KR20130111462A - 지속형 인간 성장 호르몬의 고농도 액상 제제 - Google Patents

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배성민
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Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 고농도 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온 계면활성제 및 등장화제로서의 염화나트륨을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제 및 상기 제제의 제조방법에 관한 것이다.

Description

지속형 인간 성장 호르몬의 고농도 액상 제제{A liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate}
본 발명은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온 계면활성제 및 등장화제로서의 염화나트륨을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제 및 상기 제제의 제조방법에 관한 것이다.
인간 성장 호르몬(human growth hormone, hGH, 하기 "hGH"로 인용됨)은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 22,000의 폴리펩타이드 호르몬으로서 주로 소아의 뇌하수체성 왜소증 치료에 사용되고 있다. 종래에는 사람의 뇌하수체에서 추출한 hGH이 사용되었으나 그 양이 제한되어 치료를 받을 수 있는 사람이 극히 제한되었다. 또한 뇌하수체에서 추출한 hGH를 사용한 환자 중의 일부에서 치명적 신경계 질환인 크루즈펠트-야콥(Creutzfeldt-Jacob) 질병이 발생된 예가 보고되어 이러한 뇌하수체에서 추출한 hGH의 사용은 중단되었다. 최근에는 유전 공학 기술이 발전함에 따라서 대장균, 효모 등에서 hGH의 생산에 성공하였으며, 이러한 유전 공학 방법으로 생산된 재조합 hGH 제제들은 독성 및 임상 시험을 거쳐 1985년 이후에 여러 국가에서 허가를 획득하여 시판되고 있다.
hGH와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 프로테아제 접촉 및 신장 손실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적 단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는 데에 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, PEG를 결합시키는 경우에 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
생리활성 단백질의 생체 내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질전환된 동물세포 등을 배양하여 융합 단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들어, 단백질의 안정성 증가에 효과가 높은 것으로 알려져 있는 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합 단백질이 보고되어 있다(국제공개공보 WO 93/15199 및 WO 93/15200, 유럽특허공개 EP 413,622).
또한, 면역글로불린을 이용하는 방법으로서, 미국 특허 제5,045,312호는 교차결합체를 이용하여 인간 성장호르몬에 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin: BSA) 또는 쥐의 면역글로불린을 결합시킴으로써 변형되지 않은 성장호르몬에 비해 성장호르몬의 활성을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허에서는 교차결합체로서 카보디이미드(carbodiimide) 또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 저분자량의 화학물질만을 개시하고 있을 뿐이다. 이러한 저분자량의 교차결합체를 사용할 경우 비특이적 결합으로 인해 균질한 조성물을 얻기 어려우며, 생체 내 독성을 갖는 문제가 있다. 또한 상기 특허에서는 성장호르몬의 화학적 커플링에 의해 그 활성을 증가시킬 수 있음을 보여줄 뿐이어서, 다양한 종류의 폴리펩타이드 약물에 대해서는 활성 증가의 효과가 나타날 것인지조차 불명확하여, 지속시간 및 혈중 반감기 증가와 같은 단백질의 안정성과의 관련성에 대해서는 전혀 인식조차 못하고 있다.
최근에 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 대한민국 등록특허 제10-0567902호(생체내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체), 및 대한민국 등록특허 제10-0725315호(면역글로불린단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법)에 개시되었다. 상기의 방법으로 생리활성 폴리펩타이드로서 hGH를 적용시켜 지속형 hGH 결합체를 제조할 수 있는데, 지속형 hGH 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 지속형 hGH 결합체는 폴리펩타이드 상의 hGH에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 폴리펩타이드 상의 hGH 에 비해 안정화하는데 매우 어려움이 있다.
제약 산업에서 액상에서의 단백질의 안정성이 문제되었는바, 단백질을 동결 건조하는 방법을 통하여 이러한 안정성 문제를 해결하곤 하였다. 다만, 동결 건조된 단백질 제제는 장기간 안정성을 유지시키는 장점을 가지나, 주사시 용해보조제로 재구성해야 하는 불편함이 따르고, 용해보조제로 재구성하는 경우 또는 동결 건조 과정 중에 중합체 등의 생성으로 다소 활성의 소실을 가져오며, 동결건조 과정에 드는 비용 및 시간 소요의 문제가 있었다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위하여 국제공개공보 WO 93/019776 및 WO 94/003198에서는 안정한 액상 hGH 제제를 개발하여 이를 개시하고 있다. 안정한 액상 hGH 제제를 개발하기 위해서는 탈아미드화, 중합체 형성 및 산화과정에 의한 분해 산물의 생성속도 조절과 같은 hGH의 분해 양상을 조절하는 것이 중요하다. 액상 제제의 온도, pH, 첨가제 등이 분해 산물의 생성 속도에 영향을 미치지만 현재까지 모든 단백질을 안정화시켜 임상에 적용할 수 있게 하는 조성은 아직 알려져 있지 않고 있으며, 특정 단백질에서 안정화 효과를 나타내는 액상 조성이 다른 단백질의 안정화에는 적용되지 않는 경우가 많다. 이러한 목적의 단백질, 구체적으로 상기 문헌에서는 hGH 단백질의 액상에서의 안정성을 극대화시키기 위해서 단백질의 특이 분해 산물 생성 속도를 최소화시킬 수 있는 인자 및 첨가제의 선정 및 이들의 조합이 광범위하게 선행되어야 할 필요가 있음을 개시하고 있다.
또한, 상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 저장기간 연장 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 적합한 비율, 농도 및 종류가 다양하다. 안정화제들을 병용할 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 저장하는 동안 저장 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 용액 중의 단백질을 안정화하기 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다.
특히, 생체 내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 hGH 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 인간 성장 호르몬과 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다. 또한, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역은 각각 물리화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역을 동시에 안정화하여야 한다. 그러나, 상기에서 설명한 바와 같이, 상이한 펩타이드 또는 단백질들은 그들의 물리 화학적 차이점으로 인해, 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있고, 각각의 펩타이드 또는 단백질에 적합한 안정화제들을 병용하는 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있다. 따라서, 지속형 hGH 결합체의 경우 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역을 동시에 안정화할 수 있는 안정화제의 조성을 찾는 것에 많은 어려움이 따른다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제를 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 보관할 수 있도록 안정성을 높이고 단백질 침전을 낮추기 위한 조성을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제를 이용하는 경우, 고농도의 지속형 hGH 결합체의 안정성을 증대시킴으로써 경제적이고 안정한 액상 제형을 제공할 수 있음을 확인하였다. 또한 보존제를 추가로 포함하여도 고농도의 지속형 hGH 결합체를 안정하게 보존할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제, 당알코올 및 등장화제로서의 염화나트륨을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제, 당알코올 및 등장화제로서의 염화나트륨을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제를 제공한다.
본 발명의 지속형 hGH 결합체 고농도 액상 제제는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는 것으로, 지속형 hGH 결합체에 안정성을 제공하며 바이러스 감염의 우려가 없을 뿐만 아니라, 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다. 또한, 본 발명의 액상 제제는 천연형에 비해 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 hGH 결합체를 포함하고 있으므로 통상적인 hGH 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있으며, 고농도의 지속형 hGH 결합체에 대해서도 우수한 안정성을 제공하는 특징을 가진다.
본 발명에서 용어, "지속형 인간 성장 호르몬(hGH, human growth hormone) 결합체"는 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 단백질로서, 천연형 인간 성장 호르몬에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 의미한다. 본 발명에서 용어, "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태를 의미한다.
본 발명에서 용어, "인간 성장 호르몬(hGH, human growth hormone)"은 인간의 성장, 세포 생식(cell reproduction) 및 재생을 촉진할 수 있는 펩타이드 호르몬을 의미한다. 상기 hGH 서열 등의 정보는 NCBI의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있으며, hGH의 활성을 나타내는 한, 천연형 인간 성장호르몬의 서열과 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 더욱더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산의 치환, 제거, 삽입에 의한 변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 유용한 hGH는 천연형 hGH, 이의 변이체, 이의 유도체 또는 이들의 단편의 서열일 수 있다.
본 발명에서 용어, "hGH 변이체"는 천연형 hGH와 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, hGH의 활성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 hGH 변이체는 천연형 hGH에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deleteion) 및 수식(modification) 중에서 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "hGH 유도체"는 천연형 hGH와 비교시 최소한 80% 이상의 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, hGH의 활성을 나타내며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태를 의미한다.
본 발명에서 용어, "hGH 단편"은 hGH의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태로서 hGH의 활성을 보유하는 펩타이드를 의미하며, 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다.
또한, 본 발명에 사용되는 hGH은 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 것이나 모두 가능하며, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 이용하여 제조한 재조합 hGH이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한 면역글로불린의 일부분을 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 일 수 있으며, 상기 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 결합체의 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 지속형 hGH 결합체는 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 hGH와, 천연 IgG를 특정 단백질 분해효소로 처리하거나 재조합 기술을 이용하여 형질전환 세포로부터 제조한 면역글로불린 Fc 영역을 서로 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
이때 이용되는 결합 방법으로, hGH와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 hGH와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다. 즉, 상기 결합체는 인간 성장 호르몬과 면역 글로불린 Fc가 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 형태로 제조하거나, hGH 및 면역글로불린 Fc의 융합 단백질 형태로 제조할 수 있다. 상기 융합 단백질은 hGH 및 면역글로불린 Fc가 펩타이드성 링커를 통해 연결된 형태를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
교차 결합 시 사용되는 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이나 이에 제한되지는 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 지속형 hGH 결합체의 제조를 위해 대한민국 등록특허 제10-0725315호 등이 참고문헌으로서 본 발명에 해당된다. 당업자들은 상기의 문헌에 의해 본 발명에 사용되는 지속형 hGH 결합체를 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "지속형 hGH 결합체 고농도 액상 제제"는 지속형 hGH 결합체를 고농도로 포함하는 액상 제제를 의미한다. 본 발명에서, 상기 지속형 hGH 결합체 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 hGH 결합체를 포함할 수 있으며, 일반적으로 hGH의 치료학적 유효량은 1회용 바이알(single-use vial) 내에 약 1 내지 3 mg 정도가 함유된 양이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 액상 제제에 포함되는 지속형 hGH 결합체의 농도는 1 mg/mL 내지 150 mg/mL, 바람직하게는 15 mg/mL 내지 100 mg/mL, 더욱 바람직하게는 20 mg/mL 내지 100 mg/mL이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 지속형 인간 성장호르몬 결합체 고농도 액상 제제는 기존의 저농도 액상 제제에 비해 단위 제형당 hGH 결합체가 고농도로 존재하여 안정적으로 생체 내로 hGH를 공급할 수 있으며 기존의 액상 제제와 달리 고농도의 hGH 결합체를 침전없이 안정적으로 저장할 수 있는 장점이 있으며, 특히, 20 mg/mL 내지 100 mg/mL의 고농도 hGH 결합체를 포함하여도 안정성을 부여할 수 있는 효과를 가진다.
이러한 본 발명의 지속형 hGH 고농도 액상 제제는 약리학적 유효량의 지속형 hGH 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함한다.
본 발명에서 용어, "안정화제"는 지속형 hGH 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미한다. 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 지속형 hGH 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서뿐만 아니라, 지속형 hGH 결합체에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다.
본 발명에서 용어, "완충용액"은 본 발명의 안정화제에 포함되어 지속형 hGH 결합체가 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 하는 용액을 의미한다. 상기 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소염), 나트륨 시트레이트/시트르산, 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약 상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 완충용액은 아세테이트 완충용액이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 나트륨 아세테이트 완충용액을 구성하는 아세테이트염의 농도는 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 이고, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 6.0이며, 더욱더 바람직하게는 5.2 내지 6.0이다. 본 발명의 일 실시예에서는 pH 5.6인 아세트산나트륨 완충용액이 여러 농도의 지속형 hGH 결합체의 안정에 적합한 것을 확인하였다(표 5).
본 발명에서 용어, "당 알코올"은 본 발명의 액상 제제에 포함되어 지속형 hGH 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 하는 수소화 탄수화물(hydrogenated carbohydrate)를 의미한다. 본 발명에 사용되는 당 알코올의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1% 내지 10%(w/v), 더욱 바람직하게는 5% 내지 10%(w/v)이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 당 알코올은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 만니톨이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "등장화제"는 고농도 지속형 hGH 결합체를 용액 상에서 체내에 투여할 때 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하는 물질을 의미한다. 또한, 상기 등장화제는 지속형 hGH 결합체를 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낼 수 있다. 이러한 등장화제의 대표적인 예로는 수용성 무기염을 들 수 있으며, 바람직한 예로는 염화나트륨을 들 수 있다. 본 발명에 사용되는 염화나트륨의 농도는 바람직하게는 5 mM 내지 200 mM이나, 이에 제한되지는 않으며, 제제에 포함된 성분들은 종류 및 양에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.
본 발명에서 용어, "비이온 계면활성제"는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착되거나 응집되는 것을 방지하여 주는 물질을 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제 및 폴록사머계 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들이 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 80이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 비이온 계면활성제를 액상 제제에 고농도로 사용하는 것은 적절하지 못한데, 고농도의 비이온 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵기 때문이다. 따라서, 본 발명의 용액 제형에는 상기 비이온 계면활성제가 바람직하게는 0.1%(w/v) 이하의 저농도, 더욱 바람직하게는 0.001% 내지 0.1%(w/v), 더욱더 바람직하게는 0.001% 내지 0.05%(w/v) 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, 아세테이트 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 폴리소르베이트 80을 함유하는 안정화제에서 폴리소르베이트 80의 농도가 0.2%(w/v)인 경우 2주 후부터 지속형 hGH 단백질의 침전을 유발함을 확인하였다(표 8).
또한, 본 발명의 상기 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
바람직하게, 본 발명의 상기 안정화제는 당류, 다가 알코올 또는 중성 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
지속형 hGH 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스 ,푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오즈, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 바람직한 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 및 비이온 계면활성제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
특히, 본 발명의 액상 제제는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "보존제"는 제제에서 박테리아 작용을 실질적으로 감소시키는 물질로서, 특히 다회 투여용 제제의 생산을 용이하게 하기 위하여 제제에 포함되는 화합물이다. 잠재적 보존제의 실례로서, 옥타데실디메틸-벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethyl-benzyl ammonium chloride), 헥사메소늄 클로라이드(hexamethonium chloride), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)(알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 벤제소늄 클로라이드(benzethonium chloride) 등이 있으며, 이와 다른 유형의 보존제로는 방향족 알코올, 예를 들면, 페놀, 부틸, 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸이나 프로필 파라벤; 카테콜(catechol), 레조르시놀(resorcinol), 시클로헥산올(cyclohexanol), 3-펜탄올(3-pentanol), m-크레졸(m-cresol) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 액상 제제에서 상기 보존제는 바람직하게는 벤질 알코올 또는 m-크레졸이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 액상 제제에서 상기 보존제는 바람직하게는 1 ㎎/mL 내지 10 ㎎/mL의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 pH 및 완충용액에 따른 면역글로불린 Fc 영역의 안정도를 확인한 결과, pH의 경우, pH 5.6 내지 6.0에서 안정하며 특히 pH 5.6에서 안정도가 보다 뛰어남을 확인하였고(실시예 2 및 표 1), 구연산 나트륨, 아세트산 나트륨 및 히스티딘 완충액 중에서 아세트산 나트륨에서 특히 안정도가 보다 뛰어남은 확인하였다(실시예 3 및 표 2). 이를 기초로 20mg/mL 이상의 고농도의 지속형 hGH 결합체, 및 완충용액, 등장화제인 염화나트륨, 당알코올인 만니톨 및 계면 활성제인 폴리소르베이트 80을 포함하는 액상 제제를 제조하였고, 완충용액이 아세트산나트륨일 경우 보관 2주 후에도 침전이 발생하지 않으며 대조군에 비해서도 높은 안정도를 나타냄을 확인하였다(실시예 4). 또한, 액상 제제에 포함된 당 알코올 및 계면활성제의 농도에 따라 지속형 hGH 결합체에 미치는 영향을 확인한 결과, 만니톨은 5% 내지 10%의 농도에서 안정성을 부여하며, 폴리소르베이트 80은 0.2%(w/v) 미만의 농도에서 침전을 가져오지 않음을 확인하였다(실시예 5). 또한, 본 발명의 액상 제제에 보존제가 포함되는 경우, 지속형 hGH 결합체의 안정성에 영향을 미칠 수 있는지를 확인한 결과, 보존제인 벤질 알코올 또는 크레졸을 포함하는 경우에도 대조군 대비 유사한 안정성을 나타내어, 본 발명의 액상 제제는 반복 투여가 필요한 경우 보존제를 추가로 포함할 수 있음을 확인하였다(실시예 6).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지속형 hGH 결합체 고농도 액상 제제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은 지속형 hGH 결합체; 및 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 알부민-비 함유 안정화제를 포함하는, 안정한 지속형 hGH 결합체 액상 제제를 제조할 수 있는 방법이다.
상기 지속형 hGH 결합체, 액상 제제, 완충용액, 당알코올, 등장화제 및 비이온 계면활성제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 지속형 hGH 결합체 고농도 액상 제제의 제조 방법은 지속형 hGH 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제로서의 염화나트륨을 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며, 구체적으로 a) 지속형 hGH 결합체를 제조하는 단계 또는 제조된 지속형 hGH 결합체를 준비하는 단계; 및 b) a) 단계에서 제조된 지속형 hGH 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제로서의 염화나트륨을 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법의 (b) 단계에서 지속형 hGH 결합체, 안정화제의 혼합시 보존제를 추가로 혼합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법으로 제조한 액상 제제가 보존제를 포함할 경우에는 다회 투여가 가능한 제제로 사용될 수 있다는 이점을 가진다.
본 발명의 실시예에 따르면 아세트산나트륨 완충용액, 등장화제로서 염화나트륨, 당알코올로서 만니톨 및 계면활성제로서 폴리소르베이트 80을 포함하는 안정화제는 고농도의 지속형 hGH 결합체에 대해서도 침전을 유발하지 않고 안정성을 제공하는 안정화제임을 보여주었다(실시예 1 내지 5). 즉, 20.0 mg/mL 이상의 지속형 hGH 결합체의 고농도에서도 침전없이 안정한 액상 제제를 만들 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 액상 제제에 보존제인 벤질 알코올 또는 m-크레졸을 추가로 포함하더라도 안정성이 유지됨을 확인하여, 반복 투여가 필요한 경우 보존제를 추가로 포함할 수 있음을 확인하였다(실시예 6 및 도 2).
본 발명에 따른 지속형 hGH 결합체 고농도 액상 제제는 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 안정화제를 포함하고 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아, 바이러스 감염의 우려가 없고, hGH 폴리펩티드와 면역 글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비하여 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 hGH 결합체에 대해 우수한 안정성을 제공한다. 또한, 상기 액상 제제는 보존제를 포함하여도 안정하여 다회 투여용 제제로서도 사용될 수 있다.
도 1은, 지속형 hGH 결합체의 농도에 따른, 20 mM 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.6), 150 mM 염화나트륨, 5% 만니톨 및 0.005% 폴리소르베이트 80을 함유하는 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 가속 안정성 시험 결과로서, 시료의 안정성을 IE-HPLC를 통해 분석한 그래프이며, 저농도의 지속형 hGH 결합체 액상 제제와 고농도의 지속형 hGH 결합체 액상 제제가 유사한 안정성을 유지하고 있음을 알 수 있다.
도 2는, 20 mM 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.6), 150 mM 염화나트륨, 5% 만니톨 및 0.005% 폴리소르베이트 80을 함유하는 지속형 hGH 결합체 액상 제제에 9 ㎎/mL의 벤질 알코올 또는 3 ㎎/mL의 m-크레졸을 함유하는 고농도 지속형 hGH 결합체 액상 제제의 가속 안정성 시험 결과로서, 시료의 안정성을 IE-HPLC를 통해 분석한 그래프이다. 상기 도 2는 보존제로서 벤질 알코올 또는 m-크레졸을 함유하는 고농도 지속형 hGH 결합체 액상 제제와 보존제가 포함되지 않은 고농도 지속형 hGH 결합체 액상 제제(대조군)가 유사한 안정성을 유지하고 있음을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 좀 더 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 지속형 인간 성장 호르몬( hGH ) 결합체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 약 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD를 인간 성장 호르몬(hGH, 분자량 22 kDa)과 결합시키고, 이를 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역(약 50 kDa) N 말단에 결합시켜, 본 발명의 대표적인 지속형 인간 성장 호르몬 결합체인 hGH-PEG-Fc 결합체를 제조 및 정제하였다.
실시예 2: pH 에 따른 면역글로불린 Fc 영역의 안정성 평가
지속형 hGH 결합체를 구성하는 hGH 폴리펩티드와 면역글로불린 Fc 영역을 구분하여 여러 조건하에서 안정성을 확인하였다. 완충용액과 염화나트륨(NaCl), 만니톨(mannitol), 그리고 폴리소르베이트(polysorbate) 80으로 이루어진 액상 제제를 기초하여 다양한 pH 하에서 면역글로불린 Fc 영역의 안정성을 비교하였다.
하기 표 1과 같은 조성을 각각 면역글로불린 Fc 영역의 완충용액으로 사용하여 40℃에서 4주간 보관 후, 이온 교환 크로마토그래피법 (Ion exchange chromatography, IE-HPLC)을 이용해 안정성 평가를 하였다. 표 2의 IE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 면역글로불린 Fc 영역의 잔존율을 나타낸다.
단백농도 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제
# 1 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 4.8)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 2 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.0)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 3 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.2)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 4 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.4)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 5 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 6 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.8)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 7 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 6.0)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
IE - HPLC (%)
초기 1주 2주 3주 4주
# 1 N/A N/A N/A N/A N/A
# 2 N/A N/A N/A N/A N/A
# 3 N/A N/A N/A N/A N/A
# 4 100.0 89.8 81.8 71.4 N/A
# 5 100.0 91.3 83.3 77.1 67.9
# 6 100.0 91.2 83.1 76.3 66.8
# 7 100.0 91.2 82.6 75.5 65.6
※ N/A: 응집으로 인한 침전으로 데이타 이용 불가
상기 결과에서 보듯이, pH 5.6 (#5) 일 때 4주 후 67.9%의 값을 나타내어 면역글로불린 Fc 영역의 가장 높은 안정성을 나타냈다. 또한 pH 4.8 ~ 5.2 (#1 ~ #3) 일 때는 초기부터 단백 침전이 과다 발생하여 안정성을 평가할 수 없었으며 pH 5.4 (#4) 일 때는 3주 후부터 단백 침전이 발생하였다.
실시예 3: 완충용액에 따른 면역글로불린의 안정성 평가
hGH 시판제형을 바탕으로 완충용액으로 주로 사용하는 아세테이트 (Acetate), 시트레이트 (Citrate), 히스티딘 (Histidine)에 따른 면역글로불린 Fc 영역의 안정성을 비교하였다.
하기 표 3과 같은 조성을 각각 면역글로불린 Fc 영역의 완충용액으로 사용하여 40℃에서 3주간 보관한 다음, 이온 교환 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다. 표 4의 IE-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 면역글로불린 Fc 영역의 잔존율을 나타낸다.
단백농도 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제
# 1 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 2 19.5
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 3 19.5
mg/mL		 20 mM
히스티딘 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
IE - HPLC (%)
초기 1주 2주 3주
# 1 100.0 87.3 76.2 67.8
# 2 100.0 88.9 77.6 68.2
# 3 100.0 86.7 74.6 63.3
상기 표 4에 나타난 결과에서 보듯이, 아세트산 나트륨, pH 5.6(#2)을 완충용액으로 사용한 경우, 면역글로불린 Fc 영역의 잔존율이 88.9%(1주), 77.6%(2주) 및 68.2%(3주)을 나타내었다.
이러한 결과로부터 구연산 나트륨(#1) 및 히스티딘(#3)을 사용한 경우보다 아세트산 나트륨(#2)을 완충용액으로 사용하는 면역글로불린의 Fc 영역의 안정도가 높음을 알 수 있다.
실시예 4: 단백 농도 및 완충용액에 따른 지속형 hGH 결합체의 안정성 평가
상기 실시예 3에서 확인된 완충용액을 기초하여 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성을 비교하였다. 하기 표 5와 같은 조성을 각각 고농도 지속형 hGH 결합체의 액상 제제로 사용하여 25℃에서 4주간 보관 후 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법(Size Exclusion Chromatography, SE-HPLC)을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 6의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 분석 시점에서의 고농도 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다.
단백농도 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제
대조군 19.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.2)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 1 39.0
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.2)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 2 39.0
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 3 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 4 58.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.2)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 5 58.5
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 6 58.5
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 7 78.0
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.2)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 8 78.0
mg/mL		 20 mM
구연산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 9 78.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
IE - HPLC (%) SE - HPLC (%)
초기 1주 2주 3주 4주 초기 1주 2주 3주 4주
대조군 96.20 94.21 90.34 86.39 83.64 97.27 96.73 96.59 96.11 96.09
# 1 96.01 94.76 90.52 88.26 85.77 97.30 97.02 96.77 96.24 95.98
# 2 96.04 92.88 90.16 85.77 83.17 97.21 96.71 96.56 96.16 95.86
# 3 95.99 93.91 90.90 88.75 86.62 97.27 96.73 96.77 96.29 96.09
# 4 96.03 94.71 90.63 88.54 85.71 97.22 97.08 96.58 96.20 95.96
# 5 95.99 92.60 90.12 85.66 83.15 97.19 97.10 96.39 96.00 95.67
# 6 96.03 94.72 90.85 88.56 86.61 97.15 96.69 96.62 96.21 96.02
# 7 96.15 94.53 90.60 88.50 82.53 97.21 96.77 96.61 96.18 95.93
# 8 96.14 92.57 90.11 85.56 82.81 97.20 96.74 96.40 95.95 95.64
# 9 96.17 94.53 90.91 88.66 84.22 97.20 96.76 96.61 96.21 96.02
상기 표 6에 나타난 결과에서 보듯이, 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6 (#3, #6, #9)을 완충용액으로서 사용한 경우, 20 mM 구연산나트륨, pH 5.6을 완충용액으로 사용한 경우(#2, #5, #8)에 비하여 보관 후 4주 내내 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성이 높게 나타났다.
또한, 단백농도가 39.0 mg/mL 내지 78.0 mg/mL로 고농도인 경우에서 구연산나트륨, pH 5.2 (#1, #4, #7) 또는 구연산나트륨, pH 5.6 (#2, #5, #8)를 완충용액으로 사용한 경우, 보관 2주 후부터 단백 침전이 발생하였고, 보관 3주 후에는 단백 침전이 증가하였다.
실시예 5: 당알코올 및 계면활성제 농도에 따른 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성 평가
상기 실시예 4에서 확인된 액상 제제(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6, 150 mM 염화나트륨, 5%(w/v) 만니톨, 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 80)를 기초하여 당알코올 및 계면활성제 농도에 따른 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성을 비교하였다. 이때 당알코올 및 계면활성제의 농도는 시판제형 및 허가기관에서 권고하는 최대 허용범위를 선정하였다.
하기 표 7과 같은 조성을 각각 고농도 지속형 hGH 결합체의 액상 제제로 사용하여 25℃에서 4주간 보관 후 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 8의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 분석 시점에서의 고농도 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다.
단백농도 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제
대조군
-1		 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 1 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 10%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 2 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.2%
폴리소르베이트 80
# 3 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 10%
만니톨		 0.2%
폴리소르베이트 80
대조군
-2		 78.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 4 78.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨(pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 10%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80
# 5 78.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨(pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.2%
폴리소르베이트 80
# 6 78.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨 (pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 10%
만니톨		 0.2%
폴리소르베이트 80
IE - HPLC (%) SE - HPLC (%)
초기 1주 2주 3주 4주 초기 1주 2주 3주 4주
대조군
-1		 96.15 95.06 91.77 89.30 86.42 97.22 96.96 96.87 96.71 96.50
# 1 96.12 95.04 91.68 89.11 86.19 97.22 96.96 96.77 96.15 96.09
# 2 96.12 95.04 91.64 89.14 86.31 97.30 96.94 96.78 96.12 95.96
# 3 96.12 94.88 90.47 87.36 84.10 97.19 96.96 96.69 95.96 95.82
대조군
-2		 96.15 95.08 91.76 89.33 86.40 97.25 96.90 96.86 96.69 96.42
# 4 96.12 95.04 91.65 89.10 86.20 97.26 96.93 96.77 96.17 96.14
# 5 96.07 95.01 91.61 89.07 86.31 97.20 96.94 96.76 96.21 95.97
# 6 96.10 94.95 90.45 87.31 84.10 97.18 96.95 96.62 96.04 95.84
상기 결과에서 보듯이, 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6 일 때 만니톨 및 폴리소르베이트 80은 대조군-1, 대조군-2에서 고농도 지속형 hGH 결합체에 대하여 가장 높은 안정성을 나타냈다. 또한 폴리소르베이트 80의 농도가 0.2% (w/v) 일 때 #2, #3, #5 및 #6 실험군에서는 모든 농도에서 2주 후부터 단백 침전이 발생하였다.
실시예 6: 보존제에 따른 고농도 지속형 hGH 결합체 제제의 안정성 평가
상기 실시예 5에서 확인된 액상 제제(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.6, 150 mM 염화나트륨, 5%(w/v) 만니톨, 0.005%(w/v) 폴리소르베이트 80)를 기초하여 보존제에 따른 고농도 지속형 hGH 결합체의 안정성을 비교하였다. 이때 대표적인 보존제로서 벤질 알코올과 m-크레졸을 선정하였다.
구체적으로, 하기 표 9와 같은 조성을 고농도 지속형 hGH 결합체의 액상 제제로 각각 사용하여 25℃에서 4주간 보관 후 이온교환 크로마토그래피법와 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 10의 IE-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 초기 대비 분석 시점에서의 고농도 지속형 hGH 결합체의 순도를 나타낸다.
단백농도 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제 보존제
대조군 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨
(pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80		 -
# 1 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨
(pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80		 9 mg/mL
벤질 알코올
# 2 39.0
mg/mL		 20 mM
아세트산나트륨
(pH 5.6)		 150 mM
염화나트륨		 5%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 80		 3 mg/mL
m-크레졸
IE - HPLC 초기 대비 순도 (%) SE - HPLC 초기 대비 순도 (%)
초기 1주 2주 3주 4주 초기 1주 2주 3주 4주
대조군 100.00 97.16 96.09 94.04 92.03 100.00 98.97 99.20 98.94 98.79
# 1 100.00 97.88 97.18 94.57 92.52 100.00 99.91 101.15 100.49 100.25
# 2 100.00 98.19 95.92 93.87 92.37 100.00 100.11 100.06 100.30 99.90
상기 결과에서 보듯이, 보존제로서 9 mg/mL 벤질 알코올 및 3 mg/mL m-크레졸을 첨가하는 경우, 대조군 대비 유사한 안정성을 나타내었다.
이러한 결과는, 본 발명의 고농도의 지속형 hGH 결합체를 포함하는 제제는 추가로 보존제를 포함하여도 hGH를 안정화할 수 있음을 나타내는 것으로, 보존제를 포함하는 본 발명의 제제는 반복 투여가 가능한 이점을 지닌다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

  1. 생리활성 펩타이드인 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH)과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 비이온성 계면활성제, 당알코올 및 등장화제로서의 염화나트륨을 함유하는 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완충용액은 아세테이트 완충용액인 액상 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약리학적 유효량의 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체의 농도는 20 mg/mL 내지 100 mg/mL인 액상 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 당알코올은 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 액상 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 당알코올의 농도가 전체 용액 대비 1%(w/v) 내지 10%(w/v) 인 액상 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 5.0 내지 6.0인 액상 제제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도가 5 mM 내지 200 mM인 액상 제제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 액상 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)인 액상 제제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 함유하는 것인 액상 제제.
  11. 제1항에 있어서, 상기 액상 제제는 보존제를 추가로 함유하는 것인 액상 제제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 보존제는 벤질 알코올 또는 m-크레졸인 액상 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 보존제의 농도는 1 ㎎/mL 내지 10 ㎎/mL인 액상 제제.
  14. 제1항에 있어서, 상기 인간 성장 호르몬(hGH)은 천연형 hGH와 동일한 아미노산 서열을 가지는 액상 제제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 액상 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 액상 제제.
  17. 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 액상 제제.
  18. 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 액상 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 액상 제제.
  20. 제1항에 있어서, 상기 결합체는 인간 성장 호르몬 및 면역글로불린 Fc가 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 연결된 형태이거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 연결된 형태인 것인 액상 제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 액상 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 액상 제제.
  23. 인간 성장 호르몬과 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌 글리콜에 의해 결합된 지속형 인간 성장 호르몬(hGH) 결합체, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 아세테이트 완충용액, 만니톨, 폴리소르베이트 80 및 염화나트륨을 포함하는 것인, 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 액상 제제는 보존제를 추가로 포함하는 것인 액상 제제.
  25. 지속형 인간 성장 호르몬 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제로서의 염화나트륨을 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 고농도 액상 제제의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방법은 추가로 보존제를 인간 성장 호르몬 결합체 및 안정화제와 혼합하는 것인 방법.
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