KR20130015413A

KR20130015413A - 임신성 당뇨 조기 진단 방법, 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 아포립포프로틴 씨쓰리 단백질, 임신성 당뇨의 진단을 위하여 아포립포프로틴 씨쓰리를 바이오마커로 사용하는 방법, 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법, 및 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트

Info

Publication number: KR20130015413A
Application number: KR1020110077391A
Authority: KR
Inventors: 박중신; 김철우; 김선민; 신용성; 신호상
Original assignee: 주식회사 바이오인프라; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-08-03
Filing date: 2011-08-03
Publication date: 2013-02-14
Also published as: KR101355394B1

Abstract

본 발명은 임신 16주에서 20주 사이의 임신부에 적용될 수 있는 임신성 당뇨 조기 진단 방법, 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 apolipoprotein C3 단백질, 임신성 당뇨의 진단을 위하여 apolipoprotein C3를 바이오마커로 사용하는 방법, 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법, 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 임신 16주 내지 20주에 있는 임신부들을 대상으로 apolipoprotein C3를 정량함으로써 임신성 당뇨의 발병 가능성을 미리 예측하거나, 조기 진단할 수 있어, 발병에 효과적으로 조기에 대처하는데 활용될 수 있다.　　　　

Description

임신성 당뇨 조기 진단 방법, 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 아포립포프로틴 씨쓰리 단백질, 임신성 당뇨의 진단을 위하여 아포립포프로틴 씨쓰리를 바이오마커로 사용하는 방법, 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법, 및 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트{Early diagnostic method of gestational diabetes, apolipoprotein C3 as a biomarker for the diagnosis of gestational diabetes, apolipoprotein C3 for the diagnosis of gestational diabetes and how to use it as a biomarker, Information processing method for early diagnosis of gestational diabetes, Monitoring for gestational diabetes, Kit for diagnosis and screening}

본 발명은 임신성 당뇨의 조기 진단 방법, 임신성 당뇨의 조기 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 apolipoprotein C3 단백질, 임신성 당뇨의 조기 진단을 위하여 apolipoprotein C3를 바이오마커로 사용하는 방법, 임신성 당뇨 조기 진단의 정보 처리 방법, 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 임신 16주에서 20주 사이의 임신부에 적용될 수 있는 임신성 당뇨 조기 진단 방법, 임신성 당뇨의 조기 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 apolipoprotein C3 단백질, 임신성 당뇨의 조기 진단을 위하여 apolipoprotein C3를 바이오마커로 사용하는 방법, 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법, 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트에 관한 것이다.

당뇨병은 대표적인 만성 성인병의 하나로 우리나라의 당뇨병 환자는 전체 인구의 약 5% 정도로 최소한 250 만 명으로 추정되고 있다. 선진국의 경우에 당뇨병 환자가 전체 인구의 10%까지 보고되고 있으며, 우리나라도 생활수준의 향상과 더불어 생활양식이 서구화되면서 점차로 당뇨병 환자가 증가되고 있는 추세이다.

당뇨병은 크게 인슐린을 분비하는 세포가 파괴되어 인슐린의 양이 절대적으로 부족한 제1형 당뇨병(인슐린 의존형)과 인슐린이 작용하는 장기에서 인슐린에 대한 저항성이 생긴 제2형 당뇨병(인슐린 비의존형)으로 구분되는데, 당뇨환자의 약 90% 이상은 제2형 당뇨가 차지하고 있다. 당뇨병의 원인으로는 유전적인 요인, 연령의 증가, 비만, 약물의 복용, 임신, 고혈압, 고지혈증 등이 있으며 평소 식이요법 및 규칙적인 운동을 통해서 사전에 발병을 예방해야 한다. 현재까지 향후에 당뇨로 발전될 가능성이 있는 사람을 미리 진단할 수 있는 바이오마커는 없는 실정이다.

현재 당뇨(Type 2 diabetes)가 발병된 환자의 혈액 내에서 apolipoprotein C3 단백질이 증가된다는 연구결과들은 알려져 있다(A proteomic study of the apolipoproteins in LDL subclasses in patients with the metabolic syndrome and type 2 diabetes/J Lipid Res. 2005 Sep;46(9):1999-2006). 하지만, 당뇨 발병 이전의 정상 상태일 때 채혈한 혈액 내에서 이미 apolipoprotein C3 단백질이 증가하고 있다는 점은 밝혀진 바는 없다.

바이오마커는 혈액, 체액 내에 특정 질환 여부나 상태를 나타내는 단백질을 말하는데 정상인에게 없거나 차이가 나는 단백질이 특정 질병에 걸린 환자의 혈액이나 체액에서 발견되면 이를 토대로 질병유무와 상태를 판단할 수 있다. 이러한 질병관련 바이오마커 자료가 축적되면 질병의 예방, 조기진단, 치료에 이르기까지 국민건강수준의 향상을 위해 중요하게 사용될 수 있다. 전통적으로 바이오마커를 발굴하고 유효성 검증을 통해 임상진단에 사용하기까지는 많은 시간과 노력이 요구되는 과정이었다.

이차원 전기영동(2-Dimensional Gel Electrophoresis), Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight (MALDI-TOF), surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight (SELDI-TOF) mass spectrometry 방법은 고-수행(high-throughput) 프로테옴 분석 방법들로, 상기 기술들은 매우 넓은 범위의 분자량에 걸쳐있는 모든 단백질 및 변형 단백질의 발현양상을 분석(profile) 할 수 있게 한다 (Richter R. et al., Composition of the peptide fraction in human blood plasma: database of circulating human peptides. J Chromotogr B Biomed Sci Appl 726, 2535, 1999., Paweletz C.P. et al., Rapid protein display profiling of cancer progression directly from human tissue using a protein biochip. Drug Dev Research 49, 3442, 2000).

이중 Ciphergen사의 SELDI-TOF MS(Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA, USA)는 높은 민감도와 우수한 재현성을 목적으로 설계된 장치로 단백질 프로파일링(profiling)에 의한 바이오마커 발굴이 가능하다. SELDI-TOF MS는 특수한 chromatographic 표면 처리를 한 protein chip array 위에 직접 crude sample의 단백질을 결합시킨 후 표적 단백질을 laser Desorption/Ionization 과정을 거친 후 detector에 도달하는 시간에 의해 질량을 분석하는 장비이다. cell lysate, serum, plasma, urine, tissue homogenate등의 복잡한 생화학 물질들을 다양하게 적용할 수 있으며, 아주 적은 양의 단백질 시료를 가지고도 정제과정 없이 바로 사용될 수 있다. 또한 이차원 전기영동 방법에 비해 상대적으로 20 kDa 이하의 low molecular weight 단백질 분석이 용이하다는 장점이 있다.

임신성 당뇨병의 정의는 임신 중에 처음 진단된 당뇨병이다. 임신 중에는 본래 인슐린에 대한 저항성이 생겨 공복시 약간의 저혈당, 식후 약간의 고혈당이 정상적으로도 나타나게 된다. 임신성 당뇨병이란 이와 같은 생리적(physiologic)인 범위를 넘어서 병적으로 혈당조절이 안되는 경우이고, 정의상으로는 임신 중에 처음 진단된 당뇨병을 임신성 당뇨병이라고 한다.

임신성 당뇨는 태아에는 거대아와 관련한 합병증, 모체에는 고혈압, 제왕절개율 증가 등의 합병증을 초래하게 되며, 특히 공복혈당이 높은 임신성 당뇨의 경우 현성 당뇨병과 마찬가지로 자궁 내 태아사망의 위험이 증가하는 것으로 되어있다. 임신성 당뇨의 적절한 진단과 치료는 이러한 임신 관련 합병증을 줄이고 예후를 향상시키는데 매우 중요하다. 임신성 당뇨의 선별을 위해 통상적으로 임신부를 대상으로 하여 임신 24~28주 사이에 50g 당부하 검사를 실시한다. 이 검사에서 1시간 후 혈중 당수치가 130mg/dl 혹은 140mg/dl를 초과하는 경우에는 진단을 위한 100g 당부하 검사를 실시한다.　8-14 시간 금식한 후 100g 당부하 검사를 실시하여 하기 표 1과 같은 수치 중 2개 이상에 해당되면 임신성 당뇨로 진단한다.

공복시	95 mg/dl
1시간 후	180 mg
2시간 후	155 mg
3시간 후	140 mg

임신부를 대상으로 임신 24~28주 사이에 50g 당부하 검사를 실시하면 약 15%의 여성들이 1시간 후 혈중 당 수치가 130mg/dl 혹은 140mg/dl 를 초과하며, 이러한 여성들을 대상으로 100g 당부하 검사를 실시하면 약 15%에서 임신성 당뇨가 진단된다. 최근에는 75g 당부하 검사를 지지하는 의견도 있으며, 어떤 방법이 가장 이상적인 임신성 당뇨 검사 방법인가에 대해서는 아직 논란이 있다.

정말 임신성 당뇨병이라면 분만 후에는 혈당 조절이 정상화되지만, 일부는 원래 당뇨병이 있었는데 모르고 지내다가 임신 중에 진단이 되었을 수도 있다. 이를 감별하기 위해 임신성 당뇨병을 진단받았던 산모들은 분만 6-12 후에 경구 당부하검사를 또 시행하여 이 검사에서 음성인지를 확인한다. 만약 원래 당뇨병이 있었는데 모르고 지내다가 임신 중에 진단된 경우라면 이 검사에서 당뇨로 진단이 된다.

현재 임신성 당뇨병 검사는 임신 24주 이후에 시행해야 하고 그 이전에는 검사를 하더라도 진단이 잘 되지 않는다고 알려져 있다. 검사를 일찍 시행하면 위음성 결과가 나올 위험이 있기 때문이다. 왜냐하면 임신성 당뇨병이 생기는 원인은 여러가지 호르몬의 영향으로 알려져 있는데, anti-insulin 호르몬인 somatomammotropin (placental lactogen) 이나 placental growth hormone 이 주된 역할을 하는 것으로 보인다. 이 호르몬들이 glucose homeostasis를 방해할 만큼 태반이 발달하는 주수가 되어야 임신성 당뇨병을 진단할 수 있다. 이 때문에, 임신 24주 이후에 검사를 시행하는 것이 일반적이다.

하지만, 이 시기 이전에 미래에 발생할 가능성이 있는 임신성 당뇨를 좀 더 빠른 시기에 효과적으로 예측할 수 있다면, 여러 가지 예방이나 대책 또는 요법 등을 조기에 시작할 수 있어, 궁극적으로 임신 예후를 향상시킬 수 있을 것이다. 이에 따라, 임신성 당뇨를 임신 24 주경 이전에 효과적으로 예측할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

본 발명이 이루고자 하는 첫 번째 기술적 과제는 apolipoprotein C3 발현량과 혈당 정량 결과를 사용하여 임신성 당뇨 조기 진단 방법을 제시하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 두 번째 기술적 과제는 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 apolipoprotein C3 단백질을 제시하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 세 번째 기술적 과제는 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 apolipoprotein C3 단백질을 사용하는 방법을 제시하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 네 번째 기술적 과제는 apolipoprotein C3 발현량과 혈당 정량 결과를 사용하여 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝 방법을 제시하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다섯 번째 기술적 과제는 apolipoprotein C3 발현량 정보와 혈당 정량 정보를 사용하여 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법을 제시하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 여섯 번째 기술적 과제는 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 제시하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (A) 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청의 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 단계; (B) 상기 혈액, 혈장 또는 혈청에서 혈당을 정량하는 단계; 및 (C) 상기 apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 apolipoprotein C3 범주에 포함되지를 확인하는 단계;를 포함하며, 상기 혈액, 혈장 또는 혈청은 임신 제 이 삼분기 초기 또는 임신 16주 내지 20주에 도달한 모체에서 분리된 것인 것을 특징으로 하는 임신성 당뇨 조기 진단 방법을 제시한다.

상기 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 것은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정되는 것인 것이 바람직하다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 apolipoprotein C3 단백질을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 임신성 당뇨의 진단을 위하여 apolipoprotein C3를 바이오마커로 사용하는 방법을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 사용하여 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 단계; 및 상기 apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 apolipoprotein C3 범주에 포함되는 경우, 임신성 당뇨 위험군으로 판단하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝 방법을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (K) 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청의 apolipoprotein C3 발현량 정량 정보를 입수하는 단계; (L) 상기 apolipoprotein C3 발현량 정량 정보가 기설정된 apolipoprotein C3 범주에 포함되는 지를 확인하는 단계; 및 (M) 상기 (L) 단계의 조건이 충족되는 경우, 상기 apolipoprotein C3 발현량 정보로 임신성 당뇨 위험 정보를 생성하는 단계; 포함하는 것을 특징으로 하는 apolipoprotein C3 발현량 정보를 활용하는 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 제시한다.

본 발명은 임신 16주 내지 20주에 있는 임신부들을 대상으로 apolipoprotein C3를 정량함으로써 당뇨 가능성을 미리 예측하거나, 조기 진단할 수 있어, 발병에 효과적으로 조기에 대처하는데 활용될 수 있다.　　　　　

도 1과 2는 정상인과 임신성 당뇨 환자의 혈장의 스펙트럼을 비교하는 그림이다.
도 3과 4는 정상인과 임신성 당뇨 환자의 혈장의 스펙트럼 이미지에 대한 gel view 그림이다.
도 5는 임신성 당뇨 환자의 혈장의 스펙트럼 분석 결과 정상인에 비해 9,411 Da의 피크의 강도가 증가하였음을 나타내는 산포도이다.
도 6은 15% 러닝 겔(running gel)에서 전기 영동 결과를 보여 주는 도면이다.
도 7은 패시브 용리 결과를 보여 주는 도면이다.
도 8는 마스코트 서치 결과(Mascot Search Results)을 보여 주는 도면이다.
도 9는 apolipoprotein C3의 아미노산 서열을 보여 주는 도면이다.
도 10은 정상인(control)과 환자군(GDM)에 대한 apolipoprotein C3의 정량 결과에 대한 박스 플롯을 보여주는 도면이다.
도 11은 SELDI 강도와 ELISA 정량값 간의 m/z 9,411 강도, apolipoprotein C3 정량값 상관도 비교 결과를 보여 주는 도면이다.

apolipoprotein C3는 임신 24주 이전인 16주 내지 20주 사이에 정상 상태의 비 당뇨 임신부에게 장래에 임신성 당뇨가 발병할 가능성을 예측해 주는 바이오마커로 사용될 수 있어, apolipoprotein C3를 바이오마커로 활용한 임신성 당뇨 조기 진단 방법을 제시한다.

먼저, apolipoprotein C3가 임신 16주 내지 20주 사이에 임신성 당뇨에 대한 효과적인 예측 바이오마커로 작동됨을 하기 실험으로 밝혔다.

본 실험에 사용되는 도구(material)는 하기와 같았다.

1. Ultrafree-MC, DV 0.65　㎛ (Millipore, UFC30DV00)

2. Protein G Agarose (Upstate, 16-266)

3. Octyl-Sepharose CL-4B resin (Sigma, O6001)

4. Coomassie G-250 (Fluka, 27815)

5. Formic acid (Fluka, 94318)

6. Isopropanol (Sigma, I9516)

7. apolipoprotein C3 protein (Fitzgerald, 30-AA28)

8. apolipoprotein C3 Antibody(Capture Ab.) : (chemicon, AB821)

9. apolipoprotein C3 Antibody(detection Ab.) : (Biodesign, K97113R)

효과적인 실험을 위하여 정상인과 환자군을 다음과 같이 구성하였다.

<정상인 및 환자군>

연령, 산과력, 채혈한 임신 주수, 체질량지수가 비슷한 정상 임신부 12 명과 나중에 임신성 당뇨가 발병한 임신부 12명을 대상으로 단백질 분석 (Profiling)을 실시하였다. 실험에서 환자군 (case)이었던 임신부들은 임신성 당뇨 진단 당시에 HbA1c가 모두 정상 범위에 있었으며, 이들 중에 분만 후 경구당부하 검사에서 당뇨로 진단 받은 케이스는 없었다. 따라서 위 환자군은 본래 당뇨병이 있었던 사람들이 아니라 임신에 의해 일시적으로 내당능 장애가 생겼던 임신성 당뇨병 환자들이라고 할 수 있다.

<혈장 수득 및 보관>

임신 16 ~ 20주 사이에 염색체 검사 등의 임상적 적응증으로 양수검사를 위해 내원한 임신부들의 말초혈액 5 mL을 채취하여 ethylene-diamine-tetra-acetic acid (EDTA) containing tube에 담아 700g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취해 혈장을 얻었으며 이를 polypropylene tube에 담아 사용하기 전까지 -70 ℃에서 보관하였다. 이들 임신부군에서 임신성 당뇨는 임신 24주 이후에 경구 당부하 검사를 통해 진단되었다.　

<혈장 단백질 질량 프로파일>

1. 혈장은 음이온 교환(Anion Exchange)(Q10) 단백질 칩 어레이(ProteinChip array)(Ciphergen)로 분석하였다. 혈장 2㎕를 9M Urea, 2% CHAPS 용액 3㎕와 섞어서 상온에 30분 둔 후 혼합샘플 5㎕에 Q10 바인딩 완충 용액(Binding buffer)(0.05% Triton X-100 in 50mM HEPES, pH7.0) 45㎕을 넣어주었다. Vortex로 잘 섞어주었다.

2. Q10 Chip Equilibration은 바인딩 완충 용액 10㎕를 스폿(spot)마다 로딩(loading)하고 상온에서 5분간 두었다. 바인딩 완충 용액을 제거한 후 다시 바인딩 완충 용액 10㎕를 스폿에 로딩한 후, 5분간 상온에 두었다.

3. 스폿에 혈장 혼합물(mixture) (혈장 샘플+가용화 완충 용액(solubilization buffer)+바인딩 완충 용액)를 5㎕씩 loading한 후, 상온의 습윤 챔버(humidity chamber)에서 1시간 반응시켰다.

4. 혈장 혼합물을 제거하고, 바인딩 완충 용액 10㎕를 로딩하고, 바로 바인딩 완충 용액을 제거하하는 것을 4회 반복하였다. 바인딩 완충 용액을 제거하고, HPLC water 5㎕를 로딩하하고, HPLC water를 제거하는 것을 2회 반복하였다.

5. HPLC water를 제거하고, 상온에서 건조시켰다.

6. SPA(5mg in 50% Acetonitrile(ACN), 0.5% Trifluoroacetic Acid(TFA)를 건조된 스폿 위에 1㎕ 로딩하였다. SPA가 건조되면 1㎕ 더 로딩하였다.

7. 스폿이 완전히 건조되면, 칩을 ProteinChip System Series 4000(Ciphergen, Biosystems Inc., Fremont, CA, USA )으로 스펙트럼을 얻었다. 이 때 조건은 Focus mass 8,000/28,000, laser energy 3000 nJ,　 265 shots, 1000-200000 Da ranges 이었다.

bovine Superoxide dismutase, equine Myoglobin, bovine beta-lactoglobulin A 및 horseradish peroxidase(Ciphergen, Biosystems Inc., Fremont, CA, USA)를 calibrant로 사용하여 external calibration 하였고 total ion current를 이용하여 normalization 하였다. Ciphergen Express Client ver. 3.0 소프트웨어를 사용하여 signal-to-noise 5 이상, valley depth 5 이상, minimum peak threshold는 0%, cluster mass window 0.3% MW 조건에서 자동으로 peak detection을 수행하여 모두 159개 peak cluster가 생성되었다.

이 peak들에 대한 Mann-Whitney U-test p-value를 정상인 그룹과 임신성 당뇨환자 그룹 간에 비교하였다. 전체 peak들 중 9,411 Da peak이 정상인 그룹과 현저한 차이를 보이며 증가했다(p-value 0.000128). 그 결과는 도 5에 있다. 먼저, 9,411(m/z)의 분리(separation)부터 설명한다. 본 발명자들은 하기와 같은 방법으로 실험하였다.

I. 내열성(Thermostable) 혈장 샘플의 준비　

1. 정상 혈장(Normal 혈장) 1ml을 1L 비이커에 물을 100℃로 끓이고 1.7ml effendorf 튜브 4개에 각각 250㎕씩 혈장을 넣은 후 10분간 끓여주었다. 이때 2분에 한번씩 튜브를 꺼내어 vortex mix해 주었다.

2. 10분간 끓인 후 상온에서 10분간 방치하였다.

3. 10분이 지난 후 13,000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분리해낸다. 상층액에 부유물이 떠다닐 경우 필터하여 크로마토그래피를 실시하였다. boiled 혈장이 약 200㎕정도 얻어졌다.

II. 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic chromatography) (Batchwise Method)

1. 끓인 혈장(boiled 혈장) 200㎕를 1% TFA 200㎕와 1 : 1의 비율로 희석하였다.(끓인 혈장 200 ㎕ + 1% TFA 200㎕ = 400㎕)

2. 원심분리 칼럼(centrifuge column) 1개에 옥틸-세파로즈 비드(Octyl-Sepharose beads)를 200㎕가 되도록 패킹(packing)한 후 3,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여 보존용액을 스핀 아웃(spin out) 한 후, 1% TFA 400㎕로 비드(beads)를 프리-이퀴블레이션(pre-equilibration) 해주었다. 이 때 사용하는 칼럼과 동일한 조건의 칼럼으로 균형(balance)를 맞춰서 원심 분리 해주었다.(2~3회)

3. 비드가 패킹된 칼럼에 1번 과정에서 만든 희석된 혈장 400㎕를　20분 동안 바인딩(binding)시켰다. 칼럼을 을 3,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 바인딩되지 않은 단백질을 스핀 아웃 해내었다.

4. 비드를 0.1% TFA 용액으로 3번 세척해 주었다.(2분, 3회)

5. 세척 후 비드에 바인딩된 단백질들을 0.1% TFA/10%, 20%, 30%, 50% ACN 400㎕로 elution 하였다. (5분, 각각의 ACN %에서 2회씩)

6. 각 단계에서 용리(elution)된 분획(fraction)들은 금-칩(Au-chip)에 올려 SELDI-TOF로 확인하였고, m/z 9,411 피크(peak)은 30% ACN 용리 단계에서 확인할 수 있었다.

7. 확인된 분획들을 모아서 동결건조기로 건조하였다. 분획에 남아있는 TFA와 ACN을 제거하기 위하여 HPLC D.W를 이용하여 완전건조 후 다시 녹이는 과정을 10회　반복 후 pH 시험지(paper)로 확인하였다.

8. 건조된 샘플을 최종적으로 D.W 40㎕에 녹여 -70℃에 보관하였다.

Ⅲ. 일차원 전기영동

1. 보관중인 샘플 40㎕를 5X 샘플 버퍼(sample buffer)(60 mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% Glycerol, 2% sodium dodecyl sulfate(SDS), 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 10㎕와 혼합하여 100℃에서 5분간 끓이고, 식힌 후 웰(well)에 로딩(loading)하였다.

2. 15% 러닝 겔(running gel)에서 6시간 동안 전기영동을 실시하였다. 전기 영동은 일정한 전류(Constant current)로 1 단계(step)에서는 10mA로 30분 동안 수행했고, 2 단계로 20mA로 5.5 시간 동안 수행하였다.

3. 러닝(Running) 후 Coomassie G-250으로 오버나잇 스테이닝(overnight staining)을 실시하였다.　　

Ⅳ. 패시브 용리(Passive elution)

1. 스테이닝(Staining)된 겔에서 용리할 부분을 피킹(picking)하였다.

2. 피킹한 밴드(band)를 세척하여 coomassie blue dye를 제거하였다. 이 작업은　3회에 걸쳐 5분 동안 50% ACN(acetonitrile)과 50 mM 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate) 혼합용액 20 ul를 가하는 조건하에서 수행하였고, 이 때 스테이닝된 정도에 따라서 세척 횟수를 조절할 수 있다.

3. 세척된 겔 밴드를 100% ACN으로 약 20분 동안 탈수(dehydration)시켰다.

4. 탈수된 겔 밴드에 5~10㎕의 용리액을 가해주었다. 용리액은 10% 포름산(formic acid, 30% ACN, 20% 이소프로판올(isopropanol), 40% HPLC water로 하였다.

5. 용리액을 가하고 2시간 동안 상온에서 강력하게 교반(vigorous shaking) 해주었다.

6. 용리된 단백질(Eluted protein) 2㎕를 금-칩(Au-chip)에 올려 SELDI-TOF MS로 확인하였다.

도 6은 15% 러닝 겔(running gel)에서 전기 영동 결과를 보여 주는 도면이며, 도 7은 패시브 용리 결과를 보여 준다.

이어, 9,411(m/z) 확인(Identification)이다.

Ⅴ. ESI-Q-TOF MS

앞의 Ⅲ단계에서 일차원 전기영동을 실시하고 Ⅳ단계에서 9,411 (m/z) 단백질의 밴드를 패시브 용리로 확인하였다.

확인된 밴드를 잘라내어 메탄올로 세척된 1.7ml effendorf 튜브에 넣어 ESI-Q-TOF MS 분석하였다.

도 8은 마스코트 서치 결과(Mascot Search Results)이다.

도 9는 apolipoprotein C3의 아미노산 서열이다.

ⅤI. Sandwich ELISA Assay

1. 캡처 항체(capture antibody)를 코팅 완충액(coating buffer)(15mM Na₂CO₃, 35mM NaHCO₃, pH 9.6)에 희석 하여(2㎍/ml) 웰(well)(microplate NUNC Immuno^TMModule, 469914)에 50㎕씩 넣어 코팅한 후 4℃에서 오버나잇(overnight)하였다.

2. PBS-T(0.05% Tween20)(Sigma, P5927)를 이용하여 3회 반복하여 세척하였다.

3. 5% 스킴 밀크(skim milk)/PBS-T를 웰당 300㎕씩 넣어주고, 상온에서 2시간 인큐베이션(incubation) 하였다.

4. PBS-T를 이용하여 3회 반복하여 세척하였다. (3회 반복)

5. 혈장 샘플을 assay diluent(1% BSA/PBS-T)에 1:10,000으로 dilution 하여 well당 50㎕씩 넣어준 후, 상온에서 2시간 incubation 하였다. 이 때, 사용된 혈장은 SELDI-TOF 실험에 사용된 것과 동일한 혈장 샘플을 사용하였다.

6. PBS-T를 이용하여 세척하였다. (3회 반복)

7. biotinylation된 디텍션항체(detection antibody)를 assay 희석액(diluent)(1% BSA/PBS-T)에 희석(1㎍/ml)하여 웰당 50㎕씩 넣어준 후, 상온에서 1시간 인큐베이션하였다.

8. PBS-T를 이용하여 3분동안 3회 반복하여 세척하였다.

9. Streptavidin-HRP(Horse Radish Peroxidase; Sigma, S5512)를 assay 희석액(1% BSA/ PBS-T)에 희석(1:1,000)하여 웰당 50㎕씩 넣어준 후, 상온에서 30분간 인큐베이션하였다.

10. PBS-T를 이용하여 3분동안 3회 반복하여 세척하였다.

11. TMB(KPL, 52-00-00) solution을 웰당 50㎕씩 넣어 발색시킨 후(15분), 반응정지액(2N-H₂SO₄)을 50㎕씩 넣어주었다.

12. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.(ELISA reader, Emax, U.S.A)

도 10은 정상인(control)과 환자군(GDM)에 대한 apolipoprotein C3의 정량값에 대한 박스 플롯(box plot)을 보여 주고 있다. 상기 박스 플롯에서 알 수 있듯이, apolipoprotein C3의 정량값은 양자에서 뚜렷한 차이가 있음을 보여 주고 있다.

표 2는 정상인(Control)에 대한 실험 결과이다.

샘플번호	Group	SELDI Intensity (ApoC3) m/z 9,411	ApoC3 ELISA 정량 (㎍/ml)
1.1	정상인	246.9	96.1
2.1	정상인	303.6	98.1
3.1	정상인	215.4	137.2
4.1	정상인	261.3	120.3
5.1	정상인	319.6	111.7
6.1	정상인	278.3	108.6
7.1	정상인	274.7	-
8.1	정상인	368.4	114.9
9.1	정상인	295.4	104.2
10.1	정상인	272.2	94.7
11.1	정상인	238.9	119.9
12.1	정상인	244.6	91.5

표 3은 환자군(GDM)에 대한 실험 결과이다.

샘플번호	Group	SELDI Intensity (ApoC3) m/z 9,411	ApoC3 ELISA 정량 (㎍/ml)
1	환자군	379.8	129.3
2	환자군	272.3	119.9
3	환자군	466.5	156.0
4	환자군	431.0	156.1
5	환자군	311.9	-
6	환자군	385.3	117.9
7	환자군	406.9	136.3
8	환자군	353.5	121.8
9	환자군	360.5	117.9
10	환자군	341.8	115.0
11	환자군	355.6	163.6
12	환자군	308.6	97.8

상기 표 2와 표 3에서 알 수 있듯이, 정상인과 환자군은 SELDI 강도 및 ELISA 정량 값 간에 의미 있는 뚜렷한 차이가 있음을 알 수 있었다. 특히, 도 10에서 알 수 있듯이, 정상인과 환자군간에는 apolipoprotein C3 ELISA 정량값에서 뚜렷한 차이가 보임을 알 수 있다. 상기 표 2와 표 3과 같은 실험 결과를 분석하여, SELDI 강도 및 ELISA 정량 값을 기준으로 임신성 당뇨 위험군 범주를 설정할 수 있을 것이다. 그리고, 상기 임신성 당뇨 위험군 범주의 결정은 실험 결과가 누적될수록 상대적으로 더 타당한 통계학적 범주를 결정할 수 있게 됨은 분명하다 할 것이다. 다만, 특정한 임산부와 관련된 SELDI 강도 및 ELISA 정량 값이 있을 때, 임신성 당뇨 진단에 관한 의사 결정은 전문의마다 조금씩 다를 수 있으므로, 임신성 당뇨 위험군 범주의 설정도 이에 따라 달라질 수도 있음은 물론이다 할 것이다.

도 11은 SELDI 강도 (m/z 9,411) 와 ELISA 정량 결과 간의 상관도 비교이다. 도 11에서 알 수 있듯이, 상관 관계가 상당히 높음을 알 수 있다.

상기 과정에서 알 수 있듯이, 본 발명에서는 임신성 당뇨로 진행될 임신부에서, 임신성 당뇨가 발병하기 이전 채혈한 혈액 내에서 이미 apolipoprotein C3 단백질이 임신성 당뇨가 발병하지 않은 정상 임신부들에 비하여 뚜렷하게 증가한 상태에 있어, apolipoprotein C3가 당뇨 가능성을 미리 예측하는데 사용될 수 있는 바이오마커임을 밝혔다.　　　　　

상기에서와 같이, 본 발명자들은 임상적으로 확진된 임신성 당뇨 환자들이 당뇨로 판정되기 이전에 채혈한 혈장에서 SELDI-TOF MS방법, 단백질 서열분석 방법을 사용하여, 후에 임신성 당뇨가 발병한 임신부군에서 정상 임신부군에 비해 유의한 증가를 보이는 SELDI-TOF MS peak(9,411 m/z)을 발굴하였다. 상기 피크는 크로마토그래피와 일차원 전기영동으로 분리한 후,　ESI-Q-TOF MS 분석을 통해서 apolipoprotein C3로 확인하였다. 이어, apolipoprotein C3를 Sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 정량하여 임신성 당뇨환자 그룹이 임신성 당뇨를 진단받기 이전에 채혈한 혈장에서 apolipoprotein C3가 후에 임신성 당뇨가 발병하지 않은 정상 임신부에서보다 증가되어 있음을 확인하였다. 또한 당뇨환자의 혈당 상태 (최근 1~3개월) 모니터링을 위해 현재 널리 쓰이고 있는 지표인 hemoglobin A1C는 임신성 당뇨로 진단받은 모든 임신부에서 임신성 당뇨 진단 당시에 정상이었다.본 연구에서의 결과는 apolipoprotein C3가 Hemoglobin A1C보다 조기에 당뇨에 반응하는 단백질임을 알 수 있었다.

이에 따라, apolipoprotein C3가 임신 16주 내지 20주 사이의 임신부를 대상으로 임신성 당뇨를 조기 진단하는 효과적인 바이오마커가 될 수 있음이 증명되었다. apolipoprotein C3가 임신 16주 내지 20주 사이 임신부의 임신성 당뇨를 진단하기 위한 바이오마커가 될 수 있으므로, 하기와 같은 apolipoprotein C3의 활용이 가능할 것이다.

이어, 임신성 당뇨 조기 진단 방법을 설명한다. 본 발명의 임신성 당뇨 조기 진단은 (A) 임신 제 이 삼분기 초기 또는 임신 16주 내지 20주에 도달한 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청의 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 단계; (B) 상기 혈액, 혈장 또는 혈청에서 혈당을 정량하는 단계; 및 (C) 상기 apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 위험 apolipoprotein C3 범주에 포함되는 지를 판단하는 단계;를 포함하는 것으로 처리할 수 있다. 특히, apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 위험 apolipoprotein C3 범주에 속하고, 혈당이 정상 범주에 속하는 임신부는 임신성 당뇨의 가능성이 높다고 진단할 수 있을 것이다. 상기 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 것은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정되는 것인 것이 바람직하며, 상기 바이오칩은 단백질칩 또는 핵산 어레이일 수 있다.

이어, 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝 방법을 설명한다. 본 방법은 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 사용하여 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 단계; 및 상기 apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 위험 apolipoprotein C3 범주에 속하는 지를 판단하는 단계;를 포함할 수 있다.

이어, 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법이다. 상기 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법을 실시하는 임신성 당뇨 조기 진단 정보 시스템은 (K) 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청의 apolipoprotein C3 발현량 정량 정보를 입수하는 단계; (L) 상기 apolipoprotein C3 발현량 정량 정보가 기설정된 apolipoprotein C3 위험군 범주에 속하는 지를 확인하는 단계; 및 (M) 상기 (L) 단계의 조건이 충족되는 경우, 상기 apolipoprotein C3 발현량 정보로 임신성 당뇨 위험 정보를 생성하는 단계;를 더 포함하는 방식으로 apolipoprotein C3 발현량 정보를 활용하는 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법을 수행할 수 있다. 이때, 상기 임신성 당뇨 조기 진단 시스템은 상기 혈액, 혈장 또는 혈청에서의 혈당 정량 정보를 입수하고, 상기 혈당 정량 정보가 정상 범주에 속하는 경우, 상대적으로 더 높은 확률로 상기 apolipoprotein C3 발현량 정보로 임신성 당뇨 위험 정보를 생성할 수 있게 된다. 상기 임신성 당뇨 위험 정보에는 apolipoprotein C3 발현량 수치 정보와 상기 수치 정보가 임신성 당뇨의 위험 정도와의 관계에 관한 정보가 더 포함되어 있을 수 있다.

마지막으로 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 제시한다. 상기 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 apolipoprotein C3 Antibody: (chemicon, AB821), apolipoprotein C3 Antibody: (biodesign, K97113R), apolipoprotein C3 Antibody: (usbiological, A2299-68A), apolipoprotein C3 Antibody: (abcam, ab31528), apolipoprotein C3 Antibody: (abcam, ab77664), apolipoprotein C3 Antibody: (Abnova Corporation, H00000345-M06), apolipoprotein C3 Antibody: (GenWay Biotech, Inc., 18-272-197661), apolipoprotein C3 Antibody: (LifeSpan BioSciences, LS-C20742), apolipoprotein C3 Antibody: (Abgent, AP7797b), apolipoprotein C3 Antibody: (MyBioSource.com, MBS316057), apolipoprotein C3 Antibody: (Sigma-Aldrich, SAB1300918)와 같은 것들이 있을 수 있다.

한편, 바이오마커가 존재할 때, 이들 바이오마커에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 등을 사용하는 키트의 구조는 당업자들이 통상적으로 사용하는 키트가 활용될 수 있다.

본 발명은 의료 산업, 보건 산업, 진단 산업에 광범위하게 활용될 수 있다.

Claims

(A) 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청의 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 단계;
(B) 상기 혈액, 혈장 또는 혈청에서 혈당을 정량하는 단계; 및
(C) 상기 apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 위험 apolipoprotein C3 범주에 포함되는 지를 판단하는 단계;를 포함하며,
상기 혈액, 혈장 또는 혈청은 임신 제 이 삼분기 초기 또는 임신 16주 내지 20주에 도달한 모체에서 분리된 것인 것을 특징으로 하는 임신성 당뇨 조기 진단 방법.
제1항에 있어서,
상기 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 것은 2차원 전기영동, 바이오칩 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정되는 것인 것을 특징으로 하는 임신성 당뇨 조기 진단 방법.
임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 임신성 당뇨의 진단을 위한 바이오마커로 사용되는 apolipoprotein C3 단백질.
임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 임신성 당뇨의 진단을 위하여 apolipoprotein C3를 바이오마커로 사용하는 방법.
임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트를 사용하여 apolipoprotein C3의 발현량을 정량하는 단계; 및
상기 apolipoprotein C3의 발현량이 기설정된 위험 apolipoprotein C3 범주에 속하는 지를 판단하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝 방법.
(K) 임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청의 apolipoprotein C3 발현량 정량 정보를 입수하는 단계;
(L) 상기 apolipoprotein C3 발현량 정량 정보가 기설정된 apolipoprotein C3 위험군 범주에 속하는 지를 확인하는 단계; 및
(M) 상기 (L) 단계의 조건이 충족되는 경우, 상기 apolipoprotein C3 발현량 정보로 임신성 당뇨 위험 정보를 생성하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 apolipoprotein C3 발현량 정보를 활용하는 임신성 당뇨 조기 진단 정보 처리 방법.
임신 16주 내지 20주인 모체에서 분리한 혈액, 혈장 또는 혈청을 대상으로 apolipoprotein C3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 임신성 당뇨 모니터링, 진단 및 스크리닝용 키트.