KR20140010475A

KR20140010475A - 미생물을 이용한 지방산 제조 방법

Info

Publication number: KR20140010475A
Application number: KR1020120073419A
Authority: KR
Inventors: 이진원; 이선희; 이승한
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2014-01-27
Also published as: KR101450751B1

Abstract

본 발명은 (a) 1-10 g/L 질소원을 포함하는 배양배지에서 배양하는 본배양(main cultivation) 단계; 및 (b) 상기 본배양의 배양물 중 배양균을 수확하여 0.01-1.00 g/L 질소원을 포함하는 새로운 배양배지에서 배양하는 후배양(post-cultural incubation) 단계를 포함하는 미생물을 이용한 지방산 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 미생물을 단시간동안 최대로 성장시킨 후에 배양배지 내 질소원의 농도를 감소시킨 후배양(Post-Cutrtivation Incubation) 단계를 통해 우수한 지방산 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 재조합 균주는 야생형 균주의 지방산 생산능와 비교하여 불포화 지방산 생산능이 15-25배 증가하고 포화 지방산 생산능이 2-3배 증가한다.

Description

미생물을 이용한 지방산 제조 방법{Method for Preparing Fatty Acid using Microorganism}

본 발명은 미생물을 이용한 지방산 제조 방법에 관한 것이다.

에너지 위기 및 지구 온난화와 같은 환경 문제의 증가로 인해 재생가능한 연료의 필요성이 강조되어왔다. 바이오디젤(biodiesel)은 가솔린을 대신해 사용되고 있는 전형적인 탄화수소 연료인 단일 알킬 에스테르 지방산 및 메틸 에스테르 지방산으로 정의된다. 최근에 대체 연료로서의 미생물의 장쇄 지방산으로부터 생산된 탄화수소 및 이의 유도체에 대한 관심이 증가하고 있다[1-6]. 메틸 에스테르 지방산은 수송수단의 연료와 호환할 수 있는 장점이 있으며 현재 연소시스템에 적합한 제트 연료로 사용되고 있다[7,8].

슈도모나스 애루지노사 및 대장균은 Ⅱ형 지방산 합성(Fatty Acid Synthesis; FAS) 시스템이라 불리는 다양한 지방산 합성 시스템을 갖는다. Ⅱ형 지방산 합성 시스템은 대부분의 박테리아 및 식물에서 발견되며, 개개의 효소에 의해 촉매반응된다. 아세틸-CoA 카르복실라아제(Acetyl-CoA Carboxylase; ACC)는 4 종류의 유전자(accA, accB, accC 및 accD)에 의해 코딩되고 공동인자로 바이오틴을, 기질로는 중탄산염(bicarbonate)을 사용한다. 또한, ACC는 CO₂ 첨가에 의해 아세틸-CoA로부터 말로닐-CoA(Malonyl-CoA)의 ATP-의존 반응을 촉매한다. 말로닐-CoA는 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제(fabD에 의해 코딩)에 의해 아실전송단백질(Acyl Carrier Protain; ACP)을 전송한다[9-11]. 아실-ACP 티오에스터라아제(Acyl-ACP thioesterase)는 지방산 합성 경로의 지방산 신장 단계에 필수적인 효소이다. 말로닐-ACP의 전구체 형태로의 전환은 패티 아실-ACP(fatty acyl-ACP)가 C12-C18의 지방산으로 전환되는 마지막 단계이다. 흥미롭게도, 야생형 대장균 및 슈도모나스애루지노사는 아실-ACP 티오에스터라아제를 생산하지 않는다[1].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 지방산을 생성하는 야생형 균주 또는 재조합 균주의 배양 방법을 개선하여 지방산 생성을 최대화하고자 노력하였다. 그 결과, 미생물을 단시간동안 최대로 성장시킨 후에 배양배지 내 질소원의 농도를 감소시킨 후배양(Post-Cutrtivation Incubation) 단계를 통해 우수한 지방산 생성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 지방산 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 지방산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 미생물을 이용한 지방산(fatty acid) 제조 방법을 제공한다:

(a) 1-10 g/L 질소원을 포함하는 배양배지에서 배양하는 본배양(main cultivation) 단계; 및

(b) 상기 본배양의 배양물 중 배양균을 수확하여 0.01-1.00 g/L 질소원을 포함하는 새로운 배양배지에서 배양하는 후배양(post-cultural incubation) 단계.

본 발명자들은 지방산을 생성하는 야생형 균주 또는 재조합 균주의 배양 방법을 개선하여 지방산 생성을 최대화하고자 노력하였다. 그 결과, 미생물을 단시간동안 최대로 성장시킨 후에 배양배지 내 질소원의 농도를 감소시킨 후배양(Post-Cutrtivation Incubation) 단계를 통해 우수한 지방산 생성을 확인하였다.

본 발명의 미생물을 이용한 지방산(fatty acid) 제조 방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 본배양( main cultivation )

본 발명의 지방산 제조방법에 따르면, 미생물을 1-10 g/L 질소원을 포함하는 배양배지에서 배양하며, 이를 본배양(main cultivation)이라고 명명한다.

본 발명의 지방산 제조방법에 이용될 수 있는 미생물은 야생형 균주 또는 재조합 균주이다. 본 발명의 야생형 균주는 지방산을 생산하는 당업계의 어떠한 균주도 이용할 수 있으며, 예컨대, 슈도모나스(Peudomonas) 종, 아시네토박터(Acinetobacter) 종, 로도코커스(Rhodococcus) 종, 마리노박터(Marinobacter) 종 및 알카니보락스(Alcanivorax) 종이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 상기 재조합 균주는 슈도모나스 종의 아세틸-CoA 카르복실라아제 A를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 슈도모나스 종의 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제(Malonyl-CoA/ACP transacylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 스트렙토코커스 종의 아실-ACP 티오에스터라아제(Acyl-Acyl Carrier Protein thioesterase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 슈도모나스 종의 아세틸-CoA 카르복실라아제 A(acetyl-CoA carboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 슈도모나스 종의 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제(Malonyl-CoA/ACP transacylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 스트렙토코커스 종의 아실-ACP 티오에스터라아제(Acyl-Acyl Carrier Protein thioesterase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 선택하여 발현 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조하고 이를 대장균에 형질전환하여 재조합 균주을 제조한다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용한 슈도모나스 종의 아세틸-CoA 카르복실라아제 A를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열이고, 슈도모나스 종의 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열이며, 스트렙토코커스 종의 아실-ACP 티오에스터라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열이다.

본 발명에서 이용되는 아세틸-CoA 카르복실라아제 A, 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제 또는 아실-ACP 티오에스터라아제의 뉴클레오타이드 서열은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상기 유전자들은 발현 벡터 내부에 도입되어 대장균에서 발현되게 된다. 본 명세서에 있어서, 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 지방산 제조에 관여하는 효소들을 코딩하는 각각의 뉴클레오타이드 서열들은 발현 조절서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 상기에서 '작동가능하게 연결된다(operably linked to)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, lac 프로모터, tac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL^λ프로모터, pR^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터에 사용되는 프로모터는 lac 프로모터이다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 아세토인 환원효소를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG(Isopropylthio-β-D-Galactoside)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

바람직하게는, 상기 단계 (a) 이후에 배양배지에 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하는 단계를 추가적으로 포함한다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pUCP19, pUC18, pTrc99A, pSTV28, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pET22b, pGEX 시리즈 및 pET 시리즈 등), 파지(예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 바람직하게는 pUCP19를 사용한다.

본 발명의 발현 벡터는 프로모터서열 및 발현 대상 유전자(구조 유전자)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기서열들이 5'-3' 순서대로 연결되는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 상기 발현 벡터는 lac 프로모터 서열을 포함하며 상기 lac 프로모터 서열은 상기 아세틸-CoA 카르복실라아제 A, 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제 및/또는 아실-ACP 티오에스터라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로(operatively) 결합된다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카르베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용된 선택표지는 암피실린 또는 카르베니실린이다.

본 발명의 벡터는 아세틸-CoA 카르복실라아제 A, 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제 및/또는 아실-ACP 티오에스터라아제 유전자가 효소 과발현 기능을 포함하여 최소한의 길이를 가지도록 RBS(Ribosomal binding site) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열만을 서열로 정하여 삽입시키는 것이 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이는 측면에서 바람직하다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli MG1655, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 지방산을 제조하기 위해 이용되는 숙주 세포는 대장군(E. coli) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종이고, 보다 바람직하게는 대장균 K-12 MG1655 및 슈도모나스 애루지노사 PA14이다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

상기 미생물을 1-10 g/L 질소원(바람직하게는, 2-8 g/L 질소원, 보다 바람직하게는 3-7 g/L 질소원, 보다 더 바람직하게는 4-6 g/L 질소원)을 포함하는 배양배지에서 본배양한다.

바람직하게는, 상기 질소원은 당업계의 미생물 배양에 사용되는 어떠한 질소원을 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 효모추출물을 질소원으로 이용한다.

바람직하게는, 상기 본배양은 35-40℃에서 8-15시간 동안 배양하고 보다 바람직하게는, 36-38℃에서 10-13시간 동안 배양한다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 본배양은 5 g/L 효모추출물을 포함하는 최소배지에서 37℃로 12시간동안 배양한다.

바람직하게는, 상기 배양배지는 글루코오스, 글리세롤, 수크로오스 또는 아라비노오즈를 탄소원으로 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 배양배지는 글루코오스 또는 글리세롤을 탄소원으로 포함한다.

단계 (b): 후배양( Post - culture incubation )

이어, 상기 본배양의 배양물 중 배양균을 수확하여 0.01-1.00 g/L 질소원(바람직하게는, 0.02-0.80 g/L 질소원, 보다 바람직하게는 0.03-0.70 g/L 질소원, 보다 더 바람직하게는 0.04-0.60 g/L 질소원)을을 포함하는 새로운 배양배지에서 배양한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본배양의 배양물을 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 0.05 g/L 및 0.50 g/L 질소원을 각각 포함하는 새로운 배양배지를 첨가하여 배양하며, 이를 후배양(Post-culture Incubation; PCI)라고 명명한다.

바람직하게는, 상기 단계 (b)의 질소원은 당업계의 미생물 배양에 사용되는 어떠한 질소원을 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 효모추출물을 질소원으로 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 후배양의 질소원은 본배양의 질소원보다 1/10 내지 1/100 감소된 농도로 첨가한다.

본 발명의 지방산 제조방법에 의해 제조된 지방산은 포화 지방산 및/또는 불포화지방산이고, 바람직하게는 C₁₂-C₃₆ 포화 지방산 및/또는 C₁₂-C₃₆ 불포화 지방산이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 C₁₂-C₃₆ 포화 지방산은 도데카노익산(dodecanoic acid, C₁₂), 테트라데카노익산(tetradecanoic acid, C₁₄), 헥사데카노익산(hexadecanoic acid, C₁₆) 및 옥타데카노익산(octadecanoic acid, C₁₈)이고, 상기 C₁₂-C₃₆ 불포화 지방산은 9-헥사데세노익산(9-hexadecenoic acid, C₁₆ _:1), 9-옥타데세노익산(9-octadecenoic acid, C₁₈ _:1) 및 9,12-옥타데카디에노익산(9,12-octadecadienoic acid, C₁₈ _:2)이다.

바람직하게는, 상기 재조합 균주는 야생형 균주의 지방산 생산능와 비교하여 불포화 지방산 생산능이 15-25배 증가하고 포화 지방산 생산능이 2-3배 증가한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 후배양 24시간 후에 분석한 야생형 균주에 의해 생성된 포화지방산은 약 100 ㎎/L이고 불포화지방산은 4 ㎎/L이나, 아세틸-CoA 카르복실라아제 A를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 슈도모나스 종의 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 스트렙토코커스 종의 아실-ACP 티오에스터라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주에 의해 생성된 포화지방산은 약 190 ㎎/L이고 불포화지방산은 43 ㎎/L으로 야생형 균주와 비교하여 포화지방산의 생성은 약 2배 증가하였고, 불포화지방산의 생성은 약 22배 증가하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 지방산 제조방법에 의해 제조된 지방산을 제공한다.

본 발명의 지방산은 생물 공정을 통해 제조한 탄화수소 형태의 화합물로 석유, 천연가스 및 석탄과 같은 에너지로 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 미생물을 이용한 지방산 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 미생물을 단시간동안 최대로 성장시킨 후에 배양배지 내 질소원의 농도를 감소시킨 후배양(Post-Cutrtivation Incubation) 단계를 통해 우수한 지방산 제조방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 재조합 균주는 야생형 균주의 지방산 생산능와 비교하여 불포화 지방산 생산능이 15-25배 증가하고 포화 지방산 생산능이 2-3배 증가한다.

도 1은 슈도모나스 애루지노사 PA14의 글루코오스로부터 지방산이 합성되는 대사 경로를 보여준다. ACC는 아세틸-CoA 카르복실라아제(Acetyl-CoA carboxylase), FabD는 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제(Malonyl-CoA/ACP transacylase)를 나타내고, FabH, FabF 및 FabB는 β-케토아실-ACP 신타아제(β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase), FabG는 β-케토아실-ACP 리덕타아제(β-ketoacyl-acyl carrier protein reductase), FabZ는 β-히드록시아실-ACP 디하이드라아제(β-hydroxyacyl-acyl carridr protein dehydrase), FabI는 β-에노일-ACP 리덕타아제(β-enoyl-acyl carrier protein reductase), TE는 패티 아실-ACP 티오에스터라아제(fatty acyl-acyl carrier protein thioesterase)를 나타낸다.
도 2는 재조합 벡터의 제조과정을 도식화하여 보여준다. pUCP19 벡터는 pUC18/19 벡터에서 유래한 대장균-슈도모나스 셔틀벡터이다. pUCP19 벡터에 accA, fabD 및 TE(thioesterase) 유전자를 각각 삽입하여 pJS01, pJS02 및 pJS04를 제조하였다. pJS03은 pJS02의 fabD 유전자를 pJS01에 삽입하고 pJS05 및 pJS06은 pJS04의 TE 유전자를 pJS01 및 pJS02에 각각 삽입하였다. pJS07은 TE 유전자를 pJS03에 삽입하여 제조하였다.
도 3은 대장균 SGJS17 추출물을 분석하여 장쇄 지방산 피크를 조사한 결과를 나타낸다. 표준시료에 대응하는 각 피크를 분석하였다. 도 3a의‘a'는 도데카노익산(34.763 min), 'b'는 테트라데카노익산(42.077 min), 'c'는 9-헥사데세노익산(48.125 min), 'd'는 헥사데카노익산(48.823 min), 'e'는 9-옥타데세노익산(54.098 min), 'f'는 옥타데카노익산(55.015 min)를 나타낸다. 도 3b는 헥사데카노익산(48.823 min)에 GC/MS를 적용하여 분석한 결과이고, 도 3c는 옥타데카노익산(55.015 min)에 GC/MS를 적용하여 분석한 결과이다.
도 4는 수정된 M9 최소배지에서 배양한 야생형 대장균, 대장균 SGJS06 및 대장균 SGJS17의 성장 곡선(도 4a) 및 장쇄 지방산 생산능(도 4b)를 보여준다. 균주를 12시간 동안 37℃로 수정된 M9 최소배지에서 배양하고 지방산 생산능을 증가시키기 위해 배양배지 내 질소원의 양을 0.5 g/L 또는 0.05 g/L로 감소시켜 후배양(post-culture incubation)한 결과이다. 후배양은 30℃에서 12시간 및 24시간 동안 배양하고 지방산을 분석하였다.
도 5는 도 4와 동일한 조건에서 포화 지방산(Saturated Fatty acid; SFA) 및 불포화 지방산(Unsaturated Fatty acid; UFA)을 분석한 결과를 보여준다. TFA는 총 지방산(Total Fatty acid)를 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

미생물 균주 및 배지

슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PA14(ATCC, 미국) 및 대장균(Escherichia coli) K-12 MG1655(ATCC, 미국)을 지방산 생산을 위한 숙주세포로 사용하였다. 슈도모나스 애루지노사 PAO1(한국미생물보존센터, 대한민국) 및 스트렙토코커스 피오제네스(S. pyogenes) MGAS102270(혈청형 M3, ATCC, 미국)의 지노믹 DNA로부터 accA, fabD 및 아실-ACP TE 유전자를 클로닝하였다. 재조합플라스미드를 안정화하는데 컴피턴트 대장균 AG1(stratagene, 미국)을 사용하였다. 본 발명에서 사용된 균주를 표 1에 정리하였다. 슈도모나스 애루지노사 PA14 및 슈도모나스 애루지노사 PAO1는 LB(Luria Broth) 배지(10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl 및 5 g/L 효모추출물)에서 배양하였고, 형질전환체는 200 ㎍/㎖ 카르베니실린(carbenicillin)을 포함하는 LB-아가(agar) 평판배지를 이용하여 선별하였다. 대장균 AG1 및 대장균 K-12 MG1655 균주는 LB 배지에서 배양하였고, 형질전환체는 50 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB-아가 평판배지에서 선별하였다.

균주 또는 플라스미드	관련 특성 또는 서열	출처 또는 효소 부위
대장균(E. coli)
AG1	FendA1 hsdR17 [Kn^,mk⁺] supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1	Stratagene
K-12 MG1655	F^- lambda- ilvG- rfb-50 rph-1	ATCC
SGJS04	pJS01를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
SGJS05	pJS02를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
SGJS06	pJS03를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
SGJS14	pJS04를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
SGJS15	pJS05를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
SGJS16	pJS06를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
SGJS17	pJS07를 포함하는 E. coli K-12 MG1655	본 발명
슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa )
PAO1	원영양체(prototroph)	KCCM
PA14	원영양체
SGJS01	pJS01를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
SGJS02	pJS02를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
SGJS03	pJS03를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
SGJS07	pJS04를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
SGJS08	pJS05를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
SGJS09	pJS06를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
SGJS10	pJS07를 포함하는 P. aeruginosa PA14	본 발명
플라스미드
pGEM-T	T-이지 벡터	Promega
pUCP19	pUC18/19 유래의 대장균-슈도모나스 셔틀 벡터	ATCC
pJS01	P. aeruginosa PAO1 accA 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
pJS02	P. aeruginosa PAO1 fabD 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
pJS03	P. aeruginosa PAO1 accA and fabD 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
pJS04	S. pyogenes MGAS10270 thioesterase 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
pJS05	P. aeruginosa PAO1 accA gene and S. pyogenes MGAS10270 thioesterase 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
pJS06	P. aeruginosa PAO1 fabD gene and S. pyogenes MGAS10270 thioesterase 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
pJS07	P. aeruginosa PAO1 accA and fabD 유전자 및 S. pyogenes MGAS10270 thioesterase 유전자를 포함하는 pUCP19	본 발명
프라이머
accA -F	5’-TCTAGACGACGGAAGCCTATGAACCCG-3’	XbaI
accA -R	5’-GGATCCTTACGGCGCGCCGTAGCTCAT-3’	BamHI
fabD -F	5’-GGTACCCAAGGGACCTATTCAATGTCTGC-3’	KpnI
fabD -R	5’-GAGCTCTTCTCTCCTTTCTCTCTCTCAGG-3’	SacI
thioesterase -F	5’-GAGCTCGGAGAGTATTATGGGATTAAGTTA-3’	SacI
thioesterase -R	5’-GAATTCCTAGTCTATCTCGCTTTCTGTTT-3’	EcoRI

형질전환체의 컨스트럭션

DNA 이지 티슈(Easy Tissue) 키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 슈도모나스 애루지노사 PAO1 및 스트렙토코커스 피오제네스 MGAS10270의 지노믹 DNA를 분리하였다. PCR에 사용된 프라이머를 표 1에 정리하였다. PCR 증폭반응은 다카라(Takara, 일본) PCR Thermal Cycler DICE Gradient로 수행하였다. PCR 산물을 젤 추출법(Dynabio, 프랑스)으로 분리하고 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하여 재조합 벡터를 제조하였다. 재조합 벡터를 대장균 AG1 컴피턴트 세포에 형질전환 하였다. accA, fabD 및 TE 유전자를 포함하는 플라스미드를 플라스미드 미니프렙 키트(Dynabio, 프랑스)를 사용하여 정제하였다. pUCP19 벡터(ATCC, 미국) 및 라이게이션 할 유전자를 표 1에 기재된 제한효소를 사용하여 항온반응 하였다[20]. 다양한 조합의 유전자를 포함하는 7개의 플라스미드를 제조하여 pJS01 내지 pJS07로 명명하였다(표 1 및 도 2). 대장균 K-12 MG1655 및 슈도모나스 애루지노사 PA14의 형질전환은 진 펄서(Gene Pulser) X 셀 전기영동 시스템(Bio-rad, 미국)을 이용하여 실시하였다.

배양 조건

형질전환된 슈도모나스 애루지노사 PA14 및 대장균 K-12 MG1655를 각각 카르베니실린을 포함하는 3 ㎖ LB 배지 및 암피실린을 포함하는 3 ㎖ LB 배지에서 37℃, 200 rpm 조건으로 밤새 진탕배양하였다. 500 ㎖ 쉐이크 플라스크에 카르베니실린을 포함하는 LB 배지 또는 암피실린을 포함하는 LB 배지 200 ㎖을 첨가하여 상기 3 ㎖의 종배양 중 배양물 1 ㎖(0.5%)를 첨가하고 회전진탕배양기(Jeotech, 대한민국)로 24시간동안 37℃에서 배양하였다. 배양물의 흡광도가 600 ㎚ 파장에서 0.6-0.8에 도달되었을 때(약 3시간 후), 배양배지에 0.5 mM IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다. 지방산 생산에 대한 탄소원의 영향을 분석하기 위해, 글루코오즈(Difco, 미국), 글리세롤(Difco, 미국), 수크로오즈(Difco, 미국) 및 아라비노오즈(시그마, 미국)을 1% 농도로 사용하였다.

지방산 제조를 위한 후배양( Post - cultural Incubation ; PCI )

야생형 대장균, 대장균 SGJS06 및 대장균 SGJS17을 암피실린(50 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지에 16시간 배양하고 이를 다시 새로운 LB 배지(암피실린 50 ㎍/㎖)에 접종하여 600 ㎚ 파장에서 0.6-1.0의 흡광도 값이 되었을 때, 최종 글리세롤 농도 25%로 보관용 균액을 제조하였다. 보관용 균액을 -80℃에서 실험 시까지 보관하였다.

30 ㎕ 보관용 균액을 10 ㎖ 튜브에 든 3 ㎖ LB(암피실린 50 ㎍/㎖)에 접종하여 16시간 동안 배양한 후, 종배양물(seed culture)로 이용하였다.

전배양(pre-cultivation)은 500 ㎖ 플라스크에 든 5 g/L 효모추출물을 포함하는 200 ㎖ 최소배지(4 g/L Na₂SO₄, 1.0 g/L NH₄Cl, 7.3 g/L K₂HPO₄, 1.8 g/L NaH₂PO₄H₂O, 12.0 g/L (NH₄)₂-H-Citrate, 0.25 g/L MgSO₄, 0.02 g/L 티아민 및 10 g/L 글루코오스)에 1 ㎖(0.5%) 종배양물을 접종하여 6시간동안 배양하였다.

본배양(main-cultivation)은 5 g/L 효모추출물을 첨가한 최소배지에서 전배양물 1 ㎖(0.5%)을 첨가하여 37℃로 12시간 동안 쉐이크 플라스크에서 배양하였다. 배양물의 흡광도가 600 ㎚ 파장에서 0.6-0.8에 도달되었을 때, 배양배지에 0.5 mM IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다.

후배양(post-cultural incubation)은 본배양의 배양물을 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 질소원(효모추출물)의 농도를 감소시킨 배양배지(0.5 g/L 효모추출물 및 0.05 g/L 효모추출물)를 첨가하여 부유시키고 24시간 동안 30℃로 배양하였다.

지방산 추출 및 메틸화

지방산 추출은 한국농업과학기술원의 과정에 따라 다음과 같이 실시하였다:

5 ㎖의 배양 샘플을 수득하고 원심분리하였다. 1 ㎖ 제1용액(45 g NaOH 및 150 ㎖ 메탄올을 첨가한 150 ㎖ 증류수)을 100 ℃ 샘플에 첨가하였다. 다음, 2 ㎖ 제2용액(325 ㎖ 6 N HCl 및 275 ㎖ 메탄올)을 샘플에 첨가하고, 이를 80℃에 정치하여 신속하게 감열하였다. 그 후, 1.25 ㎖ 제3용액(1:1=헥산:메틸 테르트-부틸 에스테르)를 혼합물에 첨가하였다. 샘플을 10분 동안 혼합하고 샘플의 아랫구획은 제거하였다. 남아있는 헥산/메틸 테르트-부틸 에스테르 층을 3 ㎖ 제4용액(10.8 g NaOH가 첨가된 900 ㎖ 증류수)로 세척하고, 샘플이 든 튜브를 다시 혼합하였다. 마지막으로, 헥산/메틸 테르트-부틸 에스테르 층을 수득하였다[16].

지방산의 분석 및 정량

총 장쇄 지방산의 함량 및 구성을 결정하기위해 HP-5 컬럼(필름 두께, 30×0.32 m×0.25 ㎛)으로 아질런트(Agilent) 5975 C 시리즈 GC-매스 분광검출기 시스템(7890A GC 및 5975 C inert MSD)를 사용하여 GC/MS(Gas Chromatography/Mass Spectrometry)를 실시하였다. 이동상으로 헬륨을 사용하였다. 피크는 매스 스펙트럼 데이터베이스와 비교하여 확인하였다[1]. 지방산 메틸 에스테르 표준(F.A.M.E. Mix, C8-C24, Sigma, 미국) 검정곡선과 비교하여 지방산 함량을 추정하였다. 샘플을 1:5의 분배율(split ratio)로 주입하였다. 다음의 온도 프로그램으로 진행하였다:

40℃에서 5분 동안 유지한 후 250℃까지 3℃/분로 가열하여 250℃에서 5분 동안 유지하고 검출기는 280℃로 유지하였다[21].

결과

재조합 슈도모나스 애루지노사 및 재조합 대장균의 제조

슈도모나스 애루지노사 PA14의 지방산 합성 대사 기작을 도 1에 나타내었다. 슈도모나스 애루지노사 PA14의 글루코오스를 탄소원으로 사용한 지방산합성 대사 경로는 대장균 K-12 MG1655와 유사하다[7, 16]. 본 발명에서, 지방산 합성의 초기 단계(AccA 및 FabD) 및 지방산 합성의 신장 사이클(TE)과 관련된 필수 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. AccA를 코딩하는 accA 유전자는 960-bp ORF(Open Reading Frame)을 갖으며, FabD를 코딩하는 fabD 유전자는 930-bp ORF를 갖는다. TE 효소를 코딩하는 TE 유전자는 753-bp ORF를 갖는다.

본 발명에서, 재조합 플라스미드 pJS01, pJS02 및 pJS04는 각각 accA, fabD 및 TE 유전자가 pUCP19 벡터에 삽입되었다. pUCP19 벡터는 pUC18/19 유래의 대장균-슈도모나스 셔틀 벡터이다[21]. pJS03는 pJS02의 fabD 유전자를 pJS01에 삽입하여 제조하였고, pJS05 및 pJS06은 pJS04의 TE 유전자를 각각 pJS01 및 pJS02에 삽입하여 제조하였다. pJS07은 TE 유전자를 pJS03에 삽입하여 제조하였다. 다수의 유전자를 하나의 벡터에 삽입하므로, 벡터의 안정성을 높이기 위해 순차적으로 구성하였다. 본 발명에서 제조한 재조합 플라스미드를 표 1에 정리하였다. 제조된 플라스미드의 맵을 도 2에 나타내었다. 재조합 플라스미드를 슈도모나스 애루지노사 PA14 및 대장균 K-12 MG1655에 형질전환 하였다. 형질전환 균주에 대하여 슈도모나스 애루지노사 SGSJ01 및 SGJS04, 슈도모나스 애루지노사 SGSJ02 및 SGJS05, 슈도모나스 애루지노사 SGJ03 및 대장균 SGJS06, 슈도모나스 애루지노사 SGJS07 및 대장균 SGJS14, 슈도모나스 SGJS08 및 대장균 SGJS15, 슈도모나스 애루지노사 SGJS09 및 대장균 SGJS16, 및 슈도모나스 애루지노사 SGJS10 및 대장균 SGJS17이라 명명하였다(표 1).

지방산 함량의 결정

제조된 균주의 세포건조중량을 측정하여 바이오매스의 생산을 야생형 슈도모나스 애루지노사 및 야생형 대장균과 각각 비교하였다(표 2 및 표 3). 재조합 균주의 성장은 다양한 유전자 조합 또는 재조합 플라스미드의 삽입으로 인해 저해되지 않았다. TE 유전자를 삽입한 경우(슈도모나스 애루지노사 SGJS07, SGJS08, SGJS09 및 대장균 SGJS14, SGJS15, SGJS16)의 세포건조중량은 야생형 및 accA 또는 fabD 유전자를 포함하는 재조합 슈도모나스 애루지노사 및 재조합 대장균보다 적었다.

재조합 슈도모나스 애루지노사 및 재조합 대장균 균주를 LB 배지에서 배양하고 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하여, 6시간 및 21시간에 샘플을 수확하여 IPTG에 의한 영향을 조사하고 지방산의 구성 및 함량을 조사하였다. 야생형 및 재조합 균주에서 헥사데카노익산(Hexadecanoic acid; C16) 및 옥타데카노익산(Octadecanoic acid; C18)이 주요 지방산 구성요소로 검출되었다(표 2, 표 3 및 도 3)[1,16].

재조합 슈도모나스 애루지노사 및 대장균은 동일한 재조합 벡터를 포함하여도 다른 지방산 생성 결과를 보여주었다. 4 종류의 서브유니트 중 accA 유전자만 발현됨에도 불구하고, 슈도모나스 애루지노사 SGJS01, SGJS08 및 SGJS10은 야생형 대장균과 비교하여 지방산(C16 및 C18) 함량이 상당히 증가하였다. 단 하나의 유전자만 삽입된 대장균 SGJS06 및 대장균 SGJS14은 가장 높은 지방산 정도를 보여주었다. 종합적으로, 유전적 조작으로 인해 재조합 대장균은 슈도모나스 애루지노사보다 높은 지방산(C16 및 C18) 함량을 보여주었다. 특히, 대장균 SGJS06의 C18 함량은 슈도모나스 애루지노사 SGJS03보다 3배 높은 함량을 나타내었다.

균주	지방산 함량 (㎎/L)								DCW (g/L)^a	DCW (g/L)^b
	헥사데카노익산(C16)				옥타데카노익산(C18)
	6 h	21 h	mg /g DCW^a	mg/g DCW^b	6 h	21 h	mg /g DCW^a	mg/ g DCW^b
P. aeruginosa PA14(야생형)	59.0±1.1	90.3±1.4	59	55	26.6±0.5	24.6±0.5	27	15	1.00±0.1	1.65±0.1
P. aeruginosa SGJS01	46.6±1.0	112.0±1.5	45	70	26.4±0.7	39.2±0.6	25	25	1.04±0.2	1.60±0.2
P. aeruginosa SGJS02	67.7±1.3	79.3±2.7	63	46	31.1±0.9	21.4±0.3	29	12	1.07±0.1	1.73±0.2
P. aeruginosa SGJS03	74.5±1.5	86.9±2.0	65	47	29.4±0.5	20.0±0.4	26	11	1.15±0.1	1.86±0.2
P. aeruginosa SGJS07	69.5±2.2	86.6±1.8	60	60	32.6±0.5	24.6±0.5	28	17	1.16±0.2	1.43±0.1
P. aeruginosa SGJS08	75.1±2.1	98.6±2.3	100	67	31.5±0.6	27.6±0.7	42	19	0.75±0.1	1.47±0.1
P. aeruginosa SGJS09	77.0±1.4	89.3±3.0	104	65	31.5±1.1	25.0±0.4	42	18	0.74±0.1	1.37±0.1
P. aeruginosa SGJS10	77.3±1.7	129.1±4.2	106	78	34.9±0.8	47.4±0.5	48	29	0.73±0.2	1.66±0.2

균주	지방산 함량(mg/ L)								DCW (g/L)^a	DCW (g/L)^b
	헥사데카노익산(C16)				옥타데카노익산(C18)
	6 h	21 h	mg /g DCW^a	mg/g DCW^b	6 h	21 h	mg /g DCW^a	mg/g DCW^b
E. coli K12 MG1655(야생형)	82.6±1.5	100.4±2.5	55	88	43.6±2.1	43.8±2.4	29	27	1.51±0.1	1.64±0.1
E. coli SGJS04	86.0±1.7	106.4±3.1	73	77	41.0±1.8	49.4±2.1	35	25	1.18±0.1	2.01±0.1
E. coli SGJS05	87.4±2.2	114.3±3.2	74	81	45.4±1.1	52.2±2.4	38	25	1.18±0.1	2.05±0.2
E. coli SGJS06	88.8±2.1	169.5±4.2	84	118	45.2±1.2	75.8±3.5	43	37	1.06±0.1	2.08±0.2
E. coli SGJS14	104.8±3.0	137.1±2.7	84	106	45.5±1.2	54.8±2.2	37	30	1.24±0.2	1.80±0.1
E. coli SGJS15	89.2±2.3	111.5±2.1	92	88	41.9±1.3	48.7±1.8	43	27	0.97±0.1	1.82±0.1
E. coli SGJS16	89.1±2.1	72.7±2.0	92	83	39.7±1.6	34.8±1.4	41	27	0.97±0.1	1.30±0.1
E. coli SGJS17	107.7±4.5	126.0±3.4	102	69	54.7±2.3	56.8±2.1	52	21	1.06±0.1	2.66±0.3

표 2 및 표 3의 윗첨자 ‘a’는 IPTG를 첨가하고 6시간의 결과를 나타내고, 윗첨자 ‘b’는 IPTG를 첨가하고 21시간의 결과를 나타낸다.

장쇄 지방산 제조 시 탄소원의 영향

재조합 대장균에 대하여 탄소원의 영향을 조사하기 위해, IPTG 유도 후 21시간에 장쇄 지방산 함량을 분석하였다. 총 지방산의 생성은 1% 글리세롤 및 수크로오즈를 첨가하였을 때 최대값을 나타냈고, 총 지방산의 함량은 야생형에서도 증가하였다(표 4). 세포의 성장 및 지방산의 함량이 동시에 증가하는 이전의 연구결과를 기초로 하여, 세포건조중량에 대한 장쇄 지방산의 함량을 계산하였다[13,22]. 표 4에서 확인할 수 있듯이, 지방산 함량은 탄소원의 종류에 따라 약간의 차이를 보였다. 세포내 총 장쇄 지방산 함량은 글루코오스를 첨가한 LB 배지에서 배양한 야생형 대장균과 비교하여 대장균 SGJS17(accA, fabD 및 TE 유전자 포함)에서 가장 현저하게 높았다.

본 발명에서는 지방산의 구성도 측정하였다. 대장균 SGJS14 및 대장균 SGJS17에서의 불포화지방산의 함량은 대장균 SGJS06 및 야생형 대장균보다 높았다. 탄소원을 포함하는 LB 배지에서 배양한 대장균 SGJS17의 불포화지방산 함량은 LB 배지에서 배양한 동인 균주와 비교하여 3-6배 높았다. 이러한 결과는 대장균 숙주에서 스트렙토코커스 피오제네스의 TE 유전자가 슈도모나스 애루지노사의 accA 및 fabD 유전자와 동시-발현에 적합하며, 이러한 유전자 조합의 과발현이 탄소원을 첨가한 배지에서 세포내 지방산 생산을 개선할 수 있음을 보여준다.

후배양

세포내 지방산 함량을 향상시키기 위해, 탄소원(글루코오즈)을 유지하고 질소원(효모추출물)을 감소하였다. 질소원을 조절하기 위해, 재조합 대장균을 수정된 M9 최소배지에서 배양하였다. 이는 LB 배지에서 배양된 재조합 대장균과 배교하여 낮은 지방산 생산을 나타내었다.

전반적으로, 후배양(Post-culture Incubation; PCI) 과정으로 인해 재조합 대장균 내의 장쇄 지방산 함량은 증가하였다. 세포 성장 이후에, 총 지방산 함량은 질소원이 100배 희석(0.05 g/L)된 배지보다 질소원이 10배 희석(0.5 g/L)된 배지에서 증가하였다(도 4). 그러나 세포 내 지방산 함량은 0.05 g/L 효모추출물을 첨가한 M9 배지에서 낮았다. 본배양에서, 대장균 SGJS17은 0.05 g/L 효모추출물을 첨가한 M9 배지에서 PCI 후 12시간에 약 1.3배 증가하고 24시간에 1.6배정도로 가장 높은 지방산의 함량을 나타내었다. 대장균 SGJS17의 지방산 함량은 PCI 후에 야생형과 비교하여 약 3배 증가하였다. 가장 중요한 것은, PCI 방법을 사용하여 대장균 SGJS17의 총 지방산 내 불포화지방산의 함량을 야생형과 비교하여 약 20배 증가시킨 것이다(도 5).

결론

본 발명은 장쇄 지방산 제조에 있어 지방산 합성 경로 내 3 종류의 필수 효소를 동시-발현하여 영향을 조사하였다. 본 발명은 슈도모나스 애루지노사 PA14 및 대장균 K-12 MG1655의 동시-발현을 통해 총 장쇄 지방산의 생산을 증가시키고자 하였다. 야생형 균주와 비교하여 재조합 균주의 장쇄 지방산 생산은 1.3-1.7배 증가하였다. 특히, 발명자들은 박테리아 세포에서 불포화지방산의 함량을 약 20배 개선할 수 있는 새로운 실험방법을 개발하였다. 이러한 결과는 상업적인 바이오 디젤 생산과정에 있어 장쇄 지방산의 대량 생산에 용이하게 적용될 것으로 기대된다.

참고문헌

1. Liu, T., & Khosla C. (2010). Annuual Review of Genetics , 44, 53-69.

2. Steen, E. J., Kang, Y., Bokinsky, G., Hu, Z., Schirmer, A., McClure, A., Cardayre, S. B., & Keasling, J. D. (2010). Nature letters , 463, 559-563.

3. Cao, Y., Yang, J., Xian, M., Xu, X., & Liu, W. (2010). Applied Microbiology and Biotechnology , 87, 271-280.

4. Liu, X., Sheng, J., & Curtiss, R. (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 108, 6899-6904.

5. Antoni, D., Zverlov, V. V., & Schwarz, W. H. (2007). Applied Microbiology and Biotechnology , 77, 2335.

6. Nawabi, P., Bauer, S., Kyrpides, N., & Lykidis, A. (2011). Applied and Environmental Microbiology, 77, 8052-8061.

7. Jeon, E. Y., Lee, S. H., Won, J. I., Han, S. O., Kim, J. Y., & Lee J. W. (2011). Enzyme and Microbial Technology , 49, 44-51.

8. Kalscheuer, R., Stolting, T., & Steinbuchel,A. (2006) Microbiology , 152, 2529-2536.

9. Magnuson, K., Jackowski, S., Rock, C. O., & Cronan, J. E. (1993). Microbiological Reviews , 57, 522-542.

10. Chan, D. I., & Vogel, H. J., (2010). Biochemical Journal , 430, 119.

11. Marrakchi, H., Zhang, Y. M., & Rock, C. O. (2002). Biochemical Society Transaction , 30, 1050-1055.

12. Liu, T., Vora, H., & Khosla, C. (2010). Metabolic Engineering , 12, 378-386.

13. Lu, X., Vora, H., & Khosla, C. (2008). Metabolic Engineering , 10, 333-339.

14. Lennen, R. M., Braden, D. J., & West, R. M., Dumesic, J. A., & Pfleger, B. F. (2010). Biotechnology and Bioengineering , 106, 193-202.

15. Zha, W., Rubin-Pitel, S. B., Shao, Z., & Zhao, H. (2009). Metabolic Engineering , 11, 192-198.

16. Lee, S. H., Jeon, E. Y., Yun, H. S., & Lee J. W. (2011). Biotechnologyand Bioprocess Engineering , 16, 706-713.

17. Zhang, X., Li, M., Agrawal, A., & San K. Y., (2011). Metabolic Engineering, 13, 713-722.

18. Kutchma, A. J., Hoang, T. T., & Schweiser, H. P. (1999). Journal of Bacteriology , 181, 5498-5504.

19. Wada, M., Fukunaga, N., & Sasaki, S. (1989). Journal of Bacteriology , 171, 4267-4271.

20. Schweizer, H. P. (1991). Gene , 97, 109-121.

21. Mangas, J. J., Gonzilez, M. E., Rodrfguez, R., & Blanco D. (1996). Chromatographia , 42, 101-105.

22. Kang, Z., Du, L., Kang, J., Wang, Y., Wang, Q., Kiang, Q., & Qi, Q. (2011). Bioresource Technology, 102, 6600-6604.

23. Best, E. A., & Knauf, V. C. (1993). Journal of Bacteriology , 175, 6881-6889.

24. Davis, M. S., Solbiati, J., & Cronan, J. E. (2000). Journal of Biological Chemistry , 275, 28593-28598.

25. Cahoon, E. B., Mills, L. A., & Shanklin, J. (1996) Journal of Bacteriology , 178, 936939.

26. Cao, Y., Xian, M., Yang, J., Xu, X., Liu, W., & Li, L. (2010). Protein Expression and Purification, 69, 209214.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Method for Preparing fatty acid using Microorganism <130> PN120327 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 951 <212> DNA <213> accA of P. aeruginosa PA01 <400> 1 atgaacccga actttcttga tttcgaacag ccgatcgccg acctgcaagc caagatcgaa 60 gagctgcgcc tggtgggcaa cgacaatgcg ctgaacatca gcgacgaaat ctcgcgtctg 120 caggacaaga gcaaggcgct caccgaaaac atcttcggca atctgtccag ttggcagatc 180 gcccagctcg cgcgccatcc caagcgtccc tataccctcg actacatcgg ctacctgttc 240 agcgatttcg aggaactgca cggcgaccgg catttcgccg acgacccggc gatcgtcggc 300 ggcgttgccc gcctcgacgg ttccccggtg atggtcatcg gccaccagaa gggccgcgaa 360 gtccgtgaga aggtccggcg caacttcggc atgccgcgtc cggaaggcta tcgcaaggcc 420 tgccgcctga tggaaatggc cgaacgcttc aagatgccga tcctcacctt catcgacacg 480 cccggcgcct acccggggat cgatgccgag gaacgcggcc agagcgaggc gatcgcctgg 540 aacctgcggg tgatggcgcg actgaagacg ccgatcatcg ccaccgtgat cggcgagggc 600 ggttccggcg gcgcgctggc catcggtgtc tgcgaccagt tgaacatgct gcaatactcc 660 acctattcgg tgatctcgcc ggaaggctgc gcctccatcc tctggaagac cgccgagaag 720 gcgccggaag ccgccgaggc catgggcatc accgccgagc gcctgaaagg cctgggcatc 780 gtcgacaagg tcatcgacga accgctgggc ggcgcccatc gcgatccggc gagcatggcc 840 gaatcgatcc gtggcgaact gctggcgcaa ctgaagatgc tccagggcct ggaaatgggt 900 gagttgctgg agcgtcgtta cgaccgcctg atgagctacg gcgcgccgta a 951 <210> 2 <211> 939 <212> DNA <213> fabD of P. aeruginosa PAO1 <400> 2 atgtctgcat ccctcgcatt cgtcttccct ggccagggtt cgcaatccct cggcatgctg 60 gccgagctgg gcgcccagca ggcgctggtg cgcgatacct tcgccgaggc ctccgaggcg 120 ctcggttacg acctttgggc gctggtccag aatggtcctg aagagcgcct gaaccagacc 180 gacaagaccc agccggccat ccttacggtt tcgatcgcgc tctggcgcct ctggctggcc 240 gagggcggtg cgcgcccggc gttcgtcgcc gggcacagcc tgggcgaata ttccgcgctg 300 gtcgcggccg aaagcctggc gttcgccgat gcggtcaagc tggtcgagcg taggggccaa 360 ctgatgcagc aggcggttcc ggcggggcag ggcggcatgg ccgcgatcct tggcctggaa 420 gacgccgatg tattggcggc ctgtgccgag gcggcccagg gcgaggtggt cagcgcggtc 480 aacttcaacg cgccggggca ggtagtgatc gccggtgccg cggctgccgt tgagcgtgcc 540 atcgaggcat gcaaggcacg cggcgccaag cgcgcggtgg cgttgccagt cagcgtgccg 600 tcgcattgcg aactgatgcg tccggccgcc gagcagttcg ccgcctcggt cgaaagcctg 660 cagtggcagg cgccgaagat ttcgctggtg cagaacgtca gcgccgccgt gccggctgat 720 ctcgatacgc tgcgccgcga cctgctggca cagctgtaca gcccggttcg ctgggtggag 780 agcatccagc tgctggcgga aaagggcgtc accgagctgg tcgagtgcgg gccgggcaag 840 gtcctggcag gcctcaacag gcgctgcgcg aagggcatca atacccatgg cctggatggc 900 gtcgaggcgt tcgccgccac gcgcgccgcc ctggcctga 939 <210> 3 <211> 753 <212> DNA <213> TE of S. pyogenes <400> 3 atgggattaa gttatcagga ggagttgaca cttccttttg aattatgtga tgtcaaatca 60 gatataaaat tgcccctttt attagactat tgtttgatgg tttctggtag acagtctgcg 120 caattaggac gaagtaacaa caacctttta gtcgattaca agcttgtttg gattgtaacg 180 gattatgaga tcactattca tcgcttgcca cattttcaag aaaccatcac cattgaaaca 240 aaagcccttt cctataataa atttttttgt tatcgccaat tttatattta tgatcaagag 300 gggggtcttt tagtggatat cttagcctat tttgctttgt taaacccaga tacgcgaaaa 360 gtggcaacta ttccagaaga tttagtagcg ccttttaaga ctgattttgt taaaaagtta 420 taccgtgttc ctaaaatgcc tcttttagaa caatcaattg atcgtgatta ttatgtgcgt 480 tattttgata ttgatatgaa tggtcatgtc aacaacagta aatatttaga ttggatgtat 540 gatgtgttgg ggtgtgcgtt tttaaaaacg catcagcctc ttaagatgac tttgaaatat 600 gttaaagaag tctcaccagg cggtcaaatt acttccagtt accatttgga ccaattaaat 660 tcttaccatc aaatcacctc agatgggcag ctgaatgccc aagccatgat tgaatggcga 720 gcgattaaac aaacagaaag cgagatagac tag 753

Claims

다음의 단계를 포함하는 미생물을 이용한 지방산(fatty acid) 제조 방법:
(a) 1-10 g/L 질소원을 포함하는 배양배지에서 배양하는 본배양(main cultivation) 단계; 및
(b) 상기 본배양의 배양물 중 배양균을 수확하여 0.01-1.00 g/L 질소원을 포함하는 새로운 배양배지에서 배양하는 후배양(post-cultural incubation) 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 미생물은 야생형 균주 또는 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 재조합 균주는 슈도모나스 종의 아세틸-CoA 카르복실라아제 A(acetyl-CoA carboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 슈도모나스 종의 말로닐-CoA/ACP 트랜스아실라아제(Malonyl-CoA/ACP transacylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 스트렙토코커스 종의 아실-ACP 티오에스터라아제(Acyl-Acyl Carrier Protein thioesterase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 단계 (b)의 질소원은 효모추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 배양배지는 글루코오스, 글리세롤, 수크로오스 또는 아라비노오즈를 탄소원으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 배양배지는 글루코오스 또는 글리세롤을 탄소원으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 본배양은 35-40℃에서 8-15시간동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계(b)의 후배양은 27-34℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 지방산은 C₁₂-C₃₆ 포화 지방산 및/또는 C₁₂-C₃₆ 불포화 지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 lac 프로모터를 포함하며 상기 방법은 단계 (a) 이후에 배양배지에 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 재조합 균주는 야생형 균주의 지방산 생산능와 비교하여 불포화 지방산 생산능이 15-25배 증가하고 포화 지방산 생산능이 2-3배 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 지방산.