KR20130099335A - 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유효성분인 로바릭산은 케라티노사이트의 PAR-2을 저해하고, 멜라노사이트에서 생성된 멜라노좀의 케라티노사이트로의 전달을 억제하여, 피부의 색소 침착을 감소시키고, 우수한 피부 미백 효과를 나타내며, 멜라닌의 과다 축적으로 인한 피부 색소성 질환의 개선, 예방 또는 치료효과를 나타낸다.

Description

로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 {COMPOSITION FOR WHITENING SKIN COMPRISING LOBARIC ACID AS AN EFFECTIVE COMPONENT}

본 발명은 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

피부의 색은 멜라노사이트와 케라티노사이트의 상호작용을 포함한 다양하고 복잡한 과정에 의해 결정된다. 멜라노사이트 내에서 막 구조의 멜라닌 소체인 멜라노좀이 형성되며 멜라닌은 타이로시네이즈, TYRP1, TYRP2와 같은 타이로시네이즈 유전자 패밀리에 의해 조절되어 만들어져 4단계의 성숙기를 거쳐 멜라노사이트의 수상돌기 쪽으로 이동하며 축적된다. 멜라노좀이 수상돌기 쪽으로 이동하는 것은 Rab27a, 멜라노필린을 가진 수용기에 의해 멜라노좀의 표면과 미오신 Va이 GTP-의존적으로 결합하여 조절된다. 성숙한 멜라노좀이 멜라노사이트에서 빠져 나와 인접해 있는 케라티노사이트로 전달되고, 케라티노사이트 내에서 퍼져 핵 쪽으로 모인 뒤, 분해되고 최종적으로 각질화 과정이 일어난다.

케라티노사이트에서, 멜라닌은 색소형성에 영향을 주고, 피부를 자외선과 다른 피부 질환의 원인들로부터 보호하지만, 반면에 멜라닌의 비정상적인 축적은 기미와 주근깨를 형성시킬 수도 있다.

케라티노사이트에 멜라닌이 과다하게 축적되어 나타나는 피부 색소성 질환으로는, 색소침착증, 예컨대, 주근깨, 유전성대측성색소이상증(遺傳性對側性色素異常症), 망상지단(網狀肢端)색소침착증, 모반(母斑), 예컨대, 편평(扁平)모반, 색소성모반 등과 같은 선천적 색소침착증, 및 기미, 노인성색소반 등과 같은 후천성 색소침착증이 있으며, 또한, 유전적 피부 질환, 예를 들어, 백반, 바덴부르그 증후군, 후천적 피부 질환, 예를 들어, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 기미, 약물치료에 기인한 피부 질환, 예를 들어, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘, 및 감염을 통해 전이된 피부 질환, 예를 들어, 어루러기 등이 있다.

멜라노사이트와 케라티노사이트에서 일어나는 신호 전달과 세포간 상호작용이 피부색소침착에 중요함에도 불구하고, 멜라노좀의 전달과정을 측정, 정량화하는 실험 방법에 대한 연구는 아직까지 부족한 실정이다. 연구를 통해 멜라노좀 전달이 피부색소 침착을 저해하고 케라티노사이트의 식포 능력을 조절하는데 중요한 역할을 하는데 중요한 기작임이 밝혀졌으며, 최근에는 멜라노좀 전달에 대한 연구가 더욱 활발해지고 있다. 수용기에 의한 식포 과정은 0.5-1 마이크로미터 크기의 멜라닌 과립이 세포 내로 삽입되고, 이 때 케라티노사이트에서 생성되는 다양한 인자들이 멜라노좀의 흡수와 식포 능력을 조절한다.

멜라노좀 전달과정이 일어나는 기작에 대한 여러 가지 가설이 있는데, 그 중 하나는 멜라노좀이 멜라노사이트에서 방출되어 인접한 케라티노사이트의 식포 작용으로 흡수된다는 것으로, 이는 가장 인정받고 있는 가설이다. 다른 가설로써, 멜라노사이트의 수상돌기가 케라티노사이트와 접촉하여 함몰된다는 제안, 멜라노사이트와 케라티노사이트의 막이 융합되면서 얇은 돌기에 의해 멜라노좀이 전달된다는 제안 등이 있다.

멜라노좀 전달은 UV 자극, α-멜라닌 자극 호르몬, 케라티노사이트 성장 인자 KGFR/FGFR2b, PAR-2, 렉틴과 네오글리코프로테인, autocrine과 paracrine 호르몬/사이토카인 등과 같은 수많은 요소에 의해 증가한다고 연구된 바 있다.

멜라노사이트와 케라티노사이트가 상호작용할 때 케라티노사이트 세포 내 칼슘이온 신호가 증가하며, 이는 멜라노좀이 세포 내로 전달되는데 필요한 과정이다.

G-단백질이 결합한 수용기인 PAR-2는 멜라노사이트에는 존재하지 않으며, 케라티노사이트 막에 위치하여 식포 작용에 의한 멜라노좀 흡수를 조절한다. PAR-2 수용기는 트립신의 작용으로 바깥쪽 N-말단이 잘려 활성화되고, 새롭게 형성된 N-말단 도메인을 인공적으로 합성한 SLIGRL이나 SLIGKV와 같은 펩타이드를 처리해줌으로써 트립신에 의해 수용기가 잘리지 않고도 PAR-2를 활성화 시킬 수 있다. 이전 연구를 통해 멜라노좀 흡수와 식포 능력에 작용한다고 알려진 PAR-2를 활성화 또는 억제시킴으로써 멜라노좀 전달과 피부 색소 침착을 조절할 수 있을 것이다.

현재까지, 멜라노좀 전달을 측정하기 위한 여러 방법들이 알려져 있다. 이러한 방법들로, 형광 미세입자와 멜라노사이트 세포에서 분리한 멜라노좀을 케라티노사이트 세포에 처리하여 케라티노사이트의 식포 능력을 측정하거나, 멜라노사이트와 케라티노사이트 세포를 공동배양하여 전자 현미경, 공초점 현미경, 유세포 분석기를 통해 측정하거나, 피부 조직 배양을 함으로써 미백효과를 증명하는 방법 등이 있다. 특히, 케라티노사이트에 의한 식포능력의 측정은 색소 전달에 대한 분자학적 기초를 이해하는데 도움이 된다.

한편, 페놀성 화합물에 속하는 로바릭산(lobaric acid)은 지의류 Stereocaulon alpinum 로부터 분리된 화합물로써, 본 화합물에 대하여, 돼지의 백혈구에서 5-리폭시게나아제에 의한 항염증활성을 가지고 있으며 기니피그의 꼬리 수축을 저해하는 효과가 있다는 연구 결과가 보고된 바 있으며, 미국특허공개공보 US2009/0048332호 (2009.02.19 공개)에는 로바릭산을 함유하는 항산화 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허공보 10-2010-0111632호 (2010.10.15 공개)에는 로바릭산의 단백질 타이로신 포스파타제 1B 저해활성 및 이로 인한 항당뇨 내지 항비만 효과가 개시된 바 있으나, 현재까지 로바릭산의 멜라닌 형성 또는 PAR-2에 대한 보고는 없었다.

미국특허공개공보 US2009/0048332호 (2009.02.19 공개) 대한민국 공개특허공보 10-2010-0111632호 (2010.10.15 공개)

The Journal of pharmacology and experimental therapeutics (1997) Volume: 280, Issue: 2, Pages: 770-773

본 발명은 피부 미백용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 로바릭산이 케라티노사이트(keratinocyte)의 PAR-2 (protease activated receptor-2) 활성을 저해함으로써 멜라노좀 전달을 억제하여 피부 색소 침착을 감소시킴을 최초로 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 로바릭산은 페놀성 화합물에 속하며, 하기 화학식 I의 화학구조를 가진다.

<화학식 I>

로바릭산의 세포분열저지 활성 (Morita, H. 등, Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2009년, pp.3679-3681), 근육 자발성 수축 억제 효과 (Gissurarson 등, The Journal of pharmacology and experimental therapeutics (1997) Volume: 280, Issue: 2, Pages: 770-773), 항산화 효과 (US2009/0048332호, 2009.02.19 공개), 항당뇨 내지 항비만 효과 (대한민국 공개특허공보 10-2010-0111632호, 2010.10.15 공개) 등은 알려져 있었으나, 로바릭산의 멜라닌 형성 또는 PAR-2 와 관련한 작용, 효과에 대해서는 밝혀진 바 없었다.

본 발명에서, 로바릭산은 그의 유리 형태 뿐 아니라 약학적, 식품학적 또는 화장품학적으로 허용가능한 염의 형태도 포함한다.

본 발명에서, 로바릭산은 lichen Stereoculon alpinum Laur.로부터 당 분야에 널리 알려진 방법에 의하여 분리될 수 있으며, 또한, 당업자가 당 분야에서 통상 사용되는 방법에 의하여 합성된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 로바릭산을 약 0.00001∼10 중량%, 바람직하게 약 0.01∼3 % 로 포함한다.

본 발명에서, 로바릭산은 멜라노사이트에서 케라티노사이트로의 멜라닌 이동을 억제하여 케라티노사이트 내 멜라닌 축적을 감소시킴으로써 피부 미백 효과를 나타내며, 멜라닌의 과다 축적으로 인한 피부 색소성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

멜라닌의 과다 축적으로 인한 피부 색소성 질환은 색소침착증, 예컨대, 주근깨, 유전성대측성색소이상증(遺傳性對側性色素異常症), 망상지단(網狀肢端)색소침착증, 모반(母斑), 예컨대, 편평(扁平)모반, 색소성모반 등과 같은 선천적 색소침착증, 및 기미, 노인성색소반 등과 같은 후천성 색소침착증 및, 유전적 피부 질환, 예를 들어, 백반, 바덴부르그 증후군, 후천적 피부 질환, 예를 들어, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 기미, 약물치료에 기인한 피부 질환, 예를 들어, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘, 및 감염을 통해 전이된 피부 질환, 예를 들어, 어루러기 등을 포함한다.

본 발명의 한 구현 형태로써, 본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분인 로바릭산에 추가로 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함하여 제형화될 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.

상기한 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 로바릭산의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 로바릭산은 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 적용될 수 있다. 모든 방식의 적용이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구로, 또는 복강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내로 주사되거나, 피부에 직접 적용, 예컨대, 도포될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 형태로써, 본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 효능이 있는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 기재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상, 환, 음료 등의 형태로 사용할 수 있다. 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태일 수 있다.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 로바릭신, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 로바릭산, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 로바릭산, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 로바릭산, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 로바릭산, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 μm), 14호 (1410 μm) 및 45호 (350 μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0 %이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하일 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

본 발명의 다른 구현 형태로써, 본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 효능이 있는 피부 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 개선 또는 예방용 피부 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 유분, 분말, 계면활성제, 보습제, 증점제, 저급 알콜, 피막제, 자외선 흡수제, 금속이온 봉쇄제, 유기 아민류, pH 조정제, 약효성분, 당류, 방부제, 비타민류, 산화 방지제, 향료, 물 등을 포함할 수 있다.

유분의 예로서는, 호호바유, 올리브유, 아보가도유, 피마자유, 야자유, 우지, 경화유, 액상 라놀린 등의 천연유지 및 그 유도체, 카르나우바납, 밀랍, 라놀린 등의 납류, 유동 파라핀, 마이크로 크리스탈링 왁스, 스쿠알린, 바셀린 등의 탄 화 수소류, 스테아린산 등의 고급 지방산류, 세틸알콜, 스테아릴알콜 등의 고급 알콜류, 글리세린모노스테아린산 에스테르, 트리옥탄산 글리세릴, 글리세린모노올레이트, 미리스틴산 이소프로필, 사과산 디이소스테아릴, 디2-헵틸운데칸산 글리세린, 트리2-에틸헥실산 트리메티롤프로판, 트리옥탄산 트리메티롤프로판, 세바신산 디2-에틸헥실 등의 에스테르류, 박하유, 장미유, 시트로네랄 등의 정유류, 디메틸폴리실록산, 데카메틸시클로펜타실록산 등의 실리콘유류 등을 들 수 있다. 유분의 화장료 조성물 내 함유량은, 화장료의 형태, 제형 등에 따라서 적당히 선정되지만, 통상, 화장료 조성물 총 중량 중 0.1∼95중량%로 할 수 있다.

분말의 예로서는, 탤크, 마이카, 카올린, 실리카, 아연화, 운모티타늄, 산화 티탄늄, 산화철, 나일론분말 등을 들 수 있다.

계면활성제의 예로서는, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄지방산 에스테르, 글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌소르비톨지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 변성 폴리실록산 등의 비이온 계면활성제, 팔미트산 나트륨 등의 음이온 계면활성제, 염화스테아릴 트리메틸암모늄 등의 양이온 계면활성제, 베타인, 아미드베타인, 술포베타인, 이미다졸리늄 등의 양성 계면활성화제를 들 수 있다.

보습제의 예로서는, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등을 들 수 있다.

증점제의 예로서는, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜 등의 수용성 고분자, 벤토나이트 등의 점토광물을 들 수 있다.

자외선 흡수제의 예로서는, 파라아미노 안식향산(이하 PABA로 약기함), 글리세릴 PABA, 에틸디히드록시프로필 PABA, 옥틸메톡시신나메이트, 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트, 2,4-디히드록시벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시-4-메틸벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시-4-메틸벤조페논술폰산염, 우로카닌산 에틸에스테르, 2-페닐-5-메틸벤조키사졸, 4-메톡시-4-t-부틸디벤조일메탄, 파라메톡시신남산 에틸헥실 등을 들 수 있다.

금속이온 봉쇄제의 예로서는, 에데트산 4나트륨, 구연산 등을 들 수 있다. 저급 알콜의 예로서는, 에탄올 등을 들 수 있다. 유기아민류의 예로서는, 모노에탄올아민, 트리에탄올아민 등을 들 수 있다. pH 조정제의 예로서는 유산-유산나트륨, 구연산-구연산 나트륨 등의 완충제를 들 수 있다.

약효성분의 예로서는, 판토테닐에틸에테르, 글리실리진산염 등을 들 수 있다. 비타민류의 예로서는 비타민E 또는 그 유도체 등을 들 수 있다. 산화방지제의 예로서는, 토코페롤류, 디부틸히드록시톨루엔, 갈산 프로필 등을 들 수 있다.

당류의 예로서는, 에리스리톨, 자당, 히알론산 등을 들 수 있다. 방부제의 예로서는, 에틸파라벤, 부틸파라벤, 안식향산 나트륨 등을 들 수 있다. 그 외, 상기한 의약 및 식품에 배합할 수 있는 성분 중에서 선택되어 배합할 수도 있다.

본 발명은 피부외용제 형태일 수 있으며, 이러한 피부외용제는 부형제, 안정제, 보습제, 유화제, 흡수촉진제, pH 조정제, 계면활성제, 희석제, 담체 등의 여러가지 첨가성분을 포함할 수 있다. 이들 첨가성분의 구체예로서는, 예를 들면, 전분, 유당과 같은 당류, 황산마그네슘, 탤크, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체, 대두유, 참깨유와 같은 식물유, 동물유 또는 합성유, 고무, 생리식염수 등과 같은 물, 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리알킬렌글리콜 등과 같은 알콜류 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물 내지 피부외용제는, 본 발명의 유효성분과 상기 임의 배합성분의 1종 또는 2종 이상을 혼합해서, 임의의 형태, 제형으로 조제할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물 및 피부외용제는 개별적으로 피부를 미백하고자 하는 피부에 직접 적용하는 것이 바람직하다.

처리되는 영역은 대상의 전체 피부 표면이거나 또는 미백 또는 탈색화가 필요한 영역만을 의미할 수 있다. 조성물의 적용은 피부의 미백 상태를 유지하도록 주기적으로 반복되어야 한다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물 및 피부외용제는 생체내 조건하에서 케라티노사이트 세포 피부층으로 유효성분을 전달할 수 있는 화장품학적으로 허용가능한 량의 국부 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이 담체는 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 생체내 조건하에서 시약을 케라티노사이트 세포 피부층으로 전달할 수 있는 기타 다른 형태를 포함할 수 있다. 바람직하게는 유효성분이 본 발명에 기술된 것과 같은 기능을 수행하도록 담체가 실질적으로 시약과 상호 작용 하지 않아야 한다.

담체의 성분 및 함량은 본 발명의 조성물에 사용되는 유효성분의 함량 등에 의존하며, 담체는 조성물 총 중량에 대하여 약 0.1% 내지 약 99중량%의 양으로 포함될 수 있다. 바람직하게는 담체는 알코올을 포함한다. 다르게는 담체는 당업자에게 공지된 것과 같은 리포솜 또는 수화된 지질 박막층상 (hydrated lipidic lamellar phases)일 수 있다.

담체의 바람직한 배합물은 알코올 (예컨대, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올) 및 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 카르보폴 등의 증점제 및 트랜스커톨 (transcutol)과 같은 침투 강화제가 포함된다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부외용제는 피부를 통해 활성화 물질을 침투시켜 피부를 미백화하도록 하는 여러 가지방법으로 국부 적용될 수 있다. 상기 조성물을 피부 상에서 손으로 문지를 수 있는 겔, 로숀 또는 용액 형태가 바람직하다. 적용 가능한 다른 방법은 에어로졸 스프레이 또는 도포병의 사용이 가능하다. 전형적으로 0.3 내지 1㎖/5-50㎠의 투여량으로 피부상에 적용된다. 이 배합물은 미백을 필요로 하는 부위에 1시간-2시간-6시간-8시간-12시간 주기로 자주 적용될 수 있다. 본 발명에 기재된 투여량이란 피부에 대한 조성물의 적용량 및 횟수를 의미한다. 조성물은 폴리비닐 피롤리돈 또는 폴리메틸피롤리돈과 같은 필름 형성제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 다른 용매, 보습제, 습윤제, 오일, 유화제, 증점제, 희석제, 표면 활성화제, 향미제, 보존제, 산화 방지제, 비타민 및 무기물을 함유하는 화장품용 및 치료용으로 허용 가능한 다른 담체 또는 전색제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 또한 부가적으로 피부 관리 제품에서 통상 사용되는 물질, 예컨대 액체 또는 고체 연화제, 실리콘 오일, 용제, 농축제, 자외선차단제, 피부 미백제, 분사제, 기타 특수 피부-유익성 활성제를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형도, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말계, 분말분산계, 유액계, 겔계, 연고계, 에어졸계, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계 등, 다양할 수 있으며, 예를 들면, 연고제, 용액, 크림, 유액, 화장수, 로션, 젤, 에센스(미용액), 파운데이션, 팩마스크, 루즈, 스틱, 입욕제, 목욕 또는 샤워 젤 또는 액체 비누 등 다양한 제품의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물 내지 피부 외용제는 당업계의 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 유효성분과 함께 배합되는 성분들은 제형에 따라 당업자가 적의 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.

이상 기술한 내용 뿐 아니라, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 기재된 바로부터 발명의 구현 형태를 적절히 변경 내지 응용할 수 있으며, 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 조성물은 로바릭산은 케라티노사이트의 PAR-2을 저해하고, 멜라노사이트에서 생성된 멜라노좀의 케라티노사이트로의 전달을 억제하여, 피부의 색소 침착을 억제 내지 감소시키고, 우수한 피부 미백 효과를 나타낸다.

도1A 및 1B는 SLIGKV에 의해 증가되는 HaCaT 케라티노사이트 세포 내 칼슘 이온 유입이 로바릭산에 의하여 억제되는 것을 확인한 그래프이다(도1B 중 **P<0.01, ***P<0.001 임).
도2A는 로바릭산에 의한 케라티노사이트의 식포 능력 저해 효과를 형광 현미경을 이용하여 확인한 사진이고, 도2B는 동일 저해 효과를 세포 계수하여 나타낸 그래프이다.
도3은 케라티노사이드의 단일 배양 모델을 이용하여 로바릭산에 의한 멜라노좀의 케라티노사이트 내 전달 억제를 확인한 사진이다.
도4는 멜라노사이트와 케라티노사이드의 공동 배양 모델을 이용하여 로바릭산에 의한 멜라노좀의 케라티노사이트 내 전달 억제를 확인한 사진이다.
도5는 인간 인공피부조직을 이용하여 로바릭산의 인공 피부조직에서의 색소침착 저해를 확인한 도로써, 도5A는 SLIGKV의 존재 또는 부재하에 로바릭산(100μM) 처리 전후의 피부조직을 나타낸 사진이고, 도5B는 물질 처리 전후의 사진(도6A)로부터 △L 값을 나타낸 그래프이고, 도5C는 처리 10일째 조직 절편의 멜라닌의 분포를 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 ]

< 제조예1 > 케라티노사이트 및 멜라노사이트 세포주의 단일 배양

불멸화 세포인 human HaCaT 케라티노사이트 세포(아모레퍼시픽)를 10% FBS, 50 units/ml 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에 10% CO2,37℃에서 배양하였다.

불멸화 세포인 human HM3KO 멜라노사이트 세포를 10% FBS, 50 units/ml 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 MEM 배지에 10% CO2,37℃에서 배양하였다.

Mouse melanoma 세포인 melan-a 멜라노사이트 세포를 10% FBS, 50 units/ml 페니실린/스트렙토마이신, 20nM tetradecanoyl phorbol acetate (TPA)가 함유된 RPMI1640 배지에 5% CO2,37℃에서 배양하였다.

이렇게 준비된 세포주들을 하기 실험에서 사용하였다.

참고로, 상기 HM3KO 및 melan-a 멜라노사이트 세포는 멜라닌을 생성하며, 여기서 만들어진 멜라노좀은 인접한 케라티노사이트로 전달된다.

[ 실시예 ]

< 실시예1 > 로바릭산에 의한 세포 내 칼슘이온 이동 저해 효과 확인

상기 <제조예1>의 HaCaT 케라티노사이트를 96웰 (black well, clear bottom) 플레이트에 배양 후 다음날 2 μM Fluo-4 AM, 0.02% Pluronicㄾ F-127, 2.5mM 프로베네시드가 함유된 HBSS 용액과 30분간 호일에 싼 채로 배양기에서 배양하였다. 15분간 상온에서 흔들어준 뒤, PAR-2를 활성화시키는 SLIGKV (Bachem, 20 μM) 또는 트립신을 (시그마 알드리치, 2 unit/ml)을 모든 웰에 처리하여 활성화시켰다.

로바릭산 0, 2, 10, 20 μM 처리는 따로 플레이트에 적정한 농도에 맞춰 미리 제조한 뒤, 기계에 삽입하여 (Flexstation3 기계의 reader가 한 열씩 읽으므로) 각 열당 3분 간격으로 50ul씩 처리하였다.

세포 내 칼슘이온 농도를 Flexstation 3 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 형광 세기를 시간 별로 측정하였다. 실험은 3번 이상 수행했으며, 펩타이드(SLIGKV 또는 트립신)에 의해 잘려진 기질의 양은 SoftMAx Pro로 분석하였으며, SigmaPlot 10.0으로 정량화하였다. 세포 내 칼슘이온의 이동양은 최대값에서 최소값을 빼 계산하였다. 그 결과를 도1에 나타내었다.

도1A에서 확인되는 것처럼, SLIGKV (도1A 위), 트립신 (도1A 아래)에 의하여 유도된 세포 내 칼슘 이온 증가가 로바릭산에 의하여 농도 의존적으로 억제되는 것이 확인되었다. 또한, 도1B에서 확인되는 것처럼, 2μM, 10μM, 20μM의 로바릭산이 각각 HaCaT 케라티노사이트 세포 내에서 SLIGKV에 의해 활성화 되었을 때의 칼슘이온의 유입을 음성대조군인 DMSO 대비 1%, 34%, 73% 감소시켰고, 트립신에 의해 활성화되었을 때와 비교하여 8%, 26%, 54% 감소시켰다.

PAR-2 가 활성화되면, 세포 내부의 칼슘 이온의 양이 증가하는바, 위 결과는 SLIGKV 또는 트립신에 의해 활성화된 PAR-2 가 로바릭산에 의하여 농도 의존적으로 억제되었음을 의미한다.

< 실시예2 > 로바릭산에 의한 케라티노사이트의 식포 능력 저해 효과 확인

상기 <제조예1>의 HaCaT 케라티노사이트 세포를 24시간 동안 배양 후 로바릭산(0 (대조군, 이하 동일함), 5, 10 μM)과 PAR-2를 활성화시키는 SLIGKV(Bachem, 20 μM)를 함께 6시간 동안 처리한 뒤 붉은색 형광을 띄는 FluoShperesㄾ 형광 미세입자(인비트로젠; 제조사 설명서에 따라 미리 제조한 용액, 적정한 처리농도는 예비실험에 의해 결정하여 1/50으로 처리하였음)를 배지에 1/50으로 희석하여 16시간 동안 호일에 싸서 배양하였다. 세포를 DPBS로 세척해 준 뒤, 배지를 넣어주고 15분간 배양한 뒤, DPBS를 이용하여 결합하지 않은 미세입자를 제거하기 위해 여러번 세척하였다. 세포를 안정화시키기 위해 FBS를 15분간 처리해주고, 3.7% 포름알데하이드를 이용하여 10분간 고정한 뒤 핵을 식별할 수 있도록 DAPI를 이용하여 3분간 염색하였다. 음성대조군으로 DMSO를 사용하였다. 이미지는 형광 현미경으로 확인하였으며, 그 결과를 도2A에 나타내었다.

세포 내로 전달된 형광 미세입자를 정량화하기 위하여 구간당 총 20개의 세포가 무작위로 선별되어 3명의 사람이 각각 3회 계수하였다. 실험은 3번 이상 수행하였으며, 그 평균값을 도2B에 나타내었다.

도2A에 나타난 바와 같이, SLIGKV에 의해 HaCaT 케라티노사이트 세포 내로 전달된 형광입자의 양이 음성 대조군인 DMSO에 비해 확연하게 증가한 것을 확인하였다. 반면, 로바릭산에 의하여 세포 내로 유입되는 형광입자의 수는 농도 의존적으로 감소한 것을 확인하였다(도 2A).

한편, SLIGKV에 의해 PAR-2 활성화된 HaCaT 케라티노사이트는 음성대조군인 4.8 ± 0.9개에 비해 상당히 증가한 21.9 ± 2.1개이었고, 로바릭산을 5μM 처리시 9.4 ± 0.9개, 10μM 처리시 5 ± 1.0개로 감소한 것을 확인하였다(도 2B). 이는 로바릭산이 SLIGKV에 의해 활성화되는 케라티노사이트 세포의 식포 능력을 감소시킨 것을 확인한 것이다.

< 실시예3 > 로바릭산에 의한 멜라노좀의 케라티노사이트 내 전달 억제 효과 확인-단일 배양 모델

상기 <제조예1>의 Melan-a 멜라노사이트 세포를 250mM 수크로오스 완충액(20 mM Tris-HCl(pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 처리한 뒤 긁어서 수집하였다. 세포를 얼렸다 녹이기를 두번 반복하여 파쇄한 뒤, 1000xg에서 5분간 원심 분리하여 세포 부유물과 핵을 분리하고, 상등액을 모아 그와 같은 양의 1.5M 수크로오스 완충액(20 mM Tris-HCl (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 넣어주고 50000xg에서 30분간 원심 분리하여 멜라노좀을 분리하였다.

상기 <제조예1>의 HaCaT 케라티노사이트 세포를 24시간 배양한 뒤, 6시간 동안 SLIGKV와 로바릭산(0, 10 μM)을 함께 처리 후, 앞서 분리한 멜라노좀(예비 실험을 통해 적정한 농도를 처리하였음)을 첨가하였다. SLIGKV와 로바릭산은 저해효과를 향상시키기 위해 하루에 두 번 처리하였다. 멜라닌 양을 측정하고 0.1% 은 용액으로 염색함으로써 멜라노좀의 전달 저해를 확인하였다. 그 결과를 도3에 나타내었다.

도3에서 확인되는 바와 같이, PAR-2를 활성화시키는 펩타이드인 SLIGKV를 처리에 의하여, 멜라노좀이 HaCaT 케라티노사이트의 핵쪽으로 흡수되는 양이 증가하는 것이 확인되었다(도3 가운데). 특히, 시간 경과에 따라 흡수되는 멜라노좀의 양이 DMSO 음성 대조군(도3 위)에 비하여 증가하는 것이 확인되었다(도3 가운데). 그러나, 로바릭산과 SLIGKV를 함께 처리시 HaCaT 케라티노사이트의 핵쪽으로 흡수되는 멜라노좀의 양이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도3 아래).

< 실시예4 > 로바릭산에 의한 멜라노좀의 케라티노사이트 내 전달 억제 효과 확인-공동 배양 모델

상기 <제조예1>의 HM3KO 멜라노사이트 배양 24시간 후, DPBS로 세척 후 같은 플레이트에 SLIGKV와 로바릭산(0, 10μM)을 함께 6시간 동안 선처리한 HaCaT 케라티노사이트를 멜라노사이트의 10배의 양으로 첨가하고 10% FBS, 50 unints/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지에서 공동 배양하였다.

48시간 뒤, 세포를 EtOH과 아세트산을 3:1로 혼합한 고정액으로 5분간 고정시킨 뒤, DPBS로 충분하게 세척한 뒤, 블록킹 용액(5% goat serum and 0.4% Triton X-100 in PBS)에 1시간 동안 두었다. 첫 번째 1차 NKI/beteb 항체(Mouse monoclone to NKI/beteb antibody, Abcam)를 블록킹 용액에 1:20의 비율로 희석하여 4℃에서 밤새도록 반응시킨 뒤, FITC-결합 2차 항체(Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjucted Goat polyclonal to Mouse IgG second antibody, Abcam)를 1:200의 비율로 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 뒤, cytokeratin에 대한 1차 항체(Rabbit polyclonal to wide spectrum Cytokeratin antibody, Abcam)를 1:200의 비율로 희석하여 1시간 동안 상온에서 반응 시킨 뒤, PE-결합 2차 항체(Phycoerythrin (PE)-conjucted Donkey polyclonal to rabbit IgG second antibody, Abcam)를 1:200의 비율로 반응시켰다. 형광 사진은 공초점 현미경으로 촬영하였으며, 음성 대조군은 1차 항체 없이 2차 항체만 처리해 주었다. 그 결과를 도4에 나타내었다.

도4에 나타난 것처럼, HM3KO 멜라노사이트와 HaCaT 케라티노사이트를 48시간 동안 공동 배양한 뒤, 멜라노좀내 단백질인 NKI-beteb을 표지하여 공초점 현미경으로 확인한 결과, 멜라노사이트 내뿐 아니라 HaCaT 케라티노사이트 내에서도 멜라노좀을 확인할 수 있었다. HaCaT 케라티노사이트 내로 전달된 멜라노좀의 양은 SLIGKV를 처리했을 때 DMSO에 비해 증가하였지만, 로바릭산을 함께 처리시 감소한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 로바릭산의 인공 피부조직에서의 색소침착 저해 효과 확인

사람의 인공피부조직을 이용하여 멜라노좀 전달억제에 의한 피부 미백 효과를 확인하였다.

아프리카계 미국인의 멜라노사이트와 케라티노사이트가 여러 층으로 분포하고 있는 표피층(Melanoderm^® (MatTek Corp., Ashland, MA, USA))은 EPI-100-NMM-PRF 배지로 배양하였다. MatTek Corp. 설명서에 따라서 조직을 인수한지 3일째부터 SLIGKV와 로바릭산 처리를 하였다.

조직은 37℃, 5%의 CO₂에서 배양하며, 로바릭산은 100μM로 DPBS에 희석하여 10-25ul를 조직 인서트의 윗부분에 직접 처리하였으며, PAR-2를 활성화시키는 펩타이드인 SLIGKV(100μM)를 포함한 신선한 배지는 5ml씩 조직 인서트의 바깥쪽에 첨가하였다. SLIGKV와 로바릭산은 일주일에 세 번씩 처리해 주었다. 조직 사진은 물질을 처리하기 직전 현미경과 디지털 카메라로 촬영하였으며, 4번의 물질 처리 후 10일째 되는 날 조직을 10% 포르말린에 고정하여 표준 실험절차에 따라 파라핀화, F&M, H&E 염색을 수행하여 멜라닌 분포와 표피의 형태를 확인하였다.

디지털 카메라로 촬영한 조직의 이미지 분석은 포토샵CS5를 이용하였다. 하나의 조직 인서트 내에 항상 일정한 위치를 원모양으로 선택하여 Blur → Average를 선택하여 색상을 균일화 시킨 후 L*값을 측정하였다. Treat 0~4까지의 사진을 분석하여 △L = (LT0-LT1~4)값을 산출하여 꺾은선 그래프로 그래프화하였다.

그 결과를 도5에 나타내었다.

SLIGKV를 처리한 조직은 색소 침착이 증가한 반면, 로바릭산을 처리한 조직은 로바릭산과 SLIGKV를 함유한 배지를 처리해주기 직전에 촬영한 Day 1사진과 비교하였을 때, 덜 어두워졌다(그림 5A). 이미지 분석을 통해 산출한 L값에서 로바릭산과 SLIGKV 처리 전의 L0값을 빼 준 것으로 L값 차이를 구하여 그래프화하였으며, 이를 통해 로바릭산이 사람의 인공피부조직에서 미백 효과를 나타내는 것을 확인하였다(그림 5B). 또한 로바릭산과 SLIGKV 처리 후 10일째 되는 날의 조직 절편을 F&M 염색함으로써 멜라닌의 분포를 확인하였다. 그림 5C에 나타난 것처럼, 인공 피부조직의 색소 과립의 분포가 SLIGKV를 처리한 조직에서는 DMSO에 비해 증가하였으나, 로바릭산을 처리한 조직에서 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 로바릭산이 피부의 색소 침착을 조절함을 확인한 결과이다.

Claims (4)

1. 로바릭산(lobaric acid)을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환은 주근깨, 유전성대측성색소이상증(遺傳性對側性色素異常症), 망상지단(網狀肢端)색소침착증, 모반(母斑), 편평(扁平)모반, 색소성모반, 기미, 노인성색소반, 백반, 바덴부르그 증후군, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘 및 감염을 통해 전이된 피부 질환, 또는 어루러기인 약학적 조성물.
3. 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 또는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물.
4. 로바릭산을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 또는 멜라닌 과잉 축적에 기인한 피부 색소성 질환의 개선 또는 예방용 화장료 조성물.

Images