KR20130036046A - 다발성 경화증 환자에서의 치료반응을 예측하는 방법 - Google Patents

다발성 경화증 환자에서의 치료반응을 예측하는 방법 Download PDF

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KR20130036046A
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리찰드 에이. 루딕
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Abstract

본 발명은 다발성 경화증 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β)의 치료효능을 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법 중에서 하나의 단계는 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 시료 채취 후에, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자 (IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량이 결정될 수 있다. 대조군과 비교하여 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및 또는 이의 변이체의 증가하거나 감소한 발현량은 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 대하여 저반응함을 나타낼 수 있다.

Description

다발성 경화증 환자에서의 치료반응을 예측하는 방법{METHOD FOR PREDICTING A THERAPY RESPONSE IN SUBJECTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS}
관련된 출원서
본 출원서는 2010년 6월 18일자에 제출된 미국임시특허출원 제61/356,265호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 미국임시특허출원서의 전체내용은 본 출원서에 참조로 병합되었다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 다발성 경화증(MS) 환자에서 치료반응을 예측하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상이하게 발현되는 유전자 표지(differentially expressed genetic markers)를 기반으로 하여 다발성 경화증(MS) 환자의 인터페론-베타(IFN-β) 치료반응을 예측하는 방법에 관한 것이다.
다발성 경화증(MS)은 중추 신경계의 염증성 질병이다. 유전체 전장 연관성 분석(Genome-wide association studies)에 의하여 다발성 경화증(MS)에 취약한 면역체계와 관련된 유전자가 확인되었으며, 이러한 유전자는 다발성 경화증(MS) 발병과 관련된 면역기작에서 작용한다. 타입 I 인터페론(interferon, IFN)의 증가된 생물학적 이용 가능성은 다양한 자각면역장애(autoimmune disorders)의 민감성 또는 심각성의 원인임을 보여준다. 타입 I 인터페론이 조절된 유전자(IFN-regulated genes, IRGs)의 발현증가는 치료 전 다발성 경화증(MS) 환자의 약 50%에서 확인되었으며, 이로 인하여 과도한 선천성 면역을 가진 환자군이 있음을 알 수 있다.
타입 I 및 타입 II 인터페론(IFNs)은 중복되는 인터페론이 조절된 유전자(IRGs) 세트를 조절한다. 타입 I 인터페론(IFN)은 선천성 면역의 주요 조절자인 반면, 타입 II 인터페론(IFN)은 선천성 면역 및 후천성 면역에 관여한다. 다발성 경화증(MS) 치료용 약제로서 인터페론-감마(interferon-gamma, IFN-γ)의 임상실험은 성공적이지 못했지만, 타입 I 인터페론(IFN)의 임상실험은 진행 중이며, 몇 가지의 재조합 인터페론-베타(interferon-beta, IFN-β) 제품은 다발성 경화증(MS) 치료용으로 승인되었다. 임상실험에서, 인터페론-베타(IFN-β)는 30%까지 병의 재발률을 감소시켰으며, 자기공명이미지에 의해 관찰되는 뇌손상을 억제하였다. 그러나, 임상반응은 피험자에 따라 다양했으며, 이러한 반응 기작은 아직 밝혀지지 않은 상태이다.
임상 3단계 시험 중 하나의 사후 (post-hoc) 데이터 분석에서, 인터페론-베타(IFN-β)를 투약 받은 피험자의 약 20%는 저반응군(poor responders, PR)인 것으로 확인되었다. 저반응 상태는 약리적(pharmacologic) (즉, IFN-β 중화 항체 생산과 관련됨) 또는 약물유전체적(pharmacogenomic) (즉, IFN-β 수용체 또는 신호전달관련인자의 유전적 변이와 관련됨)인 것으로 최근에 분류되었다. 이러한 피험자는 공통적으로 낮은 인터페론-베타(IFN-β) 생물학적 이용 가능성을 가진다. 이처럼 반응 기작이 밝혀졌지만, 이는 소수의 저반응군(PR)에 적용된다. 가장 큰 분류군인 세 번째의 분류군에서, 인터페론-베타(IFN-β)에 대한 저반응군(PR)은 인터페론-베타(IFN-β) 반응 특성과 관련이 있을 수 있으며, 이는 일부 다발성 경화증(MS) 발병 환자에게 적용될 수 있다. 이러한 추측은 마이크로어레이를 기반으로 한 횡단분석적인 발현분석(Microarray-based cross-sectional expression analyses) 및 개별 후보 유전자 연구에 의해 뒷받침된다.
그러나, 모든 임상실험 및 방사선 실험상의 변이는 발병을 예측하는 데 있어서, 특히 초기 단계의 다발성 경화증(MS)을 예측하는 데 있어서 제약이 되었다. 발병을 예측하는데 있어서 이러한 불명확성은 적극적인 치료가 필요한 환자가 치료를 받을 수 없다는 것을 의미하고, 역으로 불필요한 치료로 인하여 부작용에 노출될 수 있음을 의미한다.
본 발명은 다발성 경화증(MS) 환자에서 치료반응을 예측하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상이하게 발현되는 유전자 표지를 기반으로 하여 다발성 경화증(MS) 환자에서 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 대한 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 구체예로, 다발성 경화증(MS) 환자에서 인터페론-베타(IFN-β) 치료효과를 결정짓는 방법이 제공된다. 이러한 방법 중에서 하나의 단계는 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 것을 포함한다. 생물학적 시료를 채취한 후에, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체를 결정할 수 있다. 대조군과 비교하여 증가하거나 감소한 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체는 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에서 저반응할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 다른 구체예로, 다발성 경화증(MS) 치료에 사용될 수 있는 시약을 스크린하는 방법이 제공된다. 이러한 방법 중에서 하나의 단계는 인터페론-베타(IFN-β) 치료에서 저반응성을 보이는 다발성 경화증(MS) 환자 유래의 말초혈액단핵구세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 그런 후, 약제는 말초혈액단핵구세포 (PBMC)로 투여될 수 있다. 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체의 발현량은 하나 이상의 말초혈액단핵구세포 (PBMC)에서 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 다발성 경화증(MS) 환자 치료방법이 제공된다. 이러한 방법 중 한 단계는 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 시료를 채취한 후에, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체의 발현량이 결정될 수 있다. 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체의 하나 이상의 발현이 대조군과 비교하여 증가하거나 감소한다면, 피험자는 인터페론-베타(IFN-β) 외에 적어도 하나의 시약을 치료 효과를 보이는 용량으로 투여받을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 다발성 경화증(MS) 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법 중 하나의 단계는 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 것을 포함할 수 있다. 생물학적 시료를 채취한 후에, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체의 발현량이 결정될 수 있다. 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 또는 이의 변이체의 발현이 대조군보다 증가하거나 감소한다면, 환자에게 치료 효과를 가지는 용량으로 나탈리주마브(natalizumab)를 투약할 수 있다.
본 발명의 전술된 특징 또는 기타 특징은 첨부된 도면과 하기의 설명에 의해 당업자에게 더욱 명확해질 것이다.
도 1은 본 발명의 한 구체예에 따른 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β) 치료 효능을 결정하는 방법을 설명하는 순서도이다.
도 2는 본 발명의 다른 구체예에 따른 다발성 경화증(MS)를 치료하는데 사용될 수 있는 제제를 스크린하는 방법을 설명하는 순서도이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 구체예에 따른 다발성 경화증(MS) 피험자의 치료방법을 설명하는 순서도이다.
도 4는 실시간의 정량적인 PCR(real-time quantitative PCR)와 마크로어레이 (macroarray)에 의해 계산된 OASL에 대한 유도비 (induction ratios, IRs)간의 상관성을 보여주는 산포도이다(X 및 Y 축에 대하여 log2 스케일을 나타냄).
도 5는 인터페론-베타(IFN-β)의 첫 번째 투약에서 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 수를 보여주는 좌표이다. 막대는 초기 인터페론-베타(IFN-β) 투여에 있는 개개인의 피험자를 나타낸다. 막대 높이는 유도비(IRs) ≥ 2.0의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 수를 보여준다. 저반응을 보이는 피험자는 음영으로 표시하였다.
도6은 기준선(x-축) 과 6-개월(y-축)에서 인터페론-베타(IFN-β) 분자 반응에 대한 85명의 피험자에 대한 산포도이다. 개개인의 피험자에 대하여, 166개의 각각의 유전자에 대한 IR을 두 번의 시간점에서 나타냈다. 두 번의 시간점 간의 분자반응의 다양성은 각각의 좌표에 있는 대각선에서 벗어난 정도로 표시하였다.
도 7은 24개월에 걸쳐 일정한 반응을 보이는 10명의 피험자에 대한 산포도를 보여준다. 2년간 일정한 반응을 보이는지를 시험하고자 기준선, 6 개월 및 24개월에서 마크로어레이 데이터가 있는 10명의 다발성 경화증(MS) 피험자(5명은 고반응군이고 5명은 저반응군임)를 무작위적으로 선택하였다. 첫 3개의 세로단은 저반응군 피험자에 대한 결과이고 뒤쪽 3개의 세로단은 우수하게 치료반응을 보이는 피험자에 대한 결과이다. 첫 번째 세로단과 네 번째 세로단은 기준선과 6개월에서의 반응을 비교한다. 두 번째 세로단과 다섯 번째 세로단은 6 개월과 24 개월에서의 반응을 비교한다. 세 번째 세로단과 여섯 번째 세로단은 기준선과 24 개월에서의 반응을 비교한다.
도 8a-b는 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투약(도 8a) 및 6개월의 인터페론-베타(IFN-β) 투약(도 8b)에서 저반응을 보이는 피험자에서 과도한 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 반응을 보이는 히스토그램을 도시한다(히스토그램은 우수한 반응군에 속하는 모든 피험자와 저반응군에 속하는 모든 피험자에서의 모든 유전자에 대한 IR을 나타낸다).
도 9는 기준선 T2 손상부분(lesion volume, LV), 기준선에 있는 최고의 25 인터페론이 조절된 유전자(IRGs), 및 기준선 T2 손상부분+최고의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)에 대한 ROC 곡선을 보여준다. ROC 곡선은 6 개월 후에 측정되는 저반응군을 예측하고 기준선 T2 손상부분을 사용하여 예측을 어느 정도 할 수 있는지를 비교하기 위하여 기준선에서 측정된 25 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 정도를 시험한다.
본 출원서에서 사용하는 모든 과학용어와 기술용어는 별도로 기재하지 않는 한 당분야에서 일반적으로 사용되는 의미를 가진다. 본 출원서에서 기재된 정의는 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 돕기 위한 것으로 본 발명의 범위를 이로 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “대조군” 또는 “대조군 시료”는 비교군으로 사용되는 모든 시험 시료 또는 분리된 시료를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “mRNA”는 유전자 전사체를 의미할 수 있다. 전사체는 번역 및/또는 다양한 단계의 전사과정(예, 접합(splicing) 및 분해)에 대하여 준비된 성숙된 mRNA와 같은 RNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “핵산” 또는 “핵산분자”는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 및 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 사슬을 언급할 수 있으며, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 동일한 기능을 하는 자연의 뉴클레오티드의 알려진 유사물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “폴리펩티드” 또는 “단백질”은 하나 이상의 아미노산 기본 단위를 포함하는 분자를 언급할 수 있다. 폴리펩티드는 전체 단백질일 수도 있으며, 올리고 펩티드와 같은 단백질 단편일 수 있다. 또한, 올리고 펩티드는 메틸화 또는 아세틸화와 같은 아미노산 기본단위에서의 변형을 포함할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브”는 하나 이상의 화학적 결합에 의하여 항상 상보적인 염기쌍으로 상보적인 서열의 핵산을 타겟하기 위해 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들어, 올리고뉴클로에오티드 프로브는 원래의 염기(즉, A, G, C 또는 T) 또는 개조된 염기(즉, 7-데아자구아노신(7-deazaguanosine), 이노신(inosine), 등)를 포함할 수 있다. 게다가, 올리고뉴클레오티드 프로브 내의 염기는 혼성화를 방해하지 않는다면 인산디에스테르결합 외에 연관(linkage)에 의해 결합될 수 있다.
본 명세서의 유전자의 전사 정도를 정량화하는 내용에서 사용된 용어 “정량화”는 절대적인 또는 상대적인 양을 의미할 수 있다. 절대적인 양은 하나 이상의 목적하는 핵산(예, 대조군 핵산)을 알려진 농도로 주입하고 알려진 목적하는 핵산과 알려지지 않은 핵산의 혼성화 정도를 비교함으로써(예, 표준곡선을 만들어서) 알 수 있다. 반면에, 상대적인 양은 혼성화 정도로 인하여 전사 정도에서의 변화를 정량화하기 위하여 두 가지 이상의 유전자 또는 두 가지 이상의 처리군에서 혼성화 정도를 비교함으로써 알 수 있다.
본 명세서에서 유전자와 관련하여 사용되는 용어 “상대적인 유전자 발현” 또는 “상대적인 발현”은 다른 세포 또는 조직에서의 동일한 유전자 발현 산물로 항상 mRNA의 상대적인 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “피험자(환자)”는 모든 동물을 포함하며 인간 및 인간을 제외한 동물(예, 설치류, 절지류, 곤충, 어류), 인간을 제외한 영장류, 양, 소, 반추동물, 토끼목, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 조류, 등)을 포함하고 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “생물학적 시료”는 피험자 또는 이의 일부로부터 채취되는 신체 시료를 언급한다. 예를 들어, 신체 시료는 “임상시험 시료” 즉, 피험자 유래의 시료를 포함할 수 있다. 이러한 시료는 세포 (예를 들어, 혈액, 소변, 혈장, 점액, 담즙, 췌장액, 상청액(supernatant fluid), 및 혈청); 조직 또는 침생검된(needle biopsy) 시료; 및 알려진 진단, 치료, 및/또는 결과 이력을 가진 기록 시료를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 신체 시료는 조직학적 연구 목적을 위한 동결된 시료 조각과 같은 조직 조각을 포함할 수도 있다. 또한, 용어 “생물학적 시료”는 신체 시료를 처리함으로써 확보되는 모든 물질을 포함할 수도 있다. 확보되는 물질은 시료로부터 추출된 생물학적 시료 유래의 세포(또는 이의 결과물), 단백질, 및/또는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 생물학적 시료의 처리 공정은 여과, 증류, 추출, 농축, 고정, 간섭인자의 비활성화, 시약 첨가, 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “인터페론이 조절된 유전자” 또는 “IRG”는 인터페론-베타(IFN-β)와 같은 적어도 하나의 인터페론에 노출되어서 대조군에 비하여 발현이 증가 또는 감소하는 모든 유전자 또는 이의 변이체를 언급할 수 있다. 인터페론이 조절된 유전자(IRG)의 예는 표 1에서 목록화된 것뿐만 아니라, 당업자가 알고 있는 그 외의 것들을 포함한다(참고, Samarajiwa, S.A. 등, Nucleic Acids Res. 37:D852-D857, 2009년 1월).
본 명세서에서 인터페론이 조절된 유전자(IRG)와 연관되어 사용되는 용어 “변이체”는 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 뉴클레오티드 서열 상에서의 모든 변이를 의미할 수 있으며 엑손, 인트론, 및 번역되지 않은 서열을 포함하는 코딩 영역 및 비-코딩 영역에서의 변이를 포함할 수 있다. 변이는 단 하나의 뉴클레오티드 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삭제, 및 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입을 포함할 수 있다. 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 변이체의 예는 당분야에 알려져 있다(참고로 예를 들면, Vosslamber, S. 등, “Interferon regulatory factor 5 gene variants and pharmacological and clinical outcome of Interferonβ therapy in multiple sclerosis”, Genes and Immunity, 2011년 4월 7일자에 온라인으로 공개됨; 및 Baranzini 등, Hum. Mol. Genet. 15:767, 2009년)
본 발명은 일반적으로 다발성 경화증(MS) 피험자에서 치료반응을 예측하는 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 상이하게 발현되는 유전자 표지를 기반으로 하여 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타 (IFN-β) 치료 반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 다발성 경화증(MS) 피험자군에서 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 발현이 질적(즉, 조절된 IRGs의 동일성) 및 양적(즉, 조절된 IRGs의 수 및 유도 또는 억제 정도) 차이가 있음을 발견한 것에 기반한다. 특히, 저반응군으로 분류된 다발성 경화증(MS) 피험자가 첫 번째 인터페론-베타(IFN-β) 투여 및 6개월째 인터페론-베타(IFN-β) 투여 후에 유의적으로 과도한 분자적 반응(즉, 증가하거나 감소된 유전자 발현)을 보임을 발견했으며, 이는 예측하지 못한 바이다. 이러한 발견을 기반으로 하여, 본 발명은 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β) 치료 효능을 결정하는 방법, 다발성 경화증(MS) 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 외의 다른 치료제로 처치되어야 하는지를 결정하는 방법, 다발성 경화증(MS)을 치료하는데 사용될 수 있는 약제를 스크린하는 방법, 및 다발성 경화증(MS) 피험자 치료방법을 제공한다.
다발성 경화증(MS) 발병에 대한 반응 기작의 제안은 후천성 면역에 초점이 맞춰져 있고, 특히 미엘린(myelin) 성분에 대한 직접적인 면역반응에 중점을 두고 있다. 상기 언급한 대로, 저반응군 상태로 예정된 인터페론-베타(IFN-β) 수용체는 이미 높은 수준의 질병 활성 및 질병 장애를 갖는다는 것이 예상치 못하게 확인되었다. 이론과 관계없이, 타입 I 인터페론(IFN)에 대한 증가된 반응은 다발성 경화증(MS) 피험자(즉, 저반응군) 일부에서 자가면역 발병을 유도하는 선천성 면역 과정을 수반한다는 것이 알려져 있다. 타입 I 인터페론(IFN) 경로 또는 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 발현 량의 간접적인 영향 중 어느 하나에 있어서, 저반응군에서 선천성 면역의 차이가 악화된 질병의 심각성을 결정한다.
도 1은 본 발명의 한 구체예에 따른 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β)의 치료 효능을 결정하는 방법(10)을 설명하는 순서도이다. 이 방법(10)은 다발성 경화증(MS) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계(단계 12); 생물학 시료로부터 적어도 하나의 핵산을 분리하는 단계(단계 14); 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그의 변이체의 발현량을 결정하는 단계(단계 16); 및 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 대하여 피험자가 저반응하는 경우, 측정된 유전자 발현량을 분석하는 단계(단계 18)를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 방법(10)은 생물학 시료를 채취하는 단계 전에 다발성 경화증(MS) 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)를 투여하는 단계(단계 20)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “다발성 경화증(multiple sclerosis)” 또는 “MS”는 뇌 및 척수의 측색돌기 주변의 지방 수초(fatty myelin sheath)가 탈수초(demyelination) 및 반흔(scarring)을 야기하는 손상을 입은 질병을 포함할 수 있다. 질병을 앓는 피험자의 질병에 따라 다발성 경화증(MS)은 다수의 유형으로 분류가 될 수 있다. 다발성 경화증(MS)의 유형으로는 양성 다발성 경화증(benign MS), 휴지 재발완화성 다발성 경화증(quiescent relapsing-remitting MS), 활성 재발완화성 다발성 경화증(active relapsing-remitting MS), 일차진행성 다발성 경화증(primary progressive MS) 및 이차진행성 다발성 경화증(secondary progressive MS)을 예로 들 수 있다. 재발완화성 다발성 경화증은 발병 사이에 완전 또는 부분 회복 및 어떠한 질병 경과가 없는 급성발병으로 명확히 정의할 수 있는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS)의 임상과정을 포함할 수 있다. 일차진행성 다발성 경화증은 병의 차도없이 최초의 진행 형태가 나타나는 다발성 경화증(MS)의 임상과정을 포함할 수 있다. 이차진행성 다발성 경화증은 최초에는 재발완화 형태이고, 그 후 가변적 속도로 진행이 이루어지고, 산발적 재발 및 경미한 차도가 있을 수 있는 다발성 경화증(MS)의 임상적 과정을 포함할 수 있다. 진행성 재발성 다발성 경화증은 진행형으로 시작되어 간간이 재발이 되는 다발성 경화증(MS)의 임상과정을 포함할 수 있다. 일반적으로, 병이 재발된 후에 즉시 현저한 회복이 있다. 그러나, 병이 재발되는 사이에 병의 진행이 점차적으로 악화될 수 있다.
도 1과 관련하여, 단계 12에서 적어도 하나의 생물학적 시료는 피험자로부터 채취할 수 있다. 용어 “생물학 시료(biological sample)”는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 피험자로부터 발생되는 모든 임상시험 시료를 포함할 수 있다. 생물학적 시료의 예로 말초체액(peripheral bodily fluids), 조직 또는 침생검된(needle biopsy) 시료; 및 알려진 진단, 치료, 및/또는 결과 이력을 가진 기록 시료가 있으며, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료는 또한 조직학적 연구 목적을 위한 동결된 시료 조각과 같은 조직 조각과 시료를 처리함으로써 유래되는 모든 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 예로서, 생물학적 시료는 다발성 경화증(MS) 피험자의 혈관에서 주사기 바늘을 사용하여 채취한 전혈 시료를 포함할 수 있다.
단계 14에서, 적어도 하나의 핵산이 생물학적 시료에서 분리될 수 있다. 핵산은 이미 알려져 있는 다수의 방법으로 생물학적 시료로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 하나의 기술로서, 유전자의 복제개수에서 변화가 확인되는 부분에서 DNA를 분리할 수 있다. 반대로, 유전자 발현량의 확인이 요구되는 부분에서 RNA(예를 들면, mRNA)를 분리할 수 있다. mRNA와 같은 핵산 분리 방법은 해당 기술분야에 널리 알려져 있다(예: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology의 챕터 3; Hybridization With Nucleic Acid Probes, 파트 I. Theory of Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. 1993년).
본 발명의 하나의 예에서, 상업적으로 이용가능한 PAXGENE RNA 혈액 추출 키트(PAXGENE RNA blood extraction kit, PREANALYTIX, 스위스)와 같은 키트를 사용하여 전혈 샘플로부터 RNA를 엑스 비보(ex vivo)로 분리할 수 있다. 요약하자면, 적어도 하나의 전혈 샘플은 다발성 경화증(MS) 피험자로부터 얻을 수 있고, 시험관(예를 들면, RNA분해효소-프리튜브(RNase-freetube)에 수집할 수 있다. 튜브에서 세포를 펠렛화하기 위하여 정화단계는 원심분리 단계와 함께 시작할 수 있다. 이 펠렛은 단백질 소화를 촉진하도록 최적화된 완충액(프로티나아제 K와 함께)에서 세척, 재부유, 및 배양될 수 있다. 추가적인 원심분리 단계는 세포 용해물를 균질화하고, 잔여 세포 잔해를 제거하기 위하여 수행될 수 있다. 그 다음, 병류(flow-through) 일부의 상청액이 신선한 마이크로원심 튜브(microcentrifuge tube)로 옮겨질 수 있다. 그 후, 결합상태를 조절하기 위하여 에탄올이 투입될 수 있고, 뒤이어 스핀컬럼(spin column)에 용해물의 도포가 이루어질 수 있다. 간단한 원심분리가 이루어지는 동안, RNA는 오염물질이 지나가도록 스핀컬럼(spin column)의 멤브레인에 선택적으로 결합할 수 있다. 잔여 오염물질이 몇몇의 효율적인 세척 단계에서 제거될 수 있다. 제1 및 제2 세척 단계 사이에서, 예를 들면, 극미량의 결합된 DNA를 제거하기 위해 멤브레인이 DNA 분해효소 I(DNase I)로 처리될 수 있다. 세척 단계 후, RNA는 용리(溶離, elution) 완충액에서 용리될 수 있고, 열변성될 수 있다. RNA의 질과 양은 아가로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 통해 추가적으로 시각화함으로써 측정(예를 들면, 분광학)할 수 있다.
단계 16에서, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체의 발현량은 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에 의해 확인할 수 있다. 본 발명의 하나의 예에서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체(예를 들면, 약 4개의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체)의 발현량은 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에 의해 확인할 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 표 3에 열거된 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체(예를 들면, 약 4개의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체)의 발현량은 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에 의해 확인할 수 있다. 유전자의 발현량(및 그에 따른 전사량(transcription level))을 측정하기 위하여, 유전자의 mRNA 전사물로 구성된 핵산 시료 또는 mRNA 전사물로부터 유래된 핵산을 제공하는 것이 바람직한 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 사용된 것처럼, mRNA 전사물로부터 유래한 핵산은 궁극적으로 주형(template)으로 사용되는 mRNA 전사물(또는 그 염기서열)을 합성하기 위한 핵산을 포함할 수 있다. 따라서 mRNA로부터 역전사된 cDNA, cDNA로부터 전사된 RNA, cDNA로부터 증폭된 DNA, 증폭된 DNA로부터 전사된 RNA 등이 mRNA 전사물로부터 유래될 수 있고, 이러한 유래된 불질의 확인은 시료에서 초기 전사물의 존재 및/또는 존재비로 알 수 있다.
유전자 발현량 및/또는 활성도를 확인하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 알려져 있다. RNA를 확인하기 위한 방법의 예시는 제한이 없고, 예를 들면, 노던 브롯 분석(Northern blot analysis), RT-PCR, RNA 인시튜 혼성화(RNA insitu hydridization)(예를 들면, 시료에 있는 RNA 분자를 혼성화하기 위한 DNA 또는 RNA 검출법의 사용), 인시튜 RT-PCR(insitu RT-PCR), 및 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이(oligonucleotide microarrays)(예를 들면, 시료로부터 기질에 부착된 올리고뉴클레오타이드까지 유도된 폴리뉴클레이티드 염기서열의 혼성화)를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 예에서, 마크로어레이(macroarray)는 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체의 발현량을 확인하기 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 하나의 기술로서, 마크로어레이는 분명하게 발현된 확인할 수 있는 핵산과 혼성화하는 다수의 실험 탐색자(test probe) 및 선택적으로, 하나 이상의 대조군 탐색자(control probe)를 포함할 수 있다. 시험 탐색자는 일정한 크기를 갖는 올리고핵산염(oligonucleotides)(약 5개 내지 50개의 뉴클레오티드(nucleotides))을 포함할 수 있고, 확인하고자 하는 발현된 유전자의 특정한 염기서열에 대해서 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 그러므로, 시험 탐색자는 목적하는 핵산에 대하여 분명하게 혼성화할 수 있다. 마크로어레이의 부분으로 포함될 수 있는 대조군 탐색자의 예시로 표준화 대조군(normalization controls), 발현량 대조군(expression level controls), 및 미스매치 대조군(mismatch controls)가 있다.
본 발명의 다른 예에서, 실시예 2의 마크로어레이는 표 1에 열거된 적어도 약 4개의 유전자의 발현량을 확인하는데 사용할 수 있다. 적어도 약 4개의 유전자(예를 들면, 4개의 유전자)의 발현량을 확인하는 것은 몇몇의 이유로 바람직할 것이다. 정량 실험(예를 들면, qPCR)을 하기 위하여, 예를 들면, 다중 어레이(multiplex array)에서 제한된 수의 유전자의 선택은 실질적 이유(예를 들면, 필요한 시약의 부피 및 수량 등)에서 유용할 것이다. 추가적으로, 적어도 약 4개의 유전자를 선택하는 것은 본 발명의 랜덤 포레스트 모델(random forest model)을 사용함으로써 식별력(예, ROC 커브의 아래면적)을 최적화 할 수 있다.
매크로배열을 구성하는 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 약 166개의 인간 cDNAs로 표현될 것이다. 요약하면, 마크로어레이 멤브레인상의 스포팅(spotting) DNA를 위한 프로토콜, 탐색자 표지(probe labeling), 및 혼성화는 전혈로부터 전체 RNA 약 5 μg을 엑스 비보로 분리함으로서 시작될 수 있다. cDNA 탐색자는 32PdCTP(INVITROGEN,Carlsbad, 캐나다)가 있는 SUPERSCRIPT II 을 사용하여 역전사함으로써 생성될 수 있다. 잔여 RNA는 약 70°C에서 약 20분 동안 알칼리 처리에 의해 가수분해될 수 있고, cDNA는 G50 컬럼(G50 columns, GE Healthcare, Buckingham-shire, 영국)을 사용하여 정제할 수 있다. 10 ml의 혼성화 완충액에서 탐색자는 마크로어레이 멤브레인에 밤새 혼성화 될 수 있고, 저강화 완충액 및 고강화 완충액고 함께 세척된다. 그 다음, 마크로어레이는 약 2일 동안 강력한 포스포 스크린(phosphor screens)에 노출될 수 있고, STORMIMAGER(MOLECULAR DYNAMICS, Sunnyvale, 캐나다)로 스캔닝된다.
종래기술은 종종 인터페론-베타(IFN-β)로 규정된 유전자를 특징화하기 위하여 고밀도 올리고핵산염 마이크로어레이(high density oligonucleotide microarrays)를 사용한다. 이러한 방법은 새로운 인터페론-베타(IFN-β)로 규정된 유전자를 확인하는데 유용할 것이다. 그러나 그 결과는 용이하게 정량화할 수 없으므로, 이러한 기술은 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 규정의 종적, 차이를 분석하는데 적합하지 않다. 종래 고밀도 마이크로어레이와는 달리, 본 발명의 마크로어레이는 종래의 마크로어레이 실험(예를 들면, Schlaak, J.F.등, J.Biol.Chem.277: 49428-49437,2002년; 및 Rani, M.R.S. 등, Ann.N.YAcadSci.1182: 58-68, 2009년 참조)으로부터 선택된 약 166개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)를 포함할 수 있고, 이 마크로어레이는 다른 질병의 안내(예를 들면, IFN-αtreatment forh epatitisC virus)에 유효화하고, 마크로어레이는 재생산적이고, 민감하고, 정량적인 것을 확인할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 마크로어레이에 의해 확인되는 상대적으로 작은 수의 유전자는 인터페론-베타(IFN-β)로 규정된 유전자 발현을 측정하는데 집중화되고 정량적인 분석을 제공한다.
단계 18에서, 인터페론-베타(IFN-β) 치료의 효능을 확인하기 위하여 측정된 유전자 발현량이 분석될 수 있다. 예를 들면, 측정된 유전자 발현량은 대조군 유전자 발현량(예를 들면, 다발성 경화증(MS)이 없는 하나 또는 그 이상의 피험자)과 비교될 수 있다. 본 발명의 하나의 예에서, 대조군과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 약 4개의 유전자 및/또는 그 변이체의 증가 또는 감소된 발현량은 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 대해 저반응한다는 것을 나타낸다. 증가 또는 감소된 유전자 발현량이 나타날 뿐 아니라, 또한 저반응군은 치료에도 불구하고 지속적인 신경학적 악화를 보여줄 수 있다. 다발성 경화증(MS) 피험자에 대한 신경학적 악화의 측정 방법은 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, 정량적 MRI 분석(quantitative MRI analysis), 확장 장애상태 척도(Expanded Disability Status Scale, EDSS)(예를 들면, EDSS 값이 적어도 약 0.5 증가하는 경우 신경학적 악화를 나타냄), 및 Multiple Sclerosis Functional Composite을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 대조군과 비교하여 적어도 하나 (예를 들면, 약 4개)의 하기와 같은 유전자 및/또는 그 변이체의 증가 또는 감소된 발현량은 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응한다는 것을 나타낸다: 2-5OAS; Adaptin; Akt-2; APOL3; ATF 2; Bad; Bcl-2; BST2; C1-INH; C1orf29; C1r; C1S; Caspase 1; Caspase 7; Caspase 9; CCR1; CD3e; CEACAM; c-myc; COMT; CREB; CXCL11; CXCR4; CYB56; DDX17; Def-a3; Elastase 2; Fas-L; FK506; FLJ20035; G1P3; Gadd45; GATA 3; GBP2; HLADP; HLADRA; Hou; HPAST; Hsf1; Hsp90; IDO; IFI16; IFI-17; IFN-44; IFI60; IFIT1; IFIT2; IFIT5; IFITM2; IFITM3; IFN-17; IFNAR1; IFNAR2; IFNGR1; IFNGR2; IL15; IL18 BP; IL1RN; IL2; IL2Rg; IL6; Int-6; IP-10; IRF2; ISG15-L; ISG20; ISGF3g; L1CAM; MAP2K3; MAP2K4; MAP3K14; MAP3K3; MAP3K4; MAP3K7; MAP4K1; MAPK13; MAPK7; Met-onco; MMP-1; MMP-9; MT1H; MT1X; MT2A; MX1; NF-IL-6; NFκB; NMI; NT5e; OASL; P4HA1; p53; p57Kip2; PAI-1; PDK1; PDK2; PI3K; PKR; plectin; PLSCR1; PSMB9; RCNI; RGS2; RHO GDP; RIG-1; SERPIN; SNN; SOCS-1; STAT1; STAT2; STAT4; TFEC; TGFbR2; TGFbR3; TIMP-1; TNF-α; TNFAIP6; TOR1B; TRAIL; UBE2L6; USP18; VegFC; Viperin; 및 WARS.
본 발명의 다른 예에서, 대조군과 비교하여 적어도 하나 (예를 들면, 약 4개)의 하기와 같은 유전자 및/또는 그 변이체의 증가 또는 감소된 발현량은 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응한다는 것을 나타낸다: TRAIL; RIG-1; 2-5OAS; STAT1; PI3-kinase; IL-15; IP-10; MMP-1; P4HA1; caspase 7; PDK2; ATF-2; TNF-a; RGS2; SNN; hsp90; c-myc; A1-AT; HLA-DRA; COMT; NFkB; HLA-DP; TIMP-1; CXCR4; 및 IL-2.
본 발명의 다른 예에서, 대조군과 비교하여 적어도 하나 (예를 들면, 약 4개)의 하기와 같은 유전자 및/또는 그 변이체의 증가 또는 감소된 발현량은 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응한다는 것을 나타낸다: TRAIL; RIG-1; 2-5OAS; STAT1; PI3-kinase; IL-15; IP-10; MMP-1; P4HA1; caspase 7; PDK2; ATF-2; TNF-a; 및 RGS2.
본 발명의 다른 예에서, 대조군과 비교하여 적어도 하나 (예를 들면, 약 4개)의 하기와 같은 유전자 및/또는 그 변이체의 증가 또는 감소된 발현량은 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응한다는 것을 나타낸다: c-myc; A1-AT; HLA-DRA; COMT; NFkB; HLA-DP; TIMP-1; CXCR4; 및 IL-2.
본 발명의 다른 관점은 다발성 경화증(MS) 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 외의 다른 약제로 치료되어야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대조군과 비교하여 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체(예를 들면, 표 1에 열거된 적어도 약 4개의 유전자)의 증가 또는 감소된 발현량을 갖는 다발성 경화증(MS) 피험자는 인터페론-베타(IFN-β) 이외의 다른 약제로 치료될 수 있다. 인터페론-베타(IFN-β) 이외의 다른 다발성 경화증(MS) 치료는 본 발명의 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate), 마이토잔트론(mitoxantrone), 및 나탈리주마브(natalizumab)를 포함할 수 있고, 뿐만 아니라 대체 치료(예를 들면, 비타민 D)를 포함할 수 있다. 또 다른 다발성 경화증(MS) 치료는 최근 다발성 경화증(MS) 치료를 위해 임상 조사가 이루어지고 있는 알렘투주마브(alemtuzumab), 다클리주마브(daclizumab), 이노신(inosine), BG00012, 핀골리모드(fingolimod), 라키니모드(laquinimod), 및 뉴로백스(NEUROVAX)와 같은 약제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법은 이하에 상세히 서술한다.
단계 20에서, 상기 방법(10)은 생물학적 시료를 채취하는 단계 전에 다발성 경화증(MS) 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)의 투여하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 인터페론-베타(IFN-β)의 투여는 단일 조제물질에 의해 이루어질 수 있고, 단일 조제물질은 유전자 발현 측정(예를 들면, 단계 16)에서 노이즈를 감소시킬 수 있다. 다발성 경화증(MS) 피험자에게 투여할 수 있는 인터페론-베타(IFN-β) 투약의 예는 인터페론-베타-1에이(IFN-β-1a)(예를 들면, AVONEX, REBIF) 및 인터페론-베타-1비(IFN-β-1b)(예를 들면, BETASERON, EXTAVIA)를 포함한다. 인터페론-베타(IFN-β) 투여는 혈관 내 주사와 같은 알려진 경로로 투여될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)를 투여한 후, 적어도 하나의 생물학적 시료를 채취할 수 있다. 생물학적 시료는 한 번 이상의 시점에 채취할 수 있다. 예를 들면, 전혈 시료는 인터페론-베타(IFN-β) 투여 약 12시간 후 다발성 경화증(MS) 피험자로부터 채취할 수 있다. 추가적인 인터페론-베타(IFN-β)의 투여는 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투약 다음에 투여될 수 있다. 예를 들면, 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투여가 피험자에게 이루어지고, 첫 투여 약 12 시간 후 생물학적 시료를 채취할 수 있다. 그 다음에, 약 6 개월째에 두 번째 인터페론-베타(IFN-β) 투여가 이루어지고, 생물학 시료를 다시 채취할 수 있다. 생물학적 시료를 채취한 후, 상기 언급한 바와 같이 그 시료로부터 적어도 하나의 핵산을 분리할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체의 발현량은 예를 들면, 마크로어레이를 사용하여 확인할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 일단 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체의 발현량이 확인되면, 그 발현량을 분석할 수 있다. 예를 들면, 측정된 유전자 발현량은 대조군 유전자 발현양과 비교할 수 있다. 대조군 유전자 발현량은 다발성 경화증(MS)이 없는 하나 이상의 피험자로부터 분리할 수 있고, 인터페론-베타(IFN-β)로 치료되지 않은 피험자로부터 얻을 수 있고, 또는 인터페론-베타(IFN-β)로 치료되기 전에 피험자로부터 얻을 수 있다. 대조군과 비교하여 유전자 발현량이 표 1에 열거된 적어도 4개의 유전자에서 증가 또는 감소되면, 예를 들면, 그 피험자는 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 대하여 저반응할 것이다.
가장 일반적으로 인터페론-베타(IFN-β)가 다발성 경화증(MS)에 대한 질병 변경 치료에 사용될지라도, 그 반응기작은 잘 이해가 되지 않고, 개별화된 치료를 안내할 수 있는 생물학적 표지가 없다. 다발성 경화증(MS) 피험자에게 있어서 인터페론-베타(IFN-β) 주사에 대한 과도한 분자반응은 선천성 면역 반응이 발병을 유도하는 일부 피험자의 표지가 된다는 점에 기초하여, 본 발명은 바람직하게 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응군 상태를 갖는 소수의 피험자를 확인하기 위한 방법(10)을 제공한다. 이하에서 더 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명은 개개인의 다발성 경화증(MS) 피험자를 위한 질병 변경 치료의 조정이 가능하다.
도 2는 다발성 경화증(MS)를 치료하는데 사용될 수 있는 제제를 스크린하는 방법(30)으로 구성된 본 발명의 구체예를 나타낸다. 이 방법(30)은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다: 다발성 경화증(MS) 피험자 유래의 말초혈액단핵구세포(PBMCs)를 제공하는 단계(단계 32); 말초혈액단핵구세포(PBMCs)에 약제를 투여하는 단계(단계 34); 말초혈액단핵구세포(PBMCs)로부터 적어도 하나의 핵산을 분리하는 단계(단계 36); 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체의 유전자 발현량을 결정하는 단계(단계 38); 및 측정된 유전자 발현량을 분석하는 단계(단계 40).
단계 32에서, 다발성 경화증(MS)을 갖고, 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응군인 피험자로부터 말초혈액단핵구세포(PBMCs)를 채취할 수 있다. 상기에서 언급된 방법(10)에 따라 피험자가 저반응군인지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 다발성 경화증(MS) 피험자는 대조군과 비교하여 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 그 변이체(예를 들면, 표 1에 열거된 약 4개의 유전자)의 증가 또는 감소된 발현량은 저반응군으로서의 특징이 될 수 있다. 당업자에게 말초혈액단핵구세포(PBMCs)를 분리하는 몇몇의 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 말초혈액단핵구세포(PBMCs)는 상이한 밀도구배 원심분리(different density gradient centrifugation) 과정을 사용하여 전혈 시료로부터 분리할 수 있다. 전형적으로, 항혈액응고 전혈은 분리제 위로 층을 형성할 수 있고, 원심분리될 수 있다. 원심분리 단계의 최종단계에서, 몇몇의 층이 시각적으로 관찰될 수 있다(위에서부터 아래까지): 혈장/혈소판; 말초혈액단핵구세포(PBMCs); 분리제; 및 적혈구/과립성 백혈구. 말초혈액단핵구세포(PBMCs) 층은 제거될 수 있고, 오염물질(예를 들면, 적혈구)을 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 세척 후 셀 타입(cell type) 및 셀 생존능(cell viability)은 기술분야에서 잘 알려진 방법으로 확인할 수 있다. 말초혈액단핵구세포(PBMCs)는 대부분 융합성의 셀 층을 촉진하기 위하여 충분한 조건에서 일정 시간 동안 엑스 비보로 배양될 수 있다.
단계 34에서, 적어도 하나의 제제는 말초혈액단핵구세포(PBMCs)에 사용될 수 있다. 말초혈액단핵구세포(PBMCs)에 사용되는 제제는 다발성 경화증(MS) 치료를 위한 후보군이 될 수 있는 생물학적 성분, 화합물, 또는 약제를 포함할 수 있다. 이러한 제제의 예로는 생물제제, 약학 화합물, 폴리펩티트, 단백질, 핵산, 및 소분자를 포함할 수 있다.
단계 36에서, 적어도 하나의 핵산은 말초혈액단핵구세포(PBMCs)로부터 분리할 수 있다. 세포 개체군으로부터 핵산을 분리하는 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, RNA는 잘 알려진 RNA 추출분석(RNA extraction assay)을 통해 말초혈액단핵구세포(PBMCs)으로부터 분리할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체 (예를 들면, 표1에 열거된 약 4 개의 유전자)의 발현량은 단계 38에서 결정될 수 있다. 예를 들면, 마크로어레이는 유전자 값을 확인하는데 사용될 수 있다.
일단 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체(예를 들면, 표1에 열거된 약 4 개의 유전자)의 발현량이 결정되면, 상기에서 언급한 바와 같이 측정된 발현량은 단계 40에서 분석될 수 있다. 예를 들면, 측정된 유전자 발현량은 대조군의 유전자 발현량과 비교할 수 있다. 대조군과 비교하여 측정된 유전자 발현량이 증가 또는 감소된 경우, 투여된 제제는 다발성 경화증(MS) 치료를 위한 후보군이 되지 않을 수 있다. 반대로, 대조군과 비교하여 유전자 발현량은 증가 또는 감소되지 않는 경우, 투여된 제제가 다발성 경화증(MS) 치료를 위해 사용될 수 도 있다.
도3은 다발성 경화증(MS) 의 치료방법(50)을 설명한다. 이 방법(50)은 다발성 경화증(MS) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계(단계 52); 생물학적 시료로부터 적어도 하나의 핵산을 분리하는 단계(단계 54); 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 유전자 발현량을 결정하고(단계 56); 측정된 유전자 발현량을 분석하는 단계(단계 58); 그리고 피험자에게 적어도 하나의 약제를 투여하는 단계(단계 60) 로 이루어질 수 있다. 이 방법(50)은 생물학적 시료를 채취하는 단계(단계62) 전에 다발성 경화증(MS) 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 52에서, 다발성 경화증(MS) 피험자로부터 적어도 하나의 생물학적 시료를 채취할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 예를 들면, 생물학적 시료는 피험자의 정맥에서 주사기 바늘을 사용하여 채취한 전혈 시료를 포함할 수 있다.
단계 54에서, 적어도 하나의 핵산은 상기 언급한 바와 같이 생물학적 시료로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, RNA는 PAXGENE RNA 혈액 추출 키트를 사용하여 전혈 시료로부터 분리할 수 있다.
그 다음, 단계 56에서 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체를 확인할 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 예를 들면, 혼성화된 마크로어레이는 표 1에 나열된 최소한 약 4개의 유전자의 유전자 발현량을 확인하는데 사용될 수 있다.
일단 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량이 확인되면, 상기에서 언급한 바와 같이 단계 58에서 측정된 유전자 발현량을 분석할 수 있다. 예를 들면, 측정된 유전자 발현량은 대조군 유전자 발현량과 비교할 수 있다. 대조군과 비교하여 측정된 유전자 발현량이 증가 또는 감소된 경우, 피험자는 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응군일 수 있다. 반대로, 대조군과 비교하여 유전자 발현량이 증가 또는 감소하지 않는 경우, 피험험자는 인터페론-베타(IFN-β)치료의 후보군이 될 수 있다.
단계 60에서, 적어도 하나의 약제를 치료효과를 보이는 용량으로 피시험자에게 투약할 수 있다. 피시험자에게 투약되는 특정한 약제는 피시험자의 미리 결정된 반응 상태에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 만약 피시험자가 저반응군이라면, 인터페론-베타(IFN-β)와는 다른, 나탈리주마브(natalizumab)와 같은 약제를 피시험자에게 치료효과를 보이는 용량으로 투여할 수 있다. 반대로, 만약 피시험자가 저반응군이라면, 인터페론-베타(IFN-β)와 같은 약제를 피시험자에게 치료효과를 보이는 용량으로 투여할 수 있다. 병리상태의 심각성 및/또는 피시험자의 예후에 따라, 치료의 종류, 용량, 스케줄 및 치료기간 달라질 수 있다. 당업자는 복용량, 스케줄 및 치료기간의 타입을 조절할 수 있다. 바람직하게 상기 방법(50)은 불필요한 약제에 노출시키지 않고, 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 처방을 제공한다. 이는 의료 시스템에 불필요한 비용을 절약하는 측면에서 매우 도움이 될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이 상기 방법(50)은 단계 62에서 생물학적 시료를 채취하는 단계 전에 다발성 경화증(MS) 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)를 투여하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법(10, 30 및 50)의 일부에 단백질, 폴리펩티드 분리 및 확인하는 기술을 포함할 수 있다. 예를 들면, 종래기술은 본 발명의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs) 및/또는 이의 변이체에 의해 암호화된(encoded) 단백질, 폴리펩티드 및 이의 변이체를 분리하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 이렇게 하기 위해, 상기 언급한 바와 같이 생물학적 시료는 다발성 경화증(MS) 피험자로부터 채취할 수 있다. 그 다음, 생물학적 시료는 본 발명의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체에 의해 암호화된 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 이의 변이체를 분리하기 위해서 알려진 기술의 대상이 될 수 있다. Humana Press (1996)의 단백질 정제 프로토콜(Protein Purification Protocols)을 보면, 분리된 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 이의 변이체는 단백질 마이크로어레이(protein microarray), 면역염색법(immunostaining), 면역침강법(immunoprecipitation), 전기영동법(electrophoresis)(예, 2D 또는 3D), 웨스턴 블롯(Western blot), 분광광도법(spectrophotometry), 및 BCA 분석(BCA assay)과 같은 하나 이상의 알려진 기술들을 조합하여 검출할 수 있다. 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 이들의 변이체의 검출 후, 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 이들의 변이체의 값을 분석할 수 있다. 대조군과 비교하여 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 이들의 변이체의 값이 증가 또는 감소된 경우, 피시험자는 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응군이 될 수 있다. 반대로, 대조군과 비교하여 단백질, 폴리펩티드, 및/또는 이들의 변이체의 값이 증가 또는 감소되지 않은 경우, 피시험자는 인터페론-베타(IFN-β) 치료의 후보군이 될 수 있다.
다음의 실시예는 설명을 목적으로 하는 것이지 청구범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
방법
임상 프로토콜( Clinical protocol )
클리브랜드 클리닉(Cleveland Clinic, CC) 기관감사위원회가 연구를 승인하였다. 모든 피시험자들은 정보제공 동의서를 작성하였다. 이전에 치료한 적이 없는 피시험자에 한하여, 임상적 독립증후군(clinically isolated syndrome, CIS) 또는 다발성 경화증(relapsing-remitting, MS)을 가지는 경우, 근육내 인터페론-베타-1(IFN-β-1) 치료를 클리브랜드 클리닉 다발성경화증 센터(CC MS Center)에서 시작하였다. 99명의 피시험자가 등록하였고, 각각의 피시험자는 기준선, 6 개월, 12 개월 및 24 개월째에 검사하였다. 3 개월 및 18 개월째에, 피시험자들의 치료 순응도 및 부작용을 알아보기 위하여 전화로 연락하였다. 기준선, 6 개월 및 24 개월째에 방문하였고, 인터페론이 조절된 유전자(IRG)분석을 위하여 인터페론-베타(IFN-β) 투약 전 즉시, 그리고 인터페론-베타(IFN-β) 투약 후 정확히 12 시간 후 임상 연구 협회에서 혈액을 수집하였다. 그리고, 피시험자들은 병변 및 뇌 위축에 대한 양적 평가를 위해서 표준화된 뇌 MRI 검사를 하였다. 각 방문에서, 피시험자들은 Kurtzke 확장 장애상태 척도(Expanded Disability Scale Score)(참고, Kurtzke, J. F., Neurology 33:1444- 1452, 1983), 다발성 경화증 기능 종합점수(the Multiple Sclerosis Functional Composite score)(참고, Rudick, R.A. et al., Mult. Scler. 8:359-365, 2002), 및 병발성의 재발 또는 병의 기록(history)을 결정하기 위하여 신경학적 검사를 하였다; 또한, 피시험자들에게는 독감과 같은 증상, 근육통, 오한, 피로, 두통 및 기력 저하를 특정하기 위한 구체적인 설문지가 주어졌다. 6개월 및 24 개월째에 인터페론(IFN)-중화 항체를 검사하기 위해서 혈청(Serum)을 검사하였다.
MRI 분석
T2-강조(weighted) 자기공명영상기기(fluid-attenuated inversion recovery, FLAIR) 영상을 포함하는 MRI 영상 획득, T2- 및 양성자 밀도-강조(weighted) 듀얼 에코 고속 스핀 에코(echo) 영상, 및 T1-강조(weighted) 스핀 에코 영상은 표준 용량의 가돌리늄(gadolinium, 0.1 mmol/kg) 투약 전 및 후에 얻었다. 영상은 뇌실질 분율(brain parenchymal fraction, BPF), T2 병변 양(volume), T1 하이포인텐스(hypointense) 병변 양, 가돌리늄-증진 병변 양 및 수, 새로운 T2 병변의 수 및 증가된 T2 병변의 수를 결정하기 위하여 가정(house)에서 개발된 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 뇌실질 분율(BPF)은 완전히 자동화된 분류 소프트웨어(참조, Rudick, R.A. et al., J. Neuroimmunol. 93:8-14, 1999)를 사용한 FLAIR영상으로 계산하였다. 세부적인 병변 분석 방법은 이전에 설명하였다(참조, Cohen, J.A. et al., Mult. Scler. 14:370 382, 2008). 간략하게, T2 하이포인텐스(hypointense) 병변은 FLAIR 및 T2/PD 영상에서 자동으로 분류되었고, 그리고 잘못 분류된 병변을 바로잡기 위해서 대화형 소프트웨어 사용하여 시각적으로 확인하였다. 6개월째의 후속 영상은 기준선에 등록되었고, 그리고 강도가 표준화되었다. 기준선 T2 병변 마스크(mask)는 끈질긴 병변을 알기위해서 함께 등록된 6개월째 영상에 적용하였다. 6개월째에 새로운 T2 병변 및 증가된 T2 병변을 자동적으로 확인하기 위해서 등록된 강도 표준화된 6개월째 영상으로부터 기준선 영상을 뺐다. 새로운 T2 병변 및 증가된 T2 병변은 최종 집계를 하기 위한 대화형 소프트웨어를 사용하여 시각적으로 확인되었다.
RNA 분리
RNA는 에탄올 침전에 의해 농축되고 제조업체의 지침에 따른PAXGENE RNA 혈액 추출 키트(PreAnalytix, 스위스)를 사용하여 혈액에서 엑스 비보로 추출되었다. RNA의 질과 양은 분광광도법(spectrophotometry)(280/0260 nm의 흡광도 비율) 및 아가로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 추가적으로 시각화하여 평가되었다. RNA 시료는 -80°C에 보관하였다.
마크로어레이를 사용한 유전자 분석
cDNA 마크로어레이 분석을 위한 세부적인 방법론은 Schlaak, J.F. 등, J. Biol. Chem. 277, 49428-49437, 2002; Rani, M.R.S. 등, Ann. N.Y Acad Sci. 1182:58-68, 2009에 설명된 방법에 의해 수행되었다. 주문 제작된 마크로어레이의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 유니젠(Unigene) 데이터베이스로부터 선택된 166개의 인간 cDNAs에 의해 나타났다. 젠뱅크 기탁 번호(GenBank accession numbers)와 마크로어레이 상의 모든 유전자의 이름은 표1에 열거하였다.
표 1: 166 개의 타입 1의 명칭 및 유전자 은행 기탁 번호(GenBank accession numbers)
주문 제작된 마크로어레이를 위한 인터페론 반응성 유전자
유전자 기탁번호 유전자 기탁번호 유전자 기탁번호 유전자 기탁번호
2-5 OAS NM_002534 G1 P3 NM_002038 IP -10 X02530 PDK2 NM_002611
a1 - AT K01396 Gadd45 M60974 IRF4 U52682 PGK V00572
ADAM17 U69611 GATA 3 X58072 IRF1 L05072 PI3K NM_006219
Adaptin AF068706 GBP2 M55543 IRF2 X15949 PIAS AF077954
Akt -1 NM_005163 Gran B M17016 IRF7 U73036 PIAS1 AF077951
Akt -2 M77198 HLADP M83664 ISG15 -L M13755 Pig7 AF010312
APOL3 AA971543 HLADRA J00194 ISG20 NM_002201 PKR NM_002759
ATF 2 X15875 HLAE X56841 ISGF3g M87503 plectin U53204
Bad U66879 Hou U32849 JUN J04111 PLSCR1 AF098642
Bax U19559 HPAST AF00144 L1CAM M74387 PSMB9 X66401
Bcl -2 M14745 Hsf1 M64673 L- Selectin M25280 Raf X03484
BST2 D28137 Hsp90 X15183 MAP2K3 NM_002756 RCNI D42073
C1 - INH NM_000062 IDO NM_002164 MAP2K4 L36870 RGS2 NM_002923
C1orf29 NM_005951 IFI16 M63838 MAP3K11 NM_002419 RHOGDP L20688
C1r NM_001733 IFI -17 J04164 MAP3K14 NM_003954 Ribonuc NM_003141
C1S J04080 IFI35 U72882 MAP3K3 U78876 RIG -1 AF038963
Caspase 1 M87507 IFI44 D28915 MAP3K4 NM_005922 SERPIN NM_000295
Caspase 7 U67319 IFN -44 D28915 MAP3K7 NM_003188 Smad1 U59423
Caspase 9 U60521 IFI60 AF083470 MAP4K1 NM_007181 SNN NM_003498
CBFA NM_004349 IFIT1 M24594 MAPK13 AF004709 SOCS -1 N91935
CCR1 L09230 IFIT2 NM_001547 MAPK7 NM_002749 SOCS2 AF020590
CCR5 U54994 IFIT4 NM_001549 Met - onco NM_000245 SSA1 NM_003141
CD14 NM_000591 IFIT5 NM_012420 MIP -1b NM_002984 STAT1 M97935
CD3e NM_012099 IFITM2 NM_006435 MMP -1 M13509 STAT2 M97934
CEACAM NM_001712 IFITM3 X57352 MMP -9 NM_004994 STAT4 L78440
c- fos NM_005252 IFN -17 M13755 MT1H NM_005951 STAT5A L41142
c- myc L00058 IFN -9/27 J04164 MT1X NM_005952 TAP1 X57522
Collagen J03464 IFNAR1 J03171 MT2A NM_005953 TFEC NM_012252
COMT M58525 IFNAR2 L42243 MX1 M33882 TGFbR2 D50683
CREB NM_004379 IFNGR1 J03143 MX2 M30818 TGFbR3 L07594
CXCL11 NM_005409 IFNGR2 U05875 NF - IL -6 X52560 TIMP -1 M59906
CXCR4 AF005058 IkBa M69043 NFkB M58603 TNF -a X01394
CYB56 NM_007022 IL15 U14407 NMI Y00664 TNFAIP6 NM_007115
Cyp19 M28420 IL18 BP AB019504 NT5e X55740 TOR1B NM_014506
DDX17 U59321 IL1RN NM_000577 OASL NM_003733 TRAIL U37518
Def - a3 NM_005217 IL2 NM_000586 P4HA1 M24486 UBE2L6 NM_004223
Destrin S65738 IL2Rg NM_000206 p53 M14694 USP18 NM_017414
Elastase 2 M34379 IL6 X04602 p57Kip2 U22398 VegFC U43142
F- actin U56637 IL8Rb NM_001557 p70 K M60724 Viperin AF026941
Fas -L U08137 iNOS U20141 PAI -1 M16006 WARS X62570
FK506 AF038847 Int -6 U62962 PDGF -a X06374
FLJ20035 AK000042 integ -b-6 NM_000888 PDK1 Y15056
이러한 타입 1 인터페론(IFN)의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 섬유육종(fibrosarcoma), 인터페론-알파(IFN-α) 또는 인터페론-베타(IFN-β)중 하나로 치료된 상피 세포계 또는 내피 세포계 (참조, Schlaak, J.F. 등, J. Biol. Chem. 277, 49428-49437, 2002년; Rani, M.R.S. 등, Ann. N.Y Acad Sci. 1182:58-68, 2009)의 마이크로에레이(microarray) 분석에 의해 식별된다. 모든 유전자는 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)로 알려져 있다.
멤브레인에서 DNA 스포팅(spotting)을 위한 프로토콜, 프로브 라벨링, 및 혼성화(hybridization)는 다음과 같이 수정을 하여 앞에서 설명되었다(참조, Schlaak, J.F. 등, J. Biol. Chem. 277, 49428-49437, 2002년; Rani, M.R.S. 등, Ann. N.Y Acad Sci. 1182:58-68, 2009년). 혈액으로부터 엑스 비보로 분리된 총 5 μg의 RNA는 32PdCTP의 존재하에 SUPERSCRIPT II (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 역전사(reverse transcription)에 의해 방사성 표지된 cDNA 프로브를 생성하는데 사용되었다. 남은 RNA 는 cDNA는 G50 컬럼(참조, GE Healthcare, Buckingham-shire, UK)을 사용하여 정화한 후 70°C에서 20 분 동안 알칼리 처리에 의해 가수분해되었다. 마크로어레이 및 방사성 cDNA의 혼성화(hybridization) 제조는 이전에 설명된 대로 실시되었다(Schlaak, J.F. 등, J. Biol. Chem. 277, 49428-49437, 2002년; Rani, M.R.S. 등, Ann. N.Y Acad Sci. 1182:58-68, 2009년). 멤브레인에 부착된 반사성 물질의 양을 평가하였고, 그리고 ISGs의 IR을 계산하는데 사용되었다.
변수를 최소화하기 위해서, 기준선(0달) 및 6개월째의 각 피험자의 시료는 하나의 배치 실험에서 처리되었다(총 4 멤브레인).
주문 제작된 cDNA 마크로어레이를 사용하여 평가된 유도비(IRs)는 5 개의 유전자에 대한 실시간 정량 PCF를 사용하여 검증되었다: OASL (accession number NM003733); TRAIL (U37518); IFI44 (D28915); HLADRA (J00194); 및 TIMP-1 (M59906). OASL, TRAIL, IFI44, HLADRA, 및 TIMP-1를 위한 rt-PCR 및 마크로어레이 사이의 상관관계을 위한 스피어만 상관계수(Spearman correlation coefficients)는 각각 0.92, 0.75, 0.36, 0.72, 및 0.54이었다. 도 4는 OASL을 위해 얻은 상관관계 및 유도비(IRs)를 나타낸다.
통계학적 분석
인터페론-베타(IFN-β)에 대한 저반응은 정량(quantitative) MRI 분석을 기반으로 하였고, 기준선과 6개월째에 방문하여 측정한 MRI를 비교하였다. 저반응은 3개 이상의 새로운 병변 발생으로 정의되었다. 고반응군과 저반응군 사이의 기준선 특성에서의 차이는 적절하게 t-테스트(t-test) 또는 피셔의 정확검정 테스트(Fisher’s exact test)를 사용하여 비교되었다. 포아송 회귀분석(Poisson regression)은 기준선 투약에서 2.0 이상의 유도비(IRs)를 가진 유도된 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 수에서 그룹 차이를 테스트 하기 위해 사용되었다. 6개월째와 비교하여 첫 투약에서 log2변형된 유도비(log2 transformed IRs)의 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)는 85 명의 피험자로 계산되었다. 기준선, 6개월째 및 24개월째 상호(pair-wise) 상관관계는 무작위로 선택된 10명의 피험자로 계산되었다.
log2변형 유도비(log2 transformed IRs)의 최소-제곱 평균(least-square means, LS means)으로 조정된 데모그래픽(demographic) 및 기준선 MRI로 계산하였고, 공분산분석(ANCOVA)으로 반응 그룹들 사이를 비교하였다. 공변량(covariate)은 연령, 성별, 가돌리늄 증진 병변의 존재, 및 T2양을 의미한다. 인터페론-베타(IFN-β)에 반응하는 그룹 차이를 조사하기 위해서, 166개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 최소-제곱(LS) 평균의 밀도 플랏(density plot)은 반응군의 상태와 기준선 및 6개월째에서 유도비(IRs)와 비교하여 그룹을 평가하였다. 저반응군(PR)에서 더 큰 반응을 보여주는 유전자의 비율(최소-제곱(LS) 평균: 상향조절된 유전자(up-regulated genes)에서 저반응군(PRs) > 고반응군(GRs)인 경우, 또는 하향조절된 유전자(down-regulated genes )에서 저반응군(PRs) < 고반응군(GRs)인 경우)을 0.5 이하 비율의 귀무가설(null hypothesis)을 가정하는 이항식 비율 테스트로 테스트(일방적)하였다
인터페론이 조절된 유전자(IRGs)가 고반응군(GR)로부터 저반응군(PR)을 식별할 수 있는지 더 알아보기 위해서, 저반응군(PR) 및 고반응군(GR) 사이의 가장 차별된 기준선에서의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)를 다음과 같이 확인하였다. 먼저, 다양하지 않은 상이한 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)를 선택하였고, 그 다음에 랜덤 포레스트 기술(forest technique)은 유전자를 선택하고 예측 모델을 구축하는데 사용되었다. 최상의 25개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 1000 랜덤 포레스트 시뮬레이션으로부터 얻어진 다양성 중요도 평가 총 순위를 기반으로 하는 몬테-카를로(Monte-Carlo) 순위에 근거하여 선정되었다. 정확한 반응 그룹에 따라 분류된 피험자에서 이러한 25개 유전자들을 기반으로 평가된 ROC 곡선은 예측 모델하에 기준선 T2 양과 비교되었고, 그리고 예측 모델하에 기준선 T2 양없이 비교되었다.
결과
피험자의 조사
99명의 피험자들이 종단적 연구에 참여하였다. 85 명이 프로토콜에 남았고 최소한 6달 동안 근육내에 인터페론-베타-1(IFN-β-1)을 가지는 것을 유지하였다. 이중 14명은 계획되었던 6개월째 마크로어레이 분석을 완료하지 못했고, 12명은 인터페론-베타-1(IFN β 1)을 유지하지 못하였으며, 최초 투약 또는 6개월 투약에서 시료 혼성화가 남은 2명에게서 성공하지 못하였다. 기준선 데모그래픽 및 질병 특성은 첫 6 개월째 연구를 완료한 85명과 크게 차이가 나지 않았다. 그리고 데이터상에서 보여지지 않은 14명도 차이가 있지 않았다. 다른 모든 분석에서, 첫 6개월째 연구를 완료한 단지 85명의 피험자만이 포함되었다. 이 85명의 피험자 중에서 32%는 임상 독립증후군과 뇌 MRI 병변을 가지고 있었고, 68%는 다발성 경화증(MS)를 가졌다. 평균 나이는 35.7세 였고; 평균 다발성 경화증(MS) 질병 기간은 2.4년이었으며; 65%가 여자고; 그리고, 91%가 백인이었다. 6 개월째에, 연구 피험자 중15(18%)명이 미리 정한 MRI 정의에 근거하여 저반응군(PR)으로 분류되었다. 표2에 저반응군(PR), 고반응군(GR)에관한 기준선 특징 및 총 인구가 기재되었다.
표 2: 인터페론-베타(IFN-β)치료에 대한 고반응 및 저반응을 가진 피험자 사이의 기준선 특징 비교
특징 고반응군( GR )
(n　=　70) 		저반응군( PR )
(n = 15) 		총 피험자
(n = 85) 		P-값
( GR 　대　 PR )
나이(연수) 36.3 (9.4) 33.0 (11.2) 35.7 (9.8) 0.30
증상 기간(연수) 2.5 (3.0) 1.2 (1.7) 2.4 (2.9) 0.39
여성 비율(%) 69% 47% 65% 0.11
백인 비율(%) 93% 80% 91% 0.14
CIS(%) / RRMS(%) 34% / 66% 20% / 80% 32% / 68% 0.37
EDSS 1.6 (1.0) 1.6 (1.2) 1.6 (1.0) 0.91
MSFC 점수 0.39 (0.48) 0.19 (0.41) 0.35 (0.47) 0.10
Gad-증진 병변(%) 24.3% 53.3% 29.4% 0.03
Gad-증진병변 양 0.097(0.38) 0.44 (0.72) 0.16 (0.47) 0.09
T2 양 3.0 (3.7) 5.8 (3.9) 3.5 (3.8) 0.02
T1 BH 양 0.55 (0.75) 0.87 (0.82) 0.61 (0.77) 0.19
BPF 0.858 (0.014) 0.859 (0.013) 0.859 (0.014) 0.79
*달리 명시하지 않은 한, 모든 값은 평균값 ± 표준편차이다.
CIS=임상적 독립증후군(clinically isolated syndrome); RRMS = 다발성경화증(relapsing-remitting multiple sclerosis); EDSS = 확장장애상태척도(Expanded Disability Scale Score); MSFC = 다발성 경화증 기능 종합 (Multiple Sclerosis Functional Composite); Gad = 가돌리늄(gadolinium); BH = 블랙 홀(black hole); BPF = 뇌실질 분율(brain parenchymal fraction).
저반응군이 더 높은 비율로 가돌리늄 증진 병변을 가지고, 더 큰 T2 병변 볼륨을 가졌다는 것을 제외하면, 두 그룹은 모든 특징이 기준선에서 비슷했다.
첫번째 투약에 대한 인터페론이 조절된 유전자( IRG ) 반응 및 시간에 따른 안정성
인터페론이 조절된 유전자(IRG)의 유도로 정의된 2.0이상의 IR, 인터페론-베타(IFN-β)를 투약 하지 않은 건강한 피시험자로 12시간 또는 24시간으로 구분된 분석에서 1.5 배보다 더 다양한 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)를 보이는데 실패하였다. 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투약에서 유도된 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)의 수는 인터페론-베타(IFN-β) 반응군 상태 및 유도된 유전자의 수(P = 0.76) (도. 5) 와 관계 없이 7 내지 135 명의 피험자로 다양했다. 마찬가지로, 초기 인터페론-베타(IFN-β) 투약에 대한 피험자들의 반응 패턴은 상당히 다양했다. (참조, Rani, M.R.S. 등, Ann. N.Y Acad Sci. 1182:58-68, 2009년).
첫 인터페론-베타-1(IFN-β-1) 투약 후 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 반응의 패턴 및 규모에서 상당한 개체간 변이(inter-individual variability)가 발생함에도 불구하고, 시간이 지남에 따라 개개인의 피험자에 대한 반응은 안정하였다. 도 6은 모든 85명의 피험자의 첫 투약(x-축)에 대한 6개월째의 유도비(IRs, y-축)를 도시한 유도비(IRs)를 보여준다. 인터페론-베타(IFN-β) 투여에 대한 분자반응은 대부분의 모든 피시험자에 대해 현저하게 안정하였다. 세 가지 예외가 있었다. 피험자 7(첫 번째 줄, 왼쪽에서 7번째) 및 피험자 25(세 번째 줄, 왼쪽에서 첫 번째)는 기준치에서 바이러스 감염이 되고, 높은 예비-투약 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 발현량 때문에 첫 투약에서 약간의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 유도를 갖거나 또는 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 유도가 없었다. 양 피험자는 6개월째에 인터페론-베타(IFN-β) 투여에 대하여 반응하였다. 인터페론-베타(IFN-β)에 대하여 높은 적정농도의 중화 항체가 발현된 피험자 21(두 번째 줄, 왼쪽에서 아홉 번째)은 6 개월째에 확인되었다. 피험자 21은 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투여에 대하여 활발하게 반응하였지만, 6개월째에 최소한으로 반응을 하였다. 모든 다른 피험자에 대한 중화 항체 실험은 6 개월째에 부정적이었다.
이러한 세 명의 예외적인 피험자를 제외하고, 첫 투약에서 유도비(IRs)는 개개인의 피험자에 대한 6 개월째의 유도비(IRs)와 밀접하게 상호연관 되어 있었다[피어슨 평균상관계수(Pearson correlation coefficient mean, ± SD)= 0.81 ± 0.11]. 67 명의 고반응군(GR) 피험자(피험자 7, 21 및 25를 제외한 피험자)에 대한 평균상관계수인 0.81 ± 0.11과 비교하여, 15 명의 저반응군(PR) 피험자(연구번호 1, 4, 12, 14, 18, 40, 49, 57, 62, 65, 66, 70, 87, 91, 및 92)의 평균상관계수는 0.81 ± 0.10이었다.
인터페론이 조절된 유전자(IRG) 분석은 무작위로 선택된 10 명의 피험자(5명의 저반응군(PRs) 및 5명의 고반응군(GRs))에 대하여 24 개월까지 반복되었다(도 7). 이러한 10 명의 피험자에 대하여, 유도비(IRs)는 기준선과 6 개월에서의 반응(r = 0.86); 6개월과 24개월에서의 반응(r = 0.82); 및 기준선과 24 개월에서의 반응(r = 0.85) 사이에서 밀접하게 상호연관 되어 있었다. 5명의 저반응군(PR)과 5명의 고반응군(GR)에 대한 상관계수는 유사하였다.
이러한 결과는 저반응군(PR) 상태가 인터페론-베타(IFN-β) 에 대한 분자반응의 규모(도 5) 또는 시간이 지남에 따른 인터페론-베타(IFN-β)에 대한 분자반응의 감쇠 중 어느 하나의 결과로 볼 수 없다는 것을 암시한다.
고 인터페론- 베타(IFN-β)반응군 및 저 인터페론- 베타(IFN-β)반응군에서 인터페론이 조절된 유전자( IRG ) 반응
인터페론-베타(IFN-β) 의 생물학적 효과는 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 단백질의 활성에 의하여 확인되었다(Borden, E.C.등, Nat. Rev. Drug Discov. 6:975-990, 2007년). 우리는 인터페론-베타(IFN-β)에 대한 분자반응의 특성이 유해한 염증을 일으키는 유전자(Wandinger, K.P. 등, Ann. Neurol. 50:349-357, 2001년) 또는 선택적으로 발현을 실패한 이로운 유전자(Wandinger, K.P.등, Lancet 361:2036-2043, 2003년) 유도의 발견 중 어느 하나에 의해 저반응군(PR) 상태를 설명할지도 모른다는 점을 고심하였다. 마크로어레이 분석(macroarray assay, 표 1)을 실시한 166 개 유전자의 단변량분석(univariate analysis)에서, 연령, 성별, 가돌리늄 증진 MRI 병변(gadolinium enhancing MRI lesions)의 존재 및 기준선 T2 손상부분이 조절된 평균 유도비(IRs)는 17개의 유전자에 대한 저반응군(PR) 및 고반응군(GR) 사이에서 반응의 차이를 나타내었다(P < 0.05). 예상치 못하게, 모든 17개의 유전자에 대하여, 유도 또는 억압 중 어느 하나의 반응은 저반응을 보이는 피험자에게 더 많이 나타났고, 저반응은 과도한 인터페론-베타(IFN-β) 분자반응을 암시한다. 이런 가정은 두 개의 군에서 전체 IR주파수의 분석에 의해 확인되었다(도 8a-b). 도 8a는 첫 투약에서 모든 피험자의 모든 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)에 대한 IR 주파수를 나타내고, 도 8b는 인터페론-베타(IFN-β) 투약 6 개월째에서 모든 피험자의 모든 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)에 대한 IR 주파수를 나타낸다. 첫 투약시, 119개의 상향조절된 유전자(upregulated genes) 중에서, 저반응군(PRs)에 대한 최소 제곱 평균 유도비(least-square-mean IRs)는 89개의 유전자에서 GRs에 대한 최소 제곱 평균 유도비 보다 크다. 47개의 억제된 유전자의 저반응군(PRs)에서 유도비(IRs)는 34개의 유전자의 GRs에서 유도비(IRs)보다 작다. 그러므로, 166개의 유전자 중 123개의 유전자에서, 인터페론-베타(IFN-β)에 대한 과도한 반응은 저반응과 함께 존재하였다(p <0.001). 6개월 투약에서(도 8b), 인터페론-베타(IFN-β)에 대한 과도한 반응은 166개의 유전자 중 120개의 유전자에서 발생하였다(p< 0.001).
랜덤 포레스트 선택(random forest selection)을 사용하여, 우리는 저반응 상태 또는 정상 반응 상태와 밀접하게 상호연관 되어 있는 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)를 확인하였다. 랜덤 포레스트 기술은 비모수 앙상블 분류기(non-parametric ensemble classifier)이고, 비모수 앙상블 분류기는 각각의 요인(이 경우에서, 각각의 IRG)을 선택할 때 개인 변인의 중요성을 고려한다. 이 기술은 복합적 상호작용 및 변이 사이에서의 비선형 의존성에 민감하다. 그러므로, 우리는 다양한 선택 및 분류를 위하여 랜덤 포레스트를 선택하였다. 표 3은 기준선 IR이 반응 상태를 가장 잘 예측한 25개의 확인된 유전자를 열거하였다.
표 3: 25개의 인터페론- 반응성 유전자의 유도비
반응군 상태를 가장 잘 예측한 주문 제작한 마크로어레이

유전자 명칭
기탁 번호
저반응군
유도비
고반응군
유도비
P 값
유도된 유전자
TRAIL U37518 6.23 4.50 0.048
RIG-1 AF038963 5.50 4.44 0.230
2-5OAS NM_002534 3.84 3.51 0.480
STAT1 M97935 3.41 3.18 0.656
PI3-kinase NM_006219 1.99 1.49 0.026
IL-15 U14407 1.68 1.55 0.502
IP-10 X02530 1.55 1.33 0.109
MMP-1 M13509 1.47 1.32 0.128
P4HA1 M24486 1.41 1.14 0.020
caspase 7 U67319 1.37 1.13 0.040
PDK2 NM_002611 1.31 1.02 0.047
ATF-2 X15875 1.20 1.08 0.296
TNF-a X01394 1.13 1.01 0.283
RGS2 NM_002923 1.11 1.05 0.603
억제된 유전자
SNN NM_003498 0.93 1.09 0.079
hsp90 X15183 0.93 1.11 0.141
c-myc L00058 0.85 0.95 0.203
A1-AT K01396 0.84 1.04 0.199
HLA-DRA J00194 0.78 1.01 0.074
COMT M58525 0.78 0.87 0.261
NFkB M58603 0.74 0.90 0.092
HLA-DP M83664 0.72 0.91 0.039
TIMP-1 M59906 0.65 0.96 0.005
CXCR4 AF005058 0.64 0.77 0.195
IL-2 NM_000586 0.47 0.90 0.001
첫 인터페론-베타(IFN-β) 투약에 대한 반응에서 25개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs) 중, 14개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 상향조절되었고, 11개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 억제되었다. 이러한 25개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)는 예측모델에서 결합되었고, 예측모델은 예측 강도를 측정하기 위한 ROC 곡선을 구성하기 위하여 사용되었다(도 9). 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투약에서 25 개의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 모델의 예측 강도는 기준선(예비-IFN-β 치료) T2 손상부분의 예측 강도와 비교되었다. 또한, 예측모델은 기준선 T2 손상부분 및 25 개의 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)에 대한 IR이 결합되어 구성되었다. 곡선 아래 영역은 T2 손상부분 단독의 0.76, 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 모델의 0.82, 및 인터페론이 조절된 유전자(IRGs)와 결합된 T2 손상부분의 0.85이고, 첫 인터페론-베타(IFN-β) 투약 후 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 유도 차이는 6 개월째에 MRI를 이용하여 측정된 반응군 상태의 강한 예측 변수였다는 것을 의미한다. 이 곡선은 기준선 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 모델이 기준선 MRI 뇌 스캔에 비하여 더욱 강력하게 6-개월 MRI 결과를 예측한다는 것을 보여준다.
실시예 2
마크로어레이 멤브레인의 스포팅( Spotting )
스포팅을 방해할 수 있는 다량의 먼지를 제거하기 위하여 스포팅에 사용되는 벤치 영역 전부를 닦아낸다. 그 다음, 스포팅 영역을 3 mm 종이로 덮고, VP110 핀 세척용액(120 mL의 중수(dH2O)에 대한 30 mL의 용액)이 담긴 타파웨어(Tupperware) 용기에 리플리케이터 핀을 설치한다. 핀은 세척용액에 반 정도 잠겨야만 한다. 핀이 “소킹(soaking)”되는 동안, 실험에 사용하기 위하여 하이본드-N+ 멤브레인(Hybond-N+ membranes)를 충분히 자른다. 예를 들면, 장갑을 끼고 자를 사용하는 동안, 하이본드 멤브레인을 가리기 위하여 사용된 종이 층에 74 mm x 115 mm 직사각형이 표시된다. 종이 및 멤브레인에 손 또는 팔꿈치의 과도한 압력이 가해지지 않도록 하고, 멤브레인의 중심부를 덮는 종이와 가능한 최소한의 접촉을 해야 한다. 또한, 멤브레인이 종이 커버 주변으로 미끄러지지 않도록 하고, 표시된 선을 자르기 위하여 깨끗한 메스(scalpel) 및 자 또는 깨끗한 가위가 사용되어야 한다.
그 다음, 각각의 멤브레인은 두 개의 모서리를 잘라내고, 연필로 멤브레인의 가장자리에 작은 확인 번호를 기재하여, 날-눙크 트레이(nalg-nunc tray)에 낀다. 종이를 트레이에 낄 때 종이의 아치는 위쪽을 향해야 하므로, 멤브레인이 스포팅될 때 가장자리는 말리지 않는다. 트레이에 맞추기 위하여 멤브레인의 가장자리를 잘라낼 필요가 있는 경우, 일단 실험이 완료되면 윗부분은 포스포-이메이저 카세트(phosphor-imager cassette)에서 얼라인먼트로 사용되기 때문에, 아랫부분을 잘라내는 것이 가장 바람직하다.
핀을 세척용액에 7 내지 10번 담그고, 보풀방지 블랏팅지(blotting paper) VP522상에 블랏(blot)하여, 5를 셀 동안 핀이 고정되도록 한다. 핀을 중수에 7 내지 10번 담그고, 다시 블랏하고, 5를 셀 동안 핀을 고정시킨다. 중수가 든 다른 튜브에서 마지막 단계를 반복하고, 핀을 이소프로판올에 7 내지 10번 담그고, 블랏하고, 자연 건조시킨다. 그 동안 용해를 위하여DNA 96 웰 플레이트를 -20C 로부터 제거한다.
일단 핀이 건조되고, DNA가 완전히 용해되면, 각각의 DNA 96 웰 플레이트를 상응하는 번호가 붙은 라이브러리 카피어(library copier) 내에 배치한다. 상응하는 DNA에 핀을 배치하고, 스포팅을 위한 핀을 “주입(prime)”하기 위하여 보풀방지 블랏팅지에 스포팅을 하고, 핀을 다시 96 웰 플레이트에 배치한다. 등록된 장치를 하나의 멤브레인을 포함하는 트레이의 위쪽에 배치하고, DNA로부터 핀을 제거하고, 리플리케이터 트레이에서 가이드 핀을 가이드 구멍 제1열의 제1구멍에 부드럽게 고정시킴으로써 멤브레인을 스포팅한다. 핀을 DNA 플레이트에서 제거하기 전에 5를 셀 동안 핀을 멤브레인 상에 고정시킨다.
이전 단계를 제1열의 제2 및 제3구멍에서 반복한 후, 제2 DNA 트레이로 바꾸고, 핀을 주입한다. 가이드 구멍 제2열의 제1 내지 제3가이드 구멍을 이용하여 이전 두 단계를 반복한다. 제3 DNA 트레이로 바꾸고, 핀을 주입한다. 다시 한번, 가이드 구멍 제3열의 제1 내지 제3구멍을 이용하여 이전 단계를 반복한다. 이미 완료된 주입을 제외하고, 나머지 멤브레인도 이러한 단계를 수행한다. 모든 멤브레인을 공기건조 시키고, 다음 날까지 두 장의 3 mm 종이 사이에 멤브레인을 보관하고, 보관 전에 핀을 다시 세척한다.
마크로어레이 실험에서 사용하기 위한 RNA 32P 표지
10 uL의 MILLI Q 멸균수(sterile water)에 5 μg의 RNA를 투입한다(최종 부피 10 μL). 그 다음, 6 μL의 T23ACG 고정 프라이머 혼합물(anchored primer mix, 100 pmol/μL)를 투입하고, 부드럽지만 완전히 혼합한다. 각 반응에서 T23ACG 고정 프라이머 혼합물을 제조하기 위하여 프라이머 (3μL), dNTP (1.5 μL), 및 dCTP (40 μM) (1.5 μL)를 사용한다. dNTP에 대하여, 등체적(equal volumes)이 10 mM인 각각의 dATP, dGTP 및 dTTP를 혼합한다. 그 다음, 72°C에서 10분 동안 배양한다. 2분 동안 얼음 위에서 냉각한다. 응축물을 원심분리(spin down)한다. 배양하는 동안, 각 반응에서 다음의 혼성화 혼합물을 제조한다: 5x 역전사효소(Reverse transcriptase, 5 μL); 0.1 M의 DDT (3 μL); RNA 분해효소 억제제(RNAse inhibitor, 1 μL); 및 32P dCTP (2 μL).
10 분이 지나고, 시료가 냉각되고, 원심분리된 후, 11 μL의 혼성화 혼합물을 각각의 반응에 투입하고, 42°C에서 2분 동안 배양한다. 그 다음, 각각의 반응에 1.5 μL의 Superscript II 역전사효소(200 U/μL)를 투입하고, 부드럽게 혼합한다. 42°C에서 2시간 동안 배양한다. 이는 전날(예를 들면, 12 내지 24 시간 전) 스포팅한 마크로어레이 멤브레인에서 DNA를 변성시키기 바람직한 시간이다. 큰 타파웨어 용기에 변성 완충액(denaturing buffer, DB)를 붓는다. 겹치지 않고 충분히 잠길 수 있도록 완충액 내에 멤브레인을(DNA가 위로 오도록) 배치한다. 멤브레인을 10분 동안 DB로 옮겨놓는다. 10분 후, 상기에서 언급한 바와 동일한 방법으로 멤브레인을 중수 배치(batch)로 옮긴다. 박스를 10 분 동안 타원형 혼합기(elliptical shaker)에 배치한다. 멤브레인을 600 mL 이하의 중화 완충액(neutralizing buffer, NB)으로 옮기고, 동일한 혼합기에 10 분 이상 배치한다. 멤브레인을 중수로 옮기고, 멤브레인에서 NB를 씻어내기 위하여 10분 동안 혼합한다. 멤브레인을 3 mm 종이 위에서 공기 건조한다. 일단 건조되면, 혼성시까지 멤브레인을 두 장의 3 mm 종이 사이에 보관한다.
일단 42°C에서 2시간 동안 배양이 완료되면, 0.1 M의 멸균 NaOH 15 mL를 투입하고, RNA를 가수분해시키기 위하여 튜브를 70°C에서 20분 동안 배양한다. 20분 후, 반응을 중화시키기 위하여 0.1M의 멸균 HCl 15 μL를 투입한다. 간단하게 볼텍싱(vortexing)을 하고, 아랫부분을 분리하고, 3000 rpm에서 1분 동안 저온의 원심분리기 또는 베크만(Beckman)의 냉장 원심분리기를 이용하여 회전시켜 G50 컬럼을 준비한다. 조심스럼게 컬럼을 새로운 에펜돌프(Eppendorf) 튜브에 배치하여, 레진(resin)을 방해하지 않도록 한다. 천천히 32P가 표지된 cDNA을 직접 레진에 투입한다(60 μL).
그 다음, 동일한 원심분리기를 이용하여 3000 rpm에서 2분 동안 컬럼을 회전시키고, 에펜돌프로부터 컬럼을 제거한다. 이를 혼합하기 위하여 병류(flow-through)를 움직임으로써, 어떠한 시료도 분홍색이 되지 않도록 한다. 이는 과도한 동위원소가 제거되지 않았다는 신호이기 때문이다. 시료의 부피가 달라지거나 또는 방사능 용리(elution) 이전에 에펜돌프가 교환되지 않은 경우, 마이크로콘 원심분리기(MICROCON Centrifugal filter devices; MILLIPORE, Billerica, MA)가 시료를 농축시키기 위하여 사용될 수 있다. 이는 부피 차이가 큰 경우(100uL 이상의 차이가 나는 경우 또는 필요하다고 보여지는 경우)에만 필수적이다. 1 μL의 각각의 병류 튜브를 2 mL 의 신틸레이션 용액(scintillation fluid, 방사선 고체폐기물에 의하여 레피페테(repipette)로부터 얻음)을 포함하는 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 투입한다(단순히 방사능을 포함하는 모든 팁(tip)에 투입함). 뚜겅을 닫고, 볼텍스(vortex)를 이용하여 각각의 신틸레이션 바이알을 혼합한다.
신틸레이션 리더기(scintillation reader)에서 프로그램 6 슬라이드(program 6 slide)를 사용하여 실행한다(주 메뉴>자동 카운팅: 선택). 신틸레이션 리딩(scintillation readings)의 농도를 확인하고, 허용가능한 경우 50 μL의 COT-1 DNA(1 μg/uL) 및 5 μL의 Poly-A DNA(2 μg/L)를 투입한다. 그 다음, 다음과 같은 혼합물을 준비한다: 4x SSC(44 μL의10x 필터된-SSC); 중수(45 μL); 및 0.1% SDS (1μL 10% 필터된-SDS). 각각의 튜브에 90 μL의 혼합물을 투입하고, 볼텍스를 이용하여 혼합하고, 입자를 원심분리시키고, DNA를 변성시키기 위하여 95°C에서 5분 동안 배양하고, 65°C에서 2시간 동안 가수분해한다.
이는 멤브레인을 제조하기에 바람직한 시간이다. 먼저, 멤브레인을 물에 담그고, 롤 내부에서 DNA와 함께 말아 올린다. 상응하는 예열된 혼성화 병(hybridization bottle)에 투입한다. 10 mL의 65° 쳐치(CHURCH) 완충액을 투입하고, 천천히 완충액을 멤브레인 위로 굴러가게함으로써, 멤브레인 아래에 공기방울이 생겨 멤브레인의 건조를 촉진하는 것을 방지한다. 혼성화 혼합물이 준비될 때까지 로테이팅 혼성화 오븐(rotating hybridization oven)에 반응을 배치한다. 200 μL의 적절한 혼성화 혼합물을 각각의 튜브에 투입하고, 즉시 혼성화 오븐에 다시 넣고, 밤새 배양한다.
1L의 세척용액 1 및 3, 2L의 세척용액 2을 준비하고, 수조에서 65°C로 예열한다. 일단 멤브레인이 16 내지 24 시간 동안 혼성화가 되면, 병을 혼성화 오븐에서 꺼내고, 혼성화 혼합물을 큰 방사능 폐기물 비커(모든 폐기물은 허가된 10L의 방사능 안정 폐기물 저그(jugs)로 옮겨지고, 페기물 로그 시트(waste log sheet)에 올바르게 기록되기 때문에 이러한 비커는 일시적으로 폐기물을 보관하기 위하여 사용됨)에 붓고, 약 50 내지 100 mL의 세척용액 1을 투입하고, 병뚜껑을 다시 닫고, 씻어내기 위하여 멤브레인을 혼합(shake)하고, 세척용액을 버리고, 병의 1/4 내지 1/3에 세척용액 1을 투입하고, 단단히 뚜껑을 닫은 병을 혼성화 오븐으로 다시 넣고, 15분 동안 배양한다. 15분이 지나면, 완충액을 버리고, 동일한 양의 세척용액 2를 투입하고, 15분 동안 배양한다. 세척용액 3을 이용하여 세척 단계를 반복한다.
일단 세척 단계가 완료되면, 멤브레인을 병의 상단부분으로 옮기기 위하여 혼합기(shaking)를 사용한다. 멤브레인을 제거하기 위하여 겸자를 사용하고, DNA가 위로 오도록 중수가 든 타파웨어로 옮겨 SDS를 씻어낸다. 잠시 멤브레인을 블롯하고, 한 장의 3 mm 종이에서 건조하고, 두 장의 사란 랩(saran wrap) 사이에 최대로 똑바로 정렬시킨다. 멤브레인을 배열하기 위하여 줄이 있는 한 장의 종이를 사용하는 것이 바람직하고, 뿐만 아니라 두 쌍의 겸자를 사용하는 것이 바람직하다. 멤브레인을 포스포이메이저 카세트에 약 3일 간 노출시킨다. 멤브레인을 필름 카세트로 옮기고, 각각의 멤브레인 세트에 대한 데이터의 하드카피(hard copy)를 생성한다.
마크로어레이 데이터의 캡쳐
2 내지 3일 동안 멤브레인에 노출된 포스포이메이저 카세트를 스크린한 후, STORM 포스포이메이저를 이용하여 그 결과를 .gel 파일로 Ransoshared 상의 MACROARRAY폴더에 저장함으로써, 결과 이미지를 스캔한다. 일단 스캔이 완료되고 파일이 저장되면, 데이터를 캡쳐하기 위하여 파일을 IMAGEQUANT에서 연다. “preference” 풀 다운 메인 메뉴(pull down main menu)에서 선호하는 설정을 체크함으로써 시작한다. “Grid Column Major”는 체크되지 않아야 하고, “volume report settings”으로 생성된 볼륨 리포트(volume report)를 위해 “name” 및 “sum above background”만이 선택되어야 하며, 디폴트 백그라운드 콜렉션(default background correction)은 “local median”로 설정되어야 한다.
그 다음, 풀 다운 “view” 메뉴(pull down “view” menu)로부터 “Gray scale color adjustment”를 선택한다. 모든 스폿이 과도하게 노출되지 않고 시각화될 때까지 색상을 맞춘다-모든 스폿은 주변 스폿으로부터 독립적이다. “object” 풀 다운 메뉴(“object” pull-down menu)로부터 “grid”를 선택한다. 열린 창에 24개의 열 및 36개의 행을 입력한다. 각 그리드(grid) 영역의 중심에 하나의 스폿이 위치할 수 있도록 그리드를 하나의 멤브레인으로 끌어당긴다. 멤브레인이 정확하게 배열되지 않은 경우, 전체 그리드를 회전시키기 위하여 화살표 키 또는 회전 툴+쉬프트 키를 이용하여 약간의 조절을 할 수 있다.
일단 모든 스폿이 그리드 영역의 중심에 위치하면, “analysis” 풀 다운 메뉴(“analysis” pull down menu)에서 “background correction”을 선택한다. “Local Median”을 선택하고 창을 닫는다. “analysis” 메뉴에서 “Volume Report Settings”을 선택하고, “Name” 및 “Sum above background”만을 체크한다. “analysis” 메뉴에서 “Volume Report”를 선택한다. “display report”를 선택한다. 열린 창을 닫고, 마이크로소프트 엑셀 파일을 열 것 인지를 묻는 질문이 나타난 창에서 yes를 선택한다. 일단 엑셀에서, 컬럼 타이틀즈-네임(column titles-name) 및 썸 어보브 백그라운드(sum above background)를 삭제한다. “File” 메뉴에서 “save copy as”를 선택하고 *.cvs 형식으로 적절한 하위 폴더에 저장한다. 화살표 키를 이용하여, 그리드를 다음 멤브레인으로 이동시킨다. 남은 모든 멤브레인에 대하여 이전 단계를 반복한다. 일단 모든 데이터가 캡쳐되면, *.tiff형식으로 *.gel 파일로 저장한다. 포토샵 에디터(Photoshop Editor)에서 *.TIFF를 열고, 각각의 독립적인 멤브레인의 *.JPEG를 *.TIFF 파일로 저장한다.
본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자는 개선, 변화 및 수정을 예상할 것이다. 이러한 개선, 변화 및 수정은 당업자에게 자명하고, 하기 첨부된 청구항에 의해 포함될 수 있다.

Claims (15)

  1. 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및
    적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량을 결정하는 단계;
    를 포함하고, 대조군과 비교하여 상기 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자 (IRG) 및/또는 이의 변이체의 증가 또는 감소된 발현은 피험자가 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 저반응함을 나타내는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β)의 치료 효능을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood)을 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β)의 치료 효능을 결정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 전혈로부터 RNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β)의 치료 효능을 결정하는 방법.
  4. 제1항에서 있어서, 상기 생물학적 시료를 채취하는 단계 전에 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β) 의 치료 효능을 결정하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인터페론-베타(IFN-β)를 투여한 후 12 시간 내에 상기 생물학적 시료를 채취하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자에서 인터페론-베타(IFN-β)의 치료 효능을 결정하는 방법.
  6. 인터페론-베타(IFN-β) 치료에 대하여 저반응군인 피험자 유래의 말초혈액단핵구세포(PBMCs)를 제공하는 단계;
    상기 말초혈액단핵구세포(PBMC)에 약제를 투약하는 단계; 및
    하나 이상의 상기 말초혈액단핵구세포(PBMCs)에서 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량을 결정하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 치료에 사용될 수 있는 약제의 스크린 방법.
  7. 제6항에 있어서, 대조군과 비교하여 상기 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 증가 또는 감소된 발현은 상기 약제가 다발성 경화증(MS) 치료용 후보물질이 아님을 나타내는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 치료에 사용될 수 있는 약제의 스크린 방법.
  8. 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
    적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량을 결정하는 단계; 및
    대조군과 비교하여 상기 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 하나 이상의 발현이 증가하거나 감소할 경우에 인터페론-베타(IFN-β) 외에 적어도 하나의 약제를 치료효과를 보이는 용량으로 피험자에게 투여하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법
  9. 제8항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈을 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전혈로부터 RNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 생물학적 시료를 채취하는 단계 전에 피험자에게 인터페론-베타(IFN-β)를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인터페론-베타(IFN-β)를 투여한 후 12 시간 내에 상기 생물학적 시료를 채취하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
  13. 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
    적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량을 결정하는 단계; 및
    대조군과 비교하여 상기 적어도 하나의 인터페론이 조절된 유전자(IRG) 및/또는 이의 변이체의 발현량이 증가 또는 감소할 경우에 나탈리주마브(natalizumab)를 치료효과를 보이는 용량으로 피험자에게 투여하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈을 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 전혈로부터 RNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증(MS) 피험자를 치료하는 방법.
KR1020137001149A 2010-06-18 2011-06-17 다발성 경화증 환자에서의 치료반응을 예측하는 방법 KR20130036046A (ko)

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3063297A1 (en) * 2013-11-01 2016-09-07 Yissum Research Development Company of The Hebrew University of Jerusalem Ltd. Diagnostic methods and kits for determining a personalized treatment regimen for a subject suffering from a pathologic disorder
US10675589B2 (en) * 2015-10-14 2020-06-09 Novozymes A/S Cleaning of water filtration membranes
CN108304912B (zh) * 2017-12-29 2020-12-29 北京理工大学 一种运用抑制信号实现脉冲神经网络监督学习的系统和方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE320606T1 (de) * 2002-05-29 2006-04-15 Charite Universitaetsmedizin Verfahren zur identifizierung von auf ifn-beta ansprechenden multiple sklerose patienten, durch die bestimmung der expression von trail
WO2005108610A2 (en) * 2004-04-05 2005-11-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for the selection of subjects for multiple sclerosis therapy
US20100209914A1 (en) * 2007-05-25 2010-08-19 Ore Pharmaceuticals , Inc. Methods, systems, and kits for evaluating multiple sclerosis
EP2009440A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-31 Vereniging voor christelijk hoger onderwijs, wetenschappelijk onderzoek en patiëntenzorg Means and methods for classifying samples of multiple sclerosis patients.
CA2737486A1 (en) * 2008-09-16 2010-03-25 Bayer Healthcare Llc Interferon response in clinical samples (iris)

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