KR20130075737A - 기능성 아시알로당단백질 수용체를 발현하는 유전자 변형 세포주의 시알릴화 당단백질 생산에의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기능성 ASGPR 단백질을 발현하는 세포주의 시알릴화된 당단백질의 생산에의 이용과 그러한 세포주가 이용되는 것을 특징으로 하는 시알릴화된 당단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

기능성 아시알로당단백질 수용체를 발현하는 유전자 변형 세포주의 시알릴화 당단백질 생산에의 이용{USE OF A GENETICALLY MODIFIED CELL LINE EXPRESSING FUNCTIONAL ASIALOGLYCOPROTEIN RECEPTOR IN THE PRODUCTION OF SIALYLATED GLYCOPROTEINS}

본 발명은 기능성 ASGPR 단백질을 발현하는 세포주의 시알릴화된 당단백질의 생산에의 이용과 그러한 세포주가 이용되는 것을 특징으로 하는 시알릴화된 당단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

점점 더 많은 단백질들이 다양한 질병의 치료를 위한 의약품들(소위 생물의약(biopharmaceuticals) 또는 생물제제(biologics))에서 활성 성분으로서 이용된다. 제어된 생산을 가능하게 하기 위하여, 이들 단백질들은 보통 유전자 변형 세포주에 의해 생산되는데, 상기 유전자 변형 세포주는 요구되는 단백질들을 발현 및 바람직하게는 분비하도록 변형된 것으로, 소위 생산 세포주(production cell lines)라고 불린다. 보통, 의학적 용도로의 단백질 제조를 위한 생산 세포주들은, 예컨대, 설치류, 햄스터, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 오리 또는 인간과 같은 포유류 기원, 바람직하게는 설치류 또는 인간으로부터 기원된 것들이다.

완전 기능성 단백질들을 제공하기 위하여, 생산된 단백질들은 정확한 입체구조를 나타내고 적절한 번역후 변형(posttranslational modifications)을 나타내는 것이 중요하다. 특히 번역후 변형은 생산된 단백질들의 안정성, 용해도, 플라즈마 반감기, 항원성 및 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 글리코실화(Glycosylation)가 이들 특성들에 중대한 영향을 미치는 번역후 변형으로 확인되었다. 따라서, 이들 세포주들의 세포들에 의해 생산된 단백질들의 글리코실화에 최적화된 세포주들을 개발하고자 하는 시도가 이미 있어 왔다.

혈류 중 단백질의 플라즈마 반감기 또는 안전성에 영향을 주는 한가지 중요한 특성은 글리코실화된 단백질(당단백질)의 시알릴화도(the degree of sialylation)이다. 시알산은 음전하를 띠는 당 분자(sugar molecules)이고 당단백질의 복합 글리칸 구조의 말단 잔기를 나타낸다. 이들 말단 시알산 잔기들 "아래"에 존재하거나 또는 시알산 잔기들에 의해 덮여진(being capped) 글리칸 구조의 당 분자들은 혈청의 유해한 효과로부터 마스킹되거나 또는 보호된다. 글리칸 구조의 시알릴화가 전혀 나타나지 않거나 단지 불완전하게 시알릴화가 나타나는 당단백질들은 혈액 내에서 감소된 플라즈마 반감기 또는 안정성을 나타낸다. 이와 같이 불완전하게 시알릴화된 당단백질의 신속한 혈액 제거(blood clearance)를 유도하는 한가지 중요한 메카니즘은 아시알로당단백질 수용체, ASGPR의 존재에 기초한다.

ASGPR은 간(liver) 내 세포들에서 주로 발현되고 글리칸 구조의 말단 시알산 잔기가 없어져 소위 아시알로당단백질이라 불리는 당 단백질들의 복합 글리칸 구조와 결합한다. 결합시, 결합된 아시알로당단백질들은 상기 세포들 내부로 내재화되고(internalized) 분해된다(degraded). 따라서, 불완전하게 시알릴화된 당단백질들은 혈액으로부터 효율적으로 추출되며 요구되는 생물학적 또는 의학적 기능을 더 이상 발휘하지 못하게 되고, 이에 반하여, 고도로 시알릴화되거나 또는 오직 완전하게 시알릴화된 글리칸 구조를 갖는 당단백질들은 ASGPR에 결합하는 경향이 더 적고 이에 따라 덜 시알릴화된 당단백질들 보다 연장된 플라즈마 반감기를 나타낸다.

과거에, 고도로 시알릴화된 당단백질들의 생산을 가능하게 하는 세포주들을 개발하는 시도가 있어왔다. 대부분의 시도들은 발현될 당단백질들의 시알릴화에 직접적으로 개입되는 세포주의 효소 및 단백질들을 변형하는 것이었다. 이에 따라, 지금까지는 글리칸 구조 및/또는 당단백질들의 생합성 부분을 형성하는 프로세스, 효소 및 단백질에 영향을 미치는 것에 포커스가 맞혀줬다. 이러한 수단과 방법들의 예가 US 5,047,335, WO 2005/080585, EP 1 900 750, EP 1 911 766 및 US 2009/0298120에 기술되어 있다.

비록 이러한 시도들이 생산된 당단백질들의 더 높은 정도로의 시알릴화를 얻을 수 있었다 하더라도, 이들 세포들의 생산물은 전혀 시알릴화되지 않거나 또는 단지 제한된 정도의 시알릴화를 나타내는 요구되는 당단백질의 상당 부분을 여전히 포함하고 있다. 시알릴화된 당단백질들을 제조하는 방법을 보다 더 개선하기 위하여, 추가적이고 새로운 기술들에 대한 요구가 여전히 남아있다.

따라서, 본 발명의 목적은 선행기술의 단점들 중 적어도 하나를 극복하거나 또는 완화시키는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 시알릴화된 당단백질들의 효율적인 생산을 위한 새로운 방법들 및 수단들을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 시알릴화된 당단백질의 생산에 세포주를 이용함에 의해 달성되는데, 여기서 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현한다.

바람직하게는, 본 발명의 세포주는 고도로 시알릴화된 당단백질의 생산에 이용되고, 여기서 제조되는 고도로 시알릴화된 당단백질은 기능성 ASGPR 단백질 또는 그것의 일부분이 아니다.

특히, 세포주는 시알릴화된 당단백질의 생산에 이용되는데, 여기서 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고 다음과 같은 특징을 갖는다:

- 상기 세포주는 생산될 당단백질을 발현 및 분비하도록 유전자 변형된다; 그리고/또는

- 상기 세포주는 생산될 당단백질을 발현 및 분비하는 별도의 생산 세포주와의 조합으로 이용된다.

바람직하게 세포주가 이용되는데, 여기서 상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 9 를 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 10을 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 중 하나와 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및

- SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 11 을 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 12 를 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;

여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 50개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정되고, 바람직하게 서열 일치성은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산 또는 전체 서열 길이에 걸쳐 결정된다.

상기 세포주는 유전자 변형 세포주일 수 있고, 여기서 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 것이다.

본 발명은 놀랍게도 당단백질의 생산에 기능성 ASGPR 단백질을 발현하는 세포주를 이용하는 경우, 당단백질 생산 과정 동안 이미, 당단백질들이 효과적으로 풍족하게 시알릴화되고, 바람직하게는 당단백질이 완전히 시알릴화되며, 이에 따라, 힘든 생산 후 처리공정이 불필요하게 됨을 알게 되었다.

본 발명의 목적을 위하여, 시알릴화된 당단백질의 생산에의 이용은 모든 이용도 모두 가르키는 것이며, 여기서 본 발명의 세포주는 주로 또는 단지 당단백질들을 포함하는 생산물의 질을 모니터하거나 테스트하기 위해 채용된 것이 아니고, 얻어진 생산물에서 시알릴화된 당단백질의 전체 함량이 직접적이고 적극적으로 향상되도록 채용된다. 상기 "직접적" 및 "적극적"이란 용어는 시알릴화된 당단백질 함량의 향상이 당단백질의 생산 중 본 발명의 세포주 이용의 직접적인 결과이며 이미 생산된 당단백질의 질을 테스트하는데 간단하게 소진되지 않는다는 것을 나타내기 위해 이용된다. 또한, 상기 시알릴화된 당단백질의 함량 향상은 시알릴화되지 않거나 또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질을 본 발명의 세포주에 의해 발현된 기능성 ASGPR 단백질과 결합시키는 것을 포함하는 본 발명 세포주의 세포 활성의 적어도 어느 정도 직접적인 결과이다.

따라서, 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 이용은 상기 세포주가 시알릴화된 당단백질의 생산을 직접적으로 그리고 적극적으로 향상시키도록 채용되는 이용을 포함한다. 특히, 본 발명은 상기 세포주가 시알릴화된 당단백질, 바람직하게는 완전하게 시알릴화된 당단백질로 풍부해진 단백질 분획물(protein fraction)을 생산하는데 이용되는 이용에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 세포주가 이용된다. 여기서 "세포주"라는 용어는 본질적으로 무한적으로 증식할 수 있는 공통의 세포 유형 및 기원의 불멸화 세포들(immotalized cells)을 나타내는데 사용된다. 바람직하게 상기 "세포주"라는 용어는 형태적으로 그리고 유전적으로 본질적으로 균일하고 대체로 유전적으로 안정한 세포들을 일컫는다. 본 발명의 세포주는 바람직하게는 전술한 생물제제(예컨대, 펩티드, 단백질, 당단백질, 효소, 호르몬, 백신 등과 같은 생물의약)의 생산에 이용되어 오거나 그것들로부터 유도된 세포주이다. 본 발명의 세포주는 포유류 기원인 것이 바람직하고, 설치류, 햄스터, 생쥐, 쥐, 개, 오리 또는 인간 기원인 것이 더욱 바람직하고, 설치류 또는 인간 기원인 것이 가장 바람직하다. 특히, 본 발명의 세포주는 HEK293, CHO, BHK, Vero, NSO 및/또는 그것들로부터 유도된 세포 또는 세포주로부터 유도될 수 있다. 대응되는 ATCC 넘버는 : HEK293: CRL-1573, CHO-K1 : CCL-61 , BHK-21 [C-13]: CCL-10, Vero: CCL-81 , NSO-GT12: CCL-12066 이다.

본 발명의 세포주는 유전자 변형된 세포주일 수 있는데, 여기서 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 것이다.

여기서 사용된 상기 "유전자 변형된 세포주"라는 용어는 그것의 유전자 배열(genetic configuration) 또는 핵산 함량의 변경에 의해 변형된 세포주를 일컫는다. 상기 변형은 예컨대 핵산 분자들의 도입 또는 상기 세포들 또는 세포주의 유전자 배열 또는 게놈의 변경 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 변형은 결과적인 세포주가 일시적으로 또는 안정적으로 유전자 변형되도록 수행될 수 있다.

본 발명의 유전자 변형된 세포주는 유전자 변형 전에 기능성 ASGPR 단백질의 감지가능한 발현을 나타내지 않는 세포주로부터 유도되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 유전자 변형된 세포주는 또한 이미 내생적인 기능성 ASGPR 단백질을 발현한 세포주로부터 유도될 수 있다.

본 발명의 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 상기 변형은 기능성 ASGPR 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1 또는 그 이상의 핵산 분자를 갖는 세포주의 세포들을 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염(transfecting)시킴에 의해 달성될 수 있다. 당업자는 유전 암호의 퇴보(degeneracy of the genetic code) 및 1개 이상의 핵산 서열이 그와 동일한 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다는 사실을 잘 알 것이다. 기능성 ASGPR 단백질의 적어도 하나의 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 디자인하는 경우, 당업자는 유전자 변형될 세포주가 유래된 기원의 유기체의 바람직한 코돈 유시지(codon usage)를 고려할 수 있다. 기능성 ASGPR 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 1개의 단일 핵산 분자 내에 존재할 수 있거나 또는 기능성 ASGPR 단백질의 서브유닛들을 인코딩하는 핵산 서열들은 1개 또는 그 이상의 분리된 핵산 분자들을 포함하여 이루어질 수 있다.

특히, 상기 1 또는 그 이상의 핵산 분자들은 다음을 포함하거나 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 3를 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 핵산 서열과 적어도 80% 일치하는 핵산 서열, 바람직하게는 SEQ ID No. 3와 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99% 일치하는 핵산 서열; 및

- SEQ ID No. 4, 7 또는 8을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 핵산 서열과 적어도 80% 일치하는 핵산 서열, 바람직하게는 SEQ ID No. 4, 7 또는 8과 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99% 일치하는 핵산 서열,

여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 3, 4, 7 또는 8 각각의 적어도 100개의 연속되는 핵산의 서열 길이에 걸쳐 결정되고, 바람직하게 서열 일치성은 SEQ ID No. 3, 4, 7 또는 8 각각의 전체 서열 길이에 걸쳐 결정된다.

서열 일치성은 주어진 서열 길이에 걸친 % 일치성으로 표현된다. 서열 일치성은 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 이용할 수 있는 블라스트 알고리즘(Blast algorithm)을 이용하여 계산될 수 있다. 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 일치성은 블라스트엔(BlastN) 알고리즘을 이용하여 계산되고, 이에 반하여 아미노산 서열의 서열 일치성은 블라스트피(BlastP) 알고리즘을 이용하여 계산된다.

바람직하게는, 상기 1 또는 그 이상의 핵산 분자들은 SEQ ID No. 3를 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ 및 SEQ ID No. 4, 7 또는 8을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ 중 하나의 핵산 서열을 포함하거나 그것으로 구성된다.

상기 1 또는 그 이상의 핵산 분자들은 기능성 ASGPR 단백질의 발현을 가능하게 하거나 지원하는 추가적인 핵산 서열들을 포함할 수 있다. 상기 추가적인 핵산 서열들은 프로모터(promoter) 서열 및/또는 기능성 ASGPR 단백질 또는 그것의 부분들의 전사(transcription) 및/또는 번역(translation)에 강한 영향을 줄 수 있는 다른 조절(regulatory) 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 유전자 변형된 세포주는 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된다. 상기 ASGPR 단백질은 당단백질들과 결합할 수 있는 렉틴 패밀리(lectin family)의 수용체이고, 여기서, 글리칸 구조의 말단 시알산 잔기는 소실 또는 제거된다. 기능성 ASGPR 단백질은 상이한 단백질 서브유닛들로 구성된다. 기능성 인간 ASGPR 단백질은 2개의 상이한 단백질 서브유닛 Ⅰ 및 Ⅱ로 구성된다.

인간 ASGPR-Ⅰ서브유닛은 SEQ ID No. 1에 표현된 아미노산 서열을 나타내고, 이에 반하여 생쥐 ASGPR-Ⅰ서브유닛은 SEQ ID No. 9에 표현된 아미노산 서열을 나타내고, 쥐 ASGPR-Ⅰ서브유닛은 SEQ ID No. 10에 표현된 아미노산 서열을 나타낸다.

생쥐 ASGPR-Ⅱ 서브유닛은 SEQ ID No. 11에 표현된 아미노산 서열을 나타내고, 이에 반하여 쥐 ASGPR-Ⅱ 서브유닛은 SEQ ID No. 12에 표현된 아미노산 서열을 나타낸다. 각각 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6에 표현된 아미노산 서열을 나타내는 인간 ASGPR-Ⅱ 서브유닛의 3개의 이소폼(isoforms)이 존재한다. SEQ ID No. 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ 서브유닛에 상응하는 핵산 서열은 SEQ ID No. 4로 제공된다. SEQ ID No. 5의 아미노산 서열을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ 서브유닛에 상응하는 핵산 서열은 SEQ ID No. 7로 제공된다. SEQ ID No. 6의 아미노산 서열을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ 서브유닛에 상응하는 핵산 서열은 SEQ ID No. 8로 제공된다.

본 발명에 따르면 세포 또는 세포주가 관련된 모든 ASGPR 서브유닛들(예컨대, 인간 ASGPR 단백질에 대한 서브유닛 Ⅰ 및 Ⅱ)을 발현하거나 또는 발현하도록 유전자 변형되면, 세포 또는 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 결과적인 세포 또는 세포주는 세포 표면에 ASGPR 단백질을 나타내거나 감지가능한 비율의 아시알로당단백질의 결합 및 내재화(internalisation)를 보여준다. 바람직한 실시예에 따르면, 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 세포 또는 세포주는 예컨대 알파-1-안티트립신(A1AT) 또는 알파-1-산 당단백질과 같은 아시알로당단백질에 대한 내재화율(internalisation rate)이 유전자 변형이 결여된 친 세포(parent cell) 또는 세포주와 비교해서 적어도 2배 만큼 증가된 것으로 나타난다. 특히, 바람직한 실시예에 따르면, 상기 내재화율은 적어도 5배 만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 10배 만큼 증가된다.

본 발명에 있어서, 상기 내재화율은 다음에 의해 결정될 수 있다:

(1) 미리 정해진 양의 시알릴화되지 않은 당단백질, 불완전하게 시알릴화된 당단백질 및/또는 시알릴화되지 않거나 불완전하게 시알릴화된 당단백질을 포함하는 혼합물과 세포들을 접촉시키되, 바람직하게는 상기 시알릴화되지 않거나 불완전하게 시알릴화된 당단백질은 알파-1-안티트립신(A1AT) 또는 알파-1-산 당단백질임,

(2) 상기 시알릴화되지 않거나 또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질을 갖는 세포들을 배양하고

(3) 비내재화된(non-internalised) 시알릴화되지 않은 및/또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질의 양을 결정. 그러한 목적을 위하여, 상기 시알릴화되지 않은 당단백질은 감지 및 정량화가 용이하도록 하는 레이블(label), 예컨대, 방사성 레이블 또는 형광성 레이블에 의해 레이블링될 수 있다.

상기 내재화율은 다음과 같이 표현될 수 있다:

(시알릴화되지 않은 및/또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질의 미리 정해진 양 마이너스 비내재화된 시알릴화되지 않은 및/또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질의 결정된 양)/시간 단위.

바람직하게는, 본 발명의 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 여기서 상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 또는 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 9 를 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 10을 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 중 하나와 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및

- SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 11 을 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 12 를 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;

여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 50개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정되고, 바람직하게 서열 일치성은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산 또는 전체 서열 길이에 걸쳐 결정된다.

바람직하게는, 본 발명의 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 여기서 상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 또는 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 1을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열, 바람직하게는 SEQ ID No. 1과 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99% 일치하는 아미노산 서열; 및

- SEQ ID No. 2, 5 또는 6을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열, 바람직하게는 SEQ ID No. 2, 5 또는 6과 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99% 일치하는 아미노산 서열,

여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5 또는 6 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정되고, 바람직하게 서열 일치성은 SEQ ID No. 1, 2, 5 또는 6 각각의 전체 서열 길이에 걸쳐 결정된다.

바람직하게는, 본 발명의 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 여기서 상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 또는 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 1을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열; 및

- SEQ ID No. 2, 5 또는 6을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열.

본 발명의 세포주는 별도의 생산 세포주로부터 발현되고 분비된 시알릴화되지 않거나 또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질을 제거하는데 이용될 수 있는데, 여기서 상기 생산 세포주는 본 발명의 세포주와는 다르다. 이 경우, 본 발명의 세포주는 상기 생산 세포주의 1차 산물로부터의 원치않는 부산물(즉, 생산될 당단백질의 시알릴화되지 않거나 또는 불완전하게 시알릴화된 형태)을 제거하기 위한 "스캐빈저(scavenger)"로서 이용된다. 상기 제거를 달성하기 위하여, 상기 생산 세포주와 본 발명의 세포주를 동일한 배양 캐비티(cavity) 내에서 공동 배양(co-culture) 하는 것이 가능하고, 이에 따라, 생산 세포주로부터의 1차적인 당단백질 산물의 분비가 일어나고 이와 동시에 상기 1차적인 산물로부터 불완전하게 시알릴화된 당단백질의 제거는 2차 산물, 즉, 생산될 완전하게 시알릴화된 당단백질로 풍부화된 단백질 분획으로 귀결된다.

대안적으로, 본 발명의 세포주의 세포들은 생산될 당단백질의 시알릴화되지 않거나 불완전하게 시알릴화된 형태를 제거하기 위하여 생산 세포주의 1차적인 산물과 접촉될 수 있고, 이에 따라 완전하게 시알릴화된 당단백질로 풍부해진 단백질 분획에 도달한다. 이는 예를 들면 본 발명의 세포주의 세포들을 생산될 당단백질을 포함하는 생산 세포주의 상청액(supernatant) 및/또는 조정 배지(conditioned media) 또는 상기 생산 세포주의 1차적인 산물을 포함하는 다른 어떤 브로브(probe), 예컨대 액체 프로브와 접촉시킴에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 대안적인 접근은 상이한 배양 조건 하에서 상기 생산 세포주 및 본 발명의 세포주의 배양을 가능하게 한다. 바람직하게는 양 세포주들이 각각 최적의 조건하에서 배양될 수도 있다. 이에 따라, 상기 생산 세포주는 생산될 당단백질의 발현 및 분비에 최적화된 조건 하에서 배양될 수 있고, 이에 반해, 본 발명의 세포주는 시알릴화되지 않거나 또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질의 결합 및 내재화에 최적화된 조건 하에서 배양될 수 있다.

당단백질의 생산 및 시알릴화된 당단백질의 풍부화를 위해 2개의 별개의 세포주를 이용하는 대신, 양쪽 모두의 기능이 1개의 단일 세포주에 병합될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 세포주는 생산될 당단백질을 발현 및 분비하도록 (추가적으로) 유전자 변형될 수 있다. 단지 1개의 단일 세포주의 이용은, 단지 하나의 세포주에 대한 최적 조건만이 결정되어야 하므로, 배양 조건의 최적화에 대한 요구가 줄어든다. 당단백질 생산 및 고도로 시알릴화된 당단백질의 풍부화는 하나의 단계 및 하나의 배양 캐비티에서 동시에 수행될 수 있다. 배양 용기내 전체 세포괴(cell mass)는 희망하는 당단백질의 생산에 이용될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 세포주는 내재화된 시알릴화되지 않거나 또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질을 재활용하고 그것의 성분들을 시알릴화된 당단백질, 바람직하게는 완전하게 시알릴화된 당단백질의 생산에 이용할 수 있다. 따라서, 이용가능한 자원들이 보다 경제적으로 개발될 것이다.

바람직한 실시예에 따르면 본 발명의 세포주와 선택적으로 상기 생산 세포주는 현탁 배양, 바람직하게는 현탁 생물 반응기에서의 배양에도 호환된다. 대안적으로, 본 발명의 세포주, 생산 세포주 또는 양자 모두 부착 배양 조건(adherent culture condition) 하에서 배양될 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 세포주가 이용되는 것을 특징으로 하는 시알릴화된 당단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 시알릴화된 당단백질, 바람직하게는 완전하게 시알릴화된 당단백질로 풍부화된 단백질 분획을 생산하는데 이용된다.

본 발명의 바람직한 방법에 있어서, 세포주가 이용되는데, 여기서 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 상기 기능성 ASGPR 단백질은 바람직하게는 다음을 포함하거나 또는 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 9 를 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 10을 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 중 하나와 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및

- SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 11 을 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 12 를 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;

여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 50개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정되고, 바람직하게 서열 일치성은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산 또는 전체 서열 길이에 걸쳐 결정된다.

본 발명의 특히 바람직한 방법에 있어서, 세포주가 이용되는데, 여기서 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 여기서 상기 기능성 ASGPR 단백질은 바람직하게는 다음을 포함하거나 또는 그것들로 구성된다:

- SEQ ID No. 1을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및

- SEQ ID No. 2, 5 또는 6을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;

여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5 또는 6 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정되고, 바람직하게 서열 일치성은 SEQ ID No. 1, 2, 5 또는 6 각각의 전체 서열 길이에 걸쳐 결정된다.

상술한 본 발명의 세포주 및, 특히, 본 발명의 유전자 변형된 세포주는 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 세포주는 생산될 당단백질을 발현 및 분비하도록 (추가적으로) 유전자 변형될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 방법에서 상기 세포주는 생산 세포주와의 조합으로 이용될 수 있는데, 이는 생산될 당단백질을 발현 및 분비한다.

바람직하게는 본 발명의 방법은 생산될 당단백질을 포함하는 프로브를 본 발명의 세포주와 접촉시키는 단계를 포함한다.

바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 방법은 다음 단계들을 포함한다:

(ⅰ) 생산될 당단백질을 발현, 글리코실화 및 분비하는 수단을 제공, 바람직하게는 이러한 수단은 생산 세포주 및/또는 희망하는 당단백질을 발현 및 분비하도록 추가적으로 변형된 본 발명의 세포주 내에서 보여질 수 있음;

(ⅱ) 상기 분비된 당단백질을 본 발명의 세포주와 접촉시킴, 이에 따라 시알릴화되지 않은 당단백질은 본 발명의 세포주의 세포들에 의해 흡수될 수 있음; 및

(ⅲ) 본 발명의 세포주의 세포들에 의해 흡수되지 않은 상기 분비된 당단백질을 분리.

바람직하게는 적어도 상기 분비된 당단백질의 본 발명의 세포주와의 접촉은 현탁 배양 조건, 바람직하게는 생물반응기 내에서 수행된다.

이하, 본 발명은 실시예들에 의해 보다 상세히 설명된다.

도 1 은 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 안정적으로 형질감염된 HEK 세포내에서 발현된 ASGPR 서브유닛 Ⅰ 및 Ⅱ의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다.
A : 항체가 43kDa의 분자질량을 갖는 ASGPR-Ⅰ을 감지한다.
B : ASGPR-Ⅱ 서브유닛에 대한 항체는 32kDa의 특이적 밴드를 보여준다(양 항체들: 아비바 시스템즈 바이올로지(Aviva Systems Biology), 산 디에고, CA, USA)
도 2 는 상이한 세포들의 존재하에서 배지(media)로부터 A1AT 야생형(wild-type) 단백질(시알릴화되지 않은, 불완전하게 시알릴화된 그리고 완전히 시알릴화된 A1AT를 포함하는 단백질 혼합물)의 상대 흡수율을 나타낸다. 삼각형들 : HEK293 야생형 세포들의 존재하에서의 A1AT. 마름모: ASGPR-Ⅰ 서브유닛을 갖는 HEK293 세포들의 존재하에서의 A1AT. 사각형들: 기능성 ASGPR(ASGPR Ⅰ 및 Ⅱ)을 제공하는 HEK293 에 의한 A1AT의 흡수로 인한 증가된 흡수율. 상이한 세포 유형들은 컨플루언스(confluence)까지 성장되고 (~)1×10E5 세포/웰(cells/well)로 씨딩되었으며(seeded), 재조합 A1AT 야생형 단백질의 주어진 농도로 배양되었다. 상이한 시간 단계들 이후 배지 내 A1AT 농도가 ELISA에 의해 분석되었다.
도 3 은 안정적으로 형질감염된 ASGPR을 가지는 그리고 가지지 않는 2가지의 HEK293 세포에 의해 분비된 A1AT의 특이적 항-A1AT 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. 생리학적 인간 A1AT(프로라스틴(Prolastin))는 컨트롤로서(as control) 로딩된다. 분석결과에서 세럼 알부민에 의한 방해를 피하기 위해 세럼이 없는 세포 배지(AEM, 인비트로젠 GmbH, 다름슈타트, 독일) 내에서 발현이 수행되었다. ASGPR 형질감염된 세포들에서 발현된 A1AT는 ASGPR 형질감염되지 않은 세포들 및 프로라스틴과 비교하여 더 높은 분자질량으로 변화된다. 이러한 변화는 더 높은 시알릴화도(sialylation degree)에 기인한 것이다.
도 4 는 안정적으로 형질감염된 ASGPR을 가지는 그리고 가지지 않는 HEK293 세포에 의해 분비된 A1AT의 특이적 항-A1AT 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. 생리학적 A1AT(프로라스틴)는 컨트롤로서 로딩된다. A1AT는 시알리다아제(sialidase)로 디시알릴화(desialylated) 또는 PNGaseF로 디글리코실화(deglycosylated)되었고, 이는 ASGPR 형질감염이 있거나 없는 경우의 발현간 동일한 분자질량으로 귀결되었고, 이는 이러한 변화가 더 높은 시알릴화도에 기인한다는 것을 증명한다.
도 5 는 안정적으로 형질감염된 ASGPR 미존재하(a) 및 존재하(b)에 세럼이 없는 세포 배지(AEM, 인비트로젠 GmbH, 다름슈타트, 독일) 내에서 HEK293 세포들에 의해 발현된 N-글리칸(N-glycan) 프로파일을 나타낸다. A1AT 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피와 뒤따르는 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 정제되고, N-글리칸은 PNGaseF 에 의해 유리되었다. N-글리칸은 역상 카트리지 및 고상추출법에 의해 정제되고 포지티브 모드에서 수행된 말디-톱 질량 분석(MALDI-TOF mass spectrometry) 전에 마지막으로 퍼메틸화되었다(permethylated). ASGPR 형질감염된 HEK293 세포들 내에서 발현된 A1AT 내 시알릴화된 트리안테너리 구조(triantennary structures)의 명백한 증가는 더 높은 시알릴화도를 증명한다.

실시예들:

1.1 A1AT 및 ASGPR-Ⅰ 및 -Ⅱ의 클로닝

인간 A1AT-cDNA가 인비트로젠(다름슈타트, 독일)으로부터의 pcDNA3.1 zeo (+) 벡터 속으로 클로닝되었다. ASGPR-Ⅰ 및 ASGPR-Ⅱ 이소폼(isoforms) 2 cDNA가 이마진(ImaGenes(베를린, 독일))으로부터 얻어졌고 인비트로젠으로부터의 pcDNA3.1 zeo (+) 또는 pcDNA3.1 hygro (+) 속으로 클로닝되었다.

1.2 HEK293 세포들의 형질감염(transfection) 및 선발(selection)

HEK293 세포들이 5% CO₂ 분위기 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 글루타민 및 5% FCS를 갖는 37℃의 DMEM에서 배양되었다. 형질감염은 제조업체의 지시에 따라 리포펙타민과, 제오신(A1AT 또는 ASGPR-Ⅰ) 또는 하이그로마이신(ASGPR-Ⅱ)의 존재하에서 선발된 세포들을 가지고 수행되었다.

1.3 A1ATwt의 발현 및 정제

안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들이 50% 컨플루언시(confluency)까지 성장되었고, PBS로 2회 세척되었으며 24h 동안 AEM 배지에서 배양되었다. 그 다음, 상기 배지는 제거되고, 세포들은 신선한 AEM 배지에서 재현탁되고 쉐이킹 플라스크에서 10일 동안 성장되었다. 세포 배양체는 원심분리되었고, 상청액은 0.22 ㎛ 필터에 의해 여과되고 물로 1:2 로 희석되었다. 그 다음 A1AT 단백질이 음이온 교환 크로마토그래피(모노Q 5/50 GL, 버퍼 A 0.5×PBS, 버퍼 B 0.5×PBS + 1 M NaCl)와 뒤따르는 사이즈 배제 크로마토그래피(수퍼덱스 200 10/300 GL, 러닝 버퍼 0.5×PBS)에 의해 정제되었다.

1.4 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(electrophoresys), 전영염(electroblotting) 및 면역염색(immunostaining)

램리(Laemmli, U.K. (1970) 네이쳐 227, 680-5)에 따라 샘플들이 준비되었고, 단백질들이 니트로셀룰로오스 막으로 이동되었다. 이를 위해, 탱크 트랜스-블롯 셀(바이오-래드, 리치몬드, CA, USA)에서 블롯팅 버퍼(25mM 트리스, 114 mM 글리신, 10% (v/v) 에탄올)로 단백질들의 전기이동(electrotransfer)이 수행되었다. 블롯팅(blotting) 후, 상기 막은 5%의 건조 탈지유(dry skim milk)를 포함하는 PBS로 블로킹되었다. 다클론성 항-ASGPR-Ⅰ 및 -Ⅱ 항체(아비바 시스템즈 바이올로지, 산 디에고, CA, USA) 각각에 의해 ASGPR-Ⅰ 및 ASGPR-Ⅱ가 감지되었고, 이어서 화학발광 반응(chemiluminescence reaction) 및 버사 독(versa doc) 시스템(바이오-래드, 리치몬드, CA, USA)을 이용하여 2차 항체 감지(페록시다아제-컨쥬게이티드 염소 항 토끼 lgG, 잭슨 이뮤노 리서치 레보라토리, 웨스트 그로브, PA, USA)가 뒤따른다.

1.5 제거(Clearance)-분석(Assay)

안정하게 ASGPR-Ⅰ및 이중으로 ASGPR-Ⅰ 및 ASGPR-Ⅱ 형질감염된 HEK293 세포들 뿐만 아니라 형질감염되지 않은 HEK293 야생형 세포들이 96-웰 플레이트(well plates)에서 ~1×10⁴ 세포들로 씨딩되었고 표준 배양 조건하에서 2일 동안 성장되었다. 그 다음, 정제된 재조합 A1AT가 각 웰에 6 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가되었다. 지시된 시간에 100㎕의 상청액이 제거되었고(다른 웰들로부터 매 시간 그러나 동등하게 취급됨) A1AT-ELISA에 의해 A1AT 함량이 분석되었다. 데이터는 초기 A1AT 농도의 퍼센트로서 계산되었고 HEK293 세포들에 의한 A1AT 흡수율로 해석되었다.

1.6 A1AT-ELISA

96-웰 마이크로 플레이트를 이용하여, 각 웰이 100㎕의 다클론성 토끼 항-인간 A1AT 항체(PBS 에서 0.14 ㎍/㎖ )로 4℃에서 16시간 동안 코팅되었다. 뒤따르는 모든 배양 단계들은 실온에서 수행되었다. 상기 웰들은 그 다음 1%(w/v) BSA 200㎕ 및 PBS에서 0.2%(v/v) 트윈 20으로 2시간 동안 블로킹되었다. 100㎕의 스탠다드 및 샘플들이 3회 피펫되고(pipetted) 2시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 0.2%(v/v) 트윈 20을 포함하는 PBS로 세척되었고 100㎕의 단클론성 양(sheep) 항-인간 A1AT HRP 컨쥬게이티드 항체로 결합된 A1AT가 검출되었다.

결과는 도 1, 2, 3, 4, 및 5에 도시된다.

도 1 에서는, 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들은 실제로 ASGPR-Ⅰ 및 -Ⅱ 서브유닛의 발현을 나타내는 것으로 입증된다.

도 2 에서는, 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들이 시간이 지남에 따라 시알릴화되지 않은, 불완전하게 시알릴화된 그리고 고도로/완전히 시알릴화된 A1AT의 혼합물을 포함하는 상청액으로부터 재조합 A1AT 단백질을 제거하는 반면, 상기 유전자 변형이 결여된 HEK293 세포는 그러한 제거를 보여주지 않는 것으로 나타난다.

도 3 에서는, ASGPR 형질감염된 세포들에서 발현된 A1AT는 ASGPR 형질감염되지 않은 세포들 및 프로라스틴과 비교하여 더 높은 분자질량으로 변화되는 것으로 입증된다. 이러한 작지만 명확한 변화는 ASPGR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들에서 발현되는 A1AT의 더 높은 시알릴화도를 나타낸다.

도 4 에서는, ASPGR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들에서 발현되는 A1AT의 더 높은 분자질량으로의 변화는 더 높은 시알릴화도로 인한 것이라는 사실이 입증된다. A1AT는 시알리다아제로 디시알릴화되거나 PNGaseF로 디글리코실화되었는 바, 이는 ASGPR 형질감염 되거나 또는 되지 않고 이루어진 발현들간 동일한 분자질량으로 귀결되었고, 이는 상기한 변화가 ASPGR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들 내에서 발현된 A1AT의 더 높은 시알릴화도에 기인한 것이라는 사실을 증명한다.

도 5 에서는, ASGPR 형질감염된 HEK293 세포들에서 발현된 A1AT가 더 높은 시알릴화도를 나타낸다는 것을 안정적으로 형질감염된 ASGPR로 또는 그것이 없는 A1AT 의 N-글리칸 풀(pool)의 분석에 의해 보여준다. A1AT 단백질들은 음이온 교환 크로마토그래피와 뒤따르는 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고 N-글리칸은 PNFaseF에 의해 유리되었다. N-글리칸은 역상 카트리지 및 고상 추출법에 의해 정제되었고, 포지티브 모드에서 수행된 말디-톱 질량 분석 이전에 최종적으로 퍼메틸화되었다. ASGPR 형질감염된 HEK293 세포들에서 발현된 A1AT 내 시알릴화된 트리안테너리 구조의 명백한 증가는 더 높은 시알릴화도를 증명한다.

따라서, 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 HEK293 세포들은 상청액 또는 조정 배지(conditioned medium)로부터 시알릴화되지 않고 및/또는 불완전하게 시알릴화된 당단백질을 양적으로 제거할 수 있다고 결론지을 수 있다. 더 나아가, ASGPR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포들에서 발현된 당단백질 A1AT는 ASGPR 형질감염되지 않은 HEK293 세포들에서 발현된 A1AT 보다 상당히 더 높은 시알릴화도를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Charite Universitaetsmedizin Berlin <120> The use of a genetically modified cell line expressing functional ASGPR protein in the production of highly sialylated glycoproteins <130> P07767WO <150> EP 10 162 184.5 <151> 2010-05-06 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 291 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser 1 5 10 15 Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu 20 25 30 Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu 35 40 45 Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser 50 55 60 Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe 65 70 75 80 Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly 85 90 95 Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln 100 105 110 Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys 115 120 125 Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu 130 135 140 Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu 145 150 155 160 His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala 165 170 175 Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val 180 185 190 Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val 195 200 205 Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val 210 215 220 Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln 225 230 235 240 Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala 245 250 255 His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro 260 265 270 Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro 275 280 285 Pro Leu Leu 290 <210> 2 <211> 311 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn 1 5 10 15 Asp His Pro Phe His Gln Gly Glu Gly Pro Gly Thr Arg Arg Leu Asn 20 25 30 Pro Arg Arg Gly Asn Pro Phe Leu Lys Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro 35 40 45 Leu Ala Gln Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Ser Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln 65 70 75 80 Ser Glu Gly His Arg Gly Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu 85 90 95 Lys Glu Ala Phe Ser Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln 100 105 110 Ala Ile Ser Thr His Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu 115 120 125 Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp 130 135 140 Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val 145 150 155 160 Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys 165 170 175 Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser 180 185 190 His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu 195 200 205 Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile 210 215 220 Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr 245 250 255 Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu 260 265 270 Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn 275 280 285 Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg 290 295 300 Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala 305 310 <210> 3 <211> 876 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 atgaccaagg agtatcaaga ccttcagcat ctggacaatg aggagagtga ccaccatcag 60 ctcagaaaag ggccacctcc tccccagccc ctcctgcagc gtctctgctc cggacctcgc 120 ctcctcctgc tctccctggg cctcagcctc ctgctgcttg tggttgtctg tgtgatcgga 180 tcccaaaact cccagctgca ggaggagctg cggggcctga gagagacgtt cagcaacttc 240 acagcgagca cggaggccca ggtcaagggc ttgagcaccc agggaggcaa tgtgggaaga 300 aagatgaagt cgctagagtc ccagctggag aaacagcaga aggacctgag tgaagatcac 360 tccagcctgc tgctccacgt gaagcagttc gtgtctgacc tgcggagcct gagctgtcag 420 atggcggcgc tccagggcaa tggctcagaa aggacctgct gcccggtcaa ctgggtggag 480 cacgagcgca gctgctactg gttctctcgc tccgggaagg cctgggctga cgccgacaac 540 tactgccggc tggaggacgc gcacctggtg gtggtcacgt cctgggagga 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Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln 100 105 110 Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His 115 120 125 Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His 130 135 140 Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His 145 150 155 160 Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu 165 170 175 Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn 180 185 190 Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn 195 200 205 Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp 210 215 220 Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro 225 230 235 240 Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu 245 250 255 Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr 260 265 270 Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala 275 280 285 <210> 6 <211> 292 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn 1 5 10 15 Asp His Pro Phe His Gln Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro Leu Ala Gln 20 25 30 Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu Ser Phe Asn 35 40 45 Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln Ser Glu Gly 50 55 60 His Arg Gly Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ala 65 70 75 80 Phe Ser Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln Ala Ile Ser 85 90 95 Thr His Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys 100 105 110 Leu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Phe His Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln 130 135 140 Met Glu Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys Cys Pro Val 145 150 155 160 Asn Trp Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly 165 170 175 Lys Ala Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His 180 185 190 Leu Val Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile Val Gln His 195 200 205 Thr Asn Pro Phe Asn Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Asp Gly Ser 210 215 220 Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr Lys Asn Trp 225 230 235 240 Ala Val Thr Gln Pro Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Asp Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Phe 260 265 270 Cys Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr 275 280 285 Gly Glu Val Ala 290 <210> 7 <211> 864 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 atggccaagg actttcaaga tatccagcag ctgagctcgg aggaaaatga ccatcctttc 60 catcaagggc cacctcctgc ccagcccctg gcacagcgtc tctgctccat ggtctgcttc 120 agtctgcttg ccctgagctt caacatcctg ctgctggtgg tcatctgtgt gactgggtcc 180 caaagtgcac agctgcaagc cgagctgcgg agcctgaagg aagctttcag caacttctcc 240 tcgagcaccc tgacggaggt ccaggcaatc agcacccacg gaggcagcgt gggtgacaag 300 atcacatccc taggagccaa gctggagaaa cagcagcagg acctgaaagc agatcacgat 360 gccctgctct tccatctgaa gcacttcccc gtggacctgc gcttcgtggc ctgccagatg 420 gagctcctcc acagcaacgg ctcccaaagg acctgctgcc ccgtcaactg ggtggagcac 480 caaggcagct gctactggtt ctctcactcc gggaaggcct gggctgaggc ggagaagtac 540 tgccagctgg agaacgcaca cctggtggtc atcaactcct gggaggagca gaaattcatt 600 gtacaacaca cgaacccctt caatacctgg ataggtctca cggacagtga tggctcttgg 660 aaatgggtgg atggcacaga ctataggcac aactacaaga actgggctgt cactcagcca 720 gataattggc acgggcacga gctgggtgga agtgaagact gtgttgaagt ccagccggat 780 ggccgctgga acgatgactt ctgcctgcag gtgtaccgct gggtgtgtga gaaaaggcgg 840 aatgccaccg gcgaggtggc ctga 864 <210> 8 <211> 879 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 8 atggccaagg actttcaaga tatccagcag ctgagctcgg aggaaaatga ccatcctttc 60 catcaagggc cacctcctgc ccagcccctg gcacagcgtc tctgctccat ggtctgcttc 120 agtctgcttg ccctgagctt caacatcctg ctgctggtgg tcatctgtgt gactgggtcc 180 caaagtgagg gtcacagagg tgcacagctg caagccgagc tgcggagcct gaaggaagct 240 ttcagcaact tctcctcgag caccctgacg gaggtccagg caatcagcac ccacggaggc 300 agcgtgggtg acaagatcac atccctagga gccaagctgg agaaacagca gcaggacctg 360 aaagcagatc acgatgccct gctcttccat ctgaagcact tccccgtgga cctgcgcttc 420 gtggcctgcc agatggagct cctccacagc aacggctccc aaaggacctg ctgccccgtc 480 aactgggtgg agcaccaagg cagctgctac tggttctctc actccgggaa ggcctgggct 540 gaggcggaga agtactgcca gctggagaac gcacacctgg tggtcatcaa ctcctgggag 600 gagcagaaat tcattgtaca acacacgaac cccttcaata cctggatagg tctcacggac 660 agtgatggct cttggaaatg ggtggatggc acagactata ggcacaacta caagaactgg 720 gctgtcactc agccagataa ttggcacggg cacgagctgg gtggaagtga agactgtgtt 780 gaagtccagc cggatggccg ctggaacgat gacttctgcc tgcaggtgta ccgctgggtg 840 tgtgagaaaa ggcggaatgc caccggcgag gtggcctga 879 <210> 9 <211> 284 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Thr Lys Asp Tyr Gln Asp Phe Gln His Leu Asp Asn Asp Asn Asp 1 5 10 15 His His Gln Leu Arg Arg Gly Pro Pro Pro Thr Pro Arg Leu Leu Gln 20 25 30 Arg Leu Cys Ser Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ile Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Thr Ser Gln Asn Ser Gln 50 55 60 Leu Arg Glu Asp Leu Leu Ala Leu Arg Gln Asn Phe Ser Asn Leu Thr 65 70 75 80 Val Ser Thr Glu Asp Gln Val Lys Ala Leu Ser Thr Gln Gly Ser Ser 85 90 95 Val Gly Arg Lys Met Lys Leu Val Glu Ser Lys Leu Glu Lys Gln Gln 100 105 110 Lys Asp Leu Thr Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys Gln 115 120 125 Leu Val Ser Asp Val Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Phe Arg 130 135 140 Gly Asn Gly Ser Glu Arg Ile Cys Cys Pro Ile Asn Trp Val Glu Tyr 145 150 155 160 Glu Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Ser Ser Val Arg Pro Trp Thr Glu 165 170 175 Ala Asp Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Val Thr 180 185 190 Ser Arg Asp Glu Gln Asn Phe Leu Gln Arg His Met Gly Pro Leu Asn 195 200 205 Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp 210 215 220 Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Gln Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro 225 230 235 240 Asp Asn Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His 245 250 255 Phe Thr Thr Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Arg Arg Pro Tyr 260 265 270 Arg Trp Val Cys Glu Thr Lys Leu Asp Lys Ala Asn 275 280 <210> 10 <211> 284 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Met Thr Lys Asp Tyr Gln Asp Phe Gln His Leu Asp Asn Glu Asn Asp 1 5 10 15 His His Gln Leu Gln Arg Gly Pro Pro Pro Ala Pro Arg Leu Leu Gln 20 25 30 Arg Leu Cys Ser Gly Phe Arg Leu Phe Leu Leu Ser Leu Gly Leu Ser 35 40 45 Ile Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Thr Ser Gln Asn Ser Gln 50 55 60 Leu Arg Glu Asp Leu Arg Val Leu Arg Gln Asn Phe Ser Asn Phe Thr 65 70 75 80 Val Ser Thr Glu Asp Gln Val Lys Ala Leu Thr Thr Gln Gly Glu Arg 85 90 95 Val Gly Arg Lys Met Lys Leu Val Glu Ser Gln Leu Glu Lys His Gln 100 105 110 Glu Asp Leu Arg Glu Asp His Ser Arg Leu Leu Leu His Val Lys Gln 115 120 125 Leu Val Ser Asp Val Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu Arg 130 135 140 Gly Asn Gly Ser Glu Arg Ile Cys Cys Pro Ile Asn Trp Val Glu Tyr 145 150 155 160 Glu Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Ser Ser Val Lys Pro Trp Thr Glu 165 170 175 Ala Asp Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Val Thr 180 185 190 Ser Trp Glu Glu Gln Arg Phe Val Gln Gln His Met Gly Pro Leu Asn 195 200 205 Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp 210 215 220 Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Gly Gln Pro 225 230 235 240 Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His 245 250 255 Phe Thr Thr Asp Gly His Trp Asn Asp Asp Val Cys Arg Arg Pro Tyr 260 265 270 Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Gly Lys Ala Asn 275 280 <210> 11 <211> 301 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Met Glu Lys Asp Cys Gln Asp Ile Gln Gln Leu Asp Ser Glu Glu Asn 1 5 10 15 Asp His Gln Leu Ser Gly Asp Asp Glu His Gly Ser His Val Gln Asp 20 25 30 Pro Arg Ile Glu Asn Pro His Trp Lys Gly Gln Pro Leu Ser Arg Pro 35 40 45 Phe Pro Gln Arg Leu Cys Ser Thr Phe Arg Leu Ser Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Ala Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Val Ser Ser Gln 65 70 75 80 Ser Ile Gln Leu Gln Glu Glu Phe Arg Thr Leu Lys Glu Thr Phe Ser 85 90 95 Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Met Glu Phe Gly Ala Leu Asp Thr Leu 100 105 110 Gly Gly Ser Thr Asn Ala Ile Leu Thr Ser Trp Leu Ala Gln Leu Glu 115 120 125 Glu Lys Gln Gln Gln Leu Lys Ala Asp His Ser Thr Leu Leu Phe His 130 135 140 Leu Lys His Phe Pro Met Asp Leu Arg Thr Leu Thr Cys Gln Leu Ala 145 150 155 160 Tyr Phe Gln Ser Asn Gly Thr Glu Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu 165 170 175 Phe Gly Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Asp Gly Leu Thr Trp Ala 180 185 190 Glu Ala Asp Gln Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Leu Val Ile 195 200 205 Asn Ser Arg Glu Glu Gln Asp Phe Val Val Lys His Arg Ser Gln Phe 210 215 220 His Ile Trp Ile Gly Leu Thr Asp Arg Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val 225 230 235 240 Asp Gly Thr Asp Tyr Arg Ser Asn Tyr Arg Asn Trp Ala Phe Thr Gln 245 250 255 Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Glu Gln Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala 260 265 270 Glu Ile Leu Ser Asp Gly His Trp Asn Asp Asn Phe Cys Gln Gln Val 275 280 285 Asn Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ile Thr His 290 295 300 <210> 12 <211> 301 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12 Met Glu Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Asp Ser Glu Glu Asn 1 5 10 15 Asp His Gln Leu Ile Gly Asp Glu Glu Gln Gly Ser His Val Gln Asn 20 25 30 Leu Arg Thr Glu Asn Pro Arg Trp Gly Gly Gln Pro Pro Ser Arg Pro 35 40 45 Phe Pro Gln Arg Leu Cys Ser Lys Phe Arg Leu Ser Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Ala Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Val Ser Ser Gln 65 70 75 80 Ser Met Gln Leu Gln Lys Glu Phe Trp Thr Leu Lys Glu Thr Leu Ser 85 90 95 Asn Phe Ser Thr Thr Thr Leu Met Glu Phe Lys Ala Leu Asp Ser His 100 105 110 Gly Gly Ser Arg Asn Asp Asn Leu Thr Ser Trp Glu Thr Ile Leu Glu 115 120 125 Lys Lys Gln Lys Asp Ile Lys Ala Asp His Ser Thr Leu Leu Phe His 130 135 140 Leu Lys His Phe Pro Leu Asp Leu Arg Thr Leu Thr Cys Gln Leu Ala 145 150 155 160 Phe Phe Leu Ser Asn Gly Thr Glu Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu 165 170 175 Phe Gly Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Asp Gly Leu Thr Trp Ala 180 185 190 Glu Ala Asp Gln Tyr Cys Gln Met Glu Asn Ala His Leu Leu Val Ile 195 200 205 Asn Ser Arg Glu Glu Gln Glu Phe Val Val Lys His Arg Gly Ala Phe 210 215 220 His Ile Trp Ile Gly Leu Thr Asp Lys Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val 225 230 235 240 Asp Gly Thr Glu Tyr Arg Ser Asn Phe Lys Asn Trp Ala Phe Thr Gln 245 250 255 Pro Asp Asn Trp Gln Gly His Glu Glu Gly Gly Ser Glu Asp Cys Ala 260 265 270 Glu Ile Leu Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asp Asn Phe Cys Gln Gln Val 275 280 285 Asn Arg Trp Ala Cys Glu Arg Lys Arg Asp Ile Thr Tyr 290 295 300

Claims (15)

1. 기능성 ASGPR 단백질을 발현하는 세포주의 시알릴화된 당단백질의 생산에의 이용으로서:
   - 상기 세포주는 생산될 당단백질을 발현 및 분비하도록 유전자 변형되고; 그리고/또는
   - 상기 세포주는 생산될 당단백질을 발현 및 분비하는 별도의 생산 세포주와의 조합으로 이용되는 것을 특징으로 하는 이용.
2. 제 2 항에 따른 이용으로서,
   상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 그것들로 구성된다:
   - SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 9 를 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 10을 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 중 하나와 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및
   - SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 11 을 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 12 를 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;
   여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 50개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정됨.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 이용으로서,
   상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 그것들로 구성된다:
   - SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및
   - SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5 또는 SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;
   여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5 또는 6 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정됨.
4. 전항들 중 하나에 따른 이용으로서,
   상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 그것들로 구성되는 이용:
   - SEQ ID No. 1을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열; 및
   - SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5 또는 SEQ ID No. 6 중 하나를 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열.
5. 전항들 중 하나에 따른 이용으로서,
   상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 세포주인 이용.
6. 제 5 항에 따른 이용으로서,
   상기 유전자 변형된 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1 또는 그 이상의 핵산 분자로 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염된 이용.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 이용으로서,
   기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 상기 세포주는 상기 유전자 변형을 결여한 각 친 세포주와 비교해서 적어도 2배 만큼 증가된 아시알로당단백질에 대한 내재화율을 나타내는 이용.
8. 전항들 중 하나에 따른 이용으로서,
   상기 세포주 및, 선택적으로 상기 생산 세포주는 현탁 배양에 이용되는 이용.
9. 전항들 중 하나에 따른 이용으로서,
   상기 세포주는 시알릴화된 당단백질들, 바람직하게는 완전하게 시알릴화된 당단백질들로 풍부해진 단백질 분획을 생산하는데 이용되는 이용.
10. 시알릴화된 당단백질들의 생산을 위한 방법으로서,
    세포주가 이용되되, 상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하고, 상기 방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (ⅰ) 생산될 당단백질을 발현, 글리코실화 및 분비하는 수단의 제공;
    (ⅱ) 시알릴화되지 않은 당단백질이 상기 세포주의 세포들에 의해 흡수될 수 있도록, 상기 분비된 당단백질을 상기 세포주와 접촉; 및
    (ⅲ) 상기 세포주의 세포들에 의해 흡수되지 않은 분비된 당단백질을 분리.
11. 제 10 항의 방법으로서,
    상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 그것들로 구성되는 방법:
    - SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 9 를 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 10을 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열 중 하나와 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및
    - SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열, SEQ ID No. 11 을 갖는 생쥐(mouse) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID No. 12 를 갖는 쥐(rat) ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;
    여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11 및/또는 12 각각의 적어도 50개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정됨.
12. 제 10 항 또는 제 11 항의 방법으로서,
    상기 기능성 ASGPR 단백질은 다음을 포함하거나 그것들로 구성되는 방법:
    - SEQ ID No. 1 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅰ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열; 및
    - SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5 또는 SEQ ID No. 6 을 갖는 인간 ASGPR-Ⅱ의 아미노산 서열과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열;
    여기서, 서열 일치성(sequence identity)은 SEQ ID No. 1, 2, 5 또는 6 각각의 적어도 100개의 연속되는 아미노산의 서열 길이에 걸쳐 결정됨.
13. 제 10 항 내지 제12항에 따른 방법으로서,
    적어도 상기 분비된 당단백질의 상기 세포주와의 접촉은 현탁 배양 조건하에서 수행되는 방법.
14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 하나에 따른 방법으로서,
    상기 세포주는 기능성 ASGPR 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 유전자 변형 세포주인 방법.
15. 제 10 항 내지 제14 항 중 하나의 방법으로서,
    상기 방법은 시알릴화된 당단백질들, 바람직하게는 완전하게 시알릴화된 당단백질들로 풍부해진 단백질 분획을 생산하는데 사용되는 방법.

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