KR20130142635A

KR20130142635A - 리보스위치를 이용한 라이신 고생산균 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20130142635A
Application number: KR1020120066007A
Authority: KR
Inventors: 정규열; 장성호; 양진아; 서상우
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-12-30
Also published as: KR101411716B1

Abstract

본 발명은 리보스위치를 이용한 라이신 고생산균 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터 및 이를 이용한 스크리닝 방법 등에 관한 것이다. 본 발명의 리보스위치 및 이를 이용하여 라이신(Lysine) 고생산균을 스크리닝하는 방법은 라이신을 고농도로 생산하는 균주를 비교적 빠르고 쉽게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 이용한 트립토판 생산의 가격경쟁력을 높일 수 있다.

Description

리보스위치를 이용한 라이신 고생산균 스크리닝 방법{Method for Screening Microorganism with High Lysine Productivity Using Riboswitch}

본 발명은 리보스위치를 이용한 라이신 고생산균 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터 및 이를 이용한 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.

미생물을 이용한 대사산물을 생산하는 방법의 가격경쟁력을 높이기 위해 지속적으로 균주 개발이 이루어지고 있다. 전통적이면서 효과적인, 균주 개발을 위한 조합적 접근법은 생산 균주를 기반으로 균주 라이브러리를 생성한 후 라이브러리 안의 개선된 균주를 스크리닝하는 단계로 이루어져 있다. 그 예로 1960년대 추출법에서 미생물을 이용한 발효법으로 생산방법이 전환된 MSG(monosodium glutamate)생산균주의 개발 사례를 들 수 있다.

균주 라이브러리를 생성하기 위하여 예전에는 UV 조사, NTG(nitrosoguanidine)와 같은 화학적 돌연변이원을 첨가하는 화학적 변이법 등이 사용되었다. 분자생물학적 도구와 생화학적 지식이 축적된 현대에 들어서는 PCR(polymerase chain reaction) 기반으로 유전자에 돌연변이를 유발시키거나 프로토플라스트 퓨전(protoplast fusion)을 통한 게놈 셔플링(genome shuffling), 트랜스포손(transposon)을 이용한 임의 삽입(random insertion) 등의 다양한 균주 라이브러리 생성법이 제시되었다. 균주 라이브러리의 크기가 커질수록 그 중에 목적 대사산물 고생산균이 포함되었을 가능성이 높아지므로, 상기된 라이브러리 제조방법을 다중으로 사용함으로써 균주 라이브러리를 생성할 수 있다.

균주의 목적 대사산물 생산성을 파악하기 위해서 다양한 분석법이 쓰이고 있다. 액체/기체 크로마토그래피(LC/GC)는 개별 균주를 배양한 후 배양액과 균주 내의 대사산물 농도를 분석하는 방법이다. 이 방법은 대부분의 대사산물을 검출할 수 있고 표준검정곡선을 얻을 수 있다면 정량적 분석이 가능하다. 하지만 한 번에 한 종의 변이 균주에 대해서만 측정할 수 있기 때문에 처리량(throughput)이 낮아서 일정 크기 이상의 균주 라이브러리를 분석하기에는 비효율적이다.

멀티웰플레이트(multiwell plates)를 사용한 대사산물 분석 방법은 변이 균주를 구분된 칸(well)에 투입한 뒤 소량 시료의 발색, 흡광도 또는 형광도 등의 변화를 측정하여 시료 안의 대사산물의 농도 변화를 분석하는 방법이다. 소량의 시료를 사용하고, 멀티플레이트를 사용하기 때문에 비교적 다수의 변이 균주들을 동시에 분석할 수 있다. 그러나 상기된 제조방법에 의해 만들어진 크기가 큰 균주 라이브러리를 분석하기에는 처리능이 낮다. 또한, 대사산물을 기질로 한 발색 반응이 가능하거나, 흡광도 또는 형광도의 변화를 측정할 수 있는 대사산물에 대해서만 적용 가능하기 때문에 활용범위가 좁다.

유전적 바이오센서를 활용하여 생산 균주를 스크리닝하는 방법은 합성된 목적 대사산물의 농도를 즉각적으로 검출할 수 있는 신호로 전환시켜서 검출한다. 목적 대사산물에 특이적인 바이오센서를 개발하여 적용한다면 적합한 검출기를 활용함으로써 시각적으로 검출할 수 없는 목적 대사산물의 농도변화를 관찰할 수 있다.

FACS(fluorescence activated cell sorting) 기법은 변이 균주를 검출기로 흘려보내면서 개별 균주에서 방출되는 형광을 검출한다. 대량의 세포들을 동시에 흘려보내며 매우 빠르게 형광검출을 할 수 있기 때문에, 처리능이 10⁹ 이상에 달한다. 목적 대사물질이 형광을 내는 경우, 큰 라이브러리를 비교적 빠르고 쉽게 분석할 수 있기 때문에 고생산균을 효율적으로 스크리닝 할 수 있다. 그러나 형광을 나타내는 대사산물에 대해서만 적용할 수 있다는 한계점이 있다.

마지막으로 선별(selection) 방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 균주 라이브러리에서 목적 대사산물을 고농도로 생산해내는 균주만 살아남도록 만드는 기술이다. 이 방법은 처리량이 매우 높아서 큰 균주 라이브러리로부터 고생산 균주만을 효과적으로 골라낼 수 있다. 그러나 목적 대사산물의 농도가 균주의 성장 혹은 생존에 관여하는 경우에만 이 기술을 적용할 수 있다.

한편, 리보스위치(riboswitch)는 세포 내에서 특정 대사산물의 농도를 감지하여 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 생체 센서로서, 기질 특이성과 기질 친화도가 매우 높다. 또한, SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 기술을 이용하여 특정 대사산물에 결합하는 압타머(aptamer)를 생성하고, 이를 기반으로 리보스위치를 만드는 기술들이 개발되어 있다. 따라서 우리가 스크리닝 하고자 하는 대사산물만을 특이적이고 민감하게 인지하여 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 리보스위치를 개발할 수 있다.

이렇게 개발한 리보스위치의 하류에 선택 표지 유전자를 삽입하게 되면, 목적 대사산물의 농도에 따라 선택표지 유전자의 발현을 조절하는 RNA device를 얻을 수 있다. 다양한 방법을 이용하여 생성한 균주 라이브러리에 RNA device를 도입하면 각 균주 내부의 목적 대사산물의 농도에 따라서 선택표지 유전자의 발현량이 달라진다. 이때, 인공선택회로로 형질전환된 균주 후보군을 RNA device의 선택표지 유전자에 대응하는 적합한 선택압에 노출시킬 경우, 목적 대사산물을 고농도로 생산하는 균주만 살아남게 될 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 다양한 목적 대사산물에 대해 적용할 수 있고, 높은 처리량을 가지는 스크리닝 기술을 개발하고자 한다. 이를 위하여 본 발명은 라이신(Lysine) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치를 제공하고자 한다. 본 발명은 또한, 상기 리보스위치를 이용하여 라이신(Lysine) 고생산균을 효과적으로 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 라이신 리보스위치(riboswitch)는 서열번호 1로 기재되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 TetA 유전자는 서열번호 31로 기재되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터는 서열번호 11로 기재되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터로 형질전환된 균주를 제공한다. 상기 형질전환 균주는 기탁번호 KCTC 12184BP인 것을 특징으로 한다. 상기 균주의 종류에는 제한이 없다. 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)이다.

또한, 본 발명은 균주 라이브러리에 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환 하는 단계 및 상기 형질전환된 균주를 테트라마이신이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 라이신 고생산 균주를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 균주 라이브러리에 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환 하는 단계 및 상기 형질전환된 균주를 니켈이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 라이신 저생산 균주를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 30의 염기서열로 구성되는 프로모터 및 ppc 유전자를 포함하는 라이신 고생산용 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 ppc 유전자는 서열번호 33의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 리보스위치 및 이를 이용하여 라이신(Lycine) 고생산균을 스크리닝하는 방법은 라이신을 고농도로 생산하는 균주를 비교적 빠르고 쉽게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 이용한 라이신 생산의 가격경쟁력을 높일 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 리포터 시스템의 제조방법을 나타낸 개략적인 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 상대적 라이신 저생산 균주 제작을 위한 유전자 재조합 방법을 나타낸 개략적인 모식도이다.
도 3은 라이신 생산성에 따른 균주의 비형광값의 변화를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 인공선택 회로가 삽입된 라이신 생산성이 상이한 균주의 니켈과 테트라사이클린 선택압에 따른 성장 속도를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 고수율 생산균주를 제작하기 위하여 합성경로 상의 유전자들의 프로모터를 교체하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 고수율 생산균주를 제작하기 위하여 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 ddh 유전자를 도입하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 고수율 생산균주를 제작하기 위하여 경쟁대사를 제고하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 8은 강화된 M9 배지에서 0.8 mM 니켈을 첨가하였을 때 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)를 가진 W3110, W3110_ME의 비성장속도를 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 W3110/pACYC_ribo_TetA와 W3110_ME/pACYC_ribo_TetA에 테트라사이클린을 선택압으로 주었을 때의 비성장속도를 관찰한 결과이다.
도 10은 균주 혼합 시 본 발명의 선택회로의 작동 여부를 확인한 PCR 결과이다.
도 11은 ppc 발현량이 다른 라이브러리 생성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 인리치먼트된 변이주인 W3110_MEΔppc/pCDF_F0.3ppc의 라이신 축적량이 라이브러리화 되기 전의 균주인 W3110_ME/pCDF_Duet보다 더 높은 라이신 축적량을 분석한 결과이다.
도 13은 ribo_sGFP 유전자 서열을 나타낸 그림으로서, 빨간색은 제한효소사이트를, 파란색은 프로모터 서열을, 초록색은 lysC 5'UTR을, 나머지 부분은 sgfp 유전자와 터미네이터(terminator)를 나타낸다.
도 14는 ribo_TetA 유전자 서열을 나타낸 그림으로서, 빨간색은 제한효소사이트를, 파란색은 프로모터 서열을, 초록색은 lysC 5'UTR을, 나머지 부분은 TetA 유전자와 터미네이터(terminator)를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 LA-Taq 폴리머라제(LA-Taq polymerase), Phusion 폴리머라제(Phusion polymerase) 및 제한효소들은 각각 TaKaRa, New England Biolabs에서 구매하였다. pACYC_ribo_TetA, pACYC_ribo_sgf와 프로모터 라이브러리를 만드는데 사용한 pACYC_Duet, pCDF_Duet 벡터는 Novagen에서 구입하였고, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들은 Genotech에서 합성하였다. 그 밖에 배양액 제조를 위한 재료들은 모두 Sigma에서 구매하였다.

실시예 1. 리포터 시스템의 제작

먼저, E. coli 염색체를 주형으로 하여 서열번호 1의 라이신 리보스위치를 증폭하였고 이를 sGFP 유전자와 오버랩 PCR을 하여 ribo_sGFP를 제작하였다. 이 때 리보스위치 증폭에 사용된 프라이머는 서열번호 2(P_ribo-F) 및 서열번호 3(ribo-B)에 나타내었으며, sGFP 증폭에 사용된 프라이머는 서열번호 4(ribo-sgfp-F) 및 서열번호 5(sgfp-R)에 나타내었다. 리보스위치와 sGFP 증폭 PCR 조건은 98℃에서 30 초, (98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분/kb)×30 cycle, 72℃에서 5분 수행하였고, Phusion polymerase를 사용하였다.

이후 ribo_sGFP를 지속적으로 발현시키는 프로모터(J23100)를 오버행으로 하는 프라이머(서열번호 6: KpnI-P-F, 서열번호 7: SacI-vec-R)를 이용하여 증폭한 후, PCR을 통해서 증폭된 sGFP유전자를 KpnI과 SacI 사이트를 이용하여 pACYC_Duet 벡터에 클로닝 하였다. 구체적으로 오버랩 PCR은 프라이머 없이 lysC 5'UTR과 gfp 증폭산물을 섞은 후 95℃에서 1분, (95℃에서 30초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분/kb)× 5 cycle 후, 프라이머 추가하여 (95℃에서 30초, 64℃에서 30초, 72℃에서 1분/kb)× 25 cycle, 72℃에서 5분 수행하였다. 상기 실험에 대한 개략적인 모식도는 도 1에 간략히 나타내었다.

실시예 2. 상대적 라이신 저생산 균주 제작을 위한 유전자 재조합

상대적 라이신 저생산 균주를 만들기 위해 라이신 합성경로 상의 효소들 중 3개의 아이소자임(thrA , metL , lysC)이 관여하는 스텝에서 lysC를 제거함으로써 라이신 합성 경로로의 흐름을 저해된 라이신 저생산 균주를 제조하기 위하여, Red/ET 유전자 재조합 시스템을 이용하였다. Escherichia coli K12 W3110을 pKD46으로 형질전환시킨 후, Red recombinase가 발현된 컴피턴트 셀(competent cell)을 준비하였다. lysC 유전자의 인접서열과의 상등서열을 오버행으로 하는 유전자 제거용 PCR 산물(FRT_neo_FRT)을 제조하기 위하여, pKD4 variant의 FRT_neo_FRT 영역을 주형으로 하여, LA-Taq 폴리머라제를 이용하여 서열번호 8(D-lysC-F) 및 서열번호 9(D-lysC-R)의 프라이머로 증폭하였다. PCR 조건은 상기 실시예 1의 리보스위치 증폭 조건과 같다. 이 PCR 증폭산물은 Red-recombination 기작에 의해 lysC 영역을 대체한다. 증폭된 FRT_neo_FRT은 아가로스 겔(argarose gel) 상에서 정제하고, 에탄올에서 침전 농축시켜서 준비하였다. 상기 PCR 산물을 전기천공(electroporation) 시킨 후 카나마이신(kanamycin)을 함유한 LB 플레이트(Luria-Bertani plate)에서 선별(selection) 하였다. 얻어진 콜로니들은 pCP20 플라스미드의 FLP(DNA flipase)를 발현시켜 선택표지인 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자를 제거한 후 재조합된 영역을 시퀀싱하여 최종적으로 lysC 유전자의 제거를 확인하였다. 상기 실험에 대한 개략적인 모식도는 도 2에 간략히 나타내었다.

실시예 3. 라이신 생산성이 다른 균주에 의해 달라지는 형광과 성장속도 측정

W3110과 상기 실시예 2에서 제조한 W3110ΔlysC에 각각 상기 실시예 1에서 제조된 pACYC_ribo_sGFP를 형질전환 시켰으며, pACYC_Duet을 가지고 있을 때를 대조군으로 하여 라이신 생산성이 다른 균주에 의해 달라지는 형광과 성장속도를 측정하였다. 먼저, 벡터 유지를 위한 34 μg/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 강화된 M9 배지(라이신을 제외한 아미노산을 첨가한 배지)에서 12시간 이상 배양하여 시드를 준비하였다. 세포를 수확한 후 세척하여 새로운 배지에 OD600이 0.05가 되도록 희석한 후 OD600이 약 0.8이 될 때까지 5시간 동안 배양하였다. 준비된 시드를 상기 배지 4 ㎖에 OD600이 0.05가 되도록 접종한 후 2시간 간격으로 비형광값을 측정하였다. 형광은 배양체를 96-well 형광측정 플레이트에 옮긴 후 VICTOR3TM 1420 multilabel counter (PerkinElmer)를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 라이신 생산량의 차이에 의한 비형광값의 변화는 선정된 J23100 프로모터 하에서 pACYC_Duet 벡터 상에 존재할 때, lysC 5’ UTR이 세포 내의 라이신 농도를 감지하여 sGFP의 발현량을 조절함으로써 형광값이 달라짐을 이용하여 확인하였다. W3110 과 W3110ΔlysC에서 pACYC_ribo_sGFP에 의해 나타나는 비형광값의 변화를 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 실험 결과는 벡터 유지를 위해 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 강화된 M9 배지에서 W3110/pACYC_ribo_sGFP(검정색 원: 라이신 고생산 균주)와 W3110ΔlysC/pACYC_ribo_sGFP(흰색 원: 라이신 저생산 균주)를 배양한 후, 2시간 간격으로 비형광값을 나타낸 것이다. X 축은 배양시간을, Y 축은 비형광값의 비율변화를 나타낸다. 비형광값이란 측정된 형광값을 OD600 값으로 나눈 것이며, 비형광값의 비율 변화는 각 시간에 나타나는 비형광값을 2시간째의 비형광값으로 나눈 값이다. 오차값은 SD값으로 표현하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 라이신 생성량이 상대적으로 적은 W3110ΔlysC에서 sGFP의 발현량이 더 높기 때문에, 형광값이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 인공선택 회로의 구축 및 라이신 생산량의 차이에 의한 TetA 의 발현 조절

pBR322유래의 TetA로 pACYC_ribo_sGFP의 리포터 유전자인 sGFP를 교체하여 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)를 제작함으로써, 라이신 농도에 의한 비성장 속도의 변화를 유도하였다. J23100-ribo-TetA는 PCR을 통해 증폭되어 pACYC_ribo_sGFP의 J23100-ribo-sGFP위치에 클로닝 되었다.

구체적으로, tetA 유전자는 pBR322 플라스미드(plasmid)를 주형으로 서열번호 12(ribo-tetA-F) 및 서열번호 13(tetA-R)의 프라이머를 사용하여 증폭하였고, tetA 증폭산물과 lysC 5'UTR을 서열번호 6(KpnI-P-F) 및 서열번호 13(tetA-R)의 프라이머를 사용하여 오버랩 PCR 하여 ribo-tetA(서열번호 11)를 구축하였다. PCR 조건은 상기 실시예 1의 ribo-sgfp 구축조건과 같다. 증폭산물은 KpnI과 SacI 제한효소 자리를 이용하여 pACYCDuet vector에 삽입하였다.

TetA 단백질이 테트라사이클린(tetracycline)에 대한 저항성과 니켈에 대한 민감도 증가에 동시에 관여하므로, 라이신 농도에 따라 달라지는 TetA의 발현량을 이용하여 목적에 맞는 선택압을 사용하여 원하는 균주를 선택적으로 분리할 수 있다. 구체적으로, tetA 유전자가 발현되면 tetA 단백질이 세포막으로 이동하여 세포 내부의 테트라사이클린(tetracycline)을 외부로 배출하게 되며, 이로 인해 세포는 테트라사이클린에 내성을 가지게 된다. 그러나 tetA 유전자가 과발현되면, 세포가 니켈 이온(nickel ion)에 의해 사멸하게 되는 효과가 있다. 상기와 같은 tetA 유전자의 성질을 이용하면, 세포 내 라이신 농도가 높을 때 tetA가 많이 발현되고, 라이신 농도가 낮을 때 tetA를 발현하지 않는 플라스미드를 가지는 세포를 골라낼 수 있다.

라이신 생성량이 다른 두 균주, W3110과 W3110ΔlysC에 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)를 형질전환 시켰고, 테트라사이클린을 선택압으로 하는 배지와 니켈을 선택압으로 하는 배지 각각에서 비성장속도를 관찰한 결과 라이신 생성량의 차이에 의해 TetA의 발현량이 조절되는 것을 확인 할 수 있었다. 벡터 유지를 위해 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 M9 배지에서 배양하였으며, 선택압으로 사용된 니켈의 농도는 0.1 mM, 테트라사이클린의 농도는 60 μg/ml이다. 12시간 동안의 OD600값으로 비성장속도를 계산하였으며, 이를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 Y 축은 비성장 속도[h-1]를 나타낸다.

도 4에 나타난 바와 같이, 라이신에 의해 발현을 저해시키는 lysC 5’UTR 라이신 리보스위치의 경우 상대적 라이신 고생산 균주인 W3110에서 TetA의 발현이 저해되어, 사용된 테트라사이클린 농도에서 테트라사이클린에는 민감성을, 사용된 니켈 농도에서는 니켈에 저항성을 가지는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 현재 구축된 라이신에 대한 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)를 이용하면, 라이신 고생산균주가 TetA의 발현이 저해되어 상대적으로 니켈에 대해 저항성을 가지게 되고, 이를 이용하여 양성 선택이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 고수율 생산균주를 위한 대사공학

5-1. 합성경로상의 유전자들의 프로모터 교체

라이신 합성경로상에 있는 dapA, dapB, lysA의 프로모터를 PCR을 활용한 Red/ET 재조합기술을 이용하여 J23100 프로모터로 교체하였다.

이를 위해 FRT_neo_FRT-J23100 부분을 프로모터와 재조합시키기 위하여, 상등서열을 포함한 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR조건은 상기 실시예 2와 동일하나 주형은 pGEM-FRT-neo-FRT-Pc-sgfp로, J23100 프로모터가 주형에 들어있는 pKD4 variant를 사용하였다. dapA 프로모터 교체를 위해 사용된 프라이머는 서열번호 14(P-dapA-F) 및 서열번호 15(P-dapA-R)로, dapB 프로모터 교체를 위해 사용된 프라이머는 서열번호 16(P-dapB-F) 및 서열번호 17(P-dapB-R)로, lysA 프로모터 교체를 위해 사용된 프라이머는 서열번호 18(P-lysA-F) 및 서열번호 19(P-lysA-R)로 사용하였다. 상기 PCR 증폭산물을 정제하고 농축한 후 pKD46에서 발현된 람다 재조합효소(λ recombinase)를 가지고 있는 균주에 전기천공(electroporation) 시켰다. 재조합 균주는 카나마이신(kanamycine)을 함유한 배지에 의해 선별되었고 목표지점에서의 프로모터 변화를 콜로니 PCR을 통해 확인하였다. 이후 카나마이신(kanamycine) 저항성 유전자는 pCP20 벡터의 플립페이즈를 이용하여 제거하였고, 최종적으로 교체된 프로모터의 서열을 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. 본 실시예의 실험에 대한 개략적인 모식도는 도 5에 간략히 나타내었다.

5-2. Aspartokinase 에서의 피드백 제어 제거

상기 5-1)에서 제조된 피드백 제어가 제거된 lysC 유전자를 W3110 균주의 염색체에 Red/ET 재조합 시스템을 이용하여 삽입하였다. 사용된 PCR 단편은 FRT_neo_FRT와 사이트 특이적 변이생성을 이용해 아스파르토키나아제(aspartokinase)의 피드백 제어를 제거하고, UTR을 교체하여 번역단계에서의 조절을 제거시킨 lysC 유전자가 연결된 것을 주형으로 하여, W3110 염색체의 lysC 유전자의 위치에 삽입되었다.

5-3. 코리네박테리움 글루타미컴( Corynebacterium glutamicum )의 ddh 유전자 도입

THDP부터의 효소 반응 단계를 줄이기 위해 ddh 유전자(서열번호 32)를 염색체상의 lac 오페론 위치에 Red/ET 재조합 시스템을 이용해 삽입하였다. PCR 단편은 lac 오페론의 상부(upstream), 하부(downstream)와 각각 상등한 서열을 단편 말단에 포함한 프라이머를 이용하여 pGEM_FRT_neo_FRT_Pc_ddh를 주형으로 PCR 하였다. PCR조건은 실시예 2와 동일하며, 주형은 corynebacterium glutamicum 콜로니를 95℃에서 10분 동안 끓인 것을 50ul PCR 시 0.5ul 첨가하였다. ddh 증폭용 프라이머는 서열번호 20(S-ddh-F) 및 서열번호 21(S-ddh-R)로, 재조합 단편(FRT_neo_FRT_Pc_ddh)증폭용 프라이머는 서열번호 22(P-ddh-F) 및 서열번호 23(P-ddh-R)으로 나타내었다. 주형을 위해 C. glutamicum 염색체에서 증폭된 ddh 를 NdeI, XhoI 제한효소를 사용하여 클로닝 하였다. 본 실시예의 실험에 대한 개략적인 모식도는 도 6에 간략히 나타내었다.

5-4. 경쟁대사의 제거

W3110의 염색체상의 metL, thrA유전자가 Red/ET 재조합 시스템을 이용한 one-step 유전자 제거 방법을 통하여 제거되었다. 재조합 방법은 상기 실시예 5-1 내지 5-3과 같으며 프로모터 시퀀스나 외래 유전자 없이 FRT_neo_FRT 단편을 사용하였다. 이를 통하여, 라이신 생산성을 높인 라이신 고생산 균주 W3110_ME가 생산되었다. 본 실시예의 실험에 대한 개략적인 모식도는 도 7에 간략히 나타내었다.

실시예 6. 라이신 생산성에 의해 달라지는 니켈 함유 배지에서의 성장 속도 분석

라이신 고생산 균주에서 라이신의 축적에 의해 리보스위치가 TetA 발현을 저해함으로써 해당 균주의 니켈에 대한 저항성을 유지시키는 것을 확인하기 위하여 상대적 라이신 저생산 균주인 W3110과 대사공학을 통하여 라이신 생산성을 높인 라이신 고생산 균주 W3110_ME에 선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)를 형질전환 시킨 후 비성장속도 변화를 관찰하였다.

W3110/pACYC_ribo_TetA와 W3110_ME/pACYC_ribo_TetA 각각 3 ㎖씩을 강화된 M9 배지(라이신을 제외한 모든 아미노산 첨가)에서 플라스미드 유지를 위한 34μg/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)과 함께 배양하였다. 이것을 새로운 M9 배지에 OD600이 0.2가 되도록 접종한 후 5시간 동안 배양하여 시드를 준비하였다. 준비된 시드는 보강된 M9 배지에 (3 ml 혹은 0.25 ml Bioscreen C) OD600이 0.03이 되도록 희석한 후 NiCl₂농도를 0, 0.4, 0.8 mM로 달리하여 16시간 동안 배양하였다. 한편, 비성장속도의 변화가 인공선택회로 플라스미드의 TetA 발현량 변화에 의한 것임을 확인하기 위한 대조군으로 TetA를 sGFP(형광단백질)로 교체하여(pACYC_ribo_sGFP) 마찬가지 조건에서 비성장속도를 관찰하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8은 강화된 M9 배지에서 0.8 mM 니켈을 첨가하였을 때 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)를 가진 W3110, W3110_ME의 비성장속도를 나타낸다. Y 축은 비성장속도를 나타내며[h-1]각 막대가 나타내는 균주는 범례에 표시하였다. 비성장속도는 각 배양조건에서 12시간 동안 배양한 OD600측정값을 이용하여 계산하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 니켈을 선택압으로 가하는 경우 선택회로에서 라이신 고생산균주의 비성장속도가 빠름을 확인하였다. 니켈 민감도에 관여하지 않는 sGFP가 리보스위치에 의해 조절되는 경우에는 라이신 생산성에 따른 니켈 민감도의 변화가 거의 없었다. 그러나 발현량에 따라 니켈에 대한 민감도에 차이를 주는 TetA가 리보스위치에 의해 조절되는 인공선택회로 플라스미드를 가진 경우에는, 라이신 고생산균주에서 TetA의 발현이 억제됨으로써 니켈에 대한 민감도가 적어서 비성장속도가 유지되고, 상대적 라이신 저생산균주의 경우 NiCl₂ 0.8 mM 농도에서 TetA의 발현에 의한 니켈 민감도를 관찰할 수 있었다.

실시예 7. 선택회로에 기인한 라이신 고생산균주의 테트라사이클린에 대한 민감도 증가 분석

라이신 고생산균주에서 보다 직접적인 TetA 유전자의 발현억제를 확인하기 위하여 상대적 라이신 저생산균주인 W3110과 상대적 라이신 고생산균주인 W3110_ME에 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)로 형질전환 시킨 후, 60 μg/ml 테트라사이클린을 함유한 강화된 M9 배지(라이신 제외 모든 아미노산 첨가)에서 성장속도를 관찰하였다. 라이신 고생산균주는 라이신 축적 농도가 높기 때문에 리보스위치에 의해 TetA 발현이 저해되어 테트라사이클린에서 음성 선별되어야 한다. W3110/pACYC_ribo_TetA와 W3110_ME/pACYC_ribo_TetA에 테트라사이클린을 선택압으로 주었을 때의 비성장속도를 관찰한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 Y 축은 비성장속도를 나타내며[h-1]각 막대가 나타내는 균주와 항생제 첨가여부는 범례에 표시하였다. 비성장속도는 각 배양조건에서 12시간 동안 배양한 OD600측정값을 이용하여 계산하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 라이신 고생산균주인 W3110_ME/pACYC_ribo_TetA의 비성장 속도가 라이신 저생산균주인 W3110/pACYC_ribo_TetA보다 저해되었음을 확인하였다. 이는 라이신 고생산균주의 라이신 축적이 높기 때문에 선택회로에서 라이신 리보스위치에 의해 TetA의 발현이 저해되고, TetA 발현 저해에 의해 테트라사이클린을 함유한 배지에서 성장이 억제되었기 때문이다.

실시예 8. 균주 혼합 배양 시 선택회로의 작동

실제 조합적 접근법에 의한 균주개선 방법을 사용할 때, 선택회로의 선택력을 이용하여 생산균주의 라이브러리로부터 라이신 고생산균주를 분리할 수 있는지 알아보기 위해 균주를 혼합한 후 배양하여 개체수가 우세해지는 균주를 관찰하였다. 인공선택회로 플라스미드(pACYC_ribo_TetA)와 음성대조군으로 형광단백질을 발현시키는 플라스미드(pACYC_ribo_sGFP)를 W3110과 W3110_ME에 형질전환 시킨 후, 강화된 M9 배지에서 배양하며 어느 균주가 우세하게 성장하는지 관찰하였다. 선택압으로 니켈 0.8 mM을 사용하였고 8시간 간격으로 배양액에서의 우세 균주를 확인하였다. 균주의 확인은 W3110과 W3110_ME에서 PCR을 하였을 때 유전자 길이에 차이가 나는 iclR 지역을 목적으로 하여 PCR을 통해 확인하였다. W3110_ME의 경우 iclR의 제거에 의해 목적 지역의 증폭된 DNA 단편의 길이가 짧다. 실험 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 각 lane에서 C의 경우 TetA 유전자가 없는 음성 대조군으로 pACYC_ribo_sGFP를 사용한 경우를 나타내고, ET는 고속선택회로 플라스미드인 pACYC_ribo_TetA를 나타낸다. 시간이 지날수록 라이신 고생산균주의 표지의 밴드가 두꺼워 지는 것을 볼 수 있으며, 이로부터 라이신 고생산균주의 우세한 성장을 확인할 수 있다. 반면 음성 대조군에서는 니켈을 선택압으로 하였을 때 균주의 선택적 분리가 일어나지 않았다는 것을 알 수 있다.

한편, 니켈이 함유되었을지라도 두 균주가 모두 성장하는 음성대조군(pACYC_ribo_sGFP가 형질전환된 균주)과 달리 선택회로 플라스미드를 가진 경우에는 니켈이 선택압으로 작용하는 배지에서 라이신 고생산 균주가 우세해짐을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 선택회로 플라스미드를 가지고 있는 균주 사이에서 니켈을 선택압으로 주어 배양할 경우 라이신 고생산균에 대한 선택력이 있음을 확인하였다.

실시예 9. Enrichment from library

9-1. ppc 발현량 라이브러리 생성

포스포에놀피루브산카르복실화효소(phosphoenol pyruvate carboxylase, ppc) 유전자는 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)의 카르복실산화를 통해 라이신의 전구체인 옥살로아세트산(oxaloacetate)의 보전(anaplerosis)을 담당한다. 한편, PEP는 균주의 에너지 대사 과정인 TCA 사이클의 전구체인 피루브산(pyruvate)으로도 전환되어야 하기 때문에 두 개의 반응이 균형 잡혀야 한다. 이를 위해 ppc 발현량에 대한 분석들이 in silico로 이뤄지고 있지만 실제 균주 개선에서 최적의 발현량을 구현하여 성공한 사례는 없다. 따라서 본 발명에서는 무작위화시킨 프로모터를 이용하여 ppc 발현량이 다양한 플라스미드 생산균주 라이브러리를 제작한 후 인공선택회로를 활용하여 최적화된 발현량을 찾을 목적 효소로 선정하였다.

구체적으로, pCDF_ppc를 구축하기 위해 E.coli 염색체상의 ppc 유전자(서열번호 33)를 증폭하여 KpnI, SacI 제한 효소를 이용하여 pCDF_Duet 벡터에 클로닝 하였다. ppc 증폭에 사용된 PCR 조건은 상기 실시예 2와 같으며 주형은 W3110 콜로니를 95℃에서 10분 동안 끓인 것을 50ul PCR 시 0.5 uL 첨가하였다. ppc 증폭에 사용된 프라이머 서열은 서열번호 24(S-ppc-F) 및 서열번호 25(S-ppc-R)로 나타내었다.

ppc 유전자의 프로모터 서열이 다양해진 플라스미드라이브러리를 구축하기 위하여, 무작위서열 프로모터 오버행 ppc PCR을 실시하였다. 사용된 프라이머는 서열번호 26(J23series-ppc-F) 및 서열번호 27(ppc-lib-R)에 나타내었으며, 상기 클로닝된 pCDF_Duet 벡터를 주형으로 하여 서열번호 28(D-ppc-F) 및 서열번호 29(D-ppc-R)로 나타낸 프라이머에 프로모터의 -35박스, -10박스 영역을 무작위화 시킨 서열을 오버행으로 넣은 후, 5’말단에 인산기(phosphate)를 추가하여 PCR 하였다. PCR 조건은 상기 실시예 1의 PCR 조건과 같으며, PCR 산물은 GeneAll Expin^TM PCRSV PCR purification kit를 이용하여 수확되었으며, DpnI 처리를 통해 주형을 제거하고 T4 라이게이션을 수행하였다.

라이게이션 혼합물은 E.coli MegaX DH10BTM에 형질전환 된 후 pCDF_Duet 벡터의 선택표지를 위한 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 배지를 이용하여 플라스미드가 선별되었다. 12시간 이후 플레이트상의 균주를 모은 후 ppc 유전자의 프로모터가 다양해진 pCDF_J23series_ppc 라이브러리를 수확하였으며, 이를 염색체상의 ppc 유전자를 지운 W3110_MEΔppc 균주에 형질전환 시킴으로써 생산균주 라이브러리를 생성하였다.

염색체상의 ppc 유전자를 제거하는 방법은 상기 실시예 2 의 lysC 제거방법과 같으며 FRT_neo_FRT 증폭시 사용한 프라이머 서열은 서열번호 28(D-ppc-F) 및 서열번호 29(D-ppc-R)에 나타내었다.

도 11은 ppc 발현량이 다른 라이브러리 생성과정을 나타낸다. ppc 유전자를 프로모터 없이 pCDF_Duet 벡터에 클로닝 시킨 후 이를 주형으로 하여 무작위화된 프로모터를 오버행으로 가진 프라이머를 이용하여 PCR하였다. PCR 산물을 라이게이션 시키면 pCDF_J23series_ppc 벡터 라이브러리가 생성된다.

9-2. 생산균주 라이브러리에서 라이신 고생산 균주를 선별하기 위한 인공선택회로

ppc 발현량이 서로 다른 생산균주 라이브러리를 플레이트에서 수확한 후 M9 배지로 두 번 세척하였다. 세척된 생산균주 라이브러리는 보강된 M9 배지에 OD600이 0.1이 되도록 희석되었다. 그리고 선정된 NiCl₂ 농도에서 12시간 동안 배양된 후 같은 NiCl₂ 농도를 첨가한 새로운 보강된 M9 배지에서 OD600이 0.05가 되도록 희석시킨 후 12시간 동안 배양하였다. 이러한 연속된 희석과 배양과정을 세 번 반복하였다.

9-3. 선택회로를 이용한 라이신 고생산 균주의 선택적 분리 및 ppc 최적발현을 위한 프로모터 시퀀스 분석

PEP의 흐름이 TCA 회로(TCA cycle)와 옥살로아세트산(oxaloacetate)의 보전(anaplerosis)사이에서 라이신 생산을 위해 최적화된 ppc 유전자 발현량을 보이는 프로모터를 찾기 위하여, 선택회로 플라스미드를 가지고 있는 W3110_MEΔppc에 pCDF_J23series_ppc를 형질전환 시킨 후 니켈을 선택압으로 하여 스트렙토마이신(Streptomycin)을 함유한 보강된 M9 배지에 스트리킹 하고 37℃에서 배양하였다. 니켈 선택압은 pACYC_ribo_sGFP를 함유한 균주를 선택회로 플라스미드의 TetA유전자 발현이 모두 억제된 상태로 판단하여 W3110_ME/pACYC_ribo_sGFP와 W3110_ME/pACYC_ribo_TetA 균주의 니켈 최소 저해 농도(minima inhibitory concentration) 사이에서 선정하였다.

라이신 고생산 균주의 선택적 분리를 위해 세 번에 걸친 희석과 배양을 통하여 우세해진 변이주들을 플레이트에서 단일 콜로니화 시켰다. 성장한 콜로니 중 4개의 콜로니를 선택하여 스트렙토마이신(Streptomycin)을 함유한 LB 배지(Luria-Bertani medium)에서 배양한 후 ppc 발현용 플라스미드를 추출하여 인리치먼트된 균주가 가지고 있는 ppc 유전자의 프로모터 시퀀스를 분석하였다(Solgent, 대전). 총 4개 중에 2개의 프로모터 서열이 동일(서열번호 30)하였으며, 아래와 같이 나타내었다. 밑줄로 표시된 부분 중 TTGTCAG이 무작위화된 -35박스 영역, TTCCAG이 -10박스 영역이며, ATG가 시작코돈이다.

AGAGTTGTCAGCTAGCTCAGTCCTAGGTTCCAGGCTAGCAGACGACGAAAAGCAAAGCCCGAGCATATTCGCGCCAATGCGACGTGAAGGATACAGGGCTATCAAACGATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAATATGAACGAACAA (서열번호 30)

상기 서열번호 30으로 기재된 프로모터를 포함한 플라스미드를 가지는 균주와 W3110_ME의 라이신 축적량, 글루코스 소비량을 비교하였다. 인리치먼트된 변이주인 W3110_MEΔppc/pCDF_F0.3ppc의 라이신 축적량이 라이브러리화 되기 전의 균주인 W3110_ME/pCDF_Duet보다 더 높은 라이신 축적량을 보임을 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 각 균주는 스트렙토마이신을 함유한 보강된 M9 배지에서 배양되었다. W3110_ME의 경우 염색체상의 ppc 유전자를 바꾸지 않은 균주를 나타내며 대조군으로 사용하기 위해 pCDF_Duet벡터로 형질전환시켰다.

9-4. 니켈 함유 배지에서의 성장 분석

pACYC_ribo_TetA로 형질전환 시킨 W3110_ME/pCDF_Duet와 W3110_MEΔppc/pCDF_F0.3ppc를 3 ml 보강된 M9 배지에서 벡터유지를 위한 항생제와 함께 배양하였다. 이것을 새로운 보강된 M9 배지에 OD600이 0.2가 되도록 접종한 후 5시간 동안 배양하여 시드를 준비하였다. 준비된 시드는 보강된 M9 배지에(3 ml 혹은 5ml의 Bioscreen C) OD600이 0.03이 되도록 희석한 후 NiCl₂농도를 달리하여(0 ~ 2.0 mM, 0.5mM 간격) 16시간 동안 배양하였다.

9-5. ppc 발현량 변화에 따른 라이신 축적량 변화

W3110_ME/pCDF_Duet과 W3110_MEΔppc/pCDF_F0.3ppc를 보강된 M9 배지에 벡터 유지를 위한 항생제와 함께 접종한 후 새로운 배지에 OD600이 0.1이 되도록 희석하여 7시간 동안 배양한 것을 시드로 사용하였다. 라이신 측정을 위한 배양은 300 ml 플라스크를 사용하였으며 30 ml의 보강된 M9 배지에 초기 OD600이 0.05가 되도록 접종 한 후 37℃, 200rpm으로 총 20시간 동안 배양하였다. 2시간 간격으로 OD600과 남아있는 글루코스의 양, 배지에 축적된 라이신의 양을 HPLC를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 인리치먼트된 변이주인 W3110_MEΔppc/pCDF_F0.3ppc의 라이신 축적량이 라이브러리화 되기 전의 균주인 W3110_ME/pCDF_Duet보다 더 높은 라이신 축적량을 보임을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국생명공학연구원

KCTC12184BP

20120405

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for Screening Microorganism with High Lysine Productivity Using Riboswitch <130> PB11-09889 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lysine riboswitch <400> 1 gtactacctg cgctagcgca ggccagaaga ggcgcgttgc ccaagtaacg gtgttggagg 60 agccagtcct gtgataacac ctgagggggt gcatcgccga ggtgattgaa cggctggcca 120 cgttcatcat cggctacagg ggctgaatcc cctgggttgt caccagaagc gttcgcagtc 180 gggcgtttcg caagtggtgg agcacttctg ggtgaaaata gtagcgaagt atcgctctgc 240 gcccacccgt cttccgctct tcccttgtgc caaggctgaa aatggatccc ctgacacgag 300 gtagtt 306 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P_ribo-F primer <400> 2 attgacggct agctcagtcc taggtacagt gctagcgtac tacctgcgct agcgca 56 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribo-B primer <400> 3 aactacctcg tgtcagggga tccat 25 <210> 4 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribo-sgfp-F primer <400> 4 ctcttccctt gtgccaaggc tgaaaatgga tcccctgaca cgaggtagtt atggctagca 60 agggcgagga gctgt 75 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgfp-R primer <400> 5 acaaaaaacc cctcaagacc cgtttagagg c 31 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KpnI-P-F primer <400> 6 aggtaccttg acggctagct cagtcctagg tacagtg 37 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-vec-R primer <400> 7 agagctcgtg gccaggaccc aacgctgccc ga 32 <210> 8 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-lysC-F primer <400> 8 gactttggaa gattgtagcg ccagtcacag aaaaatgtga tggttttagt gcgatgcctc 60 atccgcttct c 71 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D-lysC-R primer <400> 9 gacaagaaaa tcaatacggc ccgaaatata gcttccaggc catacagtat gcaacgcagt 60 agctggagtc 70 <210> 10 <211> 1112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribo_sGFP <400> 10 ggtaccttga cggctagctc agtcctaggt acagtgctag cgtactacct gcgctagcgc 60 aggccagaag aggcgcgttg cccaagtaac ggtgttggag gagccagtcc tgtgataaca 120 cctgaggggg tgcatcgccg aggtgattga acggctggcc acgttcatca tcggctacag 180 gggctgaatc ccctgggttg tcaccagaag cgttcgcagt cgggcgtttc gcaagtggtg 240 gagcacttct gggtgaaaat agtagcgaag tatcgctctg cgcccacccg tcttccgctc 300 ttcccttgtg ccaaggctga aaatggatcc cctgacacga ggtagttatg gctagcaagg 360 gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 420 gccacaagtt cagcgtgcgc ggcgagggcg agggcgatgc caccaacggc aagctgaccc 480 tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 540 tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 600 tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcagcttc aaggacgacg 660 gcacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 720 agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 780 acttcaacag ccacaacgtc tatatcaccg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggcca 840 acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 900 agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 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ggagccacta 600 tcgactacgc gatcatggcg accacacccg tcctgtggat cctctacgcc ggacgcatcg 660 tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc gacatcaccg 720 atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc gtgggtatgg 780 tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca ccattccttg 840 cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg caggagtcgc 900 ataagggaga gcgtcgaccg atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt 960 gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg 1020 taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg 1080 cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct 1140 tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg 1200 cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc 1260 ccattatgat tcttctcgct tccggcggca tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt 1320 ccaggcaggt agatgacgac catcagggac agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca 1380 gcctaacttc gatcactgga ccgctgatcg tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca 1440 catggaacgg gttggcatgg attgtaggcg ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt 1500 tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc 1560 taacggattc accactccaa gaattggagc caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc 1620 gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg 1680 gcgcatctcg ggcagcgttg ggtcctggcc acgagctc 1718 <210> 12 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ribo-tetA-F primer <400> 12 ctcttccctt gtgccaaggc tgaaaatgga tcccctgaca cgaggtagtt atgaaatcta 60 acaatgcgct catcg 75 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tetA-R primer <400> 13 agagctcgtg gccaggaccc aacgctgccc ga 32 <210> 14 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-dapA-F primer <400> 14 ggaaagcata aaaaaaacat gcatacaaca atcagaacgg ttctgtctgc atgggaatta 60 gccatggtcc atatg 75 <210> 15 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P-dapA-R primer <400> 15 atcgcgacaa tacttcccgt gaacatgggc catcctctgt gcaaacaagt gctagcactg 60 tacctaggac 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cgcctatatc 360 gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420 ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480 gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540 atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600 agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660 atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720 tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780 ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840 atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900 tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960 caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020 gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080 gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140 tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 1191 <210> 32 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gacgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc ggcatgccac acggtggcca 840 cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc gtggaataca tcctcaagct 900 ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcctc acagatcgct ttcggtcgcg cagctcaccg 960 catgaagcag cagggccaaa gcggagcttt caccgtcctc gaagttgctc catacctgct 1020 ctccccagag aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc taa 1063 <210> 33 <211> 2652 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppc gene <400> 33 atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60 gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120 ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180 caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240 ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300 ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360 accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420 gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480 ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540 ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600 gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660 ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720 gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780 gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840 aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900 gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960 tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020 aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080 cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140 cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200 cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260 tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320 ctgccgcgca actggcaacc aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg 1380 attgccgaag caccgcaagg ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg 1440 tccgacgtac tggctgtcca cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg 1500 gttgctccgc tgtttgaaac cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag 1560 ctgctcaata ttgactggta tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc 1620 tattccgact cagcaaaaga tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca 1680 caggatgcat taatcaaaac ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt 1740 cgcggcggtt ccattggtcg cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg 1800 ccaggaagcc tgaaaggcgg cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttaaa 1860 tatggtctgc cagaaatcac cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa 1920 gccaacctgc tgccaccgcc ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg 1980 tcagtcatct cctgcgatgt ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct 2040 tacttccgct ccgctacgcc ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg 2100 gcgaaacgtc gcccaaccgg cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc 2160 tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220 gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280 tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340 tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400 ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460 gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520 gtattgcagg ccgagttgct gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg 2580 gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640 aataccggct aa 2652

Claims

라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는, 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 라이신 리보스위치(riboswitch)는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 포함하는 것인, 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 TetA 유전자는 서열번호 31로 기재된 염기서열을 포함하는 것인, 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터는 서열번호 11로 기재된 염기서열을 포함하는 것인, 라이신 고생산 균주 스크리닝용 벡터.
제 1 항의 벡터로 형질전환 된, 대장균(Escherichia coli) KCTC12184BP.
균주 라이브러리에 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환 하는 단계; 및
상기 형질전환된 균주를 테트라마이신이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 라이신 고생산 균주를 스크리닝하는 방법.
균주 라이브러리에 라이신 리보스위치(riboswitch) 및 TetA 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환 하는 단계; 및
상기 형질전환된 균주를 니켈이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 라이신 저생산 균주를 스크리닝하는 방법.
서열번호 30의 염기서열로 이루어지는 프로모터 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소(Phosphoenolpyruvate carboxylase, ppc) 유전자를 포함하는, 라이신 고생산용 벡터.
제 8 항에 있어서,
상기 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자는 서열번호 33의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 라이신 고생산용 벡터.