KR20120133382A

KR20120133382A - 대사 장애의 치료

Info

Publication number: KR20120133382A
Application number: KR1020127023681A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 이안 베이리페
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2011-02-07
Publication date: 2012-12-10
Also published as: MX2012009167A; ZA201205997B; EP2534175A2; SG182783A1; WO2011098424A2; AU2011214440A1; US20120308564A1; CA2788758A1; JP2013518863A; CN102834413A; WO2011098424A3; EA201290630A1

Abstract

본 발명은 타입 II 당뇨병 및 비만을 포함하는 대사 장애의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 IL-18 길항제, 특히 항-IL-18 항원 결합 단백질, 특히 항-IL-18 항체를 이용하여 대사 장애를 치료하고/하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

대사 장애의 치료{TREATMENT OF A METABOLIC DISORDER}

발명의 분야

발명의 배경

인터루킨-18(IL-18)은 IL-1 사이토카인 패밀리의 일원이다. IL 18은 다양한 범위의 면역 적격 및 중간엽 세포에 대해 효능 있는 효과를 갖는 다상유전성 사이토카인(pleiotropic cytokine)이다(Nakanishe et al. (2001) Ann Rev Immunol 19: 423-427). IL-18의 가장 특징적인 생물학적 기능은 미생물 병원체에 대한 숙주 방어에서의 이의 역할이다. IL-18은 Th1 및 NK 세포의 활성화 및 분화, 전염증성 사이토카인 IFN-γ의 생성(Dinarello and Boraschi (2006) Eur Cytokine Netw 17: 224-52), Fas 및 Fas 리간드(FasL)의 상향조절, 및 또한 다른 전염증성 매개체의 강화작용을 통해 바이러스 및 다른 세포내 병원체에 대한 선천 및 후천 면역 둘 모두를 준비한다. 더욱이, IL-18은 인간 미세혈관 내피세포 이동 및 관 형성에 대한 효능 있는 화학주성 자극인 것으로 제시되며(Park et al. (2001) J Immunol 167: 1644-1648), 이는 직접적으로 또는 산화 스트레스 경로 및 기질 금속단백질을 통해 내피 기능을 변경시킬 수 있거나, 혈관 평활근 세포 이동 및/또는 증식을 유도할 수 있다.

193개의 아미노산 잔기 길이인 IL-18의 자연 세포 전구체인 프로-IL-18은 카스파제-1 또는 프로테이나제-3에 의해 절단되어 156개의 아미노산 잔기 길이인 생물학적 활성 성숙 18 kDa 단백질이 생성된다(Ghayur et al. (1997) Nature 386: 619; Gu et al (1997) Science 275:206-208). 성숙 IL-18은 IL-18Rα 서브유닛에 결합하여 세포 표면 상에서 IL-18Rβ를 점증시킨다. IL-18과 이종이합체 세포 표면 수용체 사이의 상호작용은 TLR 및 IL-1 수용체와 같은 다른 IL-1R 패밀리 일원과 공유된 신호전달 경로를 유도한다(Kato et al. (2003) Nat Struct Biol 10: 966). IL-18은 대식세포, 수지상 세포, 파골세포, 활막 섬유모세포, 지방세포, 및 상피세포에 의해 발현된다. 반면, IL-18R 수용체는 대식세포, 림프구, 호중구, 자연살세포, 내피세포, 상피세포 및 평활근 세포에서 주로 발현된다(Gracie, et al. (2003) J Leukoc Biol 73:213; Nakanishe et al. (2001) Ann Rev Immunol 19:423-427). 생체내에서, IL-18R 복합체에 대한 IL-18의 결합은 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 의해 조절된다. IL-18BP는 항시적으로 발현되고, IL-18 기능의 자연 억제제로 작용한다.

자가면역 질병의 발달에서의 IL-18의 가정된 역할은 하기 발견에 의해 뒷받침된다. IL-18은 다양한 자가면역 질병, 가장 특히 성인 발병성 스틸병(AOSD)(혈장 및 간)(Kawashima et al. (2001) Arthritis Rheum 44: 550-560), 전신홍반루푸스(SLE)(혈장 및 다양한 조직), 류머티스 관절염(RA)(혈장 및 활막)(Tanaka et al. (2004) Life Sciences 74:1671-1674), 크론병(혈장 및 장 상피)(Pizarro et al. (1999) J Immunol 162:6829-6835) 및 건선(혈장 및 피부)(Ohta et al. (2001) 293:334-342)과 관련된 다양한 표적 조직에서 상승된다.

보다 최근에는, 말초에서의 IL-18 수준이 또한 체중 및 인슐린 내성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌고, IL-18은 타입 2 당뇨병(T2DM)으로의 진행을 예측하는 잠재성을 갖는다(Murdolo et al. (2008) Am J Physiol Endocrinol Metab 295: E1095-E1105; Fischera et al. (2005) Clinical Immunology 117:152-160). 또한, IL-18의 순환 수준은 또한 인과적으로 비만 및 T2DM의 다수의 동반이환과 관련된 것으로 보인다. 특히, IL-18의 혈장 수준은 내막-중막 비후화와 관련이 있고, T2DM 환자에서 추후의 심혈관 사건을 예측하는 것으로 밝혀졌다[Yamagami et al. (2005) Arterioscler Thromb Vase Biol. 25:1458-1462].

T2DM는 말초 인슐린 내성, 예를 들어, 인슐린에 대해 적절히 반응하는데 실패한 세포, 증가된 간 글루코오스 생성 및 손상된 인슐린 분비를 특징으로 한다. T2DM의 이환률은 식이 패턴에서의 변화(보다 높은 수준의 비만) 뿐만 아니라 생활양식에서의 변화(보다 앉아있는 양식)로 인해 최근 수년간 현저하게 증가하여 유행병 비율에 도달하였다. T2DM에 대한 제 1선의 치료는 식이, 체중 조절 및 신체 활동 증가이다. 그러나, 이러한 방법이 혈중 글루코오스 수준을 감소시키는데 성공적이지 않은 경우, 환자는 글루코오스 저하 약물, 예를 들어, 메트포르민(metformin)이 처방될 수 있거나, 인슐린 주사를 필요로 할 수 있다. T2DM을 조절하기 위해 다수의 다른 치료가 이용되며, 이들은 PPAR 감마 효능제, 예를 들어, 로시글리타존(rosiglitazone), GLP1 수용체 효능제(예를 들어, 엑세나티드(exenatide)(Byetta™), 리라글루티드(liraglutide)(Victoza™)) 및 PYY 수용체 효능제를 포함한다.

위약에 비해 10%를 초과하는 체중 감소를 제공하는, 현재 시판되거나 개발중인 단독 또는 조합된 항-비만제는 존재하지 않는다. 또한, 많은 시판되는 약물은 구역 및 구토와 같은 중증의 내약성 문제를 발생시킨다. 개발되는 소분자 및 생물학적 제제의 수가 증가되고 있다. 특히, 여전히 유의한 부작용을 갖지만 위약 대조 3상 시험(PhIII trial)에서 1.6%(4lbs)에 비해 11% 체중 감소를 나타낸, 펜터민과 토피라메이트의 조합물인 Qnexa™을 주목하라. 또한, 펩티드 조합물(글루카곤/GLP-1 공동-효능제, 및 GLP-1/옥신토모듈린(oxyntomodulin) 공동-효능제:Merck)이 현재 전임상 연구중이며, 둘 모두는 여전히 부작용과 관련될 수 있으나 유의한 체중 감소를 나타낸다.

T2DM과 대조적으로, 타입 1 당뇨병(T1DM)은 당뇨병 환자의 5-10%가 걸려 있으며, 이는 췌장 내 랑게르한스섬 내의 β-세포 상실의 결과로서 신체가 인슐린을 생성하는데 실패하는 것으로부터 발생한다. T1DM 환자는 인슐린 주사 형태의 치료를 필요로 한다.

당뇨병 분야에서의 IL-18 길항제에 대한 연구는 타입 1(자가면역) 당뇨병에 집중된다. 예를 들어, 길항성 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)은 어린 마우스에 예방적으로 투여되는 경우 T1DM의 비-비만 마우스(NOD) 모델에서 당뇨병의 진행을 감쇠시키는 것으로 밝혀졌다. 저자는 β-세포 아폽토시스에 대한 IL-18BP의 가능한 보호적 효과를 가정한다(Zacconea and Phillips (2005) Clinical Immunology 115: 74-79). 또한, IL-18BP는 생체외 β-세포 파괴 검정에서 아폽토시스로부터 β-세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다(Lewis and Dinarello (2006) PNAS 103: 16852-16857).

혈청 및 말초 조직 내의 IL-18은 고-지방 식이가 급식된 비만 마우스(T2DM 모델)에서 인슐린 내성(IR) 발생이 현저하게 상승되고, 인슐린 내성(IR) 발생과 관련이 있는 것으로 밝혀진 반면, 공개된 문헌에서는 상기 모델에서 IL-18 길항제의 영향에 대한 어떠한 연구의 증거도 없다.

IL-18 넉-아웃(knock-out) 마우스가 연구되었다. IL-18 넉-아웃 마우스는 과식(hyperphagic) 마우스이며, 비만 및 인슐린 내성이 된다. 최근의 IL-18 넉-아웃 마우스의 대사 분석은 두개내 용량의 뮤린 IL-18을 이용한 IL-18 넉-아웃 마우스의 재구성이 정상 급식 행동을 회복하며, 이후에 체중 감소 및 정상 혈당(glycaemic) 조절을 발생시키는 반면, 정맥내(IV)/복막내(IP) 뮤린 IL-18은 인식가능한 효과가 없는 것을 나타내었다. 이러한 데이터에 비추어, 포만 반응을 촉진하는데 있어서 IL-18의 작용에 대한 직접적 또는 간접적인 표적 기관으로서 시상하부와 관련된 급식 행동 조절에서의 IL-18의 중추적 역할이 제안되었다(Zorilla et al. (2007) PNAS 104:11097-11102; Natea and Joosten (2006) Nat Med 12:650-656). 비만 및 인슐린 내성은 상기 마우스에서 과식증의 유도로부터 발생하는 이차적 결과인 것으로 제안되었다.

IL-18 넉-아웃 마우스에서의 발견은 상승된 IL-18 수준을 인간 대사 질병의 증가된 중증도와 결부시키는 데이터와 역설적으로 합치되며, 이는 대사 질병에 있어서 원인이 아니라 인간에서의 IL-18의 상승된 발현이 보상 반응일 수 있음을 암시할 수 있다.

따라서, 특히 대사 질병과 관련하여 IL-18의 정확한 역할은 명확한 것과는 거리가 멀고, 대사 질병 모델 또는 임상에서 IL-18에 대해서는 인과관계가 확립되지 않았다.

발명의 개요

대사 질병, 예를 들어, T2DM, 비만-관련 T2DM, 및 비만의 이환률이 제공되면, 상기 대사 질병, 예를 들어, T2DM, 비만-관련 T2DM, 및 비만에 대한 안전하고 개선된 치료 및 예방적 수단이 필요하다. T2DM에 대해 소수의 효과적인 약리학적 개입(intervention)이 존재하며, 대부분은 불량한 효능 및 유의한 내약성 문제와 관련된다. 또한, 요법이 중단된 후 체중이 통상적으로 회복되며, 종종 현존하는 치료는 β-세포 기능의 감소 및 T2DM으로부터 T1DM으로의 전환으로 인한 종국적인 β-세포 파괴를 방지하는데 실패한다.

본 발명의 목적은 대사 질병에 대한 신규하고 개선된 치료, 특히 체중을 감소시키고, 혈당 조절을 개선시키고, β-세포 기능의 상실 없이 인슐린 민감성을 증가시키고, 결과로서 질병 진행을 늦추는 T2DM에 대한 신규한 치료를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 다른 T2DM 동반이환, 예를 들어, 심혈관 건강을 개선시키는 것이다.

본 발명은 첫번째 양태로 환자에서 대사 장애를 치료하거나 예방하고/하거나 환자에서 혈당 조절을 개선시키는데 사용하기 위한 IL18 길항제를 제공한다.

본 발명은 두번째 양태로 치료적 유효량의 IL-18 길항제를 대사 장애에 걸린 환자에 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세번째 양태로 예방적 유효량의 IL-18 길항제를 대사 장애에 걸리기 쉬운 환자에 투여함으로써 상기 환자에서 대사 장애를 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명은 네번째 양태로 치료적 유효량의 IL-18 길항제를 환자에 투여함으로써 상기 환자에서 혈당 조절을 개선시키는 방법을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1-10은 IL-6, JAK2, SOCS3, STAT3, MCP-1(CCL2), MCP-4(CCL13), IRS2, PPAR 감마, LEP 및 LEPR에 대한, A) Synagis(항-RSV) IgG 1 ug/ml, B) IL-18 50 ng/ml, C) IL-18 50 ng/ml + H1L2 1 ug/ml 또는 D) H1L2 1 ug/ml로 처리된 10명의 건강한 공여자로부터의 생체외 전혈 샘플에 대한 강도 값(log 척도)을 도시한다. 데이터 포인트는 공여자에 의해 쉐이딩(shading)된다.

발명의 상세한 설명

본 발명자는 인슐린 내성이 염증 장애이고, 면역계의 세포 뿐만 아니라 지방 조직에 의해 합성된 염증성 매개체가 인슐린의 조절과 관련된 것을 가정한다. 본 발명자는 과다-영양 및 비만이 염증성 마커 발현에서의 증가를 발생시키고, 이후에 대식세포의 지방 조직으로의 침윤을 증가시키는 결과를 갖는 낮은 만성 염증 상태를 야기시키는 것을 가정한다. 이러한 대식세포는 지방세포에서 인슐린 신호전달을 손상시키고, 이후에 지질분해 및 지방산의 순환으로의 방출을 증가시키는 전염증성 사이토카인을 분비한다. 지방산은 간 및 골격근이 인슐린 내성이 되도록 하고, 당뇨병의 발달을 야기시키는 당뇨병 전증 상태의 원인이 된다.

놀랍게도, 본 발명자는 IL-18이 인간 혈액에서 인터루킨-6(IL-6) 및 이의 중요 신호전달 분자(예를 들어, Janus 키나제 2 - JAK2)의 발현을 유도하고, 이러한 효과가 본 발명의 IL18 길항제, 즉, H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)에 의해 중화될 수 있는 것을 발견하였다.

IL-6은 만성 염증의 중요 매개체이고, 비만, 인슐린 내성 및 T2DM과 관련된다. 지방 조직은 순환 IL-6 수준의 35%까지 기여할 수 있다. 만성의 낮은 수준의 IL-6 발현의 전신 효과는 신호 전달인자 및 전사 활성인자 3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3) 및 사이토카인 신호전달의 억제제 3(suppressor of cytokine signalling 3, SOCS3) 발현을 통해 인슐린 기능을 억제할 수 있다. JAK2 및 STAT3은 SOCS3의 발현을 증가시키고, 이는 근육 및 지방세포에 의한 순환 글루코오스의 흡수를 감소시키고, 글리코겐 가용성을 감소시키는 인슐린 수용체 기질(IRS; 또한 IL-18에 의해 감소됨)의 인슐린 수용체(IR) 활성화를 방지할 수 있다(Kim et al. (2009) Vitamins and Hormones 80: 613-633).

따라서, 본 발명자의 관찰은 IL-18 길항제가, IL-6 수준 또는 IL-6 발현이 건강한 개체에서의 정상 수준 또는 발현에 비해 상승된 장애, 예를 들어, 대사 장애, 예를 들어, T2DM, 비만 T2DM 및 비만에 대한 유용한 치료제일 수 있음을 처음으로 암시한다.

또한, 본 발명자는 IL-18 길항제가 단핵구 화학주성 단백질(MCP-1 및 MCP-4)을 포함하는 다른 중요한 염증성 매개체를 하향조절하는 것을 밝혀내었다. 이러한 화학주성 단백질은 유전적 비만 마우스 및 비만이 고 지방 식이를 통해 유도된 건강한 마우스에서 증가된다. MCP-1 및 MCP-4가 비만 피검체의 지방조직에서 낮은-등급의 염증성 반응(대식세포 침윤)의 유도에 의해 인슐린 내성과 비만을 결부시키는 것으로 제시되었다.

추가로, 본 발명자는 IL-18이 인간 혈액에서 IRS2의 발현을 감소시키고, 이러한 효과가 본 발명의 IL18 길항제, 즉, H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)에 의해 중화될 수 있는 것을 밝혀내었다.

인슐린 신호전달은 영양소 항상성에서 특히 중요한 IRS-2와 함께 인슐린 수용체 기질 IRS1-4의 티로신 인산화를 통해 역-조절 신호전달과 통합된다. IRS-2는 인슐린의 대사 및 성장-촉진 효과의 주요 효과기이며, 이는 췌장 베타 세포 기능 및 생존 및 주요 영양소 감지를 촉진한다(Dong et al., (2006) J. Clin. Invest., 116(1):101-104). 마우스에서의 IRS-2의 조건적 넉아웃은 식욕, 마른체중 및 체지방, 및 당뇨병으로의 종국적인 진행을 갖는 선형 성장을 증가시킨다. 또한, IRS-2 넉아웃은 공복 고혈당증, 공복 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 글루코오스 불내성, 이상지질혈증 및 대사 증후군과 일치하는 다른 특징을 발생시킨다(Taniguchi et al., (2005) J. Clin. Invest. 115(3): 718-727). 이러한 데이터는 IRS-2의 하향-조절(생체외 혈액 검정에 의해 뒷받침되는 바와 같이 증가된 IL-18에 의함)이 인간에서의 비만의 발생 및 이후의 T2DM으로의 진행에서 중요한 역할을 할 수 있는 것을 암시한다. 항-IL-18 길항제를 이용한 IL-18의 효과의 차단은 IRS-2 기능이상을 역전시킬 수 있다.

본 발명자는 또한 항-IL-18 길항제가 지방조직에서 고도로 발현되는 고아 수용체(orphan receptor)인 PPAR 감마를 상향조절하는 것을 밝혀내었다. PPAR 감마 효능제, 예를 들어, 로시글리타존(rosiglitazone)은, 이들이 인슐린 민감성을 개선시키는 것으로 밝혀짐에 따라 T2DM의 치료에 사용되어왔다.

본 발명자는 또한 항-IL-18 길항제가 렙틴 및 렙틴 수용체를 상향조절하는 것을 밝혀내었다. 많은 증거가 식욕 억제 호르몬인 렙틴 및 렙틴 수용체의 낮은 수준과 비만을 결부시킨다. 렙틴 내성이 비만을 발생시킬 수 있는 것이 제시되며, 렙틴이 비만의 치료에서 사용되어왔다. 렙틴 및 이의 수용체의 상향-조절은 비만 피검체 및 T2DM 환자에서의 식욕 억제 및 이후의 체중 감소에서의 항-IL-18 길항제의 역할을 뒷받침한다.

본 발명자는 또한 놀랍게도 인간 환자에서의 IL-18과 상승된 혈장 글루코오스 수준 사이에 연관성이 있는 것을 밝혀내었다. 따라서, IL-18 길항제는 혈장 글루코오스가 건강한 개체에서의 정상 수준에 비해 상승된 장애, 예를 들어, 대사 장애, 예를 들어, T2DM, 비만 T2DM 및 비만에 대한 유용한 치료제일 수 있다.

또한, 본 발명자는 별개의 연구에서 H1L2가 비만이지만 그 외는 건강한 인간에서 글루코오스 및 인슐린을 포함하는 다양한 대사 파라미터를 조절하는 것을 밝혀내었다.

본 발명자의 발견에 비추어, 본 발명자는 비만 및/또는 당뇨 인간 환자에서 말초 IL-18의 기능을 차단한 후, 낮은-등급의 염증을 예방함으로써 혈청 및 혈장 글루코오스 수준이 감소되고, 인슐린 내성이 감쇠될 것을 예측한다. 말초에서 IL-18 작용을 차단함으로써, 체중 및 지방증이 영향을 받을 것이다. 이는 체중에 영향을 미치고, β-세포 기능에 해로운 영향을 미치지 않고 혈당 조절을 개선시킬 수 있다. 또한, IL-18 길항제는 아폽토시스를 감소시킴으로써 β-세포 기능의 직접적인 보호 효과를 가질 수 있다. 또한, 심혈관 동반이환에 대한 유리한 영향이 예견된다.

명세서 전체에 걸쳐 사용되는 "혈당 조절"은 건강한 개체에서 관찰되는 혈중 글루코오스의 정상 수준에 비한 당뇨병을 갖는 환자에서의 혈중 글루코오스의 통상적 수준, 및 이러한 수준을 조절하는 상기 환자의 능력을 의미한다. 불량한 혈당 조절은 정상 수준을 초과한 지속적으로 상승된 혈중 글루코오스를 의미하고, 완전한 혈당 조절은 항상 정상 범위 내인 혈중 글루코오스 수준을 의미한다.

본원에서 사용되는 "IL-18 길항제"는 IL-18의 생물학적 활성을 다소 억제하거나 길항시키는 작용제이다. IL-18 길항제는 신체로부터 분리되거나 재조합적으로 생성되는 경우(예를 들어, Tadekinig-α^?)에 IL-18에 결합하는 작용제, 예를 들어, 내인성 IL-18 결합 단백질(IL-18BP), 뿐만 아니라 IL-18BP-Fc 융합 단백질, 또는 IL-18에 대한 수용체에 결합함으로써 IL-18이 이의 생물학적 활성을 발휘하는 것을 방지하는 길항제를 포함한다. 특별히 고려되는 IL-18 길항제는 항-IL-18 항원 결합 단백질, 예를 들어, IL-18에 대해 면역특이적이고, IL-18의 활성을 길항시키는 항체이다. IL-18 길항제의 비제한적인 예는 유럽 특허 EP0712931호에 기재된 H1 및 H2, H18-108(Hamasaki et al., 2005), 및 WO01/58956호, WO2005/047307호 및 WO2007/137984호에 기재된 항체를 포함하며, 상기 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 한 구체예에서, IL-18 길항제는 단백질, 예를 들어, 분리되거나 재조합적으로 생성된 IL-18BP, 또는 IL-18 항원 결합 단백질이다. 한 추가 구체예에서, IL-18 길항제는 항원 결합 단백질이다. 한 구체예에서, IL-18 길항제는 신규한 화합물(new chemical entity, NCE)이 아니다. 한 특정 구체예에서, IL-18 항원 결합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 항체 H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11) 또는 이의 변이체이다.

본 발명의 항원 결합 단백질을 의미하는 용어 "항-IL-18"은 상기 항체가 인간 IL-18의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 것을 의미한다. 그러나, 이는 상기 항체가 또한 비-인간 영장류(예를 들어, 레서스(rhesus) 및/또는 시노몰구스(cynomolgus)) IL-18 및/또는 다른 종에 존재하는 IL-18의 형태의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 것을 배제하지는 않는다.

가장 넓은 의미로 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린-유사 도메인을 갖는 분자를 의미하며, 이는 모노클로날, 재조합, 폴리클로날, 키메라, 인간화, 다중특이적, 예를 들어, 이특이적 및 헤테로컨쥬게이트 항체; 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편, 면역학적으로 효과적인 단편, 단쇄 Fv, 디아바디(diabody), Tandabs™ 등(대안적 "항체" 형태의 개요에 대해서는 문헌[Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136]을 참조하라)을 포함한다.

구 "단일 가변 도메인"은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 가변 도메인(예를 들어, VH, VHH, VL)을 의미한다.

"도메인 항체" 또는 "dAb"는 항원에 결합될 수 있는 "단일 가변 도메인"과 동일한 것으로 간주될 수 있다. 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 이는 또한 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인, 예를 들어, 설치류(예를 들어, WO 00/29004호에 개시되어 있음), 너스 상어(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) VHH dAb를 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성시키는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타, 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 VHH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 "도메인 항체"인 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 VH는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질의 나머지와 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 독립된 기능적 특성을 책임지며, 많은 경우에 이는 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 옮겨질 수 있다. "단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N- 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 도메인은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다.

항원 결합 단편은 비-항체 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 도메인 상의 하나 이상의 CDR의 배열에 의해 제공될 수 있다. 도메인은 도메인 항체일 수 있거나, 자연 리간드가 아닌, 항원, 예를 들어, IL-18에 대한 결합을 수득하기 위해 단백질 조작에 적용되는 CTLA-4, 리포칼린(lipocalin), SpA, 어피바디(Affibody), 아비머(avimer), GroEI, 트랜스페린(transferrin), GroES 및 피브로넥틴/어드넥틴(adnectin)으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.

항원 결합 단편 또는 면역학적으로 효과적인 단편은 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 길이이다. 대안적으로, 단편은 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100개의 아미노산 길이이다.

항원 결합 단백질과 관련하여 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다"는 항원 결합 단백질이 IL-18에 결합하고, 다른(예를 들어, 관련되지 않은) 단백질과 결합하지 않거나, 극소로 결합하는 것을 의미한다.

항체와 관련하여 사용되는 용어 "면역특이적"은 표적 단백질(예를 들어, 인간 IL-18)에 결합하고, 다른 단백질에 결합하지 않거나, 극소로 결합하는 항체를 의미한다. 그러나, 상기 용어는 제공된 종(예를 들어, 인간)에서의 표적 단백질에 대한 항체가 또한 다른 종(예를 들어, 비-인간 영장류)에서의 표적 단백질의 다른 형태와 교차 반응할 수 있다는 사실을 배제하지는 않는다.

항원 결합 단백질-IL-18 상호작용의 평형 해리 상수(KD)는 1 mM 또는 그 미만, 100 nM 또는 그 미만, 10 nM 또는 그 미만, 2 nM 또는 그 미만 또는 1 nM 또는 그 미만일 수 있다. 대안적으로, KD는 5 내지 10 nM; 또는 1 내지 2 nM일 수 있다. KD는 1 pM 내지 500 pM; 또는 500 pM 내지 1 nM일 수 있다. 결합 친화성은, 예를 들어, 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩에 커플링된 IL-18을 이용한 항원 포획 및 표면으로의 항체 포획에 의해 BIAcoreTM로 측정될 수 있다. 대안적으로, 결합 친화성은, 예를 들어, 일차 아민 커플링에 의해 CM5 니들(needle)에 커플링된 IL-18을 이용한 항원 포획 및 표면으로의 항체 포획에 의해 FORTEbio로 측정될 수 있다. H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)는 높은 친화성(KD = 30.3 pM)으로 인간 IL-18에 결합한다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항-IL-18 항원 결합 단백질 결합 및 인간 IL-18과 관련된 평형 해리 상수는 25℃에서 측정시 약 30 pM 또는 30 pM 미만이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "중화시키다"는 IL-18의 생물학적 활성이 시험관내 또는 생체내에서 항원 결합 단백질의 부재하에서의 IL-18의 활성에 비해 본원에 기재된 항원 결합 단백질의 존재하에서 감소되는 것을 의미한다. 중화는 IL-18 수용체에 대한 IL-18 결합의 차단, 순환으로부터 IL-18의 청소, IL-18 또는 IL-18 수용체의 하향조절, 또는 효과기 기능에 대한 영향 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있다.

IL-18 활성은 생체외 자극된 전혈에서의 인터페론-γ(IFN-γ) 검정을 이용하여 간접적으로 측정될 수 있다. 간단히, 30ml의 혈액이 표준 시트레이트 또는 헤파린 항응고제로 수집되고, 다음과 같은 프로토콜이 이용된다. 약 3μl의 처리액을 6-웰 플레이트의 웰에 직접 분취시킨다(처리액은 50ng/ml의 IL18 및 적절한 대조군을 포함할 것이다). 각각의 웰에 3ml의 전혈을 첨가하고, 가볍게 진탕시켜 혼합시킨다. 4시간 동안 C0₂ 인큐베이터에서 37℃에서 플레이트를 인큐베이션시키고, 15분 마다 진탕기에서 가볍게 혼합시킨다. 인큐베이션 종료시, 2.5ml의 혈액을 PAX 튜브로 옮기고, PAX 튜브를 8-10회 뒤집고, 2시간 동안 실온에서 위로 세워 저장한다. PAX 튜브를 중간 기간 저장 동안 -20℃로 옮긴다. IFN-γ 수준은 제조업체의 지침에 따라 TaqMan 또는 ELISA/MSD를 이용하여 측정될 수 있다.

"키메라 항체"는 수용자 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된 공여자 항체로부터 유래된 자연 발생 가변 영역(경쇄 및 중쇄)을 함유하는 조작된 항체의 유형을 의미한다.

"인간화된 항체"는 비-인간 공여자 면역글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖는 조작된 항체 유형을 의미하며, 상기 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분은 하나 이상의 인간 면역글로불린(들)로부터 유래된다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화성을 보전하기 위해 변경될 수 있다(예를 들어, 문헌[Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032(1989), Hodgson et al. Bio/Technology, 9:421 (1991)] 참조). 적합한 인간 수용자 항체는 공여자 항체의 누클레오티드 및 아미노산 서열과의 상동성에 의한 통상적인 데이터베이스, 예를 들어, KABAT^? 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스, 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여자 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성(아미노산 기준)을 특징으로 하는 인간 항체는 공여자 CDR의 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기에 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 공여할 수 있는 적합한 수용자 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용자 항체 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용자 항체로부터 유래될 필요가 없는 것이 인지되어야 한다. 종래에 상기 인간화된 항체를 생성시키는 여러 방식이 기재되어 있으며, 예를 들어, EP-A-0239400 및 EP-A-054951을 참조하라. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다.

용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 유전자 서열로부터 유래된 항체를 의미한다. 이러한 완전한 인간 항체는 낮은 면역원성 치료 항체의 공급원으로서 재조작되거나 면역제거된 설치류 모노클로날 항체(예를 들어, 인간화된 항체)에 대한 대안을 제공하며, 이들은 보통 파지 디스플레이 또는 트랜스제닉 마우스 플랫폼을 이용하여 생성된다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다.

용어 "VH" 및 "VL"은 각각 항원 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다.

"CDR"은 항원 결합 단백질의 아미노산 서열의 상보성 결정 영역으로 정의된다. 이들은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 영역이다. 면역글로불린의 가변 부분에는 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역)이 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CDR"은 3개 모두의 중쇄 CDR, 3개 모두의 경쇄 CDR, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR, 또는 적어도 2개의 CDR을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열 내 아미노산 잔기는 케이뱃(Kabat) 넘버링 규칙에 따라 넘버링된다. 본원에 개시된 특정 서열과 관련된 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"이 또한 케이뱃 넘버링 규칙을 따른다. 추가 정보에 대해서는, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조하라.

그러나, 본 발명자는 본 명세서 전체에 걸쳐 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열 내의 아미노산 잔기에 대해 케이뱃 넘버링 규칙을 이용하지만, 다양한 도메인 서열 및 전장 항체 서열 내의 아미노산 잔기에 대해 대안적 넘버링 규칙이 존재하는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 문헌[Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883]에 기재된 것과 같이 CDR 서열에 대해 대안적 넘버링 규칙이 또한 존재한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 CDR 서열의 고려된 부분이고, 이것이 당업자에 의해 이해될 것을 의미할 수 있다.

당업자가 이용가능한 CDR 서열에 대한 다른 넘버링 규칙은 "AbM"(University of Bath) 및 "접촉"(University College London) 방법을 포함한다. 케이뱃, 초티아(Chothia), AbM 및 접촉 방법 중 적어도 2개를 이용한 최소 중첩 영역이 "최소 결합 단위"를 제공하기 위해 결정될 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 하위-부분(sub-portion)일 수 있다.

하기 표 1은 각각의 CDR 또는 결합 단위에 대한 각각의 넘버링 규칙을 이용한 한 정의를 기재한다. 가변 도메인 아미노산 서열을 넘버링하기 위해 케이뱃 넘버링 도표가 표 1에서 사용된다. CDR 정의의 일부가 사용되는 개별적 간행물에 따라 상이할 수 있음이 인지되어야 한다.

표 1

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:7 및/또는 SEQ ID NO:11 내에 함유된 CDR을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRH1(SEQ ID NO:1), CDRH2(SEQ ID NO:2), CDRH3(SEQ ID NO:3), CDRL1(SEQ ID NO:4), CDRL2(SEQ ID NO:5), CDRL3(SEQ ID NO:6)의 CDR 중 임의의 하나 이상 또는 이의 변이체를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDRH1(SEQ ID NO:1), CDRH2(SEQ ID NO:2), CDRH3(SEQ ID NO:3), CDRL1(SEQ ID NO:4), CDRL2(SEQ ID NO:5), 및 CDRL3(SEQ ID NO:6)를 포함한다.

본원에 기재된 CDR 또는 변이체 CDR 중 하나 이상은, 예를 들어, 인간화된 또는 키메라 가변 도메인으로서 인간 프레임워크의 상황으로 존재할 수 있다.

"CDR 변이체"는 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하며, 상기 변형은 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적 변경(예를 들어, 10개 이하의 아미노산)일 수 있고, 상기 변형은 변이체가 변형되지 않은 서열의 생물학적 특징을 보유하는 것을 가능케 한다. 예를 들어, 변이체는 IL-18에 결합하고 이를 중화시키는 기능적 변이체이다. CDR 아미노산 서열의 부분적 변경은 1 내지 수개의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 1 내지 수개의 아미노산의 첨가 또는 삽입, 또는 상기의 조합(예를 들어, 10개 이하의 아미노산)에 의한 것일 수 있다. CDR 변이체는 아미노산 서열에서의 임의의 조합의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 함유할 수 있다. CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열에서의 임의의 조합의 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있다. 아미노산 잔기에서의 치환은 보존성 치환, 예를 들어, 하나의 소수성 아미노산의 또 다른 소수성 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들어, 류신은 발린, 또는 이소류신으로 치환될 수 있다.

한 구체예에서, 항-IL-18 항체는 H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11), ABT-325(Abbott), 및 125-2H(R&D Systems)로 구성된 군으로부터 선택된다.

누클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한" 또는 "서열 동일성"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.

2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 도입시키는데 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유된 동일 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/전체 위치 수 X 100)이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 기재되는 바와 같은 수리적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.

2개의 누클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 2개의 누클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 가중치 페널티 및 4의 갭 가중치를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. 마이어 및 W. 밀러(E. Meyers and W. Miller)(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램에 통합된 니들먼 및 분쉬(Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.

폴리펩티드 서열은 본원에 기재된 폴리펩티드 참조 서열(예를 들어, SEQ ID NO:7 참조)과 동일, 즉 100% 동일할 수 있거나, 이는 동일성 %가 100% 미만이 되는 참조 서열에 비한 아미노산 변경의 특정 정수의 수를 포함할 수 있고, 이는, 예를 들어, 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일할 수 있다. 이러한 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환, 예를 들어, 보존성 및 비-보존성 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 위치, 또는 참조 서열 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 그룹 내의 아미노산 사이에서 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이의 아무 곳에서 발생할 수 있다. 제공된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 수는 본원에 기재된 폴리펩티드 참조 서열(예를 들어, SEQ ID NO:7 참조)에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수에 각각의 동일성 퍼센트의 수 퍼센트(100에 의해 나누어짐)를 곱한 후, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 참조 서열(예를 들어, SEQ ID NO:7 참조) 내의 아미노산의 상기 전체 수로부터 상기 결과를 공제함으로써 결정되거나, n_a ≤ x_a - (x_a·y)의 의해 결정되며, 상기 식에서 n_a는 아미노산 변경의 수이고, x_a는 본원에 기재된 바와 같은 참조 폴리펩티드 서열(예를 들어, SEQ ID NO:7 참조) 내의 아미노산의 전체 수이고, y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 75%에 대해 0.75, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 98%에 대해 0.98, 99%에 대해 0.99, 또는 100%에 대해 1.00이고, ·는 곱셈 운산부호에 대한 기호이며, x_a 및 y의 임의의 비-정수 결과는 x_a로부터 이를 공제하기 전에 가장 가까운 정수로 반버림(rounded down)된다.

동일성 %는 서열의 길이 전역에서 결정될 수 있다.

본 발명의 항체 중쇄는 SEQ ID NO:7(중쇄 H1), SEQ ID NO:8(중쇄 H2), 또는 SEQ ID NO:9(중쇄 H3)와 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 중쇄는 SEQ ID NO:7(중쇄 1)과 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과 또는 100%의 동일성을 갖는다.

본 발명의 항체 경쇄는 SEQ ID NO:10(경쇄 L1), SEQ ID NO:11(경쇄 L2), 또는 SEQ ID NO:12(경쇄 L3)와 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과, 또는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 경쇄는 SEQ ID NO:11(경쇄 L2)과 75% 또는 그 초과, 80% 또는 그 초과, 85% 또는 그 초과, 90% 또는 그 초과, 95% 또는 그 초과, 96% 또는 그 초과, 97% 또는 그 초과, 98% 또는 그 초과, 99% 또는 그 초과, 또는 100%의 동일성을 갖는다.

본 발명의 항체 중쇄는 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:9의 변이체일 수 있다. 한 구체예에서, 항체 중쇄는 SEQ ID NO:7의 변이체이다. 본 발명의 항체 경쇄는 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 또는 SEQ ID NO:12의 변이체일 수 있다. 한 구체예에서, 항체 경쇄는 SEQ ID NO:11의 변이체이다.

용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 각각은 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.

특정 아미노산 치환이 "보존성"인 것으로 간주되는 것이 당 분야에 널리 인지되어 있다. 아미노산은 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 그룹으로 나누어지며, 항원 결합 단백질의 결합 친화성 전부 또는 실질적 전부를 유지시키는 그룹 내에서의 치환이 보존성 치환으로 간주된다. 예를 들어, 하기 표 2를 참조하라:

표 2

한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 IL-18에 특이적으로 결합하고 이를 중화시키며, SEQ ID NO:7의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 서열을 포함하는 참조 항체(H1L2)와 IL-18에 대한 결합에 대해 경쟁한다.

항원 결합 단백질과 참조 항체 사이의 경쟁은 경쟁 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 경쟁하는 항원 결합 단백질은 동일 에피토프, 중첩 에피토프, 또는 참조 항체가 결합하는 에피토프와 근접한 에피토프에 결합할 수 있다.

항원 결합 단백질은 래트, 마우스, 영장류(예를 들어, 시노몰구스, 구세계원숭이(Old World monkey) 또는 대형 유인원) 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질은 인간화된 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 항원 결합 단백질은 인간 항체일 수 있다.

항원 결합 단백질은 임의의 이소형(isotype) 또는 서브클래스일 수 있는 불변 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역은 IgG 이소형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체일 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질 불변 영역은 IgG1이다.

불변 도메인 영역을 포함하는 항원 결합 단백질은 감소된 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능을 가질 수 있다. 불변 도메인은 IgG2 또는 IgG4 이소형의 자연 불능화된 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 도메인을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 EP0307434호에 기재되어 있다. 한 예는 위치 235 및 237에서의 알라닌 잔기의 치환을 포함한다(EU 지표 넘버링).

항원 결합 단백질은, 항체가 향상된 효과기 기능/ADCC 및/또는 보체 활성화를 갖도록 하는 돌연변이된 불변 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 문헌[Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604, Lazar et al. PNAS (2006) 103:4005-4010] 및 US6737056호, WO2004063351호 및 WO2004029207호에 기재되어 있다.

항원 결합 단백질은, 이러한 항원 결합 단백질이 향상된 효과기 기능/ADCC 및/또는 보체 활성화를 갖도록 하는 변경된 당화 프로파일을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키기 위한 적합한 방법의 예는 WO2003/011878호, WO2006/014679호 및 EP1229125호에 기재되어 있다.

본원에 기재된 바와 같은 IL-18 길항제, 예를 들어, 항원 결합 단백질의 정제된 제조물은 본원에 기재된 인간 질병, 장애 및 질환, 특히 대사 장애의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물에 통합될 수 있다. 용어 질병, 장애 및 질환은 상호교환적으로 사용된다.

본 발명의 IL-18 길항제, 특히 항원 결합 단백질은 대사 장애를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 대사 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 IL-18 길항제, 특히 항원 결합 단백질의 용도가 또한 제공된다.

"대사 장애"는 탄수화물, 아미노산, 유기산, 지방산, 미토콘드리아, 스테로이드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 신체 내의 물질의 대사에서의 불균형에 의해 규정되는 임의의 장애이다. 대사 장애는, 비제한적인 예로, 인슐린 내성, 타입 2 당뇨병(T2DM), 비만, 대사 증후군, 이상지혈증, 급성 췌장염, 간부전, 및 T2DM과 관련된 동반이환(예를 들어, 죽상경화증, 심혈관 질병)을 포함한다. 한 구체예에서, 대사 장애는 T2DM이다.

한 구체예에서, 본 발명의 IL-18 길항제는 인간 환자에서의 글루코오스 수준을 감소시킨다.

본 발명의 IL-18 길항제는 말초 인슐린 내성을 개선시킬 수 있고/있거나, 혈당 조절을 개선(즉, 8.9 mmol/L 미만, 특히 3.9 내지 7.2 mmol/L의 공복 혈중 글루코오스에 대한 표적 범위의 유지)시킬 수 있고/있거나, 베타 세포를 보호하고 베타 세포 기능의 상실을 방지할 수 있고/있거나, 췌장 기능을 개선(세크레틴에 대한 췌장의 반응을 측정함으로써 평가)시킬 수 있고/있거나, 체중을 감소(전반적 대사 개선을 통함)시킬 수 있고/있거나, 심혈관 건강을 개선(혈장 트리글리세라이드, 지질, CRP, 혈압 및 BMI의 측정에 의해 평가)시킬 수 있고/있거나, 저혈당(즉, 혈중 글루코오스가 3 mmol/L 미만으로 하락)을 야기시키는 전기한 것 중 어떠한 것도 없이 질병 진행을 늦출 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 유도된 IL-18은 IL-6, STAT3, SOCS3, JAK2, MCP-1(CCL2) 중 임의의 하나 이상 또는 전부의 유전자 발현을 증가시키고, MCP-4(CCL13)는 생체외 자극된 건강한 지원자 혈액에서 본 발명의 IL-18 길항제, 예를 들어, H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)에 의해 역전되거나 부분적으로 역전된다.

본 발명의 한 구체예에서, 유도된 IL-18은 IRS2, PPAR 감마, 렙틴의 유전자 발현을 감소시키고, 렙틴 수용체는 생체외 자극된 건강한 지원자 혈액에서 본 발명의 IL-18 길항제, 예를 들어, H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)에 의해 역전되거나 부분적으로 역전된다.

한 구체예에서, 본 발명의 IL-18 길항제는 감지할 수 있는 양으로 중추신경계(CNS)에 도달하지 않지만, 대신 말초에서 작용함으로써 이의 치료 효과를 발휘한다.

약학적 제조물은 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 본 발명의 IL-18 길항제, 예를 들어, 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. IL-18 길항제는 단독으로, 또는 약학적 조성물의 일부로 투여될 수 있다.

통상적으로, 이러한 조성물은 허용되는 약학적 실시에 의해 공지되고 요청되는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 예를 들어, 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co]을 참조하라. 이러한 담체의 예는 임의로 5 내지 8의 범위 내의 pH로 적합한 완충액으로 완충된 멸균 담체, 예를 들어, 염수, 링거액 또는 덱스트로오스 용액을 포함한다.

약학적 조성물은 주사 또는 연속 주입(예를 들어, 정맥내, 복막내, 피내, 피하, 근내 또는 문맥내)에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 적합하게는 가시적인 미립자 물질을 함유하지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 피하 주사를 통해 투여된다. 한 추가 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 피내 투여된다. 이러한 피내 투여는 피부로부터 약 15°의 각도로 삽입되는 하나의 바늘을 이용한 주사(망토우(Mantoux) 절차)를 통하거나, 패치 기술(예를 들어, 다수의 미세바늘 또는 연마제 표면)을 이용하거나, 다른 적합한 수단을 이용하여 달성될 수 있다. IL-18 길항제가 단백질인 경우, 약학적 조성물은 0.01 mg 내지 10 g의 단백질, 예를 들어, 5 mg 내지 1 g의 단백질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 5 mg 내지 500 mg, 예를 들어, 5 mg 내지 50 mg의 단백질을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 약학적 조성물은 임의로 사용 설명서와 함께 단위 투여 형태의 1 mg 내지 10 g의 단백질을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 당업자에게 널리 공지되거나 명백한 방법에 따른 투여 전에 재구성을 위해 동결건조(동결되어 건조됨)될 수 있다. IL-18 길항제가 항-IL-18 항체이고, 항체가 IgG1 이소형을 갖는 경우, 상기 이소형의 항체의 구리-매개 분해 정도를 감소시키기 위해 구리의 킬레이터, 예를 들어, 시트레이트(예를 들어, 소듐 시트레이트) 또는 EDTA 또는 히스티딘이 약학적 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, EP0612251호를 참조하라. 약학적 조성물은 또한 용해화제, 예를 들어, 아르기닌 염기, 세제/항-응집 작용제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80, 및 바이얼 공간부분 산소를 대체하기 위한 비활성 가스, 예를 들어, 질소를 포함할 수 있다.

IL-18 길항제를 투여하기 위한 효과적인 용량 및 치료 요법은 일반적으로 경험적으로 결정되고, 이는 환자의 연령, 체중 및 건강 상태 및 치료되는 질병 또는 장애와 같은 요인에 좌우될 수 있다. 이러한 요인은 주치의의 권한 내에 속한다. 적절한 용량을 선택하는데 있어서의 지침은, 예를 들어, 문헌[Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 발견될 수 있다.

피검체에 투여되는 IL-18 길항제의 투여량은 일반적으로 피검체의 체중 kg 당 1 μg 내지 피검체의 체중 kg 당 150 mg, 피검체의 체중 kg 당 0.1 mg 내지 피검체의 체중 kg 당 100 mg, 피검체의 체중 kg 당 0.5 mg 내지 피검체의 체중 kg 당 50 mg, 피검체의 체중 kg 당 1 mg 내지 피검체의 체중 kg 당 25 mg 또는 피검체의 체중 kg 당 1 mg 내지 피검체의 체중 kg 당 10 mg이다. 예를 들어, 용량은 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 60 mg/kg일 수 있다. 한 구체예에서, H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)이 1 내지 5 mg/kg의 투여량으로 피검체에 투여된다. 또 다른 구체예에서, H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)는 약 3 mg/kg의 투여량으로 피검체에 투여된다. IL-18 길항제는 비경구적으로, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근내 투여될 수 있다.

용량의 투여는 2 내지 24시간, 예를 들어, 2 내지 12시간, 또는 2 내지 6시간의 기간에 걸쳐 느린 연속 주입으로 이루어질 수 있다.

용량의 투여는 필요에 따라 1회 이상, 예를 들어, 하루에 3회, 매일 1회, 2일에 1회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회, 또는 12개월에 1회로 반복될 수 있다. 본 발명의 한 특정 구체예에서, 용량의 투여는 1개월에 1회이다. 한 추가 구체예에서, 용량의 투여는 6개월에 1회이다. IL-18 길항제는, 예를 들어, 6개월 이상의 기간 동안 1주일에 1회 유지 요법에 의해 투여될 수 있다. IL-18 길항제는 하나의 주기로, 예를 들어, 3 내지 6개월의 기간 동안 간헐적 요법에 의해 투여된 후, 3 내지 6개월 동안 투여되지 않고, 이후에 3 내지 6개월 동안 다시 IL-18 길항제가 투여되는 것 등에 의해 투여될 수 있다.

IL-18 길항제는 특정 부위에 대한 표적 요법과 같은 방식으로 피검체에 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-18 길항제는 피하 또는 정맥내로 국소적으로 주사될 수 있다.

IL-18 길항제는 메트포르민(metformin), 로시글리타존(rosiglitazone), 펜터민(phentermine), 토피라메이트(topiramate), 오를리스탯(orlistat)(Xenical™, Alli™), GLP-1 수용체 효능제(예를 들어, 엑세나티드(exenatide)(Byetta™), 리라글루티드(liraglutide)(Victoza™), 알비글루티드(albiglutide)(Syncria™)) 및/또는 본원에 기재된 질병의 치료를 위한 PYY 수용체 효능제를 포함하는 하나 이상의 다른 치료적 활성 작용제와 조합하여 사용될 수 있다.

IL-18 길항제, 예를 들어, 항원 결합 단백질이 다른 치료적 활성 작용제와 조합하여 사용되는 경우, 개별적 성분은 임의의 편리한 경로에 의해 별개의 또는 조합된 약학적 제형으로 함께 또는 별개로, 동시에, 순차적으로, 동반적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 별개로 또는 순차적으로 투여되는 경우, IL-18 길항제 및 치료적 활성 작용제(들)은 임의의 순서로 투여될 수 있다.

상기 언급되는 조합물은 상기 정의된 조합물과 함께 임의로 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 단일한 약학적 제형의 형태로 사용하기 위해 제공될 수 있다.

동일 제형 내에서 조합되는 경우, 성분은 안정적이어야 하고, 서로 및 제형의 다른 성분과 상용되어야 하고, 투여용으로 제형화될 수 있음이 인지될 것이다. 개별적으로 제형화되는 경우, 이들은 임의의 편리한 제형, 예를 들어, 당 분야의 항원 결합 단백질에 대해 공지된 방식으로 제공될 수 있다.

동일 질병에 대해 활성인 두번째의 치료제와 조합되는 경우, 각각의 성분의 용량은 IL-18 길항제가 단독으로 사용되는 경우와 상이할 수 있다. 적절한 용량은 당업자에 의해 용이하게 인지될 것이다.

IL-18 길항제 및 치료적 활성 작용제(들)은 상승작용적으로 작용할 수 있다. 즉, IL-18 길항제 및 치료적 활성 작용제(들)을 조합하여 투여하는 것은 각각의 단독의 효과의 합보다 본원에 기재된 질병, 장애, 또는 질환에 대해 더 큰 효과를 갖는다.

용어 "개체", "피검체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 피검체는 통상적으로 인간이다. 피검체는 또한 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트 또는 영장류(예를 들어, 명주원숭이(marmoset) 또는 원숭이)일 수 있다. 피검체는 비-인간 동물일 수 있다. IL-18 길항제는 또한 가축에 사용된다. 치료되는 피검체는 농장 동물, 예를 들어, 소 또는 황소, 양, 돼지, 숫소, 염소 또는 말일 수 있거나, 애완 동물, 예를 들어, 개 또는 고양이일 수 있다. 동물은 임의의 연령이거나, 성숙한 성체 동물일 수 있다.

치료는 치료적, 예방적 또는 방지적 치료일 수 있다. 피검체는 상기 치료가 필요한 피검체일 것이다. 치료가 필요한 피검체는 특정 의학적 질병에 이미 걸린 개체 뿐만 아니라 추후에 질병이 발달할 수 있는 개체를 포함할 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 IL-18 길항제는 예방적 또는 방지적 치료에 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본원에 기재된 IL-18 길항제는 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상의 발증을 예방하거나 지연시키기 위해 개체에 투여된다. 피검체는 무증상일 수 있다. 피검체는 질병에 대한 유전적 소인을 가질 수 있다. 예방적 유효량의 IL-18 길항제가 상기 개체에 투여된다. 예방적 유효량은 본원에 기재된 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상의 발증을 예방하거나 지연시키는 양이다.

본원에 기재된 IL-18 길항제는 또한 요법의 방법에 사용될 수 있다. 용어 "요법"은 질병의 적어도 하나의 양상 또는 증상의 경감, 감소, 또는 방지를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 IL-18 길항제는 본원에 기재된 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상을 개선시키거나 감소시키는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 IL-18 길항제는 치료적, 예방적 또는 방지적 치료에 대한 유효량으로 사용된다. 본원에 기재된 IL-18 길항제의 치료적 유효량은 질병의 하나 이상의 양상 또는 증상을 개선시키거나 감소시키는데 효과적인 양이다. 본원에 기재된 IL-18 길항제는 또한 본원에 기재된 질병을 치료하거나, 예방하거나, 치료하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 IL-18 길항제는 일반적으로 피검체의 건강에 대해 유익한 결과를 가질 수 있고, 예를 들어, 이는 피검체의 예상 수명을 증가시킬 수 있다.

본원에 기재된 IL-18 길항제는 완전한 치료에 영향을 주거나, 실행가능한 치료적 치료를 구성하는 질병의 각각의 증상 또는 표시를 근절할 필요는 없다. 해당 분야에서 인지되는 바와 같이, 치료제로서 사용되는 약물은 제공된 질병 상태의 중증도를 감소시킬 수 있으나, 질병의 모든 표시를 제거하는 것이 유용한 치료제인 것으로 간주될 필요는 없다. 유사하게, 예방적으로 투여되는 치료제는 실행가능한 예방적 작용제를 구성하기 위해 질병의 발증을 예방하는데 있어서 완전히 효과적일 필요는 없다. 단순히, 질병의 영향을 감소(예를 들어, 증상의 수 또는 중증도를 감소시키거나, 또 다른 치료의 효과를 증가시키거나, 또 다른 유익한 효과를 발생시킴으로써)시키거나, 질병이 피검체에서 발생하거나 악화될 가능성을 감소(예를 들어, 질병의 발증을 지연시킴에 의함)시키는 것이 충분하다.

본원에 기재된 IL-18 길항제는 본원에 개시된 임의의 대사 장애를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.

용어 "치료적 유효량"은 치료되는 질병을 예방하거나, 억제하거나, 정지시키거나, 상기 질병을 개선시키는 것을 가능케 하기에 충분한 물질, 예를 들어, IL-18 길항제의 양(용량)을 의미한다.

따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 IL-18 길항제, 예를 들어, 항-IL-18 항원 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 상기 언급된 질병을 치료하고/하거나 예방하는 방법을 제공한다.

본 명세서 내에서, 본 발명은 명확하고 간결한 명세서가 작성되도록 하는 방식으로 구체예를 참조로 하여 기재된다. 구체예는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양하게 조합되거나 분리될 수 있으며, 이는 인지되어야 한다.

본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 간행물은 본원에 완전히 기재된 것처럼 참조로서 포함된다.

본 발명의 개시는 단지 예시의 목적으로 하기 실시예로 추가로 기재된다.

실시예

실시예 1

10명의 건강한 지원 공여자로부터의 혈액을 공여자 당 4개의 분취량으로 나누고, IL-18 유도된 유전자 발현에 대한 H1L2(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:11)의 효과를 결정하기 위해, A) Synagis 1 ug/ml(대조군 항-RSV IgG), B) IL-18 50 ng/ml, C) IL-18 50 ng/ml + H1L2 1 ug/ml 또는 D) H1L2 1 ug/ml로 생체외 자극시켰다. 각각의 치료 그룹에 대한 샘플을 Affymetrix U133_plus_2.0 전체 유전체 인간 마이크로어레이에 하이브리드화시켰다. 하기 비교를 수행하였다:

● Synagis IgG 1 ug/ml vs IL-18 50 ng/ml: 혈액에서의 유전자 발현에 대한 IL-18의 효과를 결정하기 위함

● IL-18 50 ng/ml vs IL-18 50 ng/ml + H1L2 1 ug/ml: IL-18 유도된 유전자 발현에 대한 H1L2의 효과를 결정하기 위함

● Synagis IgG 1 ug/ml vs H1L2 1 ug/ml: 자극의 부재하에서 혈액에서 유전자 발현에 대한 H1L2의 효과를 결정하기 위함

IL-18 자극된 생체외 혈액은 IL-6 발현에서 9배(P<0.0001)의 증가를 나타내었고, H1L2의 첨가는 상기 효과를 중화(IL-18 단독 데이터에 대해 IL-18 + H1L2 데이터를 비교하는 경우 7배 감소)시켰다. 데이터는 도 1에 제시된다.

더욱이, JAK2, SOCS3 및 STAT3는 IL-18 자극을 이용한 발현에서 각각 3.2배, 3.1배 및 1.7배의 증가를 나타내었다. H1L2의 첨가는 상기 효과를 부분적으로 중화시켰다: IL-18 단독에 대해 IL18 + H1L2를 비교하는 경우, JAK2는 2.1배 감소시켰고, SOCS3는 1.9배 감소시켰고, STAT3는 1.6배 감소시켰다. 데이터는 도 2, 3 및 4에 제시된다.

또한, MCP-1, 및 MCP-4는 IL18 자극을 이용한 발현에서 각각 4.4 및 4.1배의 증가를 나타내었다. 이러한 증가는 H1L2의 첨가로 부분적으로 역전되었고, IL18 단독에 대해 IL18 + H1L2를 비교하는 경우 2.6 및 2.5배의 감소를 나타내었다(도 5-6 참조). PPA 감마 및 IRS2는 IL18 자극을 이용하여 각각 2.9 및 1.5배 감소를 나타내었고, 상기 효과는 H1L2의 첨가로 부분적으로 중화되었으며(도 7-8), 이는 IL18 단독에 대해 IL18 + H1L2를 비교하는 경우 1.7 및 1.4배 증가를 나타내었다. 최종적으로, 렙틴 및 렙틴 수용체 둘 모두는 IL-18 자극 후의 발현에서 1.5배 감소를 나타내었다. 이러한 효과는 또한 H1L2에 의해 중화되었다(도 9-10 참조).

이러한 연구는 마이크로어레이 상의 프로브 중 90%에서 1.1배 변화를 검출하는 90% 신뢰력(confidence power)으로 매우 효력이 있었다.

이러한 데이터는 IL-18이 IL-6 및 혈액에서의 이의 중요 신호전달 분자의 발현을 유도하고, 상기 효과가 H1L2에 의해 중화될 수 있는 것을 나타낸다.

실시예 2

다양한 암의 치료를 위한 주입되거나 피하 투여된 재조합 인간 IL-18(rhIL-18)의 유용성을 3회의 I상 연구 및 1회의 II상 연구로 연구하였다. rhIL-18의 주입과 이후의 글루코오스 대사에서의 변화 사이의 임의의 잠재적 연관성을 조사하기 위해 상기 연구로부터의 혈중 글루코오스 및 실험실 유해사례 데이터를 개관하였다. 모든 I상 연구에서, 당뇨병과 같은 동반 의학 질환을 갖는 환자가 이들의 질병이 주요 연구자에 의해 안정적인 것으로 간주되는 한 참여에 적격이었고, 상기 환자는 적어도 6개월 동안 치료를 받았다.

rhIL-18의 초생리학적 수준이 본 연구에서 연구된 모든 용량 수준에서 30-40시간에 걸쳐 환자의 혈장에서 달성되었다.

상기 연구에서 재조합 인간 IL-18(rhIL-18)의 투여 동안 조우된 가장 흔한 임상적 화학 이상은 고혈당증이었다.

현재까지 완료된 단일요법 연구 전체에 걸쳐, 치료된 환자 38-68%가 프로토콜 적격성 기준(즉, 당뇨병 피검체가 제외되었는지 아닌지의 여부)에 따라 적어도 등급 1(CTC 기준)의 고혈당증 AE(>ULN - 8.9 mmol/L)를 경험하였다.

3회의 완료되고 보고된 용량 소견 연구(n=72) 전체에 걸쳐, 8명(7%)의 환자가 등급 3(>13.9 - 27.8 mmol/L)의 고혈당증 사건을 경험하였고, 1명의 환자가 등급 4(>27.8 mmol/L)의 고혈당증을 경험하였다. 상기 환자 9명 모두는 무작위화시에 당뇨병 환자로 진단되었다.

혈중 글루코오스 수준과 명확한 용량-관계가 없으나, 투여(주입 후 5-10일) 및 혈중 글루코오스의 증가의 크기에 대해 고혈당증 AE의 시기가 일치하였으며, 이는 상기 사건이 rhIL-18의 투여와 관련되었음을 암시한다. 이러한 데이터는 IL-18과 상승된 혈장 글루코오스 수준 사이의 연관을 나타내며, 차례로 이는 IL-18 길항제가 혈장 글루코오스가 상승된 대사 장애, 예를 들어, T2DM, 비만 T2DM 및 비만에 대한 유용한 치료제일 수 있음을 암시한다.

실시예 3

본 발명의 IL-18 길항제는 이의 체중 감소에 대한 효과 뿐만 아니라 글루코오스 수준, 인슐린 수준 및 비만 및 당뇨와 관련된 다른 대사 파라미터를 연구하기 위해 다양한 용량으로 DIO(식이-유도 비만) 마우스 모델에서 사용될 수 있다.

이러한 모델에서, 18-20주 동안 45% 지방 식이가 급식되는 경우, C57bl/6 수컷 마우스는 약 40-45g의 체중에 도달하였다. 이후, IL-18 길항제를 1회 또는 수회 투여하였고, 연구 종료시까지 마우스를 매일 칭량하였다. 최종 마취 후에 마우스로부터 심장 혈액을 수집하였고, ALP, ALT, AST, GLDH, 빌리루빈, 글루코오스, 인슐린, 우레아, 크레아티딘, 전체 단백질, 알부민, 칼슘, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 포스페이트, 소듐, 포타슘, 클로라이드 및 케톤(가능한 경우, 히드록시부티레이트 및 아세토아세테이트 둘 모두)을 포함하는 여러 마커의 분석을 수행하였다. 안전성 평가를 위한 조직병리학을 평가하기 위해 조직이 수집될 수 있고, 면역조직화학을 위해 뇌 조직이 수집될 수 있다.

상기 실시예 1 및 2에 제시된 결과로, 본 발명자는 상기 뮤린 연구의 결과가 체중 감소에 대한 영향과 함께 IL-18 길항제로 처리된 마우스에서의 글루코오스 및 인슐린 수준의 감소인 것을 예상한다.

실시예 4

건강한 피검체 및 비만 피검체에서 정맥내 주입된 H1L2의 단일 용량의 안전성, 내약성, 약동학을 연구하기 위한 인간에서의 첫번째(first-time-in-human, FTIH) 연구(즉, 단일-맹검의 무작위화 위약-대조 연구)를 수행하였다. 대사 약역학을 또한 비만 피검체에서 평가하였다.

방법

상기 연구는 2 부분으로 구성되었다. 부분 1은 5 코호트의 건강한 피검체(코호트 당 n=5-15)로 구성되었고, 부분 2는 3 코호트의 비만 피검체(코호트 당 n=5-12)로 구성되었으며; 비만 피검체는 30-40의 BMI를 갖지만 그 밖에는 건강한 환자로 규정된다. 각각의 코호트는 단일 연구 기간에 참여하였다.

둘 모두의 부분을 단일-맹검으로 위약 대조군을 이용하여 수행하였다. 각 코호트 내에서, 위약 또는 활성 치료에 대한 피검체의 배당은 무작위로 하였다.

부분 1에 대한 시작 용량은 0.008 mg/kg이었고, 용량 점증을 3.0 mg/kg의 최대 용량까지 진행시켰다. 부분 1에 대해 1 mg/kg까지의 투여가 완료될 때까지 부분 2에서의 투여를 개시하지 않았으며, 예비 안전성 및 PK 데이터를 검토하였다.

세포 매개 염증에 대한 H1L2의 효과를 연구하기 위해, 지연형 과민반응(delayed type hyper-sensitivity, DTH) 방법을 부분 1에서 건강한 피검체의 1 mg/kg 및 3 mg/kg 코호트에 포함시켰다. Candin^?은 피내 투여되는 경우 DTH 염증 반응을 촉발시키는 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 피부 시험 항원(Allermed Laboratories)이다. DTH 반응자로 확인(팔의 손바닥 표면에 피내 주사된 0.1 mL Candin^?에 반응하여 >5mm의 경화)된 27명의 건강한 지원자를 1 mg/kg(H1L2 n=9, 위약 n=3) 및 3 mg/kg(H1L2 n=9, 위약 n=6)의 건강한 피검체 코호트로 모집하였다. 상기 코호트에 등록된 피검체에 연구 3일(H1L2 투여 48시간 후)에 Candin^?을 두번째 피내 주사를 투여하였다. Candin^? 공격 24시간 및 48시간 후의 경화 및 홍반 평가에 더하여, 3개의 피부 생검을 각각의 피검체로부터 채취하였다. 2mm 또는 3mm의 펀치(punch) 생검을 스크리닝에서 관련되지 않은 영역, 스크리닝에서 DTH 경화의 중심부(Candin^? 공격 48시간 후), 및 반복 공격에서 DTH 경화의 중심부(Candin^? 공격 48시간 후, H1L2 투여 96시간 후)로부터 채취하였다. RNA를 생검으로부터 추출하고, 표지화시키고, Affymetrix U133_plus_2.0 전체 유전체 인간 마이크로어레이에 하이브리드화시켰다. H1L2 투여에 의해 조정된 Candin^? DTH 공격에 반응하여 발현 변경을 갖는 유전자를 확인하기 위해 데이터를 분석하였다. 대사 장애에서 일정한 역할을 갖는 것으로 이전에 확인된 염증 유전자를 상기 모델에서 평가하였다.

3 코호트의 비만 남성 지원자를 부분 2에 포함시켰다. 시작 용량은 0.25 mg/kg이었고, 용량 점증을 3.0 mg/kg의 최대 용량까지 진행시켰고; 이는 부분 1의 가장 높은 3개의 용량을 반영한다.

대사 질병을 갖는 환자에서 H1L2의 잠재적 유용성이 제공된 경우, 본 연구는 또한 비만 피검체에서 대사 약역학 종점에 대한 H1L2의 효과를 연구하였다. 본 연구에 포함된 건강한 비만 피검체는 인슐린 수준이 상승하였고, 이는 잠재적 인슐린 내성을 나타낸다.

비만 피검체에서 다양한 용량의 H1L2의 잠재적 대사 효과를 평가하기 위해 경구 글루코오스 내성 시험(OGTT)을 이용하였다. 75g의 경구 글루코오스 공격의 섭취 후, 인슐린 세크레틴의 급격한 상승(첫번째 단계 반응)이 있었고, 이후에 상기 호르몬의 보다 지속된 방출(두번째 단계)이 있었다. 이러한 분비 과정 동안, C-펩티드, 또는 연결 펩티드가 인슐린 전구체 분자인 프로-인슐린으로부터 분할되고, 인슐린과 등몰량으로 생성된다. 혈류에서, C-펩티드는 긴 반감기를 갖는데, 이는 인슐린과 달리 C-펩티드는 간 청소에 적용되지 않기 때문이다. 혈액 샘플을 180분 동안 수집하여, OGTT 동안 C-펩티드 및 인슐린 동역학 데이터를 모델링함으로써 첫번째 및 두번째 단계의 인슐린 분비가 유도될 수 있었다. 또한, 섭취된 글루코오스의 출현 및 소실의 속도로부터 인슐린 민감성을 계산하였다.

결과

DTH 공격은 IL6 발현에서 113배(P<0.0001)의 증가를 발생시켰다(1 mg/kg 코호트에서 123배 증가(P<0.0001) 및 3 mg/kg 코호트에서 101배 증가(P<0.0001)). 반복 공격 전의 H1L2 3mg/kg을 이용한 치료는 IL6 발현을 3.4배(P<0.0001) 감쇠시켰고, 이는 위약보다 1.8배 더 큰 감소(P=0.055)이다. 이러한 효과는 H1L2 1 mg/kg의 치료에서 유의하지 않았다(1.6배 감쇠, P=0.098).

더욱이, SOCS3 및 STAT3은 DTH를 이용한 발현에서 각각 유의한(P<0.0001) 14배 및 6배 증가를 나타내었다. SOCS3 DTH 유도 발현은 H1L2 3 mg/kg 처리로 1.9배 감쇠되었으며, 이는 위약보다 1.4배 더 큰 감쇠(P<0.05)였다. STAT3 DTH 유도 발현은 H1L2 3mg/kg으로 1.3배(P<0.01) 감쇠되었고, 이는 위약보다 1.4배 더 큰 감쇠(P<0.01)였다. 이러한 효과는 1 mg/kg H1L2의 처리에서 관찰되지 않았다.

또한, LEPR은 DTH 공격을 이용한 발현에서 5배 감소(P<0.0001)를 나타내었다. DTH로 인한 LEPR에서의 감소는 H1L2 3mg/kg으로 1.5배(P<0.01) 감쇠되었다. 이는 위약보다 1.4배(P=0.084) 더 큰 감쇠였다.

예비 분석은 H1L2가 또한 비만 피검체에서 OGTT 내의 글루코오스 수준을 감소시킨 것을 나타내었고, 이러한 효과는 정상의 상부 수준을 초과하는 글루코오스 수준을 갖는 피검체에서 더욱 명료하게 나타났고, 이는 H1L2가 T2DM을 갖는 환자와 같은 더욱 중증의 집단에서 보다 큰 효과를 나타낼 수 있는 것을 암시한다. 또한, 인슐린 효과는 상기 환자의 서브셋에서 글루코오스 수준에 대해 관찰된 것을 반영하는 것을 입증하였다.

결론

상기 데이터는 H1L2가 세포 매개 염증의 생체내 모델에서 IL6, STAT3, SOCS3 및 LEPR의 발현 변화를 감쇠시킬 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 데이터는 H1L2가 글루코오스 및 인슐린 수준을 포함하는 다양한 대사 파라미터를 조절하는 것을 나타낸다. 따라서, 항-IL18 길항제, 특히 항체 H1L2는 대사 장애를 치료하는데 있어서 가망성을 나타낸다.

서열 목록

서열

SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited Andrew Ian BAYLIFFE <120> TREATMENT OF A METABOLIC DISORDER <130> PB63986 WO <150> 61/302637 <151> 2010-02-09 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 1 Gly Tyr Tyr Phe His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 2 Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 3 Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val Met Asp 1 5 10 15 Ala <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 4 Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 5 Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 6 Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Glu Ile Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val 100 105 110 Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 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Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 35 40 45 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 50 55 60 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 65 70 75 80 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 85 90 95 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys 100 105 110 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 115 120 125 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 130 135 140 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 180 185 190 Asp

Claims

환자에서 대사 장애(metabolic disorder)를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 IL-18 길항제.
제 1항에 있어서, IL-18 길항제가 단백질인 IL-18 길항제.
제 1항에 있어서, 단백질이 항원 결합 단백질인 IL-18 길항제.
제 3항에 있어서, 항원 결합 단백질이 중쇄 H1(SEQ ID NO:7)의 CDR 중 하나 이상 또는 전부 및/또는 경쇄 L1(SEQ ID NO:11)의 CDR 중 하나 이상 또는 전부, 또는 이의 CDR 변이체를 포함하는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 4항에 있어서, 약 10 nM 또는 그 미만의 평형 해리 상수(KD)를 갖는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 CDRH1(SEQ ID NO:1), CDRH2(SEQ ID NO:2), CDRH3(SEQ ID NO:3), CDRL1(SEQ ID NO:4), CDRL2(SEQ ID NO:5), 및 CDRL3(SEQ ID NO:6)로 구성된 군으로부터 선택된 CDR 중 하나 이상 또는 전부, 또는 이의 CDR 변이체를 포함하는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 이의 기능성 단편인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 IgG1 항체인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 도메인 항체인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 IL-18에 대한 결합에 대해 SEQ ID NO:7의 중쇄 서열(H1), 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 서열(L2)을 포함하는 항체와 경쟁하는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 4항에 있어서, 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO:7의 중쇄 서열(H1) 또는 이와 90% 동일한 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:11의 경쇄 서열(L2) 또는 이와 90% 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 2항에 있어서, 단백질이 분리되거나 재조합적으로 생성된 IL-18BP인 IL-18 길항제.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 장애가 타입 2 당뇨병인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 장애가 비만인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 상기 환자의 혈당(glycaemic) 조절을 증가시키는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간 환자인 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 1개월에 1회 투여되는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 6개월에 1회 투여되는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 피하 투여되는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 피내 투여되는 항-IL-18 항원 결합 단백질.
치료적 유효량의 IL-18 길항제를 대사 장애에 걸린 환자에 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 방법.
예방적 유효량의 IL-18 길항제를 대사 장애에 걸리기 쉬운 환자에 투여함으로써 상기 환자에게서 대사 장애를 예방하는 방법.
치료적 유효량의 IL-18 길항제를 환자에 투여함으로써 상기 환자에서 혈당 조절을 개선시키는 방법.
환자에서 대사 장애를 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 정의된 IL-18 길항제의 용도.