KR20120131624A - Ｐｔｋ 6의 활성 억제용 조성물 및 이를 이용한 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 PTK 6와 높은 친화도로 결합함으로써 PTK 6의 자가억제 기작을 유도하여 암세포의 증식 및 전이를 효율적으로 억제하므로, 암, 특히 유방암 및 대장암의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＰＴＫ 6의 활성 억제용 조성물 및 이를 이용한 암 예방 및 치료용 조성물{A Composition for Inhibiting Protein Tyrosine Kinase 6 and a Composition for Preventing and Treating Cancers Using the Same}
본 발명은 PTK 6의 자가억제 기작을 유도하는 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
PTK 6(protein tyrosin kinase 6)는 대부분의 유방암에서 과발현되며, 암세포의 증식만을 촉진하는데 역할을 한다.
PTK 6는 비 수용체 티로신 인산화효소(non-receptor tyrosine kinase)로서 상피조직에서 세포 내 신호전달을 담당하며 자기인산화(autophosphorylation)를 하는 것으로 알려졌다. 포유류 상피세포에서 이 유전자의 과발현은 EGF(epidermal growth factor)에 대해 세포가 민감해지도록 함으로써 표현형의 부분적인 변화를 가져온다. PTK 6는 정상적인 대장, 소장 등의 상피조직에서 일부 발현되고, 유방암 및 대장암 등에서 높게 발현되며, 신호전달 과정 및 결합 단백질의 분석으로 세포분열이 활발한 상피세포와 암에서 세포 성장의 촉진 및 세포 사멸의 억제를 유발하는 것으로 관찰되고 있다.
PTK-6는 인산화 촉매 도메인(kinase domain)과 활성 조절 도메인(SH3 및 SH2)으로 구성되어있다. 인산화 촉매 도메인은 조절도메인에 의해 활성이 조절되게 되는데 이는 조절 도메인 중 SH3 도메인과 SH2에 붙어있는 링커에 의해 매개된다. 이러한 SH3/링커 복합체가 유방암의 증식 및 전이에 큰 영향을 미치는 중요한 조절자일 것임이 예상되었으나, 아직까지 링커처럼 SH3에 결합되어 PTK 6의 자가억제 기작을 직접적으로 활성화시키는 물질은 개발된 바가 없다.
본 발명자들은 PTK 6의 자가억제 기작를 더욱 활성화시킴으로서 PTK 6를 비활성화시키는 PTK 6 억제제를 개발하고자 NMR을 이용한 삼차원 구조분석을 통해 SH3와 링커의 결합을 모사하는 화합물을 발굴하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 세포분열이 활발한 암세포에서의 신호전달 기작을 조절함로써 암세포의 증식 및 암의 전이를 억제하는 효율적인 항암 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암세포에서 특이적으로 과발현하는 인산화 효소인 PTK 6(protein tyrosine kinase)에 특이적으로 결합하는 화합물을 동정하고, 이들이 암세포의 증식 및 전이를 억제한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure pat00001
상기 화학식에서, X는 산소 또는 황이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 C1-C4 알킬기(alkyl group)이며, R3는 직쇄 또는 분쇄의 C1-C4 알킬이 치환되거나 비치환된 5각 고리 또는 6각고리 헤테로아릴이고 n은 0-3의 정수이다.
본 발명자들은 세포분열이 활발한 암세포에서의 신호전달 기작을 조절함로써 암세포의 증식 및 암의 전이를 억제하는 효율적인 항암 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암세포에서 특이적으로 과발현하는 인산화 효소인 PTK 6(protein tyrosine kinase)에 특이적으로 결합하는 화합물을 동정하고, 이들이 암세포의 증식 및 전이를 억제한다는 사실을 발견하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물은 PTK 6의 SH3 도메인에 높은 친화도로 결합함으로써 PTK6/링커 복합체에 의한 자가억제 기작을 유도한다.
본 명세서에서 용어 “직쇄 또는 분쇄의 알킬”은 직쇄 또는 분쇄 구조의 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸 및 펜틸을 포함한다. C1 -C4 알킬은 탄소수 1 내지 4의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1 -C4 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 화학식 1에서, R1 및 R2 위치의 C1 -C4 알킬은 바람직하게는 C1-C2 알킬, 보다 바람직하게는 C1 알킬(메틸)이다.
본 명세서에서 용어“헤테로아릴”은 헤테로원자로서 고리 내에 산소, 황 또는 질소를 포함하는 헤테로사이클릭 방향족기를 의미한다. 바람직하게는, 헤테로원자는 산소 또는 질소이며, 가장 바람직하게는 질소이다. 헤테로원자의 개수는 1-3이며, 바람직하게는 2이다. 본 발명의 헤테로아릴은 5각 고리 또는 6각고리이며, 바람직하게는 6각고리이다. 헤테로아릴은 다양한 위치에서 직쇄 또는 분쇄의 C1-C4 알킬로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1의 X는 산소이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1의 n은 1이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1의 R3는 비치환된 6각고리 헤테로아릴이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
화학식 2
Figure pat00002

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 3 내지 9로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물을 제공한다:
화학식 3 화학식 4
Figure pat00003
Figure pat00004

화학식 5 화학식 6
Figure pat00005
Figure pat00006

화학식 7 화학식 8
Figure pat00007
Figure pat00008

화학식 9
Figure pat00009
본 발명에 따르면, 상기 화학식 3 내지 화학식 9로 표시되는 화합물들도 PTK 6와 높은 친화력으로 결합하여 PTK 6의 자가억제 기작을 유도한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
PTK 6는 특정 신호를 받으면 일시적으로 활성화되는 방법으로 엄격하게 조절되며, 체세포 돌연변이를 비롯한 외부 자극에 의하여 과민(hyperactive) 활성을 가지거나, 유전자 증폭 또는 전사 활성에 의하여 비정상적으로 과발현되면 정상적인 조절에 실패하여 암을 유발하게 된다. 본 발명의 조성물은 PTK 6의 SH3 도메인과 높은 친화력으로 결합하여 PTK 6의 자가억제 기작을 유도하기 때문에, 효율적인 항암용 조성물로 이용될 수 있다.
PTK 6는 세포의 성장, 분화 그리고 세포 사멸을 조절하는 중요한 세포 간 및 세포 내 신호를 전달하는 효소이므로, 세포의 이상 증식(hyperproliferative)을 원인으로 하는 모든 암의 치료에 있어서 제한없이 본 발명의 조성물이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의하여 예방 또는 치료되는 암은 유방암 또는 대장암이며, 보다 바람직하게는 유방암이다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 전이(metastasis)를 억제한다. 본 발명의 조성물은 암세포의 성장 및 증식을 억제하므로, 종양의 조직 간의 전이도 효율적으로 억제하여 초기 이후의 암의 진행 또는 외과적?화학적 치료 이후의 암의 재발을 효율적으로 차단할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 PTK 6와 높은 친화도로 결합함으로써 PTK 6의 자가억제 기작을 유도하여 암세포의 증식 및 전이를 효율적으로 억제한다.
(c) 본 발명의 조성물은 암, 특히 유방암 및 대장암의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 PTK6의 각 도메인 구조의 모식도 및 SH3 도메인과 링커의 정제결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 SH3 도메인과 SH3 결합 링커의 솔루션 구조(solution structure)(Ko et al., BBRC, 2009)를 나타낸 그림이다. SH3 도메인은 6개의 β-스트랜드로 이루어져 있으며 링커는 특별한 2개의 턴(turn) 구조를 이루고 있음을 알 수 있다.
도 3은 NMR 적정을 통한 결합기작을 규명한 결과를 나타낸 그림이다(Ko et al., BBRC, 2009). 도 3a는 15N SH3 도메인 및 링커 펩타이드의 NMR 적정 결과를 나타낸 그림이다. 붉은색은 유리(free) SH3 도메인, 파란색은 1:1, 녹색은 1:3, 검은색은 1:5를 나타낸다. 도 3b는 링커 펩타이드의 결합에 따른 SH3 도메인의 화학적 이동(chemical shift) 변화를 나타낸 막대 다이아그램 그림이다. 붉은색은 유리 SH3 도메인, 파란색은 1:1, 녹색은 1:3, 검은색은 1:5를 나타낸다. 도 3c는 SH3 도메인의 링커가 결합하는 표면의 잔기를 나타낸 그림이다.
도 4는 HADDOCK을 통해 계산한 SH3 도메인/링커 복합체 구조(Ko et al., BBRC, 2009)를 나타낸 그림이다. 도 4a는 SH3 도메인과 링커 펩타이드의 특이적인 상호작용을 나타낸 그림이다. Pumol에서 SH3 도메인의 표면전하모형(surface charges model)을 계산하였으며 링커 펩타이드와의 특이적 상호작용을 점선으로 표시하였다. 도 4b는 링커 펩타이드와 SH3 도메인의 측쇄(side chain)들 사이에 관찰된 결합을 표시한 그림이다. 흰색 및 노랑은 펩타이드의 잔기를 의미하고 주황색은 SH3 도메인의 잔기를 의미한다.
도 5는 SH3/링커 복합체 구조를 통해 작성한 상호작용 맵(interaction map)과 이를 통한 새로운 인 실리코 스트리닝 결과를 나타낸 그림이다.
도 6은 MapI, II를 통해 도출한 후보물질의 LigScore 및 PLP 값을 나타낸 그림이다.
도 7은 도출된 후보물질 중 LigScore와 PLP를 통해 선별된 8개의 물질에 대한 화학정보를 나타낸 그림이다.
도 8은 선별된 8개의 후보물질과 PTK6 간의 결합력을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 형광실험을 통해 선별된 8개의 후보물질에 대한 결합력을 측정하였으며, 결합력은 1:0.2에서 1:4까지 7개의 다른 비율로 결합에 따른 형광의 변화를 추적하였다.
도 9는 카이네이즈 분석(Kinase assay)을 이용하여 도출된 후보물질의 저해활성 측정 및 이를 통해 선정된 최종 후보물질을 나타낸 그림이다. 도 9a는 PTK 6에 후보물질을 접촉시켜 카이네이즈 활성변화를 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 측정결과 2A가 가장 좋은 억제활성을 보였다. 도 9b는 LigScore, PLP, 결합력 및 저해활성을 종합하여 선정된 가장 효과가 좋은 후보물질을 나타낸 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
클로닝, 단백질 발현 및 PTK6의 정제
PTK6(잔기 1451), PTK6-SH3 도메인(잔기 172) 및 PTK6-링커(잔기 171191)를 pGEX 4T-1(Amersham)로 클로닝하였다. BamHI 사이트 및 TEV 프로티아제 인식서열(ENLYFQG)을 포함하는 센스 프라이머 및 EcoRI 사이트를 포함하는 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PTK6 단백질을 인코딩하는 모든 플라스미드로 Escherichia coli BL21(DE3)를 형질전환하였으며, 타겟 단백질의 과발현을 25℃에서 0.1 mM IPTG(isopropyl β-d-thiogalactopyranoside)로 유도하였다. 융합 단백질을 GSTrap FF 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 GST-친화 크로마토그래피로 정제하였으며, GST-tag은 TEV 프로티아제로 제거하였다. Superdex 75 컬럼을 이용하여 크기배제 크로마토그래피를 수행하였다. 샘플 완충액은 10 mM 암모니움 비카보네이트 완충액으로 교환하고 감압 동결건조하여 최종 시료를 수득하였다. 이핵 NMR 실험을 위하여, SH3 도메인을 15NH4Cl 또는 15NH4Cl/13C-d-글루코오스(Cambridge Isotope Laboratories)를 함유하는 M9 메디아에서 과발현시킨 후, GST-친화 크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 상술한 방법으로 정제하였다.
펩타이드 합성 및 시료 제작
링커에 해당하는 펩타이드(RKHEPEPLPHWDDWEREPEEF; 인간 PTK6 서열의 171191 잔기)를 Fmoc 화학(Anygen Inc., Kwangju, Korea)을 이용한 개선된 고상(solid-phase) 방법으로 합성하였다. 펩타이드를 Shimazu Prep LC-8A 시스템 상에서 Shim-pack ODS(C18) 분취 컬럼과 함께 HPLC(high-performance liquid chromatography)를 이용하여 정제하였다. 시료는 선형 구배(A = 0.1% TFA in water, B = 0.1% TFA in CH3CN)로 녹여서 분리하고 흡광도 230 nm에서 검출하였다. NMR 분석을 위하여 펩타이드를 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해된 90% H2O/10% D2O 또는 99.9% D2O에서 용해하였으며, 최종 펩타이드 농도를 24 mM로 조정하였다.
NMR 실험 및 SH3 도메인과 링커 펩타이드의 구조 계산
이핵 NMR 실험을 위하여 15N- or 13C/15N-표지 PTK6-SH3 도메인을 이용하였다. 안정한 동위원소-표지 PTK6-SH3 도메인을 크기배제 크로마토그래피를 수행하는 동안 NMR 완충액(90% H2O/10% D2O, 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.0)에 교환하고, 울트라 필터 유니트(Amicon)를 이용하여 0.2 mM로 농축하였다. 1H15N HSQC(heteronuclear single quantum coherence), 3D HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCA, HBHA(CO)NH 및 HNCO 실험을 이용하여 백본 할당(backbone assignment)을 하였다[14]. 15N-NOESY(τ=150 ms), 13C-NOESY(τ=150 ms) 및 HCCH-TOCSY를 이용하여 NOE 및 분쇄 할당(side chain assignment)을 수행하였다. 링커에 대한 NMR 분석을 위하여, 감압 동결 건조한 펩타이드를 1 mM 농도로 NMR 완충액에 용해시켰다.
링커 펩타이트에 대하여 69.7 ms 의 믹싱 펄스(mixing pulse)로 TOCSY(Two-dimensional total correlation spectroscopy)를 수행하고, 100600 ms의 믹싱 시간으로 2D NOESY(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)를 수행하였다. 모든 NMR 실험 데이터는 t2 도메인의 2048 데이터 포인트 및 t1 도메인의 256 데이터 포인트에 대한 TPPI(time proportional phase incrementation) 방법을 이용하여 위상감응(phase-sensitive) 모드에서 수집하였다. SH3 도메인에 결합한 링커의 구조를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 TR-NOESY(transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy), 2D NOESY(τ=600 ms) 및 2D TOCSY를 수행하였다. 모든 분광학 데이터들은 Cryoprobe™ 시스템이 내장된 Bruker DRX 500 MHz 및 Varian 900 MHz 스펙트로미터를 이용하여 수득하였다.
데이터 프로세싱 및 화학적 이동 측정에 XWIN-NMR, NMRPipe/NMRDraw 및 SPARKY 소프트웨어를 이용하였다. 비틀림각 동역학과 CYANA 2.1를 이용하여 구조 계산을 하였다. TALOS에서 얻은 거리 제약 및 각 제약도 최종구조 확정에 이용하였다. 16-노드 리눅스 클러스터 컴퓨터를 이용하여 CYANA 계산을 실행하였으며, 가장 에너지가 낮은 20개의 구조를 PROCHECK 로그램으로 측정하였다(21). 최종적인 구조는 Pymol(DeLano Scientific LLC) 및 MOLMOL 프로그램을 이용하여 도출하였다.
SH3 /링커 복합체의 NMR 적정 및 구조 계산
SH3 도메인과 링커 간의 상호작용에 관여하는 특정 잔기들을 동정하기 위하여 1H15N HSQC 적정을 수행하였다. 본 발명자들은 SH3:링커의 다양한 몰비율(1:1, 1:3 및 1:5)을 포함하고 최종 15N-표지 SH3 도메인의 농도가 0.2 mM인 NMR 시료를 제작하였다. 화학적 이동의 변화는 다음의 식을 이용하여 계산하였다: Δδtotal = [(ΔδHN)2 + (ΔδN/5)2]1/2.
SH3 /링커 복합체의 구조계산
본 발명자들은 HSQC 적정실험 결과, GST pull-down 분석 및 NACCESS 프로그램에서의 용매 접근성 계산에 기초하여 활성 잔기 및 부동(passive) 잔기를 결정하였다[24]. SH3 도메인의 활성 잔기(R22, H36, W44, H64, N65 및 Y66)는 HSQC 적정에서 화학적 이동 변화(Δδ)가 0.1 이상이고, 용매 접근성이 40% 이상인 경우로 정의하였다. 링커의 활성잔기(P175, P177 및 P197)는 용매 접근성이 40% 이상인 경우로 정의하였다. 모든 부동 잔기는 활성 잔기의 이웃 잔기로서 용매 접근성이 40% 이상인 잔기에 의해 결정되었다. HADDOCK 계산결과에 대한 클러스터링 분석은 RMSD 7.5, 5.0, 및 3.0 의 컷-오프 값을 이용하여 수행하였다. Pymol 프로그램을 통해 최종 구조를 분석하여 도출하였다.
약물분자구조 스크리닝
본 발명자들은 결정된 약물분자구조 지도를 정의하였다(Martin et al., 2001). 수소결합 공여자(HBDs), 수소결합 수용자(HBAs) 및 친지질성(Lipo)을 포함하는 특성들이 약물분자구조 지도를 결정하는데 이용되었다. 최종적인 약물분자구조 지도를 이용하여, 본 발명자들은 Chembridege 데이터베이스를 검색한 뒤 리간드 스코어(LigScore)의 시각적 조사 및 평가에 기초하여 PTK6 억제자 후보 화합물들을 선정하였다(Aparna et al., 2005; Venkatachalam et al., 2003).
형광 분석
실험은 RF-5301PC 스펙트로플루오로포토미터(Shimadzu, Kyoto, Japan) 상에서 25℃에서 수행하였다. 소듐 포스페이트 완충액 내의 PTK6(10 μM)의 트립토판-특이적 고유 형광을 290 nm 자극에서 290 내지 500 nm 사이 범위를 스캐닝하였다. 각각의 억제자들을 단백질:억제자의 최종 비율이 1:8이 되도록 적정하였다. 모든 용액은 유사한 완충액 농도를 포함하도록 하였다. 시료는 흥분 및 방출 경로길이가 10 mm 인 2 mL 온도조절 큐벳에 담았다. PTK6 및 억제자의 형광 양자 수율은 트립토판 방출에 의하여 결정하였다. Kd 값을 아래의 식을 이용하여 결정하였으며, F0 및 F는 각각 억제자의 부재 또는 존재 하에서 342 nm에서 PTK6의 형광 강도를 나타내고, n은 단백질 내에서의 억제자 결합부위의 숫자를 나타낸다.
Figure pat00010

PTK6 및 억제자 간의 인 비트로 카이네이즈 분석
PTK6 및 PTK6/억제자 복합체의 카이네이즈 활성을 조사하기 위하여 인 비트로 카이네이즈 분석을 수행하였다. 카이네이즈 분석을 위하여, 10 μg PTK6 기질(poly(Glu,Tyr), Sigma)을 20 μg GST-PTK6 단백질의 존재 또는 부재 하에서, 100 μM [γ-32P] ATP를 포함하는 20 μl 카이네이즈 반응 완충액(20 mM TrisHCl, 10 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 50 μM Na3VO4, pH 7.4) 내에서 30분 간 30℃에서 반응시켰다. 반응은 SDS 시료 완충액을 첨가함으로써 종료시키고 SDS-PAGE 및 방사능 사진촬영을 통한 신틸레이션 카운팅을 이용하여 분석하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물:
    화학식 1
    Figure pat00011

    상기 화학식에서, X는 산소 또는 황이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분쇄의 C1-C4 알킬기(alkyl group)이며, R3는 직쇄 또는 분쇄의 C1-C4 알킬이 치환되거나 비치환된 5각 고리 또는 6각고리 헤테로아릴이고 n은 0-3의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 X는 산소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1 및 R2는 메틸기이고, n은 1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R3는 비치환된 6각고리 헤테로아릴인 것을 특징으로 하는 조성.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
    화학식 2
    Figure pat00012

  6. 하기의 화학식 3 내지 9로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 PTK 6(protein tyrosine kinase)의 활성 억제용 조성물:
    화학식 3 화학식 4
    Figure pat00013
    Figure pat00014


    화학식 5 화학식 6
    Figure pat00015
    Figure pat00016


    화학식 7 화학식 8
    Figure pat00017
    Figure pat00018


    화학식 9
    Figure pat00019

  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 PTK 6의 SH3 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 암의 전이(metastasis)를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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