택된다.
본 발명의 백신은 포유동물, 예를 들어 인간 대상에서 Th17 면역 반응을 생성시키기에 적합하다. 본 백신은 바람직하게는 약 1-10x105, 바람직하게는 약 2-8x105개 세포의 용량(dose)으로 인간 대상에게 투여한다. 백신은 바람직하게는 단일 용량으로서, 예를 들어 주사로 투여한다. 피하 주사가 바람직하다. 더 나아가, 보조제(adjuvant) 없이 백신을 투여하는 것이 바람직하다.
백신은 바람직하게는 나병(leprosy) 또는 결핵, 특히 폐 마이코박테리움 감염, 더욱 특히 폐결핵과 같은 마이코박테리움 감염에 대한 백신이다. 더 나아가, 상기 백신은 방광암, 또는 자가면역 질환, 예를 들어 신경피부염(neurodermitis) 또는 건선(psoriasis)과 같은 자가면역 피부 질환에 대한 백신일 수 있다.
백신은 마이코박테리움-미경험(naive) 대상, 예를 들어 면역원성 마이코박테리움 시험접종에 미리 노출되지 않은 인간, 또는 마이코박테리움-기반의 백신, 예를 들어 BCG로 미리 면역접종되지 않은 인간에서 Th17 면역 반응을 생성시키기 위한 것일 수 있다. 이러한 대상의 예로는 예를 들어, 결핵과 같은 마이코박테리움 감염이 유행하는 지역의, 예를 들어, 신생아 또는 어린이, 예를 들어, 8살까지의 어린이, 또는 감염이 유행하지 않는 지역의 위험한 상태에 있는 사람들이 있다. 대안적으로, 상기 백신은 예를 들어 면역원성 마이코박테리움 시험접종에 미리 노출된 인간 또는 BCG로 미리 면역접종한 인간과 같은 대상에게 투여할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 백신은 결합된 Th17 및 Th1 면역 반응을 생성시키기 위해 사용된다.
본 발명에 따르면, Th17 면역 반응은 백신 접종된 대상에서 생성된다. Th17 면역 반응의 측정은 바람직하게는 상기 대상으로부터 유래된 생물학적 샘플에서 수행되며, 여기서 상기 샘플은 면역 세포, 특히 T 세포 및/또는 NK 세포, 더욱 특히 CD4 T 세포와 같은 항원-특이적인 T 세포를 포함한다. 샘플은 체액 또는 조직 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플, 또는 폐 또는 비장 유래의 샘플일 수 있다. 샘플을 수집하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
Th17 면역 반응의 측정을 위하여, 면역원을 갖는 분석되는 대상의 샘플 내에 존재하는 면역 세포를 재자극시키고 상기 세포로부터의 사이토카인 발현을 측정하는 것이 바람직하다. 분석할 세포는 바람직하게는 항원-특이적인 T 세포, 더욱 바람직하게는 CD4 T 세포이다. 재자극을 위한 면역원은 백신 내에 존재하는 면역원(이의 효능을 측정하고자 함)에 상응한다. 면역원은 백신 내에 존재하는 형태와 동일한 형태로 존재하거나 다른 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 백신이 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 경우, 재자극 단계의 면역원은 이의 면역원성 단편을 포함하거나, 그 반대일 수 있다. 바람직하게는, 재자극 단계를 위해 사용되는 면역원은 정제된 폴리펩티드 또는 펩티드이다. 결핵 백신, 특히 상기에서 기술한 바와 같은 생 결핵 백신의 효능을 시험하기 위하여, 면역원은 유리하게는 예를 들어, 마이코박테리움의 글리세롤 추출물 또는 Ag85A 및 Ag85B인, PPD "정제된 단백질 유도체(Purified Protein Derivative)"로부터 선택되는 마이코박테리움 항원뿐만 아니라 다른 마이코박테리움 항원 및 이들의 면역원성 단편(상기에서 기술한 바와 같은 것)일 수 있다.
본 발명에 따른 Th17 반응의 측정은 Th17 반응과 관련된 세포, 예를 들어 IL-17 생산 세포를, 상기 세포 내에 존재하고 및/또는 이에 의해 분비되는 표면 마커 및 사이토카인으로 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 표면 마커의 예로는 CD4, CD8, IL-23R, CCR4 및/또는 CCR6이 있다. 이러한 세포 내에 존재하고 및/또는 이에 의하여 분비되는 사이토카인의 예로는 IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ 및 이의 조합이 있다. 바람직하게는, 사이토카인은 IL-17 이다. 이러한 세포는 세포학적인 방법, 예를 들어, 라벨링, 예컨대 형광성 기(fluorescence group)를 가질 수 있는, 세포-표면 마커 및/또는 사이토카인에 특이적인 항체와 같은 면역학적 검출 시약을 사용한 세포 분류 기술에 의해 측정될 수 있다.
더욱 바람직하게는, Th17 면역 반응과 관련된 세포는 예를 들어, IL-17을 생산하고 선택적으로 이를 분비하는 CD4 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, Th17 면역 반응의 측정은 Th17 면역 반응 관련 세포로부터 분비된 사이토카인, 예를 들어 IL-17을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 사이토카인은 적절한 항체, 예를 들어 IL-17에 대해 지시되는 항체를 사용한 면역학적 방법에 의하여 측정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 결합된 Th17 및 Th1 면역 반응이 생성된다. Th1 면역 반응은 Th1 반응과 관련된 세포를 상기 세포 내에 존재하고 및/또는 이에 의하여 분비하는 표면 마커 및 사이토카인으로 측정함으로써 측정될 수 있다. 표면 마커의 예로는 CD4, CD8, CCR5, 및 CD62low가 있다. 이러한 세포 내에 존재하고 및/또는 이에 의하여 분비되는 사이토카인의 예로는 INF-γ, IL-22, IL-23, 및 이의 조합이 있다. 이러한 세포는 세포학적인 방법, 예를 들어, 라벨링, 예컨대 형광성 기를 가질 수 있는, 세포-표면 마커 및/또는 사이토카인에 특이적인 항체와 같은 면역학적 검출 시약을 사용한 세포 분류 기술에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, Th1 면역 반응의 측정은 Th1 면역 반응-관련 세포로부터 분비된 사이토카인, 예를 들어 IFN-γ, IL-22 및/또는 IL-23을 측정하는 단계를 포함한다. 사이토카인은 적절한 항체, 예를 들어 IFN-γ, IL-22 및/또는 IL-23에 대해 지시되는 항체를 사용한 면역학적 방법에 의해 측정될 수 있다.
바람직하게는, Th17 및 선택적으로 Th1 면역 반응이 백신접종 후의 적절한 시간에 측정된다. 예를 들어, 면역 반응은 백신접종 후 20-50일, 특히 25-35일에 측정될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 하기의 도면과 실시예에 의해 더욱 상세히 기술된다.
도 1: WT 마우스에서의 MTB 의 부하( burden ). S.c. 면역접종은 p.i.(주사 후) 90일째에 MTB 감염에 대하여 방어한다. (도 1A). 세균 부하는 p.i. 7일째에 백신접종된 그룹과 백신접종되지 않은 그룹 간에 대등하다. (도 1B) 400 CFU MTB로 에어로졸 감염시킨 이후 폐 및 비장에서의 CFU의 측정. 심성폐엽(전체 기관의 대략 71/10th) 또는 비장의 절반을 균질화하였으며; 남은 재료를 시험관 내 재자극 분석에 사용하였다. 통계학적 유의성을 양측 검정 P값을 갖는, 만-휘트니 검정 (Mann-Whitney test)에 의해 결정하였다. *, P<0.05; **, P<0.01. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3회의 실험의 대표값(representative)이다.
도 2: pBCG 백신접종 이상의 rBCG 이후의 더욱 우수한 사이토카인 유도. rBCG 또는 pBCG로 피하 백신접종 후 83일째에 폐 (도 2A) 및 비장 (도 2B)에서의 반응. 전체 2.5×105 개 (폐) 또는 2×106 개의 (비장) 세포를 PPD로 20시간 동안 재자극하고, 상층액을 다중 분석(multiplex assay)에 의해 분석하였다. 사이토카인 농도를 각 3회 반복의, 4개의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표현한다. 배지 대조군으로부터의 백그라운드 (background) 사이토카인 생산을 감산하였다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정 (Bonferroni multiple comparison test)을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05; **, P<0.01.
도 3: rBCG 에 의한 백신접종은 MTB 에 의한 에어로졸 감염시 폐로의 항원-특이적인 T 세포의 동원을 가속화한다. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 7일째의 폐 세포에 의한 사이토카인 분비. 총 2×105 세포를 PPD로 20시간 동안 자극하고 상층액을 다중 분석에 의해 분석하였다 (도 3A). 사이토카인 농도를 각 3회 반복의, 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현하였다. 배지 대조군으로부터의 백그라운드 사이토카인 생산을 감산하였다. 브레펠딘 A (Brefeldin A)의 존재 하에서 6시간 동안 PPD로 재자극한 세포를 다색 유세포 분석(multicolor flow cytometry)에 의해 분석하였다 (도 3B). 반응하는 CD4 T 세포들의 빈도를 각 3회 반복의, 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현한다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.
도 4: rBCG 로 백신접종은 MTB 에 의한 에어로졸 감염시 비장에서 PPD -특이적인 반응을 증가시킨다. 200-400 CFU의 MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 7일째의 비장 세포에 의한 사이토카인 분비. 총 2×106 세포를 PPD로 20시간 동안 재자극하고, 상층액을 다중 분석에 의해 분석하였다 (도 4A). 사이토카인 농도를 각 3회 반복의, 4개의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표현하였다. 배지 대조군으로부터의 백그라운드 사이토카인 생산을 감산하였다. 브레펠딘 A의 존재 하에서 6시간 동안 PPD로 재자극한 세포를 다색 유세포 분석에 의해 분석하였다 (도 4B). 반응하는 CD4 T 세포들의 빈도를 각 3회 반복의, 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현한다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.
도 5: pBCG 또는 rBCG 에 의한 백신접종은 Treg 세포 집단의 유의적인 변화로 이어지지 않는다. rBCG 또는 pBCG에 의한 피하 면역접종 이후 비장의 Treg 세포. 검은색 바는 CD25+FoxP3+를 나타내고 백색 바는 CD25-FoxP3+ 세포를 나타낸다. 면역접종 이후 83일째(도 5A 및 5B) 뿐만 아니라 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 7일째(도 5C 및 5D) 또는 90일째(도 5E 및 5F)의 CD4 T 세포 및 CD8 Treg 세포의 빈도. 그룹 당 3마리의 마우스, 평균 ± SEM으로 표현함. 데이터는 유사한 결과를 갖는 3개의 독립적인 실험의 대표값이다.
도 6: 백신접종과 이어지는 MTB 에 의한 에어로졸 감염 이후의 폐의 사이토카인 생산 CD8 T 세포의 빈도. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 7일째의 사이토카인 분비. 브레펠딘 A의 존재 하에서 6시간 동안 PPD로 재자극한 세포를 다색 유세포 분석에 의해 분석하였다. 반응하는 CD8 T 세포의 빈도를 각 3회 반복의, 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현한다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다.
도 7: 백신접종과 이어지는 MTB 에 의한 에어로졸 감염 이후의 비장의 사이토카인 생산 CD8 T 세포의 빈도. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 7일째의 사이토카인 분비. 브레펠딘 A의 존재 하에서 6시간 동안 PPD로 재자극한 세포를 다색 유세포 분석에 의해 분석하였다. 반응하는 CD8 T 세포의 빈도를 각 3회 반복의, 4개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현한다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.
도 8: rBCG - 백신접종된 마우스에서 지속적인 MTB 감염 동안 폐에서의 면역 반응. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 90일째의 폐 세포에 의한 사이토카인 분비. 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하고 상층액을 다중 분석에 의해 분석하였다 (도 8A). 사이토카인 농도를 각 3회 반복의, 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현하였다. 배지 대조군으로부터의 백그라운드 사이토카인 생산을 감산하였다. 브레펠딘 A의 존재 하에서 6시간 동안 PPD로 재자극한 세포를 다색 유세포 분석에 의해 분석하였다 (도 8B). 반응하는 CD4 T 세포의 빈도를 각 3회 반복의, 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현한다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05; **, P<0.01.
도 9: 백신접종과 이어지는 MTB 에 의한 에어로졸 감염 이후의 사이토카인 생산 CD8 T 세포의 빈도. 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 90일째의 폐로부터 분리된 세포에 의한 사이토카인 분비. 브레펠딘 A의 존재 하에서 6시간 동안 PPD로 재자극한 세포를 다색 유세포 분석에 의해 분석하였다. 반응하는 CD8 T 세포의 빈도를 각 3회 반복의, 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현한다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05.
도 10: 백신접종은 IL21 이 아닌 IL22 생산을 유도한다. 백신접종과 이어지는 200-400 CFU MTB에 의한 에어로졸 감염 이후 83일째의 마우스의 비장 (2 × 106 세포) 또는 폐 (2 × 105 세포)로부터의 세포에 의한 IL21 (도 10A) 및 IL22 (도 10B) 분비. IL21 농도를 그룹 당 3개의 샘플로부터 측정하였으며, 평균 ± SEM으로 표현함. IL22를 위하여, 한 그룹으로부터의 샘플을 모았다. 데이터는 2개 (백신접종 후 83일째) 및 5개 (p.i. 7일째)의 유사한 실험의 대표값이다. 세포를 PPD로 20시간 동안 재자극하고, 상층액을 ELISA로 분석하였다.
도 11: rBCG 는 유의적으로 APC 집단을 변화시키지 않고 γδT 세포 및 NK 세포의 증가된 동원을 야기한다. 106 CFU의 rBCG 또는 pBCG를 i.p. 투여하여 세포를 복강에 동원하였다. 유세포 분석기에 의한 복막 세척액 내의 세포 집단의 분석. APC는 rBCG 또는 pBCG의 i.p. 투여 이후 5시간 (상부 패널) 및 6일 (하부 패널)에 복막으로 동원되었다 (도 11A). 주사 이후 5시간째의 T 세포 집단의 ICS (도 11B). 세포를 브레펠딘 A의 존재 하에서 18시간 동안 αCD3/αCD28 항체로 자극하였다. 투여 이후 6일째의 T 세포 집단의 ICS (도 11C). 세포를 브레펠딘 A의 존재 하에서 18시간 동안 PPD로 재자극하였다. 데이터는 그룹 당 5마리의 마우스를 사용한 3개의 독립적인 실험의 요약으로 나타냈다. 가로 선은 중앙값(median)을 나타낸다. ANOVA 및 본페로니 다중 비교 검정을 통계학적 분석을 위해 적용하였다. *, P<0.05; **, P<0.01. 복막 세척액에서 검출된 사이토카인 및 케모카인(chemokine)을 평균 농도 ± SEM으로 표현되는 다중분석 (도 11D)에 의해 분석하였다.
도 12: rBCG 는 1기 임상시험의 건강한 지원자로부터 인간 PBMCs 에서 IL17 을 유도한다. 1기 임상시험의 건강한 인간 지원자로부터 분리한 인간 PBMCs에 의한 IL-17 생산. rBCG 또는 pBCG로 백신접종 후 29일째에 분리한 총 5×105 개의 세포를 PPD로 20시간 동안 재자극하고 상층액을 다중 분석에 의해 분석하였다. 통계학적 유의성을 단측 검정 P값을 갖는 만-휘트니 검정과 웰치 교정(Welch's correction)에 의해 결정하였다. *, P<0.05; pBCG에 대해서는 n=3 및 rBCG에 대해서는 n=7.
실시예
재료 및 방법
마우스
암컷 BALB/c 마우스를 베를린에 있는 Bundesinstitut fur Risikobewertung (BfR)에서 사육하였다. 마우스는 실험 시작 시에 6-8주령이었고 특정 병원균이 없는(specific pathogen free, SPF) 조건 하에서 유지하였다. 동물실험을 Landesamt fur Gesundheit und Soziales (LAGeSo, 베를린, 독일)의 승인 하에 수행하였다.
세균
사용된 MTB H37Rv 및 pBCG 및 rBCG 균주는 이전에 기술된 바 있다 (12). 세균을 글리세롤, 0.05% 트윈 80, 및 ADC를 보충한 미들브룩 7H9 브로쓰 (Middlebroth 7H9 broth) 내에서 성장시켰다. 중간-대수기 배양물(mid-logarithmic culture)을 수거하여, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 모든 저장액(stock)을 사용하기 전에 적정하였다. 27G 바늘을 가진 주사기를 통해 반복적으로 이동시켜 단일 세포 세균 현탁액을 얻었다.
백신접종 및 MTB 감염
pBCG 또는 rBCG (106 CFU)를 꼬리 기저에 인접하게 피하(s.c.)로 투여하였다. MTB에 의한 마우스의 에어로졸 감염은 글라스-콜(Glas-Col) 흡입 노출 시스템을 사용하여 수행하였다. PBS 0.5% v/v 트윈 80에서 무균적으로 제거된 기관을 기계적으로 파쇄하고 OADC로 보충한 미들브룩 7H11 한천 플레이트 상에 일련의 희석액으로 플레이팅함으로써 세균 부하를 평가하였다. 3주 후에, MTB 콜로니를 계수하였다. 결과의 통계학적 유의성은 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 5.0을 이용하여 비-매개변수적(non-parametric) 데이터에 대한 양측 p-값을 갖는 만-휘트니 검정을 통해 결정하였다.
세포 분리, 자극 및 유세포 분석
세포를 이전에 기술된 바와 같이 정제하였다 (42). 실험 그룹은 5마리의 마우스를 포함하였다. 2개의 비장 또는 폐를 모으고(pooled), 하나의 샘플을 개별적으로 처리하여, 이후의 자극에 대하여 5마리 마우스의 그룹 당 3개의 샘플을 생성하였다. 세포를 다중 분석에 의한 사이토카인 분석을 위하여 20시간 동안, 또는 세포 내 사이토카인 염색 (ICS)을 위하여 25 ㎍/㎖의 브레펠딘 A의 존재 하에서 6시간 동안, 50 ㎍/㎖의 PPD (SSI, 코펜하겐, 덴마크)로 자극하였다. 다음의 항체들을 사용하였다: CD4 (RM4-5), IFNγ (XMG-1.2), IL2 (JES6-5H4), Ly6G/C (RB6-8C5), CD11b (M1/70), γδ-TCR (GL-3), FoxP3 염색 세트 및 CD49b (클론DX5), 모두 eBioscience 제품임. CD8α (YTS169), TNF-α (XT22), CD16/CD32 (2.4G2), F4/80 (CI:A3-1) 및 CD11c (N418)를 하이브리도마 상청액으로부터 정제하고, 형광으로 내부(in house)에 표지하였다. IL-17 (TC11-18H10)을 BD Biosciences로부터 입수하였다. 세포를 FACSCanto II 또는 LSRII 유세포 분석기 및 FACSDiva 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. 사이토카인을 바이오-라드(Bio-Rad)사로부터의 바이오-플렉스(Bio-Plex) 마우스 Th1/Th2, IL17 및 IL6 비드-기반의 면역분석을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. IL21 및 IL22를 R&D 시스템으로부터 ELISA에 의해 측정하였다. 밀리포어(Millipore)사로부터의 밀리플렉스 42-플렉스 분석으로 인간 IL17을 검출하였다.
복막 세척
pBCG 또는 rBCG를 중간-대수기 배지로부터 새롭게 준비하였다. 세균을 PBS로 3번 세척하고 580 ㎚에서 광학밀도(optical density)를 측정함으로써 농도를 측정하였다. 106 CFU의 투여를 복강 내로 수행하였다. 5 ㎖ PBS의 주입에 의해 5시간 후 또는 6일 후 복강으로부터 동원된 세포를 얻었으며, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 바이오-라드사로부터의 바이오-플렉스 마우스 사이토카인 23 - 플렉스 키트를 이용하여 세척액 내의 사이토카인 및 케모카인을 측정하였다.
결과
rBCG 및 pBCG 백신접종 후 Th1 / Th17 반응
TB 백신 효능에 관련되는 면역 기전을 밝혀내기 위한 시도로서, 본 발명자들은 마우스에서 rBCG 및 pBCG에 대한 면역 반응을 비교하였다. rBCG의 더욱 우수한 방어적인 효능은 원래 정맥주사 면역접종 이후에 측정되었다 (12). 본 발명에서, 본 발명자들은 rBCG의 피하 투여가 대등한 수준의 방어를 유도하고 pBCG 이상의 더욱 우수한 효능을 유지한다는 점을 보여준다 (도 1A). 다음으로, 본 발명자들은 rBCG 또는 pBCG의 피하 백신접종 후 83일째에 마우스의 폐 및 비장에서의 장기간 기억 반응을 분석하였다. 세포를 PPD로 재자극하고, 상청액을 사이토카인에 대한 다중 분석에 의해 분석하였다. rBCG에 의한 면역접종은 pBCG와 비교하여 폐로부터 분리된 세포에 의해 유의적으로 더욱 높은 사이토카인 생산을 유도했다 (도 2A). 이들에는 IFNγ, IL2, IL6, 및 GM-CSF가 포함되었다. 대조적으로, 2형 사이토카인 IL4, IL5, 및 IL10은 백그라운드 수준 이상으로 증가하지 않았다 (데이터 미도시). 흥미롭게도, rBCG-백신접종된 마우스로부터의 폐 세포에 의해 대략 3-배 더욱 높은 IL17 농도가 생산되었다. 감염되지 않은 마우스의 폐로부터는 단지 소수의 세포들만이 분리될 수 있었음을 주목해야 한다. 결과적으로, 전체적인 사이토카인 농도는 웰 당 10-배 더욱 높은 세포 밀도를 자극에 이용할 수 있는 비장에서 보다 낮았다 (도 2B). 비장에서는, IL2, IL6, IFNγ 및 GM-CSF의 대등한 농도에 의해 반영되는 바와 같이 양쪽 백신이 동등하게 강한 Th1 반응을 이끌어 냈다. 그러나, rBCG-백신접종된 마우스로부터의 비장 세포는 pBCG-백신접종된 동물들과 비교하여 PPD로 재자극시 유의적으로 더욱 많은 IL17을 생산하였다. 그러므로, pBCG가 아닌, rBCG에 의한 면역접종은 폐 및 비장에서 동시에 일어나는(concomitant) 강력한 Th1 및 Th17 반응을 유도하고 이는 연장된 기간 동안 유지되었다.
rBCG - 백신접종한 마우스에서 전염성 MTB 로 감염시 MTB -특이적인 T 세포의 가속화된 동원
Th17 세포는 향상된 면역 감시와 연관되어 왔다 (13). 본 발명자들은 전염성 MTB로 에어로졸 감염시 백신접종된 동물에서의 항원-특이적인 T 세포 반응을 감염 후 7일째의 폐와 비장에서 비교하였다. rBCG-백신접종된 마우스로부터의 폐 세포에 의한 현저한 IFNγ, IL17, IL2 및 GM-CSF 생산이 PPD (도 3A) 또는 Ag85A 펩티드 (데이터 미도시)로 재자극 후 20시간째에 검출되었다. 대조적으로, 이들 사이토카인은 pBCG-백신접종된 마우스로부터의 세포에 의해 거의 분비되지 않았다. MTB로 감염된 비-백신접종된 동물에서, 사이토카인 생산은 검출 한계 이하이었으며, 이는 MTB-특이적인 T-세포가 MTB 감염 후 3주 전에 나타나지 않는다는 점에서 이전의 보고와 일치한다 (13). 2형 사이토카인 IL4, IL5 및 IL10은 검출되지 않으며, TNFα, IL12p70 및 IL6은 MTB 시험접종 후 이러한 초기 시점에서 단지 근소하게 백그라운드 수준 이상이었다 (데이터 미도시).
본 발명자들은 MTB 감염 후 7일째에 유세포 분석으로 폐 T 세포에 의한 사이토카인 생산을 측정하였다 (도 3B). 세포를 PPD로 6시간 동안 자극하고, IL2, IL17, IFNγ, 및 TNFα에 대한 세포 내 사이토카인 염색을 수행하였다. 비-백신접종된 대조군에서, CD4 T 세포의 적은 부분이 IL2, TNFα, 또는 IFNγ를 생산하였다. 백신접종된 마우스에서, CD4 T 세포는 IL2, IFNγ, TNFα 및 또한 IL17을 분비했다. 단일 사이토카인 생산 세포의 빈도는 rBCG 그룹에서 비록 유의적이지 않더라도, 가장 높았다. 백신접종된 동물에서, 본 발명자들은 방어적인 면역성에 연루되어 있는 다기능적인 T 세포를 검출하였다 (14). 다중 사이토카인-생산 T 세포는 대개 IL2+TNFα+ 이중 생산자이었으며, rBCG 백신접종시 유의적으로 증가하였다. 삼중-생산자 세포는 거의 독점적으로 IL2+IFNγ+TNFα+이었으며, pBCG-백신접종된 마우스와 비교하여 rBCG에서 약간 증가되었다. 또한, IL2+TNFα+IFNγ+IL17+ 사중-양성 세포는 rBCG 그룹에서 비록 매우 낮은 빈도지만 독점적으로 나타났다.
원론적으로, 비장 T 세포는 폐 T 세포와 유사한 사이토카인 패턴을 생산하였다 (도 4). IL2 및 GM-CSF 생산은 pBCG 그룹에 비교하여 rBCG-백신접종한 동물들에서 유의적으로 더욱 높았으며, 비록 비-백신접종 대조군에서 낮은 비율의 CD4 T 세포가 IFNγ를 생산하였다고 하더라도, 비-백신접종한 대조군에서는 검출 수준 이하였다. 요컨대, pBCG 또는 rBCG 중 어느 하나에 의한 백신접종은 pBCG 그룹과 비교했을 때 rBCG-백신접종된 마우스에서 단일 및 다중-생산자의 더욱 높은 빈도를 갖는 IFNγ 및 TNFα를 분비하는 CD4 T 세포를 유도하였다.
p.i. 7일째에, CD4 T 세포는 주요한 사이토카인 생산자이었으며; CD8 사이토카인 생산자는 비록 유사한 패턴이지만, 폐 (도 6) 및 비장 (도 7)에서 더욱 낮은 빈도로 검출되었다. 유의적으로 더욱 높은 빈도의 TNFα-단일 생산 CD8 T 세포가 rBCG 그룹에서 검출되었음을 주목해야 한다.
상이한 사이토카인 생산 및 생산자 세포의 빈도는 폐 및 비장에서 대등한 콜로니 형성 유닛(CFU) 수에 의해 확인된 바와 같이 (도 1B), 감염 후 이러한 초기 시점에서의 상이한 세균 부하로 기인한 것이 아니었다. Treg 세포의 총 수는 2개의 백신접종된 그룹에서 대등한 정도로 감염시 증가하였다(도 5).
rBCG 에 의한 백신접종은 지속적인 감염 동안 강한 면역 반응을 부여한다.
본 발명자들은 폐 세균 부하가 pBCG 그룹과 비교할 때 rBCG-면역접종된 동물에서 대략 10-배 더 낮고, 비-백신접종된 대조군 그룹과 비교할 때 100-배 더 낮았을 경우, p.i. 90일째에 MTB-특이적 면역 반응을 분석하였다. 백신접종된 마우스 및 비처리 대조군의 폐로부터의 세포를 20시간 동안 PPD로 재자극하고, 사이토카인 농도를 다중 분석으로 측정하였다(도 8A). 재자극시 검출된 사이토카인은 대부분 1형이었다. 그러나, 본 발명자들은 지속적인 감염 동안 백신접종된 그룹 간에서 IFNγ 또는 IL17의 차이를 검출할 수 없었다. 대조적으로, IL2, IL6, GM-CSF 및 TNFα의 양은 rBCG-백신접종된 마우스에서 더욱 높았다. 모든 그룹에서, IL4 및 IL5는 검출 한계 이하였으며, 일부 IL12p70 및 IL10가 측정되었다(데이터 미도시). 추가적으로, 다색 유세포 분석에 의한 폐 세포의 분석은 지속적인 감염 동안 대부분 사이토카인-생산 CD4 T 세포를 나타냈다(도 8B). 단지 IFNγ만을 분비하는 CD4 T 세포가 유사한 빈도로 모든 그룹에서 검출되었다. 백신접종시, 상이한 조합의 IL2, IFNγ, TNFα 또는 IL17을 생산하는 CD4 T 세포가 또한 검출될 수 있었다. 흥미롭게도, 상청액 내의 IL2 및 TNFα의 더 높은 농도에도 불구하고, 반응하는 CD4 T 세포의 빈도는 rBCG와 pBCG 백신접종 사이에서 유의적으로 다르지 않았다. 본 발명자들은 둘 모두의 백신이 더 강한 사이토카인 생산자가 되는, rBCG-유도된 T 세포에 의한 지속적인 MTB 감염 동안 폐에서 항원-특이적 CD4 T 세포의 빈도를 증가시킨 것으로 추측한다. CD8 T 세포는 모든 그룹에서 대등한 빈도로 거의 독점적으로 IFNγ를 분비하는 반면, rBCG 그룹에서는 유의적으로 더욱 높은 단일 TNFα- 생산 CD8 T 세포가 검출되었다. 다기능적인 CD8 T 세포는 간신히 백그라운드 이상인 것으로 나타났다(도 9).
백신접종은 IL21 이 아닌 IL22 생산을 야기한다.
Th17 세포는 IL21 (15) 및 IL22 (16)와 같은 추가적인 작동체(effector) 사이토카인을 생산할 수 있다. IL22-생산 세포는 결핵 환자에서 확인되었으나, 이들은 IL17-생산 세포와는 구별되는 것으로 보인다 (17). 본 발명자들은 백신접종되고 이어서 MTB-감염된 마우스로부터의 비장 또는 폐 세포의 PPD 자극 후 IL21을 검출하지 못했다 (도 10A). IL22는 rBCG-면역접종된 마우스에서 PPD로 20시간 동안 자극한 비장 세포에 의해 증가된 농도로 생산되었으나(도 10B) MTB에 의한 감염 이후 초기에 더 이상 증가하지 않았다. 폐세포에 의한 IL22 생산은 단지 rBCG-백신접종된 그룹에서 관찰되었으며, 에어로졸 MTB 감염 이후 감소하였다.
복강 내 rBCG 는 유의적으로 APC 집단을 변화시키지 않고 yδT 세포 및 NK 세포의 증가된 동원을 야기한다.
본 발명자들은 rBCG로 면역접종 후 우선적인 Th17 세포 유도에 기저를 이루는 기전을 정의하고자 하였다. 이를 위하여, rBCG와 pBCG를 i.p. 투여하고, 투여 후 5시간째 또는 6일째에 복강으로부터 분리한 이주 세포들을 유세포 분석에 의해 분석하였다 (도 11A). 호중구 (neutrophils) (Gr1HI, CD11bHI, MHCII-, CD11c-로 정의됨)는 빠르게 복강으로 들어갔으며 pBCG 및 rBCG 그룹에서 같은 정도로 i.p. 6일째에 상승된 상태로 잔존하였다. 상주하는(resident) 복강 대식세포(CD11bHI, F4/80HI, Gr1-, MHCIIHI, CD11c-) 및 수지상 세포(CD11c+, CD11bLO, Gr1-)의 빈도는 낮은 퍼센트에서 변하지 않고 잔존하였다. 요컨대, rBCG와 pBCG 그룹 간에 유의적인 차이를 검출할 수 없었다. 백신접종 후 5시간째에 수집한 복강 세포는 αCD3/αCD28 항체로 다중클론성 자극시켰다 (도 11B). CD4 T 세포 및 NK 세포의 빈도는 IFNγ 및 IL17 생산과 같이 모든 그룹들 간에 대등하였다. 투여 후 6일째에, 이들 세포는 숫자적으로 증가하였고, rBCG 그룹에서 가장 높은 빈도에 도달했다 (도 11C). 6일 시점에서 세포의 재자극을 위하여 PPD를 사용하였다. CD4 T 세포는 IFNγ 또는 IL17의 주목할 만한 양을 생산하지 않았으나, 반면에 rBCG 투여 후 NK 세포의 상당한 부분은 IFNγ를 생산하였다. γδT 세포는 결핵에서 초기 IL17의 주요한 근원으로서 확인되었다 (18). 비록 유의적이지는 않지만, rBCG 주입-후 5시간째에 IFNγ를 생산하는 γδT 세포의 증가된 비율을 확인하였다. 이러한 세포 집단은 더 증가하였고 IL17을 생산하는 현저하게 더욱 높은 빈도의 γδT 세포가 주입 후 6일째에 rBCG 그룹에서 검출되었다. 어떤 그룹에서도 CD8 T 세포가 복막에서 검출되지 않았다. 본 발명자들은 복막 세척액의 다중 분석에 의해 복강에 존재하는 사이토카인과 케모카인을 분석하였다 (도 11D). MCP-1, MIP1α, G-CSF 및 KC는 주입시 빠르게 증가하였으며; 에오택신(eotaxin)의 수준은 변하지 않은채 잔존하였고 IL12p40이 6일 후에 더욱 높은 농도로 검출되었다. IL12p70, IFNγ, IL1a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL10, IL17, GM-CSF, 및 TNFα 농도는 검출 한계 이하이었던 반면에, IL1β, IL6, IL9, IL13, MIP1β, 및 RANTES는 측정할 수는 있지만 생산은 rBCG와 pBCG 사이에 대등하다. 그러므로, rBCG 및 pBCG는 투여의 부위에서 유사한 정도로 APC의 동원뿐만 아니라 케모카인과 사이토카인 생산을 유도했다. 흥미롭게도, IL17을 분비하는 γδ T 세포 및 IFNγ를 생산하는 NK 세포의 비율은 rBCG 투여 이후 가장 높았다.
rBCG 에 의한 백신접종은 인간에서 IL17 -생산 세포를 생성한다.
마지막으로, 본 발명자들은 IL17 생산이 rBCG-백신접종된 조사 참여자에서 증가하는지 여부에 대한 정보를 얻기 위하여, 1기 임상 시험의 건강한 인간 지원자로부터 PBMCs를 분석하였다. 지원자로부터의 혈액을 rBCG 또는 pBCG로 면역접종한 후 29일째에 얻고, PBMCs를 분리한 후 냉동시켰다. PBMCs를 해동시키고, 하룻밤 동안 놓아둔 다음, 이어서 20시간 동안 PPD로 재자극하였다. 사이토카인 생산을 다중 분석에 의해 분석하였다. rBCG로 면역접종된 조사 참여자로부터의 PBMCs에서 IL17 생산이 독점적으로 검출되었다 (도 12). 제한된 수의 샘플이 이용 가능하였음을 주목해야 한다.
논의
방어의 면역 마커를 확인하는 것은 새로운 결핵 백신의 합리적인 설계에 중요하다. 이들 마커는 또한 결핵 백신 효능 시험에서 임상적인 결과의 결과변수(endpoint)를 예측하기 위하여 대리 마커의 정의를 위한 기반을 확립할 수 있었고 이에 따라 현재의 백신 후보의 개선을 위한 지침을 제공할 수 있었다. IFNγ (21) 및 TNFα (22)를 포함하는 대식세포 항마이코박테리움 능력을 활성화시키는 핵심 사이토카인의 중요성, 및 기억 세포 (23)의 확대(expansion)에 있어 IL2에 대한 필요성을 잘 확립하였고 이에 따라 결핵 백신 시험을 모니터링하는데 일반적으로 사용되었다.
백신 효능의 바이오마커를 확인하기 위한 시도로서, 본 발명자들은 모 균주인 pBCG 이상의 더욱 우수한 방어를 부여하기 위하여 증명된 rBCG에 의해 이끌어낸 장기간 기억 면역 반응을 비교하였다. 반응들은 정량적 및 정성적인 측면 모두에서 달랐다. 본 발명자들은 폐에서 rBCG로 백신접종 후 증가된 풍부한 1형 사이토카인뿐만 아니라 IL17을 검출하였다 (도 2A). 폐에서 백신-유도된 면역 반응의 분석은 임상 시험의 맥락에서 분명하게 실현가능하지 않다. 그러므로, 본 발명자들은 또한 전신성 장기간 기억 반응을 분석하였다 (도 2B). 흥미롭게도, 대등한 농도의 1-형 지시 사이토카인이 pBCG 및 rBCG 그룹에서 검출되었다. 대조적으로, 비장세포에 의한 IL17 생산은 rBCG 백신접종시 유의적으로 증가하였다. 그러므로, 본 발명자들은 IFNγ 또는 IL2 보다는 IL17이 rBCG에 의해 유도된 우수한 방어의 마커로서 자격을 갖추었다고 결론을 내린다.
Th17 세포는 IL17에 대한 반응에서 동원되는 첫 번째 세포들 중에 있는 호중구 (24)를 끌어내고 활성화함에 의해 항미생물 방어에 기여한다. IL17이 일차 MTB 감염 동안 불필요하나(25, 26), 기억 반응에서는 중요한 것임 (13)이 밝혀져 왔다. 추가적으로, 인간 Th17 세포에 대한 CCR6의 발현에 대한 최근의 보고 (27, 28)는 양성 피드백 루프(positive feedback loop)를 지적하는데, 이는 CCR6이 호중구에 의해 생산된 CCL20에 대한 수용체 (29)이고, CCL20-CCR6이 결핵의 면역병원균에 연관되어 있기 (30) 때문이다. 그러므로, Th17 세포는 세균 거주 부위로의 항원-특이적인 기억 T 세포의 가속화된 동원을 촉진할 수 있었다. MTB로 에어로졸 감염 후 7일째에 백신-유도된 면역 반응을 분석함으로써, 본 발명자들은 rBCG에 의한 백신접종이 사실상 세균 복제의 부위로의 작동체 세포의 가속화된 동원을 야기한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 항원-특이적인 CD4 T 세포의 증가된 빈도와 폐 (도 3) 및 비장 세포 (도 4)에 의한 IL2, IL17, IFNγ 및 GM-CSF의 증가된 생산을 관찰하였다.
IL2, IFNγ 및 TNFα를 공동-생산하는 다기능성 CD4 T 세포는 처음에는 리슈마니아 메이저(Leishmania major)에 대한 성공적인 백신접종 전략에 연관되었고 (14), 나중에는 MTB에 연관되었다 (31). 최근에는, 이들 다기능성 CD4 T 세포가 또한 임상적인 결핵 백신 시험에서 검출되었다(32, 33). 본 발명자들은 rBCG 및 pBCG 백신접종 및 이어지는 감염시 다기능성 CD4 T 세포를 검출하였으나(도 3 및 4); 이중- 및 삼중-생산자에서 사이토카인(IL2, IL17, IFNγ, 및 TNFα)의 조성은 실험들뿐만 아니라 개별적인 동물들 사이에서 상당히 다양하였다. 만약 다기능성 세포가 방어와 진정한 연관성이 있다면, 이들의 조성보다는, rBCG 그룹에서 더욱 높았던 전체적인 빈도가 가장 관련이 있는 것으로 보인다.
rBCG가 Th17 반응을 유도하였던 원인은 무엇일까? rBCG 및 pBCG에 의한 면역접종은 APC뿐만 아니라 케모카인 및 사이토카인 생산자의 동원을 유사한 정도로 야기했다. 흥미롭게도, IL17을 분비하는 γδT 세포 및 IFNγ를 생산하는 NK 세포의 비율이 rBCG 백신접종 후 매우 높았다. 이는 IL17이 γδT 세포 (34, 18) 뿐만 아니라 NKT 세포 (35)에 의해 빠르게 생산될 수 있다는 것을 보여주는 보고들과 일치한다. rBCG 백신접종시 또한 증가하였던 NK 세포가 초기 IFNγ의 중요한 근원이다. 본 발명자들은 rBCG로부터 방출된 다른 분자적 구성성분이 감염된 대식세포의 세포질 내에 있음을 이미 밝힌바 있다 (12). Nod-2는 중요한 세포질 PRR이며 이의 관여가 Th17 기억 T 세포 반응의 발전과 연관되어 왔다 (19).
세균 감염 동안 유도된 아폽토시스는 Th17 세포들을 유도한다 (36). 본 발명자들은 rBCG가 pBCG와 비교하여 증가된 아폽토시스를 유도하고 (12), 이는 Th17 세포의 증가된 발달에 더 기여할 수 있다는 증거를 얻었다. 염증조절복합체(inflammasome)의 활성화는 또한 IL1β의 생산을 통하여 Th17 반응에 기여할 수 있었다 (37). 예를 들어 NLRP3가 ATP 수준의 변화를 통하여 리스테리오리신(listeriolysin)의 존재를 감지하는 것이 밝혀졌다 (38). 그러므로, rBCG 백신접종시 Th17 세포의 유도는 세포내 자극과 증가된 아폽토시스의 복합 상호작용을 필요로 할 수도 있다.
Th17 세포는 성공적인 백신접종에 이롭다기보다는 콜라겐-유도된 관절염 (39), EAE (40, 39), 및 알러지성 기도 과다자극 (41, 39)과 같은 염증 질환 및 자가면역 질환에서 중요한 것으로 여겨진다. 이런 병리학적 역할은 일반적으로 깊은 IL21-매개된 염증 반응의 발달과 관련되어 있다. 본 발명자들은 어떠한 실험에서도 백그라운드 수준 이상의 백신접종과 이어지는 MTB 감염 이후의 IL21을 검출하지 못하였다 (도 10A). 게다가, 본 발명자들은 rBCG에 의한 백신접종시 주입 부위에서도 또한 MTB 감염 후 200일까지의 폐에서도 자가면역 또는 과다한 염증의 징후를 관찰하지 못했다.
마우스의 실험적인 결핵으로부터의 데이터와 인간 데이터를 비교하고자 하는 최초의 시도로서, 본 발명자들은 rBCG 및 pBCG를 사용한 1기 임상 시험으로부터의 냉동된 PBMCs의 사이토카인 프로파일을 분석하였다. 제한된 수의 샘플에서, 본 발명자들은 rBCG 백신접종 후 IL17 생산을 검출하였으나, pBCG 백신접종에서는 검출하지 못했다. Th17 세포는 MTB-감염된 인간의 말초 혈액에서 검출되었다 (17). 최근에는, IL17-생산 CD4 T 세포가 Ag85A를 발현하는 변형된 우두 바이러스(vaccinia virus) 앙카라(Ankara)로 구성된 결핵 백신 후보로 면역접종 받은 청소년에서 보고되었다 (33). 반응은 백신접종 후 7일과 28일 사이에 피크에 도달하였으며 그 후에는 떨어졌다. 이는 rBCG 그룹에서 백신접종 후 29일째에 증가된 IL17 생산을 보여주는 본 발명의 데이터와 일맥상통한다 (도 12). 그러므로, 결핵 백신 시험에서 방어의 연관자로서 IL17을 제안하고자 한다.
요약하면, 본 발명자들은 rBCG에 의한 백신접종이, Nod-2에 의한 세균 구성성분의 세포 내 인식에 의존적일 것 같은, Th17 세포의 우선적인 생성으로 이어진다는 것을 보여준다. 이들 Th17 세포는 결국 항원-특이적인 T 세포의 폐로의 동원을 가속화한다. 궁극적으로, 이러한 일련의 사건은 MTB의 초기 견제를 초래하며, 이에 따라 pBCG와 비교하여 rBCG에 의한 더욱 우수한 방어로 이어진다. 본 발명자들은 성공적으로 1기 임상시험을 마친 rBCG-면역접종된 지원자로부터의 PBMC에 의하여 독점적으로 IL17 생산을 검출하였다. IL17은 MTB 복제의 부위로의 항원-특이적인 T 세포의 가속화된 동원에 중요한 것으로 보여지므로, 장래의 결핵 백신들은 균형 잡힌 Th1 및 Th17 반응을 수반하여 유도하도록 맞춰져야 한다.
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Claims (9)

  1. Th17 면역 반응을 생성시키기 위한 백신으로 사용하기 위한, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 마이코박테리움 세포:
    (a) 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인, 및
    (b) 포식용해소체 탈출 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 요소분해효소-결핍 세포인 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 엠. 보비스(M. bovis) 세포, 특히 균주 데니쉬 서브타입 프라그(strain Danish subtype Prague)으로부터의 재조합 엠. 보비스 세포인 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역반응을 이끌어낼 수 있는 도메인은 엠. 보비스(M. bovis) 또는 엠. 투버쿨로시스(M. tuberculosis)로부터의 면역원성 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물, 예를 들어 인간 대상에서 Th17 면역 반응을 생성시키기 위한 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마이코박테리움-미경험(naive) 대상 또는 마이코박테리움 시험접종에 미리-노출된 대상에서 Th17 면역 반응을 생성시키기 위한 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (i) 내지 (iv)로부터 선택되는 질환에 대한 백신에 사용하기 위한 세포:
    (i) 결핵(tuberculosis),
    (ii) 방광 암(bladder cancer),
    (iii) 자가면역 질환(autoimmune disorder), 및
    (iv) 나병(leprosy).
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Th17 및 Th1 면역 반응을 생성시키기 위한 백신으로서 사용하기 위한 세포.
  9. 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 Th17 면역 반응을 생성시키는 방법:
    (a) 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 도메인, 및
    (b) 포식용해소체 탈출 도메인.
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