KR20130097628A - Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: An antibody-drug conjugate (ADC) is provided to show superior treatment effect compared with an existing conjugate because large drugs are conjugated to antibodies. CONSTITUTION: A lipoprotein variant is able to encapsulate a drug and has a hydrophilic region in which one or more amino acid residues are substituted with cysteine. The hydrophilic region is exposed to the outside of the lipoprotein when the drug is encapsulated. A nanostructure is prepared by encapsulating the drug in a three-dimensional structure of the variant lipoprotein. An ADC has lipoprotein and an antibody which are linked directly or by a linker and contains the drug encapsulated in the three-dimensional structure of isolated lipoprotein.

Description

아포리포단백질을 포함하는 항체-약물 결합체{Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein}Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein

본 발명은 아포리포단백질을 포함하는 항체-약물 결합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질, 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체, 상기 나노구조체의 제조방법, 상기 나노구조체와 항체가 결합된 항체-약물 결합체 및 상기 결합체의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to antibody-drug conjugates comprising apolipoproteins, and more particularly, to the present invention, wherein one or more amino acid residues of a hydrophilic region exposed to the outside of the lipoprotein can be captured by cysteine. Substituted mutant lipoproteins, nanostructures in which a drug is trapped in the three-dimensional structure of the mutant lipoproteins, a method for preparing the nanostructures, an antibody-drug conjugate in which the nanostructures and antibodies are combined, and a method for preparing the conjugates It is about.

항체(antibody)는 현재 진단용, 치료용으로 널리 사용되고 있다. 지금은 항체가 하나의 치료용 약물로 인정받고 있다. 현재까지, FDA의 승인을 받은 28개의 치료용 항체는 광범위한 질병 치료제 (예. 이식거부반응, 암, 자가면역질환과 염증, 심장질환, 전염성 감염 등)로 사용되고 있다. 최근에는 기존의 항체의 효능을 향상시키기 위해 소위 antibody-drug conjugate(ADC; 도 1)라 불리는 항체와 약물의 결합체가 개발되고 있다. ADC를 이용함으로써 단클론 항체의 특이성과 약물의 세포독성을 결합함으로써 두 구성요소의 좋은 점을 조합 가능하기 때문이다.Antibodies are currently widely used for diagnostic and therapeutic purposes. Antibodies are now recognized as a therapeutic drug. To date, 28 therapeutic antibodies approved by the FDA have been used to treat a wide range of diseases (eg, transplant rejection, cancer, autoimmune diseases and inflammation, heart disease, infectious infections, etc.). Recently, in order to improve the efficacy of existing antibodies, a combination of an antibody and a drug called a so-called antibody-drug conjugate (ADC; FIG. 1) has been developed. The use of ADC combines the goodness of the two components by combining the specificity of the monoclonal antibody with the cytotoxicity of the drug.

전통적인 화학 요법(chemotherapy)에서 항암제는 빠르게 증식하는 세포를 죽일 뿐, 정상 세포와 종양 세포 또는 종양 조직을 차별화 하지 못한다. 화학 요법으로 인한 비 종양 특이적(non-tumor specific) 전신 독성 (systemic toxicity)과 세포독성 때문에 항암제의 치료지수(therapeutic index)와 치료영역(therapeutic window)이 낮다. 이는 암 치료에서 세포독성 약물의 결점이다. 또한, 장기 치료 시 항암제에 대한 내성을 야기시킬 수 있어 세포독성 약물이 암 세포만 타겟팅하여 사멸시키는 향상된 치료요법이 절실히 요구되고 있다.In conventional chemotherapy, anticancer agents only kill rapidly proliferating cells and do not differentiate between normal cells and tumor cells or tumor tissues. Therapeutic index and therapeutic window of anticancer drugs are low because of non-tumor specific systemic toxicity and cytotoxicity due to chemotherapy. This is a drawback of cytotoxic drugs in cancer treatment. In addition, there is an urgent need for improved therapies in which long-term treatment may cause resistance to anticancer drugs, and thus cytotoxic drugs may target and kill only cancer cells.

세포독성 약물과는 달리, 종양 세포의 표면에 있는 특정 항원에 결합하는 단클론 항체는 종양에 특이적으로 결합하므로 비 종양 특이적 전신 독성을 낮추는 대안 치료요법이다. 실제로, 암 세포의 표면에 우선적 또는 독점적으로 발현되는 항원들이 확인되었고 종양과 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제작 및 생산할 수 있으며, 이러한 항체가 종양 세포와 결합되면 세포 사멸 효능을 발휘한다. 이러한 항체는 대부분 상당히 약한 항종양 활성를 가지고 있어 종종 항암제와 함께 사용하여야만 항체의 세포사멸 효능을 향상시킬 수 있다. 치료용 약물로서 항체는 화학약물과 비교하여 장점을 가지고 있지만 소수의 항체만이 암 치료용으로 유용한 이유는 대부분의 항체가 표적을 인식하는 능력만을 지니며 암세포를 죽이는 효능은 그다지 높지 않기 때문이다.Unlike cytotoxic drugs, monoclonal antibodies that bind to specific antigens on the surface of tumor cells are alternative therapies that lower non-tumor specific systemic toxicity because they specifically bind to tumors. Indeed, antigens that are preferentially or exclusively expressed on the surface of cancer cells have been identified and monoclonal antibodies that specifically bind to antigens associated with tumors can be produced and produced, and these antibodies, when combined with tumor cells, exert apoptosis effects. . Most of these antibodies have very weak antitumor activity, so they can often be used in combination with anticancer agents to improve the apoptosis efficacy of the antibodies. Antibodies as therapeutic drugs have advantages over chemicals, but only a few antibodies are useful for the treatment of cancer because most antibodies have the ability to recognize targets and are not very effective in killing cancer cells.

이러한 이유로 항체의 장점인 암세포를 타겟팅하는 능력과 항암약물의 장점인 세포를 사멸시키는 능력을 조합하려는 기술인 ADC(Antibody-drug conjugate)의 개발이 이루어지고 있다. ADC를 위해서는 약물, 항체, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커가 필요하다. 치료용으로 사용할 ADC에는 다음과 같은 성질이 필요하다. 첫째, 약물이 부착된 ADC는 원래의 항체와 같은 특성이 필요하다. 즉, 약물 부착 여부와 상관없이 항원을 잘 인식하는 능력을 보유하고 있어야 한다. 둘째, 혈류에 안정하여 약물이 항체로부터 떨어져 나오지 않아야 한다. 약물이 쉽게 항체로부터 유리되면 정상적인 조직에 피해를 입힐 수 있기 때문이다. For this reason, the development of an ADC (antibody-drug conjugate), which is a technology for combining the ability to target cancer cells, which is an advantage of antibodies, and the ability to kill cells, which is an advantage of anticancer drugs, is being made. ADCs require drugs, antibodies, and linkers that link antibodies to drugs. Therapeutic ADCs require the following properties: First, drug attached ADCs need the same properties as the original antibodies. That is, they must have the ability to recognize antigens, whether or not they are attached. Secondly, it should be stable in the bloodstream and the drug should not come off the antibody. If the drug is easily released from the antibody, it can damage normal tissues.

약물을 항체에 부착시키기 위해서 일반적으로 사용되는 링커(linker)는 산성에 민감한 하이드라존(hydrazones), 프로티아제에 민감한 펩티드, 환원제에 민감한 디설피드(disulfide) 및 티오스터(thioster) 등이 있다. Linkers commonly used to attach drugs to antibodies include acid-sensitive hydrazones, proteases-sensitive peptides, reducing agents-disulfides, and thiosters. .

그러나, 지금까지 개발된 대부분 ADC는 IgG 골격에 최대 8개 이하의 약물이 항체의 라이신(lysine) ε-아미노기(amino group)에 공유 결합(covalent conjugate)하게 되므로, 이처럼 적은 수의 약물로도 항암효과를 나타내기 위하여는 일반적인 항암제보다도 강력한 세포독성을 나타내는 약물을 사용하여야 하고, 약물에 따라서는 항체에 결합가능하도록 약물의 화학적 구조를 변형시켜야 하며, 상기 약물은 소수성 효과(hydrophobic effect)에 의하여 항체가 침전되지 않도록 높은 수용성을 나타내어야 하고, 항체의 항원인식 부위가 변형될 가능성을 방지하기 위하여 결합반응을 최소화하여야 할 필요성이 있었으나, 이러한 조건을 만족시키는 ADC는 보고되지 않고 있는 실정이다.
However, most of the ADCs developed so far have up to 8 drugs in the IgG backbone covalently bonded to the lysine ε-amino group of the antibody. In order to have an effect, a drug that shows stronger cytotoxicity than a general anticancer agent should be used, and depending on the drug, the chemical structure of the drug must be modified to be able to bind to the antibody, and the drug has a hydrophobic effect. It was necessary to minimize the binding reaction in order to prevent high precipitation and to prevent the possibility of modification of the antigen recognition site of the antibody, but ADC that satisfies these conditions has not been reported.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 소량의 약물로도 항암효과를 나타낼 수 있는 ADC를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 2~8개 분자 아닌 수백개 분자의 약물을 포집할 수 있을 뿐만아니라, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질을 제조하여 용이하게 항체와 결합 또는 다른 리포단백질과 하나 이상 연결할 수 있어서, 항체와 약물의 결합에 의해 상승된 항암효과를 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have diligently researched to develop an ADC that can have an anticancer effect even with a small amount of drugs. As a result, the inventors have applied hundreds of molecules, not 2 to 8 molecules, into the three-dimensional structure of the isolated lipoprotein. In addition to being able to capture, at least one amino acid residue of the hydrophilic region exposed to the outside of the lipoprotein can be prepared by cysteine-substituted mutant lipoproteins to easily bind the antibody to one or more lipoproteins. In addition, it was confirmed that the combination of the antibody and the drug can exhibit an elevated anti-cancer effect was completed the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a mutant lipoprotein capable of capturing a drug, wherein at least one amino acid residue of the hydrophilic region exposed to the outside of the lipoprotein is substituted with cysteine.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a nanostructure in which a drug is trapped inside the three-dimensional structure of the mutant lipoprotein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method of manufacturing the nanostructure.

본 발명의 또 다른 목적은 리포단백질 및 항체가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있고, 분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is an antibody-drug conjugate (ADC) in which lipoproteins and antibodies are linked directly or through a linker, and drugs are collected inside the isolated three-dimensional structure of lipoproteins. To provide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)의 제조방법을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the antibody-drug conjugate (ADC).

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질을 제공한다.
As one embodiment for achieving the above object, the present invention provides a mutant lipoprotein capable of capturing a drug, wherein at least one amino acid residue of the hydrophilic region exposed to the outside of the lipoprotein is substituted with cysteine.

본 발명의 용어 "변이 리포단백질"이란, 지질 또는 그의 유도체가 공유결합 또는 비공유결합에 의하여 결합될 수 있고, 3차원적 구조의 내부에 목적하는 약물을 포집할 수 있으며, 가용성 상태로 존재하는 리포단백질에 있어서, 약물의 포집시에 외부로 노출된 친수성 영역의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되도록 변이된 리포단백질을 의미한다. As used herein, the term “mutated lipoprotein” refers to a lipo that lipids or derivatives thereof can be bound by covalent or non-covalent bonds, can trap a drug of interest within the three-dimensional structure, and exist in a soluble state. In the protein, it refers to a lipoprotein which is mutated so that the amino acid residues of the hydrophilic region exposed to the outside of the drug collection are replaced with cysteine.

천연의 리포단백질은 내부에 목적하는 약물을 포집할 수 있는 3차원적 구조를 갖는데, 상기 3차원적 구조에 약물이 포집될 경우, 외부로 노출되는 친수성 영역에는 시스테인이 존재하지 않는다. 본 발명에서 제공하는 변이 리포단백질은 약물을 포집하여 나노구조체를 형성할 수 있고, 상기 형성된 나노구조체들이 상호 결합하거나 또는 항체와 결합할 수 있도록 상기 친수성 영역의 아미노산 잔기를 시스테인으로 치환한 형태를 갖는다. 이때, 상기 변이 리포단백질은 리포단백질에 존재하는 상기 친수성 영역의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 형태일 수 있는데, 바람직하게는 상기 친수성 영역의 염기성 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 리포단백질의 98번 아미노산 잔기, 166번 아미노산 잔기, 203번 아미노산 잔기, 230번 아미노산 잔기 등이 시스테인으로 치환된 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. Natural lipoproteins have a three-dimensional structure that can trap a desired drug in the interior. When the drug is captured in the three-dimensional structure, cysteine is not present in the hydrophilic region exposed to the outside. The mutant lipoprotein provided by the present invention may form a nanostructure by trapping a drug, and has a form in which amino acid residues of the hydrophilic region are substituted with cysteines so that the formed nanostructures may bind to each other or to bind to an antibody. . In this case, the mutant lipoprotein may be a form in which the amino acid residue of the hydrophilic region present in the lipoprotein is substituted with cysteine, and preferably, the basic amino acid residue of the hydrophilic region may be substituted with cysteine, more preferably. Preferably, amino acid residue 98, amino acid residue 166, amino acid residue 203, amino acid residue 230 and the like of the lipoprotein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be substituted with cysteine, and most preferably, SEQ ID NO: 3 It may be in the form consisting of the amino acid sequence of 5 to 5, but is not particularly limited thereto.

또한, 리포단백질은 바람직하게는 아포리포단백질 A, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 C, 아포리포단백질 E 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB48, ApoB100, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoC-IV 등의 아포리포단백질이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 ApoA-I이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.In addition, the lipoprotein may preferably be apo lipoprotein A, apo lipoprotein B, apo lipoprotein C, apo lipoprotein E, and the like, and more preferably ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA ApoB-48, ApoB48, ApoB100, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoC-IV, and the like may be apolipoproteins, and most preferably, ApoA-I having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. However, it is not particularly limited thereto.

상기 변이 리포단백질은 치환된 시스테인을 통하여 항체와 결합하거나 또는 상기 리포단백질이 상호 결합될 수 있는데, 이때 시스테인을 통하여 직접적으로 결합될 수도 있고, 링커를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
The mutant lipoprotein may be bound to the antibody through a substituted cysteine or the lipoprotein may be mutually bound. In this case, the lipoprotein may be directly bound through cysteine or indirectly through a linker, but is not particularly limited thereto. Does not.

본 발명의 용어 "항체(antibody)"란, 면역글로불린(immunoglobulin)이라고도 하고, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 생성되며, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원항체반응을 일으키는 물질을 의미하는데, 상기 항체는 전체 항체(whole) 형태일 수도 있고, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수도 있다. 전체 항체는 각각 2개의 전체 길이의 경쇄 및 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다) 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 단클론항체가 될 수 있다.The term "antibody" of the present invention, also referred to as immunoglobulin (immunoglobulin), is produced by the stimulation of the antigen in the immune system, a substance that specifically binds to a specific antigen that floats lymph and blood to generate an antigen-antibody reaction The antibody may be in the form of a whole antibody, or may include a functional fragment of an antibody molecule. The whole antibody is a structure having two full-length light chains and heavy chains, respectively, and each light chain is connected by heavy and disulfide bonds. Functional fragments of antibody molecules refer to fragments having antigen binding functions and include Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv. Fab in the antibody fragment has a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and the first constant region of the heavy chain (CH1) has one antigen binding site. Fab 'differs from Fab in that it has a hinge region that contains at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain. F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'. Recombinant techniques for generating Fv fragments with minimal antibody fragments in which Fv has only a heavy chain variable region and a light chain variable region are disclosed in WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086, and WO 88. / 09344. Double-chain Fv (dsFv) is a disulfide bond is linked to the heavy chain variable region and light chain variable region, and short-chain Fv (scFv) is generally covalently linked to the variable region of the heavy chain and the light chain through a peptide linker. Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., the entire antibody can be restricted to papain and Fabs can be obtained and pepsin can be used to obtain F (ab ') 2 fragments). Can be produced through genetic recombination techniques. In the present invention, the antibody is not particularly limited, but may be a monoclonal antibody.

본 발명의 용어, "단일클론 항체"란 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하는데, 상기 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 상기 단일클론 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, 단일쇄 항체 등의 천연형 항체; 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키거나, 인간화 항체와 같이 체내에서 항체에 대한 거부반응을 감소시키거나 또는 항체의 안정성을 증대시키기 위하여 천연형 항체의 일부를 변이시킨 형태의 변이항체; 상기 천연형 항체의 일부를 포함하도록 구성된 재조합 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 IgG 등의 천연항체, 항원에 대한 항체의 해리 상수값을 저하시키도록 변이된 변이항체, 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정영역(CDR, complementarity determining region)을 포함하는 재조합 항체, 항체 단편 등이 될 수 있다. As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, wherein the monoclonal antibody exhibits single binding specificity and affinity for a particular epitope. The monoclonal antibody is not particularly limited thereto, but is preferably a natural antibody such as IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgT, IgY, single chain antibody; Variant antibodies in which a portion of the native antibody is mutated to lower the dissociation constant of the antibody to the antigen, to reduce the rejection of the antibody in the body, such as a humanized antibody, or to enhance the stability of the antibody; It may be a recombinant antibody or the like configured to include a portion of the natural antibody, more preferably, a natural antibody such as IgG, mutated antibody, modified directly to lower the dissociation constant value of the antibody to the antigen, binding directly to the antigen It may be a recombinant antibody, antibody fragment, etc. comprising a complementarity determining region (CDR).

본 발명의 용어, "항체 단편"은 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 상기 항체단편은 IGF-R1과 결합할 수 있는 scFv(Single-chain variable fragment) 도메인 일 수 있다. As used herein, the term "antibody fragment" includes antigen-binding forms of an antibody, including fragments having antigen-binding ability, such as Fab ', F (ab') 2 , Fab, Fv and rIgG. The antibody fragment may be a single-chain variable fragment (scFv) domain capable of binding IGF-R1.

본 발명의 용어 “scFv”는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편을 의미하며, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. As used herein, the term “scFv” refers to the minimum antibody fragment having a complete antigen-recognition and antigen-binding site, comprising the VH and VL domains of an antibody, wherein the domain is present in a single polypeptide chain.

본 발명의 용어, "면역세포(immunocyte)"란 항체를 만드는 세포를 의미하는데, 통상적으로 B 세포, 자연 살상 세포(Natural killer cell, NK cell) 또는 T 세포 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 면역세포는 항체의존성 세포독성 메커니즘에 작용하는 자연 살상 세포 또는 T 세포를 의미할 수 있다.As used herein, the term "immunocyte" refers to a cell that makes an antibody, and may generally be a B cell, a natural killer cell (NK cell), or a T cell. For the purposes of the present invention, the immune cells may refer to natural killer cells or T cells that act on antibody-dependent cytotoxic mechanisms.

본 발명의 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미하는데, 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지의 역할을 수행할 수도 있다. 본 발명에서 상기 링커는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 항체와 나노구조체 또는 항체와 항체를 연결할 수 있는 화합물이 될 수 있고, 바람직하게는 티올기를 통하여 항체와 나노구조체 또는 항체와 항체를 연결할 수 있는 화합물이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 티올기를 통하여 항체와 나노구조체를 연결할 수 있도록 NHS(N-hydroxysuccinimide ester)와 말레이미드 그룹(maleimide group)으로 구성되어 있고 상기 그룹은 각각 일차 아민(primary amine) 및 티올기와 공유결합 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 링커는 m-말레이미도벤조일-설포숙신이미딜 에스테르(m-MaleimidoBenzoyl-SulfoSuccinimidyl ester)(제품명: sulfo-MBS(Thermo Scientific))가 될 수 있다.
As used herein, the term "linker" basically refers to two different fusion partners (e.g., biological polymers, etc.) that are hydrogen bonds, electrostatic interactions, van der Waals forces, disulfide bonds, salt bridges, It refers to a linker that can be linked using hydrophobic interactions, covalent bonds, etc., preferably to at least one disulfide bond under physiological conditions or other standard peptide conditions (eg, peptide purification conditions, peptide storage conditions). It can have at least one cysteine that can participate, and in addition to simply connecting each fusion partner, it also plays a role of providing a certain amount of spacing between fusion partners, or a hinge that provides flexibility or rigidity to the fusion. You can also do In the present invention, the linker is not particularly limited thereto, but may be a compound capable of connecting the antibody and the nanostructure or the antibody and the antibody, and preferably a compound capable of connecting the antibody and the nanostructure or the antibody and the antibody through a thiol group. More preferably, it is composed of NHS (N-hydroxysuccinimide ester) and a maleimide group to connect the antibody and the nanostructure through a thiol group, the group is a primary amine (primary amine) and A thiol group may be covalently bonded, and most preferably, the linker may be m-maleimidoBenzoyl-SulfoSuccinimidyl ester (trade name: sulfo-MBS (Thermo Scientific)).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체를 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a nanostructure in which the drug is trapped inside the three-dimensional structure of the mutant lipoprotein.

본 발명의 용어 "나노구조체"란, 상기 변이 리포단백질이 목적하는 약물을 포집한 형태로 구성된 단백질-약물 복합체를 의미하는데, 상술한 바와 같이 상기 변이된 리포단백질의 외부에 존재하는 친수성 영역의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되어 있기 때문에, 상기 시스테인을 통하여 각 나노구조체가 1:1 또는 1:다수로 상호 결합할 수 있고, 상기 나노구조체가 항체와 결합할 수도 있다. As used herein, the term “nanostructure” refers to a protein-drug complex composed of a form in which the mutant lipoprotein has captured a desired drug, and the amino acid of the hydrophilic region outside the mutated lipoprotein as described above. Since the residue is substituted with cysteine, each of the nanostructures may be 1: 1 or 1: multiple to each other through the cysteine, and the nanostructures may bind to the antibody.

또한, 본 발명에서 제공하는 나노구조체는 상기 변이 리포단백질이 아닌 변이되지 않은 리포단백질을 이용하여도 제조할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 아포리포단백질 A의 3차원 구조 내부에 약물이 포집된 나노구조체가 될 수도 있다.
In addition, the nanostructures provided by the present invention can also be prepared using the unmodified lipoprotein, rather than the mutated lipoprotein. For example, the nanostructure may be a drug trapped inside the three-dimensional structure of the apolipoprotein A having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 변이된 리포단백질로서 사용되는 ApoA-I의 경우 내부에 공극을 3쌍의 헬릭스로 감싸는 3차원적 구조를 갖는다(도 9). 도 9는 ApoA-I의 3차원적 구조를 나타내는 개략도이다. 상기 공극에 포집될 수 있는 목적 약물의 양은 상기 약물의 구조 및 분자량에 따라 달라질 수 있어 특별히 이에 제한되지는 않으나 한 분자의 리포단백질 당 약 100분자의 약물을 포집할 수 있다(도 10).
In the case of ApoA-I used as a mutated lipoprotein of the present invention, it has a three-dimensional structure in which pores are surrounded by three pairs of helixes (FIG. 9). 9 is a schematic diagram showing the three-dimensional structure of ApoA-I. The amount of the drug of interest that can be trapped in the pore may vary depending on the structure and molecular weight of the drug, but is not particularly limited thereto, and may capture about 100 molecules of drug per lipoprotein of one molecule (FIG. 10).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 ApoA-I 단백질의 염기성 아미노산인 아르기닌을 시스테인으로 치환하여 변이된 ApoA-I을 제조하고(도 4), 상기 변이된 ApoA-I과 항암약물을 이용하여 항암약물이 포집된 나노구조체를 제조하였다(도 5).
According to an embodiment of the present invention, the present inventors prepared a mutated ApoA-I by replacing arginine, a basic amino acid of the ApoA-I protein with cysteine (FIG. 4), and using the mutated ApoA-I and an anticancer drug. To prepare a nanostructure in which the anticancer drug was collected (FIG. 5).

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 나노구조체의 제조방법을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for producing the nanostructure.

구체적으로, 본 발명의 나노구조체의 제조방법은 (ⅰ) 목적하는 약물을 콜릭산 나트륨과 같은 계면활성제를 포함하는 완충용액에 용해 또는 분산시켜서 상기 계면활성제와 목적하는 약물이 결합된 미셀구조체를 형성하는 단계; 및 (ⅱ) 본 발명에 따른 변이 리포단백질과 상기 미셀구조체를 1:50 내지 1:200(몰비)로 혼합하고 임의적으로 희석하여 나노구조체를 형성하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 완충용액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 나노구조체 형성 완충용액(Tris-HCl 중 콜릭산 나트륨, pH 6~7)이 될 수 있고, 나노구조체를 형성한 후에, 형성된 나노구조체를 포함하는 반응물을 AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 나노구조체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
Specifically, the method for preparing a nanostructure of the present invention (i) dissolving or dispersing a desired drug in a buffer solution containing a surfactant such as sodium cholate to form a micelle structure in which the surfactant and the desired drug are combined. Making; And (ii) mixing the mutant lipoproteins according to the present invention with the micelle structures in a ratio of 1:50 to 1: 200 (molar ratio) and optionally diluting to form nanostructures. In this case, the buffer solution is not particularly limited thereto, but may be a nanostructure-forming buffer solution (sodium cholate in Tris-HCl, pH 6-7), and after forming the nanostructures, reactants including the formed nanostructures. May be further subjected to AKTA FPLC size exclusion chromatography to purify the nanostructures.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 리포단백질 및 항체가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있고, 분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC) 및 그의 제조방법을 제공한다.
As another embodiment for achieving the above object, the present invention is an antibody-drug conjugate in which the lipoprotein and the antibody are linked directly or through a linker, and the drug is trapped inside the isolated three-dimensional structure of the lipoprotein. (Antibody-drug conjugate, ADC) and a method for preparing the same.

본 발명의 용어 "항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)"란, 약물과 연결된 항체 또는 그의 단편으로 구성되는 질환의 표적치료에 사용될 수 있는 면역결합체(immunoconjugate) 형태의 치료제를 의미하는데, 상기 항체는 ADC가 표적세포에 결합할 수 있게 하고, 때로는 상기 항체를 통하여 표적세포의 내부로 유입되어 상기 ADC에 포함된 약물이 상기 유입된 세포로부터 분비되도록 할 수도 있다. 상기 ADC는 종래의 치료제에 비하여 항체를 이용하여 목적하는 세포에 대한 적중율이 우수하기 때문에 부작용이 낮고, 적용범위가 광범위하다는 장점이 있다. 본 발명의 목적상 상기 ADC는 약물이 포집된 리포단백질과 항체가 직접적으로 또는 링커를 통하여 결합된 형태일 수 있다(도 1). 도 1은 본 발명에서 제공하는 ADC의 구조를 나타내는 개략도이다. 항체와 변이리포단백질의 경우 항체의 일차 아민과 변이리포단백질의 티올기를 연결할 수 있는 링커를 통하여 연결되고, 상기 변이리포단백질과 변이리포단백질은 티올기를 통하여 연결되도록 구성될 수 있다. 특히, 상기 티올기를 두 개씩 갖고 있는 변이 리포단백질은 또다른 리포단백질과 연결될 수 있기 때문에, 하나의 항체에 결합될 수 있는 리포단백질의 수는 제한되지 않고, 약물을 포집한 리포단백질의 투여경로에 적합한 수준의 크기가 되도록 하나의 티올기를 포함하는 리포단백질을 이용함으로써, 리포단백질의 수를 조절할 수도 있다.As used herein, the term “antibody-drug conjugate (ADC)” refers to an immunoconjugate form of therapeutic agent that can be used for the treatment of a disease consisting of an antibody or fragment thereof linked to a drug. The antibody may allow the ADC to bind to the target cell, and sometimes may be introduced into the target cell through the antibody to secrete the drug contained in the ADC from the introduced cell. The ADC has an advantage that the side effect is low and the scope of application is wide because the hit ratio to the desired cells using the antibody is superior to the conventional therapeutic agent. For the purposes of the present invention, the ADC may be in the form in which the lipoprotein and the antibody in which the drug is collected are directly or through a linker (FIG. 1). 1 is a schematic diagram showing the structure of an ADC provided in the present invention. In the case of the antibody and the mutant lipoprotein, the primary amine of the antibody and the mutant lipoprotein may be linked through a linker capable of linking the thiol group, and the mutant lipoprotein and the mutant lipoprotein may be configured to be linked through a thiol group. In particular, since the mutant lipoprotein having two thiol groups can be linked to another lipoprotein, the number of lipoproteins that can be bound to one antibody is not limited, and the route of administration of the lipoprotein which collects the drug is not limited. The number of lipoproteins can also be controlled by using lipoproteins containing one thiol group to achieve an appropriate level of size.

또한, 본 발명의 목적상 상기 ADC는 그에 포함된 다양한 약물의 종류에 따라, 각 약물의 용도에 부합하는 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC에 포함되는 약물은 항암제일 수 있는데, 상기 항암제는 특별히 이에 제한되지 않으나, DNA 알킬화제(DNA alkylating agent)인 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드 (mustard), 사이클로로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 및 카보플라틴(carboplatin) 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 시스플라틴(cisplatin)이다. 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 항암제는 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)인 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib), EpoB(Epothilone B), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토산트론 (mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 C 블레오마이신(C Bleomycin) 등이 될 수 있다.In addition, for the purposes of the present invention, the ADC may be used for prophylaxis or treatment according to the use of each drug, depending on the type of various drugs included therein. For example, the drug included in the ADC of the present invention may be an anticancer agent, but the anticancer agent is not particularly limited thereto, but is a DNA alkylating agent (DNA alkylating agent) mechloethamine, chlorambucil, phenylalanine (phenylalanine), mustard, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), streptozotocin (streptozotocin), Busulfan, thiotepa, carboplatin, and the like, and preferably cisplatin. In addition, the anticancer agent that can be used in the present invention is anti-cancer antibiotics (dactinomycin: actinomycin D), doxorubicin (dodrirubicin: adriamycin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib), EpoB (Epothilone B) ), Daunorubicin, daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone, plicamycin, mitomycin, C bleomycin and C Bleomycin.

아울러, 상기 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC)는 (a) 상기 변이된 리포단백질 또는 아포리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물을 포집시켜 단백질 내부에 약물이 포집된 형태의 구조체를 형성하는 단계; 및, (b) 상기 구조체에 항체를 결합시키는 단계에 의하여 제조될 수 있다.
In addition, the antibody-drug conjugate (ADC) (a) traps the drug in the three-dimensional structure of the mutated lipoprotein or apolipoprotein to form a structure in which the drug is trapped inside the protein. Making; And (b) binding the antibody to the construct.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 항체를 링커로서 사용되는 sulfo-MBS(Thermo Scientific)를 결합시킨 다음, 상기 결합체에 상기 나노구조체를 가하여 결합시키고, 크로마토그래피에 의하여 상기 항체-링커-나노구조체가 결합된 형태의 ADC를 제조하였다(도 5).According to an embodiment of the present invention, the inventors bind sulfo-MBS (Thermo Scientific), which uses an antibody as a linker, and then bind the conjugate by adding the nanostructure, and then chromatography the antibody-linker- The ADC was prepared in the form of nanostructures combined (FIG. 5).

한편, 다른 약물을 사용할 경우에도, 나노구조체를 제조할 수 있는지를 확인하기 위하여, DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)를 각각 ApoA-I을 가하여, 각 약물과 apoA-I으로 구성된 나노구조체를 제조하고, 이들의 크기를 비교한 결과, 약물이 포함되지 않은 ApoA-I과 별다른 차이를 나타내지 않았으므로, 상기 약물들 역시 ApoA-I에 포집됨을 알 수 있었다(도 12).
On the other hand, even when using other drugs, to confirm whether the nanostructures can be prepared, DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib) or EpoB (Epothilone B) was added to each of the ApoA-I, As a result of preparing a nanostructure consisting of drugs and apoA-I, and comparing the sizes thereof, it was found that the drugs were also trapped in ApoA-I because they did not show any difference from ApoA-I without drug. (FIG. 12).

본 발명의 ADC는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 수의 약물이 항체에 결합된 형태로 제조될 수 있어 약물의 치료효과가 우수할 뿐만 아니라, 치료효과가 약하거나 또는 낮은 수용성을 나타내지만 안전성이 우수한 약물을 사용할 경우에도 우수한 치료효과를 나타낼 수 있어 치료안전성을 향상시킬 수 있고, 약물의 화학적 구조를 변형시키지 않아 약물의 변형에 의하여 유발될 수 있는 위험성을 배제할 수 있으며, 복잡한 결합반응이 수반되지도 않으므로, 효과적인 약물치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
The ADC of the present invention can be prepared in a form in which a significantly larger number of drugs are bound to the antibody than the conventional complex, so that the drug is not only excellent in the therapeutic effect, but also has a weak therapeutic effect or low water solubility, but is not safe. Even when a good drug is used, it can show excellent therapeutic effect, improve the safety of treatment, and do not change the chemical structure of the drug to exclude the risk that can be caused by the drug's modification, and complex binding reactions are involved. It will not be possible to use it widely in the development of effective drug treatments.

도 1은 본 발명에서 제공하는 ADC의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 두 개의 티올기를 갖도록 변이된 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1의 개열지도이다.
도 3은 한 개의 티올기를 갖는 변이된 아포리포단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1 dimer의 개열지도이다.
도 4는 환원조건 및 비환원조건에서 분석한 전기영동결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 항암 약물로 구성된 나노구조체 분획을 나타내는 크로마토그램이다.
도 6은 Sulfo-MBS의 기본 구조를 나타내는 개략도이다.
도 7a는 ADC 반응물을 superose 12 10/300GL컬럼을 이용하여 크기별로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 7b는 상기 분획물을 환원적 조건(RE)과 비환원적 조건(NR)으로 전기영동을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7c는 ADC 반응물을 AKTA FPLC desalting column을 사용하여 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램 및 전기영동사진이다.
도 8은 항암약물과 항체로 구성된 ADC에 항암약물이 포집되어 있는지를 확인한 HPLC 분석결과이다.
도 9는 ApoA-I의 3차원적 구조를 나타내는 개략도이다.
도 10은 변이 ApoA-I 단백질과 항암약물의 비율에 따른 나노구조체의 크기변화를 나타내는 크로마토그램이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 ADC를 각종 암세포에 투여하여 암세포의 사멸능을 분석한 그림이다.
도 12는 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)와 ApoA-I를 반응시켜 제조한 각각의 나노구조체의 크기를 비교한 그래프이다.1 is a schematic diagram showing the structure of an ADC provided in the present invention.
2 is a cleavage map of the expression vector pNFXexApoA-1 capable of expressing ApoA-I protein mutated to have two thiol groups.
3 is a cleavage map of the expression vector pNFXexApoA-1 dimer capable of expressing a mutated apolipoprotein having one thiol group.
4 is a photograph showing electrophoresis results analyzed under reducing and non-reducing conditions.
5 is a chromatogram showing a nanostructure fraction consisting of anticancer drugs.
6 is a schematic diagram showing the basic structure of Sulfo-MBS.
Figure 7a is a chromatogram showing the result of fractionation of the ADC reactants by size using a superose 12 10 / 300GL column.
7b is a photograph showing the results of analyzing the fractions by electrophoresis under reducing conditions (RE) and non-reducing conditions (NR).
Figure 7c is a chromatogram and electrophoresis picture showing the result of fractionating the ADC reaction using the AKTA FPLC desalting column.
8 is an HPLC analysis result confirming whether the anticancer drug is collected in the ADC composed of the anticancer drug and the antibody.
9 is a schematic diagram showing the three-dimensional structure of ApoA-I.
10 is a chromatogram showing the change in the size of the nanostructures according to the ratio of the mutant ApoA-I protein and the anticancer drug.
11 is a diagram illustrating the killing ability of cancer cells by administering the ADC prepared according to the present invention to various cancer cells.
Figure 12 is a graph comparing the size of each nanostructure prepared by reacting DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib) or EpoB (Epothilone B) and ApoA-I.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 변이된  1: mutated apolipoproteinapolipoprotein A-I의 제조 Preparation of A-I

pET 단백질 발현 시스템을 기반으로 구성된 pNFXex ApoA-I 플라스미드를 중합효소연쇄반응 (PCR, polymerase chain reaction)을 이용하여 아미노산 서열 98 또는 203번의 염기성 아미노산(basic amino acid)인 아르기닌을 시스테인으로 치환하여 각각의 변이 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1을 제작하였다(도 2). 이때, 상기 PCR은 95℃ 30초 및 18 cycle(95℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 2분)의 조건으로 수행하였다. 도 2는 두 개의 티올기를 갖도록 변이된 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1의 개열지도이다. The pNFXex ApoA-I plasmid based on the pET protein expression system was substituted with a cysteine by replacing arginine, the basic amino acid of amino acid sequence 98 or 203, with a polymerase chain reaction (PCR). An expression vector pNFXexApoA-1 capable of expressing a mutant ApoA-I protein was constructed (FIG. 2). At this time, the PCR was carried out under the conditions of 95 ℃ 30 seconds and 18 cycles (95 ℃ 30 seconds, 55 ℃ 30 seconds and 72 ℃ 2 minutes). 2 is a cleavage map of the expression vector pNFXexApoA-1 capable of expressing ApoA-I protein mutated to have two thiol groups.

상기 제조된 발현벡터 pNFXexApoA-1에 제한효소(NdeI, Not I 또는 HindIII)를 처리하여 절단하고, T4 ligase와 In-fusion 키트(In-Fusionⓡ HD Cloning kit)를 이용하여 상기 절단부위에 정상적인 ApoA-I 유전자를 삽입함으로써 하나의 티올기를 갖도록 변이된 ApoA-I 단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1 dimer를 제작하였다(도 3). 도 3은 한 개의 티올기를 갖는 변이된 아포리포단백질을 발현시킬 수 있는 발현벡터 pNFXexApoA-1 dimer의 개열지도이다.The prepared expression vector pNFXexApoA-1 was cut by treatment with restriction enzymes (NdeI, Not I or HindIII), and normal ApoA at the cleavage site using a T4 ligase and an In-fusion kit (In-Fusion® HD Cloning kit). An expression vector pNFXexApoA-1 dimer capable of expressing ApoA-I protein mutated to have one thiol group was prepared by inserting the -I gene (FIG. 3). 3 is a cleavage map of the expression vector pNFXexApoA-1 dimer capable of expressing a mutated apolipoprotein having one thiol group.

이어, 상기 제작한 각각의 발현벡터 pNFXexApoA-1 또는 pNFXexApoA-1 dimer를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 각각의 형질전환체를 제조하였다. 상기 제조된 각 형질전환체를 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 10㎖ LB배지에서 37℃조건하에서 12시간 동안 배양하여 배양물을 수득하였으며, 상기 배양물을 동일한 600㎖ LB 배지에 접종시켜 상기 각각의 형질전환체를 대량으로 배양하였다. 상기 배양된 각각의 형질전환체에서 각각의 변이된 ApoA-I 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 0.5mM IPTG(isopropyl thiogalactoside)를 배지에 첨가하여 1시간 동안 배양하고, 상기 배양온도를 28℃로 감소시킨 조건에서 5시간 동안 추가로 배양하여 각각의 배양물을 수득하였다.Subsequently, each transformant was prepared by introducing each of the prepared expression vectors pNFXexApoA-1 or pNFXexApoA-1 dimer into E. coli BL21 (DE3). Each of the transformants prepared above was incubated for 12 hours at 37 ° C. in 10 ml LB medium containing 50 μg / ml ampicillin, and the cultures were inoculated in the same 600 ml LB medium. Transformants were cultured in large quantities. In order to induce the expression of each mutated ApoA-I protein in each of the cultured transformants, 0.5mM IPTG (isopropyl thiogalactoside) was added to the medium and incubated for 1 hour, and the culture temperature was reduced to 28 ° C. Each culture was further incubated for 5 hours at the conditions.

상기 수득한 각 배양물에 포함된 각각의 변이된 ApoA-I 단백질을 하기의 방법으로 회수하였다: 구체적으로, 상기 수득한 각 배양물을 원심분리하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 이를 40mM Tris-HCl 완충(buffer)용액에 현탁시킨 후, 초음파를 처리하여 각 형질전환체를 파쇄함으로써, 각각의 세포파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 각 세포파쇄물을 원심분리하여 각각의 상등액을 수득하고, 이를 고성능 Ni-세파로스™(Quagen)에 적용하고, 세척완충액(40mM Tris-HCl, 0.3M NaCl, 20mM 이미다졸)으로 세척한 다음, 용리완충액(40mM Tris-HCl, 0.3M NaCl, 1M 이미다졸)을 이용하여 각각의 용리액을 수득하였다. 수득한 각 용리액을 40mM Tris-HCl 완충용액으로 투석하여 염이 제거된 시료를 수득하고, 상기 수득한 시료를 동일한 완충용액(40mM Tris-HCl)의 조건하에서 AKTA FPLC desalting column(Amersham Bioscience) 크로마토그래피에 적용하였으며, 이로부터 각각의 변이된 ApoA-I 단백질을 회수하였다. Each of the mutated ApoA-I proteins contained in each of the obtained cultures was recovered by the following method: Specifically, each of the obtained cultures was centrifuged to obtain respective transformants, which were obtained from 40 mM Tris. Each cell lysate was obtained by suspending each transformant by sonication after suspension in -HCl buffer solution. Each obtained cell lysate was centrifuged to obtain each supernatant, which was subjected to high performance Ni-Sepharose ™ (Quagen) and washed with washing buffer (40 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole). Next, each eluent was obtained using an elution buffer (40 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl, 1 M imidazole). Each obtained eluate was dialyzed with 40 mM Tris-HCl buffer to obtain a sample free of salts, and the obtained sample was subjected to AKTA FPLC desalting column (Amersham Bioscience) chromatography under the same buffer (40 mM Tris-HCl). Was applied to recover each mutated ApoA-I protein.

상기 회수한 각각의 변이된 ApoA-I 단백질의 농도를 측정하고, 이에 근거하여 SDS-PAGE를 이용한 환원(reduced)조건 및 native PAGE를 이용한 비환원(non-reduced)조건에서 각각의 변이된 ApoA-I의 순도 및 크기(molecular weight)를 분석하였다(도 4). 도 4는 환원조건 및 비환원조건에서 분석한 전기영동결과를 나타내는 사진으로서, 도 4의 M레인은 마커를 나타내고 A는 표준형(wild type) ApoA-I 단백질(서열번호 1)을 나타내며, 98은 98번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이된 ApoA-I 단백질(서열번호 3)을 나타내고, 166은 166번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이 ApoA-I 단백질(서열번호 4)을 나타내며, 203은 203번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이 ApoA-I 단백질(서열번호 5)을 나타내고, 230은 230번 아미노산이 시스테인으로 치환된 변이 ApoA-I 단백질(서열번호 6)을 나타낸다. 도 2에서 보듯이 표준형 ApoA-I 단백질(A레인)과 비교하여 각각의 변이 ApoA-I 단백질을 비교한 결과, 비 환원적 조건에서는 이황화결합(disulfide bond)에 의해 형성된 다양한 크기의 밴드로서 각각의 변이 ApoA-I 단백질을 확인할 수 있었다.
The concentration of each recovered ApoA-I protein was measured and based on this, each mutated ApoA- under reduced or non-reduced condition using native PAGE. The purity and molecular weight of I were analyzed (FIG. 4). Figure 4 is a photograph showing the electrophoresis results analyzed under reducing and non-reducing conditions, M lane of Figure 4 represents a marker, A represents a wild type ApoA-I protein (SEQ ID NO: 1), 98 is Amino acid 98 represents a mutated ApoA-I protein (SEQ ID NO: 3) with cysteine substitution, 166 represents a mutated ApoA-I protein (SEQ ID NO: 4) with amino acid 166 substituted with cysteine, and 203 is amino acid 203 The variant ApoA-I protein (SEQ ID NO: 5) substituted with this cysteine is shown, and 230 shows the variant ApoA-I protein (SEQ ID NO: 6) substituted with cysteine amino acid 230. As shown in FIG. 2, each mutant ApoA-I protein was compared with the standard ApoA-I protein (A-lane). As a result, in non-reductive conditions, bands of various sizes formed by disulfide bonds were used. Mutant ApoA-I protein could be identified.

실시예Example 2: 재조합 변이  2: recombinant mutation ApoAApoA -I을 이용한 나노구조체-I Nanostructures 의of 제조 Produce

항암약물이 포집된 나노구조체를 제조하기 위해 항암약물(paclitaxel(CAS # 33069-62-4, sigma))을 메탄올에 13mM의 농도로 용해시키고, 이를 이용하여 나노구조체를 제조하였다. To prepare a nanostructure in which anticancer drugs were collected, anticancer drugs (paclitaxel (CAS # 33069-62-4, sigma)) were dissolved in methanol at a concentration of 13 mM, and nanostructures were prepared using the same.

구체적으로, 상기 항암약물이 용해된 메탄올에 질소가스 및 진공상태에서 순차적으로 건조시켜서 메탄올을 완전히 제거하여 항암약물 결정을 수득하고, 이를 나노구조체 형성 완충용액(100 mM Tris-HCl 중 100mM 콜릭산 나트륨, pH7.4)에 용해시킨 다음, 항암약물로 구성된 나노구조체를 유도하기 위해 상기 항암약물이 용해된 완충용액을 초음파로 처리하여 항암약물의 결정형태를 분산시켜 나노구조체 형성 완충용액에 첨가된 콜릭산 나트륨과 서로 결합된 미셀(micelle)구조의 형성을 유도함으로써 안정화시켰다. 이어, 각각의 변이된 Apo A-I 단백질과 미셀구조를 형성한 항암약물의 비율이 1:100(몰비)이 되도록 혼합하고, 이를 희석하여 콜릭산을 제거한 다음, AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 적용하여 항암약물이 포함된 나노구조체를 분획(fractionation)하고 선별하고, 선별된 분획을 HPLC를 이용하여 정량하여 수득율을 확인하였다(도 5 및 표 1). 도 5는 항암 약물로 구성된 나노구조체 분획을 나타내는 크로마토그램이다.
Specifically, the anticancer drug was sequentially dried in methanol and nitrogen gas in which the anticancer drug was dissolved to completely remove methanol to obtain an anticancer drug crystal, which was obtained by nanostructure forming buffer solution (100 mM sodium cholate in 100 mM Tris-HCl). , pH7.4) and then ultrasonically treated the buffer solution in which the anticancer drug was dissolved to induce the nanostructure composed of the anticancer drug by dispersing the crystalline form of the anticancer drug, and adding the colloid to the nanostructure formation buffer. It was stabilized by inducing the formation of a micelle structure in combination with sodium acid. Subsequently, the mixed Apo AI protein and the micelle-structured anticancer drug were mixed at a ratio of 1: 100 (molar ratio), diluted to remove cholic acid, and then AKTA FPLC size exclusion chromatography. ) Was applied to fractionate and screen the nanostructures containing anticancer drugs, and the selected fractions were quantified using HPLC to confirm the yield (Fig. 5 and Table 1). 5 is a chromatogram showing a nanostructure fraction consisting of anticancer drugs.

항암약물이 포집된 나노구조체의 수득율Yield of nanostructures with anticancer drugs 초기약물농도(㎍/㎖)Initial Drug Concentration (㎍ / ㎖) 나노구조체에 포집된
최종약물농도(㎍/㎖)Trapped in the nanostructure
Final drug concentration (㎍ / ㎖) 수득률(%)Yield (%) 나노구조체Nano Structure 14001400 924924 6666

상기 표 1에서 보듯이, 약 66%의 수득률로 항암약물이 포집된 나노구조체를 제조할 수 있었다.
As shown in Table 1, it was possible to prepare a nanostructure collected anti-cancer drug at a yield of about 66%.

실시예Example 3:  3: ADCADC 의 제조Manufacturing

상기 제조된 항암약물을 포함하는 나노구조체와 항체를 링커를 이용하여 연결시켜서 ADC를 제조하였다.
The ADC was prepared by linking the nanostructure and the antibody including the prepared anticancer drug using a linker.

본 발명에서 제조된 나노구조체는 위치 지정 돌연변이 (Site-directed mutagenesis)를 통해 티올기(thiol group)을 갖는 시스테인(cysteine)으로 치환된 아미노산서열로 구성되고, 상기 티올기와 효율적으로 연결됨과 동시에 항체에 연결될 수 있는 링커로서 sulfo-MBS(Thermo Scientific)를 사용하였다. 상기 sulfo-MBS는 NHS(N-hydroxysuccinimide ester) 및 말레이미드 그룹을 포함하고, 상기 각 group은 각각 일차아민(primary amine) 및 티올기와 공유결합(covalent conjugation)을 형성한다(도 6). 도 6은 Sulfo-MBS의 기본 구조를 나타내는 개략도이다.
The nanostructure prepared in the present invention is composed of an amino acid sequence substituted with cysteine having a thiol group through a site-directed mutagenesis, and is effectively linked to the thiol group and simultaneously attached to the antibody. Sulfo-MBS (Thermo Scientific) was used as linker that could be linked. The sulfo-MBS comprises N-hydroxysuccinimide ester (NHS) and maleimide groups, each of which forms a covalent conjugation with the primary amine and thiol, respectively (FIG. 6). 6 is a schematic diagram showing the basic structure of Sulfo-MBS.

항체와 나노구조체를 서로 결합시키기 위해서, 우선 항체와 링커인 sulfo-MBS를 서로 결합시키고자 하였다. 구체적으로, 준비된 항체를 결합완충용액(conjugation buffer, PBS 중 5mM EDTA, pH 7.2)에 용해시키고, 링커인 sulfo-MBS를 가하여, 항체와 sulfo-MBS의 혼합비가 1:10(몰비)이 되도록 하고, 4℃에서 2시간동안 반응시켰다. 상기 반응액을 AKTA FPLC desalting column(Amersham Bioscience)을 사용한 크로마토그래피에 적용하여 항체와 sulfo-MBS가 결합된 결합체 분획을 수득하고, 상기 결합체 분획에 상기 실시예 2에서 제조한 항암약물이 포집된 나노구조체를 가한다음, 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 반응물을 superose 12 10/300GL컬럼을 이용하여 크기별로 분획하고, 이들 분획을 환원적 조건(RE)과 비환원적 조건(NR)으로 전기영동을 통해 분석하였다(도 7a 및 도 7b). 도 7a는 ADC 반응물을 superose 12 10/300GL컬럼을 이용하여 크기별로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이고, 도 7b는 상기 분획물을 환원적 조건(RE)과 비환원적 조건(NR)으로 전기영동을 통해 분석한 결과를 나타내는 사진으로서, 녹색선으로 표시된 부분은 ADC를 나타내고, 청색선으로 표시된 부분은 항체를 나타내며, 적색선으로 표시된 부분은 항암약물이 포집된 나노구조체를 나타낸다. 도 7a 및 도 7b에서 보듯이, 항체와 나노구조체에 비하여 상대적으로 거대분자량을 가지는 ADC를 확인할 수 있었으므로, 상기 ADC는 항체와 나노구조체가 결합된 형태임을 확인할 수 있었다.In order to bind the antibody and the nanostructure to each other, first, the antibody and linker sulfo-MBS were to be bound to each other. Specifically, the prepared antibody was dissolved in a binding buffer solution (5 mM EDTA in PBS, pH 7.2) and sulfo-MBS, a linker, was added so that the mixing ratio of the antibody and sulfo-MBS was 1:10 (molar ratio). The reaction was carried out at 4 ° C. for 2 hours. The reaction solution was subjected to chromatography using an AKTA FPLC desalting column (Amersham Bioscience) to obtain a conjugate fraction in which the antibody and sulfo-MBS were combined, and the anticancer drug prepared in Example 2 was collected in the conjugate fraction. The structure was added and then reacted at 4 ° C. for 24 hours. After the reaction was completed, the reaction was fractionated by size using a superose 12 10 / 300GL column, these fractions were analyzed by electrophoresis under reducing conditions (RE) and non-reducing conditions (NR) (Fig. 7a and Fig. 7b). Figure 7a is a chromatogram showing the result of fractionation of the ADC reactant by size using a superose 12 10 / 300GL column, Figure 7b is the fraction through electrophoresis under reducing conditions (RE) and non-reducing conditions (NR) As a photograph showing the result of the analysis, the part indicated by green line represents ADC, the part indicated by blue line indicates antibody, and the part indicated by red line indicates nanostructure in which anticancer drug is collected. As shown in Figure 7a and 7b, the ADC having a relatively large molecular weight compared to the antibody and the nanostructure was confirmed, the ADC was confirmed that the antibody and the nanostructure is combined form.

또한, 상기 반응물을 AKTA FPLC desalting column을 사용한 크로마토그래피에 적용하여 항체-링커-나노구조체가 결합된 결합체(ADC) 분획을 수득하고, 이를 비환원(non-reduced)조건으로 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다(도 7c). 도 7c는 ADC 반응물을 AKTA FPLC desalting column을 사용하여 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램 및 전기영동사진이다. 도 7c에서 보듯이, 제조된 ADC는 크로마토그램 상에서 약 200Kda 크기를 나타냄을 확인할 수 있었다.In addition, the reaction was subjected to chromatography using an AKTA FPLC desalting column to obtain an antibody-linker-nanostructure-bound conjugate (ADC) fraction, which was subjected to SDS-PAGE under non-reduced conditions. It was confirmed (FIG. 7C). Figure 7c is a chromatogram and electrophoresis picture showing the result of fractionating the ADC reaction using the AKTA FPLC desalting column. As shown in Figure 7c, it can be seen that the prepared ADC has a size of about 200Kda on the chromatogram.

한편, 상기 제조된 ADC에 나노구조체가 결합되었는지의 여부를 확인하기 위하여 HPLC를 이용하였다(도 8). 도 8은 항암약물과 항체로 구성된 ADC에 항암약물이 포집되어 있는지의 여부를 확인한 HPLC 분석결과로서, Drug STD는 대조군으로서 항암약물의 표준용액을 분석한 결과를 나타내고, ADC는 상기 항암약물이 포집된 ADC를 분석한 결과를 나타낸다. 도 8에서 보듯이, 표준용액의 HPLC 분석피크와 동일한 위치에서 본 발명의 ADC에 포집된 항암약물의 HPLC 분석피크가 검출되었으므로, 본 발명의 ADC가 항암약물이 포집된 나노구조체를 포함하며, ADC의 제조 도중 약물의 변성이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.
On the other hand, HPLC was used to determine whether the nanostructure is bonded to the prepared ADC (Fig. 8). FIG. 8 is an HPLC analysis result confirming whether an anticancer drug is collected in an ADC composed of an anticancer drug and an antibody. Drug STD shows a result of analyzing a standard solution of an anticancer drug as a control, and the ADC is an anticancer drug collected. The result of analyzing the ADC is shown. As shown in FIG. 8, since the HPLC analysis peak of the anticancer drug collected in the ADC of the present invention was detected at the same position as the HPLC analysis peak of the standard solution, the ADC of the present invention includes a nanostructure in which the anticancer drug is collected. It was confirmed that no denaturation of the drug occurred during the preparation.

이에, 상기 ADC에 포집된 항암약물의 함량을 측정하기 위하여, 1400㎍/㎖ 농도의 항암약물을 ADC에 가하여 반응시키고, 반응액으로부터 ADC를 추출한 다음, 상기 ADC에 포집된 항암약물의 함량을 측정하였다(표 2).
Thus, in order to measure the content of the anticancer drug collected in the ADC, the anticancer drug of 1400 ㎍ / ㎖ concentration is added to the ADC to react, extract the ADC from the reaction solution, and then measure the content of the anticancer drug collected in the ADC (Table 2).

항암약물이 포집된 ADC의 수득율Yield of anticancer drug collected ADC 초기약물농도(㎍/㎖)Initial Drug Concentration (㎍ / ㎖) ADC에 포집된
최종약물농도(㎍/㎖)Captured in ADC
Final drug concentration (㎍ / ㎖) 수득률(%)Yield (%) ADCADC 14001400 462.8462.8 3333

상기 표 2에서 보듯이, ADC에 포집된 항암약물의 농도는 약 462.8㎍/㎖이었으므로, 상기 ADC는 약 33%의 수득률로 항암약물을 포집할 수 있음을 확인하였다.
As shown in Table 2, since the concentration of the anticancer drug collected in the ADC was about 462.8 μg / ml, it was confirmed that the ADC could capture the anticancer drug at a yield of about 33%.

실시예Example 4:  4: ADCADC 에 on 포집된Captured 항암물질의 함량조절 Anticancer substance content control

상기 제조된 ADC에 포집된 항암약물의 양에 따라 상기 나노구조체의 크기가 변화되는지의 여부를 확인하고자 하였다.To determine whether the size of the nanostructure is changed according to the amount of the anticancer drug collected in the prepared ADC.

즉, 상기 실시예 2에서 사용한 항암약물의 결정을 나노구조체 형성 완충용액(100 mM Tris-HCl 중 100mM 콜릭산 나트륨, pH7.4)에 용해시키고, 초음파로 처리하여 항암약물의 결정형태를 분산시켜서, 상기 콜릭산 나트륨과 항암약물이 결합된 미셀(micelle)구조체를 형성하였다. 그런 다음, 실시예 1에서 제조한 변이 ApoA-I 단백질과 상기 반응액에 포함된 미셀구조체를 1:50, 1:100 및 1:200(몰비)로 혼합하고, 이를 희석하여 콜릭산을 제거한 다음, AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 각각의 나노구조체가 용출되는 시점을 비교하여 각 나노구조체의 크기를 비교하였다(도 10). 도 10은 변이 ApoA-I 단백질과 항암약물의 비율에 따른 나노구조체의 크기변화를 나타내는 크로마토그램이다. 도 10에서 보듯이, 항암약물의 함량이 증가할 수록 나노구조체의 크기가 증가함을 알 수 있었다. 이는 하나의 나노구조체에 포집된 항암약물의 함량을 조절할 수 있고, 이처럼 하나의 나노구조체에 포집된 항암약물의 함량을 조절할 경우 이에 의하여 나노구조체의 크기가 변화된다는 점을 시사하는 것으로 분석되었다.
That is, the crystals of the anticancer drug used in Example 2 were dissolved in a nanostructure-forming buffer solution (100 mM sodium cholate, pH7.4 in 100 mM Tris-HCl), and ultrasonically treated to disperse the crystal form of the anticancer drug. In addition, the sodium cholate and the anticancer drug formed a micelle (micelle) structure. Then, the mutant ApoA-I protein prepared in Example 1 and the micelle structure included in the reaction solution were mixed at 1:50, 1: 100, and 1: 200 (molar ratio), and diluted to remove cholic acid. In addition, the size of each nanostructure was compared by comparing the time points at which each nanostructure was eluted by AKTA FPLC size exclusion chromatography (FIG. 10). 10 is a chromatogram showing the change in the size of the nanostructures according to the ratio of the mutant ApoA-I protein and the anticancer drug. As shown in Figure 10, as the content of the anticancer drug was found that the size of the nanostructure increases. This suggests that the content of the anticancer drug collected in one nanostructure can be controlled, and that the size of the nanostructure is changed by adjusting the content of the anticancer drug captured in one nanostructure.

실시예Example 5:  5: ADCADC 를 이용한 암세포의 사멸Killing cancer cells

상기 실시예 3에서 제조된 ADC의 암세포 사멸능을 확인하였다. The cancer cell killing ability of the ADC prepared in Example 3 was confirmed.

본 발명에서 제시된 ADC의 효능을 조사하기 위하여 유방암 세포주 2종을 대상으로 ADC의 세포 사멸능을 확인하였다. MCF-7은 HER2 유전자를 낮은 수준에서 발현하는 것으로 알려져 있으며 SK-Br-3은 HER2 유전자를 높은 수준으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들에 대한 항체인 Trastuzumab (INN; trade name Herceptin)은 HER2 유전자를 발현하는 세포에 대해 사멸능이 있는 것으로 알려져 있다. 항암 약물로서는 파클리탁셀을 이용하였다. In order to investigate the efficacy of the ADC presented in the present invention, the cell death ability of ADC was confirmed in two breast cancer cell lines. MCF-7 is known to express the HER2 gene at low levels and SK-Br-3 is known to express the HER2 gene at high levels. In addition, Trastuzumab (INN; trade name Herceptin), an antibody against them, is known to have an ability to kill cells expressing the HER2 gene. Paclitaxel was used as an anticancer drug.

상기의 세포를 배양한 후 약물을 처리하고 24시간 또는 48시간 후에 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 살아남아 있는 세포(즉 cell viability)를 측정하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 파클리탁셀(PTX)은 HER2를 낮은 수준으로 발현하고 있는 MCF-7 세포에 대해서는 48시간 후에 약 40%의 사멸능을 보였으나 HER2를 과발현하고 있는 SK-Br-3 세포는 거의 사멸하지 못하였다. HER2에 대한 항체인 Herceptin 은 HER2를 과발현하는 SK-Br-3를 약 40% 수준으로 사멸하였다. 실시예 3에 따라 제조된 ADC(항체로서 Herceptin, 약물로서 paclitaxel를 이용)를 처리한 경우 세포의 사멸능은 획기적으로 증가하여 90%이상의 세포들이 사멸되었다. 따라서, paclitaxel과 같은 항암제나 Herceptin과 같은 항암 항체와 같은 종래 기술에 의해서는 매우 낮은 암세포의 사멸도를 본 발명에 따른 ADC에 의해 획기적으로 증가시킬 수 있음을 증명하였다.
After culturing the cells, the cells were treated with MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) after 24 hours or 48 hours. ) Was measured. As shown in FIG. 11, paclitaxel (PTX) showed about 40% killing after 48 hours for MCF-7 cells expressing low levels of HER2, but SK-Br-3 cells overexpressing HER2 Was hardly killed. Herceptin, an antibody against HER2, killed about 40% of SK-Br-3 overexpressing HER2. When the ADC prepared according to Example 3 (Herceptin as an antibody, using paclitaxel as a drug) was treated, the cell killing ability was dramatically increased and more than 90% of the cells were killed. Thus, it has been demonstrated that by the conventional techniques such as anticancer agents such as paclitaxel or anticancer antibodies such as Herceptin, the killing rate of very low cancer cells can be dramatically increased by the ADC according to the present invention.

실시예Example 6:  6: 파클리탁셀Paclitaxel 이외의 약물을 포함하는 나노구조체의 제조 및 특성 평가 Preparation and Characterization of Nanostructures Containing Other Drugs

상기 실시예 2의 나노구조체 제조시에 사용된 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 나노구조체를 제조하고, 상기 제조된 각각의 나노구조체가 Apo A-I의 내부에 약물이 포집된 형태로 구성되는지를 확인하고자 하였다.
To prepare a nanostructure comprising a drug other than paclitaxel used in the preparation of the nanostructure of Example 2, and to determine whether each of the prepared nanostructures are composed of the drug trapped inside the Apo AI. .

실시예Example 6-1:  6-1: 파클리탁셀Paclitaxel 이외의 약물을 포함하는 나노구조체의 제조 Preparation of nanostructures containing other drugs

항암약물로서 파클리탁셀 대신에 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)를 사용하고, Apo A-I 단백질과 미셀구조를 형성한 항암약물의 비율을 1:200(몰비)으로 하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 각각의 나노구조체를 제조하였다.
Instead of paclitaxel, DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib), or EpoB (Epothilone B) was used as an anticancer drug. Except that, each nanostructure containing a drug other than paclitaxel was prepared in the same manner as in Example 2.

실시예Example 6-2:  6-2: 파클리탁셀Paclitaxel 이외의 약물을 포함하는 나노구조체의 크기분석 Size analysis of nanostructures containing other drugs

상기 실시예 6-1에서 제조한 각각의 나노구조체의 크기를 약물을 포집하지 않은 ApoA-I의 크기와 비교하였다(도 12). 도 12는 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)와 ApoA-I를 반응시켜 제조한 각각의 나노구조체의 크기를 비교한 그래프이다. 도 12에서 보듯이, 각각의 서로 다른 약물이 포집된 4종의 나노구조체는 약물을 포집하지 않은 ApoA-I과 크기면에서 거의 동일함을 알 수 있었다.The size of each nanostructure prepared in Example 6-1 was compared with the size of ApoA-I without drug capture (FIG. 12). Figure 12 is a graph comparing the size of each nanostructure prepared by reacting DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib) or EpoB (Epothilone B) and ApoA-I. As shown in FIG. 12, the four nanostructures in which the different drugs were collected were almost identical in size to ApoA-I which did not collect the drugs.

이는 나노구조체가 DX, MTX, SF 또는 EpoB를 포함할 경우에도, 파클리탁셀과 유사하게, ApoA-I의 내부에 포집된 형태로 구성됨을 의미하는 것으로 분석되었다.
This was analyzed to mean that even if the nanostructures include DX, MTX, SF or EpoB, similarly to paclitaxel, it is composed of the form trapped inside of ApoA-I.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein <130> PA120886/KR <150> KR10-2012-0019344 <151> 2012-02-24 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> ApoA-I <400> 1 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 2 <211> 777 <212> DNA <213> ApoA-I <400> 2 atgcatcacc atcaccatca cggcctggtg ccgcgcggca gcatcgatga tccgccgcag 60 agtccatggg atcgcgtgaa ggacctggcc actgtgtacg tggatgtgct caaagacagc 120 ggcagagact atgtgtctca gtttgaagga tccgccttgg gcaaacaatt gaaccttaag 180 ctgctggaca actgggacag cgtgacgtcc accttcagca agctgcgcga acagctcggc 240 cctgtgaccc aggaattctg ggataacctg gaaaaggaga cagagggcct gcgccaggag 300 atgagcaagg atctggagga ggtgaaggcc aaggtgcagc cgtacctgga cgacttccag 360 aagaagtggc aggaggagat ggagctctac cgccagaagg tggagccgct gcgcgcagag 420 ctgcaggagg gcgcgcgcca gaagctgcac gagctgcaag agaagctgag cccactgggc 480 gaggagatgc gcgaccgcgc gcgcgcccat gtcgacgcgc tgcgcacgca tctggcgccg 540 tacagcgacg agctgcgcca gcgcttagcg gcgcgccttg aggctctcaa ggagaacggc 600 ggggcccgcc tggccgagta ccacgccaag gccaccgagc atctgagcac gctcagcgag 660 aaggccaagc cggcgctcga ggacctgcgc caaggcctgc tgccggtgct ggagagcttc 720 aaggtcagct tcctgagcgc tctggaagag tacactaaga agcttaacac ccagtga 777 <210> 3 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 3 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Cys Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 4 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 4 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 5 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 5 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Cys Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <210> 6 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 6 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val 20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe 35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn 50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly 85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val 100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu 115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly 130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg 180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His 195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro 210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Cys Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn 245 250 255 Thr Gln <110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Antibody-drug conjugate comprising apolipoprotein <130> PA120886 / KR <150> KR10-2012-0019344 <151> 2012-02-24 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> ApoA-I <400> 1 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp 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        195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro     210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn                 245 250 255 Thr Gln         <210> 2 <211> 777 <212> DNA <213> ApoA-I <400> 2 atgcatcacc atcaccatca cggcctggtg ccgcgcggca gcatcgatga tccgccgcag 60 agtccatggg atcgcgtgaa ggacctggcc actgtgtacg tggatgtgct caaagacagc 120 ggcagagact atgtgtctca gtttgaagga tccgccttgg gcaaacaatt gaaccttaag 180 ctgctggaca actgggacag cgtgacgtcc accttcagca agctgcgcga acagctcggc 240 cctgtgaccc aggaattctg ggataacctg gaaaaggaga cagagggcct gcgccaggag 300 atgagcaagg atctggagga ggtgaaggcc aaggtgcagc cgtacctgga cgacttccag 360 aagaagtggc aggaggagat ggagctctac cgccagaagg tggagccgct gcgcgcagag 420 ctgcaggagg gcgcgcgcca gaagctgcac gagctgcaag agaagctgag cccactgggc 480 gaggagatgc gcgaccgcgc gcgcgcccat gtcgacgcgc tgcgcacgca tctggcgccg 540 tacagcgacg agctgcgcca gcgcttagcg gcgcgccttg aggctctcaa ggagaacggc 600 ggggcccgcc tggccgagta ccacgccaag gccaccgagc atctgagcac gctcagcgag 660 aaggccaagc cggcgctcga ggacctgcgc caaggcctgc tgccggtgct ggagagcttc 720 aaggtcagct tcctgagcgc tctggaagag tacactaaga agcttaacac ccagtga 777 <210> 3 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 3 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp   1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val              20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe          35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn      50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly  65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly                  85 90 95 Leu Cys Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val             100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu         115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly     130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr                 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg             180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His         195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro     210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn                 245 250 255 Thr Gln         <210> 4 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 4 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp   1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val              20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe          35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn      50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly  65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly                  85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val             100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu         115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly     130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr                 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg             180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His         195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro     210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn                 245 250 255 Thr Gln         <210> 5 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 5 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp   1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val              20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe          35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn      50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly  65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly                  85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val             100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu         115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly     130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr                 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg             180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Cys Leu Ala Glu Tyr His         195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro     210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn                 245 250 255 Thr Gln         <210> 6 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA-I mutant <400> 6 Met His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Asp   1 5 10 15 Asp Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val              20 25 30 Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe          35 40 45 Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn      50 55 60 Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly  65 70 75 80 Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly                  85 90 95 Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val             100 105 110 Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu         115 120 125 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly     130 135 140 Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr                 165 170 175 His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg             180 185 190 Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His         195 200 205 Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro     210 215 220 Ala Leu Glu Asp Leu Cys Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn                 245 250 255 Thr Gln        

Claims (26)

약물을 포집할 수 있고, 약물 포집시 리포단백질의 외부로 노출되는 친수성 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 변이 리포단백질.
A variant lipoprotein capable of capturing a drug, wherein at least one amino acid residue of the hydrophilic region exposed to the outside of the lipoprotein is replaced with cysteine.
제1항에 있어서,
상기 친수성 영역의 아미노산은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 리포단백질의 98번 아미노산 잔기, 166번 아미노산 잔기, 203번 아미노산 잔기, 230번 아미노산 잔기 또는 이들의 조합인 것인 변이 리포단백질.
The method of claim 1,
Wherein the amino acid of the hydrophilic region is amino acid residue 98, amino acid residue 166, amino acid residue 203, amino acid residue 230, or a combination thereof of the lipoprotein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서,
상기 치환된 시스테인을 통하여 항체와 연결될 수 있는 것인 변이 리포단백질.
The method of claim 1,
Mutant lipoprotein that can be linked to the antibody through the substituted cysteine.
제1항에 있어서,
상기 치환된 시스테인을 통하여 둘 이상의 변이 리포단백질이 상호 연결될 수 있는 것인 변이 리포단백질.
The method of claim 1,
A variant lipoprotein, wherein two or more variant lipoproteins may be interconnected through the substituted cysteine.
제1항에 있어서,
상기 리포단백질은 아포리포단백질 A, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 C 또는 아포리포단백질 E인 것인 변이 리포단백질.
The method of claim 1,
The lipoprotein is apolipoprotein A, apolipoprotein B, apolipoprotein C or apolipoprotein E is a mutant lipoprotein E.
제1항에 있어서,
서열번호 3 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 변이 리포단백질.
The method of claim 1,
A variant lipoprotein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 5.
제3항 또는 제4항에 있어서,
이황화 결합 또는 링커를 통해 연결되는 것인 변이 리포단백질.
The method according to claim 3 or 4,
A variant lipoprotein that is linked via disulfide bonds or linkers.
제7항에 있어서,
상기 링커는 일차아민과 공유결합할 수 있는 NHS(N-hydroxysuccinimide ester), 티올기와 공유결합할 수 있는 말레이미드 그룹(maleimide group) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변이 리포단백질.
The method of claim 7, wherein
The linker is a mutant lipoprotein comprising NHS (N-hydroxysuccinimide ester) which can be covalently bonded to the primary amine, a maleimide group which can be covalently bonded to a thiol group, or a combination thereof.
제8항에 있어서,
상기 링커는 m-말레이미도벤조일-설포숙신이미딜 에스테르(m-MaleimidoBenzoyl-SulfoSuccinimidyl ester)인 것인 변이 리포단백질.
9. The method of claim 8,
Wherein said linker is m-maleimidobenzoyl-sulfosuccinimidyl ester (m-MaleimidoBenzoyl-SulfoSuccinimidyl ester).
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변이 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 나노구조체.
The nanostructure in which the drug is trapped inside the three-dimensional structure of the mutant lipoprotein of any one of claims 1 to 6.
제10항에 있어서,
둘 이상의 변이 리포단백질이 치환된 시스테인을 통하여 서로 연결되어 있는 것인 나노구조체.
The method of claim 10,
Two or more mutant lipoproteins are linked to each other through substituted cysteines.
(ⅰ) 목적하는 약물을 미셀 형성가능한 계면활성제를 포함하는 완충용액에 용해 또는 분산시켜서 상기 계면활성제와 목적하는 약물이 결합된 미셀구조체를 형성하는 단계; 및
(ⅱ) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변이 리포단백질과 상기 미셀구조체를 1:50 내지 1:200(몰비)로 혼합하여 나노구조체를 형성하는 단계를 포함하는 제11항의 나노구조체를 제조하는 방법.
(Iii) dissolving or dispersing the drug of interest in a buffer containing a micelle-forming surfactant to form a micelle structure in which the surfactant and the drug of interest are combined; And
(Ii) mixing the mutant lipoprotein of any one of claims 1 to 6 with the micelle structure in a ratio of 1:50 to 1: 200 (molar ratio) to form the nanostructure of claim 11 How to make.
제12항에 있어서,
계면활성제는 콜릭산 나트륨인 것인 방법.
The method of claim 12,
The surfactant is sodium cholate.
제12항에 있어서,
상기 완충용액은 나노구조체 형성 완충용액(Tris-HCl 중 콜릭산 나트륨, pH 6~8)인 것인 방법.
The method of claim 12,
The buffer solution is a nanostructure forming buffer (sodium cholate in Tris-HCl, pH 6 ~ 8).
제12항에 있어서,
형성된 나노구조체를 포함하는 반응물을 AKTA FPLC 크기 배제 크로마토그래피에 적용하여 나노구조체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
The method of claim 12,
Applying the reactants comprising the formed nanostructures to AKTA FPLC size exclusion chromatography to purify the nanostructures.
리포단백질 및 항체가 직접 또는 링커를 통해 연결되어 있고,
분리된 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물이 포집되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
Lipoproteins and antibodies are linked directly or through a linker,
Antibody-drug conjugate (ADC) is a drug is trapped inside the three-dimensional structure of the isolated lipoprotein.
제16항에 있어서,
리포단백질은 천연단백질 또는 변이단백질인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
17. The method of claim 16,
The lipoprotein is an antibody-drug conjugate (ADC), which is a natural protein or a variant protein.
제16항에 있어서,
리포단백질의 3차원 구조 내부에 포집되어 있는 약물은 100개 분자 단위 또는 그 이상의 스케일인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
17. The method of claim 16,
Antibody-drug conjugate (ADC) is a drug trapped inside the three-dimensional structure of the lipoprotein is on the scale of 100 molecular units or more.
제17항에 있어서,
상기 천연리포단백질은 아포리포단백질 A, 아포리포단백질 B, 아포리포단백질 C 또는 아포리포단백질 E인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
18. The method of claim 17,
The natural lipoprotein is an apolipoprotein A, an apolipoprotein B, an apolipoprotein C or an apolipoprotein E that is an antibody-drug conjugate (Antibody-drug conjugate, ADC).
제17항에 있어서,
상기 리포단백질은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변이 리포단백질인 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
18. The method of claim 17,
The lipoprotein is an mutant lipoprotein of any one of claims 1 to 6 antibody-drug conjugate (Antibody-drug conjugate, ADC).
제20항에 있어서,
둘 이상의 변이 리포단백질이 치환된 시스테인을 통하여 서로 연결되어 있는 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
21. The method of claim 20,
Antibody-drug conjugates (ADCs) in which two or more variant lipoproteins are linked to each other through substituted cysteines.
제16항에 있어서,
약물을 계면활성제와 반응시켜서 미셀구조체를 형성하고, 상기 미셀구조체의 계면활성제를 리포단백질로 치환하여 리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물을 포집시킨 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
17. The method of claim 16,
Antibody-drug conjugate (ADC) in which a drug is reacted with a surfactant to form a micelle structure, and the surfactant of the micelle structure is substituted with a lipoprotein to trap the drug in the three-dimensional structure of the lipoprotein. ).
제17항에 있어서,
제10항의 나노구조체와 항체가 결합된 것인 항체-약물 결합체(Antibody-drug conjugate, ADC).
18. The method of claim 17,
Antibody-drug conjugate (ADC), wherein the nanostructure of claim 10 is bound to an antibody.
아포리포단백질 A의 3차원 구조 내부에 약물이 포집된 나노구조체.
A nanostructure in which drugs are trapped inside the three-dimensional structure of apolipoprotein A.
제24항에 있어서,
상기 약물은 파클리탁셀, DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 및 EpoB(Epothilone B)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 나노구조체.
25. The method of claim 24,
The drug is nanostructures selected from the group consisting of paclitaxel, DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib) and EpoB (Epothilone B).
(a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변이 리포단백질 또는 아포리포단백질의 3차원 구조 내부에 약물을 포집시켜 단백질 내부에 약물이 포집된 형태의 구조체를 형성하는 단계; 및,
(b) 상기 구조체에 항체를 결합시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 결합체의 제조방법.
(A) trapping the drug in the three-dimensional structure of the mutant lipoprotein or apolipoprotein of any one of claims 1 to 6 to form a structure in which the drug is trapped inside the protein; And
(b) binding the antibody to the construct, a method for producing an antibody-drug conjugate.
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