KR20130055478A - 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 키트, 및 상기 프라이머 세트를 사용하여 녹조류에 속하는 미세조류를 검출하는 방법과 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용함으로써 분자유전학적 동정에서 발생하는 오류를 현격히 제거하여 최적화된 분자유전학적 미세조류 동정 기법을 확립할 수 있으며, 미세조류의 분리 및 동정에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

녹조류에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트{Primer sets for detecting microalgae belonging to Chlorophyta}
본 발명은 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 키트, 및 상기 프라이머 세트를 사용하여 녹조류에 속하는 미세조류를 검출하는 방법과 동정하는 방법에 관한 것이다.
석유자원의 과다 사용에 의한 환경오염이 심각해지고 자원의 고갈 가능성이 제기됨에 따라 바이오디젤에 대한 관심이 높아지고 있다. 바이오디젤은 2010년 현재 경유에 2% 포함되어 공급되고 있으며, 대부분 대두유나 팜유로부터 생산되고 있다. 그러나, 바이오디젤의 원료인 대두유나 팜유는 현재 수입에 의존하고 있는 실정이며 식량과 연계된 자원으로 국제적인 환경변화에 크게 영향을 받아 가격이 높고, 불안정하다는 문제점이 존재한다.
이에 대한 대응방안으로 식량자원이 아닌 비식용작물을 이용하여 바이오디젤을 생산하려는 시도와 저가의 폐유지를 이용하여 바이오디젤을 생산하려는 시도가 전 세계적으로 이루어지고 있다. 이러한 시점에서 단위 면적당 오일 생산량이 육상식물에 비해 매우 우수한 미세조류에 기반한 바이오디젤 생산기술에 대한 관심이 높아지고 있다. 미세조류의 단위면적당 바이오디젤 생산(oil 함량이 30%인 경우)은 약 58,700 L/ha로 대두의 446 L/ha에 비해 130배에 달하는 것으로 알려져 있다.
미세조류로부터 바이오디젤 생산의 주요 공정은 ① 미세조류 탐색 및 기능강화(균주 개량), ② 미세조류의 고밀도 대량배양, ③ 미세조류의 효율적 수확, ④ 미세조류 바이오매스로부터 유용물질 및 바이오연료 생산으로 구분해 볼 수 있다. 즉, 미세조류로부터 바이오디젤을 효율적으로 경제적으로 생산하기 위해서는 광합성능이 우수하고, 지속적인 배양이 가능하며, 바이오디젤 전환용 지질함량이 높은 조류종의 탐색이 무엇보다 중요하다. 현재 전 세계적으로 1,600여 종만이 Culture Collection에 의해 유지, 보존되고 있는 실정이다. 따라서, 더 많은 조류자원의 확보 및 이들을 대상으로 우량 미세조류 주의 선별을 위한 광범위한 탐색 작업이 필요하다.
이러한 미세조류의 동정은 최근까지 생리적,형태적 분석에 의해 동정이 진행되어왔고, 최근에 들어서야 유전자적 동정방법이 시도되고 있는 실정이다. 그러나, 유전자적 분석에 의해 동정하는 방법에 필수적인 중합효소연쇄반응(PCR)을 위한 특이적 프라이머(specific primer)의 종류가 미비하고, 기존의 프라이머는 변별력이 부족하여 명확하게 동정할 수 없는 문제가 있었다.
또한, 한국의 하천 호수에는 많은 미세조류가 존재하고 있으나, 그 미세조류들의 연구가 미비하며 분리 및 동정도 매우 제한적으로 이루어져 왔다. 한국의 기후와 수자원에 최적화된 한국형 미세조류 바이오에너지 생산을 위해서는 한국 토착 미세조류 자원의 활용이 필수이며, 미세조류의 바이오에너지 생산 산업화를 위해 빠르게 성장하고, 지질을 많이 포함하며, 광범위한 환경 적응력을 갖는 우량종 선발이 필수이며, 이 자원을 보존하기 위해서 신속하게 분리된 미세조류를 분리하고 분리 미생물을 동정하여 자원을 확보하는 것이 시급하다고 하겠다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 녹조류에 속하는 미세조류를 정확하게 동정할 수 있는 유전자적 동정기법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 경우, 녹조류에 속하는 미세조류를 특이적으로 검출할 수 있으며, 생성된 PCR 증폭 산물간의 변별력이 높아 정확한 미세조류의 동정이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응을 수행하여 녹조류에 속하는 미세조류를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응을 수행하여 녹조류에 속하는 미세조류를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로서, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "미세조류"란 단일세포의 광합성 생물로 3 ~ 30 μm의 크기에 담수나 해수에서 서식하는 단세포 생물을 의미한다. 미세조류는 이산화탄소를 흡수하고 산소를 배출하며, 오일 및 유용물질을 함유하고 있으며, 육상식물에 비해 성장률이 매우 빠르고, 대량으로 고농도 배양이 가능하며, 극한 환경에서도 성장이 가능하다는 장점을 가진다. 또한, 미세조류는 사용 가능한 오일 성분이 바이오매스의 30~70%에 달하므로, 기존 작물에 비해 높은 연료 생산성을 나타내는 이점이 있어 바이오디젤의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)" 란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 목적상 프라이머는, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류의 18S rDNA를 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통하여 녹조류에 속하는 미세조류를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 (1), 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 (2), 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 (3), 또는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 (4)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트는 클로렐라 속(Chlorella spp.), 세네데스무스 속(Scenedesmus spp.), 보트리오코커스 속(Botryococcus spp.) 및 클라미도모나스 속(Chlamydomonas spp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 미세조류 검출용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 파이레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 세네데스무스 옵투수스(Scenedesmus obtusus), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트리오코커스 칼카레우스(Botryococcus calcareus), 보트리오코커스 프로투벌란스(Botryococcus protuberans) 및 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)로 이루어진 군에서 선택되는 미세조류 검출용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 일 구현예에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 및 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)로 이루어진 군에서 선택되는 미세조류 검출용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 및 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)가 혼합된 미세조류 시료를 대상으로 상기 프라이머 세트로 PCR을 수행한 후, 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 시료에 포함된 상기 미세조류가 명확이 검출되었음을 확인할 수 있었다(도 2). 나아가, 상기 PCR 증폭 산물의 염기서열을 분석한 후 NCBI Blast를 통하여 실험에 사용한 상기 미세조류로 정확하게 동정되었음을 확인할 수 있었다(표 3).
이러한 결과는, 기존의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 증폭 산물간의 증폭구간의 유사도가 높아 동정상 오류를 범할 수 있는 문제가 발생하였으나, 본 발명의 프라이머 세트는 증폭 산물간의 유사도가 낮아 동정상 오류를 범할 가능성이 현저히 낮으며, 이에 따라 정확한 미세조류의 동정이 가능함을 나타낸다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 (a) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), (b) DNA 중합효소, 및 (c) 완충용액(buffer)을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 미세조류가 혼합된 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 지놈 DNA를 주형으로 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 행하는 단계; 및 (c) 상기 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (b)에서 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출 방법을 제공한다.
또한, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 미세조류가 혼합된 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 지놈 DNA를 주형으로 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 행하여 증폭 산물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (b)에서 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 동정 방법을 제공한다.
이하에서 본 발명의 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류를 검출하는 방법 및 동정하는 방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a)에서는 미세조류가 혼합된 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출한다. 지놈 DNA의 추출 또는 분리 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대 상업적으로 판매되는 시약, 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, G-spin plant DNA extraction ki를 사용하여 검출 또는 동정하고자 하는 미세조류로부터 지놈 DNA를 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 미세조류가 혼합된 시료는 하천, 호수, 해양에서 채취한 시료일 수 있다.
단계 (b)에서는 상기 추출된 지놈 DNA를 주형으로 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한다.
본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)" 은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 이용하여 원하는 부분을 증폭하는, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다.
PCR은 기본적으로 변성, 결합, 연장의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR의 제1단계는 주형 DNA를 단일쇄로 변성시킨다(변성단계). 제2단계는 목적하는 영역을 사이에 두는 두 종류의 단일쇄 DNA에 결합시킨다(결합단계). 제3단계는 프라이머로부터 고열에 내성인 DNA 중합효소에 의해 DNA를 합성하고 이상의 사이클을 적절한 횟수(예컨대, 25 내지 30회)로 반복한다.
다양한 DNA 중합효소가 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
상기 단계 (c)에서는 상기 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인한다. 또한, 상기 단계 (c)에서는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물의 염기서열을 분석한다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 이용하여 증폭된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열의 산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 산물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 녹조류에 속하는 미세조류를 검출할 수 있다.
녹조류에 속하는 미세조류의 동정은, 상기 증폭 산물의 염기서열을 분석함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의하여 생산된 증폭 산물의 염기서열을 분석한 후, 분석된 염기서열을 공지된 미세조류 염기서열 데이터베이스(예컨대, NCBI)의 서열과 비교함으로써, 미세조류의 종을 정확히 동정할 수 있다. 특히, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 생성된 각각의 PCR 증폭 산물은, 증폭된 염기서열 구간의 변별력이 높아 상이한 미세조류 종을 동일한 종으로 동정하는 등의 미세조류 동정상에 발생할 수 있는 오류를 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 기존에 녹조류 동정에 사용하는 452 bp의 Cloro 프라이머의 Divergence는 1.8 ~ 6.0으로 그 차이가 크지 않아 분자유전학적 미세조류 동정에서 빈번하게 교차 동정이 되는 사례가 발생하였으나, 본 발명의 프라이머 세트의 경우에는 Divergence의 값이 5.7 ~ 12.6으로 증가함으로써 교차 동정의 사례가 현격하게 감소하였음을 확인하였다(표 4 및 5).
본 발명의 녹조류에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용함으로써 분자유전학적 동정에서 발생하는 오류를 현격히 제거하여 최적화된 분자유전학적 미세조류 동정 기법을 확립할 수 있으며, 미세조류의 분리 및 동정에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 NCBI에서 획득한 다양한 녹조류(Chlorophyta)를 DNAstar 프로그램을 이용하여 염기서열을 배열한 그림을 나타낸다.
도 2는 각각의 프라이머 세트로 녹조류에 속한 미세조류의 DNA를 증폭한 아가로스 겔 사진을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트로 제주 서부 저수지에서 채취한 미세조류의 DNA를 증폭한 아가로스 겔 사진을 나타낸다.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 프라이머의 제작
녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류를 정확하게 동정할 수 있는 프라이머를 탐색하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 녹조류에 속하는 미세조류의 염기서열을 NCBI를 통해 확보한 후 DNAstar MegAlign(DNAstar Inc.)를 사용하여 총 10개의 후보 프라이머를 제작하였다(표 1).
Figure pat00001
실시예 2 : DNA 추출
실험을 위하여, 녹조류에 속하는 미세조류로 클로렐라 불가리스(Chlorella vugaris; KCTC ag10032), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus; KCTC 20831), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii; UTEX 572), 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii; UTEX 2244)를 사용하였으며, 각 미세조류는 G-spin plant DNA extraction kit(intron, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
실시예 3 : PCR 을 이용한 DNA 의 증폭
상기 실시예 2에서 추출된 DNA는 표 1에 명기된 프라이머를 이용하여 표 2의 조합으로 PCR를 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다. PCR 반응물은 아가로스 겔에서 확인하였다(도 2).
Figure pat00002
[ PCR 조건]
반응 혼합물의 구성:
DNA 1 ㎕
12.5 pmol primer F 1 ㎕
12.5 pmol primer R 1 ㎕
10 mM dNTP 혼합물 1 ㎕
Intron I-maxII pre mix 10 ㎕
dH2O 7 ㎕
[반응조건(초기 변성 및 최종 연장과정을 제외하고 30회 반복)]
초기 변성 과정 - 95 ℃, 3분
변성 과정 - 94 ℃, 1분
어닐링 과정 - 55 ℃, 1분
중합 과정 - 72 ℃, 1분
최종 연장 과정 - 72 ℃, 10분
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 1, 2, 3, 4, 10, 12 및 13번 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통하여, 실험에 사용한 상기 미세조류를 명확히 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 4 : 동정결과와 분석
상기 실시예 3에서 아가로스 겔을 통해 확인된 PCR 산물 가운데, 1 내지 4번프라이머 세트를 대상으로 염기서열 분석을 의뢰하였고(솔젠트), 염기서열은 NCBI Blast를 통하여 확인하였다. 그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 분양 시 표기된 미세조류로 정확히 동정되었으며, 매우 높은 동질성을 보였다.
Figure pat00003
실시예 5 : 유사도 분석을 통한 변별력 분석
MegAlign(DNAstar Inc.)를 통해 염기서열 간의 유사도 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 프라이머는 기존에 녹조류 미세조류 동정에 사용되는 Chloro F, Chloro R과 본 발명의 프라이머 중 염기서열이 1000 bp 정도인 4번 프라이머 세트를 대상으로 변별력을 조사하여, 그 결과를 표 4 및 5에 나타내었다.
Figure pat00004
Figure pat00005
표 4 및 5에서 Percent Identity는 염기서열간의 동일한 정도, Divergence는 염기서열간의 차이를 나타낸다. Divergence가 클수록 염기서열간의 차이가 크다는 것을 의미하며, 이것은 각각 증폭된 염기서열 구간의 변별력이 높다는 것을 의미 한다. 기존에 녹조류 동정에 사용하는 452 bp의 Cloro 프라이머의 Divergence는 1.8 ~ 6.0으로 그 차이가 크지 않아 분자유전학적 미세조류 동정에서 빈번하게 교차 동정이 되는 사례가 발생하였다. 그러나, 본 발명의 프라이머 가운데 4번 조합의 경우 그 Divergence의 값이 5.7 ~ 12.6으로 증가함으로써 교차 동정의 사례가 현격하게 감소하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 프라이머 세트로 녹조류에 속하는 미세조류를 오류 없이 정확하게 동정할 수 있음을 의미한다.
실시예 6 : 현장 시료에서 채취한 미세조류의 분자유전학적 동정
제주 서부 저수지에서 채취한 미세조류는 형태적으로 보트리오코커스 종(Botryococcus sp.)과 유사하였다. 이 분리된 미세조류를 분자유전학적으로 동정하기 위해 본 발명의 프라이머 세트 4(서열번호 1 및 9번)를 이용하여 PCR 증폭을 수행한 후, 아가로스 겔에서 확인하여, 도 3에 나타내었다. 확인된 DNA 밴드는 염기서열 분석을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 보트리오코커스 종으로 99%의 높은 동일성을 보였다.
Figure pat00006
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Primer sets for detecting microalgae belonging to Chlorophyta <130> PA110881/KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch165F <400> 1 cgacttctgg aagggacgta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch350F <400> 2 cgaaccctaa ttctccgtca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch575F <400> 3 gcggtaattc cagctccaat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch595R <400> 4 attggagctg gaattaccgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch770F <400> 5 gttcaaagca ggcctacgct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch790R <400> 6 gagcgtaggc ctgctttgaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch850R <400> 7 cagaccaaca agataggcca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch1155F <400> 8 cctgcggctt aatttgactc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch1200R <400> 9 gagtcaaatt aagccgcagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ch1780R <400> 10 ctaggtggga gggtttaatg 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트로서, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 속(Chlorella spp.), 세네데스무스 속(Scenedesmus spp.), 보트리오코커스 속(Botryococcus spp.) 및 클라미도모나스 속(Chlamydomonas spp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 파이레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 세네데스무스 옵투수스(Scenedesmus obtusus), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트리오코커스 칼카레우스(Botryococcus calcareus), 보트리오코커스 프로투벌란스(Botryococcus protuberans) 및 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 프라이머 세트.
  4. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 키트.
  5. (a) 미세조류가 혼합된 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 지놈 DNA를 주형으로 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 행하는 단계; 및
    (c) 상기 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (b)에서 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출 방법.
  6. (a) 미세조류가 혼합된 시료로부터 지놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 지놈 DNA를 주형으로 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 검출용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 행하여 증폭 산물을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (b)에서 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3으로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류 동정 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160000039A (ko) * 2014-06-23 2016-01-04 한국해양과학기술원 대한민국 연안 미세조류인 아카쉬요 산구이니아의 종 판별 방법과 이에 따른아카쉬요 산구이니아의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트
KR20220029812A (ko) 2020-08-27 2022-03-10 재단법인차세대융합기술연구원 오스트레옵시스 속 미세조류 검출용 lamp 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트

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