KR20130025255A - Ｈｐｖ 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HPV 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법에 관한 것이다.

Description

ＨＰＶ 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법{A PROBE FOR IDENTIFYING HPV GENOTYPE AND A METHOD FOR IDENTIFYING HPV GENOTYPE}
본 발명은 HPV 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 자궁경부암 환자의 99.7%에서 HR (High Risk)-HPV DNA가 존재하며 이러한 HR-HPV 감염의 존속이 침윤성 자궁경부암, 자궁경부 전암으로의 전이를 일으키는 것으로 알려져 있다. 자궁경부암의 경우 전 세계적으로는 매년 50만명, 우리나라의 경우 6000명의 새로운 환자가 발생하고 있으며 50%는 치명적인 결과를 보인다. 이러한 자궁경부 종양으로 진행하는 과정에 인두유종 바이러스 (Human Papilloma Virus, HPV)가 중요한 원인으로 알려지면서 자궁암의 조기 진단에 HPV DNA의 존재 유무를 이용하고 있다 (Bernard, H. U., I. E. Calleja-Macias, and S. T. Dunn. 2006. Int J Cancer 118:1071-6). HPV는 약 7.9 kb의 이중나선 구조의 DNA 바이러스로 papovavirus에 속하는 것으로 100개 이상의 subtype이 존재하고 있으며 이중 40개의 subtype은 생식기를 통해 감염되는 것으로 알려져 있다. 또한 HPV 바이러스는 10개의 바이러스성 단백질을 지니고 있는데 바이러스의 캡시드를 구성하는 구조 단백질 합성에 관여하는 2개의 late 유전자 산물인 L1, L2와 바이러스의 감염의 활성과 잠복을 결정하는 바이러스의 복제에 관여하는 단백질의 합성을 조절하는 8개의 early 유전자 산물인 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8을 발현한다. 특히 E6와 E7은 전암 단백질을 암호화 하고 있고, 암과 연관이 있는 부분으로 알려져 있으며 (Sedman, S. A., 등. 1991. J Virol 65:4860-6), 여러 보고에 의하여 HPV 바이러스가 여성의 자궁경부암을 유발하고, 여러 가지 악성 종양과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Godfroid, E., 등. 1998. J Virol Methods 75:69-81).
여성의 자궁경부암은 전 세계적으로 유방암에 이어 두 번째로 높은 발병율을 나타내고 있고, 우리나라에서도 매년 1,000명 이상의 사망자가 보이고 있어 자궁경부암의 조기 진단을 위한 노력이 매우 중요하게 여겨지고 있다 (Wui, J. H., 등. 2006. Journal of Gynecologic oncology and Coloscopy 17:39-4711).
현재 HPV의 유전자형은 100가지 이상이 알려져 있고 (Likes, W. M., 및 J. Itano. 2003. Clin J Oncol Nurs 7:271-6), 이 중에서 사람에게 질병을 일으킬 수 있는 유전자형은 30가지 정도로 알려져 있다. 그 유전자형은 고위험군 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 과 저위험군 (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81), 잠재위험군(34, 57, 83)으로 분류하고 있으며 (Munoz, N., 등. 2003. N Engl J Med 348:518-27), 각각의 유전자형을 지닌 HPV가 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 유전자형 특이적으로 발견됨으로써 HPV 감염의 생물학적 다양성을 인지하게 되었다.
이러한 HPV의 감염여부를 진단하기 위하여 가장 많이 쓰이는 방법은 자궁세포진 검사(Papnicolaou Smear, Pap) 방법으로서 현재도 자궁경부암의 조직학적 진단은 이 검사법에 의해 진단하고 있으나 이 검사법은 검사자의 경험과 숙련도에 많은 의존을 해야 하고, 그 때문에 정확도가 떨어진다는 단점을 가지고 있다(Kurman, R. J., D. E. Henson, A. L. Herbst, K. L. Noller, and M. H. Schiffman. 1994. JAMA 271:1866-9). 뿐만 아니라, 질확대경을 이용한 검사 방법은 자궁세포진 검사보다 정확한 결과를 얻을 수는 있지만, 숙련된 기술자와 고가의 장비가 필요하며, HPV의 유전자형을 구별할 수 없다는 단점이 있으며 위 두 방법을 통해서는 악성화 위험도가 다른 HPV 유전형을 분류할 수 없다는 단점이 있다.
상기한 단점을 보완하기 위하여 PCR, HC, DNA chip등을 이용하여 HPV 특이적 DNA 증폭을 통해 자궁경부암 전암 단계를 진단하고 유전자형을 확인하는 방법들의 연구가 계속 진행되고 있는 실정이다.
관련 선행특허로 대한민국특허 공개번호 제 10-2006-0015669호는 인유두종바이러스 유형 진단 키트에 관한 것으로 유형 특이적 인유두종바이러스 검출을 위한 프로브 및 이를 이용한 인유두종바이러스 유형 동정용 올리고 DNA 칩과 상기 DNA 칩을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단용 키트가 기재되어 있다.
또 다른 관련 선행특허로 대한민국특허 공개번호 제 10-2003-0027178 호는 인유두종 바이러스의 감염을 진단하기 위한 유전형 분석키트에 관한 것으로, 인유두종 바이러스의 DNA 또는 RNA에 결합하는 프로브, 이를 포함하는 DNA 칩을 사용하여 인유두종바이러스의 감염 및 유전형을 진단하는 인유두종바이러스의 유전형 분석키트, 및 전기 분석키트를 사용하여 인유두종바이러스의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 기존의 방법보다 HPV에 대한 특이도와 민감도가 좋은 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 이용한 HPV 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 8, 22 내지 24, 27 내지 28, 및 32의 염기서열로 이루어진 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 조성물은 서열번호 5 내지 7, 9 내지 21, 25 내지 26, 29 내지 31, 33 내지 37의 염기서열로 이루어진 프로브를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 부가적으로 사용된 프로브 서열 등을 포함한 기술 내용은 대한민국 특허공개번호 제10-2009-0129639호에 잘 기재되어 있다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프로브 조성물 및 프라이머를 포함하는 HPV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 키트는 PCR 산물을 탐지하기 위한 표지수단을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 프로브를 고체 서포트에 부착하는 단계;
b) 상기 프로브에 증폭된 HPV PCR 산물을 교잡하는 단계; 및
c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 확인 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 고체 서포트는 막, 슬라이드, 또는 웰 플레이트인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명은 검체로부터 핵산을 추출하고, PCR 증폭을 수행하였다. 세포로부터 핵산을 추출하는 방법 및 PCR 방법은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 방법과 같은 당업계에 주지된 방법을 통하여 수행하였다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 프라이머를 사용하였다. 일반적으로 프라이머는 약 10에서 25bp 길이의 올리고뉴크레오타이드가 바람직하나 더 긴 것도 가능하며, 프라이머는 단일 가닥이 바람직하나 이중 또는 단일 가닥 형태로 존재할 수도 있으며, 본 발명에서 사용한 특정 프라이머는 본 발명의 실시예에 기재하였다.
본 발명의 프라이머는 통상의 올리고뉴크레오타이드 합성법에 의하여 제조되었으며, 그러한 합성 방법은 미국특허 제 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 및 5,602,244 등에 개재된다.
본 발명의 프라이머와 같은 서열들은 샘플로부터 유래한 DNA와 같은 상보적인 서열들과 선택적으로 이중 나선을 형성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 타겟 서열에 대한 프라이머의 선택성을 변화시키기 위하여 교잡 조건을 변경할 수 있다.
일부 실시예에서는 교잡을 결정하기 위하여 표지와 같은 적당한 수단과 결합하여 본 발명의 한정된 서열의 핵산을 채택할 수 있다. 적당한 표지수단은 형광, 방사성동위원소 효소 또는 다른 리간드를 포함하는 다양한 표지수단이 가능하다.
다양한 주형 의존적인 과정들이 주어진 세포 샘플에 존재하는 특정 유전자 산물을 증폭하는데 가능하다. 가장공지된 증폭 방법 중 하나가 중합효소 연쇄반응(PCR)이다 이 방법은 미국특허 제 4,683,202 및 4,800,159 등에 기재된다.
일반적으로 한 단계 또는 또 다른 단계에서 증폭산물을 주형 또는 초과 프라이머 또는 다른 증폭산물로부터 분리하는 것이 바람직하다. 예를 들어 증폭 산물은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 표준 방법을 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 PAGE를 사용하여 분리될 수 있다.
또 흡착, 분배, 이온교환 등과 같은 크로마토그래피도 효과적인 분리방법으로 채택될 수 있다. 이들 분리방법들은 대량의 샘플을 가공하기 위하여 임상 셋팅에서 기능하도록 채택될 수 있으며, 수천개의 샘플을 한번에 분리하거나 검출할 수 있는 새로운 방법인 FMAT (fluorometric microvolume assay technique), chemiluminescence,sequence detection systems (Applied Biosystems) 및 질량 분광법 등이 있다.
본 발명에 따른 핵산은 검출되고 정량화될 것이다. 일 실시예에서 그 검출은 시각적 수단에 의하여 수행될 수 있다. 전형적인 시각적 수단 방법은 ethidium bromide로 젤을 염색하고, UV 광 하에서 밴드들을 시각화하는 것이다. 또 만약 증폭 산물이 방사선 또는 형광으로 표지된 뉴크레오타이드이면 분리된 증폭산물은 삽입된 방사선 동위원소 표지의 방사성 신티그램 촬영 또는 형광 검출을 수행한다.
본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 비한정적인 실시예에서 본 발명의 키트는 프라이머들,증폭을 위한 효소 및 부가적인 시약을 포함할 수 있다. 따라서 본 키트들은 적당한 용기 수단들에 이들 하나 이상의 시약들을 포함할 것이다. 그 키트들은 또한 핵산을 분리하고 증폭 산물을 정제하는 시약들을 포함할 수도 있다. 키트들의 구성성분은 수용성 매체 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있고, 키트의 적당한 용기 수단은 구성성분이 들어갈 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병 등을 포함한다. 키트에 하나 이상의 구성요소가 존재한다면 부가적인 구성요소들이 따로 위치될 수 있는 제2, 제3 등의 다른 부가적인 용기를 포함할 수 있다. 그러나 여러 구성요소의 조합이 하나의 용기에 포함될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 nested PCR 방법은 통상 Two-tube nested PCR을 의미하는데, 'Two-tube nested PCR'은 보통 시료의 DNA양이 매우 제한되어 있어 한번의 PCR로는 검출할 수 없는 경우에 두 번째 PCR을 보다 내측의 primer를 이용하여 시행하는 방법으로, 원하는 부분이 잘 증폭되기 위해서는 4개의 primers가 부착해야 하고, outer primers를 이용한 첫 번째 중합효소 연쇄반응을 실시하고 여기서 나온 산물로 두 번째 증폭을 할 때에는 다시 새로운 시약을 첨가하기 때문에 반응이 원활하게 일어날 수 있으며, 한 쌍의 primers가 비교적 적은 횟수의 반응을 하여 기존의 PCR에 비해 우수한 민감도와 특이성이 높일 수 있는 장점을 가지고 있지만 tube를 바꾸어 두 번의 증폭과정을 거치면서 오염의 문제가 종종 발생하기도 하는데, 이러한 문제를 해결하고자 하나의 tube에 2쌍의 primer를 같이 넣어 one-tube nested PCR을 시도하여, 오염의 문제를 줄이는 동시에 민감도 부분에서도 기존의 Two-tube PCR보다 좋은 결과가 나타남을 확인할 수 있었다(실시예 8 및 도 8과 9 참조).
본 발명의 HPV 유전자형 확인방법은 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하고 미리 그 부위에 각 HPV type 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 제작, 부착한 막에 증폭된 DNA를 ECL-Southern hybridization 을 이용한 역 교잡 혼성성화를 이용한 방법으로 최종 목적은 기존의 DNA chip 보다 특이도와 민감도가 좋은 probe 개발과 좀 더 경제적인 방법을 개발하고자 한다.
특히 본 발명에서는 2쌍의 primer를 같은 tube 안에 넣어서 증폭시키는 one-tube nested PCR을 이용하여 HPV의 검출률을 관찰하고 PCR의 결과를 다른 진단방법들과 비교함으로써 새로운 HPV의 진단 방법을 제공하고자한다.
본 발명의 구성 및 도면 등에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 HPV 유전자형 확인방법은 기존의 방법에 비해 특이도와 민감도가 우수하고, 기존의 DNA chip 또는 다른 방법에 비해 고가의 장비 (스캐너, MALDI-TOF 등)가 필요없으며, 자동화 장비 (REBA processor, REBA scanner)와의 연계를 통한 편리성 제공 가능하며, Direct sequencing이 2개 이상의 HPV genotype에 감염된 것을 밝혀내는 것에 한계가 있으나 REBA 제품은 2개는 물론 다중 감염 검체도 검출 가능하며, One tube nested PCR type으로 기존 Nested PCR type에 비해 샘플간의 오염을 최소화 할 수 있고, Internal control인 β-globin probe가 함께 REBA strip에 고정되어 있어 PCR 및 DNA추출 과정상의 오류를 파악할 수 있고, 더불어 Hybridization 상의 오류 파악을 위한 Hybridization Positive control 역시 REBA strip에 고정되어 있으며, 각종 광학 장비나 측정 장비가 필요 없어 실제 실험자의 주관적 견해가 들어갈 가능성이 적은 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 언급한 Reverse Blot Hybridization의 기본 원리에 대한 설명도이다. 즉 ① 아민기를 표지한 프로브를 멤브레인에 결합시킴.②타겟 유전자를 biotin이 라벨된 프라이머로 증폭한 후, membrane에 결합된 프로브와 반응시킴. ③ Streptavidin-conjugated alkaline phosphatase와 반응시킴. ④ Alkaline phosphatase의 기질을 처리하여 프로브와 증폭된 타켓유전자의 결함을 검출함.
도 2는 ATCC 및 KFDA로 분양 받은 클론 중 고위험군에 속하는 HPV 타입 26, 69과 저위험군에 속하는 HPV 타입 32, 40, 54 잠재위험군에 속하는 HPV 타입 73, 34 클론으로부터 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하여 Membrane에 결합된 프로브와 Reverse Blot Hybridization 반응을 시켜 발색으로 검출한 것을 보여주는 사진이며,
도 3은 Capture2 High-Risk HPV DNA Test™ (HC2) Test가 수행된 검체의 REBA 결과를 나타낸 사진이다. 즉 Digene (HC2)는 총 100례가 진행 되었고, 이들에 대하여 기존 25종에 검출 가능한 HPV 키트에 7종을 추가하여 32 검출 가능 키트로 제작하고 이를 이용하여 테스트한 결과 음성으로 확인된 검체 7례, 16, 18, 26, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 66, 69, 70의 single type으로 나온 43검체와 기타 유전자형 감염된 6검체, 2종이상의 유전자형이 감염된 22검체 총 78례에 대해 REBA(Reverse Blot Hybridization 발색실험)를 수행한 결과를 나타낸 사진이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: HPV 양성 클론 확보
KFDA로부터 7종의 HPV genotype 모두에 해당하는 플라스마드 세트를 분양 받아 확보하였으며, 더불어 각 플라스미드에 대한 Sequencing 자료까지 확보하여 실제 각 Genotype과 Sequence가 100% 일치함을 확인하였다. 이들 모든 플라스미드는 증량을 위해 E. coli에 형질전환하여 다량의 플라스미드 및 생세포 저장 상태로 보관 되어 있기 때문에 필요에 따라 된 배양 후 플라스미드 DNA를 추출 (GeneAll, Seoul, Korea)하여 중합효소연쇄증폭반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)의 주형으로 사용하였다. 특히 이중 HPV-26 플라스미드는 전체 실험의 양성 대조군으로 사용하였다.
실시예 2:HPV 임상적 검체의 확보
본 발명에 사용된 임상검체는 2007년 11월부터 6개월간 원주 기독 병원에서 이미 Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA TestTM (HC2, Digene, Gaithersburg, USA)로 검사를 받은 환자 78명을 대상으로 본 발명의 실험군으로 사용하였다.. 또한 본 연구의 신뢰도 검증을 위하여 대한민국 원주 기독 병원의 환자로부터 분리된 임상학적 검체 중 sequencing으로 genotyping이 끝난 HPV type 고위험군 26 저위험군 54 잠재 위험군 73, 34를 확보하였고 고위험군 중 HPV type 69과 저위험군 HPV type 32, 40은 강릉 아산 병원과 원주기독병원을 통해서 확보하였다.
실시예 3: 임상 검체로부터 DNA 추출
(1)1 ml~1.5 ml 임상 테스트용 LBC검체를 1.5ml tube에 넣는다.
(2)상온에서 8,000 rpm, 5분간 원심분리한다.
(3)조심스럽게 상층액을 제거한다.
(4)1ml PBS (pH7.2)를 첨가한 후 10초간 vortexing 한다.
(5)상온에서 8,000 rpm, 5분간 원심분리 한다.
(6)4번 5번 과정을 반복한다.
(7)300~500 ㎕의 멸균 증류수를 첨가한후 10초간 vortexing 한다.
(8)상온에서 13,000 rpm, 10분간 원심분리 한다.
(9)조심스럽게 상층액을 제거한다.
(10)추출 용액 50 ㎕ 를 첨가한후 1분간 vortexing 한 후 10분간 가열한다.
(11)13,000 rpm, 3분간 원심분리 한다.
(12)튜브에 상층액을 조심스럽게 옮겨 담는다.
(13)3~5ul를 PCR 반응의 주형으로 사용한다.
실시예 4: PCR
PCR 반응은 베타-5PCR를 먼저 수행하도록 하여 DNA산물에 inhibitor 가 있는지 없는지를 확인한 후에 진행하였다. 반응 조건으로는 94℃의 변성 (denaturation) 온도에서 5분간 예비 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 결합(annealing), 72℃에서 30초 신장(extension)을 총 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장 반응을 하였다. 반응 후 PCR이 증폭된 산물의(양성검체) DNA를 가지고 One-tube nested PCR을 실시하였다. 200㎕ PCR용 tube에 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P-40과 각각의 10 mM dNTP, 25 mM MgCl2, 2 pmole 농도의 Outer primer와 5pmole 농도의 inner primer, 1 unit의 Taq polymerase를 사용하였으며 총 반응 양은 20㎕로 실시하였다.
반응 조건은 94℃의 변성 (denaturation) 온도에서 5분간 예비 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 결합(annealing)로 15cycle을 먼저 반응시킨 후, 다시 94℃에서 30초 변성, 52℃에서 30초 결합(annealing)로 45cycle을 반응시키고 마지막에 72℃에서 10분간 최종 신장 반응을 하였다. 이 때 사용한 primer는 MY11/09-GP5-1/6+를 사용하며 이로 인해 150bp의 증폭 산물을 얻을 수 있다. 각각의 primer의 염기서열은 아래와 같다. 추후의 REBA 과정에서 Streptavidin과의 결합을 위해 reverse primer (My09, GP6)의 5'말단에는 Biotin을 라벨링한다.
Name 서열 농도
MY11 (A) GCM CAG GGW CTA TAA YAA TGG(서열번호 1) 2pmole/ul
MY09 (B*) CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC(서열번호 2) 2pmole/ul
GP5-1 (E) TTTGTTACWGTKGTRGATAC(서열번호 3) 5pmole/ul
GP6 (D*) GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C(서열번호 4) 5pmole/ul
표 1은 HPV 프라이머 서열 및 농도를 나타낸다. 표 1에서 MY11, MY09, GP5-1 및 GP6+ 서열은 각각 서열번호 1 내지 4에 기재하였다.
Figure pat00001
표 2는 PCR조건을 나타낸다.
실시예 5: Probe 로 사용할 oligonucleotide 와 probe 가 부착된 막의 제작
(1)막을 14X 12 cm로 절단후 1.6g/10ml EDAC로 10분간 반응시킨후 100ml 멸균 증류수로 1분간 세척한다.
(2)Miniblotter-MN45(Immunetics, Cambridge, MA)에 활성화된 막을 위치시킨 후 아스피레이터 (Aspirator)를 이용하여 슬롯의 물을 완전히 제거한다.
(3)Probe로 사용할 oligonucleotide는 막의 음성 전위를 띄는 카르복실기와 결합시키기 위해 양성전위를 갖도록 5'말단에는 아민기를 첨가하도록 바이오니아(대한민국)에 제작을 의뢰하였으며 100pmole/ul의 준비된 Probe를 막에 부착하기 위하여 0.5M NaHCO3 용액에 아래의 표와 같은 probe 농도가 되도록 희석한다.
(4)각각의 슬롯에 probe를 로딩한 후 실온에서 1시간 동안 반응하였다
(5)이 후 100 mM NaOH로 9분간 반응시킨다.
(6)60 ℃로 데워진 HS용액 (2X SSPE, 0.1% SDS)으로 60℃에서 5분간 반응시킨다.
(7)60 ℃로 데워진 1% SDS 요액으로 60℃에서 5분간 반응시킨다.
(8)20mM EDTA 용액을 넣고 실온에서 15분간 세척한다.
프로브 명 작용 농도 (pmoles/ul) Autoclaved D.W. 100μM의 프로브 프로브 부피 (㎕) 0.5 M NaHCO3 (㎕)
hyb PC 10 900 100 10 140
Universal 20 800 200 10 140
Type 16 20 800 200 10 140
Type 18 5 950 50 10 140
Type 26 25 975 25 5 145
Type 31 10 900 100 10 140
Type 33 25 750 250 10 140
Type 35 25 750 250 10 140
Type 39 15 850 150 10 140
Type 45 5 950 50 10 140
Type 51 20 800 200 10 140
Type 52 5 950 50 10 140
Type 53 20 800 200 10 140
Type 56 10 900 100 10 140
Type 58 15 850 150 10 140
Type 66 10 900 100 10 140
Type 59 20 800 200 10 130
Type 68 10 900 100 10
Type 69 2.5 975 25 5 145
Type 73 2.5 975 25 5
Type 34 2.5 975 25 5
Type 6 25 750 250 10 140
Type 11 15 850 150 10 140
Type 32 2.5 975 25 5
Type 40 2.5 975 25 5
Type 42 25 750 250 10 140
Type 43 10 900 100 10 140
Type 44 10 900 100 10 140
Type 54 2.5 975 5
Type 70 15 850 150 10 140
Type 72 15 850 150 10 140
Type 84 15 850 150 10 140
Type 81 20 800 200 10 130
Type 87 15 850 150 10
표 3은 프로브 농도를 나타낸 표이다.볼드체로 표시된 것이 추가된 7종에 대한 프로브 농도이다.
실시예6 : Reverse Blot Hybridization ( REBA )
(1)PCR 산물을 변성시키기 위하여 15 ㎕와 Denaturation solution (DS) 15 ㎕ (1:1 비율)을 섞는다.
(2)혼합액을 tapping 또는 약하게 vortex 한 후 quick-spin하고 25℃에서 5분간 방치한다.
(3)반응 동안 영동에서 제공한 특이적 oligo-probe가 부착된 REBA용 Membrane strip 을 tray well에 놓고 Hybridization solution (HS) 500 ㎕을 각 well에 분주한다.
(4)DNA 변성물과 Hybridization Solution (HS) 470 ㎕를 pipetting하여 잘 섞은 후 membrane에 뿌린다.
(5)50℃ 항온수조에서 60~80 rpm으로 30분 동안 혼성화 한다.
(6)미리 Washing Solution (WS)을 50℃로 데워 놓는다.
(7)Well로부터 hybridization mixture를 aspirator로 완전히 제거 한 후 미리 데워 놓은 Washing Solution (WS)을 1 ㎖씩 분주하고 50℃ 항온 수조에서 60~80 rpm으로 10분씩 2회 반복한다.
(8)두 번째 wash가 완료되기 1-2분전에 AP conjugate를 Conjugate Dilution Solution (CDS)으로 1:2500 (AP 0.4 ㎕/ CDS 1 ㎖)배 희석하여 준비한다.
(9)Wash액을 완전히 제거 하고 각 well에 AP conjugate 1 ㎖ 씩 분주하고 25℃에서 60~80 rpm으로 30분 동안 반응시킨 후 반응액을 완전히 제거한다.
(10)각 well에 CDS 1 ㎖씩 분주하고 Dancer (Shaker)로 25℃에서 1분씩 2회 반복한다.
발색반응을 위해서는 AP conjugate 반응이 끝난 막을 TBS (50 mM Tis-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)로 1분간 2회 세척하고 발색용 기질용액인 NBT/BCIP [Nitro Blue Tertrazolium Chloride and 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Phosphate, Toluidine salt in 67% DMSO (v/v), Roche Applied Science, Germany)]를 TBS (100 mM Tis-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5)에 1:50 (v/v)으로 희석하여 실온에서 5분 동안 반응시키면서 원하는 정도의 발색이 끝나면 발색 용액을 완전히 제거하고 3차 증류수를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
이름 서열 (5'에 amine 표지)
Universal 5'GNCATGNNGARGAATATGA-3'(서열번호 5)
Type 16 5'CAT TAT GTG CTG CCA TAT C-3' (서열번호 6)
Type 18 5'TGC TTC TAC ACA GTC TCC T-3(서열번호 7)
Type 26 5'TCTGCAGCATCTGCATCC-3(서열번호 8)
Type 31 5'GCA ATT GCA AAC AGT GAT AC-3'(서열번호 9)
Type 33 5'TGCACACAAGTAACTAGTGA-3(서열번호 10)
Type 35 5'CTGCTGTGTCTTCTAGTGA-3'(서열번호 11)
Type 39 5'ATAGAGTCTTCCATACCTTC-3'(서열번호 12)
Type 45 5'TAATTTAACATTATGTGCCTC-3'(서열번호 13)
Type 51 5'TGCTGCGGTTTCCCCAA-3'(서열번호 14)
Type 52 5'GAATACCTTCGTCATGGC-3'(서열번호 15)
Type 53 5'AACCACACAGTCTATGTCTACA -3(서열번호 16)
Type 56 5'CAGAACAGTTAAGTAAATATG-3'(서열번호 17)
Type 58 5'TATGCACTGAAGTAACTAAG-3(서열번호 18)
Type 66 5'AGCTAAAAGCACATTAACTAA-3(서열번호 19)
Type 59 5'TCTACTACTTCTTCTATTCC-3(서열번호 20)
Type 68 5'CAGACTCTACTGTACCAGC-3'(서열번호 21)
Type 69 5'ACAATCTGCATCTGCCACT-3(서열번호 22)
Type 73 5'TAGGTACACAGGCTAGTAGCTCTA-3(서열번호 23)
Type 34 5'CCACAAGTACAACTGCACCA-3(서열번호 24)
Type 6 5'TCCGTAACTACATCTTCCA-3'(서열번호 25)
Type 11 5'TCTGTGTCTAAATCTGCTAC-3'(서열번호 26)
Type 32 5'GCTACTGTAACAACTGAAGACACA-3(서열번호 27)
Type 40 5'CTTATGTGCTGCCACACAGT-3(서열번호 28)
Type 42 5'TGGTGATACATATACAGCTG-3'(서열번호 29)
Type 43 5'TCTACTGACCCTACTGTG-3'(서열번호 30)
Type 44 5'TACTAGTGAACAATATAAGCA-3'(서열번호 31)
Type 54 5'ACAGCATCCACGCAGGA-3(서열번호 32)
Type 70 5'GAAACGGCCATACCTG-3'(서열번호 33)
Type 72 5'GCGTCCTCTGTATCAGA-3(서열번호 34)
Type 84-1 5'AACACCGAATCAGAATATAAACCTACC-3(서열번호 35)
Type 81 5'CATCTGCTGCTGCAGA-3(서열번호 36)
Type 87-2 5'AACCACTGAATATGACCCCACA-3(서열번호 37)
표 4는 프로브 서열을 나타낸 표이다.볼드체로 표시된 것이 추가된 7종에 대한 프로브 서열이다.
Infection Reverse Blot hybridization 결과 상대적 빈도 (%)
HPV type n
Negative - 7 8.97
Total 7 8.97
Single 16 14 17.95
18 3 3.85
26 6 7.69
69 1 1.28
53 3 3.85
45 1 1.28
56 2 2.56
39 1 1.28
70 2 2.56
66 1 1.28
35 3 3.85
58 4 5.13
51 1 1.28
33 1 1.28
Total 43 55.13
Double
(19례)		 58, 26 3 3.85
26, 84 1 1.28
43, 84 1 1.28
16, 66 1 1.28
58, 54 1 1.28
53, 70 1 1.28
53, 58 1 1.28
26, 69 1 1.28
58, 84 1 1.28
16, 26 2 2.56
26, 33 1 1.28
16, 53 1 1.28
18, 35 1 1.28
35, 38 1 1.28
59, 68 1 1.28
35, 58 1 1.28
Total 19 24.36
Multi 16, 18, 26, 45, 52,66, 59/68, 6 1 1.28
18, 26, 52, 59/68 2 2.56
Total 3 3.85
Universal Unknown HPV type 6 7.69
Total 6 7.69
Total 100
표 5는 7종이 추가된 HPV 키트를 이용하여 임상 샘플의 유전자형에 따른 발생 확률을 나타낸 표이다.
강릉 아산 병원으로부터 받은 78례의 임상 검체에 대해 REBA 수행한 결과를 수치화 한 결과 HPV type 16의 경우가 17.95%로 가장 높았고, 기타 다른 유전자형에 대한 발생 확률을 표 5에 나타내었다.
<110> Molecules and Diagnostics Inc. YD Diagnostics <120> A PROBE FOR IDENTIFYING HPV GENOTYPE AND A METHOD FOR IDENTIFYING HPV GENOTYPE <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MY11 primer <400> 1 gcmcagggwc tataayaatg g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MY09 primer <400> 2 cgtccmarrg gawactgatc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP5-1 primer <400> 3 tttgttacwg tkgtrgatac 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GP6 primer <400> 4 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal <400> 5 gncatgnnga rgaatatga 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 16 <400> 6 cattatgtgc tgccatatc 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 18 <400> 7 tgcttctaca cagtctcct 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 26 <400> 8 tctgcagcat ctgcatcc 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 31 <400> 9 gcaattgcaa acagtgatac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 33 <400> 10 tgcacacaag taactagtga 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 35 <400> 11 ctgctgtgtc ttctagtga 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 39 <400> 12 atagagtctt ccataccttc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 45 <400> 13 taatttaaca ttatgtgcct c 21 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 51 <400> 14 tgctgcggtt tccccaa 17 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 52 <400> 15 gaataccttc gtcatggc 18 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 53 <400> 16 aaccacacag tctatgtcta ca 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 56 <400> 17 cagaacagtt aagtaaatat g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 58 <400> 18 tatgcactga agtaactaag 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 66 <400> 19 agctaaaagc acattaacta a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 59 <400> 20 tctactactt cttctattcc 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 68 <400> 21 cagactctac tgtaccagc 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 69 <400> 22 acaatctgca tctgccact 19 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 73 <400> 23 taggtacaca ggctagtagc tcta 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 34 <400> 24 ccacaagtac aactgcacca 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 6 <400> 25 tccgtaacta catcttcca 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 11 <400> 26 tctgtgtcta aatctgctac 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 32 <400> 27 gctactgtaa caactgaaga caca 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 40 <400> 28 cttatgtgct gccacacagt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 42 <400> 29 tggtgataca tatacagctg 20 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 43 <400> 30 tctactgacc ctactgtg 18 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 44 <400> 31 tactagtgaa caatataagc a 21 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 54 <400> 32 acagcatcca cgcagga 17 <210> 33 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 70 <400> 33 gaaacggcca tacctg 16 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 72 <400> 34 gcgtcctctg tatcaga 17 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 84-1 <400> 35 aacaccgaat cagaatataa acctacc 27 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 81 <400> 36 catctgctgc tgcaga 16 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYPE 87-2 <400> 37 aaccactgaa tatgacccca ca 22

Claims (9)

  1. 서열번호 8, 22 내지 24, 27 내지 28, 및 32의 염기서열로 이루어진 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 5'말단에 아민이 표지된 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브 조성물.
  3. 제 1항 또는 제2항의 프로브 조성물 및 프라이머를 포함하는 HPV 진단용 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 키트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 키트는 PCR 산물을 탐지하기 위한 표지수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 키트.
  6. a) 제 1항 또는 제2항의 프로브 조성물을 고체 서포트에 부착하는 단계;
    b) 상기 프로브에 증폭된 HPV PCR 산물을 교잡하는 단계; 및
    c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 확인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 고체 서포트는 막, 슬라이드, 또는 웰 플레이트인 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 PCR 산물은 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머를 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
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