MX2013005270A - Terapia combinada para linfomas de limfocitos b. - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona métodos para tratar linfomas de linfocitos B empleando una combinación de anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20. Tales métodos proporcionan ventajas terapéuticas sobre terapias con anticuerpos aislados, incluyendo una actividad antitumoral prolongada y/o dosificaciones reducidas.

Description

TERAPIA COMBINADA PARA LINFOMAS DE LINFOCITOS B ANTECEDENTES DE LA INVENCION La mayoría de las leucemias y los linfornas humanos, que incluyen la leucemia linfoblástica aguda (LLA) , la leucemia linfocítica crónica (LLC) y el linfoma no Hodgkin (LNH) se originan en los linfocitos B. En los últimos años, los enfoques terapéuticos basados en el agotamiento de linfocitos B, dirigiendo anticuerpos monoclonales (AcMos) a dianas de antígenos de superficie restringidos de linfocitos B, han ganado cada vez más atención. En particular, el AcMo anti-CD20 rituximab ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de cánceres de linfocitos B. (Robak et al., Cáncer Treatment Reviews, 2007; 33:710-728). La actividad de rituximab depende en grah medida de la capacidad del AcMo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus¦ siglas en inglés) acoplando receptores Fcy activados en la superficie de células efectoras, tales como macrófagos y células citotóxicas naturales NK. (Desjarlais et al., Drug Discovery Todáy, 2007; 12:898-910). Si bien otros mecanismos, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la inducción directa de la apoptosis, también pueden tener una función, la ADCC parece ser el mecanismo dominante por el cual rituximab media en la eliminación de linfocitos B Ref. 240910 cancerosos, así como normales in vivo. (Edwards et al., Nat. Rev. Immunol, 2006; 6:394-403). La combinación de rituximab con quimioterapia ha dado lugar a mejoras significativas en pacientes con linfoma folicular (LF) y LLC y puede dar como resultado remisiones duraderas. Sin embargo, esta terapia no es eficaz en todas las poblaciones de pacientes. Por lo tanto, todavía existe una gran necesidad de nuevas y mejores opciones de tratamiento.

Un grupo de diferenciación (CD, por sus siglas en inglés) , del antígeno 19 humano es un antígeno de superficie específico de linfocitos B que se expresa en los linfocitos pre-B tempranos, desde el momento del reordenamiento de la cadena pesada. CD19 pertenece a la superfamilia que contiene el dominio de inmunoglobulina de los receptores transmembranales . CD19 se expresa en los linfocitos B a lo largo de su estirpe desde los linfocitos pro-B hasta la etapa de célula plasmática, cuando la expresión de CD19 está regulada por disminución. (Nadler et al., J Immunol 1983; 131:244-250). Como proteína específica de los linfocitos B y componente del complejo de linfocito B-receptor (BCR, por sus siglas en inglés) , CD19 es un regulador positivo de la señalización de los linfocitos B, que modula el umbral para la activación de los linfocitos B y la inmunidad humoral. (Sato et al., Proc iVatl Acad Sci, 1995; 92:11558-62; Sato et al., J Immunol 1997; 158:4662-9). CD19 no se expresa en las células madre hematopoyéticas o en linfocitos B antes de la etapa linfocito pro-B (Nadler et al., J Immuhol 1983 ; 131:244-250; Loken et al., Blood, 1987; 70:1316-1324).

Es importante destacar que la expresión de:. CD19 se mantiene después de una transformación maligna de los linfocitos B, y CD19 se expresa en la mayoría de los cánceres de linfocitos B, incluyendo LLA, LLC y LNH. (Uckun. et al.,' Blood, 1988; 71:13-29; D' Arena et al . , Am J of Hématology, 2000; 64:275-281; Ginaldi et al., J Clin Pathúl, 1998; 51:364-369; Anderson et al., Blood, 1984; 63:1424-1433). La expresión generalizada y relativamente estable de, CD19 en cánceres de linfocitos B hace que este antígeno sea una diana atractiva para las terapias basadas en AcMos .

Por lo tanto existe una necesidad de una^ terapia combinada que utiliza las ventajas de ambos anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20 para el tratamiento de cánceres de linfocitos B.

SUMARIO DE LA INVENCION ¡ En esta descripción se proporcionan métodos para el tratamiento de linfomas de linfocitos B que implican administrar a un paciente que lo requiera una terapia combinada que comprende un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20. Tales terapias combinadas confieren actividad antitumoral con una duración mayor que cualquiera del. anticuerpo ariti-CD19 o el anticuerpo anti-CD20 administrado por separado, con una pauta de dosificación comparable .

También se proporcionan métodos para el tratamiento de linfomas de linfocitos B utilizando una dosis reducida de anticuerpos anti-CD19 y/o anti-CD20. En particular, tales métodos implican administrar a un paciente que lo requiera, una terapia combinada que comprende un anticuerpo ariti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20, en donde una dosificación de la terapia combinada tiene una actividad antitumoral superior que una dosificación del anticuerpo anti-CD19 que es al menos dos veces mayor que la dosificación de la terapia combinada.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1H muestran la actividad ADCC del AcMo anti-CD19 afucosilado, 16C4 (l6C4-afuc) y el AcMo anti-CD20, rituximab, contra líneas celulares de leucemia y dé linfoma de linfocitos B. Los resultados de los ensayos in -vitro de ADCC con cuatro líneas celulares muestran que son representativos para los perfiles de la actividad observados a través de un panel de 15 líneas de leucemias y de linfoma. El AcMo de CD19 fucosilado 16C4 se incluyó a efectos de comparación. Las actividades ADCC de 16C4-afuc y rituximab eran comparables cuando se sometieron a ensayo contra células Karpas-1106P (Fig. 1A) ; resultados similares se obtuvieron con las líneas celulares Farage, Raj i y MeC2. JVM2 (Fig. IB) es representativa de líneas celulares contra las cuales rituximab era más eficaz que 16C4-afuc in vitro; se obtuvieron resultados similares con las líneas 1 celulares Granta-519, DB y JVM-13. 0ci-LY19 (Fig. 1C) y Daudi (Fig. ID) son representativas de líneas celulares contra las cuales 16C4-afuc era más potente que rituximab; se obtuvieron resultados similares con células Toledo, Karpas-422, Nalm-6, RL y . Namalwa. Con todas las líneas celulares sometidas a ensayo, 16C4-afuc era más potente que la versión fucosilada de 16C4. Los resultados mostrados son la media +/- desviación típica de muestras por triplicado. Las Figs . 1F-1H muestran la expresión relativa de CD19 y CD20 (expresada como MFI ¡ véase la Tabla I en el Ejemplo 2) trazada frente al % de muerte celular máxima observada (CD19, Fig. 1F; CD20, Fig. 1G) y frente a los valores de CE50 (CD19, Fig. 1H; CD20,: Fig. II) determinada para 16C4-afuc y rituximab. Las combinaciones de línea celular/Ac o para las que no se pudo determinar una CE50 (véase también la Tabla I en el Ejemplo 2), se excluyeron. A través de este panel diverso de líneas celulares no se pudo determinar una correlación significativa de la CE50 o destrucción máxima de células con una expresión del antígeno.

La Figura 2A-2F ilustran cómo células de leucemia linfocítica crónica (LLC) obtenidas a partir de pacientes son sensibles a la ADCC mediada por l6C4-afuc in vitro. En la Fig. 2A, células LLC de pacientes muestran una expresión variable en la superficie celular de CD19 y CD20. El número; de sitios antigénicos de CD19 y CD20 sobre células LLC, se determinó tal y como se describe a continuación en Materiales y Métodos En las Figs. 2B-2C, se muestran los resultados de los ensayos de ADCC in vi tro de 16C4-afuc y rituximab con células LLC obtenidas a partir de pacientes, utilizando un ensayo basado en FACS. Células NK C1333 se utilizaron como células efectoras en una proporción E:T de 2.5:1. Se muestran los resultados de tres muestras representativas de pacientes, de las seis muestras analizadas en total. Con todas las muestras sometidas a ensayo, 16C4-afuc era más eficaz que , rituximab para agotar linfocitos B LLC, procedentes de muestras de PBMC de pacientes. Todos los ensayos de ADCC se realizaron por triplicado y se presentan los valores medios (+/- desviación estándar) . Se muestra la relación de la expresión del antígeno con la actividad de ADCC in vi tro para 16C4-afüc (Fig. 2E) y rituximab (Fig. 2F) para las seis muestras de pacientes con LLC sometidas a ensayo. El número de sitios antigénicos para CD19 y CD20 se representa gráficamente frente al porcentaje máximo de células, destruidas,: logrado con 16C4 y rituximab, respectivamente.

Las Figuras 3A-3E muestran que células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) obtenidas a partir de pacientes, son sensibles a la ADCC mediada por lSC4-afuc. La Fig. 3A ilustra la expresión de CD19 y CD20 en células; LLA de pacientes. El número de sitios antigénicos para CD19 y CD20 se determinó para tres muestras individuales de LLA. En comparación, se muestra el número de sitios antigénicos en linfocitos B humanos normales de sangre periférica, procedentes de cuatro ' donantes individuales. Como se muestra en las Figs . 3B, 3C, 3D y 3E, 16C4-afuc tiene una potente actividad ADCC in vi tro contra células LLA primarias. Se muestran los resultados de los ensayos basados en. FACS con muestras procedentes de cuatro pacientes. Las células NK KC1333 se utilizaron como células efectoras en una proporción E:T de 2.5:1; rituximab se incluyó a efectos de comparación. Todas las mediciones se realizaron por triplicado cdn valores medios (+/- desviación estándar) presentados.

Las Figuras 4A-4B muestran que la inhibición del crecimiento tumoral mediante 16C4-afuc depende de la función efectora mediada por Fe. Se muestra la inhibición del crecimiento tumoral in vivo con 16C4-afuc y el AcMo menos efector mutado en Fe, 16C4-TM en modelos de xenoinjertos de SCID-linfoma Daudi (Fig. 4A) y Raji (Fig. 4B) . Ratpnes SCID fueron inoculados por vía s.c. con células de linfoma el día 0. A partir del día 7, los animales recibieron tres dosis semanales de AcMo (2.5 mg/kg) o un volumen igual de vehículo (PBS) . El AcMo de IgGl humana R347 fue utilizado como isotipo testigo.

Las Figuras 5A-5B muestran que la inhibición del crecimiento de linfornas en ratones SCID mediante 16C4-afuc, es dependiente de la dosis. El tratamiento de xenoinjertos de células Raji con un intervalo de concentraciones de AcMo y de frecuencias de dosificación, causó una inhibición significativa del crecimiento tumoral, en comparación con los animales tratados con el isotipo testigo. El intervalo de la dosis incluye 0.3, 1, 3 y 10 mg/kg de 16C4-afuc. Las variaciones de la pauta de dosificación incluían 1, 3 y 5 dosis. La primera dosis se administró el día 5 después de la implantación celular. En la Fig. 5A, 5 dosis de 16C4-afuc administradas bisemanalmente dieron como resultado una actividad antitumoral más fuerte que 3 dosis administradas semanalmente (Fig. 5B) . El tratamiento con 3 mg/kg logró una eficacia comparable con el tratamiento con 10 mg/kg. · Las Figuras 6A-6B muestran que el AcMo de CD19, 16C4-afuc está activo en múltiples modelos de linforna en SCID. La Fig. 6A muestra la inhibición del crecimiento del tumor con 16C4-afuc y rituximab en tres modelos de xenoinjertos de linforna por vía s.c. Se muestran los resultados de las líneas celulares de linfoma Namalwa (Fig. 6A) , Daudi (Fig. 6B) y Toledo (Fig. 6C) . A los ratones SCID se les implantó por vía s.c. células tumorales el día 0 y luego fueron inyectados por vía i.p. dos veces por semana, con 16C4-afuc, isotipo testigo, vehículo o rituximab,, comenzando el día 5 con un total de 5 dosis (3 mg/kg) . En las Figs . 6D y 6E, el AcMo de CD19 16C4- afuc está activo en modelos de ratón de la enfermedad diseminada. Se muestra la comparación de la actividad antitumoral de 16C4-afuc y rituximab en dos modelos de enfermedad sistémica. Los resultados mostrados son para los ratones inyectados con células Daudi (Fig. 6B) y Namalwa (Fig. 6A) . La administración dos veces por semana por vía i.p. de 16C4-afuc, rituximab o isotipo testigo (3 mg/kg) , se inició el día 7 después de la inyección de células y continuó para 5 dosis más. En el modelo de tumor diseminado, el tiempo de supervivencia o el tiempo hasta la parálisis fue utilizado como criterio de valoración.

Las Figuras 7A-7E muestran los efectos de la supresión prolongada del crecimiento tumoral en modelos de linfoma en SCID mediante la combinación de 16C4-afuc y rituximab. En los modelos de linfoma en SCID, rituximab se administró' según la misma pauta y la misma concentración que 16C4-afuc (3 mg/kg dos veces por semana para un total de cinco dosis) . Se muestran los resultados de los modelos de xenoinjertos de Raji (Fig. 7A) , Daudi (Fig. 7B) , Oci-LY19 (Fig. 7C) y Ramos · (Fig. 7D) . La combinación de 16C4-afuc con rituximab; dio como resultado una supresión prolongada del crecimiento tumoral para los modelos de Raji y Daudi. Se observó un efecto menor en el modelo de 0ci-LY19, que respondía mal a rituximab, y el modelo Ramos que respondía mal a l6C4-afuc.

La Figura 8 muestra la. farmacocinética, y la farmacodinámica de 16C4-afuc, administrado solo o en combinación con rituximab en ratones transgénicos hüCD19/CD20 Se consideraron cuatro administraciones separadas: 16C4-afuc (1 mg/kg) + testigo; 16C4-afuc (10 mg/kg) + testigo;. 16C4-afuc (1 mg/kg) + rituximab; 16C4-afuc (10 mg/kg) + rituximab. La dosis más alta de 16C4-afuc (10 mg/kg), tanto si se administraba sola o en combinación, se conservaba por más tiempo en la sangre que la dosis más baja de l6C4-afuc (l mg/kg) .

La Figura 9 muestra el resultado de un experimento de agotamiento de linfocitos B, después de la administración de cualquier terapia combinada, rituximab solo o 16C4-afuc solo. Los resultados indican que la dosis más alta de la terapia combinada, con rituximab (10 mg/kg) + 16C4-afuc (10 mg/kg), condujo al mayor porcentaje de agotamiento de linfocitos B de la sangre y el bazo, con la mayor duración.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A. Terapia combinada con anticuerpos anti-CD19 y anti- CD20 En esta descripción se proporcionan métodos para el tratamiento de cánceres de linfocitos B que implican la administración de una combinación de un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20. La terapia combinada proporciona una eficacia antitumoral prolongada y/o un tratamiento eficaz con una dosificación reducida, en comparación con una terapia con solo un anticuerpo (por ejemplo, la administración de anti-CD19 o anti-CD20 solos) . También se proporcionan métodos para prolongar la inhibición del crecimiento tumoiral en un sujeto que lo requiera (por ejemplo, un sujeto que padece cáncer de linfocitos B) mediante la administración al sujeto de una combinación de un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20.

Tal y como se usa en este documento, "tratar" ó "tratamiento" se refiere a la administración de un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de este que se une al antígeno, a un sujeto, o la administración de un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de este, a un tejido aislado o a una línea celular procedente de un sujeto, en combinación con la administración de un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento de este que se une al antígeno, al sujeto, o a un tejido aislado o a una línea celular procedente del sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, en donde el propósito es curar, sanar, mitigar, aliviar, alterar, remediar, aplacar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad. Por "tratar" o "tratamiento" también se entiende que la combinación ; de estos anticuerpos ó fragmentos de estos que se unen al antígeno se puede administrar al sujeto, o al tejido aislado o a una línea celular procedente del sujeto, como parte de úna única composición farmacéutica, o como alternativa, como parte de composiciones f rmacéuticas individuales, comprendiendo cada una el anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) o el anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) , en donde el sujeto tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición I hacia una enfermedad, en donde el propósito es curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

Múltiples parámetros pueden ser indicativos de la eficacia del tratamiento, por ejemplo, la actividad antitumoral. Estos incluyen, pero no se limitan a estos, una reducción en el tamaño de la masa tumoral; una reducción de la invasividad metastásica del tumor; una reducción en la tasa de crecimiento del tumor; una disminución en la gravedad o la incidencia de secuelas relacionadas con el tumor, tales como caquexia y producción de ascitis; una disminución y/o prevención de complicaciones relacionadas con el tumor, tales como fracturas óseas patológicas, anemia hémolítica autoinmune, transformación prolinfocítica , síndrome de Richter, y similares; sensibilización del tumor a la quimioterapia y a otros tratamientos; un aumento de la tasa de supervivencia del paciente; un aumento en correlaciones clínicas observadas de pronóstico mejorado, tales como el aumento de linfocitos que se infiltran en el tümor y la disminución de la vascularización del tumor; y similares. Por lo tanto, en algunas modalidades, la administración de la combinación de estos dos tipos de anticuerpos se traducirá en una mejora de uno o varios de estos parámetros en un paciente (por ejemplo, sujeto) sometido a tratamiento. En otras modalidades, las mejoras en el paciente serán sinérgicas con respecto a algunos parámetros, y aditivas con respecto a otros .

En ciertas modalidades, l efecto de la terapia combinada con anticuerpos de CD19 y CD20 puede ser; aditivo. En otras modalidades, los efectos de la terapia combinada con anticuerpos de CD19 y CD20 pueden ser sinérgicos. El término "sinergia" se utiliza para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es superior a la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivó. Por lo tanto, cuando el efecto combinado de dos o más agentes da como resultado una "inhibición sinérgica" de una actividad o un proceso, por ejemplo, el crecimiento del tumor, se entiende que la inhibición de la actividad o del proceso es mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. La expresión "efecto terapéutico sinérgico" se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias, en donde el efecto terapéutico (medido por cualquiera de entre una variedad de parámetros) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con las terapias individuales respectivas. En el contexto de esta descripción, efecto sinérgico significa que el efecto observado cuando se emplea una combinación de un anticuerpo de CD19 y un anticuerpo de CD20 administrados con una pauta o programa de dosificación comparable, es (1) mayor que el efecto logrado cuando el anticuerpo de CD19 o el anticuerpo de CD20 se emplea solo (o de manera individual) y (2) mayor que el efecto añadido por suma (aditivo) de ese anticuerpo de CD19 y ese anticuerpo de CD20. Tal y como se usa en este documento, una pauta de dosificación comparable se refiere a una pauta o programa de dosificación que se utiliza para evaluar o comparar los resultados de al menos dos tratamientos diferentes y, como tal, está diseñado para que sea igual entre los tratamientos que se comparan, es decir, los pacientes están siendo dosificados de la misma manera (por ejemplo, día, tiempo entre las dosificaciones, concentración del agente anticuerpo) , pero con un anticuerpo o una terapia combinada diferentes. Las variables de la pauta de dosificación serán determinadas .por un experto en la técnica, dependiendo del cáncer de linfocitos B que se está tratando y de la elección del tratamiento. Tal sinergia o efecto sinérgico se puede determinar por medio de una variedad de medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, el efecto sinérgico de un anticuerpo de CD19 y un anticuerpo de CD20 se puede observar utilizando formatos de ensayo in vitro o in vivo, que examinan la reducción del número de células tumorales o el tamaño del tumor, o mediante la inhibición del crecimiento del tumor o un agotamiento de las células tumorales. Del mismo modo, una cantidad sinérgicamente eficaz de cada componente individual puede determinarse sometiendo a ensayo un intervalo de concentraciones de cada componente.

Tal y como se utiliza en esta descripción, el término "combinación" se utiliza en su sentido más amplio y 'significa que un .sujeto es tratado con al menos dos pautas terapéuticas Por lo tanto, "terapia combinada con anticuerpos" o "terapia combinada" significa que un sujeto es tratado con al menos dos pautas de anticuerpos, más particularmente, con al menos un anticuerpo anti-CD20 (q un fragmento de este que se une al antígeno) en combinación con por lo menos un anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno)-, pero el momento de la administración de las diferentes pautas de anticuerpos puede variar, siempre que se consigan los efectos beneficiosos de la combinación de estos anticuerpos. El tratamiento con un anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) en combinación con un anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) puede ser al mismo tiempo (por ejemplo, de forma simultánea o al mismo tiempo) , o en momentos diferentes (por ejemplo, de forma consecutiva o secuencial), o una combinación : de estas. En el contexto de la presente descripción, la administración al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) se ,refiere a la administración de los anticuerpos juntos en la misma formulación o en formulaciones separadas, en donde la i administración puede tener una diferencia de unos pocos minutos a unas horas, pero no más de un día. Tal y como se usa en este documento, la administración en 1 momentos diferentes (por ejemplo, secuencialmente) se refiere a la administración de los anticuerpos de la terapia combinada con una diferencia de unas pocas horas a días, semanas e incluso meses .

Por lo tanto, en ciertas modalidades, un sujeto sometido a terapia combinada de anticuerpos puede recibir ambos anticuerpos al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) o en momentos diferentes (por ejemplo, secuencialmente, en cualquier orden, el mismo día o en días diferentes), siempre que se produzca el efecto terapéutico de la combinación de ambas sustancias en el sujeto sometido a la terapia. En algunas modalidades, la combinación de anticuerpos se proporcionará simultáneamente para una dosificación, pero otras dosificaciones incluirán una administración secuencial, en cualquier orden, el mismo día o en días diferentes. La administración secuencial puede realizarse independientemente de si el sujeto responde a la primera administración de i anticuerpo monoclonal. Cuando los dos anticuerpos se administran simultáneamente, se pueden administrar como composiciones farmacéuticas separadas, comprendiendo cada una el anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) o el anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno), o se pueden administrar; como una composición farmacéutica única que comprende ambos de estos anticuerpos.

Los métodos de la descripción comprenden el uso de una terapia combinada que confiere una respuesta terapéutica positiva a un sujeto que requiera un tratamiento para enfermedades de los linfocitos B. Una respuesta terapéutica positiva en relación con el tratamiento combinado empleando anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20, significa una mejora en la enfermedad en asociación con la actividad antitumoral de estos anticuerpos o fragmentos de estos, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, se puede observar un efecto antiproliferativo, la prevención de nuevos crecimientos tumorales, una reducción del .tamaño del tumor, una reducción del número de células cancerígenas i y/o una disminución de uno- o varios síntomas mediados por linfocitos B neoplásicos. Por lo tanto, por ejemplo, una mejora en la enfermedad se puede caracterizar como una respuesta Completa. Por "respuesta completa" se entiende la ausencia de enfermedad clínicamente detectable, con normalización de i8 : cualquier estudio radiográfico que previamente era anormal, médula ósea y líquido cefalorraquídeo (LCR) . Tal respuesta debe persistir durante al menos un mes después del tratamiento, según los métodos de la descripción. Como alternativa, una mejora en la enfermedad se puede clasificar como una respuesta parcial. Por "respuesta parcial" se entiende una disminución de al menos aproximadamente el 50% en toda la carga tumoral medible (por ejemplo, el número de células tumorales presentes en el sujeto) en ausencia de nuevas lesiones y que persiste al menos durante un mes. Tal respuesta soló es aplicable a los tumores medibles .

La respuesta tumoral se puede evaluar por cambios en la morfología del tumor (por ejemplo, carga total del tumor, tamaño del tumor y similares) empleando técnicas de detección, tales como la exploración por resonancia magnética (RM) , formación de imágenes radiográficas por rayos X, exploración por tomografía computarizada (TC) , citometría de ; flujo o análisis por separador de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) , formación de imágenes cón bioluminiscencia, por ejemplo, formación de imágenes con luciferasa, formación de imágenes por gammagrafía ósea y toma de muestras de biopsias tumorales, que incluye la aspiración de médula ósea (BMA, por sus siglas en inglés) . Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto, sometido a terapia puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora de los síntomas asociados con la enfermedad. Por lo tanto, para los tumores de linfocitos B, el sujeto puede experimentar una disminución en los llamados síntomas de linfocitos B, por ejemplo, sudores nocturnos, fiebre, pérdida de peso y/o urticaria.

La terapia combinada descrita en este documento se administra con una dosis terapéuticamente eficaz. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz", ("cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se entiende que i es una cantidad del anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) que, cuando se administra en combinación con una cantidad del anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno), produce una. respuesta terapéutica positiva en relación con el tratamiento contra un cáncer de un sujeto, que comprende linfocitos B neoplásicos. En algunas modalidades, una1 dosis terapéuticamente eficaz tanto del anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) como del anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) está en el intervalo de entre aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg. Se reconoce que el método de tratamiento puede comprender una sola administración de una dosis terapéuticamente eficaz de la combinación de anticuerpos útil en la puesta en práctica de los métodos, o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz de la combinación de anticuerpos.

En ciertas modalidades, la terapia combinada con anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20 proporciona i una actividad antitumoral prolongada, en relación con tratamientos que implican ya sea un anticuerpo antiLCD19 solo o un anticuerpo anti-CD20 solo. En ciertas modalidades, una terapia combinada puede proporcionar una actividad antitumoral que tiene una duración de al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año o 2 años más que la actividad antitumoral obtenible con un anticuerpo anti-CD19 solo o con un anticuerpo anti-CD20 solo. La duración relativa' de la actividad antitumoral se puede determinar basándose en análisis estadísticos de una población de prueba. Por ejemplo, si un anticuerpo anti-CD19 muestra un cierto nivel de actividad antitumoral durante una media de 6 semanas en una población de prueba y un anticuerpo anti-CD20 , muestra un cierto nivel de actividad antitumoral durante una media de 8 semanas en una población de prueba, entonces la combinación muestra una actividad antitumoral que es al menos 4 semanas más larga que cualquiera terapia con un anticuerpo administrada sola, si la terapia combinada muestra al menos el mismo nivel de actividad antitumoral que la observada para la terapia con un solo anticuerpo, durante una media de al menos 12 semanas, en una población de prueba. La duración de i la actividad antitumoral puede medirse como la fécha en la que se inicia la terapia hasta el momento en el que la terapia ya no proporciona un nivel deseado de ! actividad antitumoral (por ejemplo, tal y como se mide por la capacidad de evitar un aumento del volumen tumoral, la capacidad para agotar linfocitos B, etc.) i En ciertas modalidades, la actividad antitumoral tal y como se describe en este documento, se refiere a la capacidad para evitar un incremento en el tamaño del tumor superior a 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25% o 30%. Tal y como se emplea en este documento, el tamaño del tumor se refiere a la medición del diámetro o a la medición del volumen tumoral estimado. Por ejemplo, si una terapia combinada puede evitar que un tumor aumente en más de un 10% en mediciones unidimensionales o bidimensionales , durante un período de seis meses, muestra una actividad antitumoral durante un período de seis meses. Estas mediciones de la dimensión de los tumores de linfomas (por ejemplo, tumores presentes en los ganglios linfáticos periféricos) pueden obtenerse a través de escáneres corporales, utilizando instrumentos descritos anteriormente, que proporcionan mediciones del diámetro o del volumen tumoral estimado {Journal of Clinical Oncology, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings : (Edición posterior al encuentro). Vol . 22, n.° 14S (suplemento del 15 de julio), 2004: 6606)) . Por lo tanto, la terapia- combinada ¦ ' I descrita actualmente muestra actividad antitumoral cuando no hay un aumento en una medición del diámetro de un tumor o en una medición del volumen tumoral estimado. En otra modalidad,, la actividad antitumoral se puede reflejar en una disminución real del tamaño del tumor; o en el mantenimiento de un tumor con un tamaño fijo durante un período de tiempo: En otra modalidad, la actividad antitumoral se puede determinar por la inhibición del crecimiento tumoral en más de un 1%, 2%, 5%, 8%, 10%, 12%, 15%, 20%, 25% o 30% en relación con el tamaño del tumor antes del tratamiento, por ejemplo, mediciones del diámetro o mediciones de volumen tumoral estimado.

En ciertas modalidades, la actividad antitumoral puede medirse determinando el nivel de agotamiento ! de los linfocitos B, obtenido con una terapia determinada. Los i linfocitos B circulantes, incluyendo los linfocitos B malignos, se miden más fácilmente por citometría de flujo, u otros dispositivos para el recuento de células descritos anteriormente y bien conocidos en la técnica, dando como resultado un recuento del número de linfocitos B circulantes. Se contempla, además, que cualquier método que proporciona un número de linfocitos B circulantes, se puede utilizar para determinar el agotamiento de los linfocitos B, después del tratamiento con la terapia combinada. El agotamiento de los linfocitos B circulantes se entiende bien que es un marcador sustituto para el agotamiento de los linfocitos B tisulares.

Por lo tanto, tal agotamiento de los linfocitos B incluye los linfocitos B circulantes y los linfocitos B tisulares, algunos de los cuales pueden ser cancerosos. En ciertas modalidades, la actividad antitumoral se puede determinar -por un nivel de agotamiento de los linfocitos B de por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%', 98%, 99% o 100% en relación con el nivel de linfocitos B antes del tratamiento. Por ejemplo, si una terapia puede mantener un nivel de agotamiento de los linfocitos B del 90% durante un período de al menos seis meses, la terapia muestra actividad antitumoral durante un periodo de seis meses.

Un método para predecir la eficacia clínica, es medir los efectos de la terapia combinada con estos anticuerpos en un modelo adecuado; por ejemplo, el uso de la combinación de un anticuerpo anti-CD20 y un anticuerpo anti-CD19 en modelos de cáncer murino. Estos modelos incluyen los . modelos tumorales de xenoinjertos en ratones sin pelaje, como los que se utilizan en las líneas celulares de linfoma blumano de Burkitt, conocidas como Namalwa y Daudi . En algunas modalidades, la actividad antitumoral se somete a ensayo en un modelo tumoral de xenoinjerto en ratón sin pelaje por fases, empleando la línea celular de linfoma humanó Daudi. Una línea celular de un modelo tumoral de xenoinjerto en ratón sin pelaje por fases es generalmente más eficaz para distinguir la eficacia terapéutica de un anticuerpo dado, que en un modelo sin fases, ya que en el modelo por fases, la dosificación del anticuerpo se inicia solo después de que el tumor ha alcanzado un tamaño medible. En el modelo sin fases, la dosificación del anticuerpo se inicia generalmente aproximadamente el día 1 de la inoculación del tumor y antes de que esté presente un tumor palpable. La capacidad de un anticuerpo para mostrar un aumento de la actividad antitumoral en un modelo por fases es una indicación consistente de que el anticuerpo será terapéuticamente eficaz En otras modalidades, una combinación de un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20 proporciona métodos para inhibir el crecimiento tumoral o para tratar pacientes que tienen cáncer de linfocitos B, utilizando dosificaciones reducidas de los anticuerpos terapéuticos. En particular, los ejemplos proporcionados en este documento, muestran que la dosis total de una terapia combinada (por ejemplo, una combinación de un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20) es más eficaz que una dosis de un anticuerpo anti-CD19 que es mayor que la dosis total de la terapia combinada. En consecuencia, los métodos descritos en este documento proporcionan una mejora de la eficacia de la terapia con un anticuerpo aislado, permitiendo de este modo un tratamiento eficaz con dosificaciones más bajas y evitando potencialmente efectos secundarios indeseables asociados con dosificaciones más altas de la terapia con anticuerpo. En ciertas modalidades, una terapia combinada proporciona ; el mismo efecto antitumoral o un efecto mayor, con una dosis' total que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces menor que la dosis de un anticuerpo anti-CD19 o un anticuerpo anti-CD20, que se requeriría para proporcionar la misma 1 actividad antitumoral ' (por ejemplo, el mismo grado de actividad antitumoral como respuesta a una dosis única, o ; el mismo grado de actividad antitumoral durante un periodo de tiempo definido, usando una pauta de dosificación comparable) . Por lo tanto, para cualquier dosificación dada de anticuerpo anti-CD19 que confiere una actividad an itumoral, la terapia combinada conferirá una actividad antitumoral mayor!, con una concentración menor que la dosificación del anticuerpo anti-CD19. La concentración menor puede ser la mitad de la concentración del anticuerpo anti-CDl9, o puede ser menor de la mitad de la concentración del anticuerpo anti-CD19.

En ciertas modalidades, la terapia combinada descrita en este documento puede conseguirse por diversos medios de administración. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CÉ)l9 y el anticuerpo anti-CD20 se pueden formular y administrar al paciente de forma separada. Como alternativa, los anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20 pueden formularse juntos en una única formulación. Cuando los anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20 se encuentran en formulaciones separadas, los anticuerpos se pueden administrar con las mismas pautas o con diferentes pautas de dosificación. Por ejemplo, los dos anticuerpos se pueden administrar al mismo tiempo y con la misma frecuencia (por ejemplo, ambos anticuerpos administrados al mismo tiempo, una vez a la semana) , se pueden administra en momentos distintos, pero con la misma frecuencia de administración (por ejemplo, ambos anticuerpos se administran una, vez a la semana, pero en momentos diferentes) , o se pueden administrar utilizando pautas que difieren en la frecuencia (por ejemplo, un anticuerpo se administra una vez a la semana y el otro anticuerpo se administra cada dos semanas), !etc. En modalidades ejemplares, los anticuerpos anti-CD19 y an i-CD20 se formulan conjuntamente y se administran con la misma pauta de dosificación.

B. Anticuerpos anti-CD19 La terapia combinada descrita en este documento comprende anticuerpos anti-CD19. El término ''CD19" o "antígeno CD19" se refiere a un antígeno de aproximadamente 90 kDa identificado, por ejemplo, por el anticuerpo HD237 o B4 (Kiesel et al., Leukemia Research II, 12:1119; (1987)). CD19 se encuentra en las células a lo largo de la diferenciación de la estirpe de los linfocitos B desde la etapa de célula madre hasta la diferenciación terminal en células plasmáticas, incluyendo pero sin estar limitado a, linfocitos pre-B, linfocitos B (incluyendo linfocitos B sin activar, linfocitos B estimulados con antígenos, linfocitos B de descripción, células plasmáticas y linfocitos B maduros) y las células dendríticas foliculares. CD19 también se encuentra en linfocitos B en el tejido fetal humano. En modalidades preferidas, el antígeno CD19 al que se dirigen los anticuerpos descritos en este documento, es el antígeno CD19 humano.

Cualquier anticuerpo anti-CD19 adecuado puede ser utilizado de conformidad con los métodos y las composiciones descritas en este documento. Los' anticuerpos anti-CD19 adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti'-CD19 conocidos, anticuerpos anti-CD19 comercialmente disponibles o anticuerpos anti-CDl9 desarrollados utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Tal y como se emplea en este documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos", ' también conocidos como inmunoglobulinas , abarcan anticuerpos monóclonales (incluyendo anticuerpos monóclonales de longitud completa) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos formados a partir de al menos dos fragmentos diferentes que se unen al epítopo (por ejemplo, anticuerpos biespeéíficos) , anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fvs de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla, anticuérpos de dominio único, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpos que muestran la actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción que' se une al antígeno) , Fvs unidos por disulfuro (dsFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos descritos en este documento) , intracuerpos y fragmentos que sé unen al epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de I inmunoglobulina, por ejemplo, moléculas que contienen, al menos un sitio de unión a antígeno.

Un anticuerpo de CD19 de la descripción puede ser un anticuerpo anti-CD19 monoclonal humano, humanizado o quimérico. Los anticuerpos anti-CDl9 utilizados; en las composiciones y los métodos de la descripción pueden ser anticuerpos sin modificar, inmunoconjugados o proteínas de fusión. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción puede mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos humanos (ADCC) , en la citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento (CDC) y/o en la apoptosis en una cantidad suficiente para agotar los linfocitos B circulantes. En modalidades ejemplares, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción es un anticuerpo anti-CD19 que ha sido modificado genéticamente para tener actividad ADCC mejorada en relación con el anticuerpo parental . Métodos para la creación de variantes de ¦ j í anticuerpos que tienen actividad ADCC mejorada, se describen más adelante. En ciertas modalidades, un anticuerpo t anti-CD19 de la descripción es un anticuerpo afucosilado que tiene actividad ADCC mejorada. , En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 empleado en las composiciones y los métodos de .la descripción, puede ser un anticuerpo humano, humanizado o quimérico que tiene un isotipo IgG, particularmente un isotipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humano o cualquier alelo de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 encontrado en la población humana. Los anticuerpos de la clase IgG humana tienen caracterís icas funcionales, tales como una larga semivida en suero y la capacidad de mediar en diversas funciones éfectoras ("Monoclonal Antibodies: Principies and Applications", Wiley-Liss, Inc., capítulo 1 (1995)). El anticuerpo de la clase IgG humana se clasifica adicionalmente en las siguientes 4 subclases: IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Se han llevado a cabo hasta ahora un gran número de estudios de la ADCC y la CDC como funciones éfectoras del anticuerpo de la clase IgG, y se ha descrito que entre los anticuerpos de la clase IgG humana, la subclase IgGl tiene la mayor actividad ADCC y actividad CDC en los seres humanos (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción es un anticuerpo anti-CD19 conocido que 1 incluye, pero no está limitado a, HD37 (IgGl, kappa) North America, Inc., Carpintería, California), BU12 (Callará et al., J. ímmunology, 148 (10) :2983-7 (1992)), 4G7 (igGl) (Meeker et al., Hybridpma, 3(4):305-20 (1984 Winter) ) , J4.119 , (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania) , B43 (PharMingen, San Diego, CA) , SJ25C1 (BD PharMingen, San Diego, CA) , FMC63 (IgG2a> (Zola et al., Immunol.. Cell Biol . 69 (PT6 ): 411-22 (1991); Nicholson et al., Mol Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pieterszi et al., Cáncer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995)), 89B (B4) (IgGl) (Beckman Coulter, Miami, Florida; Nadler et al., J. Immunol, 131:244-250 (1983)), y/o HD237 (IgG2b); (Fourth International Worshop on Human Leukocyte Diffeijentiation Antigens, Viena, Austria, 1989; y Pezzutto et al., J;. Immunol, 138 (9) : 2793-2799 (1987)). 'En otras modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción es cualquiera de los anticuerpos anti-CD19 descritos en las Publicaciones de Patentes de EE . UU. n.° 2008/0138336 y 20.09/0142349 y las patentes d EE . UU. n.° 7.462.352 y 7.109.304. En modalidades ejemplares, un anticuerpo anti-CD19 es el anticuerpo 16C4, ? un fragmento de este que se une a antígeno, tal y como se describe en la publicación de la patente de EE . UU. n.° 2008/0138336 y a continuación.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CDl:9 es una variante con isotipo cambiado de un anticuerpo ánti-CD19 conocido (por ejemplo, a un isotipo humano IgGl o IgG3) , tal como los descritos anteriormente.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción se puede unir inmunoespecíficamente a CD19 humano y puede tener una constante de disociación (¾) menor que 3000 pM, menor que 2500 pM, menor, que 2000 pM, menor que 1500 pM, menor que 1000 pM, menor que 750 pM, menor que 500 pM, menor que 250 pM, menor que 200 pM, menor que 150 IpM, menor que 100 pM, menor que 75 pM, según se determina usando un método conocido por un experto en la técnica (por ejemplo, un ensayo de BIAcore, ELISA) (Biacore International AB,, Uppsala, Suecia) . En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción se puede unir inmunoespecíficamente a un antígeno CD19 humano y puede tener una constante de disociación (¾) de 25 a 3400 pM, 25 a 3000 pM, 25 a 2500 M,' 25 a 2000 pM, 25 a 1500 pM, 25 a 1000 pM, 25 a 750 pM, 25 a 500 pM, 25 a 250 pM, 25 a 100 pM, 25 a 75 pM, 25 ,a 50 pM, según se determina usando un método conocido por un experto en la técnica (por ejemplo, un ensayo de BIAcore, ELISA) . En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 ' de la descripción puede unirse inmunoespecíficamente a CD19 humano y puede tener una constante de disociación (¾) de; 500 pM, 100 pM, 75 pM o 50 pM tal y como se determina utilizando un método conocido por un experto en la técnica, (por ejémplo, un ensayo de BIAcore, ELISA) .

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD19 para uso en composiciones y métodos de la descripción pueden ser capaces de reducir o agotar linfocitos B en un ser humano tratado con estos. El agotamiento de los linfocitos B puede ser en linfocitos B circulantes, o en tejidos particulares, tales como, pero no limitado a estos, médula ósea, bazo, tejidos linfoides asociados al intestino y/o¦ ganglios linfáticos. En una modalidad, el anticuerpo anti-CD19 de la descripción puede agotar linfocitos B circulantes, linfocitos B de la sangre, linfocitos B esplénicos, linfocitos B de zonas marginales, linfocitos B foliculares, linfocitos B peritoneales y/o linfocitos B de la médula ósea. En una modalidad, un anticuerpo anti-CD19 de la. descripción puede lograr el agotamiento de linfocitos B progenitores, linfocitos pro-B tempranos, linfocitos pro-B ' tardíos, linfocitos pre-B grandes, linfocitos pre-B pequeños, linfocitos B inmaduros, linfocitos B maduros, linfocitos B estimulados con antígeno y/o células plasmáticas. Tal agotamiento puede lograrse a través de diversos mecanismos, tales como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o mediante el bloqueo de la interacción de CD19 con su ligando previsto, y/o por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , inhibición de la proliferación de los linfocitos B y/o la inducción de la destrucción de los linfocitos B (por ejemplo, a través de la apoptosis) . Por "agotamiento" de linfocitos B se entiende una reducción en los linfocitos B circulantes y/o linfocitos B en tejido(s) particular (es) , en al menos aproximadamente 25%, 40%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95% Ó más. En modalidades particulares, prácticamente todos los Ünfocitos B detectables se agotan de la circulación y/o del (de los) tejido(s) particular (es) .

En cierta modalidad, el agotamiento de los linfocitos B mediante un anticuerpo anti-CD19 de la descripción puede persistir durante por lo menos 1 día, por lo menos 2 días, por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos 7 días, por lo menos 8 días, por lo menos 9 días, por lo menos 10 días, por lo menos 15 días, por lo menos 20 días, por lo menos 25 días ¾o por lo menos 30 días. En otra modalidad, el agotamiento de los linfocitos B mediante un anticuerpo anti-CDl9; de la descripción, puede persistir durante por lo menos i semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas, por lo menos 4 semanas, por lo menos 5 semanas, por lo menos 6 semanas, por lo menos 7 semanas, por lo menos 8 semanas, por lo menos 9 semanas o por lo menos 10 semanas. En una modalidad adicional, el agotamiento de los linfocitos B mediante un anticuerpo anti-CD19 de la descripción, puede persistir durante por lo menos 1 mes, por lo menos 2 meses ¡ por lo menos 3 meses, por lo menos 4 meses, por lo menos 5 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 7 meses, por lo menos 8 meses, por lo menos 9 meses, por lo menos 10 meses, por lo menos 11 meses o por lo menos 12 meses.

Los cánceres de linfocitos B se caracterizan por la expansión patológica de subgrupos de linfocitos B específicos, por ejemplo, la leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B precursores se caracteriza por una expansión anormal de linfocitos B correspondientes a las etapas de desarrollo de linfocitos pro-B / linfocitos pre-B. Los linfocitos B cancerosos mantienen una expresión en la superficie celular de marcadores normales de linfocitos B, tales como ,CD19. Por tanto, un anticuerpo anti-CD19 puede agotar linfocitos B cancerosos en un sujeto humano. En una modalidad específica, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción puede lograr al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100% de agotamiento de linfocitos B cancerosos en un sujeto humano.

Función efectora modificada genéticamente En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD19 se modifican en relación con la función efectora, á fin de aumentar la eficacia del anticuerpo para el tratamiento de cánceres de linfocitos B, por ejemplo. Una función efectora ejemplar es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC, que es una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas reconocen un anticuerpo unido a una célula ;diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. Las células citotóxicas o células efectoras, pueden ser leucocitos que expresan uno o varios FcRs . Las células efectoras expresan al menos FcyRI, FCYRII, FCYRIII y/o FcyRIV en el ratón. Algunos leucocitos humanos que median en la ADCC, incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) , células citotóxicas naturales (NK, por sus siglas en inglés), monocitos, linfócitos T citotóxicos y neutrófilos. De estas células, las células principales para mediar en la ADCC son las células NK, que expresan FCYRIII. LOS monocitos expresan FcyRI FCYRII, FcyRIII y/o FCYRIV. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en Ravetch y Kinet, Arinu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). ! Un método para mejorar la función efectora de los anticuerpos es producir glicoformas . modificadas genéticamente . Las glicoformas modificadas genéticamente se puedeíi generar por cualquier método conocido por un experto en la; técnica, por ejemplo, mediante el uso de cepas de expresión modificadas genéticamente o variantes, mediante la coexpresión con una o varias enzimas, por ejemplo DI N-acetilglucosaminiltransferasa ' III (GnTIII) , expresando una molécula que comprende una región Fe en diversos organismos o líneas celulares procedentes de diversos organismos, o modificando hidratos de carbono, después de que se haya expresado la molécula que comprende la región Fe . Los métodos para generar glicoformas modificadas genéticamente son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a los descritos en Umana et al., 1999, Nat . Biotechnol 17 ¡176-180 ; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-3473) Patente de EE . UU. n.° 6.602.684; solicitudes de patente de EE . UU. n.° de serie 10/277.370; n.° de serie 10/113.929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1 ; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent* (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación genética por glicosilación GlvcoMAb® (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza) . Véanse, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-1249. Una o varias sustituciones de aminoácidos también se pueden hacer para que den como resultado la eliminación de un sitio de glicosilación presente en la región Fe (por ejemplo, la Asparagina 297 de igG) . Además, los anticuerpos aglicosilados se pueden producir en células bacterianas que carecen de la maquinaria necesaria para una glicosilación.

' Un anticuerpo también se puede preparar de forma que tenga un tipo de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNAc de bisección incrementadas. Tales patrones alterados de glicosilacion han mostrado que aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con la maquinaria alterada para la glicosilacion. Las células con maquinaria, alterada para la glicosilacion se han descrito en la técnica y se pueden utilizar como células huésped en las que se expresan anticuerpos recombinantes de la descripción para prpducir de este modo un anticuerpo con la glicosilacion alterada. Véase, por ejemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biól . Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat . Biotech. 17:176-1, así como, la Patente de EE . UU. n.° 6.946.292; patente europea n.° EP 1176195; Publicaciones de PCT WO 03/035835, O 99/54342, cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

' En una modalidad, un anticuerpo anti-CDl? de la descripción comprende una variante de la región Fe que media en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada (ADCC) . En una modalidad, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una región Fe que tiene cádenas de azúcar ligadas a complejos de N-glicósido, ligadas a Asn297 en las que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor, en donde la región Fe media en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos me orada (ADCC) . i En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una variante de Fe, en donde el dominio variante de Fe tiene una afinidad hacia el receptor IIB de Fe gamma que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, ó al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, ó al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces mayor que la de un dominio Fe no variante comparable . i En otras modalidades, la función efectora se puede alterar mediante la introducción de residuo (s) de cisteína en la región Fe del anticuerpo, permitiendo de este: modo la formación de enlaces disulfuro entre las cadenas en esta región. El anticuerpo homodímero así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o de mayor destrucción de células mediada por el complemento y/o una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada (ADCC). Véase, Carón et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B., J. Immunol . , 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodímeros con actividad antitumoral ;mej orada también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales , tal y como se describe en Wolff, et al., Cáncer Research, 53:2560-2565 (1993). Un anticuerpo también í se puede modificar por ingeniería genética para que tenga regiones Fe duales y de este modo puede aumentar la lisis del complemento y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al .,· Anti-Cáncer Drug Design, 3:219-230 (1989).

Otros métodos para modificar genéticamente las regiones Fe de los anticuerpos, con el fin de alterar las funciones efectoras son conocidos en la técnica (por ejémplo, la Publicación de Patente de EE. UU. n.° 20040185045 y la publicación PCT n.° WO 2004/016750, ambas de Koenig et al., que describen la alteración de la región Fe para mejorar la afinidad de la unión hacia FCYRIIB, en comparación con la afinidad de la unión hacia FcyRIIA; véanse también la publicación PCT n.° WO 99/58572 de Armour et al., WO' 99/51642 de Idusogie et al . , y la patente de EE . UU. n.° 6.395.272 de Deo et al.; cuyas descripciones se incorporan en esta descripción en su totalidad) . Los métodos de modificación de la región Fe para disminuir la afinidad de la unión á FcyRIIB también son conocidos en la técnica (por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° 20010036459 y. la publicación PCT n.° WO 01/79299, ambas de Ravetch et al., cuyas descripciones se incorporan en esta descripción en su totalidad) . Los anticuerpos modificados que tienen regiones Fe variantes con una mayor afinidad de la unión hacia FCYRIIIA y/o FcyRIIA, en comparación con una región Fe natural también se han descrito (por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2004/063351, de Stavenhagen et al . , cuya descripción se incorpora en este documento en su totalidad) .

Se pueden utilizar ensayos in vitro conocidos en la técnica para determinar si los anticuerpos anti-CD19 utilizados en las composiciones y los métodos de la descripción, son capaces de mediar en la ADCC. Ensayos ejemplares se describen en la patente de EE . UU . n.° 5.500.362 o 5.821.337. En particular, células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citotóxicas naturales (NK) . Como alternativa o adícionalmente , la actividad ADCC de las moléculas de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al..

(Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)). El ensayo también puede llevarse a cabo utilizando un kit disponible comercialmente , por ejemplo, CytoTox 96 (Promega) .

Anticuerpos anti-CD19 ejemplares En ciertas modalidades, los métodos y las composiciones descritos en este documento utilizan el anticuerpo anti-CD19 16C4 (véase, por ejemplo, la Publicación de 'patente de EE. UU. n.° 2008/0138336), o un fragmento de este .que se une al antígeno. 16C4 es un AcMo de CD19 que ha mostrado tener una función efectora de ADCC potente. 16C4 es la forma afucosilada del AcMo de CD19 anti-CD19-2, que fue desarrollado mediante la humanización y la optimización de la afinidad del AcMo HB12b (Kansas GS y Tedder TF. J Iwmunol, 1-991; 147:4094-4102; Yazawa et al . , Proc Nati Acad. ' Sci, 2005; 102 (42) : 15178-15183 ; Herbst et al . , * J" Pharmacol .Exp Ther, 2010, 335 (1) -.213-222) . ¡ En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena pesada que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En otras modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena pesada que comprende una CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%., 98%' o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 3 y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otras modalidades, un anticuerpo anti-CD19 comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 1.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena ligera que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 7 y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En otras modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena ligera que comprende una CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 6, una CDR2 qué comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 7 y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO : 8. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En otras modalidades, un anticuerpo anti-CD19 comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 5.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CDl9 de la descripción comprende una CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 4, una CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de : SEQ ID NO 6, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una CDRl de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 2, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 3, una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4, una CDRl de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 6, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% de identidad con SEQ ID NO: 8.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En otras modalidades, un anticuerpo anti-CD19 de la descripción comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%! o 99% de identidad con SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 55%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 5.

La presente descripción abarca anticuerpos que son derivados del anticuerpo 16C4 que se une a CD19 humano. Las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, se pueden usar para introducir mutaciones (por ejemplo, adiciones, supresiones y/o sustituciones) en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis. mediada por PCR, que se utilizan habitualmente para generar sustituciones de aminoácidos. En una modalidad, los derivados de las CDR VH y/o VK pueden incluir menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, menos de 2 sustituciones de aminoácidos o 1 sustitución de aminoácidos, en relación con las CDR VH y/o VK originales del ánticuerpo anti-CD19 16C4. En otra modalidad, los derivados de las CDR VH y/o VK pueden tener sustituciones conservadoras de aminoácidos, realizadas en uno o varios residuos de aminoácidos previstos no esenciales (por ejemplo, residuos de aminoácidos que no son decisivos para que el anticuerpo se una específicamente a CD19 humano) . Las mutaciones también se pueden introducir al azar a lo largo de todas las secuencias o de una parte de las secuencias codificadoras de las CDR VH y/o VK, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar por la actividad biológica para identificar los mutantes que conservan la actividad. Después de la mutagénesis, el anticuerpo codificado se puede expresar y la actividad del anticuerpo se puede determinar. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, búsquedas de proteínas con BLAST.

C. Anticuerpos anti-CD20 La ' terapia combinada descrita en este documento comprende además anticuerpos anti-CD20. El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación restringido a ¦ linfocitos B humanos, Bp35) es una proteína transmembranal hidrofóbica con un peso molecular de aproximadamente 35 kD, situada en los linfocitos pre-B y los linfocitos B maduros (Valentine et al. J. Biol . Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989); Einfeld et al . ???? J. 7(3):711-717 (1988); Clark y'Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989); y Valentine et al .: J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989)). CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de los linfocitos pre-B y se: conserva hasta que la diferenciación en célula plasmática; no se encuentra en células madre humanas, células progenitoras linfoides o ' células plasmáticas normales. CD20 est 1 presente en los linfocitos B normales, así como en los linfocitos B cancerosos, por ejemplo, las células en el linfoma no Hodgkin de linfocitos B (LNH) , en donde CD20 se expresa eri más del 90% de los LNH (Anderson et al. Blood 63 (6 ): 1424 -1433 (1984)). CD20 no se encuentra en las células madre hematopjoyéticas , linfocitos pro-B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder et al. J. Immunol . 135 (2) : 973 -979 (1985)). CD20 regula una(s) etapa(s) temprana(s) en el proceso de activación para la iniciación del ciclo celular y la diferenciación (Tedder et al., supra.) y posiblemente actúa como un canal de iones calcio (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D.-195 (1990)).

Cualquier anticuerpo anti-CD20 adecuado se puede utilizar de conformidad con los métodos y las composiciones descritos en este documento. Los anticuerpos anti-CD20 adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-CD20 conocidos, anticuerpos anti-CD20 disponibles comercialmente o anticuerpos anti-CD20 desarrollados utilizando métbdos bien conocidos en la técnica.

Un anticuerpo de CD20 de la presente descripción puede ser un anticuerpo anti-CD20 monoclonal humano, humanizado o quimérico. Los anticuerpos anti-CD20 utilizados en las composiciones y los métodos de la descripción pueden ser anticuerpos sin modificar, inmunoconjugados o proteínas de fusión. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD20 de la descripción puede mediar en la citotoxicidad ? celular dependiente de anticuerpos humanos (ADCC) , la citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento (CDC) y/o la apoptosis en una cantidad suficiente para agotar los linfocitos B circulantes. En modalidades ejemplares, un anticuerpo anti-CD20 de la descripción es un anticuerpo anti-CD20 que ha sido modificado genéticamente para tener una actividad ADCC mejorada, en relación con el anticuerpo parental . Los métodos . para la creación de variantes de anticuerpos que tienen una actividad ADCC me orada se han descrito anteriormente. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD20 de la descripción es un anticuerpo afucosilado que tiene actividad ADCC mejorada.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD2p usado en las composiciones y los métodos de la descripción ;puede ser un anticuerpo humano, humanizado o quimérico que tiene un isotipo IgG, particularmente un isotipo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humano o cualquier alelo de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4 encontrado en la población humana.

Ejemplos de anticuerpos que se unen al antígeno CD20 incluyen: "C2B8" que ahora se denomina "Rituximab" ( "RITUXAN"*" ) ; el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio- [90] denominado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (Zevalin ) (Patente de EE. UU. n.° 5.736.137, incorporada expresamente en este documento por referencia) ; lgG2a murina "Bl",,., también denominada "Tositumomab" (Beckman Coulter) marcada opcionalmente con 131I para generar el anticuerpo "131I-B1" (yodo I131 tositumomab, BEXXAR*) (Patente de EE . ; UU. n:° 5.595.721, incorporada expresamente en este documento por referencia); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69 (2) : 584-591 (1987) y variantes de estos, incluyendo el "marco parcheado" o 1F5 humanizado (WO03/002607, Leung, S.); depósito de la ATCC HB-96450; anticuerpo 2H7 |murino y 2H7 quimérico (Patente de EE . UU. n.° 5.677.180, incorporada expresamente en este documento por referencia) ; 2H7 humanizado; huMax-CD20 (Genmab, Dinamarca) ; AME-133 (Applied Molecular Evolution) ; anticuerpo A20 o sus variantes, tales como el anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (US 2003/0219433, Immunomedics) ; y los anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3, B-CI o NU-B2 disponibles a partir de "International Leukocyte Typing Workshop" (Valentine et al., en: Leucocyte Typing III ( cMichael , compilador, pag. 440, Oxford University Press (1987) ) . En una modalidad ejemplar, los métodos y las composiciones de la descripción utilizan rituximab, o un fragmento de este que se une al antígeno, en combinación con un anticuerpo anti-CD19, o un fragmento de este.

Rituximab (RITUXAN®) es el anticuerpo denominado "C2B8" en la Patente de EE . UU. n.° 5.736.137 concedida el 7 de abril de 1998 (Anderson et al.). RITUXAN® está indicado para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de linfocitos B positivos para CD20 de bajo grado o folicular, recurrente o refractario. En estudios del mecanismo de acción in vi tro se ha mostrado que RITUXA ® se une al complemento humano y lisa líneas celulares linfoides de linfocitos B mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83 (2 ): 35-445 (1994)). Además, tiene una actividad significativa en ensayos de citotoxicidad celular dependiente de. anticuerpos (ADCC) . Más recientemente, RITUXAN* ha mostrado que tiene efectos antiproliferativos en ensayos de incorporación de timidina tritiada y que induce la, apoptosis directamente (Maloney et al. Blood 88(10) :637a (1996) ) . En estudios preclínicos in vivo se ha mostrado que RITUXAN® agota los linfocitos- B de la sangre periférica, ganglios linfáticos y médula ósea de monos cangrejeros, presumiblemente a través de procesos mediados por el complemento y por células (Reff et al. Blood 83 (2) :435-445 (1994) ) . Rituximab fue aprobado en Estados Unidos en noviembre de 1997 para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin de linfocitos B CD20+ (LNH) de bajo grado o folicular, recurrente o refractario en una dosis de 375 mg/m2 semanalmente en cuatro dosis.

Los términos "rituximab" o " RITUXA 8" en esta descripción, se refieren al anticuerpo monoclonal quimérico murino/humano manipulado genéticamente, dirigido contra el antigeno CD20 y designado "C2B8" en la Patente de EE. UU. n.° 5.736.137, expresamente incorporada en esta descripción por referencia. Las secuencias completas de ácido nucleico y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada o rituximab, se dan á conocer en la patente de EE . UU. n.° 5.736.137. En particular, las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de rituximab se describen en la Fig. 4 y en SEQ ID NO: 6 de la Patente de EE. UU. n.° 5.736.137. La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de rituximab se describe en la Fig. 5 y en SEQ ID NO: 9 de la Patente de EE.

UU. n.° 5.736.137. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y 9 y las Figs . 4 y 5 de la patente de EE. UU. n.° 5.736.137 se incorporan expresamente en este documento por referencia. Rituximab también se puede preparar mediante un transfectoma de células ' CHO que comprende el vector de ADN presente en la célula huésped de E. coli depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) .con el número de entrada 69119. Rituximab también se puede producir a partir del hibridoma 2B8, que está depositado en la ATCC con el número de entrada HB 11388.

D. Cánceres de linfocitos B Una terapia combinada que comprende anticuerpos anti-•CD19 y anticuerpos anti-CD20 tal y como se describ en este documento, se puede utilizar para el tratamiento de enfermedades de los linfocitos B, incluyendo cánceres dé linfocitos B. La expresión "cáncer de linfocitos B" incluye cualquier cáncer que se deriva de una célula de la estirpe de los ^ linfocitos B. Ejemplos de cánceres de linfocitos B incluyen, pero no se limitan a: linfoma no Hodgkin (LNH) de subtipo linfocitos B, que incluye LNH de bajo grado/folicular, LNH de linfocitos pequeños (SL, por sus siglas en inglés) , LNH de grado intermedio/folicular, LNH difuso de grado intermedio, LNH inmunoblástico de alto grado, LNH linfoblástico de alto grado, LNH de células eqµeñas no hendidas de alto grado,- linfoma de células del manto y LNH de enfermedad voluminosa; linfoma de Burkitt; mieloma múltiple; leucemia linfoblástica aguda pre-B y otros cánceres que se derivan de las células tempranas precursoras de linfocitos B; leucemia linfocítica aguda común (LLA) , leucemia linfocítica crónica (LLC) que incluye LLC mutada por inmunoglobulina y LLC no mutada por inmunoglobulina; leucemia dé células pilosas; leucemia linfoblástica aguda nula; macroglóbulinemia de Waldenstrom; linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés) que incluye DLBCL de tipo linfocito B de centro germinal (GCB, por sus siglas en inglés) , DLBCL de tipo linfocito B activado (ABC, por sus siglas en inglés) y DLBCL de tipo 3; leucemia prolinfocítica , enfermedad de la cadena ligera; plasmocitoma ; mieloma osteoesclerótico; leucemia de células plasmáticas; gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS, por sus siglas en inglés); mieloma múltiple quiescente (SMM, por sus siglas en' inglés) ; mieloma múltiple indolente (IM , por sus siglas en, inglés) ; linfoma de Hodgkin que incluye el tipo predominante de linfocito clásico y nodular; linfoma linfoplasmacítico (LPL, por sus siglas en inglés) ; y linfoma de la zona marginal que incluye el linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica ( ALT, por sus siglas en inglés) .

El tratamiento de las recaídas de estos tipos de cáncer también se contempla. LPHD es un tipo de enfermedad de Hodgkin que tiende a la recaída frecuente, a pesar de un tratamiento con radiación o quimioterapia y se caracteriza por células malignas positivas para CD20. LLC es uno de los cuatro tipos principales de leucemia. Un cáncer de los llamados linfocitos B maduros, LLC se manifiesta por la acumulación progresiva de células en la sangre, la médula ósea y los tejidos del sistema linfático. El linfoma indolente es una enfermedad de crecimiento lento, incurable en la que el paciente promedio sobrevive entre seis ; 10 años después de numerosos períodos de remisión y recaída.

El nivel deseado de agotamiento de los linfocitos B dependerá de la enfermedad. Para el tratamiento de un cáncer de linfocitos B, puede ser deseable maximizar el agotamiento de los linfocitos B que son la diana de los anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20 de la descripción. Por lo tanto, para el tratamiento de una neoplasia de linfocitos B, es deseable que el agotamiento de linfocitos B sea suficiente para al menos evitar la progresión de la enfermedad que puede ser determinada por el médico especialista en la técnica, por ejemplo, mediante el control del crecimiento del tumor '(tamaño) , la proliferación del tipo de células cancerosas, la metástasis, otros signos y síntomas del cáncer en particular. Preferiblemente, el agotamiento de los linfocitos B es suficiente para evitar la progresión de la enfermedad durante al menos 2 meses, más preferiblemente 3 meses, incluso más preferiblemente 4 meses, más preferiblemente 5 meses, incluso más preferiblemente 6 meses o más. En modalidades aún más preferidas, el agotamiento de los linfocitos B es suficiente para aumentar el tiempo de remisión, en al menos 6 meses, más preferiblemente 9 meses, más preferiblemente un ( año, más preferiblemente 2 años, más preferiblemente 3 años, incluso más preferiblemente 5 años o más. En una modalidad más preferida, el agotamiento de los linfocitos B es suficiente para curar la enfermedad. En modalidades preferidas, el agotamiento de los linfocitos B en un paciente con cáncer es de al menos aproximadamente el 75% y más preferiblemente, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e incluso 100% del nivel de los valores de referencia antes del tratamiento. ; Un paciente con neoplasia de linfocitos B se alivia o es tratado con éxito mediante los presentes métodos de la descripción si hay una mejora medible de los síntomas u otros criterios aplicables después de la administración de las composiciones de la descripción, en comparación con antes del tratamiento. El efecto del tratamiento puede ser evidente ál cabo de 3-10 semanas después de la administración de las composiciones de la descripción. Los criterios aplicables para cada enfermedad serán bien conocidos por el médico especializado en la técnica apropiada. Por ejemplo, él médico puede vigilar al paciente tratado para estudiar una évidencia clínica o serológica de la enfermedad, tal como márcadores serológicos de la enfermedad, hemograma completo, incluyendo un recuento de los linfocitos B y los niveles séricos de inmunoglobulinas . El paciente puede mostrar una reducción observable y/o medible o una ausencia de uno o varios de los siguientes síntomas : reducción del número de células cancerígenas o ausencia de células cancerígenas; reducción del tamaño del tumor; inhibición (por ejemplo, ralentizar en cierta medida y preferiblemente detener) de la infiltración de células cancerígenas en los órganos; inhibición (por ejemplo, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) de la metástasis tumoral; inhibición, en cierto grado, del crecimiento del tumor; y/o alivio, en cierto grado,; de uno o varios de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducción de la morbilidad y la mortalidad, y mejora de la calidad de vida. Preferiblemente, después ¦ de la administración de las composiciones de la descripción, la mejora es de al menos 20% sobre los valores de referencia para un síntoma o un criterio en particular, tomados antes del tratamiento con los métodos de la descripción, más preferiblemente, 25-30%, incluso más preferiblemente 30-35%, lo más preferible 40% y superior.

Los parámetros para determinar la eficacia o el éxito del tratamiento de la neoplasia, serán conocidos por el médico especialista en la enfermedad apropiada. En general, el médico especialista buscará una reducción de los signos y los síntomas de la enfermedad específica. Los parámetros pueden incluir el tiempo medio hasta la progresión de la enfermedad, el tiempo de remisión y la estabilización de la enfermedad. Para las neoplasias de linfocitos B, los criterios medibles pueden incluir, por ejemplo, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad, un aumento en la duración de la supervivencia global y/o exenta de progresión. En el caso de leucemia, una biopsia de la médula ósea puede llevarse a cabo para determinar el grado de remisión. La remisión completa se puede definir cuando las células de la leucemia constituyen menos del 5 por ciento de todas las células encontradas en la médula ósea de un paciente, 30 días después del tratamiento.

Las siguientes referencias describen linfornas y LLC, sus diagnósticos, tratamiento y procesos médicos convencionales para medir la eficacia del tratamiento. Canellos G. P., Lister, T. A., Sklar J. L.: The Lymphomas . W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K y Cabanillas, F: Clinical Manifestations , Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, cap. 70, págs . 1293-1338, en: Hematology, Basic Principies and Practice, 3.a ed. · Hoffman et al. (compiladores). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; y Rai, K y Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, cap. 72, págs. 1350-1362, en: Hematology, Basic Principies and Practice, 3.a ed. Hoffman et al. (compiladores) . Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000.

E. Formulaciones farmacéuticas En ciertos aspectos, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD20, o una combinación de estos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la descripción se utilizan como un medicamento.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD20, o una combinación de estos pueden formularse con un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptables, en forma de comppsiciones farmacéuticas (agentes terapéuticos) , y se pueden administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Tal y como apreciará el experto en la materia, la vía y/ó el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o varios materiales no tóxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos . Tales preparaciones pueden contener rutinariamente sales, agentes amortiguadores, conservantes, vehículos compatibles y, opcionalmente, otros ' agentes terapéuticos. Tales preparaciones farmacéuticamente aceptables también pueden contener rutinariamente cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administración en un ser humano. Otros vehículos, excipientes y/o aditivos contemplados, que se pueden utilizar en las formulaciones descritas en la presente descripción incluyen, por ejemplo, agentes saborizantes , agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, lípidos, excipientes proteicos tales como seroalbúmina , gelatina, : caseína, contraiones formadores de sales, tales como sodio y similares Estos y otros vehículos, excipientes y/o ; aditivos farmacéuticos conocidos, adecuados para uso ; en las formulaciones descritas en este documento, son conocidos en la técnica, por ejemplo, tal y como se indica en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy" , 21.a ed. , liippincott Williams & Wilkins, (2005), y en el "Physiciah's Desk Reference" , 60.a ed., Medical Economics, Montvale, N.'J. (2005) Los vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar rutinariamente para que sean adecuados: para él modo de administración, solubilidad y/o estabilidad de los anticuerpos de la terapia combinada, tal y como ¡ es bien • conocido en la técnica o como se describe en este documento.

Las formulaciones descritas en el presente documento comprenden un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CD20 o una combinación de estos en una concentración que; da como resultado un p/v adecuado para una dosis deseada. Eh ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 o un anticuerpo anti- CD20 está presente en una formulación a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente l mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, o 1 mg/ml y aproximadamente 25 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de un anticuerpo anti-CD19 o anti-CD'20 en una formulación puede variar desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100% en peso. En ciertas modalidades, la concentración de un anticuerpo anti-CD19 o anti-CD20 está en el intervalo de 0.003 a 1.0 molar.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20 se formulan juntos y cada uno de los anticuerpos está presente en una formulación, a una concentración desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 1 i mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 1 .mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, o 1 mg/ml y aproximadamente 25 mg/ml. En ciertas modalidades, la concentración de .cada uno de los anticuerpos en la formulación puede variar desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100% en peso. En ciertas modalidades, la concentración de cada uno de los anticuerpos está en el intervalo de 0.003 a 1.0 molar.

En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-^CD19 se formula de conformidad con cualquiera de las formulaciones en WO 2010102276.

En una modalidad, las formulaciones de la descripción son formulaciones exentas de pirógenos qüe están sustancialmente exentas de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y se liberan .solo cuando los microorganismos se descomponen o mueren. Las sustancias pirogénicas también incluyen sustancias termoestables que inducen la fiebre (glicoproteínas) procedentes de la membrana externa de bacterias y de otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y choque si se administra a los seres humanos. Debido a los posibles efectos perjudiciales, incluso bajas cantidades de endotoxinas deben ser retiradas de soluciones farmacéuticas de medicamentos administrados por vía intravenosa. La Administración de Fármacos y Alimentos ( "FDA" , por sus siglas en inglés) ha establecido un límite máximo de 5 unidades de endotoxina (UE) por dosis por kilogramo de peso corporal, en un periodo de solo una hora para aplicaciones de fármacos intravenosos (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1): 223 (2000)). En ciertas modalidades específicas, los niveles de endotoxinas y pirógenos en la composición son menores de 10 UE/mg, o menos de 5 UE/mg, o menos de 1 UE/mg, o menos de 0.1 UE/mg, o menos de 0.01 UE/mg, o menos de 0.001 UE/mg.

Cuando se utilizan para la administración in vivo, las formulaciones de la descripción deben ser estériles. Las formulaciones de la descripción se pueden esterilizar mediante diversos métodos de esterilización, que incluyen filtración estéril, radiación, etc. En una modalidad, la formulación es esterilizada por filtración con un filtro de 0.22 mieras, previamente esterilizado. Las composiciones estériles para inyección se pueden formular de conformidad con la práctica farmacéutica convencional, tal y como se describe en " emington : The Science & Practice of Pharmacy ", 21.a ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005).

Las composiciones terapéuticas de la presente : invención se pueden formular para determinadas vías de administración, tales como la vía oral, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parentéral . Las expresiones "administración parentéral" y "administrado parenteralmente" tal y como se emplean en este documento, se refieren a modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, normalmente ; mediante inyección, e incluye, sin limitación, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural e intraesternal . Las formulaciones de la. presente descripción que son adecuadas para la administración tópica, o transdérmica incluyen polvos, pulverizaciones, , pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El (los) anticuerpo (s) se puede (n) mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propelente que pueda ser necesario (patentes de EE. UU. n.° 7.378.110; 7.258.873; 7.135.180; publicación de EE . UU. n.° 2004-0042972 y 2004-0042971) .

Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica farmacéutica. Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden variar con el fin de obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración en particular, sin ser tóxicos para el paciente (por ejemplo, "una cantidad terapéuticamente eficaz"). El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente descripción que se emplean, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y el , historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las ciencias médicas. Las dosificaciones adecuadas pueden variar desde aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o mayor, por ejemplo desde aproximadamente 0.1, 1, 10 o 50 mg/kg de peso corporal, siendo preferido desde aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal En ciertas modalidades, el método comprende la administración de dosis múltiples de anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antlgeno) en combinación con dosis múltiples de anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se unen al antígeno) . El método puede cbmprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antigeno) o un anticuerpo anti-CDl9 (o un fragmento de este que sé une al antígeno), o ambos. La frecuencia y la duración de la administración de dosis múltiples de las composiciones farmacéuticas pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica, sin una experimentación indebida. Además, -el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de anticuerpos, puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. Por ejemplo, un sujeto puede ser tratado con la combinación de un anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) y un anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) , en donde ambos se administran con una dosis en el intervalo de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, una vez por semana, durante aproximadamente l a aproximadamente 10 semanas, preferiblemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 a aproximadamente 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. El tratamiento puede tener lugar anualmente para prevenir una , recaída o después de un indicio de recaída.

También se apreciará que la dosificación eficaz de los anticuerpos o fragmentos de estos que se unen al antígeno, empleada para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar y ser evidentes a partir de los resultados de ensayos de diagnóstico, tal y como se describen en este documento. Por lo tanto, en una modalidad, la pauta de dosificación incluye la administración de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD20 (o de un fragmento de este que se une al antígeno) en combinación con una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CDl9 (o un fragmento de este que se une al antígeno) , en donde la combinación se administra los días 1, 8, 15 y 22 de un período de tratamiento. En otra modalidad, la pauta de dosificación incluye la administración de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD2 (o un fragmento de este que se une al antígeno) en combinación con una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) , en donde la combinación se administra los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un período de tratamiento. Otras modalidades incluyen una pauta de dosificación en donde Una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) se administra en combinación con una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno), en donde la combinación se administra los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de tratamiento; una pauta de dosificación que incluye la administración de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) en combinación con una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno), en donde la combinación de los anticuerpos se administra los días 1 y 3 de una semana en un período de tratamiento,- y una pauta de dosificación preferida que incluye la administración de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) en combinación con el anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) el día 1 de cualquier semana dada en un período de tratamiento. El período de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de tratamiento pueden ser sucesivos o estar separados uno de otro por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Un tratamiento que emplea una combinación de anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) y anticuerpo anti-CD2Ü (o un fragmento de este que se une al antígeno) puede comprender la administración de uno o ambos anticuerpos simultáneamente o al mismo tiempo, siempre y cuando el tratamiento incluya la combinación de anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) y anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) en algún momento durante el tratamiento. El efecto de la terapia combinada también se puede optimizar variando la temporización de la administración del tratamiento del anticuerpo anti-iCD20 y/o del anticuerpo anti-CD19. El tratamiento con un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento de este que se une al antígeno en combinación con un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de este que se une al antígeno, puede ser simultáneo (concurrente) , consecutivo (secuencial) , o una combinación de estos. Por lo tanto, un sujeto sometido a una terapia combinada con anticuerpo puede recibir el anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que se une al antígeno) y el anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) al mismo tiempo (por ejemplo, simultáneamente) o en; momentos diferentes (por ejemplo, secuencialmente , en cualquier orden, el mismo día o en días diferentes) . Por lo tanto, en algunas modalidades, el. anticuerpo anti-CD20, tal como Rituximab (o un fragmento de este que se une al antígeno) se administra simultáneamente con el anticuerpo anti-CD19, tal como 16C4 (o un fragmento de este que se une al antígeno) . En otras modalidades, el anticuerpo anti-CD20, tal como Rituximab (o un fragmento de este que se une al antígeno) se administra primero y a continuación se administra el anticuerpo anti-CD19, tal como 16C4 (o un fragmento de este que se une al antígeno) . En aún otras modalidades, el anticuerpo anti-CD19, tal como 16C4 (o un fragmento de este que se une al antígeno) se administra primero, y el anticuerpo anti-CD20, tal como Rituximab (o un fragmento de este que se une al antígeno) se administra después. En algunas modalidades, la combinación de anticuerpos anti-CD20 y anticuerpos anti-CD19, tales como Rituximab y 16C4, se proporciona al mismo tiempo para una dosificación, pero otras dosificaciones incluyen una administración secuencial, en cualquier orden, el mismo día o en días diferentes. Cuando el anticuerpo anti-CD20 tal como Rituximab y el anticuerpo anti-CD19, tal como 16C4 se administran simultáneamente, se pueden administrar como composiciones farmacéuticas separadas, comprendiendo cada una el anticuerpo anti-CD20 (o un fragmento de este que.se une al antígeno) o el anticuerpo anti-CD19 (o un fragmento de este que se une al antígeno) , o se pueden administrar como una sola composición farmacéutica que comprende ambos; de estos agentes anticancerosos.

EJEMPLOS La invención que se describe ahora en general, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente con fines ilustrativos de ciertas modalidades y modalidades de la presente descripción, y no pretenden limitar la invención.

Ejemplo 1: El AcMo anti-CD19 16C4-afuc tiene una potente actividad ADCC in vitro contra múltiples líneas celulares de leucemia y linfoma de linfocitos B 16C4-afuc es la forma afucosilada del AcMo 16C4, que fue generado mediante la humanización y maduración por afinidad del AcMo de IG1 de ratón, HB12B. (Kansas GS y Tedder TF J Immunol, 1991; 147:4094-4102; Yazawa et al., Proc Nati Acad Sci, 2005; 102 (42) : 15178-15183 ; Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010, 335 (l) : 213-222) . En comparación con el AcMo 16C4 fucosilado, l6C4-afuc tiene ~ 9 veces más afinidad hacia el FCYRIIIA humano activador y el · FcyRIV de ratón y una función efectora ADCC mejorada. En contraste con rituximab, 16C4 no media en la CDC. (Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010, 335 (1) :213-222) .

La actividad ADCC de 16C4-afuc fue comparada con la del precursor fucosilado, el AcMo 16C4, en un panel extenso de líneas celulares de leucemia y linfoma de linfocitos B. El AcMo de CD20 rituximab se incluyó en todos los ensayos como testigo positivo. Con todas las líneas celulares sometidas a ensayo, l6C4-afuc era significativamente más potente en la mediación de ADCC que el AcMo parental, AcMo anti-CD19 (Figs. 1A-1E) . Al comparar la actividad de 16C4-afuc con la de rituximab frente a todo el panel de 15 líneas celulares cancerígenas de linfocitos B, se observaron tres perfiles diferentes de la actividad: primero, líneas celulares frente a las cuales 16C4-afuc y rituximab eran aproximadamente equipotentes , ejemplificadas por las células Karpas-1106P (Fig. 1A) , que expresan cantidades de moderadas a altas de CD19 (Tabla I) ; segundo, líneas celulares frente a las cuales rituximab era más eficaz que 16C4-afuc, tal como :1a línea celular LLC, JVM2 (Fig. IB), tercero, líneas celulares frente a las que i6C4-afuc era más eficaz que rituximab, como las células Oci-LY19 (Fig. 1C) y las células Daudi (Fig. ID y la Tabla I) .

Las líneas celulares también se analizaron para estudiar su expresión relativa de CD19 y CD20, para determinar si los niveles en superficie de los dos antígenos determinan su sensibilidad in vitro frente a los AcMo de CD19 y CD20, respectivamente (Tabla I) . En la Fig. IB, las actividades ADCC observadas con 16C4-afuc y rituximab (porcentaje máximo de citotoxicidad, Fig. 1E para el AcMo de CD19 y Fig. 1F para el AcMo de CD20; valores CE50, Fig. 1G para el AcMo de CD19 y Fig. 1H para el AcMo de CD20) se representan gráficamente frente a la expresión relativa en superficie de CD19 y CD20, tal y como se determinó por citometría de flujo con los AcMo 16C4 y rituximab como anticuerpos primarios para la detección. Para ciertas líneas celulares, la sensibilidad frente a los AcMo anti-CD19 y anti-CD20 parece que concuerda con su expresión relativa del antígeno. Por ejemplo, las células Oci-LY19 tienen niveles bajos de expresión de CD20, pero elevados de CD19 y solo responden al tratamiento < con 16C4 (Tabla I) . La inversa se observó para las células Granta-519, que expresan CD20 a niveles altos y son destruidas de manera eficaz por rituximab, pero no por 16C4-afuc. Sin embargo, una comparación a través de todas las líneas celulares no mostró una correlación significativa de la expresión del ; antígeno con la sensibilidad a ADCC mediada por AcMo. Esta falta de correlación se ilustra con las células Karpas-422, que expresan bajos niveles de CD19 y CD20, y son destruidas de manera eficaz por 16C4-afuc, pero no por rituximab.

En conjunto, los resultados muestran, que 16C4-afuc tiene una potente actividad ADCC in vitro frente a múltiples líneas celulares. Con 11 de las 15 líneas celulares analizadas, la actividad ADCC de 16C4-afuc se comparaba favorablemente con el AcMo de CD20. Con este conjunto diverso de líneas celulares de linfocitos B cancerosas, sin embargo, no hubo una correlación significativa de la expresión del antígeno con la sensibilidad frente a la ADCC mediada por el AcMo de CD19 o CD20.

Ejemplo 2: 16C4-afuc es eficaz contra células ;LLC y LLA obtenidas a partir de pacientes in vitro Teniendo en cuenta la actividad de 16C4-afuc contra las líneas celulares de linfocitos B, también se examinaron los efectos del AcMo de CD19 contra células leucémicas primarias. Seis muestras de PBMC se obtuvieron a partir de pacientes diagnosticados con LLC y se determinaron las densidades de antígeno de superficie para CD19 y CD20. Tal y como se muestra en la Fig. 2A, los linfocitos B en estas muestras expresaban CD19 y CD20 en diversos grados. En algunas de estas muestras, el número de sitios antigénicos para CD20 era mayor que el número de sitios para CD19. Un ensayo de la citotoxicidad basado en FACS in vitro se utilizó para evaluar la capacidad de l6C4-afuc para destruir linfocitos B en las muestras de LLC, con rituximab como testigo positivo. Las Figs . 2B-2D muestran los resultados de ensayos de ADCC con 16C4-afuc y rituximab para tres, muestras representativas de LLC (LLC n.° 106, Fig. 2B; LLC n.° 104, Fig. 2C; LLC n.° 107, Fig. 2D) . Los valores de CE50 para 16C4-afuc variaron desde 0.007 nM a 0.063 nM. En contraste, los valores de CE50 para rituximab variaron de 0.639 nM a 0.682 nM. La sensibilidad de las células LLC a la ADCC mediada por 16C4-afuc y rituximab se comparó con su expresión en superficie ! de CD19 y CD20, respectivamente (Figs. 2E y 2F, respectivamente). Los resultados de este análisis muestran una clara tendencia hacia una destrucción más eficaz de las células, incrementando la densidad de los antígenos tanto para CD19 como CD20. Los resultados con estas muestras de LLC primarias también muestran que 16C4-afuc es más eficaz que rituximab en la mediación del agotamiento in vi tro con niveles relativamente bajos de expresión del antigeno de superficie.

La actividad de 16C4-afuc también fue sometida a ensayos de ADCC basados en FACS, con muestras de PBMC procedentes de cuatro pacientes con LLA. Para tres de estos ensayos, había suficientes células para determinar las densidades antigénicas de CD19 y CD20, en comparación con los linfocitos B de cuatro donantes sanos (Fig. 3A) . Para los linfocitos B normales de sangre periférica, se determinó que la densidad promedio de CD19 y CD20 era de -20000 y -200000 sitios antigénicos por célula, respectivamente. En comparación con los linfocitos B normales, la expresión de CD19 fue algo menor en dos muestras y se incrementó aproximadamente dos veces en la tercera muestra de LLA (Fig. 3A) . El número de sitios antigénicos de CD20, sin embargo, variaba más ampliamente. En los ensayos de agotamiento de lirifocitos B ADCC para muestras procedentes de donantes con LLA (Figs. 3B- 3E) , los valores de CE50 con 16C4-afuc variaron desdé 0.002 nM a 0.131 nM. Estos valores eran 1/6 a menos de 1/100 de los valores de CE50 obtenidos con rituximab. ; En conjunto, los resultados muestran que 16C4-áfuc media eficazmente en ADCC contra las células leucémicas primarias de pacientes con LLC y LLA. En estos ensayos in vitro, el AcMo de CD19 era más eficaz que el AcMo de CD20 rituximab. Este fue también el caso para muestras en las que el nivel de expresión de CD20 era significativamente mayor que los niveles de CD19 en la superficie celular.

Los resultados de los experimentos anteriores se resumen en la Tabla I : Ejemplo 3: 16C4-afuc inhibe el crecimiento tumoral en modelos de linfoma SCID por un mecanismo dependiente de Fe A continuación, se sometió a ensayo la capacidad de 16C4-afuc para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. La eficacia antitumoral de 16C4 se evaluó en múltiples xenoinjertos de linfoma CD19+ humano que crecían én ratones SCID.

Algunos, pero no todos, AcMo contra CD19 tienen actividad antiproliferativa . (Ghetie et al., Bloqd, 1994; 83 (5) : 1329-1336) . Anteriormente, el AcMo 16C4 había mostrado que inhibía la proliferación de líneas celulares de linfocitos B transformados, así como linfocitos B primarios de donantes sanos. (Herbst et al . , J Pharmacol Exp Ther, 2010, 335 (l) :2l3-222) . Con el fin de determinar la contribución de la ADCC al efecto antitumoral, se comparó la eficacia de 16C4-afuc con el AcMo 16C4-TM, una versión del AcMo de CD19 modificado genéticamente para eliminar la función , efectora mediada por Fe. (Oganesyan et al., Acta Cryst de 2008; D64: 700-704) Los anticuerpos fueron evaluados en modelos de xenoinjertos de linfoma SCID en células Raji y Daudi, con dosis semanales de 2.5 mg/kg, comenzando el día 7 después de la implantación celular por vía s.c. Ambos anticuerpos condujeron a una reducción del crecimiento del tumor, aunque el AcMo anti-CDl9 afucosilado era más eficaz que el AcMo 16C4-TM mutante menos efector (Figs. 4A-4B) . En el modelo de Raji, el día 33 (en el momento en el que los grupos tratados con isotipo testigo tenían que terminar, debido al tamaño del tumor), 16C4-afuc inhibía el crecimiento del tumor en un 84% y 16C4-TM inhibía el crecimiento del tumor en un 46% (Fig. 4B) . El día 33 en el modelo de Daudi, 16C4-afuc inhibía el crecimiento del tumor en un 88% y el AcMo 16C4-TM inhibía 'el crecimiento del tumor en un 39% (Fig. 4A) . Estos resultados muestran que se requiere una función efectora dependiente de Fe para obtener una inhibición eficaz del crecimiento tumoral in vivo. Los resultados también muestran que el AcMo de CD19 puede ralentizar el crecimiento del tumor (aunque' en mucho menor grado) , en ausencia de la función efectora, lo que es probablemente el resultado de la áctividad antiproliferativa del AcMo.

Ejemplo 4: 16C4-afuc inhibe el crecimiento tümoral en varios modelos de ratón SCID de linfoma humano de linfocitos B Se determinaron las dosis de 16C4-afuc necesarias para suprimir el . crecimiento tumoral en modelos de ratón. Una gama de dosis y pautas de administración de los AcMo se sometieron a ensayo en el modelo de xenoinjerto s.c. SCID/Raji. El intervalo de dosis del AcMo incluía 0.3, 1, 3 y 10 mg/kg de l6C4-afuc. Las variaciones de la pauta de. dosificación incluían 1, 3 y 5 dosis, administrando la primera dosis el día 5 después de la implantación celular (Figs. 5Á-5B) . En general, la eficacia in vivo de 16C4-afuc era dependiente de la dosis y de la pauta. En el modelo' presentado' en esta descripción, cinco dosis de 16C4-afuc (Fig. 5B) dieron como resultado una actividad antitumoral más fuerte que 3 dosis (Fig. 5A) . Sin embargo, el tratamiento con 3 mg/kg logró una eficacia, comparable al tratamiento con 10 mg/kg. Para estudios posteriores, se utilizó una dosis de 3 mg/kg, administrada dos veces a la semana con un total de 5I dosis.

Usando esta dosis, se evaluó la eficacia de 16C4-afuc en múltiples modelos de xenoinjerto s.c. de linfoma en SCID, con rituximab como testigo positivo y punto de referencia. Las Figs. 6A-6C muestran los resultados procedentes de los modelos tumorales con células Namalwa (Fig. 6A) , Daudi (Fig. 6B) y Toledo (Fig. 6C) . En estos modelos, 16C4 inhibía el crecimiento del tumor en uñ 82%, 91% y 88%, respectivamente, en comparación con los resultados obtenidos para el grupo testigo. Mientras que los tumores de Namalwa respondieron de forma insuficiente al tratamiento con rituximab,: en los xenoinjertos de Daudi se inhibió su crecimiento un poco mejor con el AcMo de CD20 que con 16C4-afuc. En el modelo de tumór de Toledo los dos AcMo mostraron una eficacia comparable.

La eficacia antitumoral de 16C4-afuc se sometió' a ensayo adicionalmente con xenoinjertos de células Namalwa y, Daudi en el modelo de tumor diseminado IV, siendo el tiempo de supervivencia o el tiempo hasta la parálisis el criterio primario de valoración. La administración de 16C4-afuc en los modelos de Namalwa (Fig. 6E) y Daudi (Fig. 6D) aumentó la supervivencia en 50% y 43%, respectivamente, en comparación con la supervivencia observada en el grupo testigo. Al igual que con el modelo de linfoma s.c, rituximab. tenía únicamente un efecto menor en el modelo de enfermedad sistémica con células Namalwa. También para el modelo de Daudi, la eficacia relativa observada con el AcMo 16C4-afuc y rituximab recapitulaba los resultados observados en el modelo s.c. Los resultados muestran que 16C4-afuc inhibe el crecimiento tumoral en varios modelos de linfoma de linfocitos B, tanto en los modelos por vía s.c. como l'os sistémicos.

Ejemplo 5: La combinación de 16C4-afuc con rituximab da como resultado una supresión prolongada del crecimiento del tumor La inhibición del crecimiento tumoral mediada dirigiendo de forma combinada AcMo de CD19 y CD20 hacia una diana de linfocitos B cancerosos, se comparó con la inhibición del crecimiento del tumor resultante de dirigir hacia una diana un solo AcMo. Cuatro modelos diferentes de linforna/leucemia en SCID s.c. (Raji, Daudi, Oci-LY19, Ramos, SUP-B15) fueron tratados con 16C4-afuc y rituximab de forma aislada o en combinación. En estos experimentos, se administró rituximab según la misma pauta y concentración que 16C4-afuc, a 3 mg/kg para un total de 5 dosis. Tal y como se muestra en la Fig. 5, el aumento de la dosis de 16C4-afuc desde 3 mg/kg a 10 mg/kg no tuvo como resultado una mayor inhibición del crecimiento del tumor en un modelo de linfoma SCID/Raji. La combinación de l6C4-afuc con rituximab, sin embargo, dio lugar a una supresión prolongada del crecimiento de tumores en Raji (Fig. 7A) . Se obtuvieron resultados similares en el modelo de linfoma s.c. Daudi (Fig. 7C) , en donde la combinación de los dos AcMo dio como resultado una supresión mayor y prolongada del linfoma s.c. El efecto de la combinación de AcMo fue menos pronunciado en el modelo de xenoinjerto s.c. 0ci-LY19 (Fig. 7B) , lo que puede haber sido el resultado de la actividad insuficiente de rituximab en este modelo. El AcMo de CD19, sin embargo, mostraba una eficacia buena, y la combinación del AcMo de CD19 con rituximab dio como resultado una mayor supresión de los tumores. Del mismo modo, el efecto de la combinación de AcMo fue menos pronunciado en el modelo de xenoinjerto de Ramos (Fig. 7D) , lo que puede ser el resultado de la actividad relativamente insuficiente de 16C4-afuc en este modelo. Sin embargo, como se ha observado para el modelo Oci-LY19, la combinación del AcMo de ;CD19 con rituximab daba como resultado una mayor supresión túmoral en este modelo. El AcMo- 16C4-afuc y rituximab también fueron sometidos a ensayo solos y en combinación en un modelo s.c. con células SUP-B15 LLA (Fig. 7E) . La combinación de 16C4-afuc con rituximab tenía una inhibición del crecimiento tumoral más pronunciada que los agentes individuales'. Además, se sometió a ensayo el tratamiento combinado con AcMo de CD19/CD20 en un modelo de tumor sistémico. Daudi. De forma similar a los resultados de los modelos s.c, la terapia combinada mostró mayor eficacia antitumoral, dando como resultado un aumento de la supervivencia (93.5%), respecto a los testigos tratados con un solo AcMo (datos no mostrados) . Los resultados muestran que la combinación del AcMo de CD19 16C4-afuc con el AcMo de CD20 rituximab, tiene más eficacia que un AcMo solo en modelos preclínicos de linfoma de linfocitos B humanos.

Ejemplo 6: Farmacocinética y farmacodinámica de la terapia combinada en ratones doblemente transgénicos huCD19/CD20 Se generaron animales doblemente transgénicos cruzando ratones transgénicos huCD19 con ratones transgénicos huCD20. Ambas cepas que han sido bien caracterizadas previamente, expresan el transgén en una forma restringida a linfocito B, y se han utilizado con éxito para estudiar el agotamiento de linfocitos B con AcMo de CD19 y CD20, respectivamente. (Zhou et al., 1994, Mol Cell Biol 14:3884-3894; Ahuja et al., 2007, J" Immunol 179:3351-3361; Yazawa et al., 2005, Proc Nati Acad Sci USA 102: 15.178-15.183).- Los niveles de l6C4-afuc se midieron en ratones transgénicos CD19/CD20 después de una pauta de dosificación en la que se administró una muestra de rituximab o de testigo, después de aproximadamente 36 horas de la adición de 16C4-afuc . Los niveles de 16C4-afuc en la sangre de los ratones se midieron a intervalos de tiempo hasta 1680 horas. Se consideraron cuatro administraciones separadas: 16C4-afuc (1 mg/kg) + testigo (por ejemplo, sin rituximab) ; 16C4-afuc (10 mg/kg) + testigo; 16C4-afuc (1 mg/kg) + rituximab (10 mg/kg) ; 16C4-afuc (10 mg/kg) + rituximab (10 mg/kg) . La, Fig. 8A muestra los resultados farmacocinéticos del experimento. Tanto si se administraba sola o con rituximab, la dosis más alta de 16C4-afuc (10 mg/kg) se conservó más tiempo en la sangre que la dosis más baja de 16C4-afuc (1 mg/kg) .

Ejemplo 7: Agotamiento de linfocitos B en ratones transgénicos huCD19/CD20 El grado de agotamiento in vivo de los linfocitos B mediado por la terapia combinada, se comparó con los efectos de rituximab solo (Fig. 8B) . Ratones doblemente transgénicos huCD19/CD20 recibieron una dosis de uno de los siguientes: (i) rituximab (10 mg/kg); (ii) 16C4-afuc (1 mg/kg); (iii) 16C4-afuc (10 mg/kg) ; (iv) rituximab (10 mg/kg) + 16C4-afuc (1 mg/kg) ; (v) rituximab (10 mg/kg) + ,16C4-afuc (10 mg/kg) . El resto de los linfocitos B en la sangre y el , bazo se determinaron por citometría de flujo a intervalos, después de que se administraran las diversas dosis .

La Fig. 9 muestra que la dosis más alta de la terapia combinada, con rituximab (10 mg/kg) + 16C4-afuc (10 mg/kg), conducía al mayor porcentaje de . agotamiento de linfocitos B procedentes de la sangre y del bazo durante el tiempo más largo. En particular, el agotamiento de ' los linfocitos B cae precipitadamente aproximadamente a las 384 horas (o 16 días) después de que se añade la dosis de 16C4-afuc (1 mg/kg) . Una disminución similar en el agotamiento de los linfocitos B se observa aproximadamente a las 840 horas (o 35 días) después de haber añadido rituximab (10 mg/kg) o rituximab (10 mg/kg) + 16C4-afuc (1 mg/kg), aunque el porcentaje de agotamiento de los linfocitos B parece elevarse después de la administración de la última dosificación. Cuando se ha añadido una dosis más alta de 16C4-afuc (10 mg/kg) , los efectos sobre el agotamiento de los linfocitos B se prolongan en relación con dosis más bajas de 16C4-afuc (tanto si se administran · por separado como en combinación) y en relación con rituximab (10 mg/kg) solo. Sin embargo, el efecto más fuerte y más duradero se observó con la terapia combinada de rituximab (10 mg /kg) + 16C4-afuc (10 mg/kg) .

MATERIALES Y METODOS Células y reactivos Las líneas celulares de leucemia y linfoma de linfocitos B humanos Raj i , Daudi , Ramos, Namalwa, Toledo, Farage y RL, se obtuvieron a partir de la "American Type Culture Collection" (ATCC, Manassas, VA, EE . UU.). Las líneas celulares OCI-LY-19, Granta-519, Karpas-422, Nalm-6, Karpas-1106P, DB, JVM-2, JVM-13 y MEC2 se obtuvieron a partir de la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DS Z, Braunschweig, Alemania) . La línea celular KC1333 NK (que expresa CD16 humano) fue obtenida a partir de · BioWa inc.

(Princeton, NJ) . Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se suplementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS, por sus siglas éri inglés) Las muestras de sangre se obtuvieron a partir de donantes sanos después de obtener el consentimiento informado. Las muestras congeladas de PBMC purificadas con Ficoll-Hypaque de pacientes con diagnóstico de LLC o LLA, se obtuvieron de Cureline, Inc. El AcMo de CD19 humanizado, optimizado por afinidad y afucosilado 16C4-afuc, el AcMo 16C4 (16C4 fucosilado) , el AcMo humano de isotipo testigo IgGl R347 y el AcMo 16C4-TM, fueron proporcionados por el Grupo de modificación genética de anticuerpos de Medlmmune . El Fe del AcMo 16C4-TM está modificado genéticamente para eliminar la función efectora. (Oganesyan et al., Acta Cryst, 2008; D64 : 700-704 ) . El AcMo de CD20 rituximab (Biogen Idee, Inc., Cambridge, A) se utilizó como testigo positivo en ensayos in vi tro e in vivo.

Para generar un AcMo de CD19 con una mejora de la función efectora de ADCC, el AcMo de IgGl de ratón HB12b (Kansas y Tedder, J Inmuno1 , 1991; 147:4094-4102), que reconoce CD19 humano, fue humanizado y optimizado por afinidad, dando como resultado AcMo 16C4. Para generar un anticuerpo homogéneamente, afucosilado,. el AcMo de IgGl humanizado 16C4 fue expresado en una línea celular de CHO productora de fucosiltransferasa deficiente '· (BioWa Potelligent Technology, BioWa Inc.; Princeton, NJ) para generar l6C4-afuc.

Determinación de la expresión de antígenos en líneas de linfocitos B Los niveles de expresión de CD19 y de CD20 en líneas de linfocitos B se determinaron utilizando el AcMó 16C4 o rituximab, _ respectivamente, como anticuerpos primarios seguido de anti-AcMo humano de cabra marcado con fluorescencia. Para los ensayos de unión directa, los linfocitos B se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de FACS ( BS que contenía 2% de FBS) . Las células se incubaron durante 20 minutos en hielo con diluciones de AcMo sin marcar, se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía el AcMo secundario. Después de 20 minutos sobre hielo, las células se lavaron, se resuspendieron en tampón de FACS y se analizó la intensidad de la fluorescencia en las superficies de las células mediante citometría de flujo. Para todas las líneas celulares, la máxima unión del AcMo 16C4 y rituximab se logró a concentraciones de 1 µg/ml . La expresión relativa del antígeno se expresa como la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) en la Tabla i.

Determinación de la densidad del antígeno en linfocitos B normales y cancerosos Las densidades de los antígenos CD19 y CD20 sobre linfocitos B procedentes de PBMC congeladas de donantes con LLC o LLA y muestras de PBMC de donantes adultos sanos, se determinaron por citometría de flujo utilizando QIFIKIT* (Dako, Glostrp, Dinamarca) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el clon anti-CD19 HD37 y el clon anti-CD20 2H7 como anticuerpos primarios.

Ensayo de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Ensayos de ADCC se realizaron con líneas celulares de leucemia/linforna de linfocitos B como dianas (T) y células efectoras (E) NK, en una proporción E:T de 2.5:1. Las células se incubaron con diluciones en serie de AcMo durante cuatro horas y la lisis de las células diana se midió detectando la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96e (Promega Corp., Madison, I), realizado de conformidad con las instrucciones del fabricante. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

La citometría de flujo con parámetros múltiples se utilizó para cuantificar in viüro la actividad de ADCC usando PBMC purificadas, procedentes de donantes diagnosticados con LLC o LLA. El contenido en linfocitos de todas las muestras era superior al 90%. En comparación con muestras de PBMC procedentes de donantes sanos, la mayoría de las muestras de los donantes con LLC o LLA, tenían bajas concentraciones de células NK CD56+. Por lo tanto, las muestras de PMBC de LLC y LLA fueron suplementadas con células NK KC1333. Las muestras congeladas de PBMC (LLC o LLA) se descongelaron en un baño de agua a 37°C, se lavaron y se resuspendieron en medio RPMI 1640 ( suplementado con 10% de FBS termoinactivado y L-glutamina 2 mM) , y se extendieron en placas con 5xl04 células/pocilio en placas con 96 micropocillos de fondo redondo Nunc U96 (ThermoFisher Scientific, Roc ester, NY) con un volumen total de 200 µ? . Las células efectoras NK KC1333 se añadieron (25xl04) para conseguir una proporción de E:T de 5:1. Las diluciones en serie de rituximab, 16C4-afuc o del AcMo de isotipo testigo afucosilado R347, se añadieron en partes alícuotas de 10 µ? a los pocilios (por triplicado) , y las PBMC se incubaron durante 20 horas a 37°C con 5% de C02. El porcentaje de citotoxicidad se midió tiñendo las células en una mezcla de anticuerpos marcados con fluorescencia que contenían ficoeritrina-Cy7 anti-CD19 (PE-Cy7) , Pacific Blue anti-CD20, aloficocianina anti÷CD22 (APC) o ficoeritrina anti-CD22 (PE) e isotiocianato de fluoresceína anti-FcsRla (FITC) . Como patrón de recuento, se añadieron perlas de recuento absoluto de CountBright (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) para determinar la concentración celular de subgrupos celulares. Las muestras se aplicaron a un citómetro de flujo LSR II.

Los datos del separador de células activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) se analizaron con el programa informático FlowJo (FlowJo, Ashland, Oregón) , versión 7.2.2. El AcMo de IgGl afucosilado, R347-aFuc, se utilizó como un testigo del tratamiento sin agotamiento y se utilizó para definir las puertas. Se cuantificó el número de recuento absoluto de perlas en cada muestra. El número de linfpcitos B supervivientes en el total de puertas de CD22+ o CD20+CD22+, se convirtió en concentraciones celulares, empleando las perlas de recuento convencionales, de conformidad con las instrucciones del fabricante. El agotamiento de los linfocitos B (porcentaje de citotoxicidad) se calculó de conformidad con las siguientes fórmulas.

Para rituximab: % de citotoxicidad = {l - [CD22+cél laS tratadas con rituximab/mL] ÷ [ CD19+CD22+ Células tratadas con testigo /mL] } X 100.

Para 16C4-afuc: % de citotoxicidad = {l- [CD20+CD22+células 16C4 /mL] ÷ [CD20+CD22+ Células tratadas con testigo /mL] } X 100.

La concentración efectiva media máxima (CE50) de la citotoxicidad de linfocitos B, se calculó usando una ecuación de ajuste de curva con cuatro variables en GraphPad Prism v5.01 (Programa GraphPad, Inc, La Jolla, CA) .

Modelos de linfoma en ratones SCID La inhibición del crecimiento tumoral in vivo se estudió en varios modelos de xenoinjerto de linfoma (SCID, por sus siglas en inglés) inmunodeficiente , grave combinado Ratones hembra CB17-SCID de cuatro a seis semanas de edad fueron criados en las granjas de Taconic (Germantown, NY, EE . UU.) y se mantuvieron en el centro de Recursos Animales de Laboratorio en edlmmune . Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de conformidad con los protocolos aprobados del IACUC . Los estudios se realizaron utilizando los modelos de xenoinjertos de linfoma en SCID localizado y diseminado. Para el modelo de ratón con xenoinjerto localizado subcutáneo (s.c.), los ratones (cohortes de 10) fueron inoculados con 5xl06 células tumorales el día 0. Los ratones fueron tratados con AcMo o el vehículo el día 5 o 7, tal y como se indica, mediante inyección intraperitoneal (i.p.) . En los modelos s.c., el volumen del tumor se vigiló a lo largo del tiempo. En los modelos de ratón SCID diseminados, se inyectaron lxlO6 a 5xl06 células por vía intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola. Siete días después de la inyección de células tumorales, las cohortes (de 10 ratones cada una) fueron tratadas con 5 dosis de AcMo a 3 mg/kg de peso corporal, administrando una dosis cada 4 días. En el modelo de tumor diseminado, el tiempo de supervivencia o el tiempo hasta la parálisis, un síntoma clínico que precede a la muerte, se utilizó como criterio de valoración.

Estudios farmacocinéticos/farmacodinámicos El método de inmunoensayo electroquimioluminiscente (ECL, por sus siglas en inglés) MSD se utilizó para cuantificar 16C4 y rituximab en suero de ratón. 16C4-afuc se capturó con un anticuerpo antiidiotipo de ratón recombinante soluble (D9) que recubría una placa de microtitulación MA6000 MSD. Cualquier 16C4 unido se detecta a continuación, utilizando un anticuerpo biotinilado de burro específico antihumano de IgG Fe gamma, seguido de estreptavidina Sulfo-TAG. Esta se hace reaccionar con un tampón de lectura MSD y las placas se colocan sobre un lector de MSD Sector* Imager modelo 6000, para la generación y la medición de señales ECL. La concentración de 16C4-afuc en una muestra se determina interpolando desde una curva patrón usando un ajuste de curva de cuatro parámetros, en relación con los recuentos ECL para la concentración de 16C4.

Análisis del número de linfocitos B mediante citometría de flujo en ratones transgénicos huCD19/CD20 Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo en un ambiente exento de patógenos en la instalación para animales de Medlmmune , de conformidad con los protocolos aprobados por el IACUC. El agotamiento in vivo : de linfocitos B mediante Ac o de CD19 y CD20 se evaluó en ratones doblemente transgénicos huCDl9/CD20, que fueron generados cruzando ratones transgénicos huCD19 con ratones transgénicos huCD20 (Zhou et al., 1994, Mol Cell Biol. 14:3884-3894; Ahuj a et al., 2007, J Immunol 179:3351-3361) . Ratones transgénicos machos (n = 105) y hembras (n = 105) (de 9-12 semanas de edad; 2 machos y 2 hembras por momento específico/grupo) fueron distribuidos aleatoriamente en 6 grupos que recibieron una inyección de PBS, 16C4-afuc y/o rituximab en la vena de la cola. Se recogió la sangre completa desde el seno orbital en los momentos de tiempo predeterminados para su posterior análisis, empleando citometría de flujo. El número de linfocitos B se determinó en cada muestra tiñendo con B220 conjugado con PerCP-Cy5.5 (CD45R) y muCD19 conjugado con PE. Linfocitos B B220+muCD19+ se sometieron a ensayo también para estudiar la unión de anticuerpos de huCD20 conjugados con Pacific Blue y anticuerpos de huCDl9 conjugados con APC-Cy7. Por último, los linfocitos B se tiñeron con anticuerpo de CD3 conjugado con FITC. Las muestras se dejaron migrar en un citómetro de flujo BD LSRII y los datos se analizaron con FlowJo .

Incorporación como referencia Todas las publicaciones y las patentes mencionadas en este documento se incorporan a la presente por referencia en su totalidad, como si cada publicación o patente individual estuviera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia. En caso de conflicto, la presente solicitud, que incluye cualquier definición de este documento, prevalecerá.

Equivalentes Aunque se han descrito modalidades específicas de la presente invención, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones de la descripción serán evidentes para los expertos en la técnica, después de la revisión de esta descripción descriptiva y las reivindicaciones siguientes. El alcance completo de la descripción debe ser determinado por referencia a las reivindicaciones, junto con su alcance completo de equivalentes, y la descripción descriptiva, junto con tales variaciones .

Secuencias para el anticuerpo 16C4 SEQ ID NO: 1, dominio VH Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe lie Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser SEQ ID NO: 2, CDR1 de VH SSW N SEQ ID NO: 3, CDR2 de VH RIYPGDGDTNYNVKFKG SEQ ID NO: 4, CDR3 de VH SGFITTVRDFDY SEQ ID NO: 5, dominio de VK Glu He ¡ Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly lie Ser Phe lie Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys SEQ ID NO: 6, CDR1 de VK RASESVDTFGISFMN SEQ ID NO: 7, CDR2 de VK EASNQGS SEQ ID NO: 8, CDR3 de VK QQSKEVPFT Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para el tratamiento de un linfoma de linfocitos B, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que lo requiera una terapia combinada que comprende un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20, en donde la terapia combinada proporciona una actividad antitumoral con una mayor duración que cualquiera del anticuerpo anti-CD19 o el anticuerpo anti-CD20 administrado de forma individual con una pauta de -dosificación comparable.

2. Un método para el tratamiento de un linfoma de linfocitos B, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que lo requiera una terapia combinada que comprende un anticuerpo anti-CD19 y un anticuerpo anti-CD20, en el que una dosificación de la terapia combinada tiene una actividad antitumoral mayor que una dosificación del anticuerpo anti-CD19 que es al menos dos veces superior a la dosificación de la terapia combinada.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el linfoma de linfocitos B se selecciona a partir de leucemia linfoblástica aguda (LLA) , leucemia linfocítica crónica (LLC) o linfoma no Hodgkin (LNH) .

. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la terapia combinada proporcina un efecto terapéutico sinérgico.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los anticuerpos anti-CD19 y anti-CD20 se administran simultánea o secuencialmente .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque la actividad antitumoral se selecciona de un grupo qué consiste de una inhibición del crecimiento tumoral y un agostamiento de los linfocitos B cancerosos.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque la terapia combinada confiere actividad antitumoral durante al menos seis meses.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque la terapia combinada confiere actividad antitumoral durante al menos un mes más, y preferiblemente durante al menos seis meses más que cualquiera del anticuerpo anti-CD19 o el anticuerpo anti-CD20 administrado de forma individual con una pauta de dosificación comparable.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque ¡el volumen del tumor en el paciente aumenta menos de un 10% durante, un período de tratamiento de seis meses con la terapia combinada.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD19 tiene una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada tal como se mide in vitro.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CDl9 está afucosilado.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD19 es un anticuerpo humano o humanizado.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD19 comprende una CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD19 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo- anti-CD19 comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 5.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CDl9 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivinidaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD20 es. rituximab.