KR20130082379A - 체외 혈관성 조직 제작방법 - Google Patents

체외 혈관성 조직 제작방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관성 조직의 질병을 체외에서 연구하고 치료법을 개발하는데 사용될 수 있도록 체외에서 해당조직을 혈관세포를 이용하여 신생혈관형성을 유도하여 체외 혈관성 조직을 얻을 수 있는 체외 혈관성 조직 제작방법에 관한 것으로, 조직제작용 컨테이너에 혈관성 조직세포가 혼합된 하이드로젤을 공급하는 단계; 혈관세포가 부착된 수집팁을 상기 하이드로젤에 침지되는 단계; 상기 수집팁이 침지된 상태로 상기 하이드로젤을 경화시키는 단계; 및 상기 하이드로젤의 상측으로 세포배양액을 공급하는 단계를 포함한다.

Description

체외 혈관성 조직 제작방법{Extracorporeal vascularized organ manufancturing method}
본 발명은 체외 혈관성 조직 제작방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈관성 조직의 질병을 체외에서 연구하고 치료법을 개발하는데 사용될 수 있도록 체외에서 해당조직을 혈관세포를 이용하여 신생혈관형성을 유도하여 체외 혈관성 조직을 얻을 수 있는 체외 혈관성 조직 제작방법에 관한 것이다.
최근 인구의 노령화, 흡연율 증가, 식생활의 변화, 운동 부족 등으로 암의 발병이 증가하고 있고, 이를 치료하기 위한 항암제의 개발이 활발히 진행되고 있다. 지금까지 개발된 항암제들은 대부분 그 효과와 함께 정상세포 파괴에 따른 독성, 항암제에 대한 내성 발생 및 재발 등의 문제점을 갖고 있어 새로운 기전을 바탕으로 한 항암제가 요구되어지고 있다. 따라서, 암의 발병원인과 진행과정의 원인을 밝혀 보다 근본적인 해결책을 제시하려는 노력이 진행되고 왔고, 1971년 J. Folkman에 의해 종양의 성장 및 전이를 막기 위하여 신생혈관생성억제제(anti-angiogenic agent)가 새로운 대안으로 제시 되었다[Folkman 등, N. Engl. J. Med., 285, p1182, 1971].
신생혈관생성(Angiogenesis)이란 기존의 혈관에서부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 의미하며, 종양의 성장과 전이(metastasis), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 만성 염증(chronicinflammation), 궤양(ulcer)과 같은 다양한 질환의 원인이 되고 있다[Carmeliet 등, Nature, 407, p249, 2000]. 특히, 암과 같은 과도한 신생혈관생성이 일어나는 경우는, 이러한 신생혈관생성을 억제하는 것만으로도 종양의 성장과 전이를 효과적으로 억제할 수 있다
신생혈관생성 억제를 통하여 항암제를 개발하기 위한 타깃으로 혈관 내피세포 성장인자(VEGF), 혈관 내피세포성장인자 수용체(VEGFR : vascular endothelial growth factor receptor), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF :basic fibroblast growth factor), 전환 성장인자 알파 및 베타(TGF-α, -β), 표피 성장인자(EGF : epidermal growth factor), 혈소판 유래 성장인자(PDGF : platelet-derived growth factor)등을 들 수 있다.
이러한 항암제를 환자에게 투여할 경우, 환자에 따라 효과있는 항암제의 종류와 양이 서로 달라서 의사의 경험 또는 학계에 알려진 데이터에 의존하기에는 무리가 있다. 또한, 항암제는 암세포 뿐만 아니라 정상세포도 파괴시키므로, 환자에게 투여회수가 많아야 4차이내로 한정되므로, 항암제의 종류 또는 투여량을 다양하게 시험하는 것은 불가능하다.
따라서, 환자에게 적합한 항암제를 찾아내기 위해서는, 그 환자가 가지고 있는 암세포에 직접 항암제를 시험해야 하지만, 현재로서는 이를 해결할 수 있는 방법이 제시된 바 없다.
그러므로, 이러한 불확실하고, 성공확률이 낮은 항암제의 선택은 결국 수명이 얼마 남지 않은 암환자에게는 목숨을 담보로 하는 확률게임에 지나지 않는다. 그러나, 암환자는 이러한 불확실한 치료법을 신뢰하고 의사의 선택을 따를 수 밖에 없으며, 환자 또는 그 가족이 부담해야 하는 비용도 상당함에도 불구하고 치료결과는 낙관할 수 없는 것이 현실이다.
또한, 간, 뇌 등에서 발생되는 혈관성 조직의 질병의 경우에도 그 환자에게 적합한 치료법의 선택에 있어서, 암치료와 마찬가지로 이미 알려진 수많은 치료법 중에서 의사의 경험 또는 학계에 알려진 데이터에 의존할 수 밖에 없다.
상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 본 발명의 목적은, 혈관성 조직의 질병을 체외에서 연구하고 치료법을 개발하는데 사용될 수 있도록 체외에서 해당조직을 혈관세포를 이용하여 신생혈관형성을 유도하여 체외 혈관성 조직을 얻을 수 있는 체외 혈관성 조직 제작방법을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 조직제작용 컨테이너에 혈관성 조직세포가 혼합된 하이드로젤을 공급하는 단계; 혈관세포가 부착된 수집팁을 상기 하이드로젤에 침지되는 단계; 상기 하이드로젤을 경화시키는 단계; 및 상기 하이드로젤의 상측으로 세포배양액을 공급하는 단계를 포함하는 체외 혈관성 조직 제작방법이다.
상기 혈관세포는, 혈관세포용 컨테이너에 혈관세포가 혼합된 세포배양액 내에 상기 수집팁을 침지시켜 상기 세포수집부재의 수집팁에 부착되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 혈관세포를 미리 대량으로 준비할 수 있으므로, 체외 혈관성 조직 제작에 소요되는 시간을 단축할 수 있다.
여기서, 상기 혈관세포용 컨테이너는 혈관세포가 상기 수집팁의 주위로 모이도록 경사부를 가지는 것지는 것이 바람직하며, 상기 경사부의 중심에는 상기 수집팁이 삽입되는 수집홈이 형성되는 것은 더욱 바람직하다. 상기 수집팁은 다공성 재질로 이루어지거나, 외면에 콜라겐 코팅이 되는 것을 특징으로 한다.
또, 상기 혈관성 조직세포는, 암세포, 뇌세포, 간세포 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
또, 상기 하이드로젤은 세포결합역(細胞結合域, cell binding domain)을 가지고, 동시에 생분해성인 것을 특징으로 한다. 이를 통해, 혈관성 조직에 인체의 체내와 유사한 환경을 제공할 수 있다. 그리고, 상기 하이드로젤은 천연하이드로젤 또는 합성하이드로젤일 수 있다.
또, 상기 혈관세포와 상기 혈관성 조직세포의 중량비율은 1~10인 것을 특징으로 한다. 즉, 혈관성 조직세포가 혈관세포보다 더 많은 양을 가지도록 함으로써, 혈관성 조직세포로부터 제공되는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 의한 혈관의 생성을 파악하기 용이해진다.
본 발명에 따른 체외 혈관성 조직 제작방법을 통하여, 암세포, 간세포, 신경세포 등을 체외에서 혈관세포를 이용하여 신생혈관을 생성시키는 것에 의해 암조직, 간조직, 뇌조직 등을 체외에서 동시에 대량으로 제작할 수 있다.
따라서, 본 발명을 통해 얻어진 체외 혈관성 조직에 의해, 혈관성 조직에 관련된 질병을 체외에서 연구하고 치료법을 개발하는데 사용될 수 있으며, 환자에게 적합한 치료법을 빠른 시간 내에 찾을 수 있다.
그러므로, 현존하는 항암제 또는 치료법에 의한 혈관성 조직에 관련된 암, 간질환, 뇌졸증, 치매 등과 같은 질병의 완치율을 높일 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 체외 혈관성 조직 제작방법 중 혈관세포 부착작업의 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 체외 혈관성 조직 제작방법 중 도 1에 의해 준비된 혈액세포를 혈관성 조직세포와 함께 하이드로젤에서 경화시켜 배양하는 공정도이다.
도 3은 본 발명에 따른 체외 혈관성 조직 제작방법으로 제작된 체외 혈관성 조직을 이용하여 약물실험을 하는 모습의 도면이다.
도 4는 세포수집부재의 사시도이다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 설명하기로 한다. 하기의 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
도 1은 혈관세포(32)를 준비하기 위해 세포수집부재(20)의 수집팁(22)에 혈관세포(32)를 부착하는 공정을 도시한다. 상기 혈관세포(32)는 외력을 가하지 않으면, 상기 세포배양액(30) 내에서 가라앉게 된다. 본 발명에서는 이러한 성질을 이용하여 상기 혈관세포(32)를 수집한다.
혈관세포용 컨테이너(10)에 세포배양액(30)과 혈관세포(32)가 혼합하여 공급한다. 즉, 혈관세포(32)에 세포배양액(30)을 주입하거나, 반대로 세포배양액(30)에 혈관세포(32)를 공급하여 섞는 것도 가능하다. 그리고, 상기 혈관세포용 컨테이너(10) 내에 상기 세포수집부재(20)를 장착한다. 상기 세포배양액으로는 공지의 세포배양액을 사용할 수 있으며, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(α-Minimum Essential Medium)를 사용할 수 있다.
반대로, 상기 세포수집부재(20)를 상기 혈관세포용 컨테이너(10)에 장착한 후에, 혈관세포(32)가 혼합된 세포배양액(30)을 주입하는 것도 가능하다.
상기 혈관세포용 컨테이너(10)는 상기 혈관세포(32)가 상기 세포수집부재(20)의 수집팁(22) 주위로 모이기 용이한 형상을 가진다. 즉, 상기 혈관세포용 컨테이너(10)의 바닥부는 중심이 낮도록 형성된 경사부(14)를 가진다. 따라서, 상기 경사부(14)의 사면을 통해 상기 경사부(14)의 중심에 모이게 된다.
또한, 상기 수집팁(22)에 상기 혈관세포(32)의 접촉을 용이하게 하도록 상기 경사부(14)의 중심에 수집홈(12)이 형성된다. 상기 수집홈(12)은 상기 수집팁(22)이 삽입될 수 있으며, 그 주위로 간극이 형성되어 상기 간극 내로 상기 혈관세포(32)가 유입된다. 따라서, 도 1의 좌측의 도면과 같은 상태에서, 가운데 도면과 같은 상태로 된다. 특히, 상기 수집팁(22)에 상기 혈관세포(32)의 부착성을 향상시키기 위해 상기 수집팁(22)을 다공성 재질로 하거나, 콜라겐 코팅을 할 수 있다.
이렇게 얻어진 세포수집부재(20)는 상기 혈관세포용 컨테이너(10)에 그대로 두거나, 별도의 거치용 컨테이너(40)에 세포배양액이 배제된 상태로 둘 수 있다.
다음으로 도 2에 도시된 바와 같이, 혈관세포(32)가 부착된 세포수집부재(20)를 이용하여 체외 혈관성 조직을 제작할 수 있다.
먼저, 조직제작용 컨테이너(50)에 하이드로젤(60) 및 혈관성 조직세포(62)를 공급한다. 상기 하이드로젤(60)과 상기 혈관성 조직세포(12)는 도 2의 좌측도면과 같이 잘 혼합되어 있는 상태이다. 상기 조직제작용 컨테이너(50)는 내부를 관찰할 수 있도록 투명재질의 유리 또는 플라스틱으로 이루어질 수 있으며, 그 형상의 제한은 없다.
그리고, 상기 하이드로젤(60) 내에 수집팁(22)을 침지시킨다. 상기 수집팁(22)은 도 2에 도시된 바와 같이 상기 세포수집부재(20)에 결합된 상태로 상기 하이드로젤(60) 내에 침지할 수 있으며, 상기 세포수집부재(20)로부터 이격되어 수집팁(22)만이 상기 하이드로젤(60) 내부로 침지되는 것도 가능하다. 이 때, 상기 혈관세포(18)와 상기 혈관성 조직세포(12)의 중량비율은 1~10이 되도록 한다. 즉, 혈관성 조직세포가 혈관세포보다 더 많은 양을 가지도록 함으로써, 혈관성 조직세포로부터 제공되는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 의한 혈관의 생성을 파악하기 용이해진다.
따라서, 상기 수집팁(22)의 혈관세포(32)는 상기 하이드로젤(60) 내의 혈관성 조직세포(62)에 근접하여 위치하게 된다.
상기 혈관성 조직세포(62)로는 암세포, 뇌세포, 간세포 중에서 선택할 수 있으며, 상기 혈관성 조직세포(62)는 환자로부터 체취할 수 있으며, 예를 들어 암세포를 사용하는 경우 대략적으로 2~4만개를 공급한다.
상기 혈관성 조직세포는 별도의 세포배양액에서 배양할 수 잇으며, 세포배양액을 제거한 후에 상기 조직제작용 컨테이너(50)에 공급하는 것도 가능하다. 상기 세포배양액으로는 공지의 세포배양액을 사용할 수 있으며, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(α-Minimum Essential Medium)를 사용할 수 있다.
상기 하이드로젤(60)은 세포결합역(細胞結合域, cell binding domain)을 가지고, 동시에 생분해성일 것이 요구된다. 따라서, 이러한 하이드로젤(60)로는 천연하이드젤 또는 합성하이드로젤을 사용할 수 있다. 상기 천연하이드로젤로는 콜라겐 등을 사용할 수 있으며, 합성하이드로젤로는 상용의 큐겔(QGel™, QGel SA, Switzerland)을 사용할 수 있다. 이러한 하이드로젤(60)을 이용하여 신체내와 같은 함수율을 가지는 환경을 혈관성 조직세포(62) 및 혈액세포(32)에 제공할 수 있다.
상기 하이드로젤(60)의 경화(curing)는, 대략 35~40℃ 및 이산화탄소 3~10중량%의 조건에서 상기 조직제작용 컨테이너(50)를 20~40분간 두는 것으로 이루어 질 수 있다.
그리고, 그 상측으로 세포배양액(64)을 주입한다. 상기 세포배양액(64)으로는 공지의 세포배양액을 사용할 수 있으며, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(α-Minimum Essential Medium)를 사용할 수 있다.
따라서, 상기 혈관성 조식세포(62)로부터 발생되는 신생혈관생성을 위한 신호물질을 통해 상기 혈관세포(32)로부터 상기 혈관성 조직세포(62)를 향해 신생혈관(66)이 형성되며, 상기 혈관세포(18)와 상기 혈관성 조직세포(12)가 상기 신생혈관(20)에 의해 연결되는 혈관성 조직을 체외에서 얻을 수 있게 된다. 이 때 신생혈관(66)의 형성모습이 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 수집팁(22)을 중심으로 모이는 형상을 이루게 된다. 이 결과, 상기 신생혈관(66)의 모습이 뚜렷하게 보일 수 있으며, 약액시험시 상기 신생혈관(66)의 파괴모습을 쉽게 관찰할 수 있다.
이렇게 얻어지는 혈관성 조직에 대하여 약물검사 등 다양한 시험을 하기 위하여, 도 3에 도시된 바와 같이 복수의 혈관성 조직을 시험패널(70) 상에서 동시에 제작한다. 즉, 상기 시험패널(70)에 상기 조직제작용 컨테이너(50)를 장착하고, 상술한 과정을 통해 각각의 조직제작용 컨테이너(50)에서 혈관성 조직이 형성되도록 한다. 따라서, 체외에서 혈관성 조직을 다량으로 제작가능하게 된다.
그리고, 각각의 조직제작용 컨테이너(50)에 약액주입기(80)를 통해 공지의 약액을 종류 또는 투여액을 달리하면서, 상기 신생혈관(66)의 파괴 또는 상기 혈관성 조직세포(62)의 파괴를 관찰한다. 이러한 관찰결과를 통해, 환자에게 적합한 치료법 또는 약액을 결정할 수 있게 된다.
특히, 상기 약액주입기(80)에 의한 약액의 공급을 용이하게 하기 위하여, 다양한 방법을 시도할 수 있으며, 그 일예로 도 4에 도시된 바와 같이 상기 세포수집부재(20)의 상부에는 오목부(24)를 형성하고, 상기 오목부(24)에는 관통홀(26)을 하나 이상 형성시키는 것이 바람직하다. 이를 통해, 상기 오목부(24)에 상기 약액주입기(80)에 의해 약액을 공급하면, 상기 관통홀(26)을 통해 아래로 낙하하여 체외 혈관성 조직에 직접 공급될 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
10: 혈관세포용 컨테이너 12: 수집홈
14: 경사부 20: 세포수집부재
22: 수집팁 24: 오목부
26: 관통홀 30,64: 세포배양액
32: 혈관세포 40: 거치용 컨테이너
50: 조직제작용 컨테이너 60: 하이드로젤
52: 혈관성 조직세포 66: 신생혈관
70: 시험패널 80: 약액주입기

Claims (9)

  1. 조직제작용 컨테이너에 혈관성 조직세포가 혼합된 하이드로젤을 공급하는 단계;
    혈관세포가 부착된 수집팁을 상기 하이드로젤에 침지되는 단계;
    상기 수집팁이 침지된 상태로 상기 하이드로젤을 경화시키는 단계; 및
    상기 하이드로젤의 상측으로 세포배양액을 공급하는 단계를 포함하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈관세포는, 혈관세포용 컨테이너에 혈관세포가 혼합된 세포배양액 내에 상기 수집팁을 침지시켜 상기 세포수집부재의 수집팁에 부착되는 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혈관세포용 컨테이너는 혈관세포가 상기 수집팁의 주위로 모이도록 경사부를 가지는 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 경사부의 중심에는 상기 수집팁이 삽입되는 수집홈이 형성되는 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수집팁은 다공성 재질로 이루어지거나, 외면에 콜라겐 코팅이 되는 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혈관성 조직세포는, 암세포, 뇌세포, 간세포 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 세포결합역(細胞結合域, cell binding domain)을 가지고, 동시에 생분해성인 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혈관세포와 상기 혈관성 조직세포의 중량비율은 1~10인 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 천연하이드로젤 또는 합성하이드로젤인 것을 특징으로 하는 체외 혈관성 조직 제작방법.
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