KR20130093045A - Compositions for anti-obesity comprising extract of vitis amurensis ruprecht - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: An anti-obesity composition comprising a vitis coignetiae pulliat radical extract or its solvent fraction is provided to use for functional food, a therapeutic agent, or quasi drugs agent for preventing or improving obesity or obesity related diseases. CONSTITUTION: A pharmaceutical composition for obesity prevention and treatment comprises a vitis coignetiae pulliat radical extract or its solvent fraction. A food composition for obesity prevention or improvement comprises a vitis coignetiae pulliat radical extract or its solvent fraction. A quasi drug composition for obesity prevention and improvement comprises a vitis coignetiae pulliat radical extract or its solvent fraction. A pharmaceutical composition composition for obesity prevention and treatment comprises methyl stearate as an active ingredient.

Description

머루근 추출물을 포함하는 항비만용 조성물{Compositions for anti-obesity comprising extract of Vitis amurensis ruprecht}Composition for anti-obesity comprising extract of V. aureus TECHNICAL FIELD

본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 및 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 머루근으로부터 올레아놀릭산, 팔미테이트, 메틸 스테아레이트, 및 메틸 팔미테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 분리하는 방법, 및 메틸 스테아레이트를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity, a quasi-drug composition for the prevention or improvement of obesity, and a food composition for the prevention or improvement of obesity, oleanolic acid, palmitate The present invention relates to a method for separating one or more compounds selected from the group consisting of methyl stearate, and methyl palmitate, and to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising methyl stearate as an active ingredient.

비만은 일반적으로 체내에 지방 조직이 과다한 상태인 것을 의미하며, 음식물로 섭취한 에너지가 신체활동 등으로 소비한 에너지와 균형을 이루지 못하여 잉여의 에너지가 체지방으로 축적되는 현상이다. 오랜 시간에 걸쳐 에너지 불균형에 의해 체지방이 비정상적으로 많아지면 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발되며, 이는 서구에서뿐만 아니라 우리 나라에서도 심각한 사회문제로 대두되고 있다.Obesity generally means that the body has an excessive amount of fat tissue, and the energy consumed by food is not balanced with the energy consumed by physical activity, so that surplus energy is accumulated as body fat. Abnormally increasing body fat due to energy imbalance over a long period of time leads to various metabolic diseases and adult diseases such as diabetes, hyperlipidemia, heart disease, stroke, arteriosclerosis, fatty liver, etc. have.

비만은 유전적 요인, 서구화되는 식생활에 의한 환경적 요인, 스트레스에 의한 심리적 요인, 에너지 대사의 이상 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 그리고 그 종류는 원인에 따라서 과식과 운동 부족에 의한 단순 비만과 내분비성, 시상하부성, 유전성, 대사성 등에 의한 증후성 비만으로 나눌 수 있다.Obesity is caused by a variety of causes, including genetic factors, environmental factors caused by westernized eating, psychological factors caused by stress, and abnormalities in energy metabolism. The types can be divided into simple obesity due to overeating and lack of exercise and symptomatic obesity due to endocrine, hypothalamic, hereditary and metabolic.

비만도 평가에는 체중을 측정하는 방법, 피부주름의 두께를 측정하는 방법이 있는데, 일반적으로 비만도 지수가 25 이상이면 비만으로 정의한다. 신체 비만지수(체질량지수, body mass index, BMI)는 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값이며, 서양인은 30 이상이지만 인종간의 차이를 고려하여 우리 나라에서는 25 이상을 비만으로 평가한다.There are two methods for evaluating obesity: measuring weight and measuring the thickness of skin wrinkles. Generally, if the obesity index is 25 or more, it is defined as obesity. Body obesity index (body mass index, BMI) is the weight (kg) divided by the height (m) squared. Westerners are 30 or more, but in Korea, 25 or more are assessed as obesity in consideration of ethnic differences. do.

전 세계적으로 비만 치료제의 개발을 위한 다각적인 측면의 연구가 진행되고 있다. 비만치료용 약물은 크게 지방흡수 억제, 지방 분해 및 열 발생 촉진, 식욕 및 포만감의 조절, 단백질 대사 저해 그리고 음식물의 섭취와 관련된 정서 조절 기전으로 나눌 수 있다. 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(oristat)을 원료로 하여 지방흡수를 억제하는 제니칼™(Xenical™)과 시부트라민(sibutramine)을 주원료로 교감신경계를 자극하여 식욕을 억제시키는 리덕틸™(Reductil™)이 있다. 그러나 제니칼™의 경우 지방변, 복부통증, 구토, 가려움증, 간 손상 등의 부작용이 보고되어 있으며, 리덕틸™의 경우는 두통, 식욕부진, 불면, 변비 등의 부작용뿐만 아니라 심각한 심혈관계 부작용을 일으킨다는 이유로 최근 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있다.Research on various aspects of the development of anti-obesity drugs is underway worldwide. Obesity medications can be divided into mechanisms to suppress fat absorption, promote fat breakdown and heat generation, regulate appetite and satiety, inhibit protein metabolism and affect food intake. Representatives for treating obesity include Xenical ™, which inhibits fat absorption from orystat, and Reductil ™, which suppresses appetite by stimulating the sympathetic nervous system with sibutramine. . However, Xenical ™ has reported side effects such as fatty stool, abdominal pain, vomiting, itching and liver damage.Reductil ™ has serious side effects such as headache, anorexia, insomnia and constipation as well as serious cardiovascular side effects. Recently, there is a controversy over the use of standards.

이러한 비만치료제를 통한 약물요법 이외에도 비만을 예방하고 치료하기 위한 방법으로 음식물의 섭취를 제한하는 식이요법, 에너지 소비를 증가시키는 운동요법이 있으며, 정신요법, 행동요법, 외과요법 등도 실시되고 있다.In addition to the drug therapy through the treatment of obesity, there is a diet to limit the intake of food, exercise therapy to increase the energy consumption as a method for preventing and treating obesity, psychotherapy, behavioral therapy, surgical therapy, and the like.

바람직한 비만의 치료 방법으로는 운동을 통한 에너지 소비 촉진과 부작용이 적은 비만치료용 약제를 병행하는 것이 가장 안전하고 효과적인 방법으로 제시되고 있다. 그러나 비만치료용 약제의 경우, 상기의 제니칼™과 리덕틸™의 예처럼 심각한 부작용들이 보고되고 있으며 안전성에 대한 명확한 신뢰가 뒷받침되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 인체에 대해서 항비만의 우수한 효능을 나타내면서도 안전성이 보장되는 물질의 개발이 요구되고 있다. As a preferred method of treating obesity, promoting energy consumption through exercise and combining obesity treatment drugs with fewer side effects have been suggested as the safe and effective method. However, in the case of drugs for the treatment of obesity, serious side effects have been reported, such as the examples of XENALAL ™ and REDUCTIL®, and there is no clear trust in safety. Therefore, there is a demand for the development of a substance which shows excellent efficacy of anti-obesity against the human body while ensuring safety.

이에, 본 발명자들은 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 비만의 치료 효과가 우수한 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 머루근의 추출물 또는 이의 분획물이 세포에 독성을 일으키지 않는 범위 내에서 중성 지방의 생성을 유의적으로 억제할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors have made efforts to find a substance excellent in the treatment effect of obesity without causing side effects on the human body, and as a result, the production of triglycerides significantly within the range in which the extract or fraction thereof of the root muscle does not cause toxicity to the cells. This invention was completed by confirming that it can suppress.

본 발명의 목적은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity, including melon root extract or a solvent fraction thereof.

본 발명의 다른 목적은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention to provide a quasi-drug composition for the prevention or improvement of obesity, including the extract of the myrtle root or a solvent fraction thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving obesity, including melon root extract or a solvent fraction thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 머루근으로부터 올레아놀릭산(oleanolic acid), 팔미테이트(palmitate), 메틸 스테아레이트(methyl stearate), 및 메틸 팔미테이트(methyl palmitate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to separate one or more compounds selected from the group consisting of oleanolic acid, palmitate, methyl stearate, and methyl palmitate To provide a way.

본 발명의 또 다른 목적은 메틸 스테아레이트(methyl stearate)를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity, including methyl stearate (methyl stearate) as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity, including melon root extract or a solvent fraction thereof.

본 발명에서 "머루(Vitis amurensis ruprecht)"는 갈매나무목 포도과의 덩굴식물로 달고 신맛과 독특한 향을 갖는 자색의 열매가 열리는 식물을 의미할 수 있다. In the present invention, "Meat ( Vitis amurensis ruprecht) "is a vine of buckthorn grape vines and may refer to a plant that has a sweet, sour and purple fruit with a unique aroma.

본 발명에서 "머루근"은 머루의 뿌리 부위를 의미할 수 있다.In the present invention, "root muscle" may refer to the root of the root.

식물은 추출 부위에 따라서 각 추출물 또는 이의 분획물의 활성 여부, 활성의 정도, 및 이에 포함되는 구체적인 성분이 상이할 수 있다. Plants may differ in the activity, degree of activity, and specific components included in each extract or fractions thereof depending on the extraction site.

본 발명은 머루(Vitis amurensis ruprecht)의 열매, 꽃, 씨, 줄기, 잎 등의 여러 부위 중에서, 뿌리의 추출물 또는 용매 분획물의 비만의 예방 또는 치료 용도를 처음으로 밝힌 것이다. 본 발명의 머루 뿌리의 추출물 또는 용매 분획물은 소량으로도 비만 치료 효과가 우수하다.The present invention is a Vitis Among the various parts of fruits, flowers, seeds, stems, leaves, etc. of amurensis ruprecht, the extract of the root or solvent fraction is the first to reveal the purpose of preventing or treating obesity. Extract or solvent fraction of the root of the present invention of the present invention is excellent in the treatment of obesity even in a small amount.

또한, 본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물에는 항비만 활성을 나타내는 올레아놀릭산(oleanolic acid), 팔미테이트(palmitate), 및 메틸 스테아레이트(methyl stearate)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이 포함된 것일 수 있다. In addition, the extract of the present invention or the solvent fraction thereof contains at least one compound selected from the group consisting of oleanolic acid, palmitate, and methyl stearate, which exhibit anti-obesity activity. It may be.

본 발명에서 머루는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.In the present invention, the beets may be purchased and used commercially, or may be used collected or grown in nature.

상기 머루근 추출물은 머루근 또는 그의 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득할 수 있다. The root root extract may be obtained by extracting root root or a comminuted product thereof with water, an alcohol having 1 to 6 carbon atoms, or a mixed solvent thereof.

구체적으로 머루근 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 세척 및 건조로 이물질이 제거된 머루의 뿌리를 분쇄하여 얻은 머루 건조물을 물, C1~C6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C1~C4의 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 이때, 추출용매는 머루근의 건조중량의 2 ~ 20 배로 하는 것이 바람직하다. 일례로 머루 뿌리를 분말로 파쇄한 후 추출용기에 넣고 C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올을 넣고 60~80℃에서 추출하여, 알코올 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 추출 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.Specifically, the method of preparing the extract of Murus ginseng may be a conventional extraction method such as ultrasonic extraction, filtration and reflux extraction. Preferably, the dried dried fruit obtained by pulverizing the root of the dried off the foreign matter by washing and drying may be an extract extracted with water, C 1 ~ C 6 alcohol or a mixed solvent thereof, more preferably C 1 ~ C It may be an extract extracted with an alcohol of 4 , most preferably may be an extract extracted with methanol. At this time, the extraction solvent is preferably 2 to 20 times the dry weight of the root roots. For example, after crushing the roots of the roots with powder and put in an extraction container, a lower alcohol of C 1 ~ C 4 or a mixed solvent thereof, preferably in methanol and extracted at 60 ~ 80 ℃, to obtain an alcohol extract. At this time, after extraction may be further subjected to a method such as concentration or lyophilization.

한편, 본 발명에서 머루근 추출물의 분획물은 상기 추출물로부터 분획하여 얻을 수 있으며, 분획용매는 그 종류가 제한되지 않는다. 예를 들어, 보다 구체적으로, 상기 머루근 분획물은 머루근 추출물을 물 및 디클로로메탄으로 각각 분획함으로써 물 분획물 및 디클로로메탄 분획물을 각각 얻을 수 있다. 또한, 물 분획물을 다시 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻을 수 있고, 남은 물 분획물을 또 다시 n-부탄올로 분획하여 n-부탄올 분획물을 얻을 수 있다. 본 발명에서 머루근 추출물의 분획물은 바람직하게, 디클로로메탄 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 또는 이의 조합일 수 있다. On the other hand, in the present invention, the fraction of the root extract extract can be obtained by fractionation from the extract, the fraction solvent is not limited in kind. For example, more specifically, the melon root fraction can be obtained by dividing the melon root extract with water and dichloromethane, respectively, water fraction and dichloromethane fraction. In addition, the water fraction may be fractionated with ethyl acetate again to obtain an ethyl acetate fraction, and the remaining water fraction may be fractionated with n -butanol again to obtain an n -butanol fraction. In the present invention, the fraction of the root root extract may preferably be a dichloromethane fraction or an ethyl acetate fraction or a combination thereof.

본 발명의 일 실시예에서는 우수한 항비만 활성을 갖는 머루근 추출물 또는 이의 분획물에서 항비만 활성의 핵심 작용물질을 찾아내기 위하여, 머루근 추출물의 디클로로메탄 분획물으로부터 물질 분리를 수행한 결과, 상기 디클로로메탄 분획물에 올레아놀릭산, 팔미테이트, 및 메틸 스테아레이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이 포함되어 있음을 확인하였다. 특히, 올레아놀릭산 또는 메틸 스테아레이트는 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 및 지방 생성 억제 활성이 우수함을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, in order to find a key agonist of anti-obesity activity in the extract of the myrtle root or the fraction thereof having excellent anti-obesity activity, as a result of performing the material separation from the dichloromethane fraction of the myrtle extract, the dichloromethane It was found that the fraction contained at least one compound selected from the group consisting of oleanolic acid, palmitate, and methyl stearate. In particular, it was confirmed that oleanolic acid or methyl stearate has excellent activity of inhibiting the differentiation and adipogenesis of adipocytes into adipocytes.

본 발명에서 올레아놀릭산(oleanolic acid)은 올레아난 골격이 있는 트리테르펜의 일종으로서, 항염증 효과, 항암 활성, 항바이러스 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 하기의 화학식 1의 구조를 가진다. In the present invention, oleanolic acid (oleanolic acid) is a kind of triterpene having an oleanane skeleton, and is known to have an anti-inflammatory effect, anticancer activity, and antiviral activity, and has a structure of Formula 1 below.

Figure pat00001
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또한, 팔미테이트(palmitate)는 탄소 16개로 이루어진 포화 지방산의 염으로써, 하기의 화학식 2의 구조를 갖는다.In addition, palmitate (palmitate) is a salt of a saturated fatty acid consisting of 16 carbons, and has the structure of formula (2).

Figure pat00002
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상기 메틸 스테아레이트(methyl stearate)는 18개의 탄소로 구성된 포화 지방산인 스테아린산의 메틸 에스테르로서, 하기의 화학식 3의 구조를 갖는다. The methyl stearate is a methyl ester of stearic acid, which is a saturated fatty acid composed of 18 carbons, and has a structure of Formula 3 below.

Figure pat00003
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본 발명에서, "비만"이란 체중의 증가로 인해 건강에 부적절한 상태를 초래하는 것으로 에너지 섭취가 에너지 소비보다 많아서, 소비되지 않고 남은 과잉 에너지가 여러 가지 지질의 형태로 체지방으로 축적되거나 혈액 내에 지질의 함량이 높아진 상태를 말할 수 있다. In the present invention, "obesity" refers to an inadequate state of health due to an increase in weight, so that the energy intake is greater than the energy consumption, so that the excess energy left unconsumed accumulates in body fat in the form of various lipids, or It can be said that the content is high.

본 발명의 일 실시예에서는 머루근 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물인 팔미테이트, 메틸 스테아레이트, 및 올레아놀릭산이 세포 독성이 없는 범위 내에서 중성 지방의 생성을 현저히 억제할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명의 조성물은 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 비만을 예방 또는 치료할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the extract of the myrtle root, fractions thereof, or the compounds isolated therefrom, palmitate, methyl stearate, and oleanolic acid can significantly inhibit the production of triglycerides within a range that is not cytotoxic. As confirmed, the composition of the present invention can prevent or treat obesity without causing side effects on the human body.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 머루근 추출물, 또는 이의 분획물이 지방 생성 과정에 관여하는 주요 핵심 조절자인 C/EBPα, C/EBPβ, 그리고 PPARγ 유전자 및 단백질 발현을 현저히 저해하는 것을 확인하였다. 특히, C/EBPβ는 지방전구세포의 지방세포로의 분화 초기에, C/EBPα 및 PPARγ는 분화 중기에 작용하는 단백질로 알려져 있으므로, 본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 분획물은 지방 전구세포의 지방세로의 분화 과정에서 초기, 중기, 및 후기 단계를 모두 억제할 수 있으므로, 비만의 예방 및 치료에 유용히 사용될 수 있다. In addition, in one embodiment of the present invention, it was confirmed that the root extract, or fractions thereof, significantly inhibited the expression of C / EBPa, C / EBB, and PPARγ genes and proteins, which are major key regulators involved in the fat production process. In particular, C / EBPβ is known to be a protein that acts early in the differentiation of adipocytes into adipocytes, while C / EBPa and PPARγ are known to act as proteins during the differentiation period. Since the early, middle, and late stages can be suppressed in the differentiation process, it can be usefully used for the prevention and treatment of obesity.

비만이 발생하면, 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 지방생성을 억제하여 비만을 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 비만으로부터 파생되는 비만 관련 질환, 예를 들어, 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다. When obesity occurs, various metabolic diseases and adult diseases such as diabetes, hyperlipidemia, heart disease, stroke, arteriosclerosis, fatty liver, and the like can be induced. The composition of the present invention can not only treat fat by inhibiting lipogenesis, but also improve various metabolic diseases such as obesity-related diseases derived from obesity, such as diabetes, hyperlipidemia, heart disease, stroke, arteriosclerosis, fatty liver, Can be prevented or treated.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.As used herein, the term "prevention" refers to any action that inhibits or delays the development of such obesity or obesity-related diseases by administration of a composition according to the invention.

본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 비만 또는 비만 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.As used herein, the term "treatment" refers to any action that improves or beneficially alters the symptoms of the obesity or obesity-related disease by administration of a composition according to the invention.

본 발명의 약학 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 항비만 효과를 가진다고 알려진 약학 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may also be used as a single agent, and may be prepared and used as a complex preparation further including a pharmaceutical composition known to have a recognized anti-obesity effect.

본 발명의 약학 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여, 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in a pharmaceutical unit dosage form by adding a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent.

상기 "약학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.By "pharmaceutically acceptable" is meant that it does not significantly irritate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered active substance.

본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier in the present invention may be a variety of oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.The pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. It may have a formulation of.

또한, 본 발명의 조성물에서 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물은 약제학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 상기 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물은 조성물에 0.001 내지 1500㎍/ml로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게 0.001 내지 1000㎍/ml으로 포함될 수 있다.
In addition, the root extract or solvent fraction thereof in the composition of the present invention may be included in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the type and severity of the subject, the severity, age, sex and activity of the drug. , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art. Preferably, in the present invention, the root extract or the solvent fraction thereof may be included in the composition at 0.001 to 1500 µg / ml, more preferably at 0.001 to 1000 µg / ml.

다른 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 약학 조성물을 비만의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하여 비만 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating obesity or obesity-related diseases by administering to the subject in need of the prevention or treatment of obesity, a pharmaceutical composition comprising an extract of the myrium root or a solvent fraction thereof.

상기 비만 관련 질환은 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환일 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The obesity-related diseases include, but are not limited to, various metabolic diseases such as diabetes, hyperlipidemia, heart disease, stroke, arteriosclerosis, fatty liver, and the like.

상기 개체는 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체로서, 인간뿐만 아니라 비만 또는 비만 관련 질환 및 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. The subject is in need of the prevention or treatment of obesity or obesity-related diseases, such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, nutrition, dogs that require the treatment of obesity or obesity-related diseases and similar symptoms as well as humans , Mammals such as cats, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. As used herein, the term "administration" means introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention may be various oral or parenteral routes as long as it can reach the desired tissue. It can be administered through.

본 발명의 비만, 또는 비만 관련 질환의 치료방법은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
A method of treating obesity, or obesity-related diseases of the present invention, comprises administering a medicinal extract of Murus root or a solvent fraction thereof. It will be apparent to those skilled in the art that the appropriate total daily dose may be determined by the practitioner within the scope of sound medical judgment. In addition, it can be administered once or several times in divided doses. For purposes of the present invention, however, the specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend upon the nature and extent of the reaction to be achieved, the particular composition, including whether or not other agents are used, the age, weight, Sex and diet of the patient, the time of administration, the route of administration and the rate of administration of the composition, the duration of the treatment, the drugs used or concurrently used with the specific composition, and similar factors well known in the medical arts.

또 다른 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a quasi-drug for the prevention or improvement of obesity, including the melon root extract or a solvent fraction thereof.

상기 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 비만의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다. The melon root extract or a solvent fraction thereof is as described above. More specifically, the composition of the present invention can be added to the quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving obesity.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.As used herein, the term "quasi drug" refers to a fiber, a rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a human or animal, has a weak action on the human body or does not directly act on the human body, Or non-machinery and the like, or any of the agents used for sterilization, insecticide and similar purposes for the purpose of preventing infection, for the purpose of diagnosing, treating, reducing, treating or preventing human or animal diseases. Means the goods used are not instruments, machines or devices, and the items used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of humans or animals except those which are not devices, machines or devices.

본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.When the composition of the present invention is used as an quasi-drug additive, the extract or fraction may be added as it is, or used together with other quasi-drugs or quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method. The amount of the active ingredient to be mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use.

본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터충진제일 수 있다.
The quasi-drug composition of the present invention is not limited thereto, but may preferably be a disinfectant cleaner, a shower foam, a gagreen, a wet tissue, a detergent soap, a hand wash, a humidifier filler, a mask, an ointment, a patch, or a filter filler.

또 다른 양태로서, 본 발명은 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a food composition for the prevention or improvement of obesity, including the root extract extract or a solvent fraction thereof.

상기 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.The melon root extract or a solvent fraction thereof is as described above.

상기 식품 조성물은 비만, 또는 상기 설명한 비만 관련 질환의 발생 억제에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다. The food composition may have a function of helping to suppress the development of obesity, or the above-described obesity-related diseases.

본 발명의 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.Food composition for the prevention or improvement of obesity of the present invention includes the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules or liquids, and the like foods to which the composition of the invention can be added, Foods such as beverages, gum, tea, vitamin complexes, dietary supplements, and the like.

상기 식품 조성물에는 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물 이외에도 항비만 활성에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. In addition to the root extract or the solvent fraction thereof, the food composition may be added with other ingredients that do not interfere with anti-obesity activity, and the kind thereof is not particularly limited. For example, various herbal medicine extracts, food-acceptable food-aid additives or natural carbohydrates, such as ordinary foods, may be added as an additional ingredient.

본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.The term "food supplementary additive " in the present invention means a component which can be added to foods in a supplementary manner, and it can be appropriately selected and used by those skilled in the art as added to produce health functional foods of each formulation. Examples of food additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, Although pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like are included, the examples of the food additives of the present invention are not limited by the above examples.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.Examples of such natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those mentioned above, natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. .

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다. The food composition of the present invention may include a health functional food. In the present invention, the term "health functional food" refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body. Here, the term "functionality" means that the structure and function of the human body are controlled to obtain nutritional effects or effects useful for health use such as physiological actions. The health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art. In addition, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug with food as a raw material, can be excellent in portability.

유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, during the preparation of food products, the extract of the root of the present invention or the solvent fraction thereof is added in an amount of 1 to 10% by weight, preferably 5 to 10% by weight in the raw material composition. However, in the case of long-term ingestion intended for health and hygiene purposes or for the purpose of controlling health, the amount can also be used in the above-mentioned range.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
There is no particular limitation on the kind of the food. Examples of the food to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include healthy foods in a conventional sense.

또 다른 양태로서, 본 발명은 머루근을 물,C1~C4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 물 또는 비극성 유기 용매로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및 상기 분획물을 분리, 정제하는 단계를 포함하는, 머루근으로부터 올레아놀릭산(oleanolic acid), 팔미테이트(palmitate), 메틸 스테아레이트(methyl stearate), 및 메틸 팔미테이트(methyl palmitate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 분리하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention comprises the steps of extracting the roots with water, C 1 ~ C 4 alcohol, or a mixed solvent thereof to obtain an extract; Fractionating the extract with water or a non-polar organic solvent to obtain a fraction; And separating and purifying the fraction, selected from the group consisting of oleanolic acid, olemitic acid, palmitate, methyl stearate, and methyl palmitate Provided are methods for separating one or more compounds.

본 발명에서는 머루근 추출물 또는 분획물에서 올레아놀릭산, 팔미테이트, 메틸 스테아레이트, 및 메틸 팔미테이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물이 분리될 수 있음을 처음으로 확인하였다. In the present invention, it was first confirmed that at least one compound selected from the group consisting of oleanolic acid, palmitate, methyl stearate, and methyl palmitate can be isolated from the extract of the myrtle root.

구체적으로, 머루근을 물, C1~C4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 머루근을 메탄올로 추출하여 메탄올 추출물을 얻을 수 있다. Specifically, extracting the root roots with water, C 1 ~ C 4 alcohol, or a mixed solvent thereof to obtain an extract. Preferably, the extract is extracted with methanol to obtain a methanol extract.

또한, 상기 단계에서 얻어진 머루근 추출물을 물 또는 비극성 유기 용매를 이용하여 분획물을 얻는 단계를 포함한다. 상기 비극성 유기 용매로는 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매일 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄이다. In addition, the step of obtaining the fraction using the melon root extract obtained in the above step using water or a non-polar organic solvent. The nonpolar organic solvent may be hexane, ether, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, or a mixed solvent thereof, preferably dichloromethane.

상기와 같이 얻어진 비극성 용매 분획물, 즉 비극성 용매 가용층에 대해 크로마토그래피를 1회 이상 순차적으로 수행함으로써 활성 성분을 분리할 수 있으며, 크로마토그래의 컬럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다.
The active ingredient can be separated by performing chromatography one or more times on the nonpolar solvent fraction, ie, the nonpolar solvent soluble layer, obtained as described above, and the type and developing solvent of the column of the chromatograph can be variously controlled.

또 다른 양태로서, 본 발명은 메틸 스테아레이트(methyl stearate)를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. As another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity, including methyl stearate (methyl stearate) as an active ingredient.

본 발명의 일 실시예에서는 머루근 추출물의 분획물로부터 분리된 메틸 스테아레이트, 팔미테이트, 또는 올레아놀릭산이 지방 전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고, 지방 생성을 감소시키는 것을 확인함으로써, 상기 화합물을 항비만 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, the compound by confirming that methyl stearate, palmitate, or oleanolic acid isolated from the fraction of the myrtle root extract inhibits the differentiation of adipocytes into adipocytes and reduces fat production. It was confirmed that it can be used for anti-obesity use.

상기 메틸 스테아레이트는 머루근 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 것이 바람직하다. The methyl stearate is preferably isolated from the myrtle root extract or fractions thereof.

상기 화합물 및 약학 조성물은 상기 설명한 바와 동일하다.
The compound and the pharmaceutical composition are the same as described above.

본 발명의 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 항비만용 조성물은 세포 독성이 낮은 장점을 보유하면서도 지방생성을 저해할 수 있으므로, 비만 또는 비만 관련 질환의 치료제, 또는 비만 또는 비만 관련 질환을 예방 또는 개선시킬 수 있는 기능성 식품 및 의약외품 제제로 유용히 사용할 수 있다. The anti-obesity composition comprising the extract of the present invention or the solvent fraction thereof has low merit of cytotoxicity and may inhibit fat production, thereby preventing obesity or obesity-related diseases, or preventing obesity or obesity-related diseases. Or it can be usefully used as a functional food and quasi-drug preparation which can be improved.

도 1은 머루근 추출물 및 이의 용매 분획물의 분획 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 머루근 메탄올 추출물(a) 및 이의 용매 분획물(b)이 3T3-L1 지방전구세포의 독성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 머루근 메탄올 추출물이 지방전구세포의 형태적 변화 및 지방 축적(a), 중성지방(TG) 함량(b)에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 머루근의 추출물(VARM) 및 용매 분획물이 지방전구세포의 형태학적 변화에 미치는 영향(a) 및 지방 축적에 미치는 영향(b)을 나타낸 것이다.
도 5는 머루근 추출물 (VARM) 및 이의 각 용매 분획물이 지방전구세포의 중성지방(TG) 함량에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 머루근 추출물의 CH2Cl2 분획층이 지방생성 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 결과로 나타낸 것이고(a), 지방생성 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯 분석 결과(b)로 나타낸 것이다.
도 7은 머루근 추출물의 추출, 분획, 및 이로부터 활성 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 머루근 추출물의 CH2Cl2 분획층으로부터 분리된 활성 화합물이 지방 전구세포의 형태학적 변화(a), 지방 축적(b), 및 TG 함량(c)에 미치는 영향을 나타낸 것이다. Figure 1 shows a process for producing a fraction of the root extract and solvent fractions thereof.
Figure 2 shows the effect of the extract of melon root methanol (a) and its solvent fraction (b) on the toxicity of 3T3-L1 adipocytes.
Figure 3 shows the effect of the extract of melon root methanol on the morphological changes and fat accumulation (a), triglyceride (TG) content (b) of the progenitor cells.
Figure 4 shows the effect of the extract (VARM) and the solvent fraction of the root muscle on the morphological changes of fat precursor cells (a) and the effect on fat accumulation (b).
Figure 5 shows the effect of the extract of the root muscle (VARM) and each solvent fraction thereof on the triglyceride (TG) content of fat precursor cells.
6 is CH 2 Cl 2 of the root extract The effect of the fractionation layer on the expression of adipogenesis-related genes is shown by RT-PCR results (a), and the effect on the expression of adipogenesis-related proteins is shown by Western blot analysis (b).
Figure 7 shows the extraction, fractionation, and separation of the active compound from the extract of the myrtle root.
8 is CH 2 Cl 2 of the root extract The effect of the active compound isolated from the fractionation layer on the morphological changes (a), fat accumulation (b), and TG content (c) of the fat progenitor cells.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1:  One: 머루근Root 추출물 및 용매  Extracts and Solvents 분획물의Fraction 제조 Produce

머루근 5 kg을 측량하여 분말로 파쇄한 후 메탄올을 이용하여 추출하였다. 시료의 5배 부피의 메탄올 용매를 가한 후 65℃에서 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압 농축기로 농축한 후 동결건조 (FDU-2100, EYELA, Japan)하였다. 용매 분획은 감압 농축한 농축액을 물 (H2O) 층과 디클로로메탄(dichloromethane, CH2Cl2, C)층으로 분획하고, 물 층은 다시 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc, E)층과 물 층으로 분리하였다. 남은 물 층은 또 다시 n-부탄올(n-butanol, n-BuOH, B)층과 물 층으로 분획하여 각각의 분획을 감압 농축하였다. 머루근의 메탄올 추출물과 이의 용매 분획물의 분획 과정은 도 1에 나타내었다.
5 kg of melon root was weighed, crushed into powder, and extracted with methanol. A 5-fold volume of methanol solvent was added to the sample, followed by extraction three times at 65 ° C. The extracted sample was filtered and concentrated under reduced pressure concentrator and then lyophilized (FDU-2100, EYELA, Japan). The solvent fraction is concentrated under reduced pressure, and the concentrate is partitioned into a water (H 2 O) layer and a dichloromethane (CH 2 Cl 2 , C) layer, and the water layer is again an ethylacetate (EtOAc, E) layer and a water layer. Separated. The remaining water layer was further divided into an n -butanol ( n -butanol, n -BuOH, B) layer and a water layer, and each fraction was concentrated under reduced pressure. The fractionation process of the methanol extract of melon root and its solvent fraction is shown in FIG. 1.

실시예Example 2:  2: 머루근Root 추출물 및 용매  Extracts and Solvents 분획물이The fraction 3 3 T3T3 -- L1L1 지방전구세포의 세포 생존율에 미치는 영향 Effect of Cell Proliferation on Adipose Progenitor Cells

머루근 추출물 및 이의 용매 분획물의 항비만 활성 분석 수행 전, 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 WST 분석법을 이용하여 독성 평가 실험을 수행하였다. Before performing the anti-obesity activity analysis of the extract of the myrtle root and its solvent fractions, toxicity evaluation experiments were performed using the WST assay to determine the treatment concentration of the sample that does not cause cytotoxicity.

머루근 메탄올 추출물 및 용매 분획물이 마우스 지방전구 세포주(Mouse preadipocyte cell line)인 3T3-L1(ATCC에서 구입)의 세포 생존율에 미치는 영향을 살펴보았다.The effects of the extract of M. root extract and solvent fractions on cell viability of the mouse preadipocyte cell line 3T3-L1 (purchased from ATCC) were examined.

구체적으로, 1X 105 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트(tissue culture plate)에 분주하여 24 시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72 시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.Specifically, 1 × 10 5 cells were dispensed on a 24-well tissue culture plate and attached for 24 hours, followed by incubation for 72 hours by treating the samples by concentration. After treatment, the sample was replaced with a medium containing WST reagent and reacted for 1 hour, and then absorbance was measured at 450 nm using a multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA). The measured value was expressed as the average value of three replicates and subsequent experiments were performed in a concentration range that does not cause toxicity.

독성 평가 실험 결과, 도 2a에 제시한 바와 같이 0에서 1000 μg/mL의 처리 농도 범위에서 세포독성을 거의 유발하지 않았으며 특히 1000 μg/mL의 고농도 처리에 의해서도 세포생존율이 92%로 높게 나타나 머루근 추출물이 낮은 독성의 안전성이 높은 소재임을 확인하였다. 이에 먼저 머루근 추출물의 지방 생성 억제능의 분석을 0에서 1000 μg/mL까지 다양한 농도 범위에서 분석하였다.
As shown in FIG. 2A, the toxicity test results showed almost no cytotoxicity in the treatment concentration range of 0 to 1000 μg / mL. Especially, when the treatment concentration was as high as 1000 μg / mL, the cell survival rate was as high as 92% The muscle extracts showed low toxicity and high safety. First, the analysis of the ability to inhibit the fat production of the extract of wild roots was analyzed in various concentration ranges from 0 to 1000 μg / mL.

실시예Example 3:  3: 머루근Root 추출물 및 용매  Extracts and Solvents 분획물이The fraction MDIMDI 로 유도한 3Guided by 3 T3T3 -- L1L1 지방전구세포의 지방 생성 과정( Fat Producing Process of Adipose Progenitor Cells ( adipogenesisadipogenesis )에 미치는 영향)

먼저, 마우스 지방전구 세포주인 3T3-L1을 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 0.5 μM IBMX (3-이소부틸-1-메틸크산틴), 1 μM 덱사메타손(Dexamethasone), 10 μg/mL의 인슐린(insulin)(이하 MDI)을 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하였다.First, 3T3-L1, a mouse fat precursor cell line, was cultured in DMEM medium containing 10% FBS and penicillin / streptomycin. Differentiation into adipocytes was induced by treatment with 0.5 μM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), 1 μM dexamethasone, 10 μg / mL of insulin (hereinafter MDI).

12-웰 조직 배양 플레이트(tissue culture plate)에 웰 당 2X 105개의 세포를 분주하고 2일 후 10% FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 인슐린과 시료를 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 오일 레드 O 염색(Oil red O staining)을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 1× PBS로 씻어준 다음 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 오일 레드 O 염색 용액을 처리한 후 30분간 염색하였다. 염색 완료 후 100% 이소프로판올을 사용하여 염색된 지방을 추출하고 multi-plate reader를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.2 × 10 5 cells per well were dispensed into 12-well tissue culture plates and replaced with medium containing 10% FBS after 2 days. After 2 days, the samples were treated by concentration while replacing with medium containing MDI, and a total of 4 times insulin and samples were treated every two days. Two days after the last sample was processed and observed with a phase contrast microscope, the degree of adipocyte differentiation and the degree of differentiation inhibition by the sample were observed at 200 times magnification. Oil red O staining). After the adipocyte differentiation and sample treatment, the cells were washed with 1 × PBS, fixed with 10% formalin, and stained for 30 minutes after treatment with an oil red O staining solution. After staining, the stained fat was extracted using 100% isopropanol, and the absorbance was measured at 500 nm using a multi-plate reader.

그 결과 도 3a에 제시된 바와 같이, 처리한 모든 농도 범위에서 지방 세포 분화가 농도 의존적으로 강하게 억제되었고 오일 레드 O 염색 결과 염색된 지방의 수가 급격히 감소됨을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 3a, it was confirmed that the fat cell differentiation was strongly inhibited concentration-dependently in all concentration ranges treated, and the number of dyed fats rapidly reduced as a result of oil red O staining.

지방 생성의 억제 정도를 정량적으로 평가하기 위해 염색된 지방을 추출하여 TG 생성량의 정도를 측정한 결과, 10에서 1000 μg/mL의 시료 처리 범위에서 농도의존적으로 유의적인 감소를 나타내어 억제능의 정도는 10, 50, 100, 200, 500, 1000 μg/mL의 처리에 의해 각각 12, 44, 54, 61, 75, 86 %로 나타났다. 이러한 결과를 통해 산출한 지방 생성 저해능의 50% 억제농도(Inhibitory concentration), 즉 IC50 값이 80 μg/mL로 나타나 머루근 추출물이 비교적 낮은 농도에서도 높은 지방 생성 억제능을 보유함을 확인하였다(도 3b).In order to quantitatively evaluate the degree of inhibition of fat production, stained fats were extracted and the level of TG production was measured. As a result, a concentration-dependent decrease was found in the sample processing range of 10 to 1000 μg / mL, indicating that the degree of inhibition was 10 , 50, 100, 200, 500, and 1000 μg / mL of treatment resulted in 12, 44, 54, 61, 75, 86%, respectively. These results indicate that the 50% Inhibitory concentration, or IC 50 value, of the fat-inhibiting activity calculated by the IC 50 value was 80 μg / mL, indicating that the extract of Rooted Root Root had high fat-producing ability even at relatively low concentrations (Fig. 3b).

이와 같은 결과는 본 발명의 머루근 추출물 또는 용매 분획물이 효과적으로 TG의 생성을 저해하는 것을 입증하는 것이며, 이는 지방세포 분화를 억제하여 비만 또는 비만으로부터 파생되는 비만 관련 질환의 치료 또는 예방 효과가 있다는 것을 시사하는 것이다.
These results demonstrate that the root extract or solvent fraction of the present invention effectively inhibits the production of TG, which inhibits adipocyte differentiation and has the effect of treating or preventing obesity-related diseases derived from obesity. It is suggestive.

실시예Example 4:  4: 머루근Root 추출물 및 용매  Extracts and Solvents 분획물의Fraction 세포 독성 및 지방 생성 과정( Cytotoxicity and fat production process ( adipogenesisadipogenesis )에 미치는 영향)

머루근 추출물의 항비만 활성 보유 물질의 분리를 위해 용매 분획을 실시한 후, 먼저 머루근 추출물과 각 용매 분획물이 3T3-L1 지방전구세포(preadipocyte)의 세포 생존율에 미치는 영향을 비교 분석하였다. 그 결과, 도 4a에 제시된 바와 같이 머루근 추출물과 이의 4종의 분획물 모두에서 강한 세포 독성은 관찰되지 않아 머루근 추출물, n-BuOH, H2O 층은 1000 μg/mL의 고농도 처리에서도 각각 92, 94, 90%의 세포생존율을 나타내었으며, EtOAc 층은 그 보다 다소 낮아 250, 500, 750, 1000 μg/mL의 처리에 의해 각각 94, 89, 86, 82%의 세포생존율을 보였다. CH2Cl2 층의 경우 또한 EtOAc 층과 유사한 경향을 보여 250, 500, 750 μg/mL의 처리에 의해서는 각각 91, 86, 82%의 세포 생존율을 보였으나 1000 μg/mL의 고농도 처리에서는 53%의 세포생존율을 보였다. 이와 같은 추출물 및 분획물이 3T3-L1 지방전구세포의 세포생존율에 미치는 영향과 머루근 추출물에 의한 지방 세포 분화 억제능의 결과를 바탕으로 추출물 및 각 분획물이 MDI에 의한 지방 세포로의 분화 및 지방 생성에 미치는 영향을 100 μg/mL 이하의 농도 범위에서 관찰하였다. 그 결과, 도 4a 및 4b에 제시한 바와 같이 20, 50, 100 μg/mL의 추출물 및 분획물의 처리에 의해서도 물 층을 제외한 모든 분획물에서 유의적인 지방 세포 분화 억제능을 보였으며 도 5에 제시된 바와 같이 농도의존적인 TG 생성 억제능을 보였다. 지방 생성 억제능의 정도는 EtOAc, CH2Cl2, n-BuOH 층의 순으로 EtOAc 층에서 가장 높게 나타났으나, 세포 생존율 측정에서는 독성을 나타내지 않았던 EtOAc 층 분획물이 분화된 지방세포에서는 독성을 보이는 것으로 판단되어 미분화 세포와 분화된 지방세포 모두에서 독성의 유발 없이 높은 지방생성 억제능을 보유하면서 그 활성의 정도가 가장 강하게 나타난 CH2Cl2 층 분획물을 대상으로 이후 실험을 수행하였다.
After solvent fractionation was performed to isolate anti-obesity activity-bearing substances of the extract, first, the effect of the extract and each solvent fraction on the cell viability of 3T3-L1 preadipocytes was analyzed. As a result, as shown in Fig. 4a, strong cytotoxicity was not observed in both the extract and the four fractions thereof, so the extract of the root, n- BuOH, and H 2 O layers were respectively 92 even at the high concentration of 1000 μg / mL. , 94, 90% cell viability, the EtOAc layer was slightly lower than that of the cell viability of 94, 89, 86, 82% by treatment of 250, 500, 750, 1000 μg / mL respectively. The CH 2 Cl 2 layer also showed a similar tendency to the EtOAc layer, which showed cell viability of 91, 86 and 82% by treatment of 250, 500 and 750 μg / mL, respectively. Cell viability of% was shown. Based on the effect of these extracts and fractions on the cell viability of 3T3-L1 adipocytes and the inhibitory effect of adipocyte differentiation by Murus root extract, the extracts and their fractions on the differentiation and adipogenesis of adipocytes by MDI The effect was observed in the concentration range below 100 μg / mL. As a result, as shown in FIGS. 4A and 4B, all fractions except for the water layer showed significant inhibition of adipocyte differentiation by treatment of extracts and fractions of 20, 50, and 100 μg / mL, and as shown in FIG. 5. It showed concentration-dependent inhibition of TG production. The degree of fat formation inhibition was highest in the EtOAc layer in the order of EtOAc, CH 2 Cl 2 , n -BuOH layer, but the EtOAc layer fraction, which was not toxic in the cell viability measurement, was toxic in differentiated adipocytes. The experiments were subsequently performed on the CH 2 Cl 2 layer fractions, which were determined to have the strongest ability to inhibit adipogenesis without inducing toxicity in both undifferentiated and differentiated adipocytes and showed the strongest level of activity.

실시예Example 5:  5: 머루근Root 추출물  extract CHCH 22 ClCl 22 층  layer 분획물이The fraction adipogenesisadipogenesis 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향 Impact on related gene and protein expression

지방전구세포(Preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화되는 지방 생성 과정(adipogenesis)에는 초기(early), 중기(intermediate), 후기(late)의 각 단계별로 중요한 분화 조절자들이 관여한다. MDI 처리 초기에는 가장 먼저 c- fos , c-jun, c- myc 등의 유전자 발현이 증가하며 이와 함께 C/EBPβ와 δ의 발현 또한 유도된다. C/EBPβ와 δ는 지방전구세포가 MDI 등의 분화 칵테일(differentiation cocktail)에 노출되었을 때 분화 초기에 가장 먼저 작용하는 전사 인자(transcription factor)로, MDI의 경우 C/EBPβ는 DEX에, C/EBPδ는 IBMX에 의해 활성이 유도되는 것으로 알려져 있다. 이러한 C/EBPβ와 δ의 활성은 분화 중기 및 후기에서 작용하는 PPARγ와 C/EBPα의 발현 매개인자로서, 활성화된 PPARγ와 C/EBPα는 단독 혹은 상호작용을 통해 지방세포 특이적 유전자의 발현(adipocyte specific gene expression)을 유도하여 지방 세포 분화 및 지방 형성을 완성하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이와 같은 지방 세포 분화에 관여하는 주요 인자들의 발현 조절 유무는 소재가 보유한 지방 생성 억제능 및 그 작용 기전을 판단하는 주요 방법 중 하나이다.Adipogenesis, in which fat cells are differentiated into adipocytes, involves important differentiation regulators at early, intermediate, and late stages. MDI process initially is the first expression of c- fos, c-jun, c- myc gene expression, such as the increase in the same time and C / EBPβ and δ also derived. C / EBPβ and δ are transcription factors that act early in differentiation when adipocytes are exposed to differentiation cocktails such as MDI. In case of MDI, C / EBPβ is expressed in DEX and C / EBPδ is known to induce activity by IBMX. The activity of C / EBPβ and δ is an expression mediator of PPARγ and C / EBPα acting in the mid- and late stages of differentiation, and activated PPARγ and C / EBPα are expressed in adipocyte-specific genes alone or through interaction. It is known to induce specific gene expression to complete adipocyte differentiation and fat formation. Therefore, the presence or absence of expression regulation of the main factors involved in adipocyte differentiation is one of the main methods for determining the fat production inhibitory ability and its mechanism of action.

본 발명에서는 머루근이 보유한 지방 생성 억제능의 작용 기전을 알아보기 위해 CH2Cl2 층 분획물을 사용하여 지방 생성 과정에 관여하는 주요 핵심 조절자인 C/EBPα, C/EBPβ, 그리고 PPARγ 유전자 및 단백질 발현을 분석하였다. In the present invention, the expression of C / EBPα, C / EBPβ, and PPARγ genes and proteins, which are the major key regulators involved in the fat production process, were investigated using CH 2 Cl 2 layer fractions in order to investigate the mechanism of action of the muscle production inhibitory activity of the muscle root. Was analyzed.

구체적으로, 6-웰 조직 배양 플레이트에 3 X 105개의 세포를 분주하고 지방 생성 억제능 분석과 동일한 방법으로 시료를 처리한 후 유전자 발현 분석을 위한 RNA를 분리하여 RT-PCR로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 완료된 배양 세포의 전체 RNA를 TRIzol (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출한 후 NanoVue plus spectrophotometer (GE healthcare, WI, USA)를 이용하여 정량하고 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 내부 대조군(internal control)으로는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였으며 실험에 사용한 대상 유전자의 프라이머 서열은 표 1에 제시한 바와 같다. Specifically, 3 X 10 5 cells were dispensed into 6-well tissue culture plates, and the samples were processed in the same manner as in the analysis of the inhibition of fat production, and RNA for gene expression analysis was isolated and analyzed by RT-PCR. First, the total RNA of the cultured cells was extracted with TRIzol (Invitrogen, CA, USA), quantified using a NanoVue plus spectrophotometer (GE healthcare, WI, USA), and the SuperScript ™ First Strand Synthesis System (Invitrogen) And then PCR was performed. As an internal control of gene expression analysis, a housekeeping gene, GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase) was used, and the primer sequences of the target genes used in the experiment are shown in Table 1.

유전자 이름Gene name SequenceSequence C/EBPαC / EBPα 센스
안티센스sense
Antisense 5'- GTG TGC ACG TCT ATG CTA AAC CA -3' (서열번호 1)
5'- GCC GTT AGT GAA GAG TCT CAG TTT G -3' (서열번호 2) 5'- GTG TGC ACG TCT ATG CTA AAC CA -3 '(SEQ ID NO: 1)
5'- GCC GTT AGT GAA GAG TCT CAG TTT G -3 '(SEQ ID NO: 2) C/EBPβC / EBPβ 센스
안티센스sense
Antisense 5'- GTT TCG GGA GTT GAT GCA ATC -3'(서열번호 3)
5'- AAC AAC CCC GCA GGA ACA T -3' (서열번호 4)5'- GTT TCG GGA GTT GAT GCA ATC -3 '(SEQ ID NO: 3)
5'- AAC AAC CCC GCA GGA ACA T -3 '(SEQ ID NO: 4) PPARγPPARγ 센스
안티센스sense
Antisense 5'- CGC TGA TGC ACT GCC TAT GA -3' (서열번호 5)
5'- TGC GAG TGG TCT TCC ATC AC -3' (서열번호 6) 5'- CGC TGA TGC ACT GCC TAT GA -3 '(SEQ ID NO: 5)
5'- TGC GAG TGG TCT TCC ATC AC -3 '(SEQ ID NO: 6) GAPDHGAPDH 센스
안티센스sense
Antisense 5'- GGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT -3' (서열번호 7)
5'- AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC -3' (서열번호 8) 5'- GGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT -3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3 '(SEQ ID NO: 8)

상기의 RT-PCR 분석에서와 같은 방법으로 실험을 수행한 후, 시료 처리가 끝난 세포에서 단백질을 분리하여 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯혼성화 방법으로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 세포 용해물을 추출하여 브래드포드 분석(Bradford assay)으로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동하고 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)에 블롯팅(blotting)한 후 대상 단백질의 일차 항체와 혼성화하였다. 실험에 사용한 C/EBPα와 C/EBPβ의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, PPARγ 및 액틴의 일차 항체와 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse등의 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 막(membrane) 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system(FluoChem®FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였다.After the experiment was carried out in the same manner as in the RT-PCR analysis, the protein was separated from the cells treated with the sample, and the expression change of the fat production-related protein was analyzed by Western blot hybridization. First, the cell lysate was extracted from the cultured cells, and the protein concentration was determined by Bradford assay, followed by electrophoresis of 50 μg of protein with 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After blotting on the nitrocellulose membrane, they were hybridized with the primary antibody of the protein of interest. The primary antibodies of C / EBPα and C / EBPβ used in the experiment were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), and anti-goat, anti-rabbit, anti-PPARγ and actin primary antibodies and horse radish peroxidase Secondary antibodies such as mouse are disclosed in Santa Cruz Biotechnology Inc. It was purchased from (Santa Cruz, CA, USA) and used. A film (membrane) reaction after washing for one hour with secondary antibodies and the expression of each protein, using the chemiluminescence detection system (FluoChem ® FC2, AlphaInnotech, USA) were analyzed.

그 결과, 도 6에 제시된 바와 같이 MDI 처리에 의해 지방세포 분화가 일어난 대조군에서는 세 인자의 유전자 및 단백질 발현이 유의적으로 증가되었으며 머루근 CH2Cl2 층 분획물의 처리에 의해 감소함을 보였다. 특히 세 인자의 유전자 발현은 20 μg/mL의 처리에서부터 급격히 감소되었으며, 특히 C/EBPα,β의 경우 100μg/mL에서는 발현이 완전히 억제됨을 보였다(도 6a). 단백질 발현은 유전자 발현에서와 같이 저농도에서 뚜렷한 발현 저해는 관찰되지 않았으나 100 μg/mL에서는 발현이 강하게 억제되었다(도 6b). 이러한 결과는 머루근이 보유한 항비만 활성이 지방 생성 과정에 관여하는 핵심 인자의 유전자 및 단백질 발현 저해의 기작을 통해 이루어짐을 뒷받침하는 것이다.
As a result, as shown in Figure 6, the control of the adipocyte differentiation by MDI treatment significantly increased the gene and protein expression of the three factors and showed a decrease by the treatment of the root muscle CH 2 Cl 2 layer fractions. In particular, the gene expression of the three factors was sharply reduced from the treatment of 20 μg / mL, especially in the case of C / EBPa, β showed that the expression is completely suppressed at 100 μg / mL (Fig. 6a). Protein expression showed no significant inhibition at low concentrations as in gene expression, but expression was strongly inhibited at 100 μg / mL (FIG. 6B). These results support that the anti-obesity activity possessed by melanus is through the mechanism of inhibition of gene and protein expression of key factors involved in fat production process.

실시예Example 6:  6: 머루근Root CHCH 22 ClCl 22 층 유래 화합물 4종의 Of four layer-derived compounds 항비만Anti-obesity 활성 분석 Activity analysis

머루근이 보유한 항비만 활성의 핵심 작용 물질을 찾아내기 위해 도 7에서와 같이 CH2Cl2 층으로부터 물질 분리를 수행하였다. CH2Cl2 층 분획물을 n-hexane : EtOAc [10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 (v/v)] 및 MeOH 순으로 용출시켜 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 수행하여 분획물(fraction, Fr.) 1~4를 얻었다. 그 중 Fr. 3을 위와 같은 용매 순으로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 Fr. 1~6을 얻었다. 그 중 Fr. 2와 5의 GC-mass 분석을 통해 Fr. 2로부터 메틸 팔미테이트(methyl palmitate), 팔미테이트(palmitate), 메틸 스테아레이트(methyl stearate), Fr. 5로부터 올레아놀릭산(oleanolic acid) 등의 화합물의 존재를 확인하였다. 그런 다음, 각 화합물을 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 표준품과 분리 화합물의 동일성을 thin layer chromatography (TLC)를 통해 확인한 후, 각 물질이 보유한 항비만 활성 유무를 분석하였다. 그 결과, 도 8에 제시된 바와 같이 메틸 팔미테이트를 제외한 3종의 화합물이 농도의존적인 지방세포 분화 및 지방 생성 억제능을 보였다. 각 화합물의 활성의 정도는 20, 50, 100 μg/mL의 시료 처리에 의해 팔미테이트가 13, 17, 17%, 메틸 스테아레이트가 8, 24, 29%, 그리고 올레아놀릭산이 33, 41, 92%의 지방 생성 억제능을 보여 활성의 강도는 올레아놀릭산, 메틸 스테아레이트, 팔미테이트의 순으로 나타났다. Material separation was performed from the CH 2 Cl 2 layer as shown in FIG. 7 to find the key agonist of the anti-obesity activity possessed by Murusmus. CH 2 Cl 2 layer fractions were eluted with n- hexane: EtOAc [10: 1, 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1: 1 (v / v)] and MeOH in order to provide silica gel column chromatography. Silica gel column chromatography was performed to obtain fractions (fraction, Fr.) 1 to 4. Among them, Fr. 3 to silica gel column chromatography in the same solvent order as Fr. 1-6 were obtained. Among them, Fr. Fr. by GC-mass analysis of 2 and 5. Methyl palmitate, palmitate, methyl stearate, Fr. From 5, the presence of compounds such as oleanolic acid was confirmed. Each compound was then added to Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) purchased from (St. Louis, MO, USA) and confirmed the identity of the separation compound by thin layer chromatography (TLC), and then analyzed the anti-obesity activity of each material. As a result, as shown in FIG. 8, three compounds except methyl palmitate showed concentration-dependent adipocyte differentiation and adipogenic inhibition. The activity level of each compound was 20, 50, 100 μg / mL sample treatment, palmitate 13, 17, 17%, methyl stearate 8, 24, 29%, and oleanolic acid 33, 41, 92 It showed% inhibition of fat production, and the strength of activity was oleanolic acid, methyl stearate, and palmitate.

이상의 결과를 통해 머루근 추출물 및 분획물이 낮은 독성과 높은 항비만 활성을 보유함을 확인하였으며, 활성 보유 화합물 중 하나로 CH2Cl2 층 분획물에서 올레아놀릭산, 메틸 스테아레이트, 및 팔미테이트를 분리하였다.
From the above results, it was confirmed that the root extract and fractions had low toxicity and high anti-obesity activity, and oleanolic acid, methyl stearate, and palmitate were separated from the CH 2 Cl 2 layer fraction as one of the active compounds.

<110> Dong-eui University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Compositions for anti-obesity comprising extract of Vitis amurensis ruprecht <130> PA130164KR <150> KR10-2012-0014525 <151> 2012-02-13 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for C/EBPalpha <400> 1 gtgtgcacgt ctatgctaaa cca 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for C/EBPalpha <400> 2 gccgttagtg aagagtctca gtttg 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for C/EBPbeta <400> 3 gtttcgggag ttgatgcaat c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for C/EBPbeta <400> 4 aacaaccccg caggaacat 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PPAR gamma <400> 5 cgctgatgca ctgcctatga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for PPAR gamma <400> 6 tgcgagtggt cttccatcac 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for GAPDH <400> 7 gggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for GAPDH <400> 8 agccttctcc atggtggtga agac 24 <110> Dong-eui University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Compositions for anti-obesity comprising extract of Vitis          amurensis ruprecht <130> PA130164KR <150> KR10-2012-0014525 <151> 2012-02-13 <160> 8 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for C / EBPalpha <400> 1 gtgtgcacgt ctatgctaaa cca 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for C / EBPalpha <400> 2 gccgttagtg aagagtctca gtttg 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for C / EBPbeta <400> 3 gtttcgggag ttgatgcaat c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for C / EBPbeta <400> 4 aacaaccccg caggaacat 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PPAR gamma <400> 5 cgctgatgca ctgcctatga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for PPAR gamma <400> 6 tgcgagtggt cttccatcac 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for GAPDH <400> 7 gggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for GAPDH <400> 8 agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims (5)

머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity, including melon root extract or a solvent fraction thereof. 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.A quasi-drug composition for preventing or ameliorating obesity, including melon root extract or a solvent fraction thereof. 머루근 추출물 또는 이의 용매 분획물을 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.Food composition for the prevention or amelioration of obesity, including melon root extract or a solvent fraction thereof. 머루근을 물,C1~C4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계;
상기 추출물을 디클로로메탄으로 분획하여 디클로로메탄 분획물을 얻는 단계; 및
상기 분획물을 분리, 정제하는 단계를 포함하는,
머루근으로부터 올레아놀릭산(oleanolic acid), 팔미테이트(palmitate), 메틸 스테아레이트(methyl stearate), 및 메틸 팔미테이트(methyl palmitate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 분리하는 방법.Extracting the melon root with water, C 1 -C 4 alcohol, or a mixed solvent thereof to obtain an extract;
Fractionating the extract with dichloromethane to obtain a dichloromethane fraction; And
Separating and purifying the fractions,
A method for separating one or more compounds from the group consisting of oleanolic acid, palmitate, methyl stearate, and methyl palmitate. 메틸 스테아레이트(methyl stearate)를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity containing methyl stearate (methyl stearate) as an active ingredient.

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