KR20130118086A

KR20130118086A - 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20130118086A
Application number: KR1020120040994A
Authority: KR
Inventors: 이윤식; 정대홍; 이호영; 강호만; 정신영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2013-10-29
Also published as: KR101358729B1

Abstract

본 발명은 실리카 중심 입자; 및 상기 실리카 중심 입자 주변을 둘러싸고 있는 할로우 금속 나노입자층;을 포함하여 이루어진 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자, 그 제조방법 및 그를 이용한 생체 내 광학 검출방법에 관한 것으로, 본 발명은 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자는 근적외선 영역의 파장을 이용하여 생체 내, 예를 들어 피하 조직의 광학영상을 확인할 수 있고, 표면증강 라만산란 강도가 뛰어나며, 생체적합성 및 안정성이 뛰어나므로, 생체 내 다중 광학영상을 얻기 위한 나노 프로브로서 활용될 수 있다.

Description

근적외선 광학영상용 나노-표지 입자 및 그의 제조방법{Nano-tagging particle for optical imaging in near-infrared region and its preparation method}

본 발명은 생체 내 광학영상을 확인하기 위한 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

체내에서 생체리간드를 탐색하기 위한 방법으로 다양한 종류의 신호를 동시에 얻을 수 있는 광학영상(optical imaging) 방법이 적합한 것으로 알려지고 있으며, 최근 들어 금속 나노입자를 이용한 고감도 광학영상 방법이 세포 수준의 영상 또는 의학 진단 분야에서 광범위하게 사용되고 있다.

광학영상을 얻기 위해 종래 사용되어 온 형광 물질의 경우 적절한 조건에서 분자당 수천 개의 광자를 방출할 수 있어 단일분자 수준의 검출까지도 이론적으로 가능하지만, 방사성 동위원소처럼 활성 리간드의 원소를 직접 치환할 수는 없고, 구조 활성관계를 통해 비교적 활성에 영향을 주지 않는 부분을 변형하여 형광물질을 연결해야 하는 제한점이 있다. 또한 이러한 형광 표지물질들은 시간이 지나면서 형광 세기가 약해지며(photobleaching), 여기시키는 빛의 파장이 매우 좁고 발광되는 빛의 파장이 매우 넓어 서로 다른 형광물질 간에 간섭이 있는 단점을 가지고 있으며, 또한 사용할 수 있는 형광물질의 수가 극히 제한되어 있다.

한편 반도체 나노물질인 무기 양자점(inorganic quantum dot; QD)은 CdSe, CdS, ZnS, ZnSe 등으로 구성되어 있으며 크기 및 종류에 따라서 각각 다른 색의 빛을 발광한다. 유기 형광물질에 비하여 넓은 여기 파장을 가지고 있으며 좁은 발광 파장을 나타내기 때문에 구별 가능한 다른 색을 발광하는 가지 수가 유기 형광물질 보다 많다. 이 같은 장점 때문에 최근 들어 유기 형광물질의 단점들을 극복하기 위한 방법으로 양자점이 많이 사용되고 있다. 그러나, 독성이 있고 대량 생산이 힘들다는 단점이 있고, 이론적으로 그 가지 수는 다양하나 실제적으로 사용되고 있는 수는 극히 적어 생물 의학적 활용은 제한되어 있다.

이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법으로 장기간에 걸쳐서 안정성을 유지하며, 생체 적합성 또한 우수한, 금 또는 은 나노입자에 의해서 표지 분자의 진동 산란 광신호의 세기가 증강된 표면증강 라만산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS) 방법이 이용되고 있다. 표면증강 라만산란은 광학신호의 밴드 폭이 1 nm 이하로 매우 좁고, 활용 가능한 라만 표지 물질의 수가 매우 많고, 하나의 광원으로 다중 표지를 동시에 검출할 수 있다는 장점이 있어 다수의 표적에 대한 측정에서 활용도가 증가하고 있다.

한국특허 제10-0979727호는 금 할로우 나노입자를 이용한 광학영상 기술로 암세포와 정상세포를 정확하고 신속하게 판별하는 방법에 관한 것이지만, 할로우 금 나노구체를 단일 나노입자 SERS 작용제로 사용하는 것으로, 나노입자의 응집에 따른 핫스팟(hot spot)에서의 SERS 활성 증대와 균일한 신호 발생 효과를 기대할 수 없으며, 금 나노구체가 생체와 직접 접하게 되므로 나노입자의 안정성 및 생체적합성이 약화될 우려가 있고, 또한 광학영상에 근적외선 영역의 파장을 사용하고 있지 않아 피하 조직의 광학영상에는 적용할 수 없다는 한계가 있다.

또한 한국특허 제10-0845010호는 NIR/MR 이중모드 분자영상용 고분자 입자에 관한 것이지만, 근적외선 영역의 광학영상을 얻기 위하여 NIR 형광물질을 활용하는 점에서 포토블리칭, 형광물질간의 간섭으로 다중 정량 진단에 적용하는데 있어서 한계가 있다.

본 발명은 근적외선 영역의 파장을 이용하여 생체 내 광학영상을 확인할 수 있고, 표면증강 라만산란 강도가 뛰어나며, 생체적합성 및 안정성이 뛰어난 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 상기 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자와 결합할 수 있는 물질의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 실리카 중심 입자; 및 상기 실리카 중심 입자 주변을 둘러싸고 있는 할로우 금속 나노입자층;을 포함하여 이루어진 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자를 제공한다.

상기 실리카 중심 입자는 크기가 50 내지 300 nm, 바람직하게는 80 내지 200 nm로서, 상기 하한치 미만에서는 라만 표면증강 효과가 떨어지고, 상기 상한치를 초과하면 생물학적 응용시 많은 제약을 받을 수 있다.

상기 실리카 중심 입자는 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate) 및 테트라메틸 오르소실리케이트 (tetramethyl orthosilicate)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로부터 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자에서, 상기 할로우(hollow) 금속 나노입자는 할로우 금속 나노껍질, 할로우 금속 나노크레슨트 및 할로우 금속 나노구체와 같은 핵-껍질 형태의 임의의 나노입자일 수 있으며, 바람직하게는 할로우 금속 나노구체이다.

상기 할로우 나노 구체는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu) 등을 포함한 귀금속으로 이루어질 수 있으며, 이중 둘 이상의 합금으로 제조 될 수 있고, 금과 은의 합금이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 금 및 은 할로우 나노입자(hollow Au/Ag nanoparticles)는 금과 은이 합금 형태로 존재하는 나노입자로서, 금의 몰분율이 1 내지 30 %, 은의 몰분율이 70 내지 99 %인 합금이고, 더욱 바람직하게는 금의 몰분율이 2 내지 10 %, 은의 몰분율이 90 내지 98 %인 합금에서 근적외선 영역에서 표면증강 라만산란의 강도가 현저히 증가한다. 상기 금 및 은 나노입자의 최대 흡광파장은 500 nm에서 800 nm 사이에 있으며, 500 내지 600 nm 범위에서 최대 흡광을 나타내는 나노입자가 근적외선 영역에서 표면증강 라만산란의 세기가 크다.

상기 할로우 금 및 은 나노입자의 평균 입자크기가 10 내지 25 nm, 바람직하게는 15 내지 20 nm이고, 할로우 금 및 은 나노입자의 할로우 구조가 완벽히 형성된 나노입자에 비하여, 할로우를 포함하지 않은 은 나노입자에서 할로우 구조가 형성되기 시작하는 중간단계의 할로우 금 및 은 나노입자, 예를 들어 할로우 금 및 은 나노입자와 그 내부의 할로우의 크기가 10 : 1 내지 3 : 2인 나노입자에서 근적외선 영역에서 표면증강 라만산란의 강도가 높고, 할로우의 크기가 상기 범위 미만이거나 상기 범위를 초과하는 경우 표면증강 라만산란의 강도가 급격히 감소한다. 이때 할로우 금 및 은 나노입자의 할로우 크기는 1 내지 8 nm, 바람직하게는 2 내지 6 nm이다.

상기 할로우 금속 나노입자 층의 나노입자 수는 2 내지 200 개로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 120개 이다. 상기 할로우 금속 나노입자 층에는 밀집된 할로우 금속 나노입자 사이에 핫스팟(hot spot) 또는 정션(junction)이라고 불리는 접점이 존재하게 되는데, 이 위치에서는 증강된 라만 산란(surface enhanced Raman scattering) 현상이 더욱 강하게 발생하게 된다. 나노입자의 수가 상기 범위 미만이거나 이상일 경우 핫스팟의 형성이 어려울 수 있기 때문에 표면증강 라만산란의 강도가 감소하게 된다. 한편 밀집된 할로우 금속 나노입자는 단일 나노입자의 신호보다 이론적으로 그 나노입자 개수만큼 강한 신호 강도를 나타낼 수 있다.

상기 할로우 금속 나노입자 표면에는 특정 표지물질로 이루어진 자기조립단층이 코팅되어 있다. 본 발명에서 사용되는 표지물질은 간단한 구조를 가지면서도 뚜렷한 지문 영역에서 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에, 본 발명의 나노-표지 입자에 적합한 물질이라고 볼 수 있다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자에서, 상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF), 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 할로우 금속 나노입자와 결합력이 높은 화학물질이면 제한되지 않고 사용될 수 있다.

상기 "할로우 금속 나노입자와 결합력이 높은 화학물질"은 말단에 티올기(-SH), 아민기(-NH₂), 시아나이드기(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 또는 아자이드기(-N₃)가 존재하는 화학물질을 의미한다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자에서, 상기 할로우 금속 나노입자 층은 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상으로 껍질 층으로 둘러싸여 있다. 껍질 층으로는 실리카뿐만 아니라 고분자나 단백질 등도 포함될 수 있다. 고분자의 경우 친수성 고분자이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올 등이 사용될 수 있고, 단백질로는 알부민, 스트랩타비딘 등이 사용될 수 있다. 상기 껍질 층은 하나 이상의 껍질이 적층된 형태일 수 있다. 상기 껍질로 인하여 나노-표지 입자의 안정성이 증대되고, 물에 대한 용해성이 증대되며, 비특이적인 결합을 방지하고, 자가 형광을 제거할 수 있으며, 나노-표지 입자의 제어되지 않는 응집을 억제하고, 표지 물질의 누출이나 나노-표지 입자 표면에 원치 않는 화합물의 흡착을 억제할 수 있으며, 특정 물질과 결합하는 리간드나 기능기를 도입할 수 있다.

상기 실리카 껍질은 실리카 전구 물질, 즉 테트라에틸 오르소실리케이트 또는 테트라메틸 오르소실리케이트로부터 제조될 수 있고, 두께는 5 내지 10 nm인 것이 바람직하다. 상기 실리카 껍질의 두께가 5nm 미만으로 너무 얇게 되면 표지물질이 코팅된 은 나노입자 층을 외부의 환경으로부터 보호해 줄 수 없고, 10 nm를 초과하게 되면 세포나 생체 조직 등의 생물학적 응용시 제약이 될 수 있는 문제점이 있기 때문에 상기 범위의 두께로 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법은, 실리카 중심 입자를 제조하는 단계; 상기 실리카 중심 입자 표면에 은 나노입자 층을 형성하는 단계; 및 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자를 금 이온과 반응시켜 갈바니 치환 반응에 의해 할로우 금 및 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자를 제조하는 단계;를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법은, 먼저, 실리카 중심 입자는 당 업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다(W.Stober et al., Controlled growth of monodisperse silica spheres in micro size range, J.Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62). 이후, 상기 실리카 중심 입자 주변에 은 나노입자 층을 형성시키는 단계를 거치게 된다(Base Effects on Fabrication of Silver Nanoparticles Embedded Silica Nanocomposite for Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) Homan Kang, Taegyu Kang, Seongyong Kim, Jong-Ho Kim, Bong-Hyun Jun, Jinjoo Chae, Juyoung Park, Dae Hong Jeong, and Yoon-Sik Lee, Journal of Nanoscience and Nanotechnology Vol. 11, 579-583, 2011). 다음으로 상기 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자를 금 이온과 반응시켜 갈바니 치환 반응에 의해 할로우 금 및 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자를 제조하는 단계를 거치게 된다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법에서 상기 갈바니 치환 반응은 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자 분산 용액에 HAuCl₄ 수용액을 첨가하여 할로우 금 및 은 나노입자를 형성할 수 있다. 상기 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자 분산 용액에 첨가하는 HAuCl₄ 수용액의 농도 및 첨가량은 할로우 금 및 은 나노입자의 금의 몰분율이 2 내지 10 %, 은의 몰분율이 90 내지 98 %인 합금이 형성될 수 있도록 결정하며, 예를 들어 1 mg/㎖의 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자 분산 용액 5 ㎖에 0.1 mM HAuCl₄ 수용액 0.5 내지 3 ㎖, 바람직하게는 1 내지 2 ㎖를 반응시킬 수 있다.

HAuCl₄ 수용액의 농도 또는 첨가량이 충분치 않으면 할로우 금속 나노입자의 할로우 구조 형성이 충분치 않고, 근적외선 영역으로의 파장 이동이나 SERS 강도가 낮고, HAuCl₄ 수용액의 농도 또는 첨가량이 너무 많은 경우에도 오히려 SERS 강도가 낮게 된다. 본 발명에서는 HAuCl₄ 수용액의 양을 변화시킴으로써 할로우 금속 나노입자의 할로우의 크기를 조절할 수 있다.

상기 할로우 금 및 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자의 할로우 금 및 은 나노입자 표면에 표지물질을 고정화시키는 단계를 더 포함할 수 있고, 또한 상기 할로우 금 및 은 나노입자 표면에 표지물질을 고정화시키는 단계를 수행한 후, 상기 할로우 금 및 은 나노입자 층 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상 껍질 층을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 적외선 광학영상용 나노-표지 입자를 생체 조직에 주입하는 단계; 및 상기 생체 조직에 주입된 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자와 결합할 수 있는 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 검출하는 생체 내 광학 검출방법을 제공한다. 상기 검출방법에서 사용되는 근적외선 영역 광원의 파장은 650 내지 900 nm 범위, 더욱 바람직하게는 750 내지 850 nm인 것이 생체 조직의 광학영상을 얻는데 바람직하다. 상기 근적외선 영역의 파장을 얻기 위한 여기 소스로 2.5 내지 50 mW, 바람직하게는 10 내지 20 mW의 레이저(LASER)인 것이 바람직하고, 상기 하한치 미만에서는 생체조직에서 표면증강 라만산란을 얻기위한 충분한 침투깊이를 얻을 수 없고, 상기 상한치를 초과하면 생체조직에 영향을 주어 세포를 파괴할 수 있기 때문에 생체 내(in vivo) 광학 검출이 어렵다. 상기 검출방법은 특히 피하 조직 내 검출에 적합하고, 이때 표면증강 라만산란을 얻을 수 있는 피하 조직의 침투 깊이는 1 내지 10 mm이다.

특히 본 발명의 검출방법은 서로 다른 물질과 결합하여 라만 산란을 방출하는 2 이상의 표지물질로 코팅된 할로우 금속 나노입자를 포함하는 청구항 제 1 항 내지 제 14 항 중에서 선택되는 어느 하나의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자를 생체 조직에 주입하는 단계; 및 상기 2 이상의 표지물질에 결합되는 2 이상의 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 동시에 검출하는 단계;를 포함하는 생체 내 광학 다중검출방법에 적용할 수 있다.

본 발명의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자는 근적외선 영역의 파장을 이용하여 생체 내, 예를 들어 피하 조직의 광학 영상을 확인할 수 있고, 표면증강 라만산란 강도가 뛰어나며, 생체적합성 및 안정성이 뛰어나므로, 생체 내 다중 광학영상을 얻기 위한 나노 프로브로서 활용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 근적외선 분자영상용 나노-표지 입자, 즉 할로우 금 및 은 나노입자 코팅된 실리카 나노입자 제조에 사용되는 은나노입자가 코팅된 실리카 나노입자 제조공정을 나타낸 개략도이다.
도 1b는 제조예 1의 1-1의 MPTS 처리된 실리카 나노입자(sillica)의 HR-TEM 사진이다.
도 1c는 제조예 1의 1-1의 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자(Ag NPs coated sillica)의 HR-TEM 사진이다.
도 1d는 제조예 1의 1-1의 은 나노입자의 평균 입자크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 은나노입자 코팅된 실리카 나노입자로부터 본 발명의 하나의 실시예에 따른 할로우 금 및 은 나노입자 코팅된 실리카 나노입자의 제조공정을 나타낸 개략도이다.
도 2b는 제조예 1의 1-2의 나노입자의 사진으로, 각각은 도 2a의 내지 에 대응되는 것으로, 은 은 나노입자 코팅된 실리카 나노입자, 및 은 할로우 금 및 은 나노입자 코팅된 실리카 나노입자의 할로우 구조가 형성되면서 할로우 크기가 커져가는 상태의 나노입자, 는 할로우 구조가 최대로 형성된 할로우 금 및 은 나노입자 코팅된 실리카 나노입자, 는 의 할로우 금 및 은 나노입자 코팅된 실리카 나노입자를 실리카로 코팅한 나노입자의 HR-TEM 사진이다.
도 2c는 도 2b의 의 1과 2 사이 점선이 가리키는 할로우 금 및 은 나노입자 하나의 금 및 은 원자의 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 실험예 1에서 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자의 흡광 밴드 그래프이다.
도 3b는 실험예 1에서 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자를 EDX(Energy-dispersive X-ray spectroscopy)로 측정한 금의 몰분율을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 실험예 1에서 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자의 최대 흡수 파장을 나타낸 그래프이다.
도 3d는 실험예 1에서 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자의 현탁액 색깔을 확인할 수 있는 사진이다.
도 4는 실험예 2에서 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자를 4-플루오로벤젠티올로 표지시킨 후 532 nm와 785 nm의 근적외선 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노-표지 입자의 386 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 실험예 3에서 4-플루오로벤젠티올로 표지된 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자(Au/Ag-HSA, Au/Ag hollow-shell assembly coated silica)의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란의 강도의 매핑(mapping)과 이에 해당하는 SEM 사진을 중첩시킨 사진이다.
도 5b는 실험예 3에서 4-플루오로벤젠티올로 표지된 금 나노입자(Au NP)의 1075 cm^-1에서의 표면증강 라만산란의 강도의 매핑(mapping)과 이에 해당하는 SEM 사진을 중첩시킨 사진이다.
도 5c는 도 5a의 4-플루오로벤젠티올로 표지된 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자(Au/Ag-HSA)와 도 5b의 4-플루오로벤젠티올로 표지된 금 나노입자(Au NP)의 표면증강 라만산란 스펙트럼이다.
도 5d는 도 5a의 4-플루오로벤젠티올로 표지된 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자(Au/Ag-HSA)의 1075 cm^-1에서의 피크의 증강인자(enhancement factor)의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 근적외선 레이저를 이용한 본 발명의 나노-표지 입자의 표면증강 라만산란 신호의 생체 침투 깊이를 확인하기 위한 실험의 개략도이다.
도 6b는 실험예 4에서 본 발명의 나노-표지 입자를 주사하지 않은 피부(non-injectionn)와 피하주사를 한 피부(subcutaneous injection)의 위치를 나타내는 사진이다.
도 6c는 실험예 4에서 쥐에 본 발명의 나노-표지 입자를 피하주사한 후 표면증강 라만산란의 강도를 확인하는 사진이다.
도 6d는 실험예 4에서 쥐의 피하조직에 본 발명의 나노-표지 입자를 주입한 깊이에 따른 표면증강 라만산란의 강도 및 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 6e는 실험예 4에서 3개의 다른 표지물질로 코팅된 본 발명의 나노-표지 입자를 쥐의 피하조직에 주입하여 얻어진 표면증강 라만산란 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 근적외선 분자영상용 나노-표지 입자

1-1: 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자의 제조

티올기가 표면에 도입된 실리카 중심 입자의 제조한 후 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자의 제조하는 공정의 개략도를 도 1a에 나타내었다.

먼저 3 ㎖의 25% 암모니아수(NH₄OH)를 40 ㎖의 무수에탄올에 첨가하였다. 다음으로, 1.6 ㎖의 테트라에틸오르소 실리케이트(TEOS)을 상기 암모니아수와 무수에탄올의 혼합용액에 첨가하고, 이를 25 ℃에서 20 시간 동안 교반하였다. 원심분리 후 에탄올로 5회 세척하여 크기가 평균 150 nm 이하인 실리카 중심 입자를 합성하였다(J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62).

상기 실리카 중심 입자 100 mg을 에탄올에 분산시킨 후, 20 ㎕의 3-머켑토프로필트리메톡시실란((3-mercaptopropyl)trimethoxy silane, MPTS)과 50 ㎕의 25% 암모니아수를 첨가후 25 ℃에서 12 시간 동안 교반하하였다. 이를 원심분리 후 에탄올로 수회 세척하여 표면에 티올기가 도입된 실리카 중심 입자, 즉 MPTS 처리된 실리카 나노입자(silica)를 합성하였다. HR-TEM 사진으로 확인한 MPTS 처리된 실리카 나노입자(sillica)의 평균 입자크기는 125 nm이었다[도 1b].

상기 MPTS 처리된 실리카 나노입자 100 ㎎을 에틸렌글리콜에 3 mM로 용해된 AgNO₃100 ㎖에 분산시켰고, 분산된 MPTS 처리된 실리카 나노입자에 옥틸아민(octylamine) 82.7 ㎕을 첨가하였다. 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리와 에탄올 세척을 통해 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자(Ag NPs coated silica)를 얻었다. HR-TEM 사진으로 확인한 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자(Ag NPs coated sillica)의 평균 입자크기는 150 nm이었다[도 1c].

상기 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자의 TEM 이미지 상에서 115개를 측정한 은 나노입자의 평균 입자크기는 18.3 ± 3.7 nm이었고[도 1d], TEM 이미지 상에서 측정한 실리카 입자 하나당 은 나노입자의 갯수는 66 ± 12 이었다.

1-2: 갈바니 치환반응을 통한 할로우 금 및 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자의 제조

은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자로부터 갈바니 치환반응을 통해 할로우 금 및 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자를 제조하고, 상기 할로우 금 및 은 나노입자층 위에 실리카 껍질층을 형성하는 공정의 개략도를 도 2a에 나타내었다.

상기 1-1의 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자 1 mg/㎖를 분자량 40,000의 8 중량%의 폴리비닐피롤리돈 수용액 5 ㎖에 분산시키고, 그 분산용액에 0.1 mM HAuCl₄ 수용액을 마이크로 펌프를 이용하여 0.75 ㎖/분의 속도로 주입하였다. 상기 HAuCl₄ 수용액의 첨가량에 따라 할로우의 크기가 다른 할로우 금 및 은 나노입자가 형성되므로, HAuCl₄ 수용액의 첨가량을 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ㎖로 각각 달리하여 제조하였다.

HAuCl₄ 수용액을 주입한 후, 금 및 은 나노입자가 안정화되도록 100 ℃에서 10 분간 교반하고, 이 후 교반하면서 실온으로 냉각하였다. 은 나노입자가 표면에 코팅된 실리카 중심 입자는 암갈색을 나타내지만, HAuCl₄ 수용액이 첨가되면 현탁액은 회색이 된다.

상기 반응 혼합물로부터 AgCl을 제거하기 위해 NaCl 포화용액으로 세척하고, 현탁액을 원심분리한 후 증류수로 3회, 에탄올로 2회 세척하여, 실리카 중심 입자 표면의 은 나노입자가 갈바니 치환반응을 통해 할로우 금 및 은 나노입자를 형성한 실리카 입자를 제조하였다.

0.1 mM HAuCl₄ 수용액이 첨가되지 않은 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자의 개략도와 TEM 사진을 각각 도 2a의 ①과 도 2b의 ①에 나타내었다.

은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자에 0.1 mM HAuCl₄ 수용액 1 ㎖를 첨가하여 제조한 할로우 구조가 형성되기 시작한 할로우 금 및 은 나노입자의 개략도와 TEM사진을 각각 도 2a의 ②와 도 2b의 ②에 나타내었다. 도 2b의 ②에서 3 nm 크기의 할로우가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자에 0.1 mM HAuCl₄ 수용액 1.5 ㎖를 첨가하여 제조한 할로우 구조가 조금 더 커진 할로우 금 및 은 나노입자의 개략도와 TEM사진을 각각 도 2a의 ③와 도 2b의 ③에 나타내었다. 도 2b의 ③에서 5 nm 크기의 할로우가 형성된 것을 확인할 수 있었다. 도 2c는 에너지 분산 X-선(energy dispersive X-ray; EDX) 분석에 의한 원소 라인 매핑(elemental line mapping)으로 확인한 도 2b의 의 1과 2 사이 점선이 가리키는 할로우 금 및 은 나노입자 하나의 금 및 은 원소의 프로파일을 나타낸 그래프로서, 상기 금 및 은 나노입자의 할로우 구조를 재확인할 수 있었다.

은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자에 0.1 mM HAuCl₄ 수용액 3 ㎖를 첨가하여 제조한 할로우가 완벽히 형성된 할로우 금 및 은 나노입자의 개략도와 TEM사진을 각각 도 2a의 ④와 도 2b의 ④에 나타내었다. 도 2b의 ④에서 11 nm 크기의 할로우가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 입자 1 mg에 에탄올에 2 mM의 라만 표지 물질인 4-플루오로 벤젠티올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하여, 라만 표지 물질의 자기조립 층이 형성된 할로우 금 및 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자를 얻고, 이 입자를 1 mg의 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 2-프로판올 50 ㎖에 첨가하였다.

상기 반응 혼합물에 27% 암모니아수 2 ㎖를 첨가하고 교반한 다음, 250 ㎕ 테트라에틸오르소 실리케이트 용액(TEOS/2-프로판올, 0.8 v/v %)을 30 분 간격으로 4회에 걸쳐 나누어 첨가한 후 12 시간 반응시켰다. 반응 혼합물은 7000 rpm에서 15 분 원심분리하고 5배의 에탄올에 다시 현탁하여 실리카 껍질층이 형성된 할로우 금 및 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자를 제조하였다.

상기 할로우 금 및 은 나노입자층이 코팅된 실리카 입자에 실리카 껍질층이 형성된 개략도 및 TEM 사진을 도 2a의 ⑤와 도 2b의 ⑤에 나타내었다. 실리카 껍질의 두께는 약 10 nm 두께로 형성되었다.

실험예 1: HAuCl ₄ 수용액 첨가량에 따른 나노-표지 입자의 특성

제조예 1에서 0.1 mM HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ㎖로 각각 달리하여 제조한 할로우 금 및 은 나노입자층이 형성된 실리카 입자의 흡광밴드, 금 및 은의 몰분율 및 최대 흡광파장과 현탁액의 색깔변화를 확인하였다.

도 3a는 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자의 흡광 밴드를 나타낸 그래프로서, HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피가 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ㎖일 때, 각각의 흡광 밴드가 480 nm에서 515, 550, 565, 635, 710 및 825 nm로 이동하였다. 따라서 상기 나노-표지 입자는 Au³ ⁺ 이온의 첨가량에 따라 흡광 파장이 적색으로 이동하고, 근적외선(NIR) 영역에 민감하게 됨을 확인할 수 있었다. 도 3d는 입자 현탁액의 색깔을 확인할 수 있는 사진으로, 0 ㎖일 때 암갈색이었다가, HAuCl₄ 수용액을 첨가하면서 회색으로 변화되었다.

도 3b는 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자의 금의 EDX로 측정한 몰분율을 나타낸 그래프로서, 0.5 내지 1.5 ㎖까지 금의 몰분율이 3 내지 6 % 수준에서 2 ㎖부터 15% 이상으로 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 3c는 HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 달리하여 제조한 나노-표지 입자의 최대 파장을 나타낸 그래프로서, 0.5 내지 1.5 ㎖까지 나노입자의 최대 파장이 500 내지 600 nm 수준이었으나, 2 ㎖부터 600 nm 이상으로 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 레이저원의 파장에 따른 나노-표지 입자의 표면증강 라만산란 강도

제조예 1에서 0.1 mM HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ㎖로 각각 달리하여 제조한 할로우 금 및 은 나노입자층이 형성된 실리카 입자를 532 nm와 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노-표지 입자의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 확인하였다. 이를 위해 4-플루오로벤젠티올의 농도는 일정하게 하였고, 스펙트럼의 강도는 에탄올(882 cm^-1)의 것에 대해 표준화하였다.

도 4는 532 nm와 785 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때 각각의 나노-표지 입자의 386 cm^-1에서의 표면증강 라만산란(SERS) 강도를 나타낸 그래프이다.

785 nm의 근적외선 레이저원으로 여기시켰을 때 HAuCl₄ 수용액의 첨가량을 0.5 내지 1.5 ㎖로 하여 제조한 할로우 구조가 형성되기 시작하는 나노-표지 입자는 은 나노입자가 코팅된 실리카 입자에 비해 386 cm^-1에서 표면증강 라만산란 강도가 3 내지 4 배 급격히 증가하였고, 할로우 구조가 완벽히 형성되어가는 2 ㎖ 이상 첨가하여 제조한 나노-표지 입자에서는 오히려 강도가 급격히 감소하였다. 그러나 532 nm의 레이저원으로 여기시켰을 때에도 HAuCl₄ 수용액의 첨가량을 0.5 내지 1.5 ㎖로 하여 제조한 나노-표지 입자의 표면증강 라만산란 강도가 증가되었으나, 785 nm에 비하여 그 증가폭은 상대적으로 현저히 낮았다.

실험예 3: 근적외선 레이저원에서의 나노-표지 입자의 표면증강 라만산란 활성

나노-표지 입자의 표면증강 라만산란 활성을 확인하기 위하여, 표면증강 라만활성 매핑(mapping)과 SEM 사진 상관관계 방법을 통해 단일입자 표면증강 라만산란 실험을 실시하였다.

제조예 1에서 0.1 mM HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 1.5 ㎖로 하여 제조한 할로우 금 및 은 나노입자 층이 형성된 실리카 입자를 에탄올에 0.1 mg/㎖ 현탁하여, 패턴화된 슬라이드 글라스에 떨어뜨리고 0.5 ㎛ 단위로 785 nm에서 2초 동안, 2.3 mW 광원의 세기로 표면증강 라만산란 강도를 측정하였다.

도 5a는 4-플루오로벤젠티올로 표지된 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자(Au/Ag-HSA)의 표면증강 라만산란의 강도의 매핑(mapping)과 이에 해당하는 SEM 사진을 중첩시킨 사진이다. 상기 Au/Ag-HSA 단일입자의 표면증강 라만산란 신호는 노이즈에 대한 신호 검출비가 높게 나와 명확히 검출되었고, 증강인자는 약 8 ×10⁵ 및 3 ×10⁵이었으며, 검출가능한 나노-표지 입자의 비율 80% 이상이었다.

도 5b는 대조군으로 사용한 4-플루오로벤젠티올로 표지된 80 nm 크기의 금 나노입자(Au NP)[최대 흡광도 548 nm]의 표면증강 라만산란의 강도의 매핑(mapping)과 이에 해당하는 SEM 사진을 중첩시킨 사진이다. 도 5b의 점선의 원으로 표시한 위치의 Au Np은 근적외선 영역의 레이져에서 검출가능한 표면증강 라만산란 신호를 나타내지 못하였다. 다만, 도 5b의 하부의 실선의 원으로 표시한 Au Np 2개가 이중체 형태로 존재하는 경우에만 표면증강 라만산란 활성이 검출되었다. 상기 4-플루오로벤젠티올로 표지된 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자(Au/Ag-HSA)와 금 나노입자(Au NP)의 표면증강 라만산란 스펙트럼은 도 5c에 나타내었다.

4-플루오로벤젠티올로 표지된 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자(Au/Ag-HSA)의 1075 cm^-1 피크에서의 증강인자는 약 2.8 ×10⁵이었고, 그 폭이 좁고 재현성이 높았다[도 5d 참조].

실험예 4: 생체 내 광학 영상( optical imaging ) 및 다중 검출 가능성 확인

제조예 1에서 4-플루오로벤젠티올로 표지되고, HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 1.5 ㎖로 제조한 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자의 표면증강 라만산란 신호의 침투 깊이를 확인하기 위한 실험의 개략도를 도 6a에 나타내었다. 도 6b는 쥐에서 본 발명의 나노입자를 주사하지 않은 피부(non-injection: skin)과 피하주사를 한 피부(subcutaneous injection)의 위치를 나타내는 사진이고, 도 6c는 쥐에서 본 발명의 나노입자를 피하주사한 후 표면증강 라만산란의 강도를 확인하는 사진이다.

도 6d는 쥐의 피하조직에 본 발명의 나노-표지 입자를 주입한 깊이에 따른 표면증강 라만산란의 강도 및 스펙트럼을 나타낸 그래프로서, 785 nm에서 2초 동안, 21.5 mW 광원의 세기의 레이져 광원으로 7 mm 깊이까지도 표면증강 라만산란 신호를 검출할 수 있음을 확인하였다.

제조예 1에서 0.1 mM HAuCl₄ 수용액의 첨가 부피를 1.5 ㎖로 제조한 할로우 금 및 은 나노입자가 코팅된 실리카 나노입자에 표지물질로 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT)을 할로우 금 및 은 나노입자층에 코팅하여 나노-표지 입자를 제조하였다.

상기 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT) 및 4-클로로 벤젠티올(4-CBT)로 각각 표지된 나노-표지 입자를 각각 1 mg/㎖ 농도로 쥐의 피하에 3 mm 깊이에 10 ㎕ 주사하였을 때와, 상기 나노-표지 입자를 혼합하여 동일하게 주입했을 때의 얻은 표면증강 라만산란 스펙트럼을 도 6e에 나타내었다. 3가지 서로 다른 표지물질로 표지된 나노-표지 입자를 생체 내 주입하였음에도, 각각의 표지물질 또는 이와 결합하는 물질의 존재를 동시에 다중 검출할 수 있음을 확인하였다.

Claims

실리카 중심 입자; 및
상기 실리카 중심 입자 주변을 둘러싸고 있는 할로우 금속 나노입자층;을 포함하여 이루어진 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 실리카 중심 입자의 평균 입자크기는 50 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 할로우 금속 나노입자는 할로우 금속 나노구체인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 할로우 금속 나노입자는 할로우 금 나노입자, 또는 할로우 금 및 은 나노입자인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 4 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자는 금의 몰분율이 1 내지 30 %, 은의 몰분율이 70 내지 99 %인 합금인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 5 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자는 금의 몰분율이 2 내지 10 %, 은의 몰분율이 90 내지 98 %인 합금인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 6 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자의 최대 흡광파장이 500 내지 600 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 2 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자의 평균 입자크기가 10 내지 25 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 8 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자와 그 내부의 할로우의 크기의 비율이 10 : 1 내지 3 : 2인 것을 특징으로 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 9 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자의 할로우 크기가 1 내지 8 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 10 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자는 금의 몰분율이 2 내지 10 %, 은의 몰분율이 90 내지 98 %인 합금이고, 최대 흡광파장이 500 내지 600 nm인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 1 항에 있어서, 상기 할로우 금속 나노입자층의 할로우 금속 나노입자 표면이 표지물질로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 4 항에 있어서, 상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
제 12 항에 있어서, 상기 할로우 금속 나노입자층 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상으로 껍질층을 더 포함하여 이루어진 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자.
실리카 중심 입자를 제조하는 단계;
상기 실리카 중심 입자 표면에 은 나노입자층을 형성하는 단계; 및
은 나노입자층이 형성된 실리카 입자를 금 이온과 반응시켜 갈바니 치환 반응에 의해 할로우 금 및 은 나노입자층이 형성된 실리카 입자를 제조하는 단계;를 포함하여 이루어지는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 갈바니 치환 반응은 은 나노입자층이 형성된 실리카 입자 분산 용액에 HAuCl₄ 수용액을 첨가하여 할로우 금 및 은 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법.
제 16 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자의 금의 몰분율이 2 내지 10 %, 은의 몰분율이 90 내지 98 %인 합금이 형성될 수 있도록 상기 은 나노입자층이 형성된 실리카 입자 분산 용액에 첨가하는 HAuCl₄ 수용액의 농도 및 첨가량을 결정하는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자층이 형성된 실리카 입자의 할로우 금 및 은 나노입자 표면에 표지물질을 고정화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법.
제 16 항에 있어서, 상기 할로우 금 및 은 나노입자 표면에 표지물질을 고정화시키는 단계를 수행한 후, 상기 할로우 금 및 은 나노입자층 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상 껍질층을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자의 제조방법.
청구항 제 1 항 내지 제 14 항 중에서 선택되는 어느 하나의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자를 생체 조직에 주입하는 단계; 및
상기 생체 조직에 주입된 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자와 결합할 수 있는 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 검출하는 생체 내 광학 검출방법.
제 20 항에 있어서, 상기 근적외선 영역의 파장은 650 내지 900 nm 범위인 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.
제 21 항에 있어서, 상기 근적외선 영역의 파장의 흥분 소스로 2.5 내지 50 mW의 레이저(LASER)를 이용하는 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.
제 20 항에 있어서, 상기 생체 조직은 피하 조직인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.
제 20 항에 있어서, 상기 피하 조직의 깊이는 1 내지 10 mm인 것을 특징으로 하는 생체 내 광학 검출방법.
서로 다른 물질과 결합하여 라만 산란을 방출하는 2 이상의 표지물질로 코팅된 할로우 금속 나노입자를 포함하는 청구항 제 1 항 내지 제 14 항 중에서 선택되는 어느 하나의 근적외선 광학영상용 나노-표지 입자를 생체 조직에 주입하는 단계; 및
상기 2 이상의 표지물질에 결합되는 2 이상의 물질을 근적외선 영역의 라만 산란을 이용하여 동시에 검출하는 단계;를 포함하는 생체 내 광학 다중검출방법.