KR20130062654A

KR20130062654A - 락토바실러스 헬베티커스에서 유래하는 신규한 시나모일 에스터라제

Info

Publication number: KR20130062654A
Application number: KR1020110129043A
Authority: KR
Inventors: 백상호; 송영란
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2011-12-05
Publication date: 2013-06-13

Abstract

본 발명은 락토바실러스 헬베티커스에서 유래하는 신규한 시나모일 에스터라제 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체를 이용한 재조합 폴리펩타이드의 제조방법, 재조합 폴리펩타이드의 정제방법 및 상기 시나모일 에스터라제를 이용하여 카페익산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시나모일 에스터라제는 과채류 및 식품 속에 다량으로 존재하는 고흡수성 고기능성 항산화 물질인 클로로제닉산을 흡수가 용이한 카페익산으로 전환시킬수 있는 효소로서, 높은 수율로 클로로제닉산을 카페익산으로 전환시킬 수 있는바, 카페익산을 포함하는 항산화제제의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

락토바실러스 헬베티커스에서 유래하는 신규한 시나모일 에스터라제 {Novel Cinnamoyl esterase from Lactobacillus helveticus}

본 발명은 신규한 시나모일 에스터라제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus)에서 유래하는 신규한 시나모일 에스터라제 (Cinnamoyl esterase) 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이 형질전환체를 이용한 재조합 폴리펩타이드의 제조방법 및 상기 시나모일 에스터라제를 이용하여 카페익산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

식물세포벽의 다당류는 자연적으로 발생되는 가장 풍부한 유기체 화합물로 콩, 차, 커피, 사과, 배과류, 감자의 덩이줄기, 토마토, 시금치, 브로컬리, 복숭아 등 식물체에는 페놀류에 속하는 기능성 성분인 하이드록시시나믹산 (hydroxycinnamic acid)이 폭넓게 존재하며, 그중에서도 가장 풍부하게 존재하는 하이드록시시나믹산은 클로로제닉산 (chlorogenic acid, 5-caffeoyl-quinic acid)으로 카페익산 (caffeic acid)과 퀴닉산 (quinic acid)이 에스테르 결합된 형태이다. 하이드록시시나믹산의 일종인 클로로제닉산과 카페익산은 인체내에서 자유 라디칼 포집 (free radical scavenging), 금속 이온 봉쇄 (metal ion chelating) 등의 강한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그중 식품에 고농도로 존재하는 페놀류의 하나인 클로로제닉산은 식이로서 섭취될 때 소장에 도착하여 일부분 장내 미생물에 의하여 가수분해 되고, 저분자화 되어 카페익의 형태로 흡수되어지나, 이런 작용이 비교적 약하여 대부분은 흡수되어지지 못하고 배출된다. 반면 클로로제닉산의 가수분해 형태인 카페익산은 위와 소장에서 클로로제닉산에 비하여 고흡수되어 그 차이가 3배 정도에 이르며, 뛰어난 항산화 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이렇듯 인체에서의 흡수 및 작용은 효소적인 작용에 크게 의존되어 유용물질의 흡수율에 지대하게 영향을 미친다고 할 수 있는데, 클로로제닉산을 카페익산으로 가수분해 하는 효소를 시나모일 에스터라제 (cinnamoyl esterase)라고 한다. 한편 인간의 장내 미생물은 이와 같은 시나모일 에스터라제 활성을 가진 것으로 알려져 있으나, 현재까지 유산균 유래의 이 효소에 대한 연구와 특이적으로 클로로제닉산을 카페익산으로 전환하는 시나모일 에스터라제의 활성을 가진 균주의 구체적인 특성에 대한 연구와 특히 이를 이용한 식품의 개발에 대한 연구는 미미한 실정이다.

반면 콩과 (Leguminosae)류, 커피, 배, 사과, 토마토, 녹차 등 다양한 식물체 속에는 항산화 물질 성분인 주요 폴리페놀류로 전술의 클로로제닉산, 카페익산과 쿠마릭산 (p-coumalic acid), 시린진산 (syringic acid), 바닐린산 (vanillic acid)등이 천연적으로 존재하며, 이들은 유리 상태보다는 에스테르 결합을 한 형태를 가진다. 따라서 이런 에스테르 결합을 한 형태로 주로 존재하는 클로로제닉산은 시나모일 에스터라제에 의해 유리형태인 카페익산으로써 섭취 될 때, 그 소화 정도가 증가되어, 항산화 효과를 높일 것으로 보인다. 현재까지 하이드록시시나믹산에 연결되어있는 여러 종류의 당-에스터 결합을 가수분해하는 효소인 시나모일 에스터라제에 관한 연구는 인간의 대장속에서 발견되는 박테리아 유래에 대한 연구 또는 Aspergillus niger 또는 A. japonicus 등과 같은 곰팡이에 대한 연구가 주로 진행되어 있는 상태로, 유산균 유래의 시나모일 에스터라제 과량생산을 위한 발현과 정제에 관한 연구는 매우 미미하다. 따라서 본 발명에서는 이런 시나모일 에스터라제 활성을 가진 유산균을 발굴하고, 본 유산균유래 시나모일 에스터라제의 과량생산을 위해 재조합 기술을 적용하고, 최종적으로 본 연구에서 개발한 고활성의 시나모일 에스터라제를 사용하여 카페익산의 제조하고자 하였다.

본 발명자들은 카페익산을 생산하는 새로운 유산균 및 이로부터 유래한 신규 시나모일 에스터라제를 찾고자 연구한 결과, 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223으로부터 클로로제닉산을 가수분해함으로서 카페익산을 생산하는 약 28 kDa 크기의 신규 시나모일 에스테라제와 이를 코딩하는 유전자를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 균주에서 유래하는 신규한 시나모일 에스터라제를 찾고자 연구한 결과, 락토바실러스 헬베티커스로부터 클로로제닉산을 가수분해함으로서 카페익산을 생산하는 약 28 kDa 크기의 신규 시나모일 에스테라제와 이를 코딩하는 유전자를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 시나모일 에스터라제를 제공함에 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 시나모일 에스터라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 제공함에 있다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 현질전환체를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 제공함에 있다.

또한 본 발명의 목적은 카페익산을 제조하는 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 락토바실러스 헬베티커스 유래 시나모일 에스터라제를 제공한다. 바람직하게는 상기 시나모일 에스터라제는 서열번호4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및,

(2) 상기 (1)단계의 배양된 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시나모일 에스터라제와 클로로제닉산을 반응시키는 단계를 포함하는, 카페익산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 시나모일 에스터라제는 과채류 및 식품 속에 다량으로 존재하는 고흡수성 고기능성 항산화 물질인 클로로제닉산을 흡수가 용이한 카페익산으로 전환시킬수 있는 효소로서, 높은 수율로 클로로제닉산을 카페익산으로 전환시킬 수 있는바, 카페익산을 포함하는 항산화제제의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 클로로제닉산이 시나모일 에스터라제에 의하여 카페익산과 퀴닉산으로 분해되는 기작을 나타내는 그림이다.
도 2는 클로로제닉산이 포함된 배지에 락토바실러스 헬베티커스를 72시간 배양한 후 추출액의 TLC 크로마토그램의 결과이다. Line 1은 클로로제닉산 표준물질, Line 2는 카페익산 표준물질, Line 1+2은 클로로제닉산과 카페익산, Line 3은 클로로제닉산이 포함된 배지에 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223 를 접종후 배양한 배양액을 나타낸다.
도 3은 클로로제닉산이 포함된 배지에 락토바실러스 헬베티커스를 72시간 배양한 후 추출액의 HPLC 크로마토그램의 결과이다. (A)는 클로로제닉산과 카페익산의 표준물질, (B)는 클로로제닉산이 포함된 배지에 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223 를 접종후 배양한 배양액을 나타낸다.
도 4는 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223에서 수득한 시나모일 에스터라제의 유전자 증폭결과이다. M은 분자량 마커 (1 Kb DNA ladder, SolGent Co.).
도 5는 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223 로부터 유래한 시나모일 에스터라제의 아미노산 서열에 대한 정보이다.
도 6은 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223 로부터 유래한 시나모일 에스터라제의 뉴클레오타이드 서열 정보이다.
도 7은 재조합 플라스미드 pCE28N-His의 개열지도이다.
도 8은 형질전환된 대장균에서 생산된 재조합 시나모일 에스터라제의 전기영동 패턴이다. M은 분자량 마커 (molecular weight markers), C은 대조군으로서 pET28(a)로 유도된 대장균 BL21(DE3)의 조효소액, 1은 pCE28N-His로 유도된 대장균 BL21(DE3)의 조효소액.
도 9는 재조합 시나모일 에스터라제에 의한 클로로제닉산으로부터 전환된 카페익산의 HPLC 크로마토그램 결과이다. (A)는 클로로제닉산의 표준물질 (retention time; 2.98 min), (B)는 카페익산의 표준물질 (retention time; 3.44 min), (C)는 재조합 시나모일 에스터라제에 의한 시나모일 에스터라제에 대한 활성 분석, (D)는 대조군으로서 pET28(a)이 삽입된 대장균 BL21 (DE3)로부터의 효소액. 분석은 10 mM 클로로제닉산과 10 μg/mL의 조효소액을 포함하는 반응액에서 수행하였다.
도 10은 정제된 재조합 시나모일에스터라제의 정제도를 보여주는 SDS-PAGE 패턴을 나타낸 결과이다. M은 분자량 마커 (molecular weight markers), Crude는 재조합 시나모일 에스터라제의 조효소액, (NH4)2SO4는 암모니움설페이트를 사용한 시나모일 에스터라제의 농축결과, DEAE는 이온교환 크로마토그래피을 사용한 시나모일 에스터라제의 정제결과, G-200은 겔 여과 크로마토그래피를 사용한 시나모일 에스터라제의 정제결과, Q-1은 이온교환 크로마토그래피를 사용한 시나모일 에스터라제의 정제결과로 최종적으로 단일밴드로 정제된 시나모일 에스터라제를 보여주고 있다.
도 11은 정제된 재조합 시나모일 에스터라제에 의한 클로로제닉산의 카페익산으로의 전환에 대한 pH의 영향과 pH의 안정성을 나타낸 결과이다.
도 12는 정제된 재조합 시나모일 에스터라제에 의한 클로로제닉산의 카페익산으로의 전환에 대한 온도의 영향과 온도 안정성을 나타낸 결과이다.
도 13은 시나모일 에스터라제에 의한 검은콩 두유의 클로로제닉산으로부터 전환된 카페익산의 HPLC 크로마토그램 결과이다. (A)는 멸균수를 첨가한 대조구, (B)는 시나모일 에스터라제를 첨가한 실험구이다.

본 발명은 서열번호3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 락토바실러스 헬베티커스 유래 시나모일 에스터라제를 제공한다. 바람직하게는 상기 시나모일 에스터라제는 서열번호4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 “락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus)는 락토바실러스속에 속하며 젖산을 생산할 수 있는 간균이다.

본 발명에서 시나모일 에스터라제란 클로로제닉산 (chlorogenic acid, 5-caffeoyl-quinic acid)을 카페익산 (caffeic acid)과 퀴닉산 (quinic acid)으로 가수분해시킬 수 있는 효소이다 (도1). 클로로제닉산은 장내 미생물에 의하여 카페익산의 형태로 흡수되지만 그 작용이 약하여 대부분 흡수되지 못하고 배출된다. 그에 반하여 카페익산은 클로로제닉산에 비하여 인체 흡수력이 높고 뛰어난 항산화 효과를 나타낸다.

락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus ) KCCM11223 게놈 DNA에서 예상되는 시나모일 에스테라제를 PCR로 증폭하여 염기서열 분석을 실시한 결과, 본 발명의 시나모일 에스테라제는 서열번호3의 폴리펩타이드 서열을 가지며, 서열번호4의 폴리뉴클레오티드서열로 암호화 된 것임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 서열번호4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 재조합 단백질의 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이며, 그 형태를 제한하지 않는다.

발명에 따른 벡터는 당업계에 알려진 다양한 기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 상기 “프로모터”란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, “작동 가능하게 연결된다(operably linked)”는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

이 외에도, 본 발명의 발현 벡터는 일반적인 벡터의 구성요소들, 예를 들어 복제원점 및 다중 아데닐레이션 신호와 기타 전사 조절인자 등을 더 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 도7에서 나타낸 계열지도를 갖는 pET28(a) (Novagen, Madison, USA)를 발현벡터로 사용하였다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용 가능한 바람직한 형질전환용 숙주는 대장균일 수 있으며, 이를 제한하지 않는다.

본 발명에서 사용하는 용어인 “형질전환”이란 핵산을 세포에 도입하는 어떠한 방법도 포함하여, 당 분야에서 공지된 바와 같이 사용하는 대장균주에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및, 상기 단계의 배양된 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 시나모일 에스터라제 (cinnamoyl esterase)의 활성을 갖는 균주를 선별하기 위하여 국내 유산균 12균주를 대상으로 TLC (Thin-layer chromatography, 박층크로마토그래피) 및 HPLC (high performance liquid chromatography, 고속액체 크로마토그래피)를 실시하였으며, 그 결과, 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus ) KCCM11223이 54%의 클로로제닉산의 가수분해율을 보여 높은 시나모일 에스테라제 활성을 나타내었다. 또한, 이러한 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) KCCM11223 유래 시나모일 에스테라제의 염기서열을 분석한 결과, 759개의 뉴클레오타이드로 구성되고 242개의 아미노산을 암호화하였다. 또한, 이러한 서열 정보를 이용하여 상동성을 분석한 결과, 락토바실러스 헬베티커스 DSM 20075의 putative esterase와 99%, Lactobacillus johnsonii의 시나모일 에스터라제와 70%의 identity을 나타내었다. 이 유전자를 포함하는 pCE28N-His 벡터를 이용하여 대장균에서 발현한 결과 약 28 kDa의 단백질임을 확인할 수 있었고, 본 효소의 최적조건에서 (pH 7.0, 37℃) 목적하는 시나모일 에스터라제 고활성을 확인하였다. 또한, 식품에 함유되어 있는 클로로제닉산에 대한 가수분해능을 살펴본 결과, 두유속에 함유되어 있는 클로로제닉산이 카페익산으로 대부분 전환됨을 관찰하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예1 > 시나모일 에스터라제 ( cinnamoyl esterase )활성을 보유한 유산균의 선별

국내 보유 균주인 유산균 12 균주를 분양받아, 클로로제닉산 (chlorogenic acid)을 카페익산 (caffeic acid)으로 가수분해하는 시나모일 에스터라제 (cinnamoyl esterase)활성을 가진 균주를 선별하기 위한 시험을 실시하였다. 각 균주는 시나모일 에스터라제 활성을 확인하기 위하여 MRS 액체배지에 기질로 0.5% (w/v) 클로로제닉산을 혼합하여 autoclave (121℃, 15분)으로 멸균 한 뒤 측정배지로 사용하였다. MRS 액체배지에 전배양된 균주를 1% (v/v) 비율로 접종하여 37℃에서 72시간 동안 정치 배양한 후, 배양액의 전처리는 다음과 같이 실시하였다. 배양액 5 m를 0.1% (w/v) 아스코빅산(ascorbic acid)를 첨가하여 잘 혼합하고 2.5 mL의 ethyl acetate로 교반 추출한 후 원심분리(8000 rpm, 20 min, 4℃)한다. -20℃에서 정치한 후 상등액을 수집하고 얻어진 상등액을 0.45μm membrane filter로 여과하여 TLC (Thin-layer chromatography, 박층크로마토그래피) 및 HPLC (high performance liquid chromatography, 고속액체 크로마토그래피)의 분석시료로 하였다. 표준물질로서 클로로제닉산과 카페익산은 필요한 농도구배별로 메탄올에 녹여 사용하였다. 각 시료의 HPLC 정량 분석을 위하여 standard의 각 농도를 시료의 전처리 과정을 수행한 후 비교하였다.

배양액으로부터의 클로로제닉산과 카페익산 성분 확인을 위한 TLC 분석과 HPLC 분석은 다음과 같다. TLC 분석으로 silica gel TLC 판 (Merck, TLC aluminium sheet, silica gel 60F254)을 하단 2.5 cm, 상단 2.5 cm, 전개길이 12 cm, 용매사이 간격 0.8 cm으로 하였다. 각 standard와 sample은 약 15 μL씩 점적하고 toluene/ethyl acetate/formic acid (50:40:10, v/v/v)로 전개시킨 뒤 건조하여 UV하에서 확인하였다. 또한 본 시료의 HPLC의 분석조건은 하기의 표 1에 나타난 바와 같다.

HPLC 조건

Instrument	Waters 1515 Binary HPLC Pump
Detector	ELSD 800 (Alltech)
Column	inersil^® ODS-3V, 5㎛, 4.0×150 mm
	(GL Sciences Inc. Japan)
Mobile Phase	0.5% formic acid in water : MeCN = 3 : 1
Drift tube Temp.	60℃
Column Temp.	40℃
Flow Rate	1 mL/min
Injection Vol.	20 ㎕

락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223를 클로로제닉산을 기질로한 배양액에서 72시간 동안 배양한 후 배양액으로부터 카페익산을 추출한 뒤 TLC(도2)와 HPLC (도3)분석한 결과, 54%의 클로로제닉산 가수분해율을 보이면서 높은 시나모일 에스테라제 활성을 나타냈다.

< 실시예2 > 시나모일 에스터라제 ( cinnamoyl esterase ) 유전자의 클로닝

2.1. 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223 로부터 게놈 DNA(genome DNA )의 분리

현재까지 유산균인 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)로부터 시나모일 에스터라제 활성을 지닌 단백질의 발현 및 효소의 특성은 아직까지 연구되어있지 않았다. 본 발명에서는 전술에 서술한 결과로부터 시나모일 에스테라아제 고활성을 보인 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223으로부터 시나모일 에스터라제를 암호하는 유전자를 클로닝하고 발현한 후, 그 특성을 조사하였다.

락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223로부터 시나모일 에스터라제의 유전자를 획득하기 위하여 데이터베이스를 검색한 결과, Lactobacillus jonnosonii strain N6.2 유래의 시나모일 에스터라제가 유일하게 클로닝되어 특성이 연구되어 있으며, 락토바실러스 헬베티커스의 경우는 게놈 염기서열이 밝혀진 락토바실러스 헬베티커스 DSM 20075의 게놈데이터베이스에서 추정 에스터라제 (putative esterase)유전자가 5종류 존재할 뿐이었다. 그 중에 상기의 L. jonnosonii strain N6.2 유래의 시나모일 에스터라제 염기서열을 바탕으로 multiple aligment를 실시한 결과 1종류의 추정 에스터라제 (putative esterase) 유전자에서 L. jonnosonii strain N6.2 유래의 시나모일 에스터라제와 48%의 상동성 결과를 확인할 수 있었으며, 아미노산 수준에서 약 70%의 상동성을 보였다.

이와 같은 바탕으로 개시코돈의 상류와 종결코돈의 하류에 해당하는 하기 표2의 두가지 프라이머를 설계 및 제작하였다.

프라이머	서열	서열번호
CEhel-C	5'-ttaaaacgttgcaggttttaaaaattgcgc-3'	서열번호1
CEhel-N	5'-atgtttatgtcccgcattacg-3'	서열번호2

제작된 프라이머 CEhel-C와 CE-hel-N을 사용하여 락토바실러스 헬베티커스 KCCM11223 균주로부터 시나모일 에스터라제 암호화하는 염색체를 분리하기 위하여 본 균주는 MRS 액체배지 5mL에 37℃ 조건으로 24시간 배양한 뒤 게놈 DNA 분리 키트 (게놈 DNA purification kit)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 추출된 게놈 DNA는 1.2% 아가로스 겔에서 확인하고 분광계를 이용하여 단백질 농도를 측정한 뒤, -20℃에서 보관 후 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 위한 주형 (template)으로 사용되었다. 게놈 DNA를 주형으로 CEhel-C, CEhel-N 프라이머는 taq polymerase, dNTP mixure, Taq reaction 버퍼를 사용한 반응액과 함께 95℃에서 1분, 45℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 10회 사이클과 95℃에서 1분, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 사이클을 28회 실시하는 조건으로 PCR을 수행하였다. 얻어진 각각의 PCR 산물을 1.2% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동을 실시하여 확인하였고, 확인된 PCR 산물은 PCR 산물 정제 키트 (PCR Product Purification Kit)을 사용하여 정제한 뒤 ABI PRISM 3730 DNA analyzer로 염기서열 분석을 실시하였다.

본 균주의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 실시한 결과, 시나모일 에스터라제를 암호화 하는 것으로 예상되는 유전자 약 0.7 kbp의 유전자 단편을 회수할 수 있었다 (도 4). 증폭된 약 0.7 kbp의 유전자 단편을 TA 클로닝 벡터에 클로닝 한 후 유전자서열을 확인한 결과 726bp의 DNA로 구성된 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)의 유전자를 확인하였으며 252 아미노산을 암호화하고 있었다. 또한 락토바실러스 헬베티커스 DSM 20075의 putative esterase와는 DNA 수준에서 99%, 아미노산 수준에서 99%의 상동성을 확인하였으며 아미노산중 108번째의 아미노산이 Serine에서 Tyrosine으로 치환되어있는 것을 확인하였다. 또한 L. plantarum JDM1의 추정 에스터라제 (putative esterase)와는 53%의 상동성을 나타냈다. 본 유전자의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도 5 (서열번호3)와 도 6 (서열번호4)에 작성하였다.

2.2. TA 클로닝을 통한 대장균의 형질전환 및 시나모일 에스터라제 클론의 선별

최종 PCR 산물을 클로닝하기 위해서 T&A 클로닝 벡터 키트(T&A Cloning Vector Kit, RBC Bioscience)를 사용하였는데, 먼저 결찰반응 (ligation)은 PCR 산물 5 μL, T&A cloning vector 2 μL, T4-DNA ligase 1 μL와 완충액을 혼합한 총 10 μL의 혼합물을 4℃에서 밤새 반응시켰다. 결찰반응 후 대장균 JM109 competent cell에 형질 전환하였다. 형질전환 후 반응액 100 μL를 ampicillin (50 μL/mL)을 함유한 LB agar plate에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다.

배양된 plate의 집락중에서 대장균으로의 시나모일 에스터라제 클론의 선별을 위해 페놀법을 사용하였다. 형성된 집락을 무작위로 채취하여 암피실린 (ampicillin) 50 μL/mL을 함유한 LB broth 2 mL에 접종하여 37℃, 180 rpm의 조건으로 16시간 배양하였다. 배양액 400 μL는 원심분리 (15,000 rpm, 4 min, 4℃)하여 균체를 취한 뒤 phenol mixture (phenol:chloroform:isoamylalcohol=25:24:1) 50 μL을 넣고 잘 혼탁한 후 sample 버퍼 30 μL를 넣고 섞어 준 뒤 원심분리 (15,000 rpm, 4 min, 4℃)하였다. 상등액 10 μL는 1.2% 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동을 실시한 다음 브롬화 에티듐 (ethidium bromide)으로 염색을 하여 Image Analyzer를 사용하여 UV하에서 밴드를 관찰하였다. 대조군으로서 형질 전환 하지 않은 대장균 JM109 또한 동일한 방법을 사용하여 삽입 여부를 확인하였다. 대조군에서 본래의 T&A Cloning vector의 약 2750 bp의 밴드를 보이는 것과 다르게 약 3500 bp (target gene 750 bp 포함)의 밴드를 관찰함으로서 형질전환 균주를 선택하였다. 선택된 균주는 최종적으로 제한효소 처리를 함으로써 확인되었다. Plasmid Miniprep kit (Axygen Co.)를 사용하여 형질전환 된 대장균 JM109로부터 정제된 플라스미드 DNA는 제한효소 BamHⅠ과 EcoRⅠ과 함께 37℃에서 1시간동안 배양한 후 65℃에서 15분 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 생성된 반응액은 1.2% 아가로스 겔에 전기영동 함으로써 확인하였다.

T&A 클로닝 벡터에 클로닝된 DNA 단편의 염기서열을 분석하기 위하여 Plasmid Miniprep kit (Axygen Co.)를 사용하여 형질전환 된 대장균 JM109로부터 정제한 플라스미드 DNA와 프라이머 M13F (5‘-GTT TTC CCA GTC ATG AC-3') (서열번호5)과 M13R (5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3') (서열번호6)를 사용하였다. 염기서열 분석은 ABI PRISM 3730 DNA analyzer로 수행하였다. 그 결과 형질전환 된 대장균 JM109로부터의 DNA 단편이 목적하는 락토바실러스 헬베티거스 KCCM11223유래의 유전자 서열 (도 6)과 일치하는 것을 확인하여 다음단계로의 진행을 실시하였다.

2.3. 대장균을 숙주로 이용한 시나모일 에스터라제의 발현 유도

시나모일 에스터라제 유전자의 이종숙주에서의 클로닝과 발현을 위해 사용된 대장균 균주는 대장균 JM109와 BL21 (DE3) (Novagen, Madison, USA)이고, Novagen에서 구입한 pET28(a) 벡터가 사용되었다. 시나모일 에스터라제의 대장균에서의 발현을 위한 발현벡터를 구축하기 위하여, TA positive clone이 포함된 플라스미드 DNA를 주형으로 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ가 포함되도록 설계하게 제작한 프라이머 CEhelBamN과 프라이머 CEhelHindC (표 3)와 함께 95℃에서 1분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 사이클을 28회 실시하는 PCR 조건으로 수행하였고, 증폭된 PCR 산물은 정제되었다. 증폭된 약 750 bp의 DNA 산물을 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ으로 처리한 pET28(a) vector에 삽입한 뒤, JM109 competent cell을 사용하여 형질전환시킨 라이브러리를 구축하였다. 형질전환 후 반응액 100 μL를 kanamycin (50 μL/mL)을 함유한 LB agar plate에 도말하고 37℃에서 밤새 배양후 형성된 라이브러리의 콜로니에서 형질 전환 여부를 판정하기 위하여 상기와 동일한 페놀법을 사용하였다. 그 결과 삽입이 확인된 콜로니를 대상으로 플라스미드 DNA를 정제한 후 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ를 37℃에서 1시간동안 처리를 함으로써 인써트의 유무를 확인하였다. 최종적으로 얻어진 콜로니에 대해서는 T7 promoter (5‘-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') (서열번호7)와 T7 terminator (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3') (서열번호8)를 사용하여 ABI PRISM 3730 DNA analyzer로 염기서열 분석하였다. 즉, 시나모일 에스터라제의 대장균에서의 발현을 위한 발현벡터를 구축하기 위하여, TA positive clone이 포함된 플라스미드 DNA를 주형으로 제한효소 BamHⅠ과 HindⅢ가 포함되도록 설계된 하기의 표3의 프라이머 CEhelBamN과 프라이머 CEhelHindC를 이용하여 TA clone의 플라스미드 DNA를 주형으로 PCR을 실시하고 pET28(a) 벡터에 삽입하였다. 최종적으로 클로닝 된 벡터는 pCE28N-His로 명명하였다 (도 7).

시나모일 에스터라제의 클로닝을 위해 사용된 프라이머의 서열

프라이머	서열	서열번호
CEhelBamN	5'-aaaaaggatccatgtttatgtcccgcattacg-3'	서열번호9
CEhelHindC	5'-aaaaaaagcttttaaaacgttgcaggttttaaaaattgc-3'	서열번호10

2.4. 대장균을 숙주로 이용한 시나모일 에스터라제의 발현

시나모일 에스터라제의 이종숙주인 대장균에서 발현을 최종적으로 확인하기 위하여 획득된 발현용 벡터인 pCE28N-His를 이용하여 BL21(DE3) 균주를 형질전환시킨 후 50 μg/mL 농도의 kanamycin 항생물질을 포함하는 LB배지 5 mL에서 16시간 전배양한 후 10 mL의 LB 배지로 본배양하여 OD600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양하였다. 목적하는 재조합 단백질인 시나모일 에스터라제의 발현은 0.05 mM의 isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG)를 무균적으로 첨가시켜 목적 단백질 생산을 유도시켰으며 그 후 6시간 배양하였다. 배양균체는 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 멸균된 0.85% NaCl로 두 번 세척한 후 대장균을 회수하였다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 28 kDa 부위에서 대조군과 비교하여 새로운 밴드가 확인되었다 (도 8). 결과적으로 이 밴드의 분자량은 본 유전자의 아미노산 서열에서 예상된 분자량과도 일치하였다. 또한 재조합 시나모일 에스터라제의 클로로제닉산의 카페익산으로의 전환여부를 확인하고 생성량을 확인하기 위하여, 전술에 서술된 방법과 동일하게 배양된 배양액의 일부는 시나모일 에스터라제가 포함된 조효소액을 얻기 위하여 50 mM PBS 완충액 (pH 7.0) 1 ml에 회수한 균체를 현탁 후 초음파처리를 하여 균체를 파괴시켰다. 12,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 조효소액으로 사용하였다. 시나모일 에스터라제의 활성은 50 mM PBS 완충액 (pH 7.0) 에 10 mM 클로로제닉산를 첨가한 후 얻어진 조효소액 (10 μg/mL)을 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 0.45 μm membrane filter로 여과시켜 얻어진 반응액을 TLC와 HPLC로 분석하였다. 이때 대조군으로서 플라스미드 pET28(a)가 삽입된 대장균 BL21 (DE3)로부터의 효소액은 동일한 조건으로 수행되었고 그 결과는 도 9와 같다. 도 9의 (C)결과를 보면 재조합 시나모일 에스터라제는 효소반응 후 기질로서 사용된 클로로제닉산 (retention time, 2.98분)은 모두 가수분해되어 카페익산 (retention time, 3.44분)을 생성함을 관찰할 수 있었다. 또한 2.04분의 retention time이 동일한 조건에서의 HPLC 분석결과 quinic acid의 peak임을 확인하여, 본 효소반응에서는 quinic acid 역시 생성됨을 알 수 있었다. 이는 클로로제닉산가 시나모일 에스터라제에 의하여 카페익산와 quinic acid로 분명하게 가수분해 되었음을 확인할 수 있는 결과이다. 반면 도 9의 (D)결과를 보면 대조군으로 사용된 플라스미드 pET28(a)가 삽입된 대장균 BL21 (DE3)로부터의 효소 반응액에서는 기질로 첨가된 클로로제닉산의 분해는 전혀 이루어지지 않아 카페익산뿐만 아니라 quinic acid의 생성량을 관찰할 수 없었다.

2.5. 대장균에서의 시나모일 에스터라제 발현을 위한 최적조건

플라스미드 pCE28N-His로 형질전환 된 대장균 BL21(DE3) 균주에서의 CE 단백질의 발현 생산을 유도하기 위하여 온도, IPTG 첨가량, IPTG 첨가 후 배양시간에 대한 영향을 알아보았다. 50 μg/mL 농도의 kanamycin을 포함하는 LB배지 5 mL에서 37℃, 16시간 전배양한 후 5 mL의 LB 배지로 37℃에서 본배양하여 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양한 후 0.5 mM의 IPTG를 첨가한 후 배양하는 것을 기본으로 하였다.

온도의 영향을 알아보기 위하여 배양은 22℃, 27℃, 32℃, 37℃에서 IPTG 첨가 후 8시간 및 16시간 동안 배양한 후 효소활성분석과 SDS-PAGE 분석을 실시하였고, 마지막으로 배양시간에 대한 영향을 알아보기 위하여 0, 1, 2, 3, 5, 7, 8, 12, 16시간 동안 배양한 후 배양된 세포를 초음파로 파쇄하고 클로로제닉산을 기질로 하는 효소활성 분석과 SDS-PAGE 분석을 실시하였다.

그 결과, 배양온도 27℃의 조건하에서 1.0 mM의 IPTG 첨가 후 16시간 배양시켰을 경우 가장 많은 발현량을 보이며, 시나모일 에스터라제 발현을 위한 최적조건으로 설정되었다.

2.6. 재조합 시나모일 에스터라제의 정제

플라스미드 pCE28N-His로 형질전환 된 대장균 BL21(DE3) 균주로부터 효소 시나모일 에스터라제의 정제를 위하여, 먼저 형질전환 된 대장균 BL21(DE3) 균주를 50 μg/mL 농도의 kanamycin을 포함하는 총 2L이 되는 LB 액체배지에 접종하여 대량배양 하였는데, 이때 27℃에서 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양한 후 1.0 mM의 IPTG를 첨가한 후 16시간 배양한 후 원심분리 (10,000rpm, 10 min, 4^oC)와 50mM phosphate 완충액(pH 7.2)을 사용하여 두번 세척하고, 동일한 완충액 안에서 Sonicator 사용하여 파쇄한 상등액을 조효소액으로 하였다. 얻어진 조효소액은 4^oC에서 30% 암모니움 설페이트 (ammonium sulfate)로 침전되는 단백질을 제거한 뒤, 60% 암모니움 설페이트로 단백질을 침전시킨 뒤, 침전 된 단백질은 투석막 (3,500 Mw cutoff Thermo-Scientific Ltd, USA)을 사용하여 50mM phosphate 완충액(pH 7.0)에 24시간 동안 투석함으로서 암모니움 설페이트 염을 제거하였다. 염이 제거된 효소 단백질은 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피 (Ion exchange column chromatography, DEAE sepharose)를 수행함으로서 추가 정제되었다. 이때 유속은 분당 1mL로, 단백질의 용출은 50mM phosphate 완충액 중에 NaCl의 농도를 300분 동안에 0M에서 1.0M 까지 증가하여 수행하였고, DEAE 컬럼에서 용출된 CE 효소 분획을 모은 용액은 60% 암모니움 설페이트로 단백질을 침전시킨 뒤, 침전 된 단백질을 50mM phosphate 완충액 (pH 7.0)에 24시간 동안 투석함으로서 농축하였다. 효소를 더욱 정제하기 위하여, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex G-200)를 수행하였는데, 이때 용출은 300M NaCl이 포함된 50mM phosphate 완충액 (pH 7.0)를 1분당 0.5mL으로 흘려줌으로서 수행하였다. G-200 컬럼에서 용출된 단백질 분획의 염을 제거하기 위하여 동일한 완충액을 사용하여 밤새 투석한 후, 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피 (Ion exchange column chromatography, UNO Q-1)를 수행함으로서 마지막으로 CE 효소를 정제하였다. 이때 유속은 분당 0.5mL로, 단백질의 용출은 50mM phosphate 완충액 중에 NaCl의 농도를 8분 동안에 0.05M에서 0.5M까지 증가한 뒤 5분 동안 그 농도를 유지시켜줌으로써 수행되었다.

각 단계마다 용출 된 단백질의 정제도는 SDS-PAGE(10% acrylamide gel)를 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie 염색으로 확인하였으며, 또한 단백질 농도는 lowry 방법을 통하여 특정되었고 효소의 활성은 10mM 클로로제닉산를 기질로 하여 37℃ 온도에서 10분간 반응시킨 후 실시예 1의 표1과 동일한 조건으로 HPLC-ELSD 분석을 통해 측정하였다. 재조합 시나모일 에스터라제의 정제도는 표 4와 같고 또한 SDS-PAGE를 통한 정제 결과는 표 4와 도 10과 같다.

재조합 시나모일 에스터라제의 정제

Step	총 용량 (mL)	총 단백질양 (mg)	총 활성 (units)	특이적활성 (units/mg)	수율 (%)	정제도
조효소액	88.9	742.4	96626.5	130.2	100	1
(NH₄)₂SO₄	23.2	336.3	58957.5	175.3	61.0	1.4
DEAE	21	66.7	51250.4	768.8	53.0	5.9
G-200	9.2	19.7	31001.7	1577.3	32.1	12.1
Q-1	6	4.4	9042.7	2066.2	9.4	15.9

2.7. 정제된 재조합 시나모일 에스터라제 활성에 대한 pH의 영향

효소작용의 최적 pH를 알기 위하여 시나모일 에스터라제 활성의 측정에 세가지 완충액을 사용하였는 바 pH 3에서 6은 citrate 완충액, pH 6에서 8은 phosphate 완충액, pH 8에서 10까지는 Tris-HCl 완충액을 사용하였다. pH에 대한 효소의 안정성 평가는 4^oC로 냉각된 각 pH의 완충액 중에 효소를 하룻밤 (overnight) 동안 처리한 후 효소활성을 측정하는 방법을 사용하였다.

각각의 pH에 처리된 완충액을 사용하여 효소 0.1mg/μL를 10 mM 클로로제닉산를 기질로 하여 37℃ 온도에서 10분간 반응시킨 후 실시예 1의 표1과 동일한 조건으로 HPLC-ELSD 분석을 통해 측정함으로써 구한 상대적인 효소활성도로부터 찾아냈다.

재조합 시나모일 에스터라제 활성에 대한 pH에 따른 시나모일 에스터라제 활성 결과는 도 11과 같다. 최적 pH는 중성pH인 pH 7에서 가장 높았으며 pH 7.5 에서도 98% 이상의 상대활성을 나타내면서 pH 7.0에서와 유사한 활성을 보였다. 그러나 pH 5.0 이하의 조건에서는 33.7% 이하의 활성능을 보였고, 또한 pH 8.5 이상의 조건에서 21.6% 보였다. 따라서 재조합 시나모일 에스터라제는 pH 6.5∼pH 8.0 사이의 중성부근에서 최적의 활성을 나타내는 것으로 사료된다. 또한 시나모일 에스터라제의 효소반응의 pH에 대한 안정성을 살펴본 결과pH 6.0에서 pH 8.5 에서는 97% 이상의 상대활성을 보였으며, pH 5.0에서 pH 8.5 에서도 90% 이상의 상대활성을 보였다. 그러나 pH 4.0 이하의 조건에서는 84.6% 이하의 활성능을 보였고 특히 pH 4.0에서 84.6%, pH3.0에서는 17.1%의 가수분해능을 나타냈다. 또한 pH 9.0에서 87.7%, pH 10에서는 80.6%의 활성을 보였다 (도11 B).

2.8. 재조합 시나모일 에스터라제 활성에 대한 온도의 영향

효소작용의 최적 온도는 최적pH인 pH 7.0의 50mM phosphate 완충액을 사용하여 효소 0.1mg/μL를 10mM 클로로제닉산을 기질로 하여 각각의 반응액의 온도 (25, 30, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80^oC)에서 10분간 반응시킨 후 실시예 1의 표1과 동일한 조건으로 HPLC-ELSD 분석을 통해 측정하여 구한 상대적인 효소활성도로부터 찾아냈다. 또한 시나모일 에스터라제의 온도에 대한 안정성을 평가하기 위하여 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70^oC의 각각의 온도에서 시나모일 에스터라제 효소를 각각 30분 동안 방치한 후, 처리된 효소 0.1mg/μL를 기질인 10mM 클로로제닉산을 함유하는50mM PBS 완충액 (pH 7.0) 최적온도인 65^oC에서 10분간 반응시킨 후 실시예 1의 표1과 동일한 조건으로 HPLC-ELSD 분석을 통해 측정하였다.

재조합 시나모일 에스터라제 최적온도를 조사한 결과는 도 12 와 같이, 이 효소의 최적 작용 온도는 65^oC인 것으로 판단 된다. 또한 본 연구에서 획득한 시나모일 에스터라제 효소의 온도에 대한 안정성을 평가하기 위하여 25, 30, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70^oC의 온도에서 30분 동안 방치 한 후 효소의 최적 pH (7.0)과 최적온도 (65^oC)에서 효소의 활성을 측정하여 본 결과 50^oC에서 94.7%, 55^oC에서도 86.5% 이상의 상대활성을 나타내었으며, 60^oC에서도 44.2%, 65^oC에서 17.2%의 상대활성을 보이면서 비교적 열 안정성이 뛰어남을 알 수 있었다 (도 12 B).

2.9. 시나모일 에스터라제를 활용한 발효 두유 제품에의 적용 가능성 검토

본 연구에서 획득된 시나모일 에스터라제 효소의 두유제품에의 적용가능성으로 확인하기 위하여 재조합된 시나모일 에스터라제 효소를 이용하여 전환활성을 검토하였다. 우선 검은콩 두유속에 클로로제닉산의 함유 여부를 알아보기 위하여 검은콩 외피에 붙어 있는 이물질을 깨끗이 세정 한 뒤, 검은콩은 동결건조 하였다. 동결건조 후 분쇄한 검은콩 분말 5 g에 100 mL의 증류수를 넣고 잘 섞어준 후 50℃에서 3시간 동안 항온수조에서 열 추출한 후 원심분리 (10,000 rpm, 15 min, 4℃)를 통해 상층액을 분리하였다. 두유 상층액을 HPLC 분석한 결과 검은콩 분말 1 mg당 약 2 mM의 클로로제닉산이 함유되어있음을 확인할 수 있었다 (도 13A). 또한 이를 기질로하여 조효소액 50 μg/mL를 1 mL의 두유 상층액을 기질로 하여 37 ℃ 온도에서 30분간 반응한 후 HPLC-ELSD 분석을 통해 시나모일 에스터라제의 효소반응을 실시하였다. 이때 조효소액 대신 멸균수를 첨가하여 동일한 조건으로 측정한 것을 대조군으로 하였다.

결과적으로, 두유를 기질로하여 시나모일 에스터라제의 효소반응을 실시한 결과 검은콩 두유속에 존재하는 클로로제닉산의 대부분이 카페익산로 전환되었음을 확인할 수 있었다 (도 13B). 즉, 본 연구로부터의 시나모일 에스터라제는 자연계에 존재하는 식물체 및 식품에 포함되어 있는 클로로제닉산를 카페익산로 전화시키는 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 향후 본 유전자가 함유된 유산균을 이용한 발효대두유의 제조가능성을 확인하였다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel Cinnamoyl esterase from Lactobacillus helveticus <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEhel-C <400> 1 ttaaaacgtt gcaggtttta aaaattgcgc 30 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEhel-N <400> 2 atgtttatgt cccgcattac g 21 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cinnamoyl esterase amino acid squence <400> 3 Met Ser Arg Ile Thr Ile Glu Arg Asp Gly Leu Thr Leu Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Glu Glu Pro Phe Gly Glu Ile Tyr Asp Met Ala Ile Ile Met His 20 25 30 Gly Phe Thr Ala Asn Arg Asn Thr Asp Leu Leu Arg Glu Ile Ala Asp 35 40 45 Asp Leu Arg Asp Glu Asn Val Ala Ser Val Arg Phe Asp Phe Asn Gly 50 55 60 His Gly Glu Ser Asp Gly Lys Phe Glu Asp Met Thr Val Cys Asn Glu 65 70 75 80 Ile Ala Asp Gly Lys Ala Ile Leu Asp Tyr Val His Thr Asp Pro His 85 90 95 Val Arg Asp Ile Phe Leu Val Gly His Ser Glu Gly Gly Val Val Ala 100 105 110 Ser Met Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Asp Val Val Lys Lys Val Val Leu 115 120 125 Leu Ala Pro Ala Ala Glu Leu Lys Asp Asp Ala Leu Arg Gly Asn Thr 130 135 140 Glu Gly Ala Thr Tyr Asp Pro Asn His Ile Pro Asp Val Val Pro Leu 145 150 155 160 Val Gly Asn Lys Leu Gly Met Lys Val Gly Gly Phe Tyr Leu Arg Thr 165 170 175 Ala Glu Val Leu Pro Ile Tyr Glu Ile Ser Glu Arg Phe Thr Arg Pro 180 185 190 Val Ser Val Ile Ala Gly Thr Asn Asp Glu Val Val Asp Pro Lys Tyr 195 200 205 Ala Lys Lys Tyr Asp Glu Val Tyr Glu Asn Ser Glu Leu His Met Ile 210 215 220 Pro Asn Ala Asp His Arg Phe Ser Gly Gly Tyr Lys Asp Met Ala Ala 225 230 235 240 Asp Leu Thr Ala Glu Phe Leu Lys Pro Ala Thr Phe 245 250 <210> 4 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cinnamoyl esterase nucleotide sequence <400> 4 atgtcccgca ttacgattga aagagacggt ttaaccctag taggtgaccg tgaagaacca 60 tttggtgaaa tctatgacat ggcaattatc atgcatggtt tcactgctaa tagaaataca 120 gatttattaa gacaaattgc tgatgattta cgcgatgaaa atgttgccag tgttcgtttt 180 gattttaatg ggcatggcga aagcgacggt aaatttgaag acatgactgt ctgcaatgag 240 atcgccgatg gtaaagcaat tttagactat gtacatactg atccacacgt tcgagacatc 300 ttcttagtgg gacattctca aggtggcgta gtggcatcaa tgcttgcagg tctttatcct 360 gacgttgtta aaaaagttgt acttttagct cctgctgctc aattaaaaga cgacgcatta 420 agaggcaata ctcagggcgc aacttatgat ccaaatcata ttcctgatgt cgtaccactc 480 gtgggcaata aattagggat gaaggttggt ggcttttatt taagaaccgc acaagtttta 540 ccaatttatg aaatatcaca acgtttcact agaccagttt ctgtaatcgc cggtactaat 600 gaccaagttg ttgatccaaa atacgccaag aaatacgatg aagtttacga aaacagtgaa 660 ctgcatatga tcccaaatgc tgatcataga ttcagtggtg ggtacaaaga catggcagcc 720 gatttaactg cgcaattttt aaaacctgca acgttttaa 759 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M13F <400> 5 gttttcccag tcatgac 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M13R <400> 6 caggaaacag ctatgac 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter <400> 7 taatacgact cactataggg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 terminator <400> 8 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEhelBamN <400> 9 aaaaaggatc catgtttatg tcccgcatta cg 32 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEhelHindC <400> 10 aaaaaaagct tttaaaacgt tgcaggtttt aaaaattgc 39

Claims

서열번호3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) 유래 시나모일 에스터라제 (Cinnamoly esterase).
제1항에 있어서, 상기 시나모일 에스터라제는 서열번호4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는 시나모일 에스터라제.
서열번호4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제3항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
(1) 제4항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
(2) 상기 (1)단계의 배양된 형질전환체 또는 배양액으로부터 재조합 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드의 정제방법.
제1항 또는 제2항의 시나모일 에스터라제와 클로로제닉산을 반응시키는 단계를 포함하는, 카페익산을 제조하는 방법.