KR20140021185A

KR20140021185A - 인삼의 재배조건 구분방법

Info

Publication number: KR20140021185A
Application number: KR1020120087142A
Authority: KR
Inventors: 이재경; 김동현; 류권렬; 정혜진
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2014-02-20
Also published as: KR101928802B1

Abstract

본 발명은 대사체연구를 인삼의 재배조건을 구분하는데 적용함으로써, 재배조건을 모르는 인삼의 재배조건을 효과적으로 구분할 수 있는 방법에 관한 것이다. 또한, 이를 통하여 다양한 인삼을 특정 재배조건으로 신속하고 간단하게 구분짓기 위한 바이오마커(Biomarkier) 및 바이오마커의 선정방법에 관한 것이다.

Description

인삼의 재배조건 구분방법{Method for distinguishing cultivation condition of ginseng}

본 발명은 인삼의 재배조건을 구분하는 방법에 관한 것으로, 대사체학적 접근을 통하여 재배조건을 모르는 인삼의 재배조건을 구분하는 방법 및 이를 구분짓는 바이오마커(Biomarkier)를 선정하는 방법에 관한 것이다.

대사체학(Metabolomics)는 핵자기 공명 분광법(NMR), 근적외선 분광광도계(NIR), 모세관 전기영동(CE)과 같은 다양한 분석기기를 이용한 통계 알고리즘을 통하여 생체 내에 존재하는 대사물질들을 광범위하게 분석하여 비교하는 학문이다. 대사체 연구는 보통 대사체를 총체적으로 분석하는 전체 대사 프로파일링(Global metabolic profiling)과 지방산, 아미노산, 당 등과 같은 특정 대사체를 타겟으로 하는 타겟 대사 프로파일링(targeted metabolic profiling)으로 나누어 진행된다. 또한, 대사체 연구를 위해서는 시료가 2개 군집 이상이어야 하고 통계처리를 위해서 군집 내 시료가 많을수록 의미 있는 데이터가 산출될 수 있다. 또한 유기체 속의 많은 물질들을 한 번에 검출하고 주요 물질들을 선별하기 위해 NMR 이나 질량분석기와 같은 초정밀 분석기기가 필요하다.

그러나, 기존의 대사체 연구는 DNA를 연구하는 유전체학(Genomics), RNA를 연구하는 전사체학(Transcriptomics), 단백질을 연구하는 프로테오믹스(Proteomics) 처럼 주로 질병의 치료 및 인간 생명 연장을 위해 대사물질들을 분석하는데 국한되어 왔다.

따라서, 농산물의 산지 및 품질의 판별과 같은 다양한 산업분야에 활용하기 위한 대사체학적 분석방법의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 대사체연구를 인삼의 재배조건을 구분하는데 적용함으로써, 재배조건을 모르는 인삼의 재배조건을 효과적으로 구분할 수 있는 방법을 제공하고, 이를 통하여 다양한 인삼을 특정 재배조건으로 신속하고 간단하게 구분짓기 위한 바이오마커(Biomarkier) 및 바이오마커의 선정방법을 제공하는데 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

(a)재배조건을 알고 있는 인삼의 추출물들을 통계분석하는 단계;

(b)상기 통계분석을 통해 재배조건에 따라 상기 인삼의 추출물들을 각각 구분하는 단계;

(c)재배조건을 모르는 인삼의 추출물을 상기 재배조건을 알고 있는 인삼 추출물들과 함께 상기 (a)단계와 동일한 방법으로 통계분석하는 단계;및

(d)상기 재배조건을 모르는 인삼 추출물의 통계분석결과를 상기 (b)단계의 재배조건을 알고 있는 인삼의 추출물들의 분석 결과와 비교분석하여 재배조건을 찾아내는 단계;를 포함하는 인삼의 재배조건 구분방법을 제공한다.

상기 구분방법은 (a)단계 이전에 재배조건을 알고 있는 인삼과 재배조건을 모르는 인삼의 전처리 단계를 더 포함할 수 있다. 인삼의 전처리 단계로는 인삼을 건조시키고 분쇄하여 유기용매로 추출한 후, 용매를 모두 증발시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (b) 및 (c)단계에서 실시된 통계분석은 기기분석을 통해 데이터를 얻는 단계;및 상기 데이터를 통계 알고리즘에 적용하여 인삼을 재배된 조건에 따라 구분하는 단계;를 포함할 수 있다.

기기분석에 사용되는 기기분석기는 가스크로마토그래프/질량분석기(GC/MS) 및 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)가 바람직하다.

또한, 상기 통계 알고리즘은,

인삼의 추출물에 함유된 각 구성성분의 용출시간(Retention time), 각 구성성분의 분자량(m/z), 각 구성성분의 신호세기(intensity)의 3 가지 변수를 x, y, z 축으로 하여 각 인삼의 구성성분들을 좌표에 나타내었을 때, 분산이 가장 커지는 축과 이에 직교하는 축으로 좌표계를 설정하는 단계;

상기 직교하는 축에 대한 분산이 가장 커지는 축을 기준으로 하는 좌표계에 각 인삼의 추출물들의 구성 성분들을 배열하여 그래프로 나타내는 단계;및

상기 각 구성성분들을 모두 통계 알고리즘을 적용하여 평균함으로써 각 인삼별로 그래프에 나타내는 단계;로 구성될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 (d)단계에서 상기 재배조건을 모르는 인삼 추출물의 재배된 조건을 찾아낸 후, 특정 재배조건을 구분짓는 바이오마커(Biomarker)를 찾아내는 (e)단계를 포함함으로써 인삼의 특정 재배조건을 신속하고 간단하게 구분할 수 있는 구분방법을 제공한다. 이때 바이오마커는 인삼의 LC/MS 분석시 특정 재배조건하에서 재배된 인삼에서만 더 많이 검출되는 특정 성분을 의미한다.

또한, 상기 바이오마커는,

각 구성성분의 용출시간(Retention time), 각 구성성분의 분자량(m/z), 각 구성성분의 신호세기(intensity)의 3 가지 변수 중 x, y, z 축으로 하여 상기 각 인삼 추출물들의 구성성분들을 함께 좌표에 나타내었을 때, 분산이 가장 커지는 축과 이에 직교하는 축으로 좌표계를 설정하는 단계;

상기 각 구성성분의 용출시간(Retention time)을 고정시켜 상기 좌표계를 회전시키는 단계;

상기 회전시킨 직교하는 축에 대한 분산이 가장 커지는 축을 기준으로 하는 좌표계에 각 인삼 추출물들의 구성 성분들을 배열하여 그래프로 나타내는 단계;및

상기 그래프에서 원점에서 멀리 떨어져있는 성분들을 인삼이 재배된 특정 조건을 구분짓는 바이오마커로 선정하는 단계;에 의하여 정하여질 수 있다.

본 발명은 대사체연구를 활용한 통계분석을 통하여 인삼의 재배조건을 신속하고 간편하게 구분할 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법에 따르면, 재배조건을 알고 있는 인삼의 조건별 구분뿐만 아니라 재배조건을 모르는 인삼의 재배조건까지 비교분석을 통하여 효과적으로 구분할 수 있다.

또한, 본 발명의 구분방법을 이용하여 인삼의 특정 재배조건을 구분해낼 수 있는 바이오마커를 선정함으로써 그 외 재배조건을 모르는 인삼의 재배조건을 신속하고 간단하게 구분해 낼 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 인삼의 재배조건을 구분하는 방법에 의하면 농약을 사용하여 재배한 인삼과 농약을 사용하지 않고 재배한 인삼, 인삼의 재배산지, 재배년수, 재배환경 및 방법 등을 구분할 수 있다. 나아가, 본 발명의 구분방법은 인삼뿐만 아니라 다른 농산물 등을 포함하는 식물의 재배조건을 구분하는데도 활용될 수 있다.

도 1은 PLS-DA 와 OPLS-DA의 데이터 행렬의 회전 및 특이 벡터의 방향의 차이를 나타낸 도이다.
도 2는 위쪽부터 유기농 안성 6년근, 4년근, 관행삼 안성 4년근, 3년근의 TIC(Total Ion Chromatogram)를 나타낸 도이다.
도 3은 안성 및 진안지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 PCA 스코어 그래프를 나타낸 도이다.
도 4는 도 3의 PCA분석에 사용된 안성 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 로딩 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 안성 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 OPLS-DA 스코어 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 안성 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 S-Plot 및 바이오마커를 나타낸 도이다.
도 7은 안성 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal) 중 바이오마커의 Box and Whisker 그래프를 나타낸 도이다.
도 8은 안성, 진안 및 포천(Sample) 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 PCA 스코어 그래프를 나타낸 도이다.
도 9는 안성, 포천 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 OPLS-DA 스코어 그래프를 나타낸 도이다.
도 10은 안성, 포천 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)의 S-Plot 및 바이오마커를 나타낸 도이다.
도 11은 안성, 포천 및 진안 지역의 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal) 중 바이오마커의 Box and Whisker 그래프를 나타낸 도이다.
도 12는 안성 유기농 3년근과 관행삼 3년근의 6.15 분 부근의 MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 13은 안성 유기농 3년근과 관행삼 3년근의 6.15 분 부근 크로마토그램을 나타낸 도이다.

본 발명에 의한 인삼 재배조건의 구분방법은 대사체 연구를 통한 통계분석에 의한 것으로서, 본 발명에 사용되는 통계 분석법에는 하기와 같은 통계알고리즘이 사용될 수 있다.

1. PCA ( Principle Component Analysis )

주성분분석(Principal component analysis, 이하 PCA)는 데이터 집합을 분석하는 기법 중의 하나이다. PCA분석법은 데이터를 한 개의 축으로 투영시켰을 때 그 분산이 가장 커지는 축이 첫 번째 좌표축으로 오고, 두 번째로 커지는 축이 첫 번째 좌표축에 수직이 되도록 하는 것과 같은 방법으로 차례로 놓이도록 새로운 좌표계로 데이터를 선형 변환한다. 본 발명에서는 각각의 인삼샘플(A, B, C, …)에 대해 각 구성성분의 용출시간(Retention time), 각 구성성분의 분자량(m/z), 각 구성성분의 신호세기(intensity) 3 가지 변수가 x, y, z 축을 형성하며 3차원 공간상에서 위치한 각 샘플 구성 성분(A1, A2, A3, …)을 모두 고려했을 때 분산이 가장 커지는 축이 PC1, 이에 직교하는 축이 PC2가 된다. 새로운 좌표계 PC1/PC2 에서 각 샘플 구성 성분(A1, A2, A3, … & B1, B2, B3, … & C1, C2, C3, …)을 배열한 것이 로딩 그래프(loading plot)이며, 각 샘플구성 성분을 이 통계 알고리즘을 적용하여 모두 평균하고 그래프에 각 샘플 A, B, C를 서로 비교하여 나타낸 것이 스코어 그래프(score plot)이다.

이때, 로딩 그래프 상에서 원점에 가까운 성분들은 샘플들간의 편차를 많이 보이지 않는 것들이며 원점에서 멀어진 성분들이 샘플간의 편차를 보여주는데 기여하는 성분들이다.

2. OPLS -DA( Orthogonal Projection to Latent Structure - Discrimination Analysis )

샘플이 가지는 그룹을 이미 알고 있는 경우에는 PCA를 이용한 패턴 분석보다는 미지 샘플을 판별할 수 있는 PLS-DA(Projection Latent Structure-Discrimination Analysis)와 같은 회기 다변량 분석이 바람직하다. 이때 PLS-DA는 상기 PCA 분석에서 샘플의 각 구성성분 (A1, A2, A3, …) 중 하나의 변수를 고정시켜 스코어 그래프를 만드는 것이다.

한편, OPLS-DA(Orthogonal Projection Latent Structure-Discrimination Analysis)는 주 관심 대상인 그룹간의 차이가 첫 번째 특이 벡터에 나타나도록 데이터 행렬을 회전(도 1)시킴으로써 관찰값과 서로 다른 그룹간의 연관된 변이를 쉽게 알아낼 수 있는 방법이다. 따라서 OPLS-DA는 회기 분석법인 PLS-DA보다 그룹간의 차이를 더 적절하면서도 정확하게 반영할 수 있다.

3. S- Plot

OPLS-DA 분석 후 각 개체(A, B, C)를 구분하는 주요 성분(A1, A2, A3, … & B1, B2, B3, … & C1, C2, C3, …)을 확인하기 위해 S-Plot을 이용할 수 있다. S-Plot은 각 군 내에서의 편차를 X축에 나타내며 이때 양수값과 음수값은 두 그룹(A 그룹: +1, B 그룹: -1)을 의미한다. X 축의 군 내에서의 편차를 표준편차로 나눈 값으로서 군 간의 편차를 Y축에 나타낸다. S-Plot의 가장자리에 있는 주요성분들이 로딩 그래프에서 원점에서 떨어져 있는 경우 이는 두 그룹을 구분 짓는 성분이라 할 수 있다. 반대로 군 내에서의 편차가 작은 경우에는 로딩 그래프에서 원점에 가까이 위치하므로 두 그룹을 구분 짓는 성분으로써는 사용하기는 어렵다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다.

또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능함은 명백한 사실이다.

1. 인삼시료의 준비

아래에서 본 발명의 일 실시예에 따른 인삼의 재배조건 구분방법 중 인삼시료 준비단계에 대해 설명한다.

국내에서 재배되는 인삼 중 지역간 편차를 고려하여 샘플링 지역을 안성, 진안, 포천으로 선정한다. 각 지역의 노지에서 수확한 수삼을 각각 3 샘플 이상 열풍건조기에서 50℃로 약 6시간 ~ 8시간 건조한다. 건조한 인삼을 믹서기를 이용하여 곱게 갈고 10배 부피의 70 % 에탄올로 12시간 이상 교반하여 추출한다. 그 후, 증발기를 이용하여 용매를 모두 날린 후 남은 시료를 모아 검체로 한다.

시험에 사용된 인삼시료는 재배지역과 재배년수가 다른 관행삼(농약을 사용하여 재배한 인삼)과 유기농삼(농약을 전혀 사용하지 않고 재배한 인삼)을 시료로 준비하여 시험을 진행하며, 이를 표 1에 나타낸다.

재배지역	재배방법	재배년수
경기도 안성시	관행삼	3년
		4년
		5년
		6년
	유기농삼	3년
		4년
		6년
전라북도 진안군	관행삼	5년
		6년
	유기농삼	4년
		5년
경기도 포천군	재배조건모름	4년
		5년

2. 기기 분석 조건

아래에서 본 발명의 일 실시예에 따른 인삼의 재배조건 구분방법 중 통계분석을 위한 기기분석단계에 대해 설명한다.

준비한 인삼시료 1 g을 70 % 에탄올 20 mL 로 추출한다. 추출시료를 원심분리기를 통해 13,000 g로 원심분리한 후 상층액을 PTFE 필터로 분리하여 분석시료로 한다. 분석에 사용된 이동상 및 컬럼 , 기기조건은 다음과 같다.

UPLC 기기조건(Waters사 ACQUITY 시스템)

컬럼	Waters사 Acquity UPLC BEH C18 (2.1 mm X 100 mm, 1.7 mm)
유량	0.4 mL/min
컬럼 온도	40 ℃
오토샘플러 트레이 온도	25 ℃
주입부피	5 μL
위크 니들 워시(Weak needle wash)	10 % 아세토나이트릴(Acetonitrile)
스트롱 니들 워시(Strong needle wash)	메탄올
이동상	0.1% 포름산(A) / 0.1% 아세토나이트릴 중 포름산(B)
	시간(분)	이동상(%)		커브
	시간(분)	A	B	커브
	0	98.0	2.0	6
	1.0	98.0	2.0	6
	11.0	50.0	50.0	6
	14.0	10.0	90.0	6
	15.0	10.0	90.0	6
	15.5	98.0	2.0	6
	17.0	98.0	2.0	6

MS기기조건(Waters사 Synapt G2-S HDMS)

이온화 모드	ESI 양이온 모드
소스 온도	120 ℃
탈용매온도	400 ℃
탈용매 가스 유량	700 L/h
콘(Cone) 가스 유량	30 L/h
모세관 전압	3 kV
배율기(Multiplier)	2650 V
충돌기체 유량	2.0 mL/min
LM 1/HM 1 레졸루션(resolution)	4.7
소프트웨어	MassLynx 4.1 & MarkerLynx XS

3. 통계분석

아래에서 본 발명의 일 실시예에 따른 인삼의 재배조건 구분방법 중 데이터 통계분석 단계에 대해 설명한다.

상기 기기분석결과를 MassLynx 4.1을 이용하여 샘플을 분석하고 MarkerLynx XS 를 이용하여 통계분석을 실시한다. 하기의 통계 알고리즘에 따라 PCA 분석을 통해 재배방법에 따라 각 샘플이 분류될 수 있는지를 확인하고 OPLS-DA를 통해 그룹간 비교 분석 및 S-Plot을 통한 바이오마커(Biomarker)를 선정한다.

안성과 진안 지역의 샘플 분석을 통한 관행삼과 유기농삼의 구분

(1)PCA 분석

유기농삼 샘플은 안성지역의 3년근, 4년근 및 6년근과 진안지역의 4년근 및 5년근을 사용하며 관행삼 샘플은 안성지역의 3년근, 4년근, 5년근 및 6년근과 진안지역의 5년근 및 6년근을 사용한다. 각 샘플은 도 2에서 보는 바와 같이 TIC (Total Ion Chromatogram) 상에서는 큰 차이를 보이지 않음을 알 수 있지만, 도 3에서 보는 것처럼 통계알고리즘 적용을 통한 PCA 분석결과는 유기농삼과 관행삼이 명확히 구분되는 것을 알 수 있다.

한편, 도 4는 도 3의 PCA 분석에 사용된 각 지역별 구성 성분을 나타낸 로딩 그래프를 표시한 것이다.

(2)OPLS-DA 분석 및 S-Plot을 통한 Biomarker 확인

PCA plot의 경계가 명확하지가 않을 경우에는 UPLC-MS 분석의 데이터인 각 성분의 용출시간(retention time), 각 성분의 분자량(m/z), 각 성분의 신호세기(intensity) 중에서 용출시간(retention time)을 고정시켜, 서로 다른 그룹간의 연관된 변이를 쉽게 알아낼 수 있도록 데이터 행렬을 회전시킴으로써 OPLS-DA 모델을 만들 수 있다. 이 경우, 도 3의 PCA plot보다 더 명확하게 각 그룹을 구분 지을 수 있는 것을 확인할 수 있다(도 5).

도 6은 OPLS-DA 모델을 바탕으로한 안성 및 진안 지역의 관행삼과 유기농삼의 S-Plot을 나타낸 것이다. S-Plot에서 원점에 가까운 성분들은 두 그룹간에 차이가 크게 나지 않는 성분들이며 원점에서 멀어질수록 두 그룹을 구분하는데 기여하는 성분들로서 이를 바이오마커(bio-marker)라고 한다. 여기에서는 관행삼보다 유기농삼에 많이 있는 성분을 추출해 내기 위하여 S-Plot의 양의 값(유기농삼) 중 가장자리에 있는 몇 가지 성분(붉은색 박스)들을 뽑아낸 후 각 샘플에서 이에 해당하는 함량을 확인하며 그룹간에 편차가 나는 것을 도 7의 Box and Whisker 그래프로 표시한다.

도 7에서 보는 것처럼 3.95 min의 m/z 384.1580, 4.63 min의 m/z 369.2596, 6.28 min의 m/z 705.3427의 경우 관행삼보다 유기농삼에서 더 많은 양이 검출되는 것을 알 수 있으며 이 외에도 몇 개의 성분들이 관행삼보다 유기농삼에서 더 많이 검출된다.

재배방법을 모르는 포천지역 인삼의 구분

(1)PCA 분석을 통한 확인

도 8에 앞에서 분석한 안성 및 진안지역의 유기농삼, 관행삼과 함께 농약사용 유무를 알 수 없는 포천지역 인삼의 PCA 분석 결과를 함께 나타낸다. 유기농삼과 관행삼이 지역에 따른 구분이 아닌 농약사용 유무에 따른 구분이라고 볼 때 포천지역의 인삼샘플이 유기농삼과 관행삼 중 어떤 것에 해당하는지를 알기 위해서는 도 8에 나타낸 바와 같이 유기농삼과 관행삼 그룹을 기준으로 한 가상의 축(빨간 점선)을 그려볼 수 있다. 이때, 축의 한 방향은 유기농삼과 관행삼을 서로 구분 짓고 다른 직교하는 축은 관행삼 그룹에 속한 샘플들과 나란하게 그릴 수 있으며 이와 같은 상황하에서 볼 때 포천의 샘플은 유기농이 속한 그룹축에 있어 농약을 사용하지 않은 유기농삼에 해당함을 알 수 있다.

(2)OPLS-DA 분석 및 S-Plot을 통한 Biomarker 확인

포천지역에서 재배된 인삼이 유기농삼임이 확인되었으므로, 이를 바탕으로 도 9에 안성, 포천 및 진안 지역의 유기농삼과 관행삼을 OPLS-DA 분석한 결과를 나타낸다. OPLS-DA 분석을 위해서는 두 개의 그룹이 지정되어야 하기 때문에 여기에서는 유기농삼(Organic)과 관행삼(Normal)으로 그룹을 구분한다. 도 9에서 보는 것처럼 유기농삼과 관행삼은 명확히 구분이 되며 S-plot을 통해 그룹을 구분 짓는 바이오마커가 어떤 것들이 있는지 확인한다.

그 다음 도 10과 같이 안성, 포천 및 진안 지역의 유기농삼 및 관행삼의 S-Plot을 나타내고, 동일한 방법으로 몇 개의 바이어마커를 선정하여 도 11에 Box and Whisker 그래프로 나타낸다.

도 11에 나타난 것처럼 6.15 분의 m/z 177.0908 의 경우 관행삼에서는 검출이 되지 않고 유기농삼에만 검출이 되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 13.68 분의 m/z 539.3194 와 13.69 분의 m/z 545.2964 는 안성 및 진안 지역에서는 검출되지 않는 성분이기 때문에 PCA 그래프나 OPLS-DA 그래프에서 포천 지역의 샘플들이 기존 그룹들과 떨어져 위치했음을 유추할 수 있다. 그리고, 유기농삼과 관행삼을 구분해 주는 바이오마커로서 6.15 분의 m/z 177.0908 MS 스펙트럼을 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이 관행삼 3년근의 경우 m/z 177.0908이 노이즈레벨(noise level) 수준에서 검출되었으나 유기농 3년근에서는 노이즈레벨 수준 이상으로 검출된 것을 확인할 수 있다. 이를 바탕으로 유기농삼과 관행삼을 구분하기 위해 도 13과 같이 크로마토그램상에서 6.15분 부근의 전체 이온 신호세기(ion intensity) 중 m/z 177.0908 의 신호세기(intensity)를 상대적으로 알아본 결과를 표 4에 나타내었다.

관행삼과 유기농삼의 6.15 분 m/z 177.0908 의 상대적 함량

관행삼				유기농삼
구분	신호(Signal) 단위 : e³		상대적 함량 (%)	구분	신호 단위 : e³		상대적 함량 (%)
구분	총 이온	m/z 177.0908	상대적 함량 (%)	구분	총 이온	m/z 177.0908	상대적 함량 (%)
안성 3년근 #1	32.0	3.52	11.00	안성 3년근 #1	44.0	10.6	24.09
안성 3년근 #2	27.3	3.58	13.11	안성 3년근 #2	41.6	9.52	22.88
안성 3년근 #3	28.1	3.44	12.24	안성 3년근 #3	37.1	8.85	23.85
안성 4년근 #1	36.8	4.21	11.44	안성 4년근 #1	49.1	9.42	19.19
안성 4년근 #2	30.1	31.8	10.56	안성 4년근 #2	44.2	8.43	19.07
안성 4년근 #3	24.5	2.98	12.16	안성 4년근 #3	39.6	8.11	20.48
안성 5년근 #1	39.1	5.11	13.07	안성 6년근 #1	66.7	11.4	17.09
안성 5년근 #2	32.4	4.33	13.36	안성 6년근 #2	56.9	9.64	16.94
안성 5년근 #3	30.1	3.77	12.52	안성 6년근 #3	52.6	8.84	16.81
안성 6년근 #1	71.4	7.24	10.14	진안 4년근 #1	47.7	8.77	18.39
안성 6년근 #2	67.5	6.62	9.81	진안 4년근 #2	45.5	8.70	19.12
안성 6년근 #3	58.4	5.66	9.70	진안 4년근 #3	40.4	5.91	14.63
진안 5년근 #1	68.5	7.88	11.50	진안 5년근 #1	74.4	12.8	17.20
진안 5년근 #2	45.6	5.90	12.94	진안 5년근 #2	63.3	11.0	17.38
진안 5년근 #3	47.9	6.20	12.94	진안 5년근 #3	51.5	9.14	17.75
진안 6년근 #1	59.4	4.40	7.41	포천 4년근 #1	21.4	7.76	36.26
진안 6년근 #2	52.3	3.94	7.53	포천 4년근 #2	18.8	7.18	38.19
진안 6년근 #3	47.1	3.61	7.66	포천 4년근 #3	19.3	7.24	37.51
-	-	-	-	포천 5년근 #1	45.5	11.2	24.62
-	-	-	-	포천 5년근 #2	41.5	9.94	23.95
	-	-	-	포천 5년근 #3	41.3	9.79	23.70

상기 표 4에 나타난 바와 같이 관행삼과 유기농삼의 6.15 분 부근의 m/z 177.0908 의 상대적 함량을 비교해 본 결과, 유기농삼에서 함량이 높게 관찰되었으며 상대적 함량이 15 % 이상일 때 유기농삼이라고 분류할 수 있다. 진안 지역의 유기농삼 중 4년근 세번째 샘플은 도 11에서 6.15 분 부근의 m/z 177.0908 함량이 0으로 검출되지 않았는데 이는 표 2에서 보는 것처럼 함량이 다른 샘플에 비해 다소 적어 노이즈레벨 이하로 검출되었기 때문이며 이는 샘플간의 오차로 판단된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 인삼 재배조건의 구분방법의 일 실시예로서 국내에서 재배된 인삼을 농약을 사용해서 재배한 인삼(이하 관행삼)과 농약을 전혀 사용하지 않은 인삼(유기농삼)으로 대사체학적 접근을 통하여 기기분석하여 구분한 결과, PCA plot 상에서 재배지역과 무관하게 유기농삼과 관행삼을 구분할 수 있음을 확인할 수 있다.

본 발명의 구분방법에 의하면, 크로마토그램상에서는 육안으로 차이를 확인하기 어려웠음에도, 분자량 정보와 통계알고리즘 적용을 통하여 유기농삼과 관행삼을 효과적으로 구분할 수 있었다. 이는 인삼을 재배함에 있어서 농약을 사용하고 사용하지 않음에 따라 인삼시료 내에서 대사체의 종류 및 함량에 차이가 발생하기 때문이다. 특히, 본 발명에 의하면 재배방법을 알 수 없는 미지의 시료를 분석하기 위하여 미지시료를 전처리 후 UPLC/MS 분석을 통해 데이터를 얻고 이를 기존에 알고 있는 유기농삼과 관행삼 샘플과 함께 통계처리를 함으로써 PCA plot 상에서 미지시료가 유기농삼과 관행삼 중 어떤 그룹에 속하는지 확인하므로 간단하게 농약의 사용 유무를 알아낼 수 있다.

또한 유기농삼과 관행삼을 구분짓는 바이오마커로서 크로마토그램상에서 특정 분자량의 상대적 함량을 계산하여 상대적 함량이 높은 것을 선정하고, 이에 따라 미지의 인삼시료가 유기농삼인지를 구분할 수 있다.

Claims

(a)재배조건을 알고 있는 인삼의 추출물들을 통계분석하는 단계;
(b)상기 통계분석을 통해 재배조건에 따라 상기 인삼의 추출물들을 각각 구분하는 단계;
(c)재배조건을 모르는 인삼의 추출물을 상기 재배조건을 알고 있는 인삼의 추출물들과 함께 상기 (a)단계와 동일한 방법으로 통계분석하는 단계;및
(d)상기 재배조건을 모르는 인삼의 추출물의 통계분석결과를 상기 (b)단계의 재배조건을 알고 있는 인삼의 추출물들의 분석 결과와 비교분석하여 재배조건을 찾아내는 단계;
를 포함하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 1항에 있어서, 상기 구분방법은 (a)단계 이전에 재배조건을 알고 있는 인삼과 모르는 인삼의 전처리를 통해 인삼의 추출물을 얻는 단계를 더 포함하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 및 (c)단계에서 실시된 통계분석은
기기분석을 통해 데이터를 얻는 단계;및
상기 데이터를 통계 알고리즘에 적용하여 인삼을 재배된 조건에 따라 구분하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 3항에 있어서, 상기 통계 알고리즘은
인삼의 추출물에 함유된 각 구성성분의 용출시간(Retention time), 각 구성성분의 분자량(m/z), 각 구성성분의 신호세기(intensity)의 3 가지 변수를 x, y, z 축으로 하여 구성성분들을 각각 좌표에 나타내었을 때, 분산이 가장 커지는 축과 이에 직교하는 축으로 좌표계를 설정하는 단계;
상기 직교하는 축에 대한 분산이 가장 커지는 축을 기준으로 하는 좌표계에 각 인삼의 구성 성분들을 배열하여 그래프로 나타내는 단계;및
상기 각 구성성분들을 모두 평균하여 각 인삼별로 그래프에 나타내는 단계;
로 구성됨을 특징으로 하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 1항에 있어서, 상기 구분방법은 상기 (d)단계에서 상기 재배조건을 모르는 인삼의 재배된 조건을 찾아낸 후, 재배조건을 구분짓는 바이오마커(Biomarker)를 찾아내는 (e)단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 5항에 있어서, 상기 바이오마커는
각 구성성분의 용출시간(Retention time), 각 구성성분의 분자량(m/z), 각 구성성분의 신호세기(intensity)의 3 가지 변수 중 x, y, z 축으로 하여 상기 각 인삼 추출물들의 구성성분들을 함께 좌표에 나타내었을 때, 분산이 가장 커지는 축과 이에 직교하는 축으로 좌표계를 설정하는 단계;
상기 각 구성성분의 용출시간(Retention time)을 고정시켜 상기 좌표계를 회전시키는 단계;
상기 회전시킨 직교하는 축에 대한 분산이 가장 커지는 축을 기준으로 하는 좌표계에 각 인삼 추출물들의 구성 성분들을 배열하여 그래프로 나타내는 단계;및
상기 그래프에서 원점에서 멀리 떨어져있는 성분들을 인삼이 재배된 특정 조건을 구분짓는 바이오마커로 선정하는 단계;
에 의하여 정하여지는 것임을 특징으로 하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 1항에 있어서, 상기 구분방법은 농약을 사용하여 재배한 인삼과 농약을 사용하지 않고 재배한 인삼을 구분하는 방법임을 특징으로 하는 인삼의 재배조건 구분방법.
제 1항에 있어서, 상기 구분방법은 인삼의 산지를 구분하는 방법임을 특징으로 하는 인삼의 재배조건 구분방법.