KR20130031008A

KR20130031008A - 홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130031008A
Application number: KR1020110094652A
Authority: KR
Inventors: 강다원; 성낙주; 신정혜; 한재희
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-03-28

Abstract

본 발명은 대식세포주에서 LPS에 의해 유도되어지는 NO의 생성을 감소시킬 수 있는 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 상기 홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품첨가용 조성물 및 홍마늘 추출물을 포함하는 대식세포 또는 생체내에서 NO의 생성을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 대식세포내에서 NO의 생성을 억제하는 효과를 나타내므로 염증성 질환의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating inflammatory disease comprising extract of aged red garlic}

본 발명은 홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 및 홍마늘 추출물을 포함하는 대식세포 또는 생체내에서 NO의 생성을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.

통상적으로, 염증은 감염 또는 조직손상에 대한 국소적인 방어 보호반응으로 정의될 수 있는데, 증상적으로는 감염되거나 손상된 조직에 국소적으로 혈관벽이 확장되어 혈류량이 증가하고, 증가된 혈류량으로 인하여 과도하게 공급된 혈액성분이 확장된 혈관벽을 통하여 조직으로 유입되며, 유입된 혈액성분에 포함된 각종 면역세포로 인하여 손상된 조직을 제거하고, 새로운 조직의 재생을 촉진하는 일련의 과정을 의미한다. 상기 염증을 유발하는 염증반응은 감염 또는 조직손상에 의하여 유발되는 다양한 비특이적 반응결과들이 복합적으로 작용하여 도출되는 것으로 알려져 있다.

상기 염증은 생체의 중요한 방어기작의 하나이지만, 사이토카인과 같은 염증매개물질과 같이 상기 염증반응에 관여하는 인자들이 정상적으로 조절되지 않을 경우에는 과도한 염증반응으로 인하여 질환(염증성 질환)이 유발될 수 있다. 상기 염증반응에 관여하는 인자로는 브라디키닌(bradykinin), 산화질소(Nitric oxide, NO), NOS 등의 다양한 물질이 알려져 있다.

이 중, 브라디키닌은 염증 반응이 발생할 경우에 과다하게 분비생성되는데, 다형핵 백혈구, 대식세포, 내피세포, 윤활막 조직(synovial tissue) 등의 세포의 표면에 존재하는 그의 수용체를 활성화 시켜서, PGE2, PGI2, LTs(leukotrienes), 히스타민, PAF, IL-1, TNF와 같은 다양한 염증반응 매개체의 분비를 유도하고, 이에 의하여 분비된 다양한 염증반응 매개체들은 프로스타글란딘을 합성하는 효소인 phosphololipase A2와 cyclooxygenase를 활성화시키며, 대사효소인 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase를 억제하여 프로스타글란딘의 작용을 증가시킴으로써, 결과적으로는 생체내에서 부종, 통증, 조직의 기능 소실 등을 유발한다. 또한, NO는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 아르기닌으로부터 생성되고, 대식세포(macrophage)의 세포독성활성(cytotoxic activity)을 유발하여 면역기능을 유지시키는 반면, 류마티스 관절염 같은 염증반응 매개 질환을 악화시키기도 하며, 그 외에도 혈관확장, 신경전달, 혈액응고 등의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

아울러, NO를 생성하는 NOS는 cNOS(constitutive NOS)와 iNOS(inducible NOS)로 구분될 수 있다. 먼저, cNOS는 칼슘-칼모듈린 의존적으로 평상시에도 활성화되어 지속적으로 NO를 생성하여 체내의 항상성을 유지하는데 대체로 신경(neuronal), 혈관내피(endothelial) 등에 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, iNOS는 칼슘-칼모듈린 비의존적이고, IFN-γ, IL-1, TNF-α 등의 사이토카인이나 박테리아의 LPS(lipopolysaccharide) 등에 의해 활성화되고, 연개반응을 통해 장시간 동안 대량의 NO를 생성하는데, 대체로 대식세포(macrophage)와 간세포(hepatocytes) 등에 존재하는 것으로 알려져 있다.

상술한 염증반응에 관여하는 인자의 세포내 수준을 조절하여 염증성 질환을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 초기에는 화학적 물질을 이용하여 상기 인자들의 세포내 수준을 조절하고자 하였으나, 부작용이 심하다는 단점이 있어, 최근에는 부작용이 없거나 매우 낮은 수준으로 나타나는 천연물 유래의 물질을 이용하여 상기 인자들의 세포내 수준을 조절하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자는 홍마늘 추출물이 Nfr-2(Nuclear factor-erythoid 2-related factor 2)발현의 자극에 의해 HO-1의 발현을 증가시키고, 이에 따라 대식세포주에서 LPS에 의해 유도되어지는 NO의 생성을 감소시킴으로써, 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 홍마늘 추출물을 포함하는 대식세포 또는 생체내에서 NO의 생성을 억제하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 실시양태로서, 본 발명은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 홍마늘은 기존의 생마늘을 특정조건 및 특정시간 동안 숙성시킴으로써 생마늘 특유의 냄새 및 매운 맛을 개선시킨 적갈색을 띄는 중간숙성 마늘로서 하기의 방법으로 제조되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 각각의 생마늘 조각들을 400W-600W의 전자레인지에서 5분간 가공한 후, 스테인레스 스틸 팬을 사용하여 마늘이 위치하는 높이가 아래로부터 4cm 미만이 되도록 고정하였다. 그 후, 팬을 인큐베이터에 넣은 후 90℃의 온도, 60%의 습도에서 24시간 동안 숙성하였다. 24시간 후, 온도와 습도를 각각 50℃, 50%로 감소시킨 후 마늘 조각들을 30시간 동안 더 숙성하였다. 이후, 12시간동안 50℃, 30시간동안 5℃, 36시간동안 70℃의 온도에서 더 숙성하였다. 숙성한 후, 30분내 온도를 40℃로 낮추고난 후 다시 30시간 동안 숙성과정을 진행하여 홍마늘을 제조하였다(실시예 1).

본 발명은 홍마늘로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 홍마늘 추출물을 얻기 위한 추출방법 역시 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 생마늘로부터 제조된 홍마늘을 열수, 무기용매 또는 유기용매 추출을 통해 홍마늘 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명의 홍마늘 추출물을 무기용매를 사용하여 추출하는 경우, 제조된 홍마늘의 껍질을 벗기고 으깬 후, 10배 부피의 증류수와 혼합하고, 60℃ 이상, 바람직하게는 70℃ 이상의 온도에서 7시간 이상, 바람직하게는 8시간 이상 가열하고, 가열된 혼합물을 여과하여 추출할 수 있다. 이때, 70℃보다 높은 온도에서 가열하는 경우 시간은 줄어들지만 유효성분이 파괴되어 손실될 수 있고, 60℃ 보다 낮은 온도에서 가열하게 되면 혼합물의 유효성분이 완전 추출되지 않을 수 있다.

또한, 본 발명의 홍마늘 추출물을 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출 유기용매도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올, 아세톤, 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 1,3-부틸렌글리콜을 이용하여 실온에서 또는 가온하여 추출할 수 있다.

최종 추출물은 부유하는 고체입자를 제거하기 위하여 나일론 등의 필터를 이용하거나 냉동여과법에 의해 여과시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 홍마늘 추출물에 포함되는 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 홍마늘 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

바람직하게는, 상기 홍마늘 추출물은 대식세포 또는 생체내에서 NO의 수준증가를 억제하는 효과를 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, LPS에 의하여 세포내 및 생체내에서 NO의 수준이 증가되지만, 이는 본 발명의 홍마늘 추출물에 의해 유도되는 iNOS 발현 억제 및 HO-1 활성화에 의하여 억제될 수 있으므로(실시예 4, 5, 7 및 8), 생체내에서 유도될 수 있는 염증성 질환을 본 발명의 홍마늘 추출물을 포함하는 조성물이 예방 또는 치료할 수 있다. 이러한 홍마늘 추출물의 항염증 표과는 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었으며, 나아가 본 발명의 홍마늘 추출물이 생마늘 및 흑마늘에 비해 우수한 항염증 효과가 있음 또한 확인하였다(도 1의 C).

본 발명의 염증성 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, NO의 생성에 의하여 유발되는 질환이 될 수 있고, 바람직하게는 천식, 급성 비염, 알레르기성 비염, 위축성 비염, 만성 비염, 막형 비염, 계절성 비염, 사르코이드증, 농부의 폐(farmer's lung), 섬유질 폐, 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonia), 류머티스 관절염, 베체트 질환(Behcet's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 아토피 피부염, 접촉 피부염, 습진 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선(Lichen planus), 천포창(Pemphigus), 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 두부종(angiodermas), 혈관염(vasculitides), 홍반, 피부 호산구다증, 포도막염, 봄철 결막염, 복강내 질환(Coeliac disease), 직장염, 호산구성 위장염, 췌장염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 홍반성 낭창, 하시토모 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis) 등이 될 수 있다. 상기 염증성 질환은 모두 체내에서 NO 수준의 증가를 수반하므로, 세포내 및 체내에서 NO의 증가를 억제할 수 있는 본 발명의 홍마늘 추출물은 상술한 바와 같은 다양한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물은 염증성 질환을 앓고 있는 개체에게 투여함으로써 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 용어, "개체"란 염증성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

이때, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

아울러, 본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 홍마늘 추출물을 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품첨가하여 건강기능식품을 제조할 수 있는데, 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강 식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다. 이때, 첨가하는 방법은 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용되고, 첨가량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 본 발명의 건강기능식품은 홍마늘 추출물 이외의 다양한 성분을 추가로 포함할 수도 있는데, 이들 다양한 성분은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 될 수 있다. 뿐만 아니라, 기호성 및/또는 기능성을 부가하기 위하여 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 홍마늘 추출물을 포함하는 대식세포 또는 생체내에서 NO의 생성을 억제하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 NO는 생체내에서 산화질소 합성효소(NOS)에 의해 아르기닌으로부터 생성되고, 류마티스 관절염 같은 염증반응 매개 질환을 악화시키기도 하며, 그 외에도 혈관확장, 신경전달, 혈액응고 등의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 적어도 지금까지 알려진 염증성 질환의 발병시에는 NO의 수준증가가 반드시 수반되므로, 생체내에서 NO의 수준을 감소시킬 경우에는 염증성 질환의 발병이 예방되거나 또는 발병된 염증성 질환이 치료될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, LPS에 의하여 세포내 및 생체내에서 NO의 수준이 증가되지만, 이는 본 발명의 홍마늘 추출물에 의해 유도되는 iNOS 발현 억제 및 HO-1 활성화에 의하여 억제될 수 있으므로(실시예 4, 5, 7 및 8), NO의 수준 증가에 의하여 생체내에서 유도될 수 있는 염증성 질환을 본 발명의 홍마늘 추출물이 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 대식세포 및 생체내에서 NO의 생성을 억제하는 본 발명의 홍마늘 조성물은 염증성 질환들의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 대식세포내에서 NO의 생성을 억제하는 효과를 나타내므로 염증성 질환의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 Raw 264.7 대식세포에서 LPS-유도 NO 생성에 대한 ARGE의 효과를 나타내는 도면으로서, A 및 B는 대식세포 생존 능력에 대한 LPS 및 마늘 추출물의 세포 독성 효과를 나타내는 그래프이고, C는 ARGE 처리에 의한 LPS-유도 NO 생성의 저해효과를 나타내는 그래프이며, D는 LPS-유도 iNOS 상승 조절에 대한 ARGE의 저해 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 LPS-유도 HO-1 인덕션에 대한 ARGE의 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진으로서, A는 LPS-유도 HO-1 인덕션 결과를 나타내고, B는 시간-의존적 방식으로 ARGE 처리에 의한 HO-1 인덕션 결과를 나타내며, C는 투여량-의존적 방식으로 ARGE 처리에 의한 HO-1 인덕션 결과를 나타내고, D는 ARGE 처리에 의한 LPS-유도 HO-1 인덕션의 상승 조절결과를 나타내며, E는 ARGE 처리에 의한 Nrf-2 활성화 결과를 나타낸다.
도 3. HO-1 활성에 대한 ARGE의 효과를 나타내는 도면으로서, A는 LPS-유도 NO 생성에 대한 ZnPP의 효과를 나타내는 그래프이고, B H&E 염색에 의한 폐 조직의 조직학적 분석결과를 나타내는 현미경 사진이며, C는 LPS-유도 TNF-α 생성에 대한 ARGE의 효과를 나타내는 그래프이고, D는 식염수, LPS-, 및 LPS+ARGE-처리 생쥐에서 iNOS 발현량의 변화를 나타내는 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 홍마늘 추출물( aged red garlic extract , ARGE)의 제조

생마늘 조각들을 400W-600W의 전자레인지에서 5분간 가공한 후, 스테인레스 스틸 팬을 사용하여 마늘이 위치하는 높이가 아래로부터 4cm 미만이 되도록 고정하였다. 그런 다음, 상기 팬을 인큐베이터에 넣은 후 90℃의 온도, 60%의 습도에서 24시간 동안 1차 숙성시켰다. 이어, 온도와 습도를 각각 50℃, 50%로 감소시킨 후 마늘 조각들을 30시간 동안 2차 숙성시켰다. 아울러, 12시간동안 50℃, 30시간동안 5℃, 36시간동안 70℃의 온도에서 3차 숙성시켰다. 끝으로, 30분내 온도를 40℃로 낮추고 다시 30시간 동안 4차 숙성시켜서 홍마늘을 제조하였다.

한편, 생마늘(FRG), 흑마늘(ABG, Aged black garlic) 또는 홍마늘(ARGE)를 박피시키고 분쇄하였다. 이때, 흑마늘은 공지된 방법에 따라 제조하였다(특허등록 제886463호). 분쇄된 각 마늘 100g에 각각 증류수 1L를 가하고, 70℃에서 8시간동안 추출한 다음, 이를 여과하여 추출액과 잔사를 분리하였다. 그런 다음, 상기 잔사를 이용한 동일한 방법을 3회 수행하여 추출액을 수득한 다음, 이들 추출액을 혼합하였다. 이어, 상기 혼합 추출액을 와트만 필터 페이퍼(Grade No. 2, Whatman International Ltd, Kent, UK)에 여과 및 동결-건조한 다음, 분쇄하여 분말형태의 추출물을 각각 제조하였다.

실시예 2: LPS 및 다양한 마늘 추출물의 세포 독성 확인

먼저, RAW 264.7 대식세포는 10% FBS, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL)을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에서 배양하고, 상기 배지를 2일에 한번씩 교체하였다.

다음으로, MTT 검사법을 이용하여 RAW 264.7 세포에서 LPS 및 ARGE의 세포 독성을 조사하였다. 구체적으로, 지수기 상의 RAW 264.7 대식세포를 24 웰 플레이트에 4x10⁴cells/ml의 농도로 접종하였다. 이어, LPS(0.01 내지 10 μg/mL) 또는 상기 실시예 1에서 제조한 각 마늘의 추출물(0.01 내지 1%)을 처리하고 24시간이 경과한 다음, 20μl의 MTT 용액(5 mg/ml)을 각 웰에 가하고 4 시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, 200μl DMSO를 각 웰에 가하여 각 웰의 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 다음, 상기 웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 적용하여, 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다(도 1의 A 및 B). 도 1의 A 및 B는 대식세포 생존 능력에 대한 LPS 및 마늘 추출물의 세포 독성 효과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 1의 A 및 B에서 보듯이, RAW 264.7 대식세포에 다양한 농도의 LPS 또는 마늘 추출물을 처리하여도, 상기 세포의 생존율은 거의 영향받지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: LPS 및 다양한 마늘 추출물이 NO 의 수준에 미치는 영향

RAW 264.7 대식세포 배양용 배지에 축적된 아질산염의 농초를 측정하여, 상기 배지에서 생성되는 NO의 수준을 간접적으로 산출하였다. 이때, 상기 배지에 축적된 아질산염의 농도는 공지된 Griess 방법으로 측정하였다.

구체적으로, RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 상기 실시예 1에서 제조한 각 마늘의 추출물로 2시간 동안 처리한 다음, 24시간동안 LPS를 1μg/mL의 농도로 처리하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상등액을 수득하고, 상기 상등액과 동일부피의 Griess 시약(1% 설파닐아마이드, 0.1% N-1-나프틸레틸렌디아민 디하이드로클로라니드, 및 2% 인산)을 혼합하고, 10분동안 반응시킨 다음, 550nm에서 반응물의 흡광도를 측정하였으며, 측정값을 표준곡선에 적용하여 아질산염의 농도를 산출하였다(도 1의 C). 이때, 대조군으로는 어떠한 LPS 및 마늘추출물이 전혀 처리되지 않은 그룹과 LPS와 NOS의 저해제로 알려진 디페닐렌아니오도니엄(DPI)을 동시에 처리한 그룹을 사용하였다. 도 1의 C는 ARGE 처리에 의한 LPS-유도 NO 생성의 저해효과를 나타내는 그래프이다. 도 1의 C에서 보듯이, LPS 처리는 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성을 현저하게 증가시켰고, 생마늘 추출물은 LPS 처리에 의하여 증가된 NO의 수준에 거의 영향을 미치지 못하였으나, ARGE는 흑마늘 추출물에 비해 LPS 처리에 의하여 증가된 NO의 수준을 현저히 감소시키는 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 4: ARGE가 NOS 의 발현수준에 미치는 영향

상기 실시예 3의 결과로부터 본 발명의 ARGE가 LPS에 의하여 유도된 NO의 생성을 저해함을 확인하였으므로, 상기 NO의 생성을 저해하는 효과가 NO를 합성하는 iNOS의 발현수준을 저해함에 의한 것인지의 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 상기 ARGE(0.1 또는 1%)를 2시간 동안 처리한 다음, 24시간동안 LPS를 1μg/mL의 농도로 처리하여 반응시켰다. 반응이 종료된 세포에 단백질 추출 용액(50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM 디티오트레톨 (DTT), 0.5% 노닐 페녹실폴리에톡실에탄올 (NP-40), 1% Triton X-100, 1% 디옥시콜레이트, 0.1% 소디엄 도데실 설페이트 (SDS), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 1 μM 류펩틴, 1 μM 펩스타틴 A, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 0.1 μM 아프로티닌)(PRO-PREPTM, iNtRON Biotechnology Inc, 성남, 한국)을 가하고, 간혹적으로 볼텍싱하면서 30분간 항온처리하여 세포를 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물을 4℃에서 20분간 13,000 rpm(16,609 × g; Micro 17TR, 한일, 한국)에서 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액으로 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-iNOS 단클론 항체(1:1000 희석; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체(1:10,000 희석)를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포에서 발현된 iNOS의 수준을 측정하였다(도 1의 D). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체(1:10,000 희석)를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 1의 D는 LPS-유도 iNOS 상승 조절에 대한 ARGE의 저해 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 1의 D에서 보듯이, 대식세포에 LPS만 처리될 경우에는 iNOS가 발현되어 그의 수준이 증가하였으나, ARGE의 처리양이 증가할 수록 이에 반비례하여 iNOS의 수준이 감소됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 ARGE의 NO의 생성저해 효과는 ARGE가 NO를 합성하는 iNOS의 발현수준을 저해함에 의하여 유발된 것임을 확인하였다.

실시예 5: 대식세포에서 LPS 및 ARGE가 HO -1 발현에 미치는 영향

실시예 5-1: LPS 가 HO -1 발현에 미치는 영향

RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 1μg/mL의 LPS를 0.08 내지 8시간동안 처리하면서 배양하였다. 배양된 세포를 상기 실시예 4의 방법에 적용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-HO-1 다클론 항체(1:1000 희석; Biovision, Mountain View, CA, USA) 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포에서 발현된 HO-1의 수준을 측정하였다(도 2의 A). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 2의 A는 LPS-유도 HO-1 인덕션 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진이다. 도 2의 A에서 보듯이, LPS의 처리에 의하여 HO-1의 발현수준이 증가하였으나, LPS의 처리시간과 HO-1의 발현수준이 비례하지는 않음을 알 수 있었다.

실시예 5-2: ARGE의 처리시간이 HO -1 발현에 미치는 영향

RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 1%의 ARGE를 0.08 내지 24시간동안 처리하면서 배양하였다. 배양된 세포를 상기 실시예 4의 방법에 적용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-HO-1 다클론 항체 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포에서 발현된 HO-1의 수준을 측정하였다(도 2의 B). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 2의 B는 시간-의존적 방식으로 ARGE 처리에 의한 HO-1 인덕션 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진이다. 도 2의 B에서 보듯이, ARGE의 처리에 의하여 HO-1의 발현수준이 증가하였고, ARGE의 처리시간이 3시간 이상인 경우에는 ARGE의 처리시간과 HO-1의 발현수준이 비례하는 양상을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5-3: ARGE의 처리농도가 HO -1 발현에 미치는 영향

RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 0.01 내지 1%의 ARGE를 8시간동안 처리하면서 배양하였다. 배양된 세포를 상기 실시예 4의 방법에 적용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-HO-1 다클론 항체 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포에서 발현된 HO-1의 수준을 측정하였다(도 2의 C). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 2의 C는 농도-의존적 방식으로 ARGE 처리에 의한 HO-1 인덕션 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진이다. 도 2의 C에서 보듯이, ARGE의 처리농도와 HO-1의 발현수준이 대체로 비례하는 양상을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5-4: LPS 및 ARGE가 HO -1 발현에 미치는 영향

상기 실시예 5-1 내지 5-3의 결과로부터, LPS 및 ARGE가 각각 대식세포에서 HO-1 발현수준을 증가하는 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 LPS 및 ARGE를 함께 또는 개별적으로 처리할 경우 HO-1 발현수준에 어떠한 영향을 나타내는지를 확인하고자 하였다.

구체적으로, RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 1μg/mL의 LPS 또는 1%의 ARGE를 함께 또는 개별적으로 8시간동안 처리하면서 배양하였다. 배양된 세포를 상기 실시예 4의 방법에 적용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-HO-1 다클론 항체 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포에서 발현된 HO-1의 수준을 측정하였다(도 2의 D). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 2의 D는 LPS 및 ARGE 처리에 의한 HO-1 인덕션 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 2의 D에서 보듯이, LPS 및 ARGE는 각각 HO-1의 발현수준을 증가시켰고, LPS 및 ARGE를 함께 처리할 경우에는 HO-1의 발현수준을 상승조절하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 6: 대식세포에서 LPS 및 ARGE가 Nrf -2의 활성화에 미치는 영향

상기 실시예 5의 결과로부터, LPS 및 ARGE가 HO-1 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었으므로, 상기 HO-1 발현에 직접적으로 관여하는 Nfr-2(Nuclear factor-erythoid 2-related factor 2)의 활성화에 상기 LPS 및 ARGE가 관여하는지를 확인하고자 하였다.

구체적으로, RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, 1μg/mL의 LPS 또는 1%의 ARGE를 함께 또는 개별적으로 8시간동안 처리하면서 배양하였다. 배양된 세포로부터 핵 분획과 세포질 분획을 각각 분리하고, 분리된 핵 분획과 세포질 분획을 각각 상기 실시예 4의 방법에 적용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-핵인자-적혈구 2-관계인자 2(Nrf-2) 단클론 항체(1:1000 희석; Santa Cruz, CA, USA) 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포의 핵 분획 및 세포질 분획에서 발현된 Nrf-2의 수준을 각각 측정하였다(도 2의 E). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 2의 E는 LPS 및 ARGE 처리에 의한 Nrf-2 활성화 결과를 나타내는 웨스턴 블럿 분석사진이다. 도 2의 E에서 보듯이, 세포질 분획에서는 LPS가 단독으로 처리된 경우에만 Nrf-2가 세포질에 잔류함을 알 수 있었고, 핵 분획에서는 모든 실험군에서 Nrf-2가 핵에 존재함을 알 수 있었다. 상기 결과는 LPS만 처리한 경우에는 세포질에서 발현된 Nrf-2가 모두 핵으로 전달되지 않지만, ARGE를 LPS와 함께 또는 단독으로 처리한 경우에는 세포질에서 발현된 Nrf-2가 모두 핵으로 전달된다는 것을 의미하므로, 본 발명의 ARGE는 Nrf-2를 활성화시키는 것으로 분석되었다.

실시예 7: HO -1 활성 조절이 NO 생성에 미치는 영향

본 발명의 ARGE를 이용하여 HO-1의 발현정도를 조절할 경우, 이에 의하여 NO의 생성에 영향을 미치는지의 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, RAW 264.7 대식세포를 2x10⁴/웰의 농도로 96웰 플레이트에서 배양하고, 하룻밤동안 항온처리하였으며, HO-1의 활성을 촉진시키는 Hemin(10 내지 30μM), HO-1의 활성을 억제시키는 ZnPP(10 내지 30μM) 및 ARGE(1%)를 각각 단독으로 또는 조합하여 2시간 동안 처리한 다음, 24시간동안 LPS를 1μg/mL의 농도로 처리하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 실시예 3과 동일한 방법을 수행하여 아질산염의 농도를 산출하였다(도 3의 A). 이때, 대조군으로는 어떠한 LPS 및 마늘추출물이 전혀 처리되지 않은 그룹과 DMSO 만을 처리한 그룹을 사용하였다. 도 3의 A는 LPS-유도 NO 생성에 대한 ZnPP의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 3의 A에서 보듯이, LPS만 처리된 대식세포에서는 NO가 높은 수준을 유지하였으나, HO-1의 활성을 촉진시키는 Hemin을 처리할 경우에는 NO의 수준이 LPS가 처리되지 않았을 때의 수준으로 저하되고, HO-1의 활성을 억제시키는 ZnPP를 처리한 경우에는 LPS를 처리한 결과에 별다른 영향을 미치지 않았다. 또한, LPS와 ARGE가 함께 처리된 경우에는 LPS만 처리된 대식세포보다는 NO가 낮은 수준을 나타내었으나, 이에 HO-1의 활성을 억제시키는 ZnPP를 처리한 경우에는 LPS와 ARGE가 함께 처리된 경우보다는 상대적으로 NO가 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

상기 도 3의 A의 결과를 참조하면, 본 발명의 ARGE가 HO-1의 활성을 촉진시켜서 NO의 수준을 저하시키는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 실험동물을 이용한 ARGE의 항염증 효과 확인

실시예 8-1: LPS 및 ARGE가 처리된 실험동물의 제조

마우스(C57BL/6, 수컷, 5주령)를 1주일 동안 12시간 명암주기하에서 사육하여 순화시킨 다음, 1% ARGE(100μL/개체)가 포함되거나 또는 포함되지 않은 생리식염수를 경구투여하고, 2시간이 경과된 후에 생리식염수에 용해된 LPS(10 mg/kg)를 복강주사하였다. 이때, 대조군으로는 생리식염수만을 복강주사한 마우스를 사용하였다. 상기 LPS를 투여한 마우스로부터 혈액 및 폐조직을 수득하여 다음 실험에 사용하였다.

실시예 8-2: 조직학적 분석

상기 실시예 8-1에서 수득한 각 마우스의 폐조직을 대상으로 H&E 염색을 수행하였다. 구체적으로, 상기 수득한 폐조직에 4% 파라포름알데히드를 포함하는 0.1M PBS를 관류할 수 있는 튜브를 연결하여 4℃에서 하룻밤동안 관류시켰다. 관류된 폐조직을 세척하고, 5%, 20%, 및 30% 수크로스를 포함하는 0.1M PBS를 이용하여 항냉화시킨 다음, 상기 폐조직을 티슈-텍(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에 고정시켰다. 상기 고정된 폐조직을 급속동결시키고, 4 μm 두께로 박편화한 다음, 헤마톡실린으로 염색하였다. 염색된 박편을 상기 박편을 젤라틴 코팅된 슬라이드에 안치시키고 건조시켰으며, 건조된 박편을 헤마토자일린에 침지하고, 물방울을 떨어뜨려서 잔류하는 염색약을 제거하였다. 이어, 상기 박편을 에오신으로 3분동안 염색하고 70% 내지 100% 에탄올을 3분씩 가하여 상기 박편을 탈수시켰다. 탈수된 박편을 자일렌으로 세척한 다음, 커버슬립에 안치시켰다. 안치된 박편은 BX-51 현미경(Olympus, Tokyo, Japan) 및 고해상도 비디오 카메라(Camedia C-7070; Olympus, Tokyo, Japan)로 관찰하고, 이의 사진을 촬영하였다(도 3의 B). 도 3의 B는 H&E 염색에 의한 폐 조직의 조직학적 분석결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 3의 B에서 보듯이, LPS만을 처리한 마우스의 폐조직에서는 다량의 염증세포 침윤이 관찰된 반면, 아무것도 처리하지 않은 마우스의 폐조직인 대조군의 폐조직과, LPS 및 ARGE를 함께 처리한 마우스의 폐조직에서는 염증세포의 침윤이 전혀 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 ARGE는 LPS에 의하여 유도된 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 8-3: TNF -α 수준의 비교

상기 실시예 8-1에서 수득한 각각의 폐조직을 TNF-α ELISA 키트(BioSource; Camarillo, CA, USA)에 적용하여, 각 폐조직으로부터 TNF-α의 수준을 측정하였다(도 3의 C). 도 3의 C는 LPS-유도 TNF-α 생성에 대한 ARGE의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 3의 C에서 보듯이, 염증매개인자로 알려진 TNF-α는 LPS만을 처리한 마우스에서는 증가하였으나, LPS와 ARGE를 함께 처리한 마우스에서는 LPS만을 처리한 마우스보다는 감소된 수준을 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 ARGE가 LPS에 의하여 유도된 염증반응을 억제할 수 있음을 다시한번 확인하였다.

실시예 8-4: iNOS 발현량의 비교

상기 실시예 8-1에서 수득한 각 마우스의 폐조직으로부터 iNOS 발현량을 측정하고 상호 비교하였다.

구체적으로, 실시예 8-1에서 수득한 각 마우스의 폐조직을 실시예 4의 방법에 적용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 1차 항체인 항-iNOS 단클론 항체 및 2차 항체인 페록시다제-컨쥬게이티드 항-토끼 또는 항-생쥐 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여, 각 대식세포에서 발현된 iNOS의 수준을 측정하였다(도 3의 D). 이때, 내부대조군으로서 α-튜불린 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 3의 D는 식염수, LPS 및 LPS+ARGE 처리된 마우스에서 iNOS 발현량의 변화를 나타내는 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 3의 D에서 보듯이, 대조군에 비하여 LPS만 처리된 마우스의 폐조직에서는 iNOS의 수준이 증가된 반면, LPS와 ARGE가 함께 처리된 마우스의 폐조직에서는 iNOS의 수준이 LPS만을 처리한 마우스보다는 감소된 수준을 나타냄을 확인하였다.

상기 실시예 8-1 내지 8-4의 결과를 종합하면, 본 발명의 ARGE가 생체내에서 염증반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.

Claims

홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 홍마늘 추출물은 열수 추출된 것인 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 홍마늘 추출물은 대식세포 또는 생체내에서 NO의 수준증가를 억제하는 것인 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 천식, 급성 비염, 알레르기성 비염, 위축성 비염, 만성 비염, 막형 비염, 계절성 비염, 사르코이드증, 농부의 폐(farmer's lung), 섬유질 폐, 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonia), 류머티스 관절염, 베체트 질환(Behcet's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 아토피 피부염, 접촉 피부염, 습진 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선(Lichen planus), 천포창(Pemphigus), 수포성 천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 두부종(angiodermas), 혈관염(vasculitides), 홍반, 피부 호산구다증, 포도막염, 봄철 결막염, 복강내 질환(Coeliac disease), 직장염, 호산구성 위장염, 췌장염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 홍반성 낭창 및 하시토모 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
홍마늘 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
홍마늘 추출물을 포함하는 대식세포 또는 생체내에서 NO의 생성을 억제하기 위한 조성물.