KR20130130726A - B 세포 림프종을 위한 병용 요법 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용은 항-CD19 및 항-CD20 항체의 조합을 사용하여 B 세포 림프종을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 단일 항체 치료에 비해 장기적인 항종양 활성 및/또는 감소된 투여량을 비롯한 치료적 장점을 제공한다.

Description

B 세포 림프종을 위한 병용 요법{COMBINATION THERAPY FOR B CELL LYMPHOMAS}

급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비호지킨 림프종(NHL)을 비롯한 인간 백혈병 및 림프종의 대부분은 B 세포 기원의 것이다. 최근 몇년 동안, 단일 클론 항체(mAb)로 B 세포 제한 표면 항원을 표적함으로써 B 세포 고갈을 기초로 하는 치료적 접근이 증가된 관심을 얻고 있다. 특히, 항-CD20 mAb 리툭시맙은 B 세포 종양의 치료에 있어서 유망한 결과를 제시하고 있다. (Robak et al., Cancer Treatment Reviews, 2007; 33:710-728). 리툭시맙의 활성은 주로 효과기 세포, 예컨대 대식 세포 및 NK 세포의 표면 상에 활성화된 Fcγ 수용체를 유도(engaging)함으로써 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 매개하는 mAb의 능력에 의존한다. (Desjarlais et al., Drug Discovery Today, 2007; 12:898-910). 보체-의존성 세포독성(CDC) 및 세포사멸의 직접 유도와 같은 다른 기전이 또한 역할을 할 수도 있지만, 리툭시맙이 생체내 악성 B 세포 뿐만 아니라 정상 B 세포의 제거를 매개하는 ADCC가 주요 기전인 것으로 여겨진다. (Edwards et al., Nat Rev Immunol, 2006; 6:394-403). 리툭시맙과 화학요법의 조합은 여포성 림프종(FL) 및 CLL을 앓는 환자에게 상당한 호전을 유도하고 있으며 오랫동안 지속되는 차도를 보여줄 수 있다. 하지만, 이러한 치료는 모든 환자 집단에 걸쳐 효과적인 것은 아니다. 따라서, 새로운 그리고 개선된 치료 선택에 대한 상당한 요구가 여전히 남아있는 실정이다.

인간 분화 클러스터(CD) 항원 19는 중쇄 재배열 시기부터 초기 프레-B 세포에 의해 발현되는 B 세포-특이적 표면 항원이다. CD19는 막관통 수용체의 면역글로불린 도메인-함유 수퍼패밀리에 속한다. CD19는 CD19 발현이 하향 조절되는 경우 프로-B 세포부터 형질 세포 단계까지 계통 전반에 걸쳐 B 세포 상에 발현된다. (Nadler et al., J Immunol. 1983; 131:244-250). B 세포-특이적 단백질, 및 B 세포-수용체(BCR) 복합체의 성분으로서, CD19는 B 세포 활성 및 체액성 면역의 역치를 조절하는 B 세포 신호전달의 포지티브 조절자이다. (Sato et al., Proc Natl Acad Sci, 1995; 92:11558-62; Sato et al., J Immunol . 1997; 158:4662-9). CD19는 프로-B-세포 단계 전에 조혈모세포 또는 B 세포 상에 발현되지 않는다. (Nadler et al., J Immunol . 1983; 131:244-250; Loken et al., Blood, 1987; 70:1316-1324).

중요하게도, CD19의 발현은 B 세포의 악성 변환 후 유지되고, CD19는 ALL, CLL, 및 NHL을 비롯한 대부분의 B 세포 종양 상에 발현된다. (Uckun et al., Blood, 1988; 71:13-29; D'Arena et al., Am J of Hematology, 2000; 64:275-281; Ginaldi et al., J Clin Pathol, 1998; 51:364-369; Anderson et al., Blood, 1984; 63:1424-1433). B 세포 종양 상의 광범위하고 비교적 안정한 CD19의 발현은 이 항원이 mAb를 기초로 하는 치료에 매력적인 표적이 되도록 한다.

따라서, B 세포 종양의 치료에는 항-CD19 및 항-CD20 항체의 이점을 이용하는 병용 요법이 요구된다.

본 발명에는 B 세포 림프종의 치료가 필요한 환자에게 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체를 포함하는 병용 요법을 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종의 치료 방법이 제공된다. 이러한 병용 요법은 유사한 투여 일정 하에 단독으로 투여되는 상기 항-CD19 항체 또는 상기 항-CD20 항체보다 더 긴 기간 동안 항종양 활성을 부여한다.

또한, 본 발명에는 항-CD19 및/또는 항-CD20 항체의 감소된 투여량을 이용하는 B 세포 림프종의 치료 방법이 제공된다. 특히, 상기 방법은 B 세포 림프종의 치료가 필요한 환자에게 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체를 포함하는 병용 요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 병용 요법의 투여량은 병용 요법 투여량보다 2배 이상 더 많은 상기 항-CD19 항체의 투여량보다 더 높은 항종양 활성을 갖는다.

도 1에는 B 세포 백혈병 및 림프종 세포주에 대해 어푸코실화(afucosylated)된 항-CD19 mAb 16C4(16C4-afuc) 및 항-CD20 mAb, 리툭시맙의 ADCC 활성이 도시된다. 15개의 백혈병 및 림프종 세포주의 패널에 걸쳐 관찰된 활성 프로파일에 해당하는 4개의 세포주에 의한 시험관내 ADCC 검정으로부터의 결과가 도시된다. 푸코실화된 CD19 mAb 16C4는 비교를 위해 포함되었다. Karpas-1106P 세포에 대해 테스트하는 경우 16C4-afuc 및 리툭시맙의 ADCC 활성은 유사하였고(도 1A); 세포주 Farage, Raji 및 MeC2에서도 유사한 결과를 얻었다. JVM2(도 1B)는 리툭시맙이 시험관내 16C4-afuc보다 더욱 효과적인 세포주에 해당하고; 세포주 Granta-519, DB, 및 JVM-13에서도 유사한 결과를 얻었다. Oci-LY19(도 1C) 및 Daudi(도 1D)는 16C4-afuc가 리툭시맙보다 더욱 강력했던 세포주에 해당하고; Toledo, Karpas-422, Nalm-6, RL, 및 Namalwa 세포에서도 유사한 결과를 얻었다. 16C4-afuc가 테스트된 모든 세포주는 16C4의 푸코실화된 형태보다 더욱 강력하였다. 제시된 결과는 3회 반복 샘플의 평균 +/- 표준 편차이다. 도 1F∼H에는 관찰된 최대 세포사(%)(CD19, 도 1F; CD20, 도 1G)에 대해 그리고 16C4-afuc 및 리툭시맙에 대해 측정된 EC₅₀ 값(CD19, 도 1H; CD20, 도 1I)에 대해 플롯팅한 CD19 및 CD20(MFI로서 표시됨; 실시예 2의 표 1 참조)의 비교적 표시가 도시된다. EC₅₀으로 측정할 수 없는 세포주/mAb 조합은 제외되었다(또한, 실시예 2의 표 1 참조). 세포주의 이러한 다양한 패널에 걸쳐 EC₅₀ 또는 최대 세포사와 항원 발현의 유효한 상관관계는 측정할 수 없었다.
도 2에는 환자-유래 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포가 시험관내 16C4-afuc 매개된 ADCC에 얼마나 민감한지 도시된다. 도 2A에서, 환자 CLL 세포에는 CD19 및 CD20의 가변적인 세포 표면 발현이 도시된다. CLL 세포 상의 CD19 및 CD20 항원 부위의 갯수는 재료 및 방법 하에 하기 기술된 바와 같이 측정하였다. 도 2B∼C에는, FACS계 검정을 사용하여 환자-유래 CLL 세포에 의해 16C4-afuc 및 리툭시맙의 시험관내 ADCC 검정으로부터의 결과가 도시된다. KC1333 NK 세포는 2.5:1의 E:T 비율에서 효과기 세포로서 사용되었다. 전체로서 테스트된 6개의 샘플로부터 3개의 대표적 환자 샘플에 의한 결과가 제시된다. 16C4-afuc가 테스트된 모든 샘플은 환자 PBMC 샘플로부터의 CLL B 세포를 고갈시키는 데 리툭시맙보다 더욱 효과적이었다. 모든 ADCC 검정은 3회 반복 수행하여 평균 값(+/- 표준 편차)이 존재하였다. 테스트된 6개의 모든 CLL 환자 샘플에 대해 16C4-afuc(도 2E) 및 리툭시맙(도 2F)에 대한 시험관내 ADCC 활성과 항원 발현의 관계가 제시된다. CD19 및 CD20의 항원 부위의 갯수는 16C4 및 리툭시맙에서 실현된 세포사의 최대 백분율로 각각 플롯팅된다.
도 3에는 환자-유래 급성 림프아구성 백혈병(ALL) 세포가 16C4-afuc 매개 ADCC에 민감성이 있는 것이 도시된다. 도 3A에는 환자 ALL 세포 상의 CD19 및 CD20의 발현이 도시된다. CD19 및 CD20에 대한 항원 부위의 갯수는 3개의 개별 ALL 샘플에서 측정하였다. 비교를 위해, 4명의 개별 공여자로부터의 정상 인간 말초 혈액 B 세포 상의 항원 부위의 갯수가 제시된다. 도 3B, 3C, 3D, 및 3E에 도시된 바와 같이, 16C4-afuc는 기본적인 ALL 세포에 대해 강력한 시험관내 ADCC 활성을 갖는다. 4명의 환자로부터의 샘플에 의한 FACS계 검정으로부터의 결과가 도시된다. KC1333 NK 세포는 2.5:1의 E:T 비율에서 효과기 세포로서 사용되었고; 리툭시맙이 비교를 위해 포함되었다. 모든 측정은 3회 반복 수행하여 평균 값(+/- 표준 편차)이 존재하였다.
도 4에는 16C4-afuc에 의한 종양 성장 억제가 Fc-매개 효과기 기능에 의존하는 것이 도시된다. Daudi(도 4A) 및 Raji(도 4B)의 SCID-림프종 이종이식 모델에서 16C4-afuc 및 효과기-불포함(effector-less) Fc-돌연변이된 mAb 16C4-TM에 의한 생체내 종양 성장 억제가 도시된다. 0일째에 SCID 마우스에 림프종 세포를 피하 접종하였다. 7일째에 착수하여, 동물은 3주 마다 mAb의 투여량(2.5 mg/kg) 또는 동일 부피의 비히클(PBS)을 수용하였다. 인간 IgG1 mAb R347을 이소타입 대조군으로서 사용하였다.
도 5에는 16C4-afuc에 의한 SCID 마우스에서 림프종 성장 억제가 투여량 의존성인 것이 도시된다. 일정 범위의 mAb 농도 및 투여 빈도에 의한 Raji 세포 이종이식의 치료는 이소타입 대조군-치료된 동물과 비교하였을 때 상당한 종양 성장 억제를 유발하였다. 투여량 범위는 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg 16C4-afuc를 포함하였다. 투여 일정 변형는 1회, 3회, 및 5회 투여량을 포함하였다. 제1 투여량은 세포 이식 후 5일째에 제공되었다. 도 5A에서, 주 2회마다 투여된 5회 투여량의 16C4-afuc는 매주마다 투여된 3회 투여량(도 5B)보다 더 강한 항종양 활성을 유도하였다. 3 mg/kg에 의한 치료는 10 mg/kg에 의한 치료와 유사한 효능을 실현하였다.
도 6에는 CD19 mAb 16C4-afuc가 다중 SCID 림프종 모델에 활성인 것이 도시된다. 도 6A에는 3개의 피하 림프종 이종이식 모델에서 16C4-afuc 및 리툭시맙에 의한 종양 성장 억제가 도시된다. Namalwa(도 6A), Daudi(도 6B) 및 Toledo(도 6C) B 림프종 세포주에 대한 결과가 도시된다. 0일째에 SCID 마우스에 종양 세포를 피하 이식한 후 총 5회 투여량(3 mg/kg)에 대해 5일째에 착수하여 16C4-afuc, 이소타입 대조군, 비히클, 또는 리툭시맙으로 매주 2회 복강내 주사하였다. 도 6D 및 6E에서, CD19 mAb 16C4-afuc는 파종성 질병의 마우스 모델에 활성이 있다. 2마리의 전신 질병 모델에서 16C4-afuc 및 리툭시맙의 항종양 활성의 비교가 도시된다. 제시된 결과는 Namalwa(도 6A) 및 Daudi(도 6B) 세포가 주사된 마우스에 대한 것이다. 매주 2회 16C4-afuc, 리툭시맙, 또는 이소타입 대조군(3 mg/kg)의 복강내 투여는 세포 주사 후 7일째에 시작하였고 5회 투여량을 계속하였다. 파종성 종양 모델의 경우, 생존 기간 또는 마비까지의 기간을 종점으로 사용하였다.
도 7에는 16C4-afuc 및 리툭시맙의 조합에 의한 SCID 림프종 모델에서의 장기간의 종양 성장 억제 효과가 도시된다. SCID-림프종 모델에서 리툭시맙은 16C4-afuc와 동일 일정 및 농도(총 5회 투여량에 대해 주 2회마다 3 mg/kg)에 따라 투여되었다. Raji(도 7A), Daudi(도 7B), Oci-LY19(도 7C) 및 Ramos(도 7D) 이종이식 모델로부터의 결과가 도시된다. 16C4-afuc와 리툭시맙의 조합은 Raji 및 Daudi 모델에서 장기간의 종양 성장 억제를 유도하였다. 리툭시맙에 대해 저조하게 반응한 Oci-LY19 모델, 및 16C4-afuc에 대해 저조하게 반응한 Ramos 모델에서 더 낮은 효과가 관찰되었다.
도 8에는 huCD19/CD20 형질전환된 마우스에서 단독으로 또는 리툭시맙과 조합하여 투여되는 16C4-afuc의 약동학 및 약력학이 도시된다. 4가지의 개별 투여가 고려되었다: 16C4-afuc(1 mg/kg) + 대조군; 16C4-afuc(10 mg/kg) + 대조군; 16C4-afuc(1 mg/kg) + 리툭시맙; 16C4-afuc(10 mg/kg) + 리툭시맙. 더 높은 투여량의 16C4-afuc(10 mg/kg)는, 단독 투여이든 또는 조합 투여이든, 더 낮은 투여량의 16C4-afuc(1 mg/kg)보다 혈액 내 더 오래 유지되었다.
도 9에는 병용 요법, 리툭시맙 단독, 또는 16C4-afuc 단독의 투여 후 B 세포 고갈 실험의 결과가 도시된다. 이 결과는 리툭시맙(10 mg/kg) + 16C4-afuc(10 mg/kg)에 의한 가장 높은 투여량의 병용 요법이 가장 오랜 기간 동안 혈액 및 비장으로부터 B 세포 고갈의 가장 높은 비율을 유도한다는 것을 나타낸다.

A. 항- CD19 및 항- CD20 항체에 의한 병용 요법

본원에는 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체의 조합을 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 종양의 치료 방법이 제공된다. 상기 병용 요법은 단일 항체 치료(예, 항-CD19 또는 항-CD20의 단독 투여)와 비교하였을 때 감소된 투여량에서 장기적인 항종양 효능 및/또는 효과적인 치료를 제공한다. 또한, 본원에는 장기적인 종양 성장 억제가 필요한 피험체(예, B 세포 종양을 앓는 피험체)에게 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체의 조합을 투여함으로써 상기 피험체 내 장기적인 종양 성장을 억제하는 방법이 제공된다.

본원에 사용되는 "치료하는" 또는 "치료하다"는 항-CD20 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 피험체에게 또는 피험체로부터의 단리된 조직 또는 세포주에게 투여하는 것과 함께, 항-CD19 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 피험체에게 투여하는 것, 또는 항-CD19 항체 또는 이의 단편을 피험체로부터의 단리된 조직 또는 세포주에게 투여하는 것을 지칭하고, 여기서 피험체는 질병, 질병 증상, 또는 질병에 대한 소인을 갖고, 그 목적은 질병, 질병의 증상, 또는 질병에 대한 소인을 낫게 하거나, 치료하거나, 완화하거나, 경감시키거나, 변동시키거나(alter), 치유하거나, 개선하거나, 호전시키거나 또는 영향을 미치는 것이다. "치료하는" 또는 "치료하다"에 의한 것은 또한 이러한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 조합을 피험체에게 또는 피험체로부터의 단리된 조직 또는 세포주에게 각각 항-CD19 항체(또는 이의 항원-결합 단편) 또는 항-CD20 항체(또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는, 단일 약학 조성물의 일부로서 또는 대안적으로 각각의 약학 조성물의 일부로서 투여할 수 있는 것을 의도하며, 여기서 피험체는 질병, 질병 증상, 또는 질병에 대한 소인을 갖고, 그 목적은 질병, 질병의 증상, 또는 질병에 대한 소인을 낫게 하거나, 치료하거나, 완화하거나, 경감시키거나, 변동시키거나, 치유하거나, 개선하거나, 호전시키거나 또는 영향을 미치는 것이다.

다중 매개변수는 치료 효능, 예컨대 항종양 활성을 가리킬 수 있다. 이것은, 비제한적 예로서, 종양 덩어리(mass) 크기의 축소; 종양의 전이성 침습성의 감소; 종양 성장 속도의 감소; 악액질 및 복수 생성과 같은 종양 관련 후유증의 중증도 또는 발생률의 감소; 종양 관련 합병증, 예컨대 병적 골절, 자가면역성 용혈성 빈혈, 전림프구성 형질전환, 라히터 증후군 등의 감소 및/또는 예방; 화학요법 및 기타 치료에 대한 종양의 민감성; 증가된 환자 생존율; 증가된 종양 침윤성 림프구 및 감소된 종양 혈관형성과 같은 호전된 예후의 관찰되는 임상적 연관성의 증가 등을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 이러한 2가지 유형의 항체 조합의 투여는 치료를 받고 있는 환자(예, 피험체)로부터 상기 매개변수 중 하나 이상의 호전을 유도할 것이다. 다른 구체예에서, 환자의 호전은 일부 매개변수와 관련하여 상승적이거나, 다른 것들과 관련하여 가산적이 될 것이다.

특정 구체예에서, CD19 및 CD20 항체에 의한 병용 요법의 효과는 가산적일 수 있다. 다른 구체예에서, CD19 및 CD20 항체에 의한 병용 요법의 효과는 상승적일 수 있다. 용어 "상승"은 각 활성제의 개별 효과의 합보다 더 큰 둘 이상의 활성제의 조합 효과를 설명하는 데 사용된다. 따라서, 둘 이상의 제제의 조합 효과가 종양 성장과 같은 활성 또는 과정의 "상승적 억제"를 유도하는 경우, 활성 또는 과정의 억제가 각 활성제의 억제 효과의 합보다 더 크다는 것을 의도한다. 용어 "상승적 치료 효과"란 (다수의 매개변수 중 임의의 것에 의해 측정될 때) 치료 효과가 각 개별 치료에 의해 관찰되는 개별 치료 효과의 합보다 더 큰, 둘 이상의 치료의 조합에 의해 관찰되는 치료 효과를 지칭한다. 본원의 목적의 경우, 상승적 효과란 유사한 투여 일정 또는 처방 하에 투여된 CD19 항체 및 CD20 항체의 조합을 사용할 경우 관찰되는 효과가 (1) 그 CD19 항체 또는 CD20 항체가 단독으로 (또는 개별적으로) 사용되는 경우 실현되는 효과보다 더 크고 (2) 그 CD19 항체 및 CD20 항체에 대한 첨가된(가산된) 효과 합보다 더 크다는 것을 의미한다. 본원에 사용된, 유사한 투여 일정이란 둘 이상의 상이한 치료의 결과를 평가하거나 비교하는 데 사용하고 그 자체로 비교되는 치료 사이와 동일하게 되도록 설계되는 투여 일정 또는 처방을 지칭하고, 즉 환자는 동일한 방식(예, 일자, 투여간 시간, 항체 제제의 농도)으로 상이한 항체 또는 병용 요법에 의해 투여된다. 투여 일정의 변수는 치료할 B 세포 종양 및 치료의 선택에 따라 당업자에 의해 확인될 것이다. 상기 상승 또는 상승적 효과는 당업계에 공지된 각종 수단에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, CD19 항체 및 CD20 항체의 상승적 효과는 종양 세포 수 또는 종양 크기의 감소, 또는 종양 성장의 억제 또는 종양 세포의 고갈에 의해 조사되는 시험관내 또는 생체내 검정 포맷을 사용하여 관찰될 수 있다. 유사하게, 각 개별 성분의 상승적 유효량은 각 성분의 일정 범위의 농도를 테스트함으로써 확인될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "조합(병용)(combination)"은 광의의 의미로 사용되고 피험체가 둘 이상의 치료 계획에 의해 치료되는 것을 의미한다. 따라서, "조합 항체 치료" 또는 "병용 요법"은 피험체가 둘 이상의 항체 계획, 더욱 구체적으로는 하나 이상의 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)와 함께 하나 이상의 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)로 치료되는 것을 의미하지만, 상이한 항체 계획의 투여 타이밍은 상기 항체의 조합의 유리한 효과가 실현되는 한 달라질 수 있다. 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)와 함께 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)에 의한 치료는 동일한 시기에(예, 동시에 또는 일시에), 또는 여러 시기에(예, 연속하여 또는 순차적으로), 또는 이의 조합일 수 있다. 본 개시 내용의 목적의 경우, 동일한 시기에(예, 동시에) 투여하는 것은 동일한 제형 또는 별개의 제형으로 함께 항체를 투여하는 것을 지칭하고 여기서 투여는 몇 분 내지 몇 시간을 두지만 1일 이하일 수 있다. 본원에 사용된 여러 시기에(예, 순차적으로) 투여하는 것은 몇 시간 내지 몇 일, 몇 주, 심지어 몇 개월을 두고 병용 요법의 항체를 투여하는 것을 지칭한다.

따라서, 특정 구체예에서, 조합 항체 치료를 받는 피험체는 양 물질의 조합의 치료 효과가 치료를 받는 피험체에게 유발되기만 하면 동일한 시기에(예, 동시에) 또는 여러 시기에(예, 같은 날에 또는 다른 날에, 순차적으로, 순서대로) 양 항체를 수용할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체의 조합은 하나의 투여를 위해 동시에 제시될 것이지만, 다른 투여는 같은 날에 또는 다른 날에 순서대로 순차적인 투여를 포함할 것이다. 순차적 투여는 피험체가 첫 단일 클론 항체 투여에 반응하는지 여부에 상관없이 수행될 수 있다. 2개의 항체가 동시에 투여되는 경우, 이는 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 또는 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)를 각각 포함하는 별개의 약학 조성물로서 투여될 수 있거나, 또는 상기 항체 양자를 포함하는 단일 약학 조성물로서 투여될 수 있다.

본 개시 내용의 방법은 B 세포 질병에 대한 치료가 필요한 피험체에게 양성 치료 반응을 부여하는 병용 요법을 사용하는 것을 포함한다. 항-CD19 및 항-CD20 항체를 사용하는 병용 요법에 대한 양성 치료 반응은 상기 항체 또는 이의 단편의 항종양 활성과 공동으로 질병의 호전, 및/또는 질병과 관련된 증상의 호전을 의미한다. 즉, 항-증식성 효과, 추가 종양 파생물의 예방, 종양 크기의 감소, 암 세포 수의 감소, 및/또는 종양성 B 세포에 의해 매개된 하나 이상의 증상의 감소가 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 질병의 호전은 완전한 반응으로서 특징지을 수 있다. "완전한 반응"이란 종래의 임의의 비정상적 방사선 연구, 골수, 및 뇌척수액(CSF)의 정상화에 의해 임상적으로 검출가능한 질병의 부재를 의도한다. 이러한 반응은 본 개시 내용의 방법에 따라 치료 후 1개월 이상 동안 지속되어야 한다. 대안적으로, 질병의 호전은 부분적 반응이 되는 것으로서 분류될 수 있다. "부분적 반응"이란 새로운 병변의 부재 하에 1개월 이상 동안 지속되면서 모든 측정가능한 종양 부담(burden)(예, 피험체 내 존재하는 종양 세포의 수)이 약 50% 이상 감소하는 것을 의도한다. 이러한 반응은 오직 측정가능한 종양에만 적용가능하다.

종양 반응은 자기 공명 이미징(MRI) 스캔, x-방사선 이미징, 전산화 단층(CT) 스캔, 유동 세포분석법 또는 형광-활성화된 세포 선별기(FACS) 분석, 생물발광 이미징, 예컨대 루시퍼라제 이미징, 골 스캔 이미징, 및 골수 흡인(BMA)을 포함한 종양 생검 샘플링과 같은 선별 기법을 이용하여 종양 형태(예, 전체적인 종양 부담, 종양 크기 등)의 변화에 대해 평가될 수 있다. 이러한 양성 치료 반응 이외에도, 치료를 받는 피험체는 질병과 관련된 증상의 호전의 유리한 효과를 경험할 수 있다. 따라서, B 세포 종양의 경우, 피험체는 소위 B 증상, 예컨대 식은땀, 열, 체중 감량, 및/또는 두드러기의 감소를 경험할 수 있다.

본원에 개시된 병용 요법은 치료적으로 유효한 투여량으로 투여된다. 용어 "치료적으로 유효한 투여량," "치료적으로 유효량," 또는 "유효량"은 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 양과 함께 투여될 경우, 종양성 B 세포를 포함하는 암에 대해 피험체의 치료에 대해 양성 치료 반응을 유도하는 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 양이 되는 것을 의도한다. 일부 구체예에서, 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 또는 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량은 약 1 mg/kg∼약 200 mg/kg 범위 내에 있다. 당업자라면 치료 방법은 방법의 실시에 유용한 항체 조합의 치료적으로 유효한 투여량의 단독 투여 또는 항체 조합의 치료적으로 유효한 투여량의 다중 투여를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다.

특정 구체예에서, 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체에 의한 병용 요법은 항-CD19 항체 단독 또는 항-CD20 항체 단독을 수반하는 치료와 비교하였을 때 장기적인 항종양 활성을 제공한다. 특정 구체예에서, 병용 요법은 항-CD19 항체 단독 또는 항-CD20 항체 단독에 의해 얻을 수 있는 항종양 활성보다 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 또는 2년 이상 동안 유지되는 항종양 활성을 제공할 수 있다. 항종양 활성의 상대 기간은 테스트 집단의 통계학적 분석을 기초로 확인될 수 있다. 예를 들면, 항-CD19 항체가 테스트 집단에서 평균 6주 동안 특정 수준의 항종양 활성을 제시하고 항-CD20 항체가 테스트 집단에서 평균 8주 동안 특정 수준의 항종양 활성을 제시하는 경우, 그 조합은 병용 요법이 테스트 집단에서 평균 12주 이상 동안 단일 항체 치료에서 확인된 바와 적어도 동일한 수준의 항종양 활성을 제시하는 경우 단독 투여된 항체 치료보다 적어도 4주 더 길게 항종양 활성을 제시한다. 항종양 활성 기간은 치료가 (예, 종양 부피의 증가를 방지하는 능력, B 세포를 고갈시키는 능력 등에 의해 측정될 때) 바람직한 수준의 항종양 활성을 더이상 제공하지 않는 시점까지 치료를 시작하는 날짜로 측정될 수 있다.

특정 구체예에서, 본원에 기술된 항종양 활성은 종양 크기의 증가를 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25% 또는 30%보다 더 방지하는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 종양 크기는 직경 측정 또는 예상 종양 부피 측정을 지칭한다. 예를 들면, 6개월에 걸쳐 1차원 또는 2차원 측정시 종양이 10%보다 더 증가하는 것을 병용 요법이 방지할 수 있다면 이는 6개월에 걸친 항종양 활성을 제시한다. 림프종 종양(예, 말초 림프절에 존재하는 종양)의 이러한 차원적 측정은 직경 또는 예상 종양 부피 측정을 제공하는 상기 기술된 기구를 사용하여 바디 스캔에 의해 얻을 수 있다(Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 22, No 14S (July 15 Supplement), 2004: 6606)). 따라서, 본원에 개시된 병용 요법은 종양의 직경 측정 또는 예상 종양 부피 측정에서 증가가 결핍되는 경우 항종양 활성을 제시한다. 또다른 구체예에서, 항종양 활성은 종양 크기의 실질적 감소, 또는 일정 기간에 걸쳐 고정된 크기의 종양의 유지로 나타낼 수 있다. 또다른 구체예에서, 항종양 활성은 치료 전 종양의 크기, 예컨대 직경 측정 또는 예상 종양 부피 측정과 비교하였을 때 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25% 또는 30%보다 더욱 크게 종양 성장을 억제함으로써 확인될 수 있다.

특정 구체예에서, 항종양 활성은 제공된 치료에 의해 얻어진 B 세포 고갈 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다. 악성 B 세포를 포함한 순환 B 세포는 유동 세포분석법, 또는 상기 기술되고 당업계에 잘 공지된 다른 세포 계수 장치에 의해 가장 쉽게 측정되며, 순환 B 세포의 계수 수를 유도한다. 다수의 순환 B 세포를 제공하는 임의의 방법은 병용 요법에 의한 치료 후 B 세포의 고갈을 측정하는 데 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 순환 B 세포 고갈은 조직 B 세포 고갈을 위한 대리 마커가 될 것으로 잘 이해된다. 따라서, 이러한 B 세포 고갈은 일부가 악성일 수 있는 순환 B 세포 및 조직 B 세포 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 항종양 활성은 치료 전 B 세포의 수준과 비교하였을 때 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 B 세포 고갈 수준에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 치료가 6개월 이상에 걸쳐 90%의 B 세포 고갈 수준을 유지할 수 있는 경우, 치료는 6개월에 걸쳐 항종양 활성을 제시한다.

임상 효능을 예측하는 한가지 방법은 적당한 모델에서 상기 항체에 의한 병용 요법의 효과; 예를 들어, 쥐과 암 모델에서 항-CD20 항체 및 항-CD19 항체의 조합의 용도를 측정하는 것이다. 이러한 모델은 누드 마우스 이종이식 종양 모델, 예컨대 Namalwa 및 Daudi로 공지된 인간 버킷 림프종 세포주를 사용한 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항종양 활성은 Daudi 인간 림프종 세포주를 사용하여 단계화된 누드 마우스 이종이식 종양 모델에서 검정된다. 단계화된 누드 마우스 이종이식 종양 모델 세포주는 일반적으로 종양이 측정가능한 크기에 도달한 후에만 단계화된 모델 항체 투여가 개시되는 것과 같이 비단계화된 모델보다 제시된 항체의 치료 효능을 구별하기에 더욱 효과적이다. 비단계화된 모델에서, 항체 투여는 일반적으로 종양 접종 약 1일 내에 그리고 감지가능한 종양이 존재하기 전에 개시된다. 단계화된 모델에서 증가된 항종양 활성을 제시하는 항체의 능력은 항체가 치료적으로 유효할 것이라는 강한 조짐이다.

다른 구체예에서, 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체의 조합은 치료적 항체의 감소된 투여량을 사용하여 B 세포 종양을 가진 환자를 치료하거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특히, 본원에 제공된 실시예에는 병용 요법(예, 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체의 조합)의 총 투여가 병용 요법의 총 투여량보다 많은 항-CD19 항체의 투여량보다 더욱 효과적이라는 것이 제시된다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 단일 항체 치료의 효능을 향상시킴으로써 더 낮은 투여량에서 효과적인 치료를 허용하고 잠재적으로 항체 치료의 높은 투여량과 관련된 불필요한 부작용을 방지하는 것을 제공한다. 특정 구체예에서, 병용 요법은 동일한 항종양 활성(예, 단일 투여량에 반응하여 동일한 정도의 항종양 활성, 또는 유사한 투여 일정을 이용하여 한정된 기간에 걸쳐 동일한 정도의 항종양 활성)을 제공하는 데 요구되는 항-CD19 항체 또는 항-CD20 항체의 투여량보다 적어도 2배, 3배, 4배 또는 5배 낮은 총 투여량에서 동일하거나 더 큰 항종양 효과를 제공한다. 따라서, 항종양 활성을 부여하는 항-CD19 항체의 임의의 제공된 투여량의 경우, 병용 요법은 항-CD19 항체의 투여량보다 낮은 농도에서 더 높은 항종양 활성을 부여할 것이다. 더 낮은 농도란 항-CD19 항체 농도의 절반일 수 있거나, 또는 항-CD19 항체 농도의 절반 미만일 수 있다.

특정 구체예에서, 본원에 기술된 병용 요법은 다양한 투여 수단에 의해 실현될 수 있다. 예를 들면, 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체는 개별적으로 조제되고 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 항-CD19 및 항-CD20 항체는 단일 제형으로 함께 조제될 수 있다. 항-CD19 및 항-CD20 항체가 별도의 제형으로 있는 경우, 항체는 동일하거나 상이한 투여 일정 하에 투여될 수 있다. 예를 들면, 2개의 항체는 동시에 그리고 동일 빈도로 투여될 수 있거나(예, 양 항체는 1주 1회 동시에 투여됨), 별도의 투여 시간에 동일한 투여 빈도로 투여될 수 있거나(예, 양 항체는 1주 1회 다른 시간에 투여됨), 또는 빈도가 상이한 일정을 이용하여 투여될 수 있다(예, 하나의 항체는 1주 1회 투여되고 다른 항체는 격주로 투여됨). 예시적 구체예에서, 항-CD19 및 항-CD20 항체는 함께 조제되고 동일한 투여 일정 하에 투여된다.

B. 항- CD19 항체

본원에 기술된 병용 요법은 항-CD19 항체를 포함한다. 용어 "CD19" 또는 "CD19 항원"은 예컨대 HD237 또는 B4 항체에 의해 동정된 약 90 kDa의 항원을 지칭한다(Kiesel et al., Leukemia Research II, 12:1119(1987)). CD19는 말기 분화를 통해 줄기 세포 단계에서 비제한적 예로서 프레-B 세포, (고유의(naive) B 세포, 항원-자극된 B 세포, 기억 B 세포, 형질 세포, 및 B 림프구를 포함한) B 세포 및 여포성 수지상 세포를 포함하는 형질 세포까지 B-계통 세포의 분화 전반에 걸쳐 세포 상에서 발견된다. CD19는 또한 인간 태아 조직의 B 세포 상에서도 발견된다. 바람직한 구체예에서, 본원에 개시된 항체에 의해 표적화된 CD19 항원은 인간 CD19 항원이다.

임의의 적당한 항-CD19 항체는 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 사용될 수 있다. 적당한 항-CD19 항체는, 예를 들어 공지된 항-CD19 항체, 구입 가능한 항-CD19 항체, 또는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 발달시킨 항-CD19 항체를 포함한다.

본원에 사용된, 면역글로불린으로도 공지된 용어 "항체" 및 "항체들"은 단일 클론 항체(전장 단일 클론 항체를 포함), 다클론 항체, 둘 이상의 상이한 에피토프 결합 단편(예, 2중특이적 항체)으로부터 형성된 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화된(camelised) 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 Fvs(scFv), 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 목적하는 생물학적 활성을 제시하는 항체 단편(예, 항원-결합 부분), 디설피드-연결된 Fvs(dsFv), 및 항-유전자형(항-Id) 항체(예, 항-Id 항체 내지 본원에 개시된 항체를 포함), 인트라바디(intrabody), 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 단편을 포함한다.

본 개시 내용의 CD19 항체는 단일 클론 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체일 수 있다. 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 노출(naked) 항체, 면역접합 또는 융합 단백질일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 순환 B 세포를 고갈시키기에 충분한 양으로 인간 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포-매개성 세포독성(CDC), 및/또는 세포사멸을 매개할 수 있다. 예시적 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 모 항체에 비해 강화된 ADCC 활성을 갖도록 조작된 항-CD19 항체이다. 강화된 ADCC 활성을 갖는 항체 변이체를 생성하는 방법은 하기 추가로 기술된다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 강화된 ADCC 활성을 갖는 어푸코실화된 항체이다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용된 항-CD19 항체는 IgG 이소타입, 구체적으로는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 인간 이소타입 또는 인간 집단에서 발견되는 임의의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 대립유전자를 갖는 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다. 인간 IgG 클래스의 항체는 각종 효과기 기능을 매개하는 능력 및 혈청내 장기간의 반감기와 같은 기능적 특징을 갖는다(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). 인간 IgG 클래스 항체는 다음의 4개의 서브클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 분류된다. 다수의 연구는 지금까지 IgG 클래스 항체의 효과기 기능으로서의 ADCC 및 CDC에 대해 실시되었고, 인간 IgG 클래스의 항체 중, IgG1 서브클래스가 인간에서 가장 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖는다는 것이 보고된 바 있다(Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는, 비제한적 예로서, HD37(IgG1, kappa)(DAKO North America, Inc., Carpinteria, Calif.), BU12(Callard et al., J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992)), 4G7(IgG1)(Meeker et al., Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter)), J4.119(Beckman Coulter, Krefeld, Germany), B43(PharMingen, San Diego, Calif.), SJ25C1(BD PharMingen, San Diego, Calif.), FMC63(IgG2a)(Zola et al., Immunol. Cell. Biol. 69(PT6): 411-22(1991); Nicholson et al., Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pietersz et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995)), 89B(B4)(IgG1)(Beckman Coulter, Miami, Fla.; Nadler et al., J. Immunol., 131:244-250 (1983)), 및/또는 HD237(IgG2b)(Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989; 및 Pezzutto et al, J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987))을 포함하는 공지된 항-CD19 항체이다. 다른 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 미국 공개 번호 2008/0138336 및 2009/0142349, 및 미국 특허 번호 7,462,352 및 7,109,304에 기술된 항-CD19 항체 중 임의의 것이다. 예시적 구체예에서, 항-CD19 항체는 미국 공개 번호 2008/0138336 및 이하에 기술된 16C4 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다.

특정 구체예에서, 항-CD19 항체는 상기 기술된 바와 같이 (예, IgG1 또는 IgG3 인간 이소타입에 대한) 공지된 항-CD19 항체의 이소타입 전환된(switched) 변이체이다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 인간 CD19에 면역특이적으로 결합될 수 있고 당업자에게 공지된 방법(예, BIAcore 검정, ELISA)(Biacore International AB, 스웨덴 웁살라 소재)을 사용하여 평가된 바와 같이 3000 pM 미만, 2500 pM 미만, 2000 pM 미만, 1500 pM 미만, 1000 pM 미만, 750 pM 미만, 500 pM 미만, 250 pM 미만, 200 pM 미만, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 75 pM 미만의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합될 수 있고 당업자에게 공지된 방법(예, BIAcore 검정, ELISA)을 사용하여 평가된 바와 같이 25∼3400 pM, 25∼3000 pM, 25∼2500 pM, 25∼2000 pM, 25∼1500 pM, 25∼1000 pM, 25∼750 pM, 25∼500 pM, 25∼250 pM, 25∼100 pM, 25∼75 pM, 25∼50 pM의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 인간 CD19에 면역특이적으로 결합될 수 있고 당업자에게 공지된 방법(예, BIAcore 검정, ELISA)을 사용하여 평가된 바와 같이 500 pM, 100 pM, 75 pM 또는 50 pM의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 항-CD19 항체는 이로 치료된 인간에서 B 세포를 감소시키거나 고갈시킬 수 있다. B 세포의 고갈은 순환 B 세포, 또는 특히 비제한적 예로서 골수, 비장, 장관련 림프양 조직, 및/또는 림프절과 같은 조직 내에서 있을 수 있다. 일 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장 B 세포, 변연부(marginal zone) B 세포, 여포성 B 세포, 복막 B 세포, 및/또는 골수 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 일 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 전구 B 세포, 초기 프로-B 세포, 말기 프로-B 세포, 대-프레-B 세포, 소-프레-B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원-자극된 B 세포, 및/또는 형질 세포의 고갈을 실현시킬 수 있다. 이러한 고갈은 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC)과 같은 각종 기전을 통해, 및/또는 목표하는 리간드와의 CD19 상호작용의 차단, 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC), B 세포 증식 억제 및/또는 (예, 세포사멸을 통한) B 세포사 유도에 의해 실현될 수 있다. B 세포의 "고갈"이란 순환 B 세포 및/또는 B 세포, 특히 조직(들) 내 적어도 약 25%, 40%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 감소를 의미한다. 특정 구체예에서, 사실상 모든 검출가능한 B 세포는 순환 및/또는 특정 조직(들)로부터 고갈된다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상, 또는 30일 이상 동안 지속될 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 또는 10주 이상 동안 지속될 수 있다. 추가 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체에 의한 B 세포 고갈은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상 동안 지속될 수 있다.

B 세포 종양은 특이적 B 세포 서브셋의 병리학적 팽창을 특징으로 하고, 예를 들어 전구체 B 세포 급성 림프아구성 백혈병은 프로-B 세포/프레-B 세포 발생 단계에 해당하는 B 세포의 비정상 팽창을 특징으로 한다. 악성 B 세포는 정상 B 세포 마커, 예컨대 CD19의 세포 표면 발현을 유지한다. 항-CD19 항체는 이에 따라 인간 피험체 내 악성 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 이상의 인간 피험체 내 악성 B 세포 고갈을 실현할 수 있다.

조작된 효과기 기능

일부 구체예에서, 항-CD19 항체는 B 세포 종양 등을 치료시 항체의 효과를 향상시키도록 효과기 기능에 대해 변형된다. 예시적 효과기 기능은 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식한 후 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응인 항체-의존성 세포-매개성 세포독성, 또는 ADCC이다. 세포독성 세포, 또는 효과기 세포는 하나 이상의 FcR을 발현하는 백혈구일 수 있다. 효과기 세포는 마우스에서 적어도 FcγRI, FCγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. ADCC를 매개하는 일부 인간 백혈구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이들 세포 중, ADCC를 매개하는 주요 세포는 FcγRIII를 발현하는 NK 세포이다. 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)]에 요약된다.

항체의 효과기 기능을 향상시키는 한가지 방법은 조작된 글리코형(glycoform)을 생성하는 것에 의한 것이다. 조작된 글리코형은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 조작된 또는 변이체 발현 계통(strain)을 사용하여, 하나 이상의 효소, 예컨대 DI N-아세틸글루코사민일전이효소 III(GnTIII)와의 공동 발현에 의해, 각종 유기체 또는 각종 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시킴으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 발생될 수 있다. 조작된 글리코형의 발생 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적 예로서 문헌[Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473], 미국 특허 번호 6,602,684; 미국 연속 번호 10/277,370; 미국 연속 번호 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent^TM 기법(Biowa, Inc., 미국 뉴저지주 프린스톤 소재); GlycoMAb^TM 글리코실화 조작 기법(GLYCART biotechnology AG, 스위스 취리히 소재)에 기술된 것을 포함한다. 예를 들면, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49를 참조한다. 하나 이상의 아미노산 치환이 또한 일어날 수 있다(예, IgG의 아스파라긴 297). 추가적으로, 어글리코실화된(aglycosylated) 항체는 필요한 글리코실화 기구가 없는 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.

항체는 또한 글리코실화의 변경 유형, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔류물을 갖는 히포푸코실화된 항체 또는 증가된 2등분된 GlcNAc 구조를 갖는 항체를 갖는 것으로 제조될 수도 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 상기 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 호스트 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술된 바 있으며 본 개시 내용의 재조합 항체를 발현함으로써 변경된 글리코실화에 의한 항체를 생성하는 호스트 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1], 뿐만 아니라 미국 특허 번호 6,946,292; 유럽 특허 번호: EP 1,176,195; PCT 공개 WO 03/035835; WO 99/54342를 참조하고, 이의 각각은 그 전문이 본원에 참고 인용된다.

일 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 강화된 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 매개하는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 푸코스가 감소된 말단에서 N-아세틸글루코사민에 결합되지 않는 Asn297에 연결된 복합체 N-글리코시드-연결된 당류 쇄를 갖는 Fc 영역을 포함하고, 여기서 상기 Fc 영역은 강화된 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 매개한다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 Fc 변이체를 포함하고, 여기서 상기 변이체 Fc 도메인은 유사한 비-변이체 Fc 도메인보다 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 5배 이상, 또는 7배 이상, 또는 10배 이상, 또는 20배 이상, 또는 30배 이상, 또는 40배 이상, 또는 50배 이상, 또는 60배 이상, 또는 70배 이상, 또는 80배 이상, 또는 90배 이상, 또는 100배 이상, 또는 200배 이상 큰 Fc 감마 수용체 IIB에 대한 친화성을 갖는다.

다른 구체예에서, 효과기 기능은 항체의 Fc 영역에 시스테인 잔류물(들)을 도입시킴으로써 변경하여, 상기 영역에 쇄간 디설피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이에 따라 발생된 단독이량체 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포사 및/또는 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922(1992)]를 참조한다. 강화된 항종양 활성을 갖는 단독이량체 항체는 또한 문헌[Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 이종이작용성 가교결합체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는 또한 이중 Fc 영역을 갖도록 조작될 수 있고 이에 의해 강화된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)]를 참조한다.

효과기 기능을 변경하도록 항체의 Fc 영역을 조작하는 다른 방법은 당업계에 공지된다(예, FCγRIIA에 대한 결합 친화성과 비교하였을 때 FcγRIIB에 대한 결합 친화성을 향상시키는 Fc 영역을 변경하는 것을 기술하는 미국 특허 공개 번호 20040185045 및 PCT 공개 번호 WO 2004/016750(양 문헌은 Koenig 등에 의한 문헌임); 또한 PCT 공개 번호 WO 99/58572(Armour 등), WO 99/51642(Idusogie 등), 및 미국 특허 번호 6,395,272(Deo 등)을 참조하고; 본 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고 인용됨). FcγRIIB에 대한 결합 친화성을 감소시키는 Fc 영역을 변형시키는 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다(예, 미국 특허 공개 번호 20010036459 및 PCT 공개 번호 WO 01/79299(양 문헌은 Ravetch 등에 의한 문헌임), 본 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고 인용됨). 야생형 Fc 영역과 비교하였을 때 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 강화된 결합 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 갖는 변형된 항체는 또한 기술된 바 있다(예, PCT 공개 번호 WO 2004/063351(Stavenhagen 등), 본 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고 인용됨).

당업계에 공지된 시험관내 검정은 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체가 ADCC를 매개할 수 있는지 여부를 측정하는 데 사용될 수 있다. 예시적 검정은 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된다. 특히, 상기 검정에 대한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예컨대 Clynes 등(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998))에서 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 상기 검정은 또한 구입 가능한 키트, 예컨대 CytoTox 96^TM(Promega)을 사용하여 수행될 수도 있다.

예시적 항- CD19 항체

특정 구체예에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 항-CD19 항체 16C4(예, 미국 공개 번호 2008/0138336 참조), 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한다. 16C4는 유효한 ADCC 효과기 기능을 갖는 것으로 확인된 CD19 mAb이다. 16C4는 HB12b mAb의 인간화 및 친화성 최적화에 의해 발생된 CD19 mAb 항-CD19-2의 어푸코실화된 형태이다(Kansas GS and Tedder TF. J Immunol, 1991; 147:4094-4102; Yazawa et al., Proc Natl Acad Sci, 2005; 102(42):15178-15183; Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010, 335(1):213-222).

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:2와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호:4와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호:1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:6과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:7과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호:8과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호:5와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호:7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호:8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:2와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호:3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호:4와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호:6과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호:7과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호:8과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD19 항체는 서열 번호:1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:5와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 개시 내용은 인간 CD19에 결합하는 항체 16C4의 유도체인 항체를 포함한다. 아미노산 치환을 발생시키는 데 일상적으로 사용되는 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발 등을 포함하는 당업자에게 공지된 표준 기법은 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 돌연변이(예, 첨가, 결실, 및/또는 치환)를 도입시키는 데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, VH 및/또는 VK CDR 유도체는 16C4 항-CD19 항체의 본래의 VH 및/또는 VK CDR과 비교하였을 때 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 2개 미만의 아미노산 치환, 또는 1개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 또다른 구체예에서, VH 및/또는 VK CDR 유도체는 하나 이상의 예상 비-필수 아미노산 잔류물(예, 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체에 중요하지 않은 아미노산 잔류물)에서 만들어진 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 돌연변이는 또한 VH 및/또는 VK CDR 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라, 예를 들어 포화 돌연변이유발에 의해 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 생물학적 활성을 스크리닝하여 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정할 수 있다. 돌연변이유발 후, 코딩된 항체는 발현될 수 있고 항체의 활성은 측정될 수 있다. 2가지 아미노산 서열의 동정 백분율은, 비제한적 예로서 BLAST 단백질 검색을 포함한 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.

C. 항- CD20 항체

본원에 기술된 병용 요법은 항-CD20 항체를 추가로 포함한다. CD20 항원 (또한, 인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 지칭됨)은 프레-B 및 성숙 B 림프구에 위치하는 대략 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막관통 단백질이다(Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989); Einfeld et al. EMBO J. 7(3):711-717 (1988); Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989); 및 Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)). CD20은 초기 프레-B 세포 발생 동안 발현되고 형질 세포의 분화까지 유지되고; 인간 줄기 세포, 림프성 전구 세포 또는 정상 형질 세포 상에서는 발견되지 않는다. CD20은 정상 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포, 예컨대 B 세포 비호지킨 림프종(NHL) 내 세포 양자 상에 존재하며, 여기서 CD20은 90%의 NHL보다 많이 발현된다(Anderson et al. Blood 63(6):1424-1433 (1984)). CD20은 조혈모세포, 프로-B 세포, 정상 형질 세포 또는 다른 정상 조직 상에서는 발견되지 않는다(Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). CD20은 세포 주기 개시 및 분화를 위한 활성 과정에서 초기 단계(들)를 조절하고(Tedder et al., supra) 가능한 경우 칼슘 이온 채널로서 작용한다(Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).

임의의 적당한 항-CD20 항체는 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 사용될 수 있다. 적당한 항-CD20 항체는, 예를 들어 공지된 항-CD20 항체, 구입 가능한 항-CD20 항체, 또는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 발달시킨 항-CD20 항체를 포함한다.

본 개시 내용의 CD20 항체는 단일 클론 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD20 항체일 수 있다. 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용된 항-CD20 항체는 노출 항체, 면역접합 또는 융합 단백질일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD20 항체는 순환 B 세포를 고갈시키기에 충분한 양으로 인간 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포-매개성 세포독성(CDC), 및/또는 세포사멸을 매개할 수 있다. 예시적 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD20 항체는 모 항체에 비해 강화된 ADCC 활성을 갖도록 조작된 항-CD20 항체이다. 강화된 ADCC 활성을 갖는 항체 변이체를 생성하는 방법은 상기 기술된다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 항-CD20 항체는 강화된 ADCC 활성을 갖는 어푸코실화된 항체이다.

특정 구체예에서, 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용된 항-CD20 항체는 IgG 이소타입, 구체적으로는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 인간 이소타입 또는 인간 집단에서 발견되는 임의의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 대립유전자를 갖는 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.

CD20 항원에 결합하는 항체의 예는 이하 "리툭시맙"("RITUXAN^TM")으로 지칭되는 "C2B8"; "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 티우크세탄"(ZEVALIN^TM)으로 지정된 이트륨-[90]-라벨링된 2B8 쥐과 항체(미국 특허 번호 5,736,137, 확실히 본원에 참고 인용됨); "131I-B1" 항체(요오드 I131 토시투모맙, BEXXAR^TM)를 발생시키는 131I로 경우에 따라 라벨링된 쥐과 IgG2a "B1," 또한 소위 "토시투모맙,"(Beckman Coulter)(미국 특허 번호 5,595,721, 확실히 본원에 참고 인용됨); "골격 팻치화(framework patched)" 또는 인간화 1F5를 포함하는 쥐과 단일 클론 항체 "1F5"(Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987) 및 이의 변이체(WO03/002607, Leung, S.); ATCC 기탁물 HB-96450; 쥐과 2H7 및 키메라 2H7 항체(미국 특허 번호 5,677,180, 확실히 본원에 참고 인용됨); 인간화 2H7; huMax-CD20(Genmab, Denmark); AME-133(Applied Molecular Evolution); A20 항체 또는 이의 변이체, 예컨대 키메라 또는 인간화 A20 항체(각각 cA20, hA20)(US 2003/0219433, Immunomedics); 및 국제 백혈구 타이핑 워크샵에서 이용가능한 단일 클론 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-CI 또는 NU-B2(Valentine et al., In: Leukocyte Typing III(McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))를 포함한다. 예시적 구체예에서, 본 개시 내용의 방법 및 조성물은 항-CD19 항체, 또는 이의 단편과 조합하여 리툭시맙, 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한다.

리툭시맙(RITUXAN^TM)은 1998년 4월 7일 발행된 미국 특허 번호 5,736,137(Anderson 등)에서 "C2B8"로 지칭된 항체이다. RITUXAN^TM은 재발성 또는 난치성 저 악성(low grade) 또는 여포성, CD20-포지티브, B 세포 비호지킨 림프종을 앓는 환자의 치료에 권고된다. 작용 연구의 시험관내 기전으로 RITUXAN^TM은 인간 보체에 결합하고 보체-의존성 세포독성(CDC)을 통해 림프성 B 세포주를 용해시킨다는 것이 입증되었다(Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). 추가적으로, 항체-의존성 세포 매개성 세포독성(ADCC)에 대한 검정에 상당한 활성을 갖는다. 더욱 최근에는, RITUXAN^TM은 3중 수소화된 티미딘 혼입 검정시 항-증식성 효과를 갖고 직접 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었다(Maloney et al. Blood 88(10):637a(1996)). 생체내 임상전 연구로 RITUXAN^TM이 아마도 보체 및 세포-매개 과정을 통해 시아노몰구스 원숭이의 말초 혈액, 림프절, 및 골수로부터 B 세포를 고갈시키는 것이 확인되었다(Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). 리툭시맙은 4회 투여량 동안 매주 375 mg/m²의 투여량에서 재발성 또는 난치성 저급 또는 여포성 CD20+ B 세포 비호지킨 림프종(NHL)을 앓는 환자를 치료하기 위해 1997년 11월에 미국에서 승인되었다.

본원에서 용어 "리툭시맙" 또는 "RITUXAN^TM"은 CD20 항원에 대해 지정되고 본원에 확실히 참고 인용된 미국 특허 번호 5,736,137에서 "C2B8"로 지정된 유전적으로 조작된 키메라 쥐과/인간 단일 클론 항체를 지칭한다. 리툭시맙의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 위한 완전한 핵산 및 아미노산 서열은 미국 특허 번호 5,736,137에 개시된다. 특히, 리툭시맙의 경쇄 가변 영역을 위한 핵산 및 아미노산 서열은 미국 특허 번호 5,736,137의 도4 및 서열 번호:6으로 개시된다. 리툭시맙의 중쇄 가변 영역을 위한 핵산 및 아미노산 서열은 미국 특허 번호 5,736,137의 도 5 및 서열 번호:9에 개시된다. 미국 특허 번호 5,736,137의 서열 번호: 6 및 9 그리고 도 4 및 5의 핵산 및 아미노산 서열은 본원에 확실히 참고 인용된다. 리툭시맙은 또한 수탁 번호 69119 하에 미국모식균배양수집소(ATCC)에 기탁된 이. 콜라이(E. coli) 호스트 세포에 존재하는 벡터 DNA을 포함하는 CHO 세포 트랜스펙토마(transfectoma)에 의해 제조될 수 있다. 리툭시맙은 또한 수탁 번호 HB 11388 하에 ATCC에 기탁된 하이브리도마(hybridoma) 2B8로부터 생성될 수 있다.

D. B 세포 종양

본원에 기술된 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체를 포함하는 병용 요법은 B 세포 종양을 포함한 B 세포 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 용어 "B 세포 종양"은 B 세포 계통의 세포로부터 유도된 임의의 종양을 포함한다. 예시적 B 세포 종양은, 비제한적 예로서, 저 악성/여포성 NHL, 소림프구성(SL) NHL, 중 악성(intermediate grade)/여포성 NHL, 중 악성 분산 NHL, 고 악성(high grade) 면역아세포 NHL, 고 악성 림프아구성 NHL, 고 악성 소 비분할된(non-cleaved) 세포 NHL; 맨틀-세포 림프종, 및 큰(bulky) 질병 NHL을 포함한 B 세포 서브타입 비호지킨 림프종(NHL); 버킷 림프종; 다발성 골수종; 프레-B 급성 림프아구성 백혈병 및 초기 B 세포 전구체 유래의 기타 종양; 일반적인 급성 림프구성 백혈병(ALL); 면역글로불린-돌연변이화된 CLL 및 면역글로불린-비돌연변이화된 CLL을 포함한 만성 림프구성 백혈병(CLL); 모발 세포 백혈병; 눌(Null)-급성 림프아구성 백혈병; 발덴슈트롬 거대글로불린혈증; 배아 중심 B 세포-유사(GCB) DLBCL, 활성화된 B 세포-유사(ABC) DLBCL, 및 제3형 DLBCL을 포함한 확산 대 B 세포 림프종(DLBCL); 전-림프구성 백혈병; 경쇄 질병; 형질세포종; 골경화 골수종; 형질 세포 백혈병; 유의성이 결정되지 않은 단일 클론 감마글로불린병증(MGUS;monoclonal gammopathy of undetermined significance); 아급성(smoldering) 다발성 골수종(SMM); 비활동성(indolent) 다발성 골수종(IMM); 전형적 및 결절성(nodular) 림프구 우성 유형을 포함한 호지킨 림프종; 림프구형질세포성 림프종(LPL); 및 위점막-관련 림프양 조직(MALT) 림프종을 포함한 변연부 림프종을 포함한다.

이러한 암의 재발 치료가 또한 고려된다. LPHD는 방사선 또는 화학요법 치료에도 불구하고 자주 재발되는 경향이 있는 호지킨 질병 유형이고 CD20-포지티브 악성 세포를 특징으로 한다. CLL은 4가지 주요 유형의 백혈병 중 하나이다. 림프구로 지칭되는 성숙 B 세포의 암인 CLL은 혈액, 골수 및 림프 조직 내 세포의 진행성 축적에 의해 나타나게 된다. 비활동성 림프종은 보통의 환자가 차도 및 재발의 수많은 기간 후 6년 내지 10년간 생존하는 저-성장의, 불치의 질병이다.

목적하는 수준의 B 세포 고갈은 질병에 따라 달라질 것이다. B 세포 종양의 치료를 위해서는, 본 개시 내용의 항-CD19 및 항-CD20 항체의 표적인 B 세포의 고갈을 최대화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, B 세포 신생물(neoplasm)의 치료를 위해서는, 예를 들어 종양 성장(크기), 암세포 유형의 증식, 전이, 특정 암의 다른 징후 및 증상을 모니터링함으로써 당업자에 의해 평가될 수 있는 질병의 진행을 적어도 방지하기에 충분한 B 세포의 고갈이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, B 세포의 고갈은 2 개월 이상, 더욱 바람직하게는 3개월, 더욱 더 바람직하게는 4개월, 더욱 바람직하게는 5개월, 더욱 더 바람직하게는 6개월 또는 그 이상의 개월 동안 질병의 진행을 방지하기에 충분하다. 더욱 더 바람직한 구체예에서, B 세포의 고갈은 6개월 이상, 더욱 바람직하게는 9개월, 더욱 바람직하게는 1년, 더욱 바람직하게는 2년, 더욱 바람직하게는 3년, 더욱 더 바람직하게는 5년 또는 그 이상으로 차도의 기간을 증가시키기에 충분하다. 가장 바람직한 구체예에서, B 세포의 고갈은 질병을 낫게 하는데 충분하다. 바람직한 구체예에서, 암 환자 내 B 세포의 고갈은 치료 전 기준치 수준의 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 및 심지어 100%이다.

환자는 치료 전과 비교하였을 때 본 개시 내용의 조성물의 투여 후 증상 또는 다른 적용가능한 기준의 측정가능한 호전이 있는 경우 본 개시 내용의 방법에 의해 B 세포 신생물이 완화되거나 또는 성공적으로 치료된다. 치료의 효과는 본 개시 내용의 조성물의 투여 후 3∼10주 내에 알 수 있다. 각 질병에 대한 적용가능한 기준은 적절한 업계 내 당업자에게 잘 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 당업자는 치료된 환자에서 임상적, 또는 질병의 혈청학적 증거, 예컨대 질병의 혈청학적 마커, B 세포 계수를 비롯한 완전한 혈구 수치, 및 혈청 면역글로불린 수준을 모니터링할 수 있다. 환자는 암 세포 수의 감소 또는 암 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 암 세포의 장기로의 침습의 억제(예, 어느 정도까지 느리게 그리고 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이의 억제 (예, 어느 정도까지 느리게 그리고 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및/또는 특정 암과 관련된 증상 중 하나 이상의 어느 정도까지의 경감; 감소된 질병률 및 사망률, 및 생활의 질 이슈(quality of life issues)의 향상 중 하나 이상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 본 개시 내용의 조성물의 투여 후, 본 개시 내용의 방법에 의해 치료되기 전 취해진 특정 증상 또는 기준에 대해 기준치보다 20% 이상, 더욱 바람직하게는 25∼30%, 더욱 더 바람직하게는 30∼35%, 가장 바람직하게는 40% 이상 향상된다.

신생물 치료의 효능 또는 성공을 평가하는 매개변수는 적절한 질병으로 당업자에게 공지될 것이다. 일반적으로, 당업자는 특정 질병의 징후 및 증상의 감소를 기대할 것이다. 매개변수는 질병 진행에 대한 중간 기간, 차도가 있고 안정한 질병의 기간을 포함할 수 있다. B 세포 신생물의 경우, 측정가능한 기준은, 예를 들어 질병 진행에 대한 기간, 전반적인 및/또는 진행 없는 생존 기간의 증가를 포함할 수 있다. 백혈병의 경우, 골수 생검은 차도의 정도를 측정하기 위해 실시될 수 있다. 완전한 차도는 치료 30일 후 환자의 골수 내에서 발견되는 모든 세포 중 5% 미만이 백혈병 세포를 만들어내는 것으로서 한정될 수 있다.

하기 문헌에는 림프종 및 CLL, 이의 진단, 치료 및 치료 효능을 측정하는 표준 의학 절차가 기술된다. 문헌[Canellos G P, Lister, T A, Sklar J L: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors.) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; 및 Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].

E. 약학 제형

특정 측면에서, 본 발명은 항-CD19 항체, 항-CD20 항체 또는 이의 조합, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용의 약학 조성물은 약제로서 사용된다.

특정 구체예에서, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 또는 이의 조합은 약학 (치료적) 조성물로서 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 조제될 수 있고, 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에게 자명하게도, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 하나 이상의 비독성 재료를 의미한다. 이러한 제제는 일상적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 및 경우에 따라 다른 치료 제제를 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 제제는 또한 일상적으로 인간에게 투여하기에 적당한 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 제형에 이용될 수 있는 기타 고려되는 담체, 부형제, 및/또는 첨가제는, 예를 들어 향미제, 항균제, 감미제, 산화방지제, 정전기 방지제, 지질, 단백질 부형제, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 카제인, 염 형성 짝이온, 예컨대 나트륨 등을 포함한다. 본원에 기술된 제형에 사용하기에 적당한 상기 및 추가적으로 공지된 약학 담체, 부형제 및/또는 첨가제는, 예를 들어 당업계에 공지된 것, 예컨대 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21^st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005)], 및 ["Physician's Desk Reference", 60^th ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (2005)]에 나열된 것이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 병용 요법의 항체의 투여 방식, 용해성 및/또는 안정성에 적당한 것, 및 당업계에 공지된 것 또는 본원에 기술된 것이 일상적으로 선택될 수 있다.

본원에 기술된 제형은 목적하는 투여량에 적절한 w/v를 유도하는 농도의 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 항-CD19 항체 또는 항-CD20 항체는 약 1 mg/㎖∼약 200 mg/㎖, 약 1 mg/㎖∼약 100 mg/㎖, 약 1 mg/㎖∼약 50 mg/㎖, 또는 1 mg/㎖∼약 25 mg/㎖의 농도로 제형 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 제형 내 항-CD19 또는 항-CD20 항체의 농도는 약 0.1∼약 100 중량%로 다양할 수 있다. 특정 구체예에서, 항-CD19 또는 항-CD20 항체의 농도는 0.003∼1.0몰의 범위 내에 있다.

특정 구체예에서, 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체는 함께 조제되고 상기 항체는 각각 약 1 mg/㎖∼약 200 mg/㎖, 약 1 mg/㎖∼약 100 mg/㎖, 약 1 mg/㎖∼약 50 mg/㎖, 또는 1 mg/㎖∼약 25 mg/㎖의 농도로 제형 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 제형 내 상기 항체 각각의 농도는 약 0.1∼약 100 중량%로 다양할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 항체 각각의 농도는 0.003∼1.0몰의 범위 내에 있다.

특정 구체예에서, 항-CD19 항체는 WO 2010102276의 제형 중 임의의 것에 따라 조제된다.

일 구체예에서, 본 개시 내용의 제형은 내독소 및/또는 관련된 발열 인자 물질이 실질적으로 없는 발열 인자-무함유 제형이다. 내독소는 미생물 내부에 한정된 독소를 포함하고 미생물이 분해되거나 사망하는 경우에만 방출된다. 발열 인자 물질은 또한 박테리아 및 기타 미생물의 외막으로부터 발열 유도성의 내열성 물질(당단백질)을 포함한다. 이러한 물질은 모두 인간에게 투여될 경우 발열, 저혈압 및 쇼크를 유발할 수 있다. 잠재적인 유해 효과로 인해, 심지어 적은 양의 내독소라도 정맥내 투여되는 약학적 약물 용액으로부터 제거되어야만 한다. 미 식품 의약국("FDA")은 정맥내 약물 적용을 위해 단일 1시간에 체중 1 kg 당 투여량 당 5 내독소 단위(EU)의 상한을 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 특정 구체예에서, 조성물 내 내독소 및 발열 인자 수준은 10 EU/mg 미만, 또는 5 EU/mg 미만, 또는 1 EU/mg 미만, 또는 0.1 EU/mg 미만, 또는 0.01 EU/mg 미만, 또는 0.001 EU/mg 미만이다.

생체내 투여에 사용할 경우, 본 개시 내용의 제형은 멸균되어야 한다. 본 개시내용의 제형은 멸균 여과, 방사선 등을 포함한 각종 멸균 방법에 의해 멸균될 수 있다. 일 구체예에서, 제형은 사전멸균처리된 0.22-미크론 필터로 필터-멸균처리된다. 주사용 멸균 조성물은 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21^st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005)]에 기술된 바와 같이 종래의 약학적 실시에 따라 조제될 수 있다.

본 개시 내용의 치료적 조성물은 경구, 비내, 폐, (협측 및 설하를 비롯한) 국소, 직장, 질내 및/또는 비경구 투여와 같은 특정 투여 경로용으로 조제될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이란 통상 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하고, 비제한적 예로서 정맥내, 근육내, 동맥내, 포막, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지내, 피하, 큐티클하, 관절내, 관절낭하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 국소 또는 경피성 투여에 적당한 본 개시 내용의 제형은 분말, 스프레이, 연고제, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 팻치 및 흡입체를 포함한다. 항체(들)은 약학적으로 허용가능한 담체, 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진체와 멸균 조건 하에 혼합될 수 있다(미국 특허 번호 7,378,110; 7,258,873; 7,135,180; 미국 공개 번호 2004-0042972; 및 2004-0042971).

제형은 편리하게 단위 제형으로 존재할 수 있고 약학 업계에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 본 개시 내용의 약학 조성물 내 활성 성분의 실질적인 투여량 수준은 환자에게 독성이 되는 일 없이 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 목적하는 치료적 반응을 실현하기에 효과적인 활성 성분의 양(예, "치료적 유효량")을 얻도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 개시 내용의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 비율, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용된 기타 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반 건강 및 사전 병력, 및 의학 업계에 잘 공지된 유사 인자를 포함한 여러 가지의 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다. 적당한 투여량은 체중 1 kg 당 약 0.0001∼약 100 mg 이상, 예컨대 체중 1 kg 당 약 0.1, 1, 10, 또는 50 mg의 범위일 수 있고, 체중 1 kg 당 약 1∼약 10 mg이 바람직하다.

특정 구체예에서, 상기 방법은 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 다중 투여와 조합하여 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 다중 투여의 투여를 포함한다. 이 방법은 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 또는 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편), 또는 양자를 포함하는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 투여량을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 회 이상 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학 조성물을 다중 투여하는 것의 투여 빈도 및 기간은 과도한 실험을 하는 일 없이 당업자에게 쉽게 확인될 수 있다. 게다가, 항체 조합의 치료적 유효량으로 피험체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 피험체는 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 및 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 조합으로 치료될 수 있고, 여기서 양자는 약 1주∼약 10주, 바람직하게는 약 2∼약 8주, 더욱 바람직하게는 약 3∼약 7주, 더욱 더 바람직하게는 약 4주, 5주, 또는 6주 동안 1주에 1회, 체중 1 kg 당 약 1∼약 100 mg의 범위의 투여량에서 투여된다. 치료는 재발을 예방하거나 또는 재발 조짐시 1년에 1회 실시할 수 있다.

또한, 당업자라면 치료에 사용된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 효과적 투여량은 특정 치료의 과정 중에 증가 또는 감소될 수 있다는 것을 알 것이다. 투여량의 변경은 본원에 기술된 진단 검정의 결과로부터 유도되고 명확하게 될 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 투여 계획은 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량과 조합하여 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량의 투여를 포함하고, 여기서 조합은 치료 기간 중 1일째, 8일째, 15일째, 및 22일째에 투여된다. 또다른 구체예에서, 투여 계획은 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량과 조합하여 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량의 투여를 포함하고, 여기서 조합은 치료 기간 내 주중 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 6일째, 및 7일째에 투여된다. 추가의 구체예는 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량이 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량과 조합하여 투여되는 투여 계획(여기서, 조합은 치료 기간 내 주중 1일째, 3일째, 5일째, 및 7일째에 투여됨); 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량과 조합하여 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량의 투여를 포함하는 투여 계획(여기서, 항체의 조합은 치료 기간 내 주중 1일째 및 3일째에 투여됨); 및 치료 기간 내 임의의 제시된 주중 1일째에, 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)와 조합하여 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 치료적으로 유효한 투여량의 투여를 포함하는 바람직한 투여 계획을 포함한다. 치료 기간은 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월, 6개월, 또는 1년을 포함할 수 있다. 치료 기간은 서로 1일, 1주, 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 또는 1년이 지나 후속되거나 분리될 수 있다. 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 및 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 조합을 사용하여 치료하는 것은, 치료가 치료 동안 어느 시점에 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 및 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)의 조합을 포함하는 한, 항체 동시에 또는 일시에 항체 하나 또는 양자를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 병용 요법의 효과는 또한 항-CD20 항체 및/또는 항-CD19 항체 치료의 투여 타이밍을 변화시킴으로써 최적화될 수 있다. 항-CD19 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 항-CD20 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 치료하는 것은 동시에(일시에), 연속하여(순차적으로), 또는 이의 조합일 수 있다. 따라서, 조합 항체 치료를 받는 피험체는 동일한 시기에(예, 동시에) 또는 여러 시기에(예, 같은 날에 또는 다른 날에, 순차적으로, 순서대로) 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 및 항-CD19 (또는 이의 항원-결합 단편)를 모두 수용할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙(또는 이의 항원-결합 단편)은 항-CD19 항체, 예컨대 16C4 (또는 이의 항원-결합 단편)와 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙(또는 이의 항원-결합 단편)이 우선 투여되고 이후 항-CD19 항체, 예컨대 16C4 (또는 이의 항원-결합 단편)가 다음으로 투여된다. 다른 구체에에서, 항-CD19 항체, 예컨대 16C4 (또는 이의 항원-결합 단편)가 우선 투여되고, 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙(또는 이의 항원-결합 단편)이 다음으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항-CD20 항체 및 항-CD19 항체, 예컨대 리툭시맙 및 16C4의 조합은 1회 투여에 대해 일시에 제공되지만, 나머지 투여는 같은 날에 또는 다른 날에 순서대로 순차적 투여를 포함한다. 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙 및 항-CD19 항체, 예컨대 16C4가 동시에 투여되는 경우, 이는 각각 항-CD20 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 또는 항-CD19 항체 (또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 별도의 약학 조성물로서 투여될 수 있거나, 또는 상기 항암제 모두를 포함하는 단일 약학 조성물로서 투여될 수 있다.

실시예

본 발명은 이하 일반적으로 기술되며, 본 개시 내용의 구체예 및 특정 구체예를 단지 예시의 목적으로 포함하고, 본 발명을 한정하려는 것이 아닌 하기 실시예를 참고하여 더욱 쉽게 이해할 것이다.

실시예 1: 항-CD19 mAb 16C4-afuc는 다중 B 백혈병 및 림프종 세포주에 대해 강력한 시험관내 ADCC 활성을 가짐

16C4-afuc는 마우스 IgG1 mAb HB12B의 인간화 및 친화성 돌연변이에 의해 발생된 mAb 16C4의 어푸코실화된 형태이다. (Kansas GS and Tedder TF. J Immunol, 1991; 147:4094-4102; Yazawa et al., Proc Natl Acad Sci, 2005; 102(42):15178-15183; Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010, 335(1):213-222). 푸코실화된 16C4 mAb와 비교하였을 때, 16C4-afuc는 활성화된 인간 FcγRIIIA 및 마우스 FcγRIV에 대해 ∼9배 증가된 친화성 및 강화된 ADCC 효과기 기능을 갖는다. 리툭시맙과 대조적으로, 16C4는 CDC를 매개하지 않는다. (Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010, 335(1):213-222).

B 백혈병 및 림프종 세포주의 대형 패널에서 16C4-afuc의 ADCC 활성을 푸코실화된 전구체, mAb 16C4와 비교하였다. CD20 mAb 리툭시맙은 양성 대조군으로서 모든 검정 내에 포함되었다. 모든 테스트된 세포주에 있어서, 16C4-afuc는 모 mAb 항-CD19 mAb보다 ADCC 매개에 더욱 유의적으로 강력하였다(도 1A∼1E). 15개의 악성 B 세포주의 전체 패널에 대해 리툭시맙에 의해 16C4-afuc의 활성을 비교하였을 때, 3개의 상이한 활성 프로파일이 관찰되었다: 하나, 16C4-afuc 및 리툭시맙이 대략 동등한 힘을 가지고, 중간 정도의 양에서 많은 양의 CD19(표 1)를 발현하는 Karpas-1106P 세포(도 1A)로 예시되는 세포주; 둘, 리툭시맙이 16C4-afuc, 예컨대 CLL 세포주 JVM2(도 1B)보다 더욱 효과적인 세포주; 셋, Oci-LY19 세포(도 1C) 및 Daudi 세포(도 1D 및 표 1)에서와 같이, 16C4-afuc가 리툭시맙보다 더욱 효과적인 세포주.

세포주는 또한 CD19 및 CD20의 상대적 발현에 대해 분석하여 2개의 항원의 표면 수준이 각각 CD19 및 CD20 mAb에 대한 시험관내 민감성을 확인하는지 여부를 측정하였다(표 1). 도 1B에서, 16C4-afuc 및 리툭시맙에 의해 관찰된 ADCC 활성(세포독성의 최대 백분율, CD19 mAb의 경우 도 1E 및 CD20 mAb의 경우 도 1F; EC₅₀ 값, CD19 mAb의 경우 도 1G 및 CD20 mAb의 경우 도 1H)은 검출용 기본 항체로서 mAb 16C4 및 리툭시맙을 이용하는 유동 세포분석법에 의해 측정된 바와 같이 CD19 및 CD20의 상대적 표면 발현에 대해 플롯팅한다. 특정 세포주의 경우 항-CD19 및 항-CD20 mAb에 대한 민감성은 상대적 항원 발현에 대응하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, Oci-LY19 세포는 낮은 수준의 CD20을 갖지만 CD19의 높은 발현을 갖고 유일하게 16C4 치료에 반응한다(표 1). 역으로는 높은 수준에서 CD20을 발현하고 16C4-afuc에 의해서가 아니라 리툭시맙에 의해 효율적으로 사망시키는 Granta-519 세포에 대해 관찰하였다. 하지만, 모든 세포주에 걸친 비교는 mAb에 의해 매개된 ADCC에 대한 민감성을 갖는 항원 발현의 유효한 상관관계를 제시하지 않았다. 이러한 상관관계의 결핍은 CD19 및 CD20 양자의 낮은 수준을 발현하고, 리툭시맙에 의해서가 아니라 16C4-afuc에 의해 효율적으로 사망시키는 Karpas-422 세포에 의해 예시된다.

동시에, 결과는 16C4-afuc가 다중 세포주에 대해 강력한 시험관내 ADCC 활성을 갖는 것을 입증한다. 테스트된 15개의 세포주 중 11개에 의해, 16C4-afuc의 ADCC 활성은 CD20 mAb에 대해 유리하게 비교되었다. 하지만, 악성 B 세포주의 이러한 다양한 세트에서는, CD19 또는 CD20 mAb 매개된 ADCC에 대한 민감성을 갖는 항원 발현의 유효한 상관관계가 없었다.

실시예 2: 16C4-afuc는 환자 유래 시험관내 CLL 및 ALL 세포에 대해 유효함

B 세포주에 대해 16C4-afuc의 활성이 주어지면, 기본 백혈병 세포에 대한 CD19 mAb의 효과 또한 조사되었다. CLL로 진단된 환자로부터 6개의 PBMC 샘플을 얻었고 CD19 및 CD20에 대한 표면 항원 밀도를 측정하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 상기 샘플 내 B 세포는 다양한 정도로 CD19 및 CD20을 발현하였다. 상기 샘플의 일부에서 CD20 항원 부위의 수는 CD19 부위의 수보다 많았다. 시험관내 FACS계 세포독성 검정은, 리툭시맙을 양성 대조군으로 하여, CLL 샘플에서 B 세포를 사망시키는 16C4-afuc의 능력을 평가하는 데 사용되었다. 도 2B∼2D는 3개의 대표 CLL 샘플(CLL#106, 도 2B; CLL #104, 도 2C; CLL #107, 도 2D)에 대해 16C4-afuc 및 리툭시맙에 의한 ADCC 검정으로부터의 결과를 도시한다. 16C4-afuc의 EC₅₀ 값은 0.007 nM∼0.063 nM의 범위이다. 대조적으로, 리툭시맙의 EC₅₀ 값은 0.639 nM∼0.682 nM의 범위이다. 16C4-afuc 및 리툭시맙에 의해 매개된 ADCC에 대한 CLL 세포의 민감성은 각각 CD19 및 CD20의 표면 발현(각각 도 2E 및 2F)으로 비교하였다. 이러한 분석으로부터의 결과는 CD19 및 CD20 양자에 대한 항원 밀도가 증가할수록 더욱 효율적인 세포사에 대한 명확한 추세를 제시한다. 이러한 기본 CLL 샘플에 의한 결과는 또한 16C4-afuc가 비교적 낮은 수준의 표면 항원 발현으로 시험관내 고갈을 매개하는 데 있어서 리툭시맙보다 더 효과적이라는 것이 제시된다.

16C4-afuc의 활성은 또한 ALL을 앓는 4명의 환자로부터의 PBMC 샘플에 의해 FACS계 ADCC 검정으로 테스트하였다. 이러한 검정 중 3의 경우, 4명의 건강한 공여자로부터의 b 세포와 비교하였을 때 CD19 및 CD20에 대한 항원 밀도를 측정하기에 충분한 세포 수가 있었다(도 3A). 정상 말초 혈액 B 세포의 경우, CD19 및 CD20의 평균 밀도는 각각 세포 당 ∼20,000 및 ∼200,000 항원 부위가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 정상 B 세포와 비교하였을 때, CD19 발현은 다소 둘로 나눈 것보다 덜하고 제3 ALL 샘플의 약 2배로 증가하였다(도 3A). 하지만, 항원 부위의 수는 더욱 광범위하게 다양해졌다. ALL을 앓는 공여자로부터의 샘플에 대한 ADCC B 세포 고갈 검정(도 3B∼3E)에 있어서, 16C4-afuc의 EC₅₀ 값은 0.002 nM∼0.131 nM 범위였다. 이러한 값은 리툭시맙에 의해 얻은 EC₅₀ 값의 1/6 내지 1/100 미만이었다.

동시에, 결과는 CLL 및 ALL을 앓는 환자로부터의 기본 백혈병 세포에 대해 ADCC를 효과적으로 매개한다는 것을 제시한다. 이러한 시험관내 검정에서, CD19 mAb는 CD20 mAb 리툭시맙보다 더 효과적이었다. 이는 또한 CD20 발현 수준이 CD19의 세포 표면의 수준보다 유의적으로 더 높은 샘플의 경우였다.

선행 실험으로부터의 결과는 하기 표 1에 요약한다:

실시예 3: 16C4-afuc는 Fc-의존성 기전에 의한 SCID-림프종 모델에서의 종양 성장을 억제함

다음으로, 생체내 종양 성장을 억제하는 16C4-afuc의 능력을 테스트하였다. 16C4의 항종양 효능은 SCID 마우스에서 성장한 다중 인간 CD19+ 림프종 이종이식으로 평가하였다.

CD19에 대한 전부는 아니지만 일부의 mAb는 항-증식성 활성을 갖는다. (Ghetie et al., Blood, 1994; 83(5):1329-1336). 앞서, mAb 16C4는 형질전환된 B 세포주뿐만 아니라 건강한 공여자로부터의 기본 B 세포의 증식도 억제하는 것으로 확인되었다. (Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010 , 335(1):213-222). 항종양 효과에 대한 ADCC의 기여를 확인하기 위해, 16C4-afuc의 효능은 mAb 16C4-TM, 즉 Fc-매개 효과기 기능의 제거로 조작된 CD19 mAb 형태와 비교하였다. (Oganesyan et al., Acta Cryst, 2008 ; D64:700-704). 항체는 피하 세포 이식 후 7일째에 개시된 2.5 mg/kg가 매주 투여된 Daudi 및 Raji SCID-림프종 이종이식 모델 모두에서 평가하였다. 항체 양자는 어푸코실화된 항-CD19 mAb가 효과기-불포함 돌연변이체 mAb 16C4-TM보다 더 효과적이었지만 종양 성장에 있어 감소를 유도하였다(도 4). 33일째(이소타입 대조군-치료된 군이 종양 크기로 인해 종료되어야하는 경우의 시간)의 Raji 모델에 있어, 16C4-afuc는 종양 성장을 84%로 억제하였고 16C4-TM은 종양 성장을 46%로 억제하였다(도4B). Daudi 모델 33일째에, 16C4-afuc는 종양 성장을 88%로 억제하였고 mAb 16C4-TM은 종양 성장을 39%로 억제하였다(도 4A). 이러한 결과는 Fc-의존성 효과기 기능이 생체내 종양 성장의 효과적인 억제에 필요하다는 것을 입증한다. 이 결과는 또한 CD19 mAb가 mAb의 항-증식성 활성의 결과일 것 같은 효과기 기능의 부재 하에 종양 성장을 (비록 훨씬 더 낮은 정도이지만) 서행시킬 수 있다는 것을 제시한다.

실시예 4: 16C4-afuc는 인간 B 세포 림프종의 다중 SCID 마우스 모델에서 종양 성장을 억제함

마우스 모델의 종양 성장을 억제하는 데 필요한 16C4-afuc의 투여량을 확인하였다. SCID/Raji 피하 이종이식 모델에서 mAb 투여량의 범위 및 투여 일정을 테스트하였다. mAb 투여 범위는 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg 16C4-afuc를 포함하였다. 투여 일정 변형은 1회, 3회, 및 5회 투여량을 포함하고, 제1 투여는 세포 이식 후 5일째에 제공되었다(도 5). 전반적으로, 16C4-afuc의 생체내 효능은 투여량 및 일정 의존적이었다. 여기에 제시된 모델에서, 5회 투여량의 16C4-afuc(도 5B)는 3회 투여량(도 5A)보다 더 강한 항종양 활성을 유도하였다. 하지만, 3 mg/kg에 의한 치료가 10 mg/kg에 의한 치료와 유사한 효능을 실현하였다. 후속 연구의 경우, 3 mg/kg의 투여를 사용하였고, 총 5회 투여에 대해 매주 2회 제공하였다.

이러한 투여량을 사용하여, 다중 피하 SCID 림프종 이종이식 모델에서 16C4-afuc의 효능은 기준 시점 및 양성 대조군으로서의 리툭시맙에 의해 평가하였다. 도 6에는 Namalwa(도 6A), Daudi(도 6B), 및 Toledo 세포(도 6C)를 갖는 종양 모델로부터의 결과가 도시된다. 이러한 모델에서 16C4는 대조군에서 얻은 결과와 비교하였을 때 종양 성장을 각각 82%, 91%, 및 88%로 억제하였다. Namalwa 종양은 리툭시맙 치료에 저조하게 반응한 반면, Daudi 이종이식은 16C4-afuc보다 CD20 mAb와 다소 더 양호하게 성장을 억제하였다. Toledo 종양 모델에서 2개의 mAb는 유사한 효능을 제시하였다.

16C4-afuc의 항종양 효능은 기본 종점으로서 생존 기간 또는 마비까지의 기간에 의해 IV 파종성 종양 모델 내 Namalwa 및 Daudi 세포 이종이식으로 추가 테스트하였다. Namalwa(도 6E) 및 Daudi(도 6D) 모델에서 16C4-afuc의 투여는 대조군에서 관찰된 생존율과 비교하였을 때 각각 50% 및 43%로 생존율이 증가하였다. 피하 림프종 모델에서와 같이, 리툭시맙은 Namalwa 세포를 가진 전신 질병 모델에서 단지 적은 효과만을 가졌다. 또한 Daudi 모델의 경우에도 mAb 16C4-afuc 및 리툭시맙에서 관찰된 상대 효능은 피하 모델에서 관찰된 결과를 반복하였다. 이 결과는 16C4-afuc가 피하 및 전신 모델 양자의 B 세포 림프종의 다중 모델에서 종양 성장을 억제한다는 것을 제시한다.

실시예 5: 16C4-afuc와 리툭시맙의 조합은 장기간의 종양 성장 억제를 유도함

CD19 및 CD20 mAb와 악성 B 세포의 조합된 표적에 의해 매개되는 종양 성장 억제는 mAb 단독에 의한 표적으로부터 유도되는 종양 성장 억제와 유사하였다. 4가지의 상이한 피하 SCID 림프종/백혈병 모델(Raji, Daudi, Oci-LY19, Ramos, SUP-B15)을 16C4-afuc 및 리툭시맙 단독으로 또는 조합으로 치료하였다. 이러한 실험에서, 리툭시맙은 총 5회 투여량에 대한 3 mg/kg으로 16C4-afuc와 동일한 일정 및 농도에 따라 투여되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 3 mg/kg 내지 10 mg/kg의 16C4-afuc 투여량 증가는 SCID/Raji 림프종 모델에서 종양 성장을 크게 억제하지 못했다. 하지만, 16C4-afuc와 리툭시맙의 조합은 Raji 종양 성장을 장기간 억제하였다(도 7A). 피하 Daudi 림프종 모델에서도 유사한 결과가 얻어졌고(도 7C), 여기서 2개의 mAb의 조합은 피하 림프종을 더욱 많이 그리고 장기간 억제하였다. mAb 조합의 효과는 Oci-LY19 피하 이종이식 모델에서 덜 두드러졌는데(도 7B), 이는 이들 모델에서 리툭시맙의 낮은 활성의 결과일 수 있다. 하지만, CD19 mAb는 우수한 효능을 제시하였고, CD19 mAb와 리툭시맙의 조합은 더 많은 종양 억제를 유도하였다. 유사하게, mAb 조합의 효과는 Ramos 이종이식 모델에서 덜 두드러졌는데(도 7D), 이는 이들 모델에서 16C4-afuc의 비교적 낮은 활성의 결과일 수 있다. 하지만, Oci-LY19 모델에서와 같이, CD19 mAb와 리툭시맙의 조합은 이들 모델에서 더 많은 종양 억제를 유도하였다. mAb 16C4-afuc 및 리툭시맙은 또한 SUP-B15 ALL 세포를 갖는 피하 모델에서 단독으로 그리고 조합하여 테스트하였다(도 7E). 16C4-afuc와 리툭시맙의 조합은 단일 제제보다 더욱 두드러진 종양 성장 억제를 실시하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 전신 Daudi 종양 모델에서 CD19/CD20 mAb 병용 요법을 테스틀하였다. 피하 모델로부터의 결과와 유사하게, 병용 요법은 단일 mAb-치료된 대조군에 비해 증가된 생존율(93.5%)을 유도하는 더 높은 항종양 효능을 제시하였다(데이타 미제시). 이 결과는 CD19 mAb 16C4-afuc와 CD20 mAb 리툭시맙의 조합이 인간 B 세포 림프종의 임상전 모델에서 mAb 단독보다 더 높은 효능을 갖는다 것을 입증한다.

실시예 6: huCD19/CD20 이중 형질전환된 마우스에서 병용 요법의 약동학 및 약력학

huCD19 형질전환된 마우스와 huCD20 형질전환된 마우스를 이종 교배시켜 이중 형질전환된 동물을 발생시켰다. 양 계통은 사전에 잘 특성화되었고, B 세포 한정된 방식으로 형질전환 유전자를 발현하였으며, 각각 CD19 및 CD20 mAb에 의한 B세포 고갈을 연구하는 데 성공적으로 사용되었다. (Zhou et al., 1994, Mol Cell Biol 14:3884-3894; Ahuja et al, 2007, J Immunol 179:3351-3361; Yazawa et al, 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102:15178-15183).

16C4-afuc의 수준은 리툭시맙 또는 대조군의 샘플을 투여한 후, 대략 36시간 후 16C4-afuc를 첨가하는 투여 계획 후 CD19/CD20 형질전환된 마우스에서 측정하였다. 마우스 혈액 내 16C4-afuc의 수준을 1680 시간까지의 시점에서 측정하였다. 4회의 별도 투여를 고려하였다: 16C4-afuc(1 mg/kg) + 대조군(예, 리툭시맙 불포함); 16C4-afuc(10mg/kg) + 대조군; 16C4-afuc(1mg/kg) + 리툭시맙(10 mg/kg); 16C4-afuc(10mg/kg) + 리툭시맙(10 mg/kg). 도 8A에는 실험의 약동학적 결과가 도시된다. 단독으로 투여되든 또는 리툭시맙과 함께 투여되든, 더 높은 투여량의 16C4-afuc(10mg/kg)가 더 낮은 투여량의 16C4-afuc(1mg/kg)보다 혈액 내에서 더 오래 유지되었다.

실시예 7: huCD19/CD20 형질전환된 마우스 내 B 세포 고갈

병용 요법에 의해 매개되는 생체내 B 세포 고갈의 정도는 리툭시맙 단독의 효과와 유사하였다(도 8B). 이중 형질전환된 huCD19/CD20 마우스는 다음 중 하나의 투여량을 수용하였다: (i) 리툭시맙(10mg/kg), (ii) 16C4-afuc(1 mg/kg); (iii) 16C4-afuc(10 mg/kg); (iv) 리툭시맙(10 mg/kg) + 16C4-afuc(1 mg/kg); (v) 리툭시맙(10 mg/kg) + 16C4-afuc(10 mg/kg). 혈액 및 비장 B 세포 수를 유지하는 것은 다양한 투여량을 투여한 후 간격을 두고 유동 세포분석법에 의해 확인되었다.

도 9에는 리툭시맙(10 mg/kg) + 16C4-afuc(10 mg/kg)에 의한 가장 높은 투여량의 병용 요법이 가장 긴 기간 동안 혈액 및 비장으로부터 B 세포 고갈의 가장 높은 백분율을 유도하는 것이 도시된다. 특히, B 세포 고갈은 16C4-afuc(1 mg/kg)의 투여량이 첨가된 후 대략 384시간 (또는 16일)째에 가파르게 떨어진다. 리툭시맙(10 mg/kg) 또는 리툭시맙(10 mg/kg) + 16C4-afuc(1 mg/kg)이 첨가된 후, B 세포 고갈의 백분율이 후자 투여량의 투여 후 증가하는 것으로 여겨지더라도, 대략 840 시간 (또는 35일)째에 B 세포 고갈의 유사한 하락이 관찰된다. 더 높은 투여량의 16C4-afuc(10 mg/kg)가 첨가된 경우, B 세포 고갈의 효과는 (단일하게 투여되든 또는 조합하여 투여되든) 더 낮은 투여량의 16C4-afuc에 비해 그리고 리툭시맙(10 mg/kg) 단독에 비해 장기적이다. 하지만, 리툭시맙(10 mg/kg) + 16C4-afuc(10 mg/kg)의 병용 요법에서 가장 강하고 가장 오래 지속되는 효과가 관찰된다.

재료 및 방법

세포 및 시약

미국모식균배양수집소(ATCC, 미국 버지니아주 머네서스 소재)로부터 인간 B 백혈병 및 림프종 세포주, Raji, Daudi, Ramos, Namalwa, Toledo, Farage, 및 RL을 얻었다. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, 독일 브라운슈바이크 소재)으로부터 세포주 OCI-LY-19, Granta-519, Karpas-422, Nalm-6, Karpas-1106P, DB, JVM-2, JVM-13 및 MEC2를 얻었다. BioWa Inc.(미국 뉴저지주 프린스턴 소재)로부터 (인간 CD16을 발현하는) KC1333 NK 세포주를 얻었다. 모든 세포주를 RPMI-1640 배지(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 유지하였고 10% 우태 혈청(FBS)으로 보충하였다. 고지에 입각한 동의를 얻은 후 건강한 공여자로부터 혈액 샘플을 얻었다. CLL 또는 ALL로 진단된 환자로부터의 냉동된 피콜-하이파크(ficoll-hypaque) 정제된 PBMC 샘플을 Cureline, Inc로부터 얻었다. 인간화, 친화성 최적화된 그리고 어푸코실화된 CD19 mAb 16C4-afuc, mAb 16C4 (푸코실화된 16C4), 인간 IgG1 이소타입 대조군 mAb R347, 및 mAb 16C4-TM은 MedImmune Antibody Engineering Group에 의해 제공되었다. 16C4-TM mAb Fc는 효과기 기능이 제거되도록 조작된다. (Oganesyan et al., Acta Cryst, 2008 ; D64:700-704). 시험관내 및 생체내 검정에서 CD20 mAb 리툭시맙(Biogen Idec, Inc; 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)을 양성 대조군으로 사용하였다.

ADCC 효과기 기능이 강화된 CD19 mAb를 발생시키기 위해, 인간 CD19를 인식하는 마우스 IgG1 mAb HB12b(Kansas and Tedder, J Immunol, 1991; 147:4094-4102)를 인간화 및 친화성 최적화시키고, mAb 16C4를 유도하였다. 균일하게 어푸코실화된 항체를 발생시키기 위해, 인간화 IgG1 mAb 16C4를 푸코실전이효소-결핍 생산자 CHO 세포주(BioWa Potelligent® Technology, BioWa Inc.; 미국 뉴저지주 프린스턴 소재)에서 발현시켜 16C4-afuc를 발생시켰다.

B 세포주 상의 항원 발현 확인

B 세포주 상의 CD19 및 CD20 발현의 수준은 기본 항체 후 형광-라벨링된 염소 항-인간 mAb로서 각각 mAb 16C4 또는 리툭시맙을 사용하여 확인되었다. 직접 결합 검정의 경우, B 세포를 PBS로 세척하고 FACS 완충제(2% FBS 함유 PBS) 중에 재현탁시켰다. 세포를 미라벨링된 mAb의 희석물과 함께 20분간 아이스 상에서 항온처리하고, 세척하고 2차 mAb를 함유한 PBS 중에 재현탁시켰다. 아이스 상에서 20분 후, 세포를 세척하고, FACS 완충제 중에 재현탁시키고 유동 세포분석법에 의해 세포 표면 상의 형광 강도를 분석하였다. 모든 세포주의 경우, 1 μg/㎖의 농도에서 mAb 16C4 및 리툭시맙의 최대 결합을 실현하였다. 표 1에서 중간 형광 강도(MFI)로서 상대 항원 발현을 보고하였다.

정상 및 악성 B 세포 상의 항원 밀도의 확인

CLL 또는 ALL을 앓는 공여자로부터의 냉동 PBMC 및 건강한 성인 공여자로부터의 PBMC 샘플 유래의 B 세포 상의 CD19 및 CD20 항원 밀도를, 기본 항체로서 항-CD19 클론 HD37 및 항-CD20 클론 2H7에 의해 제조자의 지시에 따라 QIFIKIT^®(Dako, 덴마크 글로스트립(Glostrp) 소재)를 사용하여 유동 세포분석법으로 확인하였다.

항체-의존성 세포 매개성 세포독성 검정

2.5:1의 E:T 비율에서 표적(T) 및 NK 효과기(E) 세포로 B 백혈병/림프종 세포주에 ADCC 검정을 수행하였다. mAb의 계열 희석하여 4시간 동안 세포를 항온처리하고 제조자의 지시에 따라 수행되는 CytoTox 96® 비-방사선활성 세포독성 검정(Promega Corp., 미국 위스콘신주 메디슨 소재)을 사용하여 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출을 검출함으로써 표적 세포 용해를 측정하였다. 모둔 검정은 3회 반복하여 실시하였다.

CLL 또는 ALL로 진단된 공여자로부터의 정제된 PBMC를 사용하여 시험관내 ADCC 활성을 정량하는 데 다중 매개변수 유동 세포분석법을 사용하였다. 모든 샘플의 림프구 함량은 90%보다 많았다. 건강한 공여자로부터의 PBMC 샘플과 비교하였을 때, CLL 또는 ALL을 앓는 공여자로부터의 대부분의 샘플은 낮은 농도의 CD56+ NK 세포를 가졌다. 따라서, CLL 및 ALL PBMC 샘플은 KC1333 NK 세포로 보충되었다. 냉동 PBMc(CLL 또는 ALL) 샘플을 37℃ 수조에서 해동시키고, 세척하고, (10% 열 불활성화된 FBS 및 2 mM L-글루타민으로 보충된) RPMI 1640 중에 재현탁시키고, 200 ㎕의 총 부피에서 Nunc U96-웰 둥근 바닥 마이크로웰 플레이트(ThermoFisher Scientific, 미국 뉴욕주 로체스터 소재) 중에 5×10⁴ 세포/웰로 플레이팅하였다. KC1333 NK 효과기 세포(25×10⁴)를 첨가하여 5:1의 E:T 비율을 실현하였다. 리툭시맙, 16C4-afuc의 계열 희석, 또는 어푸코실화된 이소타입 대조군 mAb R347의 계열 희석을 10 ㎕ 분액으로 웰에 첨가하고(3회 반복), PBMC를 5% CO₂와 37℃에서 20시간 동안 항온처리하였다. 항-CD19 피코에리트린-Cy7(PE-Cy7), 항-CD20 퍼시픽 블루, 항-CD22 알로피코시아닌(APC) 또는 항-CD22 피코에리트린(PE), 및 항-FcεR1α 플루오세인 이소티오시아네이트(FITC)를 함유하는 형광-라벨링된 항체의 칵테일에서 세포를 염색함으로써 세포독성의 백분율을 측정하였다. 계수 표준으로서, CountBright Absolute Counting Beads(Invitrogen, LifeTechnologies Corp., 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 첨가하여 세포 서브셋의 세포 농도를 확인하였다. LSR II 유동 세포분석기 상에서 샘플을 얻었다. 형광 활성된 세포 분류(FACS) 데이타는 FlowJo(FlowJo, 미국 오리건주 아쉬랜드 소재) 소프트웨어, 버젼 7.2.2에 의해 확인되었다. IgG1 어푸코실화된 mAb, R347-aFuc를 비-고갈 치료 대조군으로서 사용하고 게이트를 한정하는 데 사용하였다. 각 샘플 내 완벽한 계수 비드의 수가 정량화되었다. 총 CD22+ 또는 CD20+CD22+ 게이트에서 B 세포의 생존 수는 제조자의 지시에 따라 표준 계수 비드를 사용하여 세포 농도로 전환시켰다. B 세포 고갈(백분율 세포독성)을 하기 식에 따라 계산하였다.

리툭시맙의 경우:

%세포독성 = {1 - [CD22+_{리툭시맙 -처리된} 세포/㎖] ÷ [CD19+CD22+_{대조군-처리된} 세포/㎖]} × 100.

16C4-afuc의 경우:

%세포독성 = {1 - [CD20+CD22+_{16 C4} 세포/㎖] ÷ [CD20+CD22+_{대조군-처리된} 세포/㎖]} × 100.

GraphPad Prism v5.01에서 4개의-가변 곡선 피트 방정식을 사용하여 B 세포 세포독성의 절반의 최대 효율 농도(EC₅₀)를 계산하였다(GraphPad Software, Inc, 캘리포니아주 라졸라 소재).

SCID 마우스 림프종 모델

중증 복합형 면역 부전증(SCID)-림프종 이종이식 모델로부터 생체내 종양 성장의 억제를 연구하였다. 4주 내지 6주령 암컷 CB17-SCID 마우스를 Taconic Farms(미국 뉴욕주 저먼타운 소재)에서 사육하였고 MedImmune의 실험 동물 자원 시설에서 유지하였다. 모든 마우스 실험은 IACUC 승인된 프로토콜에 따라 실시하였다. 연구는 국소화 및 파종성 SCID-림프종 이종이식 모델 모두를 사용하여 수행하였다. 국소 피하(s.c.) 이종이식 마우스 모델의 경우, 마우스(10 코호트)에 0일째에 5×10⁶ 종양 세포를 접종하였다. 지적한 바와 같이, 복강내(i.p.) 주사에 의해 5일 또는 7일째에 마우스를 mAbs 또는 비히클로 치료하였다. 피하 모델의 경우, 종양 부피를 경시적으로 모니터링하였다. 파종성 SCID 마우스 모델의 경우, 1×10⁶ 내지 5×10⁶ 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내(i.v.) 주사하였다. 종양 세포 주사 후 7일째에, 코호트(각 10마리의 마우스)를 체중 1 kg 당 3 mg에서 mAbs의 5회 투여량으로 치료하였고, 하나의 투여량은 매 4일마다 투여되었다. 파종성 종양 모델에서, 생존 기간 또는 마비까지의 기간, 사망에 앞선 임상 증상을 종점으로서 사용하였다.

약동학적/ 약력학 연구

마우스 혈청 내 16C4 및 리툭시맙을 평가하는 데 MSD 전기화학발광(ECL) 면역검정 방법을 사용하였다. 16C4-afuc는 MA6000 MSD 마이크로역가판으로 코팅된 가용성 재조합 마우스 항-유전자형 항체(D9)에 의해 포획되었다. 임의의 결합된 16C4는 이후 바이오틴화 당나귀 항-인간 IgG Fc 감마 특이적 항체 후 설포-TAG 스트렙타비딘을 사용하여 검출되었다. 이를 MSD 판독 완충제와 반응시키고 ECL 신호를 생성 및 측정하기 위해 MSD Sector™ Imager 모델 6000 판독기 상에 플레이트를 배치하였다. 16C4의 농도에 대해 ECL 계수와 관련된 4-매개변수 곡선 피트를 사용하여 표준 곡선으로부터 내삽법에 의해 샘플 내 16C4-afuc 농도를 확인하였다.

유동 세포분석법 huCD19 / CD20 형질전환된 마우스에 의한 B 세포 수의 분석

모든 마우스 실험은 IACUC 승인된 프로토콜에 따라 MedImmune 동물 시설의 무병균 환경에서 수행되었다. CD19 및 CD20 mAb에 의한 B 세포의 생체내 고갈은 huCD19/CD20 이중 형질전환된 마우스에서 평가되었고, 이 마우스는 huCD19 형질전환된 마우스와 huCD20 형질전환된 마우스를 이종 교배시킴으로써 발생하였다(Zhou et al, 1994, Mol Cell Biol 14:3884-3894; Ahuja et al, 2007, J Immunol 179:3351-3361). 수컷(n=105) 및 암컷(n=105) 형질전환된 마우스(9∼12주령; 시점/그룹 당 수컷 2마리 및 암컷 2마리)를 PBS, 16C4-afuc, 및/또는 리툭시맙의 꼬리 정맥 주사를 수용한 6 그룹으로 무작위 추출하였다. 유동 세포분석법을 사용하여 추가의 분석을 하기 위해 소정의 시점에 오비탈 부비강(orbital sinus)으로부터 전혈을 수집하였다. PerCP-Cy5.5 접합된 B220(CD45R) 및 PE 접합된 muCD19로 염색시킴으로써 각 샘플에서 B 세포 수를 확인하였다. 또한, 퍼시픽 블루 접합된 huCD20 및 APC-Cy7 접합된 huCD19 항체의 결합에 대해 B220 + muCD19 + B 세포를 테스트하였다. 마지막으로, T 세포를 FITC 접합된 CD3 항체로 염색하였다. BD LSRII 유동 세포분석기 상에서 샘플을 구동시키고 FlowJo에 의해 데이타를 분석하였다.

참고 인용

본원에 언급된 모든 공개 및 특허는 각 개별 공개 또는 특허가 참고 인용되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 나타내었다면 그 전문이 본원에 참고 인용된다. 충돌의 경우, 본원의 임의의 정의를 포함한 본 명세서는 제한될 것이다.

등가물

본 발명의 특정 구체예가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이며 제한되는 것이 아니다. 본 개시 내용의 다양한 변형예는 하기 본 명세서 및 하기 청구범위의 검토시 당업자에게 자명할 것이다. 본 개시 내용의 전체 범위는 전체 범위의 등가물과 함께 청구범위, 및 변형예와 함께 명세서를 참고인용하여 확인되어야 한다.

16 C4 항체의 서열

SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE, LLC <120> COMBINATION THERAPY FOR B CELL LYMPHOMAS <130> MED0597.PCT <140> PCT/US2011/060520 <141> 2011-11-14 <150> 61/413,771 <151> 2010-11-15 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr 1 5

Claims (34)

1. B 세포 림프종의 치료가 필요한 환자에게 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체를 포함하는 병용 요법으로 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종의 치료 방법으로서, 상기 병용 요법은 유사한 투여 일정 하에 단독으로 투여되는 상기 항-CD19 항체 또는 상기 항-CD20 항체보다 더욱 긴 기간 동안 항종양 활성을 제공하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 B 세포 림프종은 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 비호지킨 림프종(NHL)에서 선택하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 병용 요법은 상승적 치료 효과를 제공하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 항-CD19 및 항-CD20 항체는 동시에 투여되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 항-CD19 및 항-CD20 항체는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 항종양 활성은 종양 성장의 억제인 방법.
7. 제1항에 있어서, 항종양 활성은 악성 B 세포의 고갈(depletion)인 방법.
8. 제1항에 있어서, 병용 요법은 유사한 투여 일정 하에 단독으로 투여되는 상기 항-CD19 항체 또는 상기 항-CD20 항체보다 1개월 이상 더 오래 항종양 활성을 부여하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 병용 요법은 유사한 투여 일정 하에 단독으로 투여되는 상기 항-CD19 항체 또는 상기 항-CD20 항체보다 6개월 이상 더 오래 항종양 활성을 부여하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 병용 요법은 6개월 이상 동안 항종양 활성을 부여하는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 환자의 종양 부피는 병용 요법에 의한 치료 6개월 동안 10% 미만 증가하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 시험관내 측정될 때 강화된 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC)을 갖는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 어푸코실화된(afucosylated) 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인 방법.
15. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 항-CD20 항체는 리툭시맙인 방법.
20. B 세포 림프종의 치료가 필요한 환자에게 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체를 포함하는 병용 요법으로 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 림프종의 치료 방법으로서, 상기 병용 요법의 투여량은 병용 요법의 투여량보다 2배 이상 더 많은 상기 항-CD19 항체의 투여량보다 더 높은 항종양 활성을 갖는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 B 세포 림프종은 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 비호지킨 림프종(NHL)에서 선택하는 것인 방법.
22. 제20항에 있어서, 병용 요법은 상승적 치료 효과를 제공하는 것인 방법.
23. 제20항에 있어서, 항-CD19 및 항-CD20 항체는 동시에 투여되는 것인 방법.
24. 제20항에 있어서, 항-CD19 및 항-CD20 항체는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
25. 제20항에 있어서, 항종양 활성은 종양 성장의 억제인 방법.
26. 제20항에 있어서, 항종양 활성은 악성 B 세포의 고갈인 방법.
27. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 시험관내 측정될 때 강화된 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC)을 갖는 것인 방법.
28. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 어푸코실화된 것인 방법.
29. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인 방법.
30. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호:6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 방법.
31. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 것인 방법.
32. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인 방법.
33. 제20항에 있어서, 항-CD19 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인 방법.
34. 제20항에 있어서, 항-CD20 항체는 리툭시맙인 방법.

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