KR20130119674A

KR20130119674A - 섬유아세포 성장인자를 포함하는 알긴산을 유효성분으로 하는 창상 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130119674A
Application number: KR1020120042657A
Authority: KR
Inventors: 박대환; 양재호; 장선미
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2013-11-01

Abstract

본 발명은 섬유아세포 성장인자(FGF)를 포함하는 알긴산을 유효성분으로 하는 창상 치료용 조성물에 관한 것으로 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 통계학적으로 유의할 만한 창상치유 효과를 관찰할 수 있었으므로 섬유아세포 성장인자(FGF)를 포함하는 알긴산 조성물을 창상치유의 지지체로서의 역할을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

섬유아세포 성장인자를 포함하는 알긴산을 유효성분으로 하는 창상 치료용 조성물{A composition comprising alginate with fibroblast growth factor for wound healing}

본 발명은 섬유아세포 성장인자를 포함하는 알긴산을 유효성분으로 함유하는 개방창상 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부조직은 어떤 원인으로든 손상을 입게 되면 생체의 정상적인 리듬이 깨어지게 되어 창상을 치유하려는 반응이 곧 시작되는데, 창상치유는 염증단계(inflammatory phase), 상피화 단계(epithelization phase), 증식단계(proliferation phase) 및 성숙단계(maturatio phase)의 4단계로 구분할 수 있고, 각 단계는 명확한 구분 없이 중첩되면서 연속적으로 진행된다.

창상치유의 네 단계 중에서 임상적으로 가장 중요한 것이 바로 염증단계이다. 이 단계에서 파괴된 조직 부유물 및 괴사된 조직이 급성 및 만성 염증세포에 의해 제거 또는 함입되어야 다음 단계로 이행할 수 있으며, 이 단계가 오래 지속되면 다음 창상 치유과정이 지연된다. 따라서 대부분의 창상치유에 쓰이는 소재들 혹은 약품들도 이 염증단계에 노출된 창상의 지혈을 돕고, 유해한 외부 환경으로부터 창상을 차단하고 보호하며, 미생물의 감염을 예방하고 다음 창상치유 단계로 빨리 치유가 진행될 수 있도록 하는 데에 그 목적을 두고 있다.

최근에 창상치유를 촉진하는 여러 가지 성장인자와 사이토카인(cytokine)들이 소개되고 있고 키토산(chitosan)을 비롯한 많은 생체재료들이 창상치유를 도모하는 목적으로 이용되고 있다. 그 중 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF)는 18 kDa에 달하는 작은 크기의 폴리펩타이드 성장인자들로서 주로 섬유아세포 및 내피세포 혈관 평활근에 의해 생성된다. 이는 내피세포의 세포분열을 돕고, 모세혈관 내피세포의 증식을 유발하여 신생혈관을 증가시키는 혈관형성인자로서 작용하며, 또 섬유아세포, 각질세포 및 근육모세포를 자극한다.

섬유아세포 성장인자군은 폴리펩타이드 구조상 일정부분 동일한 구조를 공유한다고 알려져 있다. 또한 헤파린에 결합능을 보유하고, 분비에 관여하는 신호 전달 물질을 가지고 있으며 세포외로 분비되어 세포외 기질의 heparin-like glycosaminoglycans(HLGAGs)에 결합한다. 이는 표적세포에 직접 작용하기도 하고 세포외 기질내의 소화작용에 의해 혹은 섬유아세포 성장인자 결합 단백에 의해 분비될 수도 있다. 섬유아세포 성장인자는 HLGAGs와 연관된 특이 수용체의 tyrosine kinase에 결합되고 이는 수용체의 이합화와 활성화로 이어져 다양한 신호전달체계를 활성화시킨다.

현재까지 섬유아세포 증식인자는 구조상의 유사성으로부터 23종류로 구분되는데. 그 중 염기성 섬유아세포 증식인자(basic-FGF, bFGF)와 산성의 섬유아세포 증식인자(acidic-FGF, aFGF)가 대표적이다. 이는 중배엽, 신경외배엽 세포에서 분열촉진과 세포주성, 혈관생성의 역할을 하며, 평활근 성장과 상처의 치유, 손상된 조직의 복구를 촉진하는 외에 조혈작용과 신경계, 눈, 골격계의 분화와 기능에도 중요하다.

섬유아세포는 상처 발생 5일경에 나타나서 FGF, PDGF 및 TGF-β등과 같은 성장인자의 자극에 의하여 증식이 되는 한편, 섬유소나 파이브로넥틴에 의하여 새로운 섬유아세포가 지속적으로 상처부위에 모이게 된다. 이렇게 모여든 섬유아세포는 기질을 만들며 교원질을 합성하게 되는데 이 과정은 2-4주정도 지속이 된다. 그 결과 섬유소와 파이브로넥틴으로 구성되었던 초기의 기질이 교원질로 구성된 새로운 기질로 바뀌게 되며, 이 기질은 다시 섬유아세포의 성장과 교원섬유의 합성을 억제하는 역할을 하게 된다.

창상치유를 촉진하기 위해서는 드레싱 재료가 조직내에 이식되었을 때 염증의 정도가 미약하며 조직세포의 접근 및 부착, 함입, 성장을 촉진하여야 하고 촉진된 세포들이 잘 유지되어야 하는데 최근 창상치유를 촉진하고 조직재생 활성에 기여하는 물질로 알긴산(Alginate)이 각광받고 있다.

알긴산(Alginate)은 갈색해조류의 세포벽을 이루는 성분이며 mannuronic acid와 guluronic acid의 block으로 이루어진 이형다당류이다. 최근에 창상치유를 촉진하고 조직재생을 활성화하는 여러 가지 드레싱 재료 및 물질이 소개되고 있는데 그 중 알긴산은 전체적으로 무독성과 점성용액 및 겔(gel)을 형성하는 물성과 더불어서 조직내에 이식되었을 때 염증의 정도가 감소하고 조직세포의 접근, 부착, 함입 및 성장을 촉진할 뿐만 아니라 알긴산에 의해 생성이 촉진된 세포들은 그 표현형(phenotype)이 잘 유지되어 성형외과 및 기타 영역에서 조직재생을 위한 이식물질로서의 가능성을 보고하고 있다. 또한 내시경을 이용한 방광-요관 역류의 치료에서 알긴산의 세포외 지지체로서의 안전성 및 치료효과에 대한 보고도 있다.

알긴산과 관련하여, 대한민국 특허 제10-2008-0052671호 '창상 치료용 알진 조성물'에는 알긴산을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 알긴산 드레싱에 대해 기재되어 있으며, 대한민국 특허 제10-2009-0068738호 '창상치유용 인공피부 대용물질 및 그 제조방법'에는 창상치유용 인공피부의 대용물질로서 알긴산과 알긴산에 콜라겐을 혼합한 형태의 스폰지를 제조하여 살펴본 생체적합성 및 면역반응에 대해 기재되어 있다.

창상치유에 관한 연구가 최근 세포생물학적, 분자생물학적 분야로 더욱 세분화되고 있으며 창상치유 촉진에 관한 임상적 적용 또한 더욱 광범위해지고 있으나 아직도 미세한 세포생물학 및 분자생물학적 기전에는 의문점들이 많다. 또한, 창상치유를 촉진하는 대부분의 성장인자와 사이토카인은 분리·정제해 내기도 어려울 뿐만 아니라 값이 매우 비싸고 모두 외국에서 수입해 쓰는 실정이고 키토산도 창상치유 효과가 약하고 그 기전이 명확히 밝혀져 있지 않으며, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)는 창상치유 촉진에 효과가 있다는 보고가 있으나 인공진피와 같이 사용되는 경우는 지금까지 전무한 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 섬유아세포 성장인자(FGF)를 포함하는 알긴산 복합물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 알긴산 및 FGF를 포함하는 알긴산 환(disc)을 제조하는 단계와; 제조한 조성물을 이용한 동물이식 실험 단계와; 상기 실험을 육안적, 조직학적 및 분자생물학적 평가 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 섬유아세포 성장인자(FGF)를 포함하는 알긴산 환(disc)을 이용하여 창상치유를 극대화하는 생체재료를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 대조군인 바세린 거즈, 알긴산 및 알긴산-FGF 복합물 환이 백서의 등부위 피부에 이식된 모습을 보인 사진도이다.
도 2는 대조군, 알긴산 및 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 창상치유 정도, 창상 상피화 및 상처구축 정도를 나태낸 그래프이다.
도 3은 대조군, 알긴산 및 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 염증소견여부를 조직학적 방법인 헤마톡실린-에오신 염색 및 TGF-β1을 이용한 면역조직학적인 방법을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 대조군, 알긴산 및 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 창상피부의 TGF-β1 및 VEGF 단백질 발현을 나타낸 사진으로 액틴은 비교대조군으로 사용되었다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 바람직한 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명한다.

본 발명에 사용된 실험동물로는 체중 200g - 250g의 Sprague-Dawley종 백서 수컷을 사용하였다. 실험동물은 온도 24 ± 0.5℃, 습도 55 - 65% 및 12시간 주기로 명암이 자동으로 조절되는 사육조건하에서 관리되었으며 약 7일간 환경에 적응시킨 후 실험에 사용되었다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 알긴산 환 및 알긴산-fibroblast growth factor(FGF) 복합물 환 제작

알긴산 공정에서 얻어진 공유결합된 알긴산 환(disc)을 제조하였다. 먼저 1 gram 의 공유결합 알긴산을 100 mL 물에 녹여 1% 용액으로 만든 후 12 well plate 각각의 well에 첨가한 후 동결 냉동 및 건조시켜 원판 모양의 알긴산 제재를 제작하였다. 알긴산-FGF 복합물 disc는 2 ㎍의 FGF을 2 mL의 공유결합된 알긴산에 첨가하여 결합시켰다. FGF가 결합된 1% 알긴산 용액 2 mL를 12 well plate에 첨가한 후 냉동 동결 및 건조시켜 직경 2 ㎝의 원판 알긴산-FGF 복합물 환(disc)을 제조하였다.

실시예 2 : 알긴산 조성물을 이용한 동물이식

실험동물은 에테르(ether)로 흡입마취를 유도한 후 Ketamine-HCL(Ketara^®, 유한양행)을 kg당 5 ㎎ 용량으로 복강내에 주사하여 마취를 유지하였다. 엎드린 자세에서 백서의 등부위 털을 면도한 후 betadine과 alcohol로 소독하고 15번 칼과 조직가위를 이용하여 3곳에 동일한 크기(지금 2 ㎝의 원형창상)와 동일한 깊이의 피부전층창상을 만들었다.

도 1과 같이 각 창상에 적용한 드레싱 재료에 따라서 A, B, C 처리군으로 세분화하여 실험군을 준비하였다. A군에는 바세린 거즈를 사용하였는데, 바세린 거즈는 고식적인 드레싱 재료를 대표하는 물질로서 창상을 습윤하게 유지시켜 주지만 성장인자나 항염증작용을 돕는 성분이 없으므로 대조군으로 사용하였다. B군은 알긴산 환을, C군은 FGF가 공유결합된 알긴산 환을 사용하였다.

모든 처리군에서 수술 후 7일까지는 이틀에 한번씩, 8일부터 그 후 까지는 3 - 4일에 한번씩 드레싱 하였다.

실험예 1 : 창상치유의 육안적 분석

피부전층창상을 만든 후 창상의 테두리를 멸균 처리한 투명 OHP 필름에 따라 그리고 스캔하여 그 면적을 영상분석 프로그램(NIH image analysis system, Bio-Optics사, USA)을 이용하여 창상의 면적을 측정하였다. 피부전층창상 시술 후 5, 10, 15 및 20일에 수술시와 동일한 방법으로 백서를 마취시키고 창상의 면적을 측정하였다. 구한 값을 토대로 창상치유 정도, 창상 상피화 및 상처구축 정도를 분석하였다.

실험결과 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 공유결합된 알긴산을 처리한 군에서 대조군인 바세린군에 비해 상처구축, 창상 상피화 및 창상치유 정도가 통계적으로 유의하게 높게 나타났다. 그뿐만 아니라, FGF가 공유결합된 알긴산-FGF 복합물 처리군의 경우는 다른 두개의 처리군에 비해 현저하게 통계적으로 높은 창상치유 효과를 육안으로 관찰할 수 있었다.

실험예 2 : 창상치유의 조직학적 분석

조직학적인 평가를 위하여 백서에 창상을 만든 후 20일째에 전체 창상을 적출하여 즉시 10% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 6 ㎛ 두께로 잘라 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin)으로 염색하여 관찰하였다.

TGF-β1(transforming growth factor β1)의 단백질 발현을 면역조직학적 분석을 통해 살펴보았다. 파라핀 포매된 피부생검조직을 5 ㎛ 두께로 잘라서 부착제로 처리된 슬라이드에 붙이고 탈 파라핀을 거쳐 함수하였다. 메탄올에 희석한 3% 과산화수소수 용액에서 10분간 처리하여 내인성 과산화효소에 대한 반응을 차단하고 0.01 M 인산염 완충액에서 10분간 세척하였다. TGF-β1(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)에 대한 1차 항체를 37℃에서 1시간 반응시키고, biotinylated anti-mouse IgG(DAKO LSAB kit, USA)를 2차 항체로 사용하여 37℃에서 30분간 반응시키고 DAB(3,3,-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 발색하였다. 그런 다음 헤마톡실린으로 대조염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, 대조군인 바세린군(A)에 비해서 알긴산군(B) 및 알긴산-FGF 복합물군(C)에서 더 적은 염증세포의 발현을 관찰할 수 있었으며, 창상치유와 관련된 사이토카인인 TGF-β1의 발현양도 대조군에 비해 알긴산 및 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 감소하였다.

실험예 3 : TGF-β1 및 VEGF 발현 분석

조직의 재생과 세포분화에서 중요한 역할을 하는 TGF-β1(transforming growth factor β1)과 혈관신생에 관여하는 VEGF(vascular endothelial growth factor)에 대한 단백질 분석을 수행하였다. 조직을 lysis buffer solution(iNtRON biotechnology, Korea)에 넣고 조직분쇄기로 분쇄한 후 얼음 위에서 30분간 반응시키고 30분간 원심분리(4℃, 12,000 rpm)하여 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 iNtRON biotechnology Protein assay kit을 사용하여 정량하였고, 50 ㎍의 단백질을 15% SDS-PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리한 후 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)(Amersham, Netherlands)으로 전이시켜 5% 탈지유가 함유된 TBS 용액으로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 단백질 발현정도를 측정하기 위하여 TGF-β1 및 VEGF에 대한 1차 항체를 TBS에 희석(1 : 1,000)하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 3회 세척하였다. 2차 항체는 anti-rabbit IgG 및 anti-mouse IgG(Santa Cruz, USA)를 1 : 2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 5회 세척하여 ECL(Thermo, Japan)과 반응 후 감광하여 발현 정도를 확인하였다.

실험결과 도 4에서 보는 바와 같이, 반흔 형성에 중요하게 관여하는 염증관련 사이토카인인 TGF-β1의 발현양은 알긴산군 및 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 대조군인 바세린군보다 감소함을 확인하였다. 반흔 형성과정 중 신생혈관 생성인자인 VEGF의 발현도 대조군인 바세린군보다 알긴산군 및 알긴산-FGF 복합물 처리군에서 발현양이 감소하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growht factor)를 포함하는 알긴산 복합물을 유효성분으로 하는 창상 치료용 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 피부의료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

알긴산에 섬유아세포 성장인자(fibroblast growht factor)를 첨가하여 된 알긴산-FGF 복합물을 유효성분으로 하는 창상 치유용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알긴산과 섬유아세포 성장인자의 혼합비를 1 : 1(W/V)로 하여 공유결합한 것이 특징인 창상 치유용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물이 환(disc) 형태인 것이 특징인 창상치유용 의료품