KR20120133135A

KR20120133135A - 화마인의 추출물을 포함하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120133135A
Application number: KR1020110051655A
Authority: KR
Inventors: 마진열; 임남희; 정윤희; 이주혜; 이지혜; 김홍익; 유기종
Original assignee: 한국 한의학 연구원; (주)비타바이오
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2012-12-10

Abstract

본 발명은 치아우식증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 구강용 조성물 및 건강식품에 관한 것이다. 상기 화마인 추출물은 치아우식균에 대한 항균 효과가 우수하고, 치아우식균의 생육 및 균성장시 방출되는 효소인 글루코실트랜스퍼라제의 활성을 억제하며, 그 효과도 지속적일 뿐만 아니라, 천연물인 화마인으로부터 추출되어 매우 안전하므로, 치아우식증을 예방 및/또는 치료하기 위한 구강용 조성물 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

화마인의 추출물을 포함하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Dental Caries Comprising Extract of Cannabis sativa}

본 발명은 치아우식증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 화마인의 추출물을 유효성분으로 함유하며, 치아우식증의 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.

치아우식증이란 치은연상 및 치은연하의 치면 세균막에 존재하는 미생물들에 의해 음식물 중의 탄수화물이 대사되어 국소적으로 생산된 유기산의 작용으로 인해 치아의 경조직이 파괴되는 질환으로, 그 예방 및 치료제의 개발은 우리나라뿐만 아니라 세계적인 관심사 중 하나이다. 치아우식증은 인간의 생명에는 직접적인 관계가 없지만, 음식물의 저작기능이 저하되므로 소화계통의 질병에 직간접으로 영향을 미친다. 치아우식증의 이환율은 특히 어린이에게 많은데, 5세 어린이의 85%에 이르고 있을 정도로 대부분의 사람들이 치아우식증으로 인한 고통을 경험했거나 경험하고 있다.

치아우식증의 발생 원인은 다양하나, 일반적으로 구강 내에 상주하는 세균의 발효 작용에 의해 치아에 부착된 음식물 찌꺼기의 당분이나 전분 등의 탄수화물이 분해되어 생기는 젖산이 치아 경조직의 석회를 탈각시켜 치아우식증이 발생하게 된다. 이러한 치아우식증을 일으키는 병원성 미생물로는 여러 종들이 알려져 있지만, 특히 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus) 등이 치아우식증 발생의 주된 병원체로 작용한다(비특허문헌 1). 스트렙토코커스 뮤탄스는 균체외 또는 균체 표층에 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase, GTase)라는 효소를 분비하여 음식물 내 수크로오스를 기질로 하여 글루코오스와 프럭토오스를 생성하고, 동시에 글루코오스의 중합체인 불용성 글루칸(insoluble glucan)을 치면에 형성하게 된다. 이 글루칸에 의해 구강 내 다른 미생물들이 치면에 부착함으로써 치면 세균막, 즉 치태(dental plaque)를 형성하게 된다. 이 치태 내에서 스트렙토코커스 뮤탄스균을 포함한 젖산균이 증식하여 프럭토오스를 탄소원으로 젖산을 생성하고, 부착성 글루칸에 젖산이 포집, 농축된다. 이렇게 농축된 고농도의 산은 치아의 구성성분인 인산칼슘 중 Ca² ⁺를 녹아내리게 하여 치아의 외막인 법랑질을 용해시킴으로서 치아우식증을 유발하게 되는 것이다(비특허문헌 2).

이러한 치아우식증을 억제하기 위해 사용되는 방법으로는 스포라마이신(sporamycin), 반코마이신(vancomycin), 클로로헥시딘(chlorhexidine) 등의 항생물질을 이용하는 방법, 유기 또는 무기 불소에 의한 병원성 세균의 억제 방법 등이 이용되고 있다(비특허문헌 3). 그러나, 항생물질을 계속 이용하면 미생물이 내성을 갖게 되거나, 설사, 구토 등의 부작용을 유발할 수 있는 단점이 있을 뿐만 아니라, 이러한 항생물질의 남용으로 인해 구강 내 상재하는 세균들의 생육이 저해되는 문제점이 있다. 따라서, 효과적이고 안정성이 있는 치아우식증의 예방 및 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 화마인(火麻仁, Cannabis sativa)은 뽕나무과의 한해살이 풀인 대마의 열매를 말하는 것으로서, 성미는 달고 한열이 평이한 성질이 있다. 기름 성분이 많아서 노인이나 임산부 및 허약 체질로 진액이 부족해서 일어나는 변비에 유효하며, 허혈로 인해 머리카락이 나지 않을 때 볶아서 기름을 내어 머리에 붙이거나 오동나무 잎을 넣고 달인 물로 머리를 세척하면 효험이 있다. 어린아이의 경우에는 화마인의 가루를 꿀에 넣은 후 머리에 붙인다. 한방에서는 다한증, 장조변비, 소갈, 열림, 풍비, 이질, 월경불순, 개창, 선나를 치료한다. 그러나 많이 먹을 경우 정기가 빠져나가고, 양기가 부족해진다. 현재 화마인을 갱년기 합병증의 치료에 사용할 수 있음이 알려져 있고(비특허문헌 4), 탈모 방지 및 발모 촉진 위한 생약 조성물의 한 성분으로서 화마인이 사용될 수 있다는 보고가 있으나(특허문헌 1), 화마인을 치아우식증의 예방이나 치료에 사용할 수 있음을 보여주는 문헌은 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 치아우식증의 예방이나 치료에 유용하게 사용될 수 있는 다양한 생약 추출물에 대해 연구한 결과, 화마인의 추출물이 종래 보고된 바 없는 뛰어난 치아우식증 예방 또는 치료 효과를 보인다는 사실을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-1999-0065207호 공개공보

Liljemark W.F. et al., Crit. Rev. Oral Bio. Med. 7:180-198, 1996 Sigmund, S.S. et al., J. Periodontol. 63:322-331, 1992 Mcbain, A.J. et al., Appl. Environ. Microbiol. 69:4770-4776, 2003 Saberivand A. et al., Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 32(7):467-473, 2010

본 발명은 화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 구강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 완화용 건강식품을 제공한다.

본 발명은 화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 구강용 조성물을 제공한다.

상기 화마인 추출물은 화마인에 2?30배량, 바람직하게는 5?20배량의 추출용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출용매로는 물을 사용하는 것이 일반적이지만, 필요에 따라 물 이외에 다른 유기용매를 사용해도 무방하다. 사용될 수 있는 유기용매로는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 바람직하게는 에탄올, 아세톤, 또는 이의 수용액 등을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 "화마인 추출물"은 상기 추출용매를 이용하여 제조된 화마인 추출물뿐만 아니라, 상기 화마인 추출물에 하나 이상의 "분획화 유기용매"를 추가로 가하여 추출한 분획물도 포괄하는 의미로 사용된다. 상기 분획화 유기용매로는 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상의 유기용매가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 화마인의 수추출물에 대해 에틸아세테이트 또는 부탄올 등의 유기용매를 분획화 유기용매로 사용하였다.

본 발명의 화마인 추출물을 함유하는 구강용 조성물은 치약류, 구강청정제 또는 구강용 스프레이드 등의 제형으로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 구강용 조성물에 있어서, 상기 치약류는 연마제, 점결제, 보습제, 발포제, 감미료, 향미제 등의 성분을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 연마제로는 수산화알루미늄, 무수규산, 규산알루미늄, 제2인산칼슘, 제2수산화물 및 무수물, 제3인산칼슘, 탄산칼슘, 피로인산칼슘, 불용성 메타인산나트륨, 제3인산마그네슘, 탄산마그네슘, 황산칼슘, 폴리메타아크릴산메틸, 기타 합성수지 등에서 1종 또는 2종 이상을 전체 조성물의 약 20?90%의 양으로 배합하여 사용할 수 있다(페이스트 치약의 경우에는 20?60%가 된다). 상기 점결제로는 가라기닌, 각종 점증용 셀룰로오스 유도체, 잔탄검, 트라가칸트 검(Tragacanth gum) 등의 검류, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산/말레인산 공중합체, 카르복시비닐 폴리머 등의 합성 고분자 유도체 등의 유기계 점결제와 실리카, 라포나이트 등의 무기계 점결제에서 1종 또는 2종 이상을 전체 조성물의 약 0.3?5%의 양으로 배합하여 사용할 수 있다. 치약류 중 페이스트상과 액상 구강용 조성물에서는 그 제조시 보습제로 솔비톨, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에테르 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등에서 1종 또는 2종 이상을 전체 조성물의 약 10?70%의 양으로 배합하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화마인 추출물을 함유하는 구강용 조성물에는 맨톨(Mentol), 아네톨(Anetol), 오이게놀(Eugenol), 리모넨(Limonene), 오시멘(Ocimene), n-도데실알코올(n-Dodecy Alcohol), 시트로네놀(Citronenol), 알파터피네올(α-Terpineol), 살리실메틸(Methyl salycilate), 메틸아세테이트(Methyl Acetate), 시트로네릴 아세테이트(Citronelyl Acetate), 시네올(Cineol), 리나롤(Linalool), 에틸리나롤(Ethyl Linalool), 바닐린(Vanillin), 티몰(Thymol), 스피아민트(Speamint)유, 세지(Sage)유, 로즈마리(Rosemary)유, 계피(Cinamon)유 등의 항료를 단독 또는 조합하여 전체 조성물의 0.1?10%, 바람직하게는 0.5?5%의 양으로 배합하여 사용할 수 있다. 또한, 사카린나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐, D-자일로오스(D-Xylose) 등과 같은 감미제 등을 전체 조성물의 0?1%, 바람직하게는 0.01?0.5%의 양으로 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 구강용 조성물에는 트리클로산, 클로로 헥시딘, 벤제토늄클로라이드, 벤잘코늄클로라이드, 세틸피리듐 클로라이드과 같은 양이온성 살균제, 모노플루오로인산나트륨과 모노플루오로 인산칼륨 등과 같은 알칼리금속 모노플루오로 포스페이트와 불화나트륨, 불화제일주석 등의 불소화물, 트라넥삼산, 입실론 아미노 카프론산, 알루미늄 클로로 히드록실 알란토인, 디히드로 콜레스타놀, 클리틸리친산류, 글리세로 포스테이트, 염화나트륨, 수용성 무기인산 화합물, 아스코르빈산(나트륨), 초산 dl-a-토코페롤, 자일리톨, 염산피리독신, 폴리비닐 피롤리돈 등의 각종 효능 성분 중 1종 또는 2종 이상을 선택 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 구강용 조성물에서 발포 성분으로 사용하는 계면활성제로는 음이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및/또는 양이온성 계면활성제를 사용할 수 있다. 여기서, 음이온성 계면활성제로는 라우릴 황산나트륨, 미리스틸 황산나트륨 등의 알킬 황산나트륨, N-라우로일 사르코신산나트륨(Sodium N-Lauroyl sarcosinate), N-미리스틸 사르코신산나트륨(Sodium N-miristyl sarcosinate) 등의 N-아실 사르코신산나트륨(Sodium N-acyl sarcosinate) 등을 사용할 수 있고, 비이온성 계면활성제로는 슈가지방산 에스테르, 말토스 지방산 에스테르, 락토스 지방산 에스테르 등과 같은 당(糖)유래 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌고급알코올 에테르, 폴리옥시 에틸렌 폴리옥시 프로필렌 공중합체, 폴리옥시 에틸렌 폴리프로필렌 지방산 에스테르 등을 사용할 수 있다. 양이온성 계면활성제로는 N-라우릴 디 아미노에틸글리신, N-미리스틸 디아미노에틸글리신 등과 같은 N-알킬 디 아미노에틸글리신, N-알킬-N-카르복시메틸 암모늄 베타인, 2-알킬-1-히드록시에틸 이미다졸린 베타인 나트륨 등을 사용할 수 있다. 이 경우 발포 성분으로는 음이온성 계면활성제를 주로 사용하며 대표적인 것으로는 라우릴 황산나트륨과 같은 알킬황산 나트륨을 가장 널리 사용하고 있다. 또한 이들 계면활성제는 1종 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용하는 것이 바람직하며, 배합량은 통상 전체 조성물의 0.01?0.5%, 보다 바람직하게는 0.05?0.3%를 사용한다.

상기 화마인 추출물은 본 발명의 구강용 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나, 그 함량은 활성 성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별, 상태, 치아우식증의 정도 등에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 화마인 추출물은 치아우식증의 원인균에 대해 강한 항균 활성을 나타내며, 특히 화마인 수추출물의 부탄올 분획물에서 강한 항치주균 활성을 나타낸다(표 1 참조). 또한, 디스크 확산법을 이용한 항균 활성 실험에서는 70% 에탄올 추출물에서 가시적인 저해환이 관찰되어 치아우식균의 생장을 강하게 억제함을 확인할 수 있다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 치아우식균에 대한 항균 활성이 약했던 열수 추출물 처리군에서 글루칸 생성이 가장 강하게 억제되는 한편, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매 분획물에서는 상기 열수 추출물의 약 절반 정도의 글루칸 생성 저해능을 나타내었고, 특히 치아우식균에 대한 항균 활성이 강하게 나타났던 부탄올 분획물의 경우 글루칸 생성 저해능이 비교적 낮게 나타나, 부탄올 분획물의 항균 활성은 글루코실트랜스퍼라제의 활성 억제보다는 직접적인 균생육 억제에 의해 나타난 것임을 추측할 수 있다(표 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 치아우식균에 처리시 확인된 항균 활성 정도와 유사하게 부탄올 분획물에서 페놀성 화합물의 함량이 가장 높게 측정되었으며, 에틸아세테이트 분획물에서도 다량의 페놀성 화합물이 존재함을 확인할 수 있는데, 이는 화마인의 치아우식균에 대한 항균 활성이 화마인에 존재하는 페놀성 화합물에 의한 것일 수 있음을 시사하고 있다(표 3 참조).

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 마우스를 이용한 독성 실험 결과, 실험에 사용된 모든 마우스에서 시험 물질 투여와 관련된 어떠한 임상 증상의 이상 소견도 관찰되지 않았고, 사망동물 또한 관찰되지 않았다(표 4 참조). 아울러. 실험동물 모두 유의적인 체중 감소 또는 증가 효과는 나타나지 않았다(표 5 참조).

상기 화마인 추출물은 치아우식증 증상의 예방이나 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있으며, 화마인 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 화마인 추출물이 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 화마인 추출물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 0.01?0.04 g, 바람직하게는 약 0.02?0.03 g 이다.

상기 외에도 본 발명의 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 화마인 추출물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만, 화마인 추출물 100 중량부 당 0.01?0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 상기 화마인 추출물은 치아우식균에 대한 항균 효과가 우수하고, 치아우식균의 생육 및 균성장시 방출되는 효소인 글루코실트랜스퍼라제의 활성을 억제하며, 그 효과도 지속적일 뿐만 아니라, 천연물인 화마인으로부터 추출되어 매우 안전하므로, 치아우식증을 예방 및/또는 치료하기 위한 구강용 조성물 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 치아우식균에 대한 화마인 추출물의 항균 활성을 보여주는 생육 저해환 실험 결과를 보여주는 사진으로서, (A)는 70% 에탄올 추출물 2 ㎎ 투여시 19 ㎜의 생육 저해환이 형성되었음을 나타내고, (B)는 열수 추출물 2 ㎎ 투여시 14 ㎜의 생육 저해환이 형성되었음을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화마인 추출물의 제조

<1-1> 열수 추출물의 제조

건조된 화마인 50 g에 증류수 1 리터를 첨가하여 3시간 동안 열수 추출한 후, 여과지를 사용하여 여과하여 동결건조시켰다.

<1-2> 유기용매 추출물의 제조

건조된 화마인 50 g에 70% 에탄올 0.5 리터를 첨가하여 1시간 동안 25℃에서 음파처리한 후, 여과지를 사용하여 여과하였고, 감압하에서 회전식 농축기를 이용하여 용매를 제거하였다.

<1-3> 열수 추출물의 활성 성분 분획물의 제조

실시예 <1-1>에서 제조한 화마인의 열수 추출물을 물에 현탁한 후 용매의 극성도를 고려하여 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 극성이 낮은 용매에서 극성이 높은 용매로 순차적으로 계통 분획하여 각 유기용매 분획물을 얻었다. 획득한 유기용매 분획물을 감압 회전 농축기를 사용하여 농축한 후 25 ㎎/㎖ 농도로 DMSO (Dimetyl Sulfoxide)에 녹여 -20℃에 저장하였으며, 실험시 증류수에 희석하여 사용하였다.

비교예 1. 황련 추출물의 제조

화마인 대신에 치아우식균에 대한 항균 활성이 보고된 바 있는 황련을 이용한 것을 제외하고는 실시예 <1-1>과 동일하게 하여 황련 수추출물을 제조하였다.

실험예 1. 치아우식증 원인균에 대한 성장 억제 활성 측정

본 실험에 사용한 치아우식증 원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스 균주는 그람-양성의 통성 혐기성 세균으로서, 한국생명공학연구원 미생물자원센터로부터 분양받은 KCTC3065 균주를 BHI 브로스(Brain Heart Infusion broth)(Difco, USA)와 아가(Agar) 배지에 계대배양하여 실험에 사용하였다. 치아우식증 원인균에 대한 화마인 추출물의 성장 억제 활성을 조사하기 위하여, 상기 스트렙토코커스 뮤탄스 균주를 BHI 브로스에 접종하여 계대배양한 후, 550 ㎚에서의 흡광도값이 0.1이 되도록 균액을 희석하였다. 이 희석액을 BHI 브로스에 10% 접종하고, 96-웰 마이크로플레이트에 200 ㎕씩 분주하였다. 분주 후, 최종 농도가 화마인 70% 에탄올 추출물 및 열수 추출물은 2.5 ㎎/㎖, 열수 추출물 유래의 유기용매 분획물은 1.25 ㎎/㎖이 되도록 각각 웰에 첨가하였다. 20시간 동안 배양시킨 후 흡광도를 측정하여 생육억제능을 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

처리 농도 (㎍/㎖)	70% 에탄올 추출물	열수 추출물	에틸아세테이트 분획물	부탄올 분획물
처리 농도 (㎍/㎖)	2,500	2,500	1,250	1,250
치아우식균 성장 저해능(%)	57.72±0.67	24.80±0.95	29.66±0.06	68.72±0.45

표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 70% 에탄올 추출물에서 가장 강한 항균 활성을 확인하였다. 또한, 수추출물의 부탄올 분획물을 처리할 경우, 모액인 화마인의 열수 추출물보다 2배 희석된 농도에서도 3배 정도 강한 항치주균 활성을 확인하여, 활성 성분이 용매 분획에 의해 농축되어 효율성이 높아진 것을 확인하였다.

실험예 2. 치아우식증 원인균에 대한 항균 활성 측정

디스크 확산법에 의해 실시예 1에서 제조한 화마인 추출물의 항균 활성을 측정하였다. 이를 위하여, 1.5% 아가를 첨가한 BHI 플레이트를 베이스층(base layer)으로, 또 OD₅₅₀ ㎚에서 흡광도가 0.1이 되게 희석한 균액 10%를 1% 아가가 첨가된 BHI 배지에 접종한 것을 오버층(over layer)으로 준비한 후, 그 위에 70% 에탄올 추출물과 열수 추출물이 각각 2 ㎎ 처리된 8 ㎜ 종이 디스크를 올려 항균 활성에 의한 저해환의 크기를 측정하였다.

그 결과, 일정 농도의 스트렙토코커스 뮤탄스 균주가 존재하는 배양 플레이트에 화마인 추출물을 처리한 결과, 70% 에탄올 추출물와 열수 추출물 모두에서 가시적인 저해환이 생성되어 치아우식균의 생장을 강하게 억제하고 있음을 확인하였다(도 1).

실험예 3. 글루칸 생성 저해능 측정

구강내 음식물 속의 수크로오스를 기질로 하여 치면에 불용성 글루칸을 형성하는 글루코실트랜스퍼라제의 특성을 이용하여, 치아우식균에 의해 분비되는 글루코실트랜스퍼라제를 수집한 후 수크로오스가 포함된 완충 용액과 화마인 열수 추출물 및 그의 유기용매 분획물들을 첨가하여 글루칸 생성 저해능을 확인하였다. 먼저, 스트렙토코커스 뮤탄스 균주를 BHI 브로스에 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후, 4℃에서 4,300 rpm으로 30분간 원심분리하여 상징액을 취하였다. 0.2 ㎛ 주사기형 필터로 상기 상징액을 여과한 후, Amicon Ultra Centrifugal Filter(MWCO 30 kDa, Cat. No. UFC903008, Millipore)를 사용하여 조효소액을 제조하였다.

글루코실트랜스퍼라제의 활성은 수크로오스를 기질로 하여 생성된 불용성 글루칸의 농도를 분광광도계를 이용하여 측정함으로써 확인하였다. 이를 위하여, 유리 시험관에 기질 용액(0.0625 M Potassium Phosphate Buffer (pH 6.5) 1 리터 중 Sucrose 12.5 g, NaN₃ 0.25 g 함유) 800 ㎕, 조효소액 20 ㎕ 및 화마인 열수 추출물 또는 용매 분획물 또는 황련 추출물 180 ㎕를 첨가하여 최종 용량이 1 ㎖가 되도록 하였다. 음성대조군으로는 증류수 180 ㎕를 첨가하였다. 시험관을 30° 정도 경사지게 하여 37℃ 배양기에서 30시간 반응시켰다. 반응 후 원심분리하여 상징액을 버리고 4 ㎖의 증류수를 가하여 10분간 초음파 처리하여 형성되어 있는 글루칸을 분산시켰다. 분산 직후 분광광도계로 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 각 시료의 글루코실트랜스퍼라제에 대한 저해율을 하기 식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

글루칸 생성 저해율(%) = [{(control - control blank) - (sample - sample blank)}/(control - control blank)] × 100

처리 농도 (㎍/㎖)	열수 추출물	에틸아세테이트 분획물	부탄올 분획물	황련 열수 추출물
처리 농도 (㎍/㎖)	250	250	250	500
글루칸 생성 저해율(%)	46.51±3.26	23.81±0.09	32.48±0.39	53.35±1.28

표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 치아우식균에 대한 항균 활성이 약했던 열수 추출물 처리군에서 글루칸 생성이 가장 강하게 억제되었으며, 부탄올 분획물에서도 비교적 강한 글루칸 생성 저해능을 확인하였다. 반면, 치아우식균에 대한 항균 활성이 강하게 나타났던 부탄올 분획물의 경우 동일 농도 처리시 열수 추출물보다 글루칸 생성 저해능이 비교적 낮게 나타나 부탄올 분획물의 항균 활성은 글루코실트랜스퍼라제 활성 억제보다는 직접적인 균생육 억제에 의해 나타난 것임을 추측할 수 있었다. 아울러, 치아우식균에 대한 항균 활성이 보고된 황련 열수 추출물을 동량 처리한 후 활성을 비교한 결과, 화마인 열수 추출물은 황련 열수 추출물보다 2배 희석된 농도에서도 황련 열수 추출물과 유사한 글루칸 생성 저해능을 보여 화마인이 글루코실트랜스퍼라제의 활성을 강하게 억제하는 것으로 확인되었다.

실험예 4. 총 페놀성 화합물의 함량 측정

종래에 치아우식증 억제 활성이 있는 것으로 알려진 생약재들에서 페놀성 화합물의 함량이 높다는 점이 보고된 바 있으므로(Lee HO, et al., Antibacterial effects of sophora flavescens on Streptococcus mutans. Korea J. Food Nutr. 13: 536-546, 2000; Yun-Mi Park, et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 35(3):284-293, 2006), 이를 근거로 화마인의 열수 추출물 및 열수 추출물 유래 유기용매 분획물 내의 총 페놀성 화합물의 함량을 Folin-Denis법(Slater TF. 1984. Free radical mechanisms in tissue injury. Biochem J 222:1-15)을 이용하여 측정하였다. 화마인의 열수 추출물과 두 종류의 용매 분획물을 증류수로 10배 희석하여 2 ㎖씩 취한 후, 2배 희석한 Folin-Ciocalteu' 시약(Sigma, MO, USA)을 동량 첨가하여 3분간 반응시켰다. 그 후 동량의 10% Na₂CO₃를 서서히 가한 후 1시간 동안 반응시켰고, 분광광도계(UV/Vis Spectrophotometer U-2900, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도로부터 탄닌산을 이용한 표준곡선으로 총 페놀성 화합물의 양을 환산하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

총 폴리페놀	농도(㎍/㎖)
열수 추출물	31.77±1.15
에틸아세테이트 분획물	27.28±0.59
부탄올 분획물	94.72±0.59

표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 치아우식균에 처리시 확인된 항균 활성 정도와 유사하게 부탄올 분획물에서 페놀성 화합물의 함량이 가장 높게 측정되었으며, 에틸아세테이트 분획물에서도 다량의 페놀성 화합물이 존재함을 확인하였다. 이는 화마인의 치아우식균에 대한 항균 활성이 화마인에 존재하는 페놀성 화합물에 의한 것일 수 있음을 시사한다.

실험예 5. 급성독성 실험

화마인 추출물의 안전성에 대한 자료를 마련하기 위하여 단회투여 독성실험을 수행하였다. 단회투여 독성 실험은 식품의약품안전청 고시 제2005-60호 의약품 등의 독성시험방법의 "비임상시험 관리기준"(2005년 10월 25일)에 따라 암?수 ICR 마우스를 이용하여 수행하였다. 동물구입 후 약 1주일 동안 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수 시간당 12?16회, 조명 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도 150?300 Lx인 사육 환경하에서 검역 및 순화시키면서 외관을 육안으로 검사한 후 건강한 동물을 골라 실험에 사용하였다. 암수 각각의 마우스를 각 군당 5마리씩 설정하여, 케이지에 5마리씩 개별 수용하였다. 사료와 물은 자유섭취 시켰으며, 사료는 실험동물용 고형사료(PMI nutrition, USA)를 공급하였다.

화마인 열수 추출물의 투여 용량은 2,000 ㎎/㎏ 및 1,000 ㎎/㎏(Mouse, B.W.)의 2가지 용량으로 설정하였으며, 부형제인 생리식염수로 각각의 투여 용량별로 희석하여 시험에 사용하였다. 투여 경로는 경구투여법을 이용하였으며, 동물을 하룻밤 절식시킨 후 경구투여용 일회용 존데와 주사관을 이용하여 배부 피부 고정법으로 몸체를 고정한 후 경구 투여하였다.

임상 증상은 투여 직후부터 6시간 동안 매시간 관찰하였으며, 그 후 14일 동안 1일 1회, 일반 상태의 변화, 운동성, 외관, 자율신경 등의 일반증상 및 사망례를 관찰하였다. 체중은 입수 시, 군 분리전 및 시험물질 투여 후 1, 3, 7, 14일에 각각 측정하였다. 실험동물을 희생하기 전날 밤 18시간 절식 시킨 후 Zoletil 50( Virbac S.A, France)과 자일라진 히드로클로라이드(Xylazine Hydrochloride, 바이엘 코리아 주식회사, 경기도)를 복강 내 주사하여 마취하였으며, 후대정맥을 통한 방혈을 실시한 후 모든 장기에 대한 육안적 병변을 관찰하였다.

그 결과, 실험에 사용된 모든 암?수 ICR 마우스에서 보행 장애, 행동 이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡 촉박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유연 등 시험 물질 투여와 관련된 어떠한 임상 증상의 이상 소견도 관찰되지 않았고, 모든 암?수 ICR 마우스에서 사망동물도 관찰되지 않았다(표 4). 따라서, 화마인 추출물은 한계용량(2,000 ㎎/㎏/day)까지 경구 투여해도 사망을 관찰할 수 없어 LD₅₀ 값은 산출되지 않았다.

군	용량 (㎎/㎏)	성별	동물의 수	이상 동물의 수	사망률(%)
대조군	0	수컷	5	0	0
대조군	0	암컷	5	0	0
화마인 추출물	1,000	수컷	5	0	0
	1,000	암컷	5	0	0
	2,000	수컷	5	0	0
	2,000	암컷	5	0	0

또한, 화마인 열수 추출물을 경구로 단회 투여한 후 1, 3, 7, 14일 동안 실험동물의 체중변화를 관찰한 결과, 모든 실험동물이 개시체중에 비하여 수컷의 경우 약 25% 이상, 암컷의 경우 약 10% 이상 증가하였다. 실험동물 모두 유의적인 체중 감소 또는 증가 효과는 관찰되지 않았다(표 5).

군	용량 (㎎/㎏)		체중(g)
군	용량 (㎎/㎏)		0일	1일	3일	7일	14일
대조군1	0	평균	25.136	28.210	29.070	31.264	33.030
대조군1	0	SD	1.984	2.271	2.008	2.419	0.466
수컷 (male)	1,000	평균	25.066	27.808	28.590	30.632	32.916
	1,000	SD	1.414	0.554	0.579	0.624	0.385
	2,000	평균	25.246	27.976	28.830	30.420	33.340
	2,000	SD	1.232	1.525	1.511	1.413	1.160
대조군2	0	평균	22.008	21.308	23.382	23.458	24.932
대조군2	0	SD	1.299	0.952	1.104	0.923	1.025
암컷 (female)	1,000	평균	21.592	22.378	22.212	23.816	25.510
	1,000	SD	0.966	1.321	1.312	1.149	1.896
	2,000	평균	21.640	23.008	23.342	23.640	25.756
	2,000	SD	0.707	1.360	1.401	1.256	1.529

제조예 1: 화마인 추출물을 포함하는 구강용 조성물의 제조

<1-1> 치약의 제조

실시예 1의 화마인 추출물 ????????????????? 1 g

탄산수소나트륨?????????????????????? 20 g

글리세린????????????????????????? 15 g

화이트클레이 ??????????????????????? 2 g

죽염??????????????????????????? 10 g

비타민 E ????????????????????????? 2 g

정제수 점도에 맞게 소량

상기한 원료를 배합하여 치아우식증 예방 효과를 지닌 천연 치약을 제조하였다. 청량감을 주기 위해 멘톨이나 페퍼민트 정유를 첨가할 수도 있다.

<1-2> 구강청정제의 제조

실시예 1의 화마인 추출물 ????????????????? 0.5%

에탄올??????????????????????????? 15%

글리세린?????????????????????????? 10%

나트륨 벤조에이트 ???????????????????? 0.15%

삭카린 나트륨??????????????????????? 0.1%

페퍼민트 정유 ?????????????????????? 0.15%

정제수(이온교환수) ??????????????????? 74.09%

pH 6.0

일반적인 구강청정제 성분인 알코올, 습윤제, 계면활성제로 에탄올, 글리세린, 나트륨벤조에이트를 사용하고, 실시예 1에서 제조한 화마인 추출물을 첨가하여 치아우식증 및 구취 예방효과를 지닌 구강청정제를 제조하였다. 청량감을 더하기 위해 페퍼민트 정유를 첨가할 수 있으며, 한약재 추출물에 의한 맛을 조정하기 위해 삭카린 나트륨을 첨가할 수 있다.

제조예 2: 화마인 추출물을 함유하는 건강식품의 제조

<2-1> 식품의 제조

실시예 1에서 제조한 화마인 추출물을 포함하는 식품을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

화마인 추출물 20?95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

화마인 추출물 0.2?1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

화마인 추출물 0.5?5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

화마인 추출물 0.1?5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

화마인 추출물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

화마인 추출물 5?10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 화마인 추출물을 진공 농축기에서 감압?농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 화마인 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

화마인 추출물의 건조 분말(3 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

<2-2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

화마인 추출물 1?5%, 설탕 5?10%, 구연산 0.05?0.3%, 카라멜 0.005?0.02%, 비타민 C 0.1?1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79?94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85?98℃에서 20?180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5?0.82%를 주입하여 화마인 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 화마인 추출물(3%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채주스의 제조

화마인 추출물 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

4. 과일주스의 제조

화마인 추출물 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 치료용 구강용 조성물.
청구항 1에 있어서,
화마인 추출물은 화마인에 2?30배량의 추출용매를 가하여 추출되는 구강용 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 추출용매는 물 또는 유기용매인 구강용 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 아세톤 및 이의 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구강용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 유기용매는 에탄올 또는 에탄올 수용액인 구강용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화마인 추출물은 화마인 수추출물에 분획화 유기용매를 가하여 추출한 분획물인 구강용 조성물.
청구항 6에 있어서,
상기 분획화 유기용매는 에틸아세테이트 또는 부탄올인 구강용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 구강용 조성물 총 중량에 대하여 상기 화마인 추출물을 0.01 내지 50 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구강용 조성물은 치약, 구강청정제 및 구강용 스프레이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 구강용 조성물.
화마인 추출물을 유효성분으로 함유하는 치아우식증의 예방 또는 완화용 건강식품.
청구항 10에 있어서,
상기 건강식품은 식품 또는 음료의 형태인 건강식품.