KR20120123726A - Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20120123726A
KR20120123726A KR1020127026179A KR20127026179A KR20120123726A KR 20120123726 A KR20120123726 A KR 20120123726A KR 1020127026179 A KR1020127026179 A KR 1020127026179A KR 20127026179 A KR20127026179 A KR 20127026179A KR 20120123726 A KR20120123726 A KR 20120123726A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
pufa
domain
acid sequence
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020127026179A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101234200B1 (ko
Inventor
제임스 지. 메츠
크래그 에이. 위버
윌리엄 알. 바클레이
제임스 에이치 플래트
Original Assignee
마텍 바이오싸이언스스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 filed Critical 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션
Publication of KR20120123726A publication Critical patent/KR20120123726A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101234200B1 publication Critical patent/KR101234200B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

본 발명은 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템, 이의 상동체, 그러한 PUFA PKS 시스템의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 분리된 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자, PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 유기체, 생활성 분자의 제조를 위하여 그러한 시스템을 제조하고 이용하는 방법 및 그러한 PUFA PKS 시스템을 가진 새로운 박테리아 및 비박테리아의 미생물을 동정하는 신규한 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＵＦＡ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도{PUFA POLYKETIDE SYNTHASE SYSTEMS AND USES THEREOF}
본 발명은 트라우스토카이트리드 미생물과 같은 진핵 유기체를 포함한 미생물로부터 유래된 다중불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid, PUFA) 폴리케타이드 신타제(polyketide synthase systems, PKS) 시스템에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 비박테리아의(non-bacterial) PUFA PKS 시스템을 코딩하는 핵산, 비박테리아의 PUFA PKS 시스템, 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 유기체 및 본 발명에 개시된 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PUFA 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템의 조작에 의해 다양한 다중불포화 지방산(PUFA), 특히 에이코사펜타엔산(C20:5, ω-3; EPA)이 풍부한 리피드(멤브레인과 관련된 포스포리피드(PL)뿐만 아니라 트리아실글리세롤(TAG))를 효과적으로 제조하는 유전적으로 변형된 미생물 및 방법에 관한 것이다.
폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템은 지방산 신타제(FAS) 시스템에서 유래된 효소 복합체로서 당업계에 공지되어 있지만, 종종 변형되어 지방산과 거의 유사함을 보이지 않는 특별한 생산물을 제조하기도 한다. 그러나 폴리케타이드 신타제 시스템은 말로닐 Co-A로부터 PUFA를 합성할 수 있는 해양 박테리아 및 특정한 미세조류(microalgae)에 존재하는 것으로 보여져왔다. 쉐와넬라(Shewanella) 및 다른 해양 미생물인 비브리오 마리누스(Vibrio marinus)의 PUFA 합성을 위한 PKS 경로는 미국특허 제6,140,486호에 상세히 개시되어 있다. 진핵의 트라우스토카이트리드(Thraustochytrid)인 스키조카이트리움(Schizochytrium)의 PUFA 합성을 위한 PKS 경로는 미국특허 제6,566,583호에 상세히 개시되어 있다. 또한, 스키조카이트리움에서 PUFA PKS 경로의 완전한 구조적인 묘사를 포함한 트라우스토카이트리알레(Thraustochytriales)의 멤버와 같은 진핵에서 PUFA 합성을 위한 PKS 경로와 트라우스토카이트리움에서 PUFA PKS 경로의 동정이, 이 경로의 이용에 관한 상세 설명을 포함하여 (2002년 4월 16일에 출원된 미국특허출원 제10/124,800호에 대응되는) 2002년 12월 19일에 공개된 미국특허공개 제20020194641호에 상세히 개시되어 있다.
연구원들은 상기 문헌에 개시된 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템을 타입 II, 타입 I 및 모듈라(modular)로 언급되는 세 가지 기본 타입 중 어느 하나로 분류함으로써 개발을 시도하였다. 타입 II 시스템은 각각이 개별적인 효소 반응을 수행하는 분리될 수 있는 단백질에 의해 특징지어진다. 상기 효소는 협력하여 최종 생산물을 제조하고 상기 시스템의 각각의 효소는 최종 생산물의 제조에 여러 차례 참여한다. 이러한 타입의 시스템은 식물과 박테리아에서 발견된 지방산 신타제(FAS) 시스템과 유사한 방식으로 작동한다. 타입 I PKS 시스템은 효소가 최종 생산물을 제조하기 위하여 반복적으로 사용된다는 점에서 타입 II 시스템과 유사하다. 타입 I은 효소 활성이 분리될 수 있는 단백질과 연관되어 있는 대신에 더 큰 단백질의 도메인으로서 존재한다는 점에서 타입 II와 상이하다. 상기 시스템은 동물과 진균에서 발견되는 타입 I FAS 시스템과 유사하다.
타입 I 및 타입 II 시스템과는 대조적으로 모듈라 PKS 시스템에서 각 효소 도메인은 최종 생산물의 제조에서 단지 한차례만 이용된다. 도메인은 매우 큰 단백질에서 발견되고 각 반응의 산물은 PKS 단백질에 있는 다른 도메인으로 전달된다. 또한, 상술한 모든 PKS 시스템에서 최종 산물에 탄소-탄소 이중 결합이 통합된다면 항상 트랜스 배형(configuration)이다.
상술한 타입 I 및 타입 II PKS 시스템에서는 최종 생산물이 수득될 때까지 각 사이클마다 동일한 반응의 세트가 수행된다. 상기 생합성 과정 중에 독특한 반응이 도입될 가능성은 없다. 모듈라 PKS 시스템은 반복적인 반응의 효율을 이용하지 않는 거대한 단백질을 요구한다(즉, 개별적인 도메인이 각 반응마다 요구된다). 또한, 탄소-탄소 이중 결합은 상술한 모든 PKS 시스템에서 트랜스 배형으로 도입된다.
다중불포화 지방산(PUFA)은 대부분의 진핵생물에서 멤브레인 리피드의 중요 성분이고(Lauritzen et al. Prog . Lipid Res . 40 1(2001); McConn et al. Plant J. 15, 521 (1998)) 특정 호르몬과 신호 분자의 전구체이다(Heller et al. Drug 55, 487(1998); Creelman et al. Annu . Rev . Plant Physiol . Plant Mol . Biol . 48, 355 (1997)). 공지된 PUFA 합성 경로에는 연장(elongation)과 호기성의 불포화(desaturation) 반응에 의한 지방산 신타제(FAS)로부터 유래된 포화 16:0 또는 18:0 지방산(약자 X:Y에서 X 탄소 원소와 (일반적으로 PUFA에서 시스인) Y 이중 결합을 포함한 아실기를 의미한다; PUFA의 이중 결합 위치는 지방산 쇄의 메틸 탄소(ω3 또는 ω6)에 대하여 이중 결합의 체계적인 메틸렌 도입으로 나타낸다)의 처리를 포함한다(Sprecher, Curr . Opin . Clin . Nutr . Metab . Care 2, 135 (1999); Parker-Barnes et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97, 8284 (2000); Shanklin et al. Annu Rev . Plant Physiol . Plant Nol . Biol . 49, 611 (1998)). 아세틸-CoA로 시작하여 도코사헥사엔산(DHA)은 약 30개의 개별적인 효소 활성과 지방산 합성 사이클의 네 번의 반복적인 단계를 포함하여 거의 70개의 반응을 요구한다. 폴리케타이드 신타제(PKS)는 FAS와 일부 동일한 반응을 수행하고(Hopwood et al. Annu . Rev. Genet . 24, 37(1990); Bentley et al. Annu Rev . Microbiol . 53, 411 (1999)) 성장하는 탄소쇄에 공유결합의 부착 위치로서 동일한 작은 단백질(또는 도메인)인 아실 캐리어 단백질(ACP)을 이용한다. 그러나 이러한 효소 시스템에서는 FAS에서 보여지는 환원, 탈수 및 환원의 완전한 사이클은 종종 생략되어 일반적으로 트랜스 배형의 탄소-탄소 이중 결합 뿐만 아니라 많은 케토- 및 하이드록시기를 포함한 파생된 탄소쇄가 제조된다. PKS의 일차 산물은 종종 순환되어 항생제와 많은 다른 이차 산물을 포함한 복잡한 생화학물질을 형성한다(상기된 Hopwood et al.(1990); Bentley et al. (1999); Keating et al. Curr . Opin . Chem Biol . 3, 598(1999).
도코사헥사엔산(DHA; 22:6ω3) 및 에이코사펜타엔산(EPA; 20:5ω3)과 같은 장쇄의 PUFA가 쉐와넬라 sp를 포함한 여러 종의 해양 박테리아로부터 보고되었다(Nichols et al. Curr . Op . Biotechnol . 10, 240(1999); Yazawa. Lipids 31, S (1996); Delong et al. Appl Environ . Microbiol . 51, 730 (1986)). 쉐와넬라 sp 균주 SCRC2738 유래의 (플라스미드 pEPA로서 클론된) 게놈 단편의 분석은 대장균에서 EPA 제조에 필수적이고 충분한 총 20Kb인 다섯 개의 오픈 리딩 프레임(Orfs)의 동정으로 이어졌다(상기 Yazawa, (1996)). 추정된 단백질 도메인 중 몇 개는 FAS 효소의 상동체인 반면에 다른 영역은 공지된 기능의 단백질과 상동성을 보이지 않았다. 다섯 개의 Orfs 내에서 적어도 11개의 영역의 추정된 효소 도메인으로서 동정되었다(Metz et al. Science 293:290-293(2001) 참조). 유전자 데이터베이스에 있는 서열들과 비교하였을 때 이들 중 일곱 개가 FAS 단백질 보다는 PKS 단백질과 더욱 관련성이 있었다. 상기 그룹 내에는 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT), β-케토아실-ACP 신타제(KS), β-케토아실-ACP 환원효소(KR), 아실트랜스퍼라제(AT), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄 길이 (또는 쇄 개시) 인자(CLF) 및 독특한 여섯 개의 ACP 도메인 무리(즉, PKS 또는 FAS 서열에서 종래에는 보고된 바 없는 둘 이상의 무리를 이룬 ACP 도메인의 존재)을 코딩하는 것으로 추정되는 도메인이 포함되어 있다. 쉐와넬라에서 동정된 PUFA 합성을 위한 PKS 경로가 해양 박테리아에서 일반적인 것으로 보인다. 쉐와넬라 유전자 무리와 높은 상동성을 가진 유전자가 포토박테리움 프로펀둠(Photobacterium profundum, Allen et al. Appli . Environ Microbiol . 65:1710 (1999)과 모리텔라 마리나(비브리오 마리누스)(Moritella Marina(Vibrio marinus, 미국특허 제6,140,486호 및 Tanaka et al. Biotechnol. Lett . 21:939 (1999))에서 동정되었다.
다중불포화 지방산(PUFA)은 영양학적, 약제학적, 산업적 및 기타 목적에 유용한 것으로 여겨진다. 천연원 및 화학적 합성에서 유래된 PUFA의 확장된 공급은 상업적 수요에는 충분하지 못하다. PUFA의 현재 주요 공급원은 해양의 어류로부터 유래된다; 그러한 어류의 재고는 감소하고 있어 이는 지속 가능한 자원일 수 없다. 또한, 중금속 및 독성의 유기 분자에 의한 오염은 해양 어류로부터 유래된 오일에서 심각한 문제가 되고 있다. 오일 종자 작물에서 유래된 식물의 오일은 상대적으로 저렴하고 어류 오일과 관련된 오염 문제로부터 자유롭다. 그러나 상업적으로 개발된 식물의 오일에서 발견되는 PUFA는 일반적으로 리놀레산(델타 9 및 12 위치에 2개의 이중 결합을 가진 18개의 탄소 - 18:2 델타 9,12)과 리놀렌산(18:3 델타 9, 12, 15)에만 제한된다. PUFA 합성을 위한 전통적인 경로에서 중쇄 길이의 포화 지방산(지방산 신타제(FAS) 시스템의 생산물)은 일련의 연장과 탈포화 반응에 의해 변형된다. 다수의 개별 탈포화 효소 및 연장 효소들이 리놀레산 및 리놀렌산으로부터 더욱 포화되고 더욱 긴 쇄의 PUFA를 제조하는 지방산의 합성을 위하여 요구되기 때문에 EPA 및 도코사헥사엔산(DHA)과 같은 PUFA의 발현을 위해 식물 숙주 세포를 조작하는 것은 합성을 달성하기 위하여 여러 개의 개별 효소의 발현을 요구할 것이다. 또한, 그러한 PUFA를 유용한 양으로 제조하기 위해서는 돌연변이 유발 또는 색소체(plastid) 세포 소기관으로 효소의 표적화와 같이 예를 들면 기질에 대하여 경쟁하는 효소를 하향 조정하는 조작, 더 높은 효소 활성으로의 조작과 같은 추가의 조작 노력이 요구된다. 따라서 천연적으로 이러한 지방산을 제조하는 종으로부터 유래된 PUFA 생합성에 관여하는 유전적 물질을 입수하고 이렇게 분리된 물질을 단독으로 또는 상업적인 양으로 PUFA의 제조가 가능하도록 조작될 수 있는 이형성의 시스템과 조합하여 발현시키는 것이 적절하다.
쉐와넬라 및 비브리오 마리누스와 같은 해양 박테리아에서 PUFA PKS 시스템의 발견(미국특허 제6,140,486호 참조)은 상업적인 PUFA 제조의 새로운 방법을 위한 자원을 제공한다. 그러나 이러한 해양 박테리아는 상업적인 수준의 그들의 유용성을 제한하는 한계를 가지고 있다. 첫 번째 미국특허 제6,140,486호에는 상기 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템이 식물을 유전적으로 변형시키는데 이용될 수 있다고 개시되어 있으나, 상기 해양 박테리아는 차가운 해양 환경에서 천연적으로 생존하고 성장하며, 상기 박테리아의 효소 시스템은 22℃ 이상에서 제대로 기능을 발휘하지 못한다. 이와 대조적으로 PUFA PKS 시스템을 사용하는 유전적 조작의 매력적인 표적인 많은 작물은 22℃ 이상 40℃ 보다 높은 온도에서 일반적인 성장 조건을 가진다. 따라서 이러한 해양 박테리아 유래의 PUFA PKS 시스템은 일반적인 성장 조건 하에 있는 식물 발현에 용이하게 적용할 수 없을 것으로 예상된다. 또한, 공지된 해양 박테리아의 PUFA PKS 시스템은 트리아실글리세롤(TAG)을 직접적으로 제조하지 않는데, 일반적으로 낮은 수준으로 축적될 수 있는"구조적" 리피드 생산물(예, 포스포리피드)에 반해 TAG는 리피드 저장 생산물로서, 결과적으로 세포에서 매우 높은 수준으로 축적될 수 있기 때문에 TAG의 직접적인 제조가 적합할 것이다.
에이코사펜타엔산(EPA)의 제조와 관련하여 특히 연구원들은 광합성 및 종속영양(heterotrophic) 배양 모두에서 미생물을 성장시킴으로써 미생물에 의해 EPA를 제조하기 위하여 노력해왔다. 그들은 배양 조건하에서 유기체의 생산성을 증가시키기 위한 전통적 및 직접적인 유전적 방식 모두를 사용하였다. 다른 연구원은 다양한 탈포화 및 연장 효소를 코딩하는 유전자의 도입에 의해 오일-종자 식물에서 EPA를 제조하는 것을 시도하였다.
연구원들은 적색 미세조류(모노두스, Monodus), 규조류[예, 패오닥틸룸(Phaeodactylum)], 다른 미세조류 및 진균[예, 낮은 온도에서 배양되는 모티렐라(Mortierella)])의 배양을 이용하는 시도를 해보았다. 그러나 모든 경우에서 DHA와 같은 다른 장쇄의 PUFA를 위한 종래의 상업적인 미생물의 제조 시스템과 비교하였을 때 생산성은 낮았다. 많은 경우에 EPA가 일차적으로 트리아실글리세롤(TAG) 보다는 포스포리피드(PL)에서 존재하였다. 미세 조류의 생산성은 종속영양 성장 환경 하에서 광합성 환경 하에서 보다 훨씬 높을 수 있기 때문에 연구원들은 특정한 당 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 도입함으로써 영양의 전환을 시도하였고 달성하였다. 그러나 신규하게 수득된 종속 영양의 능력으로도 오일과 관련된 생산성은 상대적으로 낮았다.
내인성의 지방산 생합성 경로의 변형에 의한 오일-종자 작물에서 EPA를 제조하기 위한 노력은 오일 중에 매우 낮은 수준의 PUFA를 가진 식물을 수득할 뿐이었다. 상기된 바와 같이 몇 개의 해양 박테리아가 PUFA(DHA 뿐만 아니라 EPA)를 제조하는 것으로 보여졌다. 그러나 상기 박테리아는 TAG를 제조하지 않고 EPA는 PL 멤브레인에서 일차적으로 발견된다. (상기된) 이러한 특정한 해양 박테리아의 성장 특성 뿐만 아니라 제조된 EPA의 수준은 EPA의 상업적인 제조를 위한 이들의 능력을 제한한다.
따라서 상업적으로 이용될 수 있도록 더 높은 유동성을 가지는 또 다른 PUFA PKS 시스템과 상업적으로 유용한 제조방법으로 EPA와 같은 목적한 PUFA가 풍부한 양의 리피드를 효과적으로 제조하는 생물학적 시스템에 대한 수요가 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 양태는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 한 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 한 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 한 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및/또는 (f) (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 핵산 서열과 완전히 상보적인 핵산 서열로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 핵산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩한다. 한 측면에서, 상기 핵산 서열은 서열번호: 38, 서열번호: 40, 서열번호: 42, 서열번호: 44, 서열번호: 47, 서열번호: 49, 서열번호: 51, 서열번호: 53, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 서열번호: 65 및 서열번호: 67로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태는 상술한 핵산 분자 중 어느 하나를 적어도 하나의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 상술한 재조합 핵산 분자로 형질감염된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것으로서, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및/또는 (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 미생물은 PKS 시스템의 활성에 영향을 미치도록 유전적으로 변형된다.
한 측면에서, 상기 미생물은 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 (PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질감염됨으로써 유전적으로 변형된다. 예를 들면, 상기 미생물은 스키조카이트리움과 같은 트라우스토카이트리드(Thraustochytrid)를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 그러한 미생물은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 재조합에 의해 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되었다. 비박테리아의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템을, 한 측면으로는 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 미생물은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 내인적으로 발현하고 유전적 변형은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 있다. 다른 측면에서, 상기 미생물은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템(예, 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템과 같은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 재조합에 의해 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되었다.
다른 측면에서, 상기 미생물은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PUJFA PKS 시스템을 내인적으로 발현하고 유전적 변형은 제 2의 PKS 시스템에서 유래된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자와 내인성의 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재조합 핵산 분자의 발현을 포함한다. 상기 제 2의 PKS 시스템에서 유래된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인은 이에 제한되는 것은 아니지만, (a) 트라우스토카이트리드 미생물 유래의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템의 도메인; (b) (i) 적어도 하나의 PUFA를 제조하는 미생물을 선택하는 단계; (ii) 발효 배지 중 약 5% 이상의 용존 산소 포화 농도에서 미생물에 의한 PUFA 생산량과 비교하였을 때 발효 배지 중 약 5% 이하의 용존 산소 포화 농도에서 증가된 PUFA를 제조하는 능력을 가진 미생물을 동정하는 단계에 의해 동정된 미생물로부터 PUFA PKS 시스템의 도메인; (c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호:13, 서열번호:18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 도메인; (d) 상기 (c)의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 재조합 핵산 분자는 포스포판테테인 트랜스퍼라제를 코딩한다. 한 측면에서 두 번째 PKS 시스템은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템(예, 이에 제한되는 것은 아니지만, 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템을 포함한 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템과 진핵의 PUFA PKS 시스템)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 유전적으로 변형된 식물에 관한 것으로서, 상기 도메인은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및/또는 (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 식물은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템(예, 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템과 같은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 재조합에 의해 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되었다.
본 발명의 또 다른 양태는 생활성 분자를 제조하기에 효과적인 조건하에서 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 유전적으로 변형된 유기체를 배양하는 단계를 포함하여 폴리케타이드 신타제 시스템에 의해 제조되는 생활성 분자를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및/또는 (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 상기 유기체는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 내인적으로 발현하고 유전적 변형은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 있다. 한 측면에서, 상기 유전적 변형은 PUFA PKS 시스템이 유전적으로 변형되지 않은 유기체와 비교하였을 때 내인성의 PKS 시스템에 의해 제조되는 적어도 하나의 생산물을 변화시킨다.
다른 측면에서, 상기 유기체는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 내인적으로 발현하고 유전적 변형은 제 2의 PKS 시스템에서 유래된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자와 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재조합 핵산 분자에 의한 유기체의 형질감염을 포함한다. 한 측면에서 유전적 변형은 PUFA 제조에 영향을 미치도록 유전적으로 변형되지 않은 유기체와 비교하였을 때 내인적으로 PKS 시스템에 의해 제조되는 적어도 하나의 생산물을 변화시킨다.
다른 측면에서, 상기 유기체는 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS)의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질전환됨으로써 유전적으로 변형된다.
다른 측면에서, 상기 유기체는 유전적 변형이 없는 자연적으로 존재하는 유기체와는 상이한 다중불포화 지방산 (PUFA) 프로필을 제조한다.
다른 측면에서, 상기 유기체는 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 발현하고, 유전적 변형은 비박테리아의 PUFA PKS 시스템 중 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 다른 PKS 시스템 유래의 도메인으로 치환하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 유기체는 PUFA PKS 시스템에 의해 제조되는 지방산의 쇄 길이를 조절하는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 유기체를 형질감염시킴으로써 변형된 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 발현한다.
다른 측면에서, 상기 생활성 분자는 항염증 제형, 화학 요법제, 활성 부형제, 골다공증 약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파이로리 약, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약, 퇴행성 간 질환의 치료를 위한 약, 항생제 및/또는 콜레스테롤 저하 제형으로부터 선택된다. 한 측면에서, 생활성 분자는 항생제이다. 다른 측면에서, 생활성 분자는 다중불포화 지방산(PUFA)이다. 또 다른 측면에서, 생활성 분자는 시스-배형의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 분자이다. 한 측면에서 상기 생활성 분자는 세 번째 탄소마다 이중 결합을 포함하는 분자이다. 한 측면에서, 유기체는 미생물이다. 또 다른 측면에서, 유기체는 식물이다.
본 발명의 다른 양태는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 식물의 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하여 천연적으로 존재하는 식물과는 상이한 다중불포화 지방산(PUFA) 프로필을 가진 식물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및 (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 제조된 오일을 최종 산물에 첨가하는 단계를 포함하여, 적어도 하나의 지방산을 함유하는 최종 산물을 변형시키는 방법에 관한 것으로, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및 (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 상기 최종 산물은 식이 보조제, 식료품, 약제학적 제형, 인간화된 동물의 밀크 및 분유로부터 선택된다. 한 측면에서, 상기 약제학적 제형은 항염증 제형, 화학 요법제, 활성 부형제, 골다공증 약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파이로리 약, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약, 퇴행성 간 질환의 치료를 위한 약, 항생제, 콜레스테롤 저해 제형으로부터 선택된다. 한 측면에서, 최종 산물은 만성 염증, 급성 염증, 위장관계 질환, 암, 카켁시아(cachexia), 심장의 재협착증, 신경퇴행성 질환, 간의 퇴행성 질환, 혈액 리피드 질환, 골다공증, 동맥경화, 자가면역 질환, 자간전증, 조산, 노화와 연관된 황발변증, 호흡기계 질환 및 퍼옥시조말(peroxisomal) 질환으로부터 선택된 용태를 치료하는데 이용된다.
본 발명의 또 다른 양태는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 밀크를 제조하는 동물의 밀크를 제조하는 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하여, 인간화된 동물 밀크를 제조하는 방법에 관한 것으로 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (c) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및 (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템 중 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 내인적으로 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템을 발현하고, 내인성의 PUFA PKS 시스템은 유전적으로 변형되지 않은 트라우스토카이트리드 미생물과 비교했을 때 트라우스카이트리드 미생물에 의한 다중불포화 지방산 (PUFA)의 발현 프로필을 변형시키도록 유전적으로 변형시킨 트라우스토카이트리드 미생물에 관한 것이다.
한 측면에서, 상기 내인성의 PUFA PKS 시스템은 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 돌연변이에 의해 변형되었다. 한 측면에서, 상기 변형은 표적화된 돌연변이에 의해 제조된다. 다른 측면에서, 상기 변형은 전통적인 돌연변이 및 스크리닝에 의해 제조된다.
다른 측면에서, 내인성의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 미생물의 PUFA 제조 프로필을 변이시키기 위하여 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 결실하고 상기 내인성 도메인의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 유전적으로 변형시킨다. 여기서, 상기 상동체는 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진다. 한 측면에서, 내인성 도메인의 상동체는 내인성 도메인과 비교하였을 때 미생물에 의한 PUFA 제조의 변이를 초래하는 적어도 하나의 결실, 삽입 또는 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변이를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 상동체의 아미노산 서열은 내인성 도메인의 아미노산 서열의 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하다. 한 측면에서, 내인성 도메인의 상동체는 다른 트라우스토카이트리드 미생물의 PUFA PKS 시스템에서 유래된 도메인이다.
다른 측면에서, 내인성의 PUFA PKS 시스템은 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 결실하고 다른 미생물 유래 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 변형되었다. 한 측면에서, 다른 미생물 유래 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 박테리아의 PUFA PKS 시스템으로부터 유래된다. 예를 들어 다른 미생물은 약 25℃ 이상의 온도에서 천연적으로 PUFA를 제조하는 PUFA PKS 시스템을 가진 해양의 박테리아일 수 있다. 한 측면에서, 상기 해양의 박테리아는 쉐와넬라 올레야나 및 쉐와넬라 자포니카로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 측면에서, 다른 미생물 유래의 PKS 시스템의 도메인은 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 다른 트라우스토카이트리드 미생물 유래의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템 유래이다.
상기 측면 중 하나에서, 내인성의 PUFA PKS 시스템의 도메인은 이에 제한되는 것은 아니지만, 말로닐-CoA: ACP 아실트랜스퍼라제(MAT), β-케토 아실-ACP 신타제(KS), 케토환원효소(KR), 아실트랜스퍼라제(AT), FabA-유사 β-하이드록시 아실 ACP 탈수소효소(DH), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄길이 인자(CLF), 아실 캐리어 단백질(ACP), 엔오일 ACP-환원효소(ER), 트랜스2-아실 ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실 ACP의 시스-3-아실 ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소, 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실 ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 어느 하나의 생물학적 활성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 상기 측면 중 어느 하나에서, 내인성의 PUFA PKS 시스템의 도메인은 (a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 및 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
한 측면에서, PUFA 제조 프로필은 미생물에 의한 에이코사펜타엔산(EPA)의 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된다. 다른 측면에서 PUFA 제조 프로필은 미생물에 의한 도코사헥사엔산(DHA)의 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된다. 다른 측면에서, PUFA 제조 프로필은 미생물에 의한 도코사펜타엔산(DPA)의 하나 또는 두 개의 이성질체의 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된다. 다른 측면에서, PUFA 제조 프로필은 미생물에 의한 아라키돈산의 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된다. 다른 측면에서, 상기 트라우스토카이트리드는 스키노카이트리움, 트라우스토카이트리움 및 자포노카이트리움으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속에서 유래된다. 다른 측면에서, 트라우스토카이트리드는 스키조카이트리움 속에서 유래된다. 다른 측면에서, 트라우스토카이트리드는 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔 및 스키조카이트리움 미누툼으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 스키조카이트리움 종에서 유래된다. 다른 측면에서, 트라우스토카이트리드는 트라우스토카이트리움 종에서 유래된다.
본 발명의 다른 양태는 에이코사펜타엔산(EPA)을 제조하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움에 관한 것으로 상기 스키조카이트리움은 스키조카이트리움에 의한 EPA의 제조를 초래하는 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 내인성의 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템을 가진다. 한 측면에서, 상기 스키조카이트리움은 말로닐-CoA: ACP 아실트랜스퍼라제(MAT), β-케토 아실-ACP 신타제(KS), 케토환원효소(KR), 아실트랜스퍼라제(AT), FabA-유사 β-하이드록시 아실 ACP 탈수소효소(DH), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄길이인자(CLF), 아실 캐리어 단백질(ACP), 엔오일 ACP-환원효소(ER), 트랜스2-아실 ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실 ACP의 시스-3-아실 ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소, 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실 ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 어느 하나의 생물학적 활성을 가진 도메인을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 스키조카이트리움은 내인성의 PUFA PKS 시스템의 서열번호 : 2를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에서 유래된 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 스키조카이트리움은 내인성의 PUFA PKS 시스템의 서열번호 : 4를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에서 유래된 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 스키조카이트리움은 내인성의 PUFA PKS 시스템의 서열번호 : 6을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에서 유래된 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 스키조카이트리움은 β-케토 아실-ACP 신타제(KS), FabA-유사 β-하이드록시 아실 ACP 탈수소효소(DH), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄길이 인자(CLF), 트랜스2-아실 ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실 ACP의 시스-3-아실 ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소, 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실 ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 어느 하나의 생물학적 활성을 가진 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 스키조카이트리움은 내인성 PUFA PKS 시스템의 서열번호 : 20, 서열번호 : 22, 서열번호 : 28 및 서열번호 : 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 스키조카이트리움은 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 결실하고 비스키조카이트리움 미생물 유래의 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 변형된다. 한 측면에서, 비스키조카이트리움 미생물은 적어도 약 15℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 20℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 성장하고 PUFA를 제조한다. 한 측면에서 비스키조카이트리움 미생물 유래의 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 박테리아의 PUFA PKS 시스템 유래이다. 한 측면에서, 상기 박테리아의 PUFA PKS 시스템은 쉐와넬라 올레야나 및 쉐와넬라 자포니카로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아이다. 다른 측면에서, PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다(예를 들면, 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템과 같은 진핵의 PUFA PKS 시스템).
본 발명의 다른 양태는 유전적으로 변형되지 않은 스키조카이트리움과 비교하였을 때 증가된 양의 도코사헥사엔산(DHA)을 제조하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움에 관한 것으로 상기 스키조카이트리움은 스키조카이트리움에 의한 DHA의 증가된 제조를 초래하는 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 내인성의 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템을 가진다. 한 측면에서, 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 트라우스토카이트리움 유래의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인 대신에 치환됨으로써 변형되었다. 한 측면에서, 스키조카이트리움에 의해 제조된 DHA 대 DPA의 비율은 유전적으로 변형되지 않은 스키조카이트리움과 비교하였을 때 증가된다.
본 발명의 다른 양태는 리피드를 제조하기에 효과적인 조건하에서 상술한 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물 또는 상술한 유전적으로 변형된 스키조카이트리움을 배양하는 단계를 포함하여 적어도 하나의 선택된 다중불포화 지방산(PUFA)으로 풍부한 리피드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 선택된 PUFA는 에이코사펜타엔산(EPA)이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, EPA가 풍부한 리피드를 제조하기에 효과적인 조건하에서 내인성 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템을 가지고, 유전적으로 변형되지 않은 미생물과 비교하였을 때 내인성의 PUFA PKS 시스템이 미생물의 리피드에서 EPA의 제조를 개시 또는 증가시키도록 적어도 하나의 도메인에서 유전적으로 변형된 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물을 배양하는 단계를 포함하여 에이코사펜타엔산(EPA)이 풍부한 리피드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 일반적으로 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이트 신타제(PKS) 시스템, 그러한 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 유기체, 생물질, 특히 DHA, DPA 및 EPA와 같은 PUFA를 포함한 생산물의 제조를 위하여 그러한 시스템을 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 PUFA PKS 시스템은 일반적으로 하기 동정 특징을 가지고 있다: (a) 시스템의 천연 물질로서 PUFA를 제조한다; (2) 상기 시스템은 지방산 쇄의 반복적인 과정 뿐만 아니라 선택된 사이클에서 트랜스-시스 이성질화 및 엔오일 환원 반응을 포함한 비반복적 과정 모두를 수행하는 복합체로 어셈블리되는 여러 개의 다기능성 단백질을 포함한다(예를 들면 도 1 참조). PUFA PKS 시스템은 유기체에서 PUFA를 제조하기 위하여 복합적으로 작용하는 모든 유전자 및 이들의 코딩된 생산물을 집합적으로 의미한다. 따라서 PUFA PKS 시스템은 이의 천연 생산물이 PUFA인 PKS 시스템을 특히 의미한다.
보다 자세하게, 첫 번째, 본 발명의 기본을 형성하는 PUFA PKS 시스템은 생산물로서 다중불포화 지방산(PUFA)을 제조한다 (즉, 내인적으로 (천연적으로) PKS 시스템을 이용하여 PUFA를 제조하는 그러한 시스템을 함유하는 유기체) 본 발명에서 PUFA는 적어도 16개의 탄소, 보다 바람직하게는 적어도 18개의 탄소, 보다 바람직하게는 적어도 20개의 탄소, 보다 바람직하게는 22개 이상의 탄소를 가지고, 적어도 3개 이상의 이중 결합, 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 5개 이상, 보다 더 바람직하게는 6개 이상의 이중 결합을 가지되, 상기 모든 이중 결합은 시스 배형(configuration)인 다중불포화지방산을 의미한다. 본 발명의 목적은 유전적 변형 또는 최종 생산물의 조작을 통하여 목적한 쇄의 길이와 목적한 이중 결합수를 가진 다중불포화지방산을 제조하는 PKS 시스템을 발견하거나 제조하는 것이다. PUFA의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, DHA(도코사헥사엔산 (C22:6, ω-3)), ARA(에이코사테트라엔산 또는 아라키돈산 (C20:4, n-6)), DPA (도코사펜타엔산 (C22:5, ω-6 또는 ω-3) 및 EPA (에이코사펜타엔산 (C20:5, ω-3))을 포함한다.
두 번째, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 반복적이고 비반복적인 반응 모두를 통합하고 있어 상기 시스템은 기존에 개시된 PKS 시스템(예, 타입 I, 타입 II 또는 모듈라)과는 차별화된다. 보다 상세하게 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 각 사이클 동안 기능을 발휘하는 도메인 뿐만 아니라 일부 사이클 동안만 기능을 발휘하는 도메인을 모두 포함한다. 이러한 기능성의 중요 측면은 박테리아의 Fab-A 효소와 상동성을 보이는 도메인과 관련될 수 있다. 예를 들어, 대장균의 Fab-A 효소는 두 개의 효소 활성을 보유하는 것으로 보여진다. 이는 하이드록시기를 포함하는 탄소쇄로부터 물 분자(H2O)를 추출하고 탄소 쇄에 트랜스 이중 결합을 남겨두는 탈수 활성을 보유한다. 또한, 트랜스 이중 결합을 시스 배형으로 전환하는 이소머라제 활성을 가지고 있다. 이러한 이성질화는 근접한 탄소 원소로 이중 결합을 이동시키는 것과 접합하여 달성된다. PKS (및 FAS) 시스템에서 주 탄소 쇄의 개수는 2개 탄소의 증가분으로 연장된다. 따라서 이러한 PKS 시스템의 PUFA 생산물을 제조하기 위하여 요구되는 연장 반응 회수가 예측된다. 예를 들어, DHA(C22:6, 모두 시스)를 제조하기 위하여 10번의 연장 반응이 요구된다. 최종 산물에 단지 6개의 이중 결합이 있기 때문에 일부 반응 사이클 동안에 이중 결합이 (시스 이성질체로서) 유지되며, 나머지에서 이중 결합은 다음 연장 이전에 환원된다.
해양 박테리아(미국특허 제6,140,486호 참조)에서의 PUFA PKS 시스템의 발견 이전에 PKS 시스템은 이러한 반복적이고 선택적인 효소 반응의 조합을 보유하지 않는 것으로 알려졌고 시스 배형의 탄소-탄소 이중 결합을 제조할 수 없는 것으로 여겨졌다. 그러나 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 시스 이중 결합을 도입하는 능력과 사이클에 있는 반응 순서를 다양화하는 능력을 가지고 있다.
본 발명자들은 이전에 개시된(타입 II, 타입 I 및 모듈라) PKS 시스템에서 의해 제조될 수 없는 범위의 생활성 분자를 제조하기 위하여 PUFA PKS 시스템의 이러한 특징을 이용할 것을 제안한다. 이러한 생활성 분자는 이에 제한되는 것은 아니지만, 다중불포화지방산(PUFA), 항생제 또는 다른 생활성 화합물이며, 이들 다수는 하기에서 설명된다. 예를 들어, 본 발명에서 개시된 PUFA PKS 유전자 구조에 대한 지식을 이용하여 다수의 방법 중 어느 하나가 PUFA PKS 유전자를 변이시키거나 다른 PKS 시스템을 포함한 다른 합성 시스템과 이러한 유전자의 일부를 조합하여 사용해서 새로운 생산물을 제조할 수 있다. 반복적이고 선택적인 반응을 모두 수행하는 이러한 특별한 타입의 시스템의 타고난 능력은 상기 시스템으로 하여금 유사한 방법이 PKS 시스템의 다른 타입에 적용된다면 발견될 수 없는 생산물을 제조 가능하게 할 것이다.
진핵의 트라우스토카이트리드인 스키조카이트리움의 PUFA 합성을 위한 PKS 시스템 구조의 대부분이 미국특허 제6,566,583호에 상세히 기술되어 있다. 본 발명자에 의한 스키조카이트리움의 cDNA 및 게놈 클론의 완전한 서열분석은 OrfA, OrfB 및 OrfC 각각의 전장 게놈 서열의 동정과 쉐와넬라에 있는 도메인과 상동성을 가진 스키조카이트리움 Orf에 있는 특정한 도메인의 완전한 동정을 가능하게 하였다(도 2와 미국특허출원 제10/124,800호 참조). 미국특허출원 제10/124,800호에서, 발명자들은 트라우스토카이트리움 종이 PUFA PKS 시스템을 가질 기준을 만족시킨다는 것을 동정하였고 서던 블롯 분석에 의해 이러한 유기체가 스키조카이트리움 PUFA PKS 유전자와 상동성을 가진 유전자를 보유하는 것을 증명하였다. 그러나 상기 유전자의 분리와 구조의 결정 및 상기 유전자의 도메인 조직화는 미국특허출원 제10/124,800호에 개시되어 있지 않다. 본 발명에서 발명자들은 트라우스토카이트리움 속의 상기 트라우스토카이트리드(특히 트라우스토카이트리움 sp.23B(ATCC 20892))에 있는 상동성의 오픈 리딩 프레임(Orf)의 전장 게놈 서열을 클로닝하고 분석하였으며, 상기 트라우스토카이트리움에 있는 PUFA PKS 시스템을 포함한 도메인을 동정하였다. 따라서 본 발명은 상업적 이용을 위하여 유동성을 가지는 추가의 PUFA PKS 시스템을 제공한다는 상술한 문제점을 해결할 수 있다. 트라우스토카이트리움 PUFA PKS 시스템은 하기에서 상세히 기술된다.
또한, 본 발명은 본 발명자들에 의한 스키조카이트리움과 트라우스토카이트리움과 같은 트라우스토카이트리알레 목의 멤버를 포함하여 진핵생물에서 PUFA를 제조하는 폴리케타이트 신타제 유사 시스템의 조작에 의해 PUFA가 풍부한 리피드(멤브레인 관련 포스포리피드(PL) 뿐만 아니라 트리아실글리세롤(TAG))을 효과적으로 제조하는 방법과 유전적으로 변형된 미생물의 발달에 의해 EPA와 같은 상업적으로 가치있는 목적한 PUFA가 풍부한 리피드의 제조를 위한 상술한 문제점을 해결한다. 특히 본 발명자들은 PUFA, 일차적으로 도코사헥사엔산 (DHA; C22:6, n-3) 및 도코사펜타엔산 (DPA; C22:5, n-6)가 풍부한 오일의 상업적인 제조를 위하여 앞서 최적화되었고, 여기서 유기체의 오일 제조 특성을 희생하지 않으면서 EPA(C20:5, n-3) 제조 (또는 다른 PUFA 제조)가 DHA 제조를 대체하도록 유전적으로 변형될 스키조카이트리움의 균주를 예시로서 기술한다. 또한, 본 발명자들은 특히, PUFA PKS 시스템의 변형을 통하여 미생물에 의해 제조되는 DHA 대 DPA의 비율을 변이시킴으로써 스키조카이트리움 유기체에 의한 DHA 제조를 증진시키기 위하여 트라우스토카이트리움 유래의 PUFA PKS 유전자로 스키조카이트리움의 유전적 변형을 기술하고 있다. 이는 단지 본 발명에 포함되는 기술의 일부 예에 지나지 않으며, 본 발명의 사상은 하기에서 설명되는 다른 제조 유기체 및 다른 목적한 PUFA에 대하여 용이하게 적용될 수 있다.
한 양태에서 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 적어도 하나의 하기 생물학적으로 활성인 도메인을 포함한다:(a) 적어도 두 개의 엔오일-ACP 환원효소(ER) 도메인; (b) 적어도 여섯 개의 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인; (c) 적어도 두 개의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (d) 적어도 하나의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인; (e) 적어도 하나의 β-케토아실-ACP 환원효소(KR) 도메인; (f) 적어도 두개의 FabA 유사 β-하이드록시아실-ACP 탈수소효소(DH) 도메인; (g) 적어도 하나의 쇄길이인자(chain length factor, CLF) 도메인 및 (h) 적어도 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인. 이러한 도메인의 기능은 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련하여 하기에서 상세하게 기술될 것이다.
다른 양태에서, PUFA PKS 시스템은 적어도 하나의 하기 생물학적 활성인 도메인을 포함한다: (a) 적어도 하나의 엔오일-ACP 환원효소 (ER) 도메인; (b) 다수의 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인(적어도 한 개 내지 네 개, 바람직하게는 적어도 다섯 개, 보다 바람직하게는 적어도 여섯 개, 보다 더 바람직하게는 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개 이상); (c) 적어도 두 개의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (d) 적어도 한 개의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인; (e) 적어도 한 개의 β-케토아실-ACP 환원효소(KR) 도메인; (f) 적어도 두 개의 FabA 유사 β-하이드록시아실-ACP 환원효소(DH) 도메인; (g) 적어도 한 개의 쇄길이인자(CLF) 도메인 및 (h) 적어도 한 개의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인. 바람직하게는 그러한 PUFA PKS 시스템은 비박테리아의 PUFA-PKS 시스템이다.
한 양태에서, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 비박테리아의 PUFA PKS 시스템이다. 다시 말해 한 양태에서, 본 발명의 PUFA PKS 시스템은 박테리아가 아닌 유기체로부터 분리되거나 진핵생물 또는 고세균(archaebacterium)과 같은 박테리아가 아닌 유기체 유래의 PUFA PKS 시스템으로부터 유래되거나 이의 상동체이다. 진핵생물은 세포의 분화 정도를 기초로 하여 원핵생물과 구별되는데, 진핵생물은 보다 더 분화된 세포를 가지고 있으며 원핵생물은 덜 분화된 세포를 가지고 있다. 일반적으로 원핵생물은 핵의 멤브레인을 보유하지 않으며, 세포 분열 중에 유사분열을 보이지 않고, 단지 하나의 염색체를 가지고 있으며, 이들의 사이토플라즘은 70S 리보좀을 함유하고, 미토콘드리아, 소포체, 엽록체, 리소좀 또는 골지체를 보유하지 않으며, 이들의 편모는 (존재한다면) 단일 원섬유로 구성된다. 대조적으로 진핵생물은 핵의 멤브레인을 가지고 있으며, 세포 분열 중에 유사 분열을 보이고, 다수의 염색체를 가지며, 이들의 사이토플라즘은 80S 리보좀을 함유하고, 미토콘드리아, 소포체, (조류에서) 엽록체, 리소좀 및 골지체를 보유하고, 이들의 편모는 (존재한다면) 다수의 원섬유로 구성된다. 일반적으로 박테리아는 원핵생물인데 반하여 조류, 진균, 원생생물, 프로토조아 및 보다 고도의 식물이 진핵생물이다.
해양 박테리아(예, 쉐와넬라 sp. 균주 SCRC2738 및 비브리오 마리누스)의 PUFA PKS 시스템은 본 발명의 기본을 이루지 않지만, 이러한 박테리아의 PUFA PKS 시스템에서 유래된 도메인을 본 발명에 따른 비박테리아의 PUFA PKS 시스템에서 유래된 도메인과 접합하여 사용하는 것을 고려한다. 또한, 본 발명은 하이브리드 작제물 및 유전적으로 변형된 미생물과 식물을 제조하기 위해서 본 발명에서 언급된 비박테리의 PUFA PKS 유전자를 변형시키거나 조합하기 위한 PUFA PKS 유전자원으로서 이용하기에 특히 적합할 다른 박테리아(예, 쉐와넬라 올레야나 및 쉐와넬라 자포니카)로부터 분리된 PUFA PKS 유전자 세트(및 이에 의해 코딩된 단백질 및 도메인)의 분리와 이용을 고려한다. 예를 들어 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 유기체는 비박테리아의 PUFA PKS 기능성 도메인을 박테리아의 PUFA PKS 기능성 도메인 뿐만 아니라 다른 PKS 시스템(타입 I, 타입 II, 모듈라) 유래의 PKS 기능성 도메인 또는 단백질 또는 FAS 시스템과 통합하여 제조될 수 있다. 하기에서 상세히 설명되는 쉐와넬라의 두 종 즉, 쉐와넬라 올레야나 또는 쉐와넬라 자포니카 유래의 PUFA PKS 유전자는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물, 식물 및 방법에 이용하는데 바람직한 예시적인 박테리아의 유전자이다. 그러한 해양 박테리아(예, 쉐와넬라 올레야나 또는 쉐와넬라 자포니카) 유래의 PUFA PKS 시스템(유전자 및 이에 의해 코딩된 단백질과 도메인)은 신규한 PUFA PKS 서열로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에서 용어/구 "트라우스토카이트리드", "트라우스토카이트리알레 미생물" 및 "트라우스토카이트리알레 목의 미생물"은 상호 교환적으로 이용될 수 있으며, 트라우스토카이트리알레 목의 멤버를 의미하고, 트라우스토카이트리아시애 과 및 라비린툴라시애 과 모두를 포함한다. 용어 " 라비린툴리드" 및 "라비린툴라시애"는 특히 라비린툴라시애 과의 멤버를 의미하기 위하여 사용된다. 트라우스토카이트리아시애 과의 멤버인 트라우스토카이트리드를 특히 의미하기 위하여 용어 "트라우스토카이트리아시애"가 사용된다. 따라서 본 발명에서 라비린툴리드의 멤버는 트라우스토카이트리드에 포함되는 것으로 여겨진다.
발달은 트라우스토카이트리드의 분류학에 빈번한 교정을 유발하였다. 분류학의 이론학자들은 트라우스토카이트리드를 조류 또는 조류 유사 원생 생물과 같이 지정한다. 그러나 분류학의 불확실성 때문에 본 발명의 목적에 따라 본 발명에서 트라우스토카이트리드로서 언급되는 균주를 하기 유기체를 포함하는 것이 적합하다: 목: 트라우스토카이트리알레; 과: 트라우스토카이트리아시애(종: 트라우스토카이트리움, 스키조카이트리움, 자포노카이트리움, 아플라노카이트리움 또는 엘리나) 또는 라비린투라시애(속: 라비린툴라, 라비린툴로이드 또는 라비린토믹사). 또한, 하기 속들이 종종 트라우스토카이트리아시애 또는 라비린툴라시애 둘 중 하나의 군으로 포함되는데: 알토르니카, 코랄로카이트리움, 디플로파이리스 및 피르호소러스, 본 발명의 목적에 따라 트라우스토카이트리드 또는 트라우스토카이트리알레 목의 멤버로 포함된다. 본 발명의 시기에 트라우스토카이트리드의 분류학에서의 교정은 라비린툴로이드 종을 라비린툴라시애의 과에 지정하고, 상기 두 개의 트라우스토카이트리아시애 및 라비린툴라시애 과의 위치를 스트라메노필 계통(Stramenopile lineage)으로 확정한다. 라비린툴라시애는 통상적으로 라비린툴리드 또는 라비린툴라 또는 라비린툴로이드라고 불리우며, 트라우스토카이트리아시애는 통상적으로 트라우스토카이트리드로 불리지만, 앞서 설명된 바와 같이 본 발명을 명확하기 위한 목적으로 트라우스토카이트리드는 트라우스토카이트리알레 목의 모든 멤버를 포함하고/거나 투라우스토카이트리아시애 및 라비린툴라시애 모두의 멤버를 포함한다. 최근 분류학에서의 변화를 다음과 같이 정리한다.
본 발명에서 개시된 특정 단일 세포의 미생물 균주는 트라우스토카이트리알레 목의 멤버다. 트라우스토카이트리드는 진화한 분류학 역사를 가진 해양의 진핵생물이다. 트라우스토카이트리드의 분류학적 지정과 관련된 문제는 Moss(1986), Bahnweb 및 Jackle(1986) 및 Chamberlain 및 Moss(1988)에 의해 검토되었다.
편의를 목적으로 트라우스토카이트리드는 분류학자들에 의하여 다른 무색의 유주자성(zoosporic) 진핵생물과 함께 파이코미세트(Phycomycete, 조류 유사 진균)에 지정되었다. 그러나 파이코미세트라는 이름이 분류학 상태로부터 떨어지고 트라우스토카이트리드는 우마이세트(Oomycete, 이편모의 유주자성 진균)로 유지되었다. 초기에 우마이세트는 헤테로콘트 조류(heterokont algae)와 관련이 있는 것으로 예상되었고 Barr에 의해 정리된 광범위한 초구조 및 생화학적 연구는 이러한 예상을 지지하였다(Barr, 1981, Biosystems 14:359-370). 실제로 우마이세트는 Leedale(Leedale, 1974, Taxon 23:261-271)에 의해 수용되었고 다른 조류학자들은 헤테로콘트 조류의 일부로서 수용하였다. 그러나 이들의 종속영양 특징으로부터 야기된 편의상의 문제로 우마이세트와 트라우스토카이트리드는 조류학자(조류를 연구하는 과학자) 보다는 균학자(진균을 연구하는 과학자)에 의해 주로 연구되었다.
또 다른 분류학의 시각으로부터 진화 관련 생물학자들은 진핵생물이 어떻게 진화되었는지에 대한 두 가지 학설을 발달시켜왔다. 하나의 가설은 일련의 내부공생(endosymbioses)을 통한 멤브레인-바운드 소기관의 외인성 유래를 제안한다(Margulis, 1970, Origin of Eukaryotic Cells. Yale University Press, New Haven); 예, 미토콘드리아는 박테리아의 내부공생자로부터, 엽록체는 시아노파이트(cyanophyte)로부터, 편모는 스피로헤타(spirochaete)로부터 유래된다. 다른 가설은 자생적 과정(autogenous process)을 통한 원핵생물 조상의 비-멤브레인-바운드 시스템으로부터 멤브레인-바운드 소기관으로의 점진적인 진화를 제안한다(Cavalier-Smith, 1975, Nature (Lond.) 256:462-468). 그러나 상기 두 그룹의 진화 관련 생물학자들은 진균으로부터 우마이세트와 트라우스토카이트리드를 제거하고 크로모사이트 조류(chromocyte algae)와 함께 크로모파이타(Chromophyta) 계에(Cavalier-Smith, 1987, BioSystems 14:461-481)(상기 계는 최근에 다른 원생생물을 포함하도록 확장되었고 그러한 계의 멤버를 현재 스트라메노필이라고 부른다) 또는 모든 조류와 함께 원생생물 계에 지정하였다(Margulis and Sagen, 1985, Biosystems 18:141-147).
전자 현미경의 발달로 두 개의 트라우스토카이트리드 속인 트라우스토카이트리움 및 스키조카이트리움의 유주자낭의 초구조에 대한 연구는 트라우스토카이트리아시애는 우마이세트와 관련성이 적다는 증거를 제공하였다(Perkins, 1976, pp.279-312, in "Recent Advances in Aquatic Mycology" (ed.E.B.G. Jones), John Wiley & Sons, New York; Kazama, 1980, Can.J.Bot. 58:2324-2446; Barr, 1981, Biosystems 14:359-370). 또한, 5-S 리보좀 RNA 서열의 대응되는 분석 (다변량 통계의 형태)을 나타내는 유전적 데이터는 트라우스토카이트리알레는 독특한 진핵 생물의 그룹으로, 진균과는 완전히 구별되며 적갈색의 조류 및 우마이세트의 멤버와 가장 밀접하게 관련 있다는 것을 암시한다(Mannella, et al. 1987, Mol . Evol . 24:228-235). 대부분의 분류학자들은 트라우스토카이트리드를 우마이세트로부터 제거하는데 동의하였다(Bartnicki-Garcia, 1987, pp.389-403 in "Evolutionary Biology of the Fungi" (eds. Rayner, A.D.M., Brasier, C.M. & Moore, D. Cambridge University Press, Cambridge).
요약하면, Cavalier-Smith(Cavalier-Smith, 1981, BioSystems 14:461-481, 1983; Cavalier-Smith, 1993, Microbiol Rev. 57:953-994)의 분류학적 체계를 도입하여 트라우스토카이트리드는 크로모사이트 조류와 함께 크로모파이타 계(스트라메노필)로 분류된다. 이러한 분류학적 지정은 트라우스토카이트리드가 진균이 아닌 크로미스트(chromist)라는 것을 증명한 헤테로콘타의 18s rRNA 신호를 사용하여 Cavalier-Smith에 의해 최근에 재확인되었다(Cavalier-Smith et al. 1994, Phil . Tran. Roy . Soc . London Series BioSciences 346:387-397). 이는 트라우스토카이트리드를 진균과는 완전히 상이한 계에 지정한 것이며, 모두 유펀자이(Eufungi)계에 지정된다.
최근에 71개의 개별적인 진핵생물 유기체의 그룹이 있으며(Patterson 1999) 상기 그룹 내에서 네 개의 주요 계통이 동정되었다.: (1) 알베오레이트(Alveolates), (2) 스트라메노필, (3) a Land Plant-green algae Rhodophyte_Glaucophyte("식물") 클라드 및 (4) Opisthokont 클라드(진균과 동물). 이전에 상기 네 개의 주요 계통은 계로 식별되었으나, 몇몇 연구원들은 "계"라는 개념의 이용을 더 이상 유용하지 않은 것으로 여긴다.
Armstrong에 의해 주지된 바와 같이 스트라메노필은 삼등분된 관상의 모(hair)와 관련이 있고 상기 계통의 대부분의 멤버는 그러한 모를 보유한 편모를 가지고 있다. 스트라메모필의 운동성 세포들(단인 세포 유기체, 정자 및 유주자)은 두개의 측면으로 삽입된 편모, 즉 편모의 추진을 역전시키는 삼등분 관상 모를 보유한 긴 편모와 짧고 부드러운 편모를 가진 비대칭성이다. 예전에 그룹이 덜 광범위하였을 때 스트라메모필은 이 그룹이 옐로우-그린 조류, 골든-브라운 조류, 유스티그마토파이트(Eustigmatophyte) 및 규조류(Diatom)와 함께 브라운 조류 또는 패오파이트(phaeophyte)를 구성하기 때문에 크로미스타 계 또는 헤테로콘트(=서로 다른 편모) 조류로서 불리었다. 이어서 몇 개의 종속 영양의, 진균 유사 유기체, 물 곰팡이 및 라비린툴리드(점액망 아베마)가 동일한 운동성 세포를 보유한다는 것이 밝혀져서, 광합성 색소 또는 조류를 지칭하는 그룹 명칭이 부적합하게 되었다. 현재, 스프라메노필 계통 내에 있는 두개의 과는 라비린툴라시애 및 트라우스토카이트라시애이다. 역사적으로 이러한 독특한 미생물에 대하여 수많은 분류 전략이 있어왔고 이들은 동일한 목(즉, 트라우스토카이트리알레)으로 분류되었다. 상기 그룹 내에 있는 멤버들 간의 관계는 여전히 변화되고 있다. Porter 와 Leander은 단계적에서 트라우스토카이트리드-라비린툴리드 클라드를 암시하는 18S 스몰 서브유니트 리보좀 DNA를 기반으로 한 데이터를 개발하였다. 그러나, 상기 클라드는 두 가지에 의해 지지된다: 첫 번째는 트라우스토카이트리움 및 울케니아 프로펀다를 포함하고 두 번째는 리비린툴라의 세개의 종, 라비린툴로이드의 두 개의 종 및 스키조카이트리움 아그레가툼을 포함한다.
본 발명에서 이용된 트라우스토카이트리드의 분류학적 지정은 다음과 같이 정리된다:
계: 크로모피타(스트라메노필)
문: 헤테로콘타
목: 트라우스토카이트리알레(트라우스토카이트리드)
과: 트라우스토카이트리아시애 또는 라비린투라시애
속: 트라우스토카이트리움, 스키조카이트리움, 자포노카이트리움, 아플라노카이트리움, 엘리나, 라비린툴라, 라비린툴로이드 또는 라비린툴로믹사.
초기 일부 계통학자들은 (아메바형의 생존 단계를 가진) 트라우스토카이트리움 속의 본래 멤버 중 일부를 울케니아(Ulkenia)로 불리는 별개의 속으로 구별지었다. 그러나 모두는 아니지만, (트라우스토카이트리움과 스키조카이트리움을 포함한) 대부분의 트라우스토카이리드는 아메바형의 단계를 보이고, 이로써 울케니아는 일부에 의하여 하나의 확실한 종으로 여겨지지 않는다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 트라우스토카이트리움 속은 울케니아를 포함할 것이다.
목과 계의 더 높은 분류에서 분류학적 지정의 불확실성에도 불구하고 트라우스토카이트리드는 이들의 멤버가 트라우스토카이트리알레 목으로 분류되도록 하는 구별되고 특징적인 그룹을 유지하고 있다.
스키조카이트리움은 DHA와 도코사펜타엔산(DPA;22:5ω-6)이 풍부한;예를 들면, 건조 중량으로 30% DHA + DPA인 다량의 트리글리세리드를 축적하는 트라우스토카이트리드 해양 미생물이다(Barclay et al. J. Appl . Phycol . 6, 123 (1994)). 연장/탈포화 경로에 의해 20- 및 22- 탄소의 PUFA를 합성하는 진핵생물에서 18, 20- 및 22-탄소 중간체의 풀(pool)은 상대적으로 커서 [14C]-아세테이트를 이용한 생체내 표지 실험은 예측된 중간체에 대한 명백한 전구체-생산물 카이네틱(kinetic)을 밝혀냈다.(Gellerman et al. Biochim . Biophys . Acta 573:33 (1979)). 추가로 그러한 유기체로 외인적으로 제공된 방사능 표지된 중간체는 최종 PUFA 생산물로 전환된다. 본 발명자들은 [1-14C]-아세테이트가 스키조카이트리움 세포에 의해 신속하게 섭취되고 지방산으로 통합되는 것을 보여주었지만, 가장 짧은 표지 시간(1분)에 DHA가 지방산에서 회수된 표지의 31%를 포함하고 이러한 비율은 [14C]-아세테이트 통합의 10-15분과 연속된 24시간의 배양 성장 동안에 변하지 않고 유지되었다. 유사하게 DPA는 실험 내내 표지의 10%를 보였다. 16- 또는 18- 탄소의 지방산과 22-탄소 다중불포화지방산 간의 전구체-생산물 관계에 대한 증거는 없다. 이러한 결과는 매우 작은(가능한 효소에 결합된) 풀의 중간체를 포함하는 [14C]-아세테이트로부터 DHA의 신속한 합성과 일치한다. 스키조카이트리움 배양으로부터 유래된 세포 배제 호모게네이트 [1-14C]-말로닐-CoA를 DHA, DPA 및 포화된 지방산으로 통합하였다. 동일한 생합성 활성이 100,000xg에 의해 상등액 분획물에 유지되지만 멤브레인 침전물에 존재하지는 않았다. 따라서 스키조카이트리움에서 DHA 및 DPA 합성은 다른 진핵생물에 대하여 언급된 바와 같은 멤브레인-바운드 불포화 효소 또는 지방산 연장 효소를 포함하지 않는다(상기 Parker-Barnes et al. 2000; Shanklin et al. 1998). 상기 분획물 데이터는 스웨넬라 효소로부터 얻은 데이터와는 대조적이며(Metz et al. 2001 참조) 스키조카이트리움 효소에 의한 CoA와 같은 상이한 (용해되는) 아실 수용체 분자의 이용을 암시한다. 트라우스토카이트리움은 유사한 생화학을 가질 것으로 예상된다.
미국특허 제6,566,583호에서 스키조카이트리움 유래의 cDNA 라이브러리가 작제되었고 약 8500개의 무작위적 클론(EST)이 서열분석되었다. 도2에 나타낸 스웨넬라 PKS 유전자의 11 도메인 중 8에 대한 상동성을 보여준 서열은 0.2-0.5%의 확률로 동정되었다. 미국특허 제6,566,583호에서 스웨넬라 PKS 유전자에 대한 상동성을 보이는 스키조카이트리움 유래의 수개의 cDNA 클론이 서열분석되었고 다양한 클론이 두개의 부분적인 오픈 리딩 프레임과 하나의 완전한 오픈 리딩 프레임으로 어셈블리되었다.
본 발명자들에 의한 cDNA와 게놈 클론의 추가 서열 분석은 스키조카이트리움의 OrfA, OrfB 및 OrfC 각각의 전장 게놈 서열의 동정, 스키조카이트리움에 있는 도메인(도 2 참조)에 대한 상동성을 가진 스키조카이트리움에 있는 도메인의 완전한 동정을 가능하게 하였다. 미국특허출원 제10/124,800호에 상세히 기술되고 하기에서 상세히 설명된다.
본 발명자들은 트라우스토카이트리움 종의 트라우스토카이트리드(특히, 트라우스토카이트리움 sp. 23B(ATCC20892))에 있는 상동성의 Orf의 전장 게놈 서열을 동정, 클론 및 서열분석하였고 상기 트라우스토카이트리움에서 PUFA PKs 시스템의 도메인을 동정하였다.
스웨넬라의 PUFA PKS 시스템의 도메인과 스키조카이트리움의 PUFa PKS 시스템의 도메인의 비교를 기초로 하여 스키조카이트리움 게놈은 EPA 합성을 촉매할 수 있는 스웨넬라에 있는 단백질과 상당히 유사한 단백질을 코딩한다. 스키조카이트리움에 있는 단백질은 DHA 및 DPA 합성을 촉매하는 PUFA PKS을 구성한다. 스웨넬라에 대하여 동정된 반응 전략의 간단한 변형은 스키조카이트리움에서 DHA 합성을 가능하게 할 것이다. 원핵생물인 스웨넬라와 진핵생물인 스키조카이트리움간의 상동성은 PUFA PKS가 측면 유전자 전달을 수행한다는 것을 지지한다.
트라우스토카이트리움에 대한 유사한 비교가 이루어질 수 있다. 모든 경우에 트라우스토카이트리움 23B(Th.23B) PUFA PKS 단백질 또는 도메인과 다른 공지된 서열의 비교는 미국특허출원 10/124,800호에 기술된 스키조카이트리움 PUFA PKS 단백질 (OrfA, B 또는 C 또는 이의 도메인)의 어느 하나와 가장 가깝게 매치된다는 것을 보여주었다. 모든 경우에서 그 다음으로 가깝게 매치되는 대상은 해양 박테리아(스웨넬라 SCRC-2738, 스웨넬라 오네이덴시스, 포토박터 프로펀듐 및 모리텔라 마리나)로부터 유래된 PUFA PKS 단백질 중 어느 하나 또는 질소고정 시아노박테리아(예, 노스톡 펑티포르메 및 노스톡 sp. PCC 7120)에서 발견되는 관련 시스템에서 유래된 것이었다. 시아노박테리아의 효소 시스템의 생산물은 이중 결합이 결여되고 상기 단백질은 시스 이중 결합 형성을 암시하는 DH 도메인과 관련된 도메인(즉, FabA와 관련된 DH 도메인)이 결여된다.
본 발명에서 용어"오픈 리딩 프레임(open reading frame)"은 약자 "Orf"로 표기한다. 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 단백질은 모두 대문자로 "ORF"라고 표기하고, 오픈 리딩 프레임인 핵산 서열은 모두 소문자 "orf"라고 표기하지만, 일치시키기 위하여 스펠링 "Orf"가 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩된 단백질 모두를 정의하는데 바람직하게 사용된다. 단백질 또는 핵산 서열을 정의하든지 간에 상기 용어의 용도는 문맥으로부터 명백해질 것이다.
스키조카이트리움 PUFA PKS
도 1은 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템에서 유래된 세 개의 오픈 리딩 프레임을 도식적으로 나타낸 것이고, 상기 PUFA PKS 시스템의 도메인 구조를 포함한다. 미국특허출원 제10/124,800호에 상세히 기술된 바와 같이 각 오픈 리딩 프레임의 도메인 구조는 다음과 같다:
오픈 리딩 프레임 A( OrfA ):
OrfA의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1에 나타내었다. OrfA는 서열번호: 2에 기재된 2910개의 아미노산 서열을 코딩하는 (정지 코돈을 포함하지 않는) 8730개의 뉴클레오타이드 서열이다. OrfA 내에는 12개의 도메인이 있다: (a) 하나의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 (MAT) 도메인; (c) 아홉 개의 아실 캐리어 단백질 (ACP) 도메인; 및 (d) 하나의 β-케토아실-ACP 환원효소 (KR) 도메인. OrfA의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에 Accession No. AF378327(아미노산 서열 Accession No. AAK728879)로 수탁되었다.
스키조카이트리움 OrfA의 첫 번째 도메인은 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인이며, 본 발명에서 OrfA의-KS라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 1(OrfA)의 약 1 내지 40 위치의 시작점으로부터 서열번호 1의 약 1428 내지 1500 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfA-KS 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 7에 나타내었다(서열번호: 1의 1-1500 위치). KS 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 2(OrfA)의 약 1 내지 14 위치의 시작점으로부터 서열번호: 2의 약 476 내지 500 위치의 종결점까지 이른다. OrfA-KS 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 8(서열번호:2의 1-500 위치)에 나타내었다. OrfA-KS 도메인은 활성 부위 모티브:DXAC(*아실 결합 부위 C215)를 포함한다.
본 발명에서 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 생물학적 활성(기능)을 가진 도메인 또는 단백질은 FAS (및 PKS) 연장 반응 사이클의 개시 단계를 수행하는 효소로서 특징지어진다. 용어 "β-케토아실-ACP 신타제"는 "3-케토 아실-ACP 신타제", "β-케토 아실-ACP 신타제" 및 "케토-아실 ACP 신타제" 및 유사한 파생어와 상호교환적으로 이용될 수 있다. 연장을 위하여 예정된 아실기는 티오에스테르 결합에 의하여 효소의 활성 부위에 있는 시스테인 잔기로 결합된다. 다단계 반응으로 상기 아실-효소는 말로닐-ACP와 축합하여 -케토아실-ACP, CO2와 유리 효소를 형성한다. KS는 연장 사이클에서 중요한 역할을 수행하고, 많은 시스템에서 상기 반응 사이클의 다른 효소 보다 높은 기질 특이성을 보유하는 것으로 보여진다. 예를 들어 대장균은 세 개의 개별적인 KS 효소를 함유하는데 각각은 유기체의 생리학에서 자신만의 특정한 역할을 갖는다(Magnuson et al. Microbiol . Rev , 57, 522(1993)). PUFA-PKS 시스템의 두개의 KS 도메인은 PUFA 생합성 반응 순서에서 개별적인 역할을 가질 수 있다.
KS는 효소의 한 분류로서 충분히 특정되었다. 많은 확인된 KS 유전자의 서열이 공지되었고, 활성 부위 모티브가 동정되었으며, 몇 개의 결정 구조가 결정되었다. 단백질(또는 단백질의 도메인)은 공지된 KS 서열에 대한 상동성에 의해 KS 군의 효소에 속하는 것으로써 동정될 수 있다.
OrfA에 있는 두 번째 도메인은 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인이고, 본 발명에서 OrfA-MAT라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 1(OrfA)의 약 1723 내지 1798 위치의 시작점으로부터 서열번호: 1의 약 2805 내지 3000 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfA-MAT 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 9에 나타내었다(서열번호:1의 1723-3000 위치). MAT 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 2(OrfA)의 약 575 내지 600 위치의 시작점으로부터 서열번호: 2의 약 935 내지 1000 위치의 종결점까지 이른다. OrfA-MAT 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 10(서열번호: 2의 575-1000 위치)에 나타내었다. OrfA-MAT 도메인은 서열번호: 11에 나타낸 바와 같이 활성 부위 모티브:GHS*XG(*아실 결합 부위 S706)를 포함한다.
본 발명에서, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 생물학적 활성(기능)을 가진 도메인 또는 단백질은 말로닐-CoA로부터 ACP로 말로닐 부를 전달하는 효소로서 특징지어진다. 용어 "말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제"는 "말로닐 아실트랜스퍼라제" 및 유사한 파생어와 상호교환적으로 이용될 수 있다. 상기 효소는 활성 부위 모티브(GxSxG) 뿐만 아니라 (스키조카이트리움 OrfB의 AT 도메인과는 대조적으로) 상기 효소를 MAT 효소로서 동정하게 한 연장된 모티브(중요 위치에 있는 R 및 Q 아미노산)를 보유한다. (PUFA PKS 도메인을 제외하고) 일부 PKS 시스템에서 MAT 도메인은 메틸- 또는 에틸- 말로네이트를 (상응하는 CoA 에스테르 유래의) ACP기로 로딩할 것이고, 이에 의해 측쇄를 선형의 탄소쇄로 도입할 것이다. MAT 도메인은 공지된 MAT 서열에 대한 이들의 상동성 및 이들의 연장된 모티브 구조에 의하여 인식될 수 있다.
OrfA의 3-11번째 도메인은 아홉 개의 직렬 연결된 아실 캐리어 단백질(ACP) 도메인이고, 본 발명에서 OrfA-ACP라고도 한다(서열에서 첫 번째 도메인은 OrfA-ACP1이고, 두 번째 도메인은 OrfA-ACP2이며, 세 번째 도메인은 OrfA-ACP3이다). 첫 번째 ACP 도메인인 OrfA-ACP1은 서열번호: 1 (OrfA)의 약 3343 위치로부터 약 3600위치에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfA-ACP1 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 12(서열번호: 1의 3343-3600 위치)에 나타내었다. 첫 번째 ACP 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 2의 약 1115 위치로부터 1200 위치까지 이른다. OrfA-ACP1 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 13(서열번호: 2의 1115-1200 위치)에 나타내었다. OrfA-ACP1 도메인은 서열번호: 14에 나타낸 바와 같이 활성 부위 모티브: LGIDS* (*판테테인 결합 모티브 S1157)를 포함한다.
아홉 개의 ACP 도메인의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 매우 보존적이어서 각 도메인의 서열은 개별적인 서열 식별자에 의해 나타내지 않았다. 그러나 본 발명에 개시된 정보를 기반으로 하여 당업자는 다른 여덟 개의 ACP 도메인 각각을 포함하는 서열을 용이하게 결정할 수 있다(하기 설명을 참조).
아홉 개의 모든 ACP 도메인은 서열번호: 1의 약 3283 위치로부터 6288 위치까지의 OrfA의 영역에 이르며, 서열번호: 2의 약 1095로부터 2096까지의 아미노산 위치에 대응한다. 아홉 개의 모든 도메인을 포함하는 전체 ACP 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 16에 나타내었다. 서열번호: 16에 기재된 영역은 각각의 ACP 도메인 사이에 존재하는 링커 절편을 포함한다. 아홉 개 도메인의 반복적인 간격은 서열번호: 16의 약 330 뉴클레오타이드(근접한 활성 부위 세린 간에 측정된 실질적인 아미노산 수가 104 내지 116 아미노산 이내이다)마다이다. 아홉 개의 ACP 도메인 각각은 (서열번호: 14에 나타낸) 판테테인 결합 모티브 LGIDS*을 포함하며, 상기 S*는 판테테인 결합 부위 세린(S)이다. 판테테인 결합 부위 세린은 각 ACP 도메인 서열의 중심 근처에 위치한다. ACP 도메인 영역의 각 말단과 각 ACP 도메인 사이에는 프롤린(P)과 알라닌(A)이 매우 풍부한 영역이 있는데 상기 영역은 링커 영역인 것으로 여겨진다. 예를 들어 ACP 도메인 1과 2 사이에는 서열번호: 15에 나타낸 APAPVKAAAPAAPVASAPAPA 서열이 있다. 서열번호: 2의 아미노산 서열에 대한 아홉 개 ACP 도메인 각각의 활성 부위 세린 잔기의 위치(즉, 판테테인 결합 부위)는 다음과 같다: ACP1 = S1157; ACP2 = S1266; ACP3 = S1377; ACP4 = S1488; ACP5 = S1604; ACP6 = S1715; ACP7 = S1819; ACP8 = S1930; 및 ACP9 = S2034 . ACP 도메인의 평균 크기는 링커를 제외하면 약 85개의 아미노산이고, 링커를 포함하면 약 110개의 아미노산이며, 도메인의 중심 근처에 활성 부위 세린이 있다는 것이 주어진 바 당업자라면 OrfA에 있는 아홉 개 ACP 도메인 각각의 위치를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에서 아실 캐리어 단백질(ACP) 생물학적 활성(기능)을 가진 도메인 또는 단백질은 단백질에 공유결합으로 결합된 보조인자로의 티오에스테르 결합을 통하여 성장하는 지방 아실쇄의 캐리어로서 기능을 발휘하는 작은 폴리펩타이드(전형적으로 80 내지 100개의 아미노산)인 것으로 특징지어진다. 이들은 더 큰 단백질 내에서 개별적인 유니트 또는 도메인으로서 존재한다. ACP는 CoA의 포스포판테테닐 부를 ACP의 매우 보존적인 세린 잔기로 전달함으로써 불활성 아포-형태(apo-form) 에서 기능성의 홀로-형태(holo-form)로 전환된다. 아실기는 포스포판테테닐 부의 자유 말단에서 티오에스테르 결합에 의해 ACP로 부착된다. ACP는 방사능의 판테테인으로 표지함으로써 그리고 공지된 ACP에 대한 서열 상동성에 의해 동정될 수 있다. 상기된 모티브(LGIDS*)의 다양성의 존재가 또한 ACP의 신호이다.
OrfA에 있는 12번째 도메인은 β-케토아실-ACP 환원효소(KR) 도메인이며, 본 발명에서 OrfA-KR이라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 1의 약 6598 위치의 시작점으로부터 서열번호: 1의 약 8730 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfA-KR 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 17(서열번호: 1의 6598-8730 위치)에 나타내었다. KR 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 2(OrfA)의 약 2200 위치의 시작점으로부터 서열번호: 2의 약 2910 위치의 종결점까지 이른다. OrfA-KR 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 18(서열번호: 2의 2200-2910 위치)에 나타내었다. KR 도메인 내에는 단쇄 알데하이드-탈수소효소에 상동성을 가진 코어 영역이 있다(KR은 상기 군의 멤버다). 상기 코어 영역은 서열번호: 1의 약 7189로부터 약 7500 위치에 이르고 이는 서열번호:2의 2400-2500 아미노산 위치에 대응된다.
본 발명에서 β-케토아실-ACP 환원효소(KR) 활성을 가진 도메인 또는 단백질은 피리딘-뉴클레오타이드 의존적인 ACP의 3-케토아실 형태의 환원을 촉매하는 효소로서 특징지어진다. 용어 "β-케토아실-ACP 환원효소"는 "케토환원효소", "3-케토아실-ACP 환원효소", "케토-아실 ACP 환원효소" 및 상기 용어의 유사한 파생어가 상호교환적으로 이용될 수 있다. 이는 데노보(de novo) 지방산 생합성 연장 사이클과 폴리케타이드 생합성에서 수행되는 반응에서 첫 번째 환원 단계이다. 상당한 서열 유사성이 엔오일-ACP 환원효소(ER)의 일 군, (PUFA PKS 시스템에 존재하는 ER군 이외의) FAS의 다른 환원효소 및 단쇄 알코올 탈수소효소 군에서 확인된다. 상기된 PUFA PKS 영역의 Pfam 분석은 코어 영역에서 단쇄 알코올 탈수소효소의 군과의 상동성을 보여주었다. 동일한 영역의 Blast 분석은 다른 특징지어진 PUFA PKS 시스템 유래의 도메인과 상동성의 연장된 영역 뿐만 아니라 공지된 KR 효소와 코어 범위에서 매치된다.
오픈 리딩 프레임 B( OrfB ):
OrfB의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 3에 나타내었다. OrfB는 서열번호: 4에 나타낸 2059개의 아미노산 서열을 코딩하는 (정지 코돈을 포함하지 않는) 6177개의 뉴클레오타이드 서열이다. OrfB 내에는 네 개의 도메인이 있다: (a) 하나의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 쇄길이인자(CLF) 도메인; (c) 하나의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인 및 (d) 하나의 엔오일-ACP 환원효소(ER) 도메인. OrfB의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에 Accession No. AF378328(아미노산 서열 Accession No. AAK728880)로 수탁되었다.
OrfB에 있는 첫 번째 도메인은 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인이고, 본 발명에서 OrfB-KS라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 3(OrfB)의 약 1 내지 43 위치의 시작점으로부터 서열번호: 3의 약 1332 내지 1350 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfB-KS 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 19(서열번호: 3의 1-1350)에 나타내었다. KS 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 4(OrfB)의 약 1 내지 15 위치의 시작점으로부터 서열번호: 4의 약 444 내지 450 위치의 종결점까지 이른다. OrfB-KS 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 20에 나타내었다(서열번호: 4의 1-450 위치). OrfB-KS 도메인은 활성 부위 모티브:DXAC*(*아실 결합 부위 C196)를 포함한다. KS의 생물학적 활성 및 그러한 활성을 가진 단백질 또는 도메인을 동정하는 방법은 앞서 기술되었다.
OrfB에 있는 두 번째 도메인은 쇄길이인자(CLF) 도메인이고, 본 발명에서 OrfB-CLF라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 3(OrfB)의 약 1378 내지 1402 위치의 시작점으로부터 서열번호: 3의 약 2682 내지 2700 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfB-CLF 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 21(서열번호: 3의 1378-2700)에 나타내었다. CLF 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 4(OrfB)의 약 460 내지 468 위치의 시작점으로부터 서열번호: 4의 약 894 내지 900 위치의 종결점까지 이른다. OrfB-CLF 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 22(서열번호: 4의 460-900 위치)에 나타내었다. OrfB-CLF 도메인은 아실 결합 시스테인 없는 KS 활성 부위 모티브를 포함한다.
본 발명에서 도메인 또는 단백질은 하기 논리를 기본으로 하여 쇄길이인자(CLF)로서 정의된다. CLF는 본래 타입 II(분해되는 효소) PKS 시스템의 특징으로서 정의되었고 연장 사이클의 회수, 그 결과 최종 산물의 쇄길이를 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 가정되었다. CLF 아미노산 서열은 KS 도메인에 상동성을 보이지만 (그리고 KS 단백질과 이종이량체를 형성하는 것으로 여겨지지만) 활성 부위 시스테인이 결여되어 있다. PKS 시스템에서 CLF의 역할은 현재 논쟁중이다. 새로운 증거(C. Bisang et al. Nature , 401, 502(1999))는 PKS 시스템을 준비하는(연장될 초기 아실기를 제공하는) 역할을 제안한다. 이러한 역할에서 CLF 도메인은 말로네이트(말로닐-ACP로서)를 탈카르복실화시켜 KS 활성 부위로 전달될 수 있는 아세테이트기를 형성할 것으로 여겨진다. 따라서 이러한 아세테이트는 초기 연장(축합) 반응을 수행할 수 있는'준비(priming)' 분자로서 작용한다. 타입 II CLF의 상동체가 일부 모듈라 PKS 시스템에서 '로딩' 도메인로서 동정되었다. CLF의 서열 특징을 가진 도메인이 최근에 동정된 모든 PUFA PKS 시스템에서 확인되고 각각의 경우에 다중도메인 단백질의 일부로서 발견된다.
OrfB에 있는 세 번째 도메인은 AT 도메인이고, 본 발명에서 OrfB-AT라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 3(OrfB)의 약 2701 내지 3598 위치의 시작점으로부터 서열번호: 3의 약 3975 내지 4200 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfB-AT 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 23(서열번호: 3의 2701-4200 위치)에 나타내었다. AT 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 4(OrfB)의 약 901 내지 1200 위치의 시작점으로부터 서열번호: 4의 약 1325 내지 1400 위치의 종결점까지 이른다. OrfB-AT 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 24(서열번호: 4의 901-1400 위치)에 나타내었다. OrfB-AT 도메인은 아실트랜스퍼라제(AT) 단백질의 특징인 활성 부위 모티브 GxS*xG(*아실 결합 부위 S1140)을 포함한다.
"아실트랜스퍼라제" 또는 "AT"는 다수의 개별적인 아실 전달 반응을 수행할 수 있는 효소의 일반적인 부류를 의미한다. 용어 "아실트랜스퍼라제"는 용어 "아실 트랜스퍼라제"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 스키조카이트리움 도메인은 현재 연구중인 모든 다른 PUFA PKS 시스템에 존재하는 도메인과 상당한 상동성을 보이지만 아실트랜스퍼라제 기능이 동정된 일부 아실트랜스퍼라제(예, 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, MAT)에 대해서는 거의 상동성을 보이지 않았다. MAT와의 약한 상동성에도 불구하고 상기 AT 도메인은 MAT 효소의 연장된 모티브 구조 특징을 보유하지 않기 때문에 상기 AT 도메인이 MAT로서 기능을 발휘할 것으로 여겨지지 않는다(상기 MAT 도메인에 대한 설명 참조). 상기된 목적에 따라 PUFA PKS 시스템에 있는 AT 도메인의 기능은 이에 제한되는 것은 아니지만: OrfA ACP 도메인으로부터 물로 지방 아실기를 전달 (즉, 티오에스테라제-유리 지방산으로서 지방 아실기를 방출), CoA와 같은 수용체로 지방 아실기를 전달, 다양한 ACP 도메인간에 아실기를 전달 또는 친지질 수용체 분자(예, 리소포스파드산)로 지방 아실기의 전달을 포함한다.
OrfB에 있는 네 번째 도메인은 ER 도메인이고, 본 발명에서 OrfB-ER이라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 3(OrfB)의 약 4648 위치의 시작점으로부터 서열번호: 3의 약 6177 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfB-ER 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 25(서열번호: 3의 4648-6177)에 나타내었다. ER 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 4(OrfB)의 약 1550 위치의 시작점으로부터 서열번호: 4의 약 2059 위치의 종결점까지 이른다. OrfB-ER 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 26(서열번호: 4의 1550-2059 위치)에 나타내었다.
본 발명에서 이러한 도메인은 엔오일-ACP 환원효소(ER) 생물학적 활성을 가진다. 본 발명에서 용어"엔오일-ACP 환원효소"는 "엔오일 환원효소", "엔오일 ACP-환원효소" 및 "엔오일 아실-ACP 환원효소"와 상호교환적으로 이용될 수 있다. ER 효소는 지방 아실-ACP에 있는 (DH 활성에 의해 도입된) 트랜스-이중 결합을 환원하여 결과적으로 상기 탄소를 완전히 포화시킨다. PUFA-PKS에 있는 ER 도메인은 새롭게 특정된 ER 효소의 군과 상동성을 보인다(Heath et al. Nature 406, 145 (2000)). Heath 및 Rock는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 대상 유전자를 클로닝하고, 그 유전자로부터 발현된 단백질을 정제하고, 실험실내 에세이에서 ER 활성을 가지고 있다는 것을 보여줌으로써 이러한 ER 효소의 새로운 부류를 동정하였다. OrfB의 스키조카이트리움 ER 도메인의 서열은 S. 뉴모니애 ER 단백질과 상동성을 보인다. 현재 연구중인 모든 PUFA PKS 시스템은 스키조카이트리움 ER 도메인과 매우 높은 서열 상동성을 가진 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템은 두개의 ER 도메인을 포함한다(OrfB 상에 하나와 OrfC상에 하나).
오픈 리딩 프레임 C( OrfC):
OrfC의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 5에 나타내었다. OrfC는 서열번호:6에 나타낸 1503개의 아미노산 서열을 코딩하는 (정지 코돈을 포함하지 않는) 4509개의 뉴클레오타이드 서열이다. OrfC 내에는 세 개의 도메인이 있다: (a) 두개의 FabA 유사 β-하이드록시아실-ACP 탈수소효소(DH) 도메인; 및 (b) 하나의 엔오일-ACP 환원효소(ER) 도메인. OrfC의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에 Accession No. AF378329(아미노산 서열 Accession No. AAK728881)로 수탁되었다.
OrfC에 있는 첫 번째 도메인은 DH 도메인이고, 본 발명에서 OrfC-DH1이라고도 한다. 이는 OrfC에 있는 두개의 DH 도메인 중 하나이며, 그래서 DH1으로 명명된다. 상기 도메인은 서열번호: 5(OrfC)의 약 1 내지 778 위치의 시작점으로부터 서열번호: 5의 약 1233 내지 1350 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfC-DH1 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 27(서열번호: 5의 1-1350 위치)에 나타내었다. DH1 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 6(OrfC)의 약 1 내지 260 위치의 시작점으로부터 서열번호: 6의 약 411 내지 450 위치의 종결점까지 이른다. OrfC-DH1 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 28(서열번호: 6의 1-450 위치)에 나타내었다.
본 발명에서, 상기 도메인은 FabA 유사 β-하이드록시아실-ACP 탈수소효소(DH) 생물학적 활성을 가진다. 용어 "FabA 유사 β-하이드록시아실-ACP 탈수소효소"는 용어 "FabA 유사 β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소", "β-하이드록시아실-ACP 탈수소효소", "환원효소" 및 유사한 파생어와 상호교환적으로 이용될 수 있다. PUFA PKS 시스템에 있는 두개의 DH 도메인(하기 DH2의 경우 참조)은 앞부분에서 기술되었다. 이러한 부류의 효소는 β-케토아실-ACP로부터 HOH를 제거하고 탄소쇄에 트랜스 이중 결합을 남긴다. PUFA PKS 시스템의 DH 도메인은 (다른 PKS 시스템의 DH 도메인 보다는) FAS 시스템과 관련된 박테리아의 DH 효소에 상동성을 보인다. 박테리아의 DH, FabA 유사 DH의 일부 집합은 시스-트랜스 이소머라제 활성을 보유한다(Heath et al. J. Biol . Chem . 271, 27795 (1996)). FabA 유사 DH에 대한 상동성은 두 개의 DH 도메인 중 하나가 PUFA PKS 산물에서 시스 이중 결합의 삽입에 관련이 있다는 것을 암시한다.
OrfC에 있는 두 번째 도메인은 DH 도메인이고, 본 발명에서 OrfC-DH2라고도 한다. 이는 OrfC에 있는 두 개의 DH 도메인 중 두 번째이며, 그래서 DH로서 명명된다. 상기 도메인은 서열번호: 5(OrfC)의 약 1351 내지 2437 위치의 시작점으로부터 서열번호: 5의 약 2607 내지 2850 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfC-DH2 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 29(서열번호: 5의 1351-2850)에 나타내었다. DH2 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 6(OrfC)의 약 451 내지 813 위치의 시작점으로부터 서열번호: 6의 약 869 내지 950 위치의 종결점까지 이른다. OrfC-DH2 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 30(서열번호: 6의 451-950 위치)에 나타내었다. DH 생물학적 활성은 앞서 기술되었다.
OrfC에 있는 세 번째 도메인은 ER 도메인이고, 본 발명에서 OrfC-ER이라고도 한다. 상기 도메인은 서열번호: 5(OrfC)의 약 2998 위치의 시작점으로부터 서열번호: 5의 약 4509 위치의 종결점에 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. OrfC-ER 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 31(서열번호: 5의 2998-4509)에 나타내었다. ER 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 6(OrfC)의 약 1000 위치의 시작점으로부터 서열번호: 6의 약 1502 위치의 종결점까지 이른다. OrfC-ER 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 32(서열번호: 6의 1000-1502 위치)에 나타내었다. ER 생물학적 활성은 앞서 기술되었다.
트라우스토카이트리움 23B PUFA PKS
Th . 23B 오픈 리딩 프레임 A( OrfA ):
Th. 23B OrfA의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 38에 나타내었다. 서열번호: 38은 Th. 23B OrfA에 있는 하기 도메인을 코딩한다: (a) 하나의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; (b) 하나의 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT) 도메인; (c) 여덟 개의 아실 캐리어 단백질(ACP)도메인; 및 (d) 하나의 β-케토아실-ACP 환원효소(KR) 도메인. 이러한 도메인 조직화는 Th. 23B OrfA은 8개의 근접한 ACP 도메인을 가진 반면에, 스키조카이트리움 OrfA는 9개의 근접한 ACP 도메인을 가지고 있다는 점을 제외하고는 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 1)에 존재하는 바와 동일하다. Th. 23B OrfA는 서열번호: 39에 나타낸 2811개의 아미노산 서열을 코딩하는 (정지 코돈을 포함하지 않는) 8433개의 뉴클레오타이드 서열이다. Th. 23B OrfA 아미노산 서열(서열번호: 39)은 표준 BLAST 조사로 공지된 서열과 비교되었다(BLAST 변수: Blastp, 낮은 복잡성 필터 오프, 프로그램- BLOSUM62, 캡-cost-존재:11, 신장:1)(Altschul, S. F. , Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 아미노산 레벨에서 Th. 23B OrfA에 가장 높은 상동성을 가진 서열은 스키조카이트리움 OrfA(gb AAK72879.1)(서열번호: 2)이었다. 정렬은 (ACP 반복 수의 차이로 인하여) 2 조각으로 분리된 전체 질의(query)에 걸쳐서 신장된다. 서열번호: 39는 먼저 서열번호: 2와 (8개의 ACP 도메인을 포함하는) 6 내지 1985 위치에서 정렬되고 2017개의 아미노산에 걸쳐서 서열번호: 2와 54%의 서열 동일성을 보인다. 또한 서열번호: 39는 서열번호: 2와 980 내지 2811 위치에서 정렬되고 1861개의 아미노산에 걸쳐서 서열번호: 2와 43%의 서열 동일성을 보인다. 상기 두 번째 정렬에서, 매치는 Th. 23B 8 X ACP의 보존적인 판테테인 부착 부위 모티브의 영역에서 명백하지만, 첫 번째 스키조카이트리움 ACP 도메인에 걸쳐서 매우 적었다(즉, Th. 23B 질의 서열에는 9번째 ACP 도메인이 없지만 이러한 조건 하에서 Blastp 출력은 이들의 정렬을 시도한다). 서열번호: 39는 쉐와넬라 오네이덴시스(Accession No. NP_717214) 및 포토박터 프로펀듐(Accession No. AAL_01060) 유래의 서열과 그 다음으로 가장 가까운 동일성을 보인다.
Th. 23B OrfA에 있는 첫 번째 도메인은 KS 도메인이고, 본 발명에서 Th. 23B OrfA-KS라고도 한다. KS 도메인의 기능을 앞서 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 40으로 나타낸 서열번호: 38의 약 1 위치로부터 약 1500 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th. 23B KS 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 41로 나타낸 서열번호: 39의 약 1 위치로부터 약 500 위치까지 이르는 서열번호: 39의 영역이다. 서열번호: 39의 이러한 영역은 서열번호: 39의 약 1 위치로부터 약 450 위치까지(또한 서열번호: 41의 1 위치로부터 약 450 위치까지) 이르는 FabB(β-케토아실-ACP 신타제)에 Pfam 매치를 가지고 있다. Th. 23B OrfA-KS 도메인은 DXAC*(*아실 결합 부위 C207)을 포함한다. 또한, Th. 23B KS 영역의 말단에 있는 특징적인 모티브인 GFGG는 서열번호: 39의 453-456 위치(또한, 서열번호 41의 453-456 위치)에 존재한다. 서열번호: 39의 1-500위치에 이르는 아미노산 서열은 496개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)과 약 79% 동일하다. 서열번호: 39의 1-450 위치에 이르는 아미노산 서열은 446개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)와 약 81% 동일하다.
Th. 23B OrfA에 있는 두 번째 도메인은 MAT 도메인이고, 본 발명에서 Th. 23B OrfA-MAT라고도 한다. MAT 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 42로 나타낸 서열번호: 38의 약 1503 위치로부터 약 3000 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th. 23B MAT 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 43으로 나타낸, 약 501 위치로부터 약 1000 위치까지 이르는 서열번호: 39의 한 영역이다. 서열번호: 39의 이러한 영역은 서열번호: 39의 약 580 위치로부터 약 900 위치까지(서열번호: 43의 80-400) 이르는 FabD (말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제)에 Pfam 매치를 가지고 있다. Th. 23B OrfA-MAT 도메인은 서열번호: 39의 695-699 위치에 나타낸 활성 부위 모티브: GHS*XG(*아실 결합 부위 S697)을 포함한다. 서열번호: 39의 501-1000 위치에 이르는 아미노산 서열은 481개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)과 약 46% 동일하다. 서열번호: 39의 580-900 위치에 이르는 아미노산 서열은 333개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)와 약 50% 동일하다.
Th. 23B OrfA에 있는 3-10번째 도메인은 여덟 개의 직렬 연결된 ACP 도메인이고, 또한 Th. 23B OrfA-ACP라고도 한다(서열에서 첫 번째 도메인은 OrfA-ACP1, 두 번째 도메인은 OrfA-ACP2, 세 번째 도메인은 OrfA-ACP3이다). ACP 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 첫 번째 Th. 23B ACP 도메인인 Th. 23B OrfA-ACP1은 서열번호: 44로 나타낸 서열번호 :38(OrfA)의 약 3205 위치로부터 약 3555 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th. 23B ACP 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 45로 나타낸, 서열번호: 39의 약 1069 위치로부터 약 1185 위치까지 이르는 서열번호: 39의 한 영역이다. 서열번호: 39의 1069-1185 위치에 이르는 아미노산 서열은 85개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)와 약 65% 동일하다. Th. 23B OrfA-ACP1은 스키조카이트리움 OrfA에 있는 아홉 개의 ACP 도메인과 유사한 동일성을 가지고 있다.
Th. 23B OrfA에 있는 여덟 개의 ACP 도메인은 서로 인접해있고 (서열번호: 46으로 나타낸) 포스포판테테인 결합 부위 모티브 LGXDS*의 존재에 의해 동정될 수 있다. 여기서, S*는 포스포판테테인 부착 부위이다. 서열번호: 39에 대하여 여덟 개의 S* 부위 각각의 아미노산 위치는 1128(ACP1), 1244(ACP2), 1360(ACP3), 1476(ACP4), 1592(ACP5), 1708(ACP6), 1824(ACP7) 및 1940(ACP8)이다. 여덟 개의 모든 Th. 23B ACP 도메인의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 매우 보존적이고, 따라서 각 도메인의 서열은 개별적인 서열 식별자에 의해 나타내지 않았다. 그러나 본 발명에서 개시된 정보를 기반으로 당업자라면 서열번호: 38 및 서열번호: 39에 있는 다른 일곱 개의 ACP 도메인 각각을 포함하는 서열을 용이하게 결정할 수 있다.
여덟 개의 모든 Th. 23B ACP 도메인은 서열번호: 38의 약 3205 위치로부터 약 5994 위치까지 이르는 Th. 23B OrfA의 영역에 이르며, 이는 서열번호: 39의 약 1069로부터 약 1998 위치까지의 아미노산에 대응된다. 여덟 개의 모든 도메인을 포함하는 전체 ACP 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 : 47에 나타내었다. 서열번호: 47은 서열번호: 48로 나타낸 아미노산 서열을 코딩한다. 서열번호: 48은 각각의 ACP 도메인 간의 링커 절편을 포함한다. 여덟 개 도메인의 반복적인 간격은 서열번호: 48의 약 116개의 아미노산마다이고 각 도메인은 (상기된) 활성 부위 모티브를 중심으로 약 116개의 아미노산으로 구성된 것으로 여겨진다. 스키조카이트리움의 OrfA에 있는 아홉 개의 근접한 ACP 도메인 사이에 있는 링커 영역은 프롤린과 알라닌 잔기가 매우 풍부한 반면에 트라우스토카이트리움의 OrfA에 있는 여덟 개의 근접한 ACP 영역 사이에 있는 링커 영역은 세린 잔기(프롤린 또는 알라닌 잔기가 아닌)가 풍부하다.
Th. 23B OrfA에 있는 마지막 도메인은 KR 도메인이고, 본 발명에서 Th. 23B OrfA-KR이라고 한다. KR 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 49로 나타낸 서열번호: 38의 약 6001 위치 내지 약 8433 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th. 23B KR 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 50으로 나타낸, 서열번호: 39의 약 2001 위치로부터 약 2811 위치까지 이르는 서열번호: 39의 한 영역이다. 서열번호: 39의 이러한 영역은 서열번호: 39의 약 2300 위치로부터 약 2550 위치까지(서열번호: 50의 300-550 위치) 이르는 FabG (β-케토아실-ACP 환원효소)에 Pfam 매치를 가지고 있다. 서열번호: 39의 2001-2811 위치에 이르는 아미노산 서열은 831개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)와 약 40% 동일하다. 서열번호: 39의 2300-2550 위치에 이르는 아미노산 서열은 235개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 2)와 약 51% 동일하다.
Th . 23B 오픈 리딩 프레임 B( OrfB ):
Th. 23B OrfB의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 51에 나타내었다. 서열번호: 51은 Th. 23B OrfB에 있는 다음 도메인을 코딩한다: (a) 하나의 β-케토아실-ACP 신타제 (KS) 도메인; (b) 하나의 쇄길이인자(CLF) 도메인; (c) 하나의 아실트랜스퍼라제 (AT) 도메인 및 (d) 하나의 엔오일-ACP 환원효소 (ER) 도메인. 상기 도메인 조직화는 스키조카이트리움 단백질의 AT와 ER 사이에 있는 링커 영역이 Th.23B 보다 약 50-60개 아미노산 정도 더 길다는 점을 제외하고는 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 3)과 동일하다. 또한, 스키조카이트리움에 있는 이러한 링커 영역은 세린 잔기가 매우 풍부한 특정한 영역을 가지고 있는데 반하여(15개의 근접한 세린 잔기 뿐만 아니라 상기 영역 내에 있는 다른 세린도 포함된다) Th. 23B OrfB에 있는 상응하는 링커 영역은 세린 잔기가 풍부하지 않다. AT/ER 링커 영역에 있는 이러한 차이점은 상기 영역의 시작부에서 스키조카이트리움 OrfB와 Th.23B OrfB 간의 정렬에서 분리를 설명할 것이다.
Th. 23B OrfB는 서열번호: 52에 나타낸 1935 아미노산 서열을 코딩하는 (정지 코돈을 포함하지 않는) 5805 뉴클레오타이드 서열이다. Th. 23B OrfB 아미노산 서열(서열번호: 52)은 표준 BLAST 조사로 공지 서열과 비교되었다(BLAST 변수: Blastp, 낮은 복잡성 필터 오프, 프로그램-BLOSUM62, 캡-cost-존재:11, 신장:1)(Altschul, S. F. , Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 아미노산 레벨에서, Th. 23B OrfB에 대하여 가장 높은 상동성을 가진 서열은 대부분의 OrfB에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(gb AAK72880.1)(서열번호: 4)와 마지막 도메인에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfC(gb AAK72881.1)(서열번호: 6)(정렬은 상기된 바와 같이 2조각으로 분리된다)이었다. 서열번호: 52는 먼저 서열번호: 4와 (KS, CLF 및 AT 도메인을 포함한) 10 내지 1479 위치에서 정렬되고 1483개의 아미노산에 걸쳐서 서열번호: 4에 대하여 52%의 서열 동일성을 보인다. 서열번호: 52는 또한 서열번호: 6과 (ER 도메인을 포함한) 1491 내지 1935 위치에서 정렬되고 448개의 아미노산에 걸쳐서 서열번호: 4에 대하여 64%의 서열 동일성을 보인다.
Th.23B OrfB에 있는 첫 번째 도메인은 KS 도메인이고, 본 발명에서 Th.23B OrfB-KS라고도 한다. KS 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 53으로 나타낸 서열번호: 51의 약 1 위치로부터 약 1500 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th. 23B KS 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 54로 나타낸, 서열번호: 52의 약 1 위치로부터 약 500 위치까지 이르는 서열번호: 52의 한 영역이다. 서열번호: 52의 이러한 영역은 약 1 위치로부터 약 450 위치까지(서열번호: 54의 1-450) 이르는 FabB (β-케토아실-ACP 신타제)에 Pfam 매치를 가지고 있다. Th.23B OrfB-KS 도메인은 활성 부위 모티브: DXAC*를 포함한다. 여기서, C*는 아실기 부착 부위이고 C*는 서열번호: 52의 201 위치에 있다. KS 영역의 말단에 있는 특징적인 모티브인 GFGG는 서열번호: 52의 434-437 위치의 아미노산에 존재한다. 서열번호: 52의 1-500 위치에 이르는 아미노산 서열은 500개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 64% 동일하다. 서열번호: 52의 1-450 위치에 이르는 아미노산 서열은 442개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 67% 동일하다.
Th.23B OrfB에 있는 두 번째 도메인은 CLF 도메인이고, 본 발명에서 Th.23B OrfB-CLF라고도 한다. CLF 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 55로 나타낸 서열번호: 51(OrfB)의 약 1501 위치로부터 약 3000 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. CLF 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 56으로 나타낸, 서열번호: 52의 약 501 위치로부터 약 1000 위치까지 이르는 서열번호: 52의 한 영역이다. 서열번호: 52의 이러한 영역은 약 550 위치로부터 약 910 위치까지(서열번호: 56의 50-410) 이르는 FabB (β-케토아실-ACP 신타제)에 Pfam 매치를 가지고 있다. CLF 도메인은 KS 단백질에 상동성을 가짐에도 불구하고 KS 단백질에서 아실기가 부착되는 활성 부위 시스테인이 결여되었다. 서열번호: 52의 501-1000 위치에 이르는 아미노산 서열은 517개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 49% 동일하다. 서열번호: 52의 550-910 위치에 이르는 아미노산 서열은 360개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 54% 동일하다.
Th.23B OrfB에 있는 세 번째 도메인은 AT 도메인이고, 본 발명에서 Th.23B OrfB-AT라고 한다. AT 도메인 기능은 앞서 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 57로 나타낸, 서열번호: 51(Th.23B OrfB)의 약 3001 위치로부터 약 4500 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th.23B AT 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 58로 나타낸, 서열번호: 52의 약 1001 위치로부터 약 1500 위치까지 이르는 서열번호: 52의 한 영역이다. 서열번호: 52의 이러한 영역은 약 1100 위치로부터 약 1375 위치까지(서열번호: 58의 100-375) 이르는 FabD (말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제)에 Pfam 매치를 가지고 있다. PUFA 신타제의 이러한 AT 도메인은 MAT 단백질과 상동성을 가짐에도 불구하고, MAT의 연장된 모티브(중요 아르기닌과 글루타민 잔기)가 부족하며 말로닐-CoA 전달에 관여하지 않을 것으로 여겨진다. 아실트랜스퍼라제의 GXS*XG 모티브가 존재하되, S*는 아실 부착 부위이고 서열번호: 52에 대하여 1123 위치에 존재한다. 서열번호: 52의 1001-1500 위치에 이르는 아미노산 서열은 459개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 44% 동일하다. 서열번호: 52의 1100-1375 위치에 이르는 아미노산 서열은 283개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 45% 동일하다.
Th.23B OrfB에 있는 네 번째 도메인은 ER 도메인이고, 본 발명에서 Th.23B OrfB-ER이라고 한다. ER 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 59로 나타낸 서열번호: 51(OrfB)의 약 4501 위치로부터 약 5805 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th.23B ER 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 60으로 나타낸, 서열번호: 52의 약 1501 위치로부터 약 1935 위치까지 이르는 서열번호: 52의 한 영역이다. 서열번호: 52의 이러한 영역은 약 1501 위치로부터 약 1810 위치까지(서열번호: 60의 1-310 위치) 이르는 2-니트로프로판 디옥시게나제에 관련된 디옥시게나제 군에 Pfam 매치를 가지고 있다. 상기 도메인이 ER로서 기능을 발휘한다는 것은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 유래의 새롭게 특정된 ER 효소에 대한 상동성 때문인 것으로 추정된다. 서열번호: 52의 1501-1935 위치에 이르는 아미노산 서열은 433개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 66% 동일하다. 서열번호: 52의 1501-1810 위치에 이르는 아미노산 서열은 305개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 70% 동일하다.
Th . 23B 오픈 리딩 프레임 C( OrfC ):
Th. 23B OrfC의 완전한 뉴클레오타이트 서열을 서열번호: 61에 나타내었다. 서열번호: 61은 Th. 23B OrfC에 있는 다음 도메인을 코딩한다: (a) 두 개의 FabA 유사 β-하이드록시아실-ACP 탈수소효소(DH) 도메인, 둘 모두는 FabA 단백질(트랜스-2-데케노일-ACP의 합성과 상기 생산물을 시스-3-데케노일-ACP로 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소)에 대하여 상동성을 가진다; (b) 스키조카이트리움 OrfB의 ER 도메인에 대하여 높은 상동성을 가진 하나의 엔오일-ACP 환원효소 (ER) 도메인. 상기 도메인 조직화는 스키조카이트리움 OrfC(서열번호: 5)에 있는 바와 동일하다.
Th. 23B OrfC는 서열번호: 62에 나타낸 1470 개의 아미노산 서열을 코딩하는 (정지 코돈을 포함하지 않는) 4410개의 뉴클레오타이드 서열이다. Th. 23B OrfC(서열번호: 62)는 표준 BLAST 조사로 공지된 서열과 비교되었다(BLAST 변수: Blastp, 낮은 복잡성 필터 오프, 프로그램- BLOSUM62, 갭-cost-존재:11, 신장:1)(Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 아미노산 레벨에서 Th. 23B OrfC에 대하여 가장 높은 상동성을 가진 서열은 스키조카이트리움 OrfC(gb AAK728881.1)(서열번호: 6)이다. 서열번호: 62는 스키조카이트리움 OrfC(서열번호: 6)과 66% 동일하다.
Th. 23B OrfC에 있는 첫 번째 도메인은 DH 도메인이고, 본 발명에서 Th. 23B OrfC-DH1이라고 한다. DH 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 63으로 나타낸 서열번호: 61(OrfC)의 1 위치로부터 약 1500 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열 내에 포함된다. Th.23B DH1 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 64로 나타낸, 서열번호: 62의 약 1 위치로부터 약 500 위치까지 이르는 서열번호: 62의 한 영역이다. 서열번호: 62의 이러한 영역은 약 275 위치로부터 약 400 위치까지(서열번호: 64의 275-400 위치) 이르는 FabA에 Pfam 매치를 가지고 있다. 서열번호: 62의 1-500 위치에 이르는 아미노산 서열은 526개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfC(서열번호: 6)와 약 66% 동일하다. 서열번호: 62의 275-400 위치에 이르는 아미노산 서열은 126개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfC(서열번호: 6)와 약 81% 동일하다.
Th. 23B OrfC에 있는 두 번째 도메인은 DH 도메인이고, 본 발명에서 Th. 23B OrfC-DH2라고도 한다. 이는 OrfC에 있는 두 개의 DH 도메인 중 두 번째이고 따라서 DH2라고 명명된다. 상기 도메인은 서열번호: 65로 나타낸 서열번호: 61(OrfC)의 약 1501로부터 내지 약 3000 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열내에 포함된다. Th. 23B DH2 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호: 66에 나타낸, 서열번호 62의 약 501 위치로부터 약 1000 위치까지 이르는 서열번호: 62의 영역이다. 서열번호: 62의 이러한 영역은 상기된 바와 같이 약 800 내지 약 925 위치에 이르는 FabA에 대한 Pfam 매치를 가지고 있다(서열번호: 66의 300-425 위치). 서열번호: 62의 501-1000 위치에 이르는 아미노산 서열은 518개의 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfC(서열번호: 6)와 약 56% 동일하다. 서열번호: 62의 800-925에 이르는 아미노산 서열은 124개의 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfC(서열번호: 6)와 약 58% 동일하다.
Th. 23B OrfC에 있는 세 번째 도메인은 ER 도메인이고, 본 발명에서 Th. 23B OrfC-ER이라고 한다. ER 도메인 기능은 앞서 상세히 기술되었다. 상기 도메인은 서열번호: 67에 나타낸 서열번호: 61(OrfC)의 약 3001 위치로부터 약 4410 위치까지 이르는 뉴클레오타이드 서열내에 포함된다. Th. 23B ER 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 서열번호 68에 나타낸, 서열번호 62의 약 1001 위치로부터 약 1470 위치까지 이르는 서열번호: 62의 한 영역이다. 서열번호: 62의 이러한 영역은 상기된 바와 같이 약 1025 위치로부터 약 1320 위치(서열번호: 68의 25-320 위치)에 이르는 2-니트로프로판 디옥시게나제에 관련된 디옥시게나제에 대한 Pfam 매치를 가지고 있다. ER로서의 이러한 도메인의 기능은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 유래의 새롭게 특정된 ER 효소에 대한 상동성으로 인하여 추정된다. 서열번호: 62의 1001-1470 위치에 이르는 아미노산 서열은 474개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 75% 동일하다. 서열번호: 62의 1025-1320 위치에 이르는 아미노산 서열은 296개 아미노산에 걸쳐서 스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 4)와 약 81% 동일하다.
본 발명의 한 양태는 비박테리아의 PUFA PKS 시스템 유래의 분리된 단백질 또는 도메인, 이의 상동체 및/또는 이의 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에서 언급된(하기에서 상세히 설명되는) 단백질, 도메인 또는 펩타이드 중 어느 하나를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서 PUFA PKS 시스템 유래의 단백질 또는 펩타이드와 같은 분리된 단백질 또는 펩타이드는 천연 환경으로부터 제거되어진(즉, 인간의 조작이 이루어진) 단백질 또는 (폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한) 이의 단편이고 예를 들면 정제된, 부분적으로 정제된, 재조합으로 제조된 단백질 및 합성으로 제조된 단백질을 포함한다. 이에 "분리된"은 단백질이 정제된 정도를 반영하지 않는다. 바람직하게는 본 발명에 따른 분리된 단백질은 재조합으로 제조된 것이다. 분리된 펩타이드는 합성(예, 펩타이드 합성에 의한 것과 같이 화학적으로) 또는 재조합으로 제조될 수 있다. 또한, 예를 들어 "트라우스토카이트리움 PUFA PKS 단백질"은 트라우스토카이트리움 미생물 유래의 (일반적으로 PUFA PKS 단백질의 상동체를 포함하는) PUFA PKS 단백질 또는 트라우스토카이트리움 유래의 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 단백질의 공지된 구조(예, 서열)와 혹은 기능으로부터 제조된 PUFA PKS 단백질을 의미한다. 즉, 트라우스토카이트리움 PUFA PKS 단백질은 트라우스토카이트리움 유래의 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 단백질의 실질적으로 유사한 구조와 기능을 가진 PUFA PKDS 단백질 또는 상기된 트라우스토카이트리움 유래의 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 단백질의 생물학적으로 활성인(즉, 생물학적 활성을 가지는) 상동체를 포함한다. 이에, 트라우스토카이트리움 PUFA PKS 단백질은 정제된, 부분적으로 정제된, 재조합, 돌연변이된/변형된 및 합성된 단백질을 포함할 수 있다. 동일한 정의가 스키조카이트리움 또는 다른 미생물 유래의 PUFA PKS 단백질 및 도메인과 같은 본 발명에서 언급된 다른 단백질 또는 펩타이드에 적용될 수 있다.
본 발명에서 용어"변형" 및 "돌연변이"는 본 발명에 언급된 단백질 또는 펩타이드의 일차 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 변형/돌연변이의 경우에는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "변형"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸화, 파르네실화, 카르복시메틸화, 게라닐 게라닐화, 당쇄화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 프레닐화, 팔미토일화 및/또는 아미드화를 포함한 단백질 또는 펩타이드에 대한 해독후 변형을 정의하는데 사용될 수 있다. 변형은 또한 예를 들면 단백질 또는 펩타이드를 다른 화합물과 복합체화(complexing)하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 예를 들면 천연적인 야생형 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 해독후 변형과 상이하다면 돌연변이로서 여겨질 수 있다.
본 발명에서 용어 "상동체"는 천연적으로 존재하는 단백질 또는 펩타이드에 대한 하나 이상의 미미한 변형 또는 돌연변이에 의해 상기 천연적으로 존재하는 단백질 또는 펩타이드(즉, "프로토타입"또는 "야생형" 단백질")와 상이하지만, 천연적으로 존재하는 형태의 측쇄(side chain) 구조와 전반적인 기본 단백질을 유지하는 (즉, 그로 인하여 상동체는 야생형 단백질과 관련된 것으로 동정될 수 있다) 단백질 또는 펩타이드를 의미하는데 이용된다. 그러한 변화는 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 또는 수개의 아미노산 측쇄에서 변화; 결실(예를 들면 단백질 또는 펩타이드의 절단된 형태), 삽입 및/또는 치환을 포함한 하나 또는 몇 개 아미노산의 변화; 하나 또는 몇 개 원소의 입체화학에서의 변화; 및/또는 이에 제한되는 것은 아니지만, 메틸화, 파르네실화, 게라닐 게라닐화, 당쇄화, 카르복시메틸화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 프레닐화, 팔미토일화 및/또는 아미드화를 포함한 미미한 파생화를 포함한다. 상동체는 천연적으로 존재하는 단백질 또는 펩타이드와 비교하였을 때 증진된, 감소된 또는 실질적으로 유사한 성질을 가진다. PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 바람직한 상동체가 하기에서 상세히 설명된다. 상동체는 합성으로 제조된 상동체, 주어진 단백질 또는 도메인의 천연적으로 존재하는 대립형질 변이체, 또는 대상 서열이 유래된 유기체 이외의 유기체로부터 유래된 상동성의 서열을 포함할 수 있다.
보존적인 치환은 전형적으로 하기 그룹 내에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소루신 및 루신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴 및 글루타민; 세린 및 트레오닌; 리신 및 아르기닌; 그리고 페닐알라닌 및 티로신. 치환은 보존적인 소수성 또는 친수성을 기반으로 (Kyte and Doolittle, J. Mol . Biol . (1998) 157: 105-132) 또는 유사한 폴리펩타이드 이차 구조를 예상하는 능력을 기반으로 (Chou and Fasman, Adv . Enzymol . (1978) 47: 45-148, 1978) 이루어질 수 있다.
상동체는 천연의 대립형질 변이 또는 천연의 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산의 천연적으로 발생하는 대립형질 변이체는 상기 단백질을 코딩하는 유전자와 게놈상에서 실질적으로 동일한 위치에서 존재하는 유전자이지만 예를 들면 돌연변이 또는 재조합에 의해 유발된 천연의 변이에 의해 유사하지만 동일하지 않은 서열을 갖게 된다. 대립형질 변이체는 비교 대상이 되는 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성과 유사한 활성을 갖는다. 한 부류의 대립형질 변이체는 유전자의 코드의 축퇴성으로 인하여 상이한 핵산 서열을 갖지만 동일한 단백질을 코딩할 수도 있다. 대립형질 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3'비해독 영역(예, 조절 영역)에서의 변이를 포함할 수도 있다. 대립형질 변이체는 또한 당업계에 공지되어 있다.
상동체는 이에 제한되는 것은 아니지만 분리된, 천연적으로 발생한 단백질에 대한 직접적인 변형, 직접 단백질 합성 또는 무작위적 또는 표적화 돌연변이를 일으킬 수 있는 예를 들면 전통적인 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 변형을 가하는 방법을 포함한 단백질의 제조 방법과 관련하여 공지 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
야생형 단백질과 비교했을 때 단백질 상동체에서의 변형은 천연적으로 발생한(야생형) 단백질과 비교했을 때 상동체의 기본적인 생물학적 활성을 증가, 감소 또는 실질적으로 변화를 일으키지 않을 수 있다. 일반적으로 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체내(즉, 단백질의 천연의 생리학적 환경) 또는 시험관내(즉, 실험실 조건 하에서)에서 측정되거나 관측된 천연적으로 발생하는 형태의 단백질에 의해 보여지고 수행되는 기능을 의미한다. PUFA PKS 시스템과 PUFA PKS 시스템을 이루는 각각의 단백질/도메인의 생물학적 활성이 본 발명에서 상세히 언급되어 있다. 상동체 또는 (후술하는) 모방체와 같은 단백질의 변형은 천연적으로 발생하는 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 천연적으로 발생하는 단백질과 비교했을 때 감소된 또는 증가된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성시킬 수 있다. 단백질의 발현을 감소시키거나 단백질의 활성을 감소시키는 변형은 단백질의 (완전한 또는 부분적인) 불활성화, 하향 조정 또는 단백질의 감소된 작용 (또는 활성)을 의미한다. 유사하게 단백질 발현을 증가시키거나 단백질의 활성을 증가시키는 변형은 증폭, 과잉생산, 활성화, 향상, 상향 조정 또는 단백질의 증가된 작용 (또는 활성)을 의미한다. 야생형 단백질의 생물학적 활성을 가지는 상동체란 야생형 단백질과, 특히 생물학적 활성의 정도에 있어서 동일하다는 것을 필수적으로 의미하지 않는다. 그보다 상동체는 야생형 단백질과 비교했을 때 감소 또는 증가된 정도로 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 수행할 수 있다. PUFA PKS 시스템의 기능적 도메인은 생물학적 기능을 수행할 수 있는 (즉, 생물학적 활성을 가지는) 도메인 (즉, 도메인은 단백질의 일부분일 수 있다)이다.
PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 생물학적 활성을 검출하고 측정하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 전사량의 측정, PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 해독량의 측정, PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 해독 후 변형의 측정, PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 효소 활성의 측정 및/또는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 생산물(예, PUFA 생산량)의 생산량 측정을 포함한다. (상동체를 포함한) 본 발명에 따른 분리된 단백질은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 가질 것을 반드시 요구받지 않는다. 예를 들어 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 절단된, 돌연변이된 또는 불활성화 단백질일 수 있다. 그러한 단백질을 스크리닝 에세이 또는 예를 들어 항체 제조와 같은 다른 목적에 유용하다. 바람직한 양태에서 본 발명의 분리된 단백질은 야생형 단백질과 (상기된 바와 같이 반드시 동등하지 않을지라도) 유사한 생물학적 활성을 가진다.
단백질 발현을 측정하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만 웨스턴 블롯, 면역블롯, 효소결합면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 면역침전법, 표면 플라즈몬 공명, 화학발광, 형광 편광, 야광(phosphorescence), 면역조직화학 분석법, 매트릭스 보조된 레이저 탈락/이온화 타임 오프 플레이트(MALDI-TOF) 거대질량분석기, 미세포분류, 마이크로에레이, 현미경, 형광 활성화된 유세포 분석(FACS) 및 유세포 분류 뿐만 아니라 이에 제한되는 것은 아니지만 효소의 활성 또는 다른 단백질 파트너와의 결합을 포함한 단백질의 성질을 기반으로 한 분석법을 포함할 수 있다. 결합 분석법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, BIAcore 기계가 두 단백질간 복합체의 결합 상수를 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 복합체에 대한 분해 상수는 완충용액이 칩 상에 통과하는 시간에 대하여 굴절율에서의 변화를 모니터링함으로써 측정될 수 있다(O'Shannessy et al. Anal . Biochem . 212:457-468 (1993), Schuster et al. Nature 365:343-347 (1993)). 한 단백질과 다른 단백질 간의 결합을 측정하는 적합한 다른 분석법은 예를 들면 효소결합면역흡착(ELISA) 및 방사면역측정법(RIA)과 같은 면역분석법; 형광, UV 흡수, 원편광분광분석 또는 핵자기공명(NMR)을 통한 단백질의 분광학적 및 광학적 성질에서의 변화를 모니터링함으로써 결합의 측정을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호: 39, 서열번호: 52, 서열번호: 62 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (b) 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; (c) (a)의 아미노산 서열의 적어도 500개의 연속적인 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및/또는 (d) (b)의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 단백질에 관한 것이다. 추가의 양태에서, PUFA PKS 도메인 중 몇 개와 관련하여 상기된 활성 부위 도메인 또는 다른 기능적 모티브를 포함한 아미노산 서열이 본 발명에 의해 포함된다. 한 양태에서, 상기된 아미노산 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명에서 언급된 특정한 PUFA PKS 단백질 또는 도메인의 상동체를 포함하여, 본 발명에 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 52 또는 서열번호: 62로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 500개의 연속적인 아미노산과 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 52 또는 서열번호: 62의 적어도 약 600개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 700개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 800개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 900개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1000개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1100개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1200개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1300개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1400개의 연속적인 아미노산 또는 서열번호: 62의 전장에 대하여 적어도 약 60% 동일하다. 추가의 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39 또는 서열번호: 52의 적어도 약 1500개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1600개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1700개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1800개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1900개의 연속적인 아미노산 또는 서열번호: 52의 전장에 대하여 적어도 약 60% 동일하다. 추가의 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39의 적어도 약 2000개의 연속적인 아미노산, 바람직하게는 적어도 약 2100개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2200개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2300개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2400개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2500개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2600개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2700개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2800개의 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 서열번호 39의 전장에 대하여 적어도 약 60% 동일하다. 한 양태에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 중 하나의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
다른 측면에서, 상기된 상동체를 포함하여, 본 발명에 의해 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 상기 단락에서 기술된 연속적인 아미노산 길이에 걸쳐서 서열번호: 39, 서열번호: 52 또는 서열번호: 62로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 85% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 한 양태에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 중 하나의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 상기된 상동체를 포함하여, 본 발명에 의해 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 60% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 85% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가진다. 한 양태에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 중 하나의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
다른 측면에서, 상기된 상동체를 포함하여, 본 발명에 의해 포함되는 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52 및 서열번호: 58로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 50% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 55%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진다. 추가의 측면에서 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 65% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진다. 다른 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진다. 다른 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진다. 한 양태에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 중 하나의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 분리된 단백질 또는 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 또는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가진 임의의 단편을 포함하여, 상기의 생물학적으로 활성인 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성하거나, 구성한다.
본 발명의 한 측면에서, 하기 스키조카이트리움 단백질과 도메인이 본 발명의 하나 이상의 양태에서 유용하며, 이들 모두는 상기된 미국특허출원 제10/124,800호에 개시되어져 있다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명에서 유용한 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 서열번호: 2, 서열번호: 4 및 서열번호: 6으로부터 선택된 아미노산의 적어도 약 500개의 연속적인 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 60% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 측면에서, 서열번호: 2, 서열번호: 4 및 서열번호: 6의 적어도 약 600개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 700개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 800개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 900개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1000개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1100개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1200개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1300개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1400개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1500개의 연속적인 아미노산 또는 서열번호: 6의 전장에 대하여 적어도 약 60% 동일하다. 추가의 측면에서, 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2 또는 서열번호: 4의 적어도 약 1600개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1700개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1800개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 1900개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2000개의 연속적인 아미노산 또는 서열번호: 4의 전장에 대하여 적어도 약 60% 동일하다. 추가의 측면에서, 상기 단백질의 아미노산은 서열번호: 2의 적어도 약 2100개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2200개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2300개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2400개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2500개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2600개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2700개의 연속적인 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 약 2800개의 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 서열번호: 2 전장에 대하여 적어도 약 60% 동일하다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 양태에서 유용한 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 상기 단락에 언급된 연속적인 아미노산 길이에 걸쳐서 서열번호: 2, 서열번호: 4 또는 서열번호: 6으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 하나 이상의 양태에서 유용한 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 측면에서, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 65% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 동일하되, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 양태에서 유용한 PUFA PKS 단백질 또는 도메인은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 또는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 임의의 도메인을 포함하여, 상기의 생물학적으로 활성인 단편을 포함하거나, 필수적으로 구성하거나, 구성한다.
본 발명에 있어서, 핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 이용된 용어 "인접한"또는 "연속적인"은 중단되지 않은 서열에서 연결된 것을 의미한다. 예를 들어 제 1 서열이 제 2서열의 30개의 인접한(또는 연속적인) 아미노산을 포함한다는 것은 상기 제 1 서열이 제 2서열의 중단되지 않는 30개 아미노산 잔기의 서열과 100% 동일한 중단되지 않은 30개 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 의미한다. 유사하게 제 1 서열이 제 2 서열과 "100% 동일성"은 갖는다는 것은 상기 제 1 서열과 제 2서열이 뉴클레오타이드 또는 아미노산 간의 갭(gap)없이 정확하게 일치한다는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한 동일성 %에 대한 언급은 (1) 아미노산 조사용 blastp 및 핵산 조사용 blastn, 핵산 조사와 6개의 오픈 리딩 프레임내 해독된 아미노산 조사용 blastX를 모두 디폴트 변수로 사용해서 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 조사; 여기서, 질의(query) 서열은 디폴트에 의해 복잡성이 낮은 영역에 대해 필터링된다 (참조: Altschul, S. F. , Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다); (2) BLAST 2 정렬(하기 기재한 변수를 사용함); (3) 및/또는 표준 디폴트 변수를 사용한 PSI-BLAST(Position Specific Iterated BLAST)를 사용하여 수행하는 상동성 평가를 의미한다. BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST 2 간에 표준 변수의 몇 가지 차이가 있기 때문에, BLAST 2 프로그램을 사용하는 경우에 2개의 특이적 서열이 유의적 상동성을 갖는 것으로 인정될 수 있는 반면에, 질의 서열로서 서열들 중 하나를 사용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST으로 수행한 조사는 제 2 서열을 최상의 매치로서 식별하지 않을 수 있음이 주지된다. 또한, PSI-BLAST는 서열 상동체를 고찰하기 위한 민감한 방법으로서, 사용이 용이한 자동화 형태의 "프로필" 조사를 제공한다. 상기 프로그램은 먼저, 갭이 있는(gapped) BLAST 데이터베이스 조사를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 다음 라운드의 데이터베이스 조사를 위해 질의 서열을 대신하게 되는 위치-특이적 스코어 행렬을 구축하기 위해 복귀된 임의의 유의적 정렬로부터의 정보를 사용한다. 따라서, 동일성%는 이들 프로그램 중 어느 하나를 사용함으로써 측정할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
2개의 특이적 서열을 문헌[참조: Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다]에 기재된 바와 같이 BLAST2 서열을 사용하여 서로 정렬할 수 있다. 생성된 정렬에 갭(결실 및 삽입)의 도입을 허용하면서 상기 두 서열 간에 갭이 있는(Gapped) BLAST 조사(BLAST 2.0)를 수행하기 위해 BLAST 2 서열 정렬은 BLAST 2.0 알고리즘을 사용하여 blastp 또는 blastn으로 수행한다. 본 발명에서 명료성의 목적상, BLAST 2 서열 정렬은 다음과 같은 표준 디폴트 변수를 사용하여 수행한다.
blastn의 경우, 다음의 0 BLOSUM62 행렬을 사용한다:
매치에 대한 보상값=1
미스매치에 대한 패널티= -2
오픈 갭(5) 및 신장 갭(2) 페널티
갭 x_탈락값(50) 기대값(10) 단어 길이(11) 필터(적용)
blastp의 경우, 다음의 0 BLOSUM62 행렬을 사용한다:
오픈 갭(11) 및 신장 갭(1) 페널티
갭 x_탈락값(50) 기대값(10) 단어 길이(3) 필터(적용).
본 발명에서 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열은 앞서 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템에 의해 예시되고 추가로 트라우스토카이트리움 PUFA PKS 시스템에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명에서 언급된 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이다. 스키조카이트리움 또는 트라우스토카이트리움 PUFA PKS 시스템내에 있는 다양한 도메인의 생물학적 활성은 앞서 기술되었다. 따라서, 본 발명에서 유용한 분리된 단백질은 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임의 해독 생산물, PUFA PKS 도메인, 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 생물학적 활성을 가지는 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 오픈 리딩 프레임 생산물 또는 도메인의 상동체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열은 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩타이드와 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 것으로 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 (이하에서 언급되는) 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건에서 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩타이드을 코딩하는 핵산 분자(즉, 천연적으로 존재하는 PUFA PKS 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 가닥의 상보체)에 (즉, 와) 혼성화될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열은 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건에서 PUFA PKS 단백질 또는 도메인에 대하여 전술된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 상보적 서열을 유추하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 아미노산 서열 분석 및 핵산 서열 분석 기술은 오류로부터 완전히 자유롭지 않기 때문에 본 발명에 나타낸 서열은 최대한 본 발명에 따른 PUFA PKS 도메인 또는 단백질의 분명한 서열을 나타낸 것이다.
본 발명에서 혼성화 조건은 임의의 핵산 분자가 유사한 핵산 분자를 동정하기 위하여 이용될 수 있는 표준 혼성화 조건을 의미한다. 그러한 표준 조건은 예를 들어, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989에 개시되어 있다. 상기 문헌 Sambrook et al.은 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다(특히 페이지 9.31-9.62 참조). 또한, 뉴클레오타이드의 부정합(mismatch) 정도를 다양화하는 혼성화를 달성하기에 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하는 공식은 예를 들어 Meinkoth et al. 1984, Anal . Biochem . 138, 267-284에 개시되어 있다. 상기 문헌 Meinkoth et al.은 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.
보다 자세하게는 본 발명에서 기술된 온화한 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 70% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 의미한다(즉, 약 30% 이하의 뉴클레오타이드의 부정합을 가능하게 하는 조건). 본 발명에서 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 말한다(즉, 뉴클레오타이드의 약 20% 이하의 부정합을 가능하게 하는 조건). 본 발명에서 매우 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 말한다(즉, 뉴클레오타이드의 약 10% 이하의 부정합을 가능하게 하는 조건). 앞서 기재된 바와 같이 당업자는 이러한 특정한 뉴클레오타이드 부정합 정도를 달성할 수 있는 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하는데 Meinkoth et al.에 기술된 공식을 사용할 수 있다. 그러한 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 혼성체가 형성되는지에 따라 달라질 것이다. DNA:DNA 혼성체에 대하여 계산된 용융 온도는 DNA:RNA 혼성체 보다 10℃ 이하이다. 특정한 양태에서, DNA:DNA 혼성체에 대한 엄격한 혼성화 조건은 적합한 세정 조건을 포함하여 6X SSC(0.9M Na+)의 이온 강도로 약 20℃ 내지 약 35℃(낮은 엄격성), 보다 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃(높은 엄격성), 보다 더 바람직하게는 약 35℃ 내지 45℃의 온도(보다 높은 엄격성)에서의 혼성화를 포함한다. 특정 양태에서, DNA:RNA 혼성체에 대한 엄격한 혼성화 조건은 유사하게 엄격한 세정 조건을 포함하여 6X SSC(0.9M Na+)의 이온 강도로 약 30℃ 내지 약 45℃, 보다 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 50℃, 보다 더 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 이러한 수치는 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 0% 포름아미드 및 약 40%의 G+C 함량의 분자에 대한 용융 온도의 계산에 기반을 둔다. 선택적으로 Tm은 위에서 인용된 Sambrook et al. 페이지 9.31 내지 9.62에 기술된 바에 따라 실험적으로 계산될 수도 있다. 일반적으로 세정 조건은 가능한 엄격해야 하고 선택된 혼성화 조건에 적합해야 할 것이다. 예를 들어, 혼성화 조건은 염과 특정한 혼성체에 대하여 계산된 Tm 보다 약 20-25℃ 낮은 온도 조건의 조합을 포함할 수 있으며, 세정 조건은 염과 특정한 혼성체에 대하여 계산된 Tm 보다 약 12-20℃ 낮은 온도 조건의 조합을 포함한다. DNA:DNA 혼성체에 이용하기에 적합한 혼성화 조건의 한 예는 약 42℃에서의 6X SSC(50% 포름아미드)에서 2-24시간 혼성화하고 실온에서 약 2X SSC로 한 차례 이상 세정하고 이어서 더 높은 온도와 더 낮은 이온 강도에서 추가로 세정(예, 약 37℃에서 약 0.1X-0.5X SSC로 적어도 한 차례 이상 세정한 후 약 68℃에서 약 0.1X 내지 0.5X SSC로 적어도 한 차례 이상 세정)하는 세정 단계를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 융합 절편에 부착된 PUFA PKS 단백질 또는 도메인 또는 상동체 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에서 이용하기에 적합한 융합 절편은 이에 제한되는 것은 아니지만 단백질의 안정성을 증진시키고; 다른 목적한 생물학적 활성을 제공하고/거나 단백질의 (예, 친화 크로마토그래피에 의한) 정제를 용이하게 하는 절편을 포함한다. 적합한 융합 절편은 목적한 기능(예, 증가된 안정성, 용해성, 생물학적 활성을 부여고/거나 단백질의 정제를 간편화하는)을 가지는 임의의 크기의 도메인일 수 있다. 융합 절편은 단백질의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 결합될 수 있으며, 목적한 단백질의 간편한 회수가 가능하도록 절단에 민감할 수 있다. 융합 단백질은 본 발명에 따른 단백질의 카르복시 및/또는 아미노 말단에 부착된 융합 절편을 포함한 단백질을 코딩하는 융합 핵산 분자로 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 제조된다.
본 발명의 한 양태에서, 상기된 PUFA PKS 아미노산 서열 뿐만 아니라 상기 서열의 상동체는 특정된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각의 측면에 적어도 하나 내지 적어도 약 20개까지 추가 이형성 아미노산 서열이 위치하도록 제조될 수 있다. 이렇게 형성된 단백질 또는 폴리펩타이드는 특정한 아미노산 서열로 "필수적으로 구성되는"이라고 기술될 수 있다. 본 발명에서 상기 이형성 아미노산 서열은 특정한 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체내에서 발견되지 않는), 천연적으로 발생하는 서열에서 그러한 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는 아미노산 서열이다. 유사하게, "필수적으로 구성되는"이라는 문구가 본 발명에서 핵산 서열과 관련되어서 사용되면 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단 각각에 적어도 하나 내지 약 60개까지 추가 이형성 뉴클레오타이드가 측면에 위치하는 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 이형성 뉴클레오타이드는 천연 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 측면에 천연적으로 발견되지 않는다(즉, 천연 생체내에서 발견되지 않는다).
한 측면에서 본 발명에 따른 단백질 또는 도메인 및/또는 상동체 또는 이의 단편의 최소 크기는 필요한 생물학적 활성을 가지거나 항체의 생성을 위한 항원으로서 또는 실험실내 에세이에서 표적으로서 작용하기에 충분한 크기이다. 한 양태에서, 본 발명의 단백질은 본 발명에 따른 단백질 또는 도메인의 (예, 항체 에피토프 또는 에세이에서 검출할 수 있는 펩타이드로 적합한) 적어도 약 8개의 아미노산, 적어도 약 25개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 적어도 약 100개의 아미노산, 적어도 약 150개의 아미노산, 적어도 약 200개의 아미노산, 적어도 약 250개의 아미노산, 적어도 약 300개의 아미노산, 적어도 약 350개의 아미노산, 적어도 약 400개의 아미노산, 적어도 약 450개의 아미노산, 적어도 약 500개의 아미노산, 적어도 약 750개의 아미노산, 정수(예, 8, 9, 10,..25, 26,..500, 501,..1234, 1235...)로 8개 아미노산 내지 전장 중 임의의 길이 또는 더 길 수 있다. 단백질의 최대 크기에 대해서는 통상적인 제한 이외의 특별한 제한은 없어서, 단백질은 PUFA PKS 단백질의 일부, 도메인 또는 이의 생물학적으로 활성이거나 유용한 단편 또는 전장의 PUFA PKS 단백질 또는 단편, 목적한다면 더해진 추가 서열(예, 융합 단백질 서열)을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 상동체 또는 이의 단편 포함하여, 상기된 단백질 또는 도메인을 코딩하는 핵산 서열 뿐만 아니라 이에 완전히 상보적인 핵산 서열을 포함하는, 필수적으로 구성되는 또는 구성되는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서, 분리된 핵산 분자는 이의 천연 환경 즉, 상기 핵산 분자가 천연에서 위치하는 게놈 또는 염색체인 그것의 천연 환경으로부터 제거된(즉, 인간의 조작이 가해진) 핵산 분자이다. 이에 "분리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 필수적으로 반영하지는 않지만, 상기 분자는 상기 분자가 천연적으로 존재하는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 분리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 분리된 핵산 분자는 그 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라 동일한 염색체에 천연적으로 존재하는 추가 유전자 없이 상기 유전자와 관련된 코딩 영역과 조절 영역을 포함한다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 특정된 핵산 서열의 측면에 정상적으로 위치하는 않는(즉, 이형성의 서열) 추가 핵산이 측면(즉, 서열의 5'및/또는 3'의 말단)에 위치하는 특정한 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA(예, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA 중 어느 하나의 유도체(예, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"는 일차적으로 물리적인 핵산 분자를 의미하는 것이고 "핵산 서열은"은 일차적으로 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것이지만, 상기 두 문구는 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열이라는 관점에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술(예, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 천연의 핵산 분자 및 이의 상동체로 이에 제한되는 것은 아니지만 천연 대립형질 변이체 및 PUFA PKS 단백질의 상기된 바와 같은 생물학적 활성에 목적한 영향을 제공할 수 있는 방식으로 뉴클레오타이드가 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위된 변형된 핵산 분자를 포함한 상동체를 포함한다. 단백질 상동체(예, 핵산 분자 상동체에 의해 코딩된 단백질)는 앞에서 기술되었다.
핵산 분자 상동체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어 상기 문헌 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989). 예를 들어 핵산 분자는 이에 제한되는 것은 아니지만, 위치 지정 돌연변이, 핵산 분자에 돌연변이를 유발할 수 있는 화합물을 처리, 핵산 단편의 효소 처리에 의한 절단, 핵산 단편의 라이게이션, PCR 증폭 및/또는 핵산 서열의 선별된 영역의 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성과 핵산 분자의 혼합체를 "세우기"위한 혼합군의 라이게이션 및 이들의 조합과 같은 전통적인 돌연변이 유발 기술 및 재조합 DNA 기술을 포함한 다양한 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 핵산 분자 상동체는 그 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질의 기능에 대하여 스크리닝 및/또는 야생형 유전자와의 혼성화에 의해 변형된 핵산의 혼합물로부터 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 최소의 크기는 본 발명에서 유용한 핵산 분자의 상보적인 서열과 (예, 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건에서) 안정적 혼성체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 형성하기에 충분하거나 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 코딩하기에 충분한 크기이다. 이와 같이 그러한 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 크기는 혼성화 조건 그 자체(예, 온도, 염농도 및 포름아미드 농도) 뿐만 아니라 핵산 분자의 조성 및 핵산 분자와 상보적 서열간의 백분율 상동성 또는 동일성에 따라 달라질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브로서 이용되는 핵산 분자의 최소 크기는 일반적으로 GC가 풍부하다면 적어도 약 12 내지 약 15 뉴클레오타이드 이상이며 AT가 풍부하다면 적어도 약 15 so지 약 18 염기이다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 최대 크기에 대하여 통상적인 제한 이외의 제한은 없지만, 핵산 분자는 PUFA PKS 시스템의 도메인의 생물학적으로 활성인 단편, PUFA PKS 시스템의 전체 도메인, PUFA PKS 시스템의 오픈 리딩 프레임 (Orf) 내에 있는 여러 개의 도메인, PUFA PKS 시스템의 전체 Orf 또는 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 Orf를 코딩하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 분리된 핵산 분자는 본 발명에서 언급된 스키조카이트리움 또는 트라우스토카이트리움 유래의 아미노산 서열 또는 이의 상동체를 포함한 상술된 아미노산 서열 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성하거나, 구성한다. 한 측면에서, 상기 핵산 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 서열번호: 7, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 17, 서열번호: 19, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 25, 서열번호: 27, 서열번호: 29, 서열번호: 31, 서열번호: 38, 서열번호: 40, 서열번호: 42, 서열번호: 44, 서열번호: 47, 서열번호: 49, 서열번호: 51, 서열번호: 53, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 서열번호: 65 또는 서열번호: 67 또는 (상기 서열에 대하여 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한) 상동체 또는 이의 단편 또는 이의 상보적인 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태는 재조합 벡터와 상기된 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 펩타이드 (또는 상동체 또는 이들의 단편)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 서열은 앞서 상세히 기술되었다. 본 발명에 있어서, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하고 그러한 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하는 도구로서 이용되도록 설계된(즉, 인위적으로 제조된) 핵산 분자이다. 따라서 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 클로닝, 서열분석 및/또는 선택된 핵산 서열의 발현 및/또는 그러한 핵산 서열의 숙주 세포로 전달하여 재조합 세포를 형성하는 것과 같이 다른 조작에 이용하는데 적합하다. 그러한 벡터는 일반적으로 클로닝되고 전달되는 핵산 서열에 천연적으로 근접하여 위치하지 않는 핵산 서열인 이형성의 핵산 서열을 포함하지만, 상기 벡터는 또한 본 발명의 핵산 분자에 천연적으로 근접하여 위치하거나 (이하에서 자세히 기술되는) 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예, 프로모터, 비해독 영역)을 포함할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있으며 원핵생물 또는 진핵생물 유래일 수 있으며 일반적으로는 플라스미드이다. 벡터는 염색체외 성분(예, 플라스미드)으로서 유지되거나 재조합 유기체(예, 미생물 또는 식물)의 염색체로 통합될 수 있다. 전체 벡터는 숙주 세포내에 위치하거나 특정 조건에서는 본 발명의 핵산 분자를 남겨두면서 플라스미드 DNA가 결실될 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체 프로모터의 조절하에 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절하에 또는 여러 프로모터 조합의 조절하에 위치시킬 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 다수의 카피가 염색체내로 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자로 이용되는 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 코딩된 생산물(예, 대상 단백질)의 제조에 적합한 벡터를 의미한다. 이러한 양태에서, 제조될 생산물(예, PUFA PKS 도메인)을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 벡터에 삽입되어 재조합 핵산 분자로 제조된다. 제조될 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 숙주 세포내에서 상기 핵산 서열의 전사 및 해독을 가능하게 하는 벡터의 조절 서열에 상기 핵산 서열을 작동가능하게 연결시키는 방식으로 벡터에 삽입할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자로 이용되는 재조합 벡터는 표적화 벡터이다. 본 발명에서 용어 "표적화 벡터"는 재조합 숙주 세포 내로 특정 핵산 분자를 전달하는데 이용되는 벡터를 의미하는 것으로 상기 핵산 분자는 숙주 세포 또는 미생물 내에서 내인성 유전자를 결실 또는 불활성화시키는데 이용된다(즉, 표적 유전자의 파괴 또는 녹아웃 기술에서 이용되는). 이러한 벡터는 당업계에 또한 "녹-아웃"벡터로서 알려져 있다. 이러한 양태의 한 측면에서, 벡터의 일부분, 보다 일반적으로는 벡터에 삽입된 핵산 분자(즉, 삽입물)는 숙주 세포내 표적 유전자(즉, 결실 또는 불활성화되도록 표적화된 유전자)의 핵산 서열과 상동성인 핵산서열을 갖는다. 벡터 삽입물의 핵산 서열은 표적 유전자와 결합하도록 설계되어 표적 유전자와 삽입물간의 상동성 재조합이 일어나서 그에 의하여 (즉, 돌연변이 또는 결실된 내인성 표적 유전자의 적어도 일부분에 의해) 내인성 표적 유전자가 결실, 불활성 또는 약화된다. 내인성의 스키조카이트리움 유전자를 재조합 유전자로 치환하기 위하여 상기 타입의 재조합 벡터를 이용한 것이 실시예 부분에 기술되어 있으며, 트라우스토카이트리드의 유전적 형질전환을 위한 일반적인 기술은 2003년 9월 4일자 미국특허공개 제20030166207호로 공개된 미국특허출원 제 10/124,807호에 상세히 개시되어 있다.
일반적으로 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 적어도 하나 이상의 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서 용어 "재조합 분자"또는 "재조합 핵산 분자"는 일차적으로 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 의미하는 것이지만, 그러한 핵산 분자가 본 발명에서 기술된 바와 같이 재조합 분자일 때에는 용어 "핵산 분자"와 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 분자가 숙주 세포로 형질감염(즉, 형질전환, 형질도입, 형질감염, 접합 또는 전도)되었을 때 발현될 수 있는 방식으로 발현 조절 서열(예, 전사 조절 서열 및/또는 해독 조절 서열)에 연결된 것을 의미한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 또는 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 것이다. 적합한 전사 조절 서열은 재조합 핵산 분자가 도입된 숙주 세포 또는 유기체에서 기능을 발휘할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 핵산 분자는 재조합 세포에 적합한 해독 조절 서열, 복제 개시점 및 다른 조절 서열과 같은 추가의 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. 한 양태에서, 숙주 세포 염색체로 통합된 재조합 분자를 포함하여 본 발명에 따른 재조합 분자는 발현된 단백질을 제조한 세포로부터 분리되도록 하는 분비 신호(즉, 신호 단편 핵산 서열)를 또한 포함한다. 적합한 신호 절편은 발현될 단백질과 천연적으로 연관된 신호 절편 또는 본 발명에 따른 단백질의 분비를 유도할 수 있는 임의의 이형성 신호 절편을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 재조합 분자는 발현된 단백질이 숙주 세포막에 전달 및 삽입되도록 하는 리더 서열을 포함한다. 적합한 리더 서열은 단백질과 천연적으로 연관된 리더 서열 또는 세포막으로 단백질의 전달 및 삽입을 유도할 수 있는 임의의 이형성 리더 서열을 포함한다.
본 발명자들은 스키조카이트리움 PUFA PKS OrfA 및 B가 게놈 상에서 가깝에 연결되어 있다는 것을 발견하였고, Orfs 간의 영역을 서열분석하였다. Orf는 반대 방향으로 배향되어 있으며, 4244개의 염기쌍이 개시(ATG) 코돈을 이격시킨다(즉, 이들은 다음과 같이 배열된다:3'OrfA5'-4244bp-5'OrfB3'). 4244bp의 유전자간 영역의 연구는 어떠한 분명한 Orf를 밝혀내지 못하였다(BlastX 조사에서 상당한 매치가 발견되지 않았다). OrfA 및 B 모두가 스키조카이트리움에서 적어도 오일 제조 중에 발현되었는데, 이는 활성 프로모터 요소가 상기 유전자간 영역에 포함되어 있다는 것을 암시한다. 이러한 유전적 요소는 유전자 도입용으로 적용함에 있어서 이방향성(bi-directional) 프로모터로서의 유용성을 갖는 것으로 여겨진다. 예를 들어 바람직한 양태에서, 상기 영역을 클로닝하고 대상 유전자를 각 말단에 위치하고 그 작제물을 스키조카이트리움 (또는 상기 프로모터가 기능을 발휘하는 것으로 보이는 일부 다른 숙주)으로 도입할 수 있다. 적합한 조건하에서 조절 요소는 조합 작용하여 두 개의 도입된 유전자의 높은 발현율을 제공할 것이다. 스키조카이트리움 PUFA PKS 조절 요소(예, 프로모터)를 포함한 조절 영역의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 36에 나타내었다.
유사한 방식으로 OrfC도 오일 제조 중에 스키조카이트리움에서 발현되고 조절 요소는 이의 개시 코돈의 업스트림 영역에 존재할 것으로 예상된다. OrfC의 게놈 DNA 업스트림의 영역은 클로닝되고 서열분석되어 본 발명에서 나타내었다(서열번호: 37). 상기 서열은 OrfC 개시 코돈의 3886 nt의 바로 업스트림을 포함한다. 이러한 영역의 연구는 어떠한 분명한 Orf를 밝혀내지 못하였다(BlastX 조사에서 상당한 매치가 발견되지 않았다). 상기 영역내에 포함된 조절 요소는 적합한 조건 하에서 이들의 뒤에 위치하는 유전자의 높은 발현을 가능하게 할 것이다. 또한, 적합한 환경 하에서 유전자의 발현율은 A-B 유전자간 영역(서열번호: 36)의 조절 하에 있는 유전자와 조합 조절될 수 있다.
따라서 한 양태에서, 상기된 본 발명에서 유용한 재조합 핵산 분자는 서열번호: 36 및/또는 서열번호: 37 내에 포함된 PUFA PKS 조절 영역을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역은 적어도 기본적인(basal) PUFA PKS 전사 활성을 가진 서열번호: 36 및/또는 서열번호: 37의 일부 (단편)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 하나 이상의 재조합 분자가 본 발명의 코딩된 생산물(예, PUFA PKS 도메인, 단백질 또는 시스템)을 제조하는데 이용될 수 있다. 한 양태에서, 코딩된 생산물은 단백질을 제조하기에 효과적인 조건 하에서 상기 핵산 분자를 발현함으로써 제조된다. 코딩된 단백질을 제조하기에 바람직한 방법은 하나 이상의 재조합 분자로 숙주 세포를 형질감염하여 재조합 세포를 형성하는 것이다. 형질감염하기에 적합한 숙주 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만, 형질감염될 수 있는 박테리아, 진균(예, 효모), 곤충, 식물 또는 동물의 세포를 포함한다. 본 발명의 한 양태에서, 바람직한 숙주 세포는 (하기에서 상세히 설명되는) 트라우스토카이트리드 숙주 세포 또는 식물 숙주 세포이다. 숙주세포는 형질감염되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 다른 재조합 핵산 분자로 형질감염된 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자(즉, 재조합 핵산 분자)를 세포내로 삽입할 수 있는 임의의 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은 이 용어가 핵산 분자를 조류, 박테리아 및 효소와 같은 미생물 또는 식물 세포로 도입하는데 이용할 경우 용어 "형질감염"과 상호교환적으로 이용될 수 있다. 미생물 시스템에서 용어 "형질전환"은 미생물 또는 식물에 의한 외인성 유전자의 습득으로 인한 유전되는 변화를 설명하는데 이용되며 "형질감염"과 본질적으로 같은 의미이다. 그러나 동물 세포에서 형질전환은 배양 중 세포의 생장 특성에서의 변화로 이들이 예를 들어 종양화된(cancerous) 후를 말하는 제 2의 의미를 갖고 있다. 따라서 혼동을 피하기 위하여 동물 세포로의 외래 핵산의 도입에 관련해서는 용어 "형질감염"을 사용하는 것이 바람직하고, 본 발명에서 용어 "형질감염"은 상기 용어들이 외래 핵산 분자를 세포내로 도입하는 것과 연관된 것에 한에서는 동물 세포의 형질감염과 식물 세포와 미생물 세포의 형질전환을 포함한다. 따라서 형질감염 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 형질전환, 입자 사격(particle bombardment), 확산(diffusion), 활성 트랜스포트, 수조내 초음파처리(bath sonication), 전기천공, 미세주입, 리포펙션(lipofection), 흡수, 감염 및 원형질체 융합을 포함한다.
재조합 DNA 기술의 이용은 예를 들면 숙주 세포 내에서 핵산 분자의 카피수, 이러한 핵산 분자가 전사되는 효율, 이렇게 형성된 전사체가 해독되는 효율, 해독후 변형의 효율을 조작함으로써 형질감염된 핵산 분자의 발현의 조절을 개선시킬 수 있다는 것이 당업자에게는 자명하다. 또한, 프로모터 서열은 본래(ative) 프로모터와 비교하였을 때 발현율을 증진시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. 핵산 분자의 발현을 조절하는데 유용한 재조합 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 숙주 세포 염색체로 핵산 분자의 통합, 플라스미드로 벡터 안정화 서열의 추가, 전사 조절 신호(예, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 변형, 해독 조절 서열(예, 리보좀 결합 부위, Shine-Dalgarno 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 이용에 상응하도록 핵산 분자의 변형, 전사체를 불안정하게 하는 서열의 결실을 포함한다.
재조합 핵산 분자와 숙주 세포의 형질감염과 관련된 상기 설명은 PUFA PKS 유래의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는, 다른 PKS 시스템 유래의 아미노산 서열을 코딩하는, 다른 단백질 또는 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하여 본 발명에서 기술된 임의의 재조합 핵산 분자에 적용하고자 한 것이다.
다중불포화 지방산(PUFA)는 보다 고등 진핵생물의 필수적인 멤브레인 구성요소이고 많은 리피드 유래의 신호 분자의 전구체이다. 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템은 포화 지방산의 탈포화 및 연장을 요구하지 않는 PUFA 합성을 위한 경로를 이용한다. PUFA PKS에 의해 촉매되는 경로는 구조와 메커니즘에 있어서, 기존에 알려진 PKS과는 구별된다. 시스 이중 결합의 생성은 위치 특이적인 이소머라제를 포함할 것으로 제안된다; 이러한 효소는 새로운 군의 항생제를 제조하는데 유용할 것으로 여겨진다.
하나 이상의 목적한 다중불포화 지방산 또는 다른 생활성 분자를 상당히 높은 수율로 제조하기 위하여 유기체, 바람직하게는 미생물 또는 식물, 가장 바람직하게는 트라우스토카이트리드 미생물을 유전적으로 변형시켜 미생물 또는 식물에서의 PUFA PKS 시스템의 활성, 특히 최종 생산물을 변이시킬 수 있다.
따라서 본 발명의 한 양태는 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 발현하는 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다. PUFA PKS 시스템의 한 도메인은 상기된(예, 스키조카이트리움과 트라우스토카이트리움에 있어서) PUFA PKS 시스템과 관련된 상동체를 포함하여, 도메인은 포함할 수 있으며, 트라우스토카이트리드 미생물을 포함하여 진핵생물의 미생물을 포함한 다른 비박테리아의 미생물에서 유래된 PUFA PKS 시스템의 도메인 또는 미국특허출원 제10/124,800호에 개시된 스크리닝 방법에 의해 동정된 미생물 유래의 PUFA PKS 시스템의 도메인을 포함할 수 있다. 상기 유기체에서 유전적 변형은 PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다. 미국특허출원 제10/124,800호에 개시된 스크리닝 방법은 (a) 적어도 하나의 PUFA를 제조하는 미생물을 선택하는 단계 및 (b) 발효 배지 중 약 5%, 바람직하게는 약 10%, 보다 바람직하게는 약 15%, 보다 바람직하게는 약 20% 이상의 용존 산소 포화 농도에서 미생물에 의한 PUFA 생산량과 비교하였을 때 발효 배지 중 약 5% 이하의 용존 산소 포화 농도에서 증가된 PUFA를 제조하는 능력을 가진 미생물을 동정하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 그러한 유기체는 내인적으로 PUFA PKS 시스템을 포함하고 발현할 수 있으며, 유전적 변형은 상기 내인성의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나 이상의 기능성 도메인의 유전적 변형일 수 있으며, 이로써 상기 변형은 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다. 다른 측면에서, 그러한 유기체는 내인적으로 PUFA PKS 시스템을 포함하고 발현할 수 있고, 유전적 변형은 적어도 하나의 외래성 핵산 서열(예, 재조합 핵산 분자)의 도입일 수 있으되, 상기 외래성 핵산 서열은 제 2의 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인 또는 단백질 및/또는 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질(예, 하기에서 설명되는 포스포판테테인 트랜스퍼라제(PPTase))을 코딩한다. 또 다른 측면에서, 유기체는 반드시 내인적으로(천연적으로) PUFA PKS 시스템을 포함하지 않지만, PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 도입하여 유전적으로 변형된다. 이러한 측면에서, PUFA PKS 활성은 유기체에 PUFA PKS 활성을 도입하거나 증가시킴으로써 영향을 미친다. 이러한 측면과 관련된 다양한 양태가 하기에서 더욱 상세히 설명될 것이다.
PUFA PKS 시스템 또는 PUFA PKS 시스템을 포함하는 유기체의 유전적 변형은 (도메인의 일부를 포함한) PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인, (PUFA PKS 시스템에서 근접한 도메인, 비인접한 도메인 또는 상이한 단백질의 도메인을 포함한) PUFA PKS 시스템의 하나 이상 또는 여러 개의 도메인, PUFA PKS 시스템의 전체 단백질, 전체 PUFA PKS 시스템(예, PUFA PKS에 의해 코딩된 모든 단백질)의 변형을 포함할 수 있다. 이에, 변형은 내인성 PUFA PKS 시스템의 단일 도메인에 대한 미미한 변형; 주어진 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나 이상의 도메인 또는 단백질에 대한 치환, 결실 또는 추가; 한 유기체의 전체 PUFA PKS 시스템을 다른 유기체 유래의 PUFA PKS 시스템으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 당업자에게는 PUFA PKS 시스템에 대한 유전적 변형이 본 발명에 의해 포함된다는 것이 자명하다.
본 발명에 개시된 유전적으로 변형된 미생물은 유전적으로 변형된 박테리아, 원생생물, 미세조류, 진균류, 또는 다른 세균과 특히 본문에서 서술한 트라우스토카이트리알레(예, 트라우스토카이트리드)목의 모든 속(예를 들어 스키조카이트리움, 트라우스토카이트리움, 자포노카이트리움, 라비린툴라, 라비린툴로이데스 등)을 포함한다. 상기의 유전적으로 변형된 미생물은 정상적인(즉, 야생형 또는 천연적으로 존재하는) 형태로부터 목적한 결과를 수득하기(PUFA PKS의 활성 및/또는 PKS 시스템을 사용하여 목적한 생산물의 제조를 증가 또는 변형시키기) 위해 변형된(즉, 돌연변이 또는 변화된) 게놈을 가지고 있다. 미생물의 유전적인 변형은 전통적인 균주 개발 및/또는 분자 유전학적 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 당업계에 공지된 이와 같은 기술은 예를 들어 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press에 일반적으로 미생물에 관하여 개시되어 있다. 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다. 유전적으로 변형된 미생물은 상기 변형이 미생물 내에서 목적한 효과를 제공하는 방식으로 핵산 분자가 삽입, 결실 또는 변형(즉, 돌연변이된; 예를 들면 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위에 의해)된 미생물을 포함한다.
본 발명에 따라 변형할 바람직한 미생물 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니지만, 박테리아, 원생생물, 미세조류, 진균류 또는 프로토조아를 포함한다. 한 측면에서, 유전적으로 변형시키기에 바람직한 미생물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 트라우스토카이트리아세 및 라비린툴라시애에 있는 임의의 미생물을 포함한 트라우스토카이트리얼 목의 미생물을 포함한다. 본 발명에서 이용하기에 특히 바람직한 숙주 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 트라우스토카이트리움, 자포노카이트리움, 아플라노카이트리움, 트라우스토카이트리아시애 및 라비린툴라 내의 엘리나 및 스키조카이트리움, 라빌린툴로이드 및 라빌린툴라시애 내의 라빌린토믹사를 포함한 속 유래의 미생물을 포함할 수 있다. 상기 속 내의 바람직한 종은 이에 제한되는 것은 아니지만: 라브린툴라 sp., 라비린툴라 알게리엔시스, 라비린툴라 시엔콥스키, 라비린툴라 샤토니, 라비린툴라 코에노시스티스, 라비린툴라 마크로시스티스, 라비린툴라 마크로시스티스 아틀란티카, 라비린툴라 마크로시스티스 마크로시스티스, 라비린툴라 마그니피카, 라비린툴라 미누타, 라비린툴라 로스코펜시스, 라비린툴라 발카노비, 라비린툴라 비텔리나, 라비린툴라 비텔리나 파시피카, 라비린툴라 비텔리나 비텔리나, 라비린툴라 조피를 포함한 라비린툴라의 모든 종; 라비린툴로이데스 sp., 라비린툴로이데스 미누타, 라비린툴로이데스 스키조카이트롭을 포함한 라비린툴로이데스의 모든 종; 라비린토믹사 sp., 라비린토믹사 폴리아, 라비린토믹사 사바게이를 포함한 모든 라비린토믹사 종; 아플라노카이트리움 sp. 과 아플라노카이트리움 케르구엘렌시스를 포함한 모든 아플라노카이트리움종; 엘리나 sp., 엘리나 마리살바, 엘리나 시노리피카를 포함한 모든 엘리나종; 자파노카이트리움 sp., 자파노카이트리움 마리눔을 포함한 모든 자파노카이트리움종; 스키조카이트리움 sp., 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔, 스키조카이트리움 미누툼, 스키조카이트리움 옥토스포룸을 포함한 모든 스키조카이트리움종; 트라우스토카이트리움 sp., 트라우스토카이트리움 아그레가툼, 트라우스토카이트리움 아루디멘탈레, 트라우스토카이트리움 오레움, 트라우스토카이트리움 벤티콜라, 트라우스토카이트리움 글로버섬, 트라우스토카이트리움 킨네이, 트라우스토카이트리움 모티붐, 트라우스토카이트리움 파카이더문, 트라우스토카이트리움 프로리페룸, 트라우스토카이트리움 로세움, 트라우스토카이트리움 스타리아툼, 울케니아 sp., 울케니아 미누타, 울케니아 프로펀다, 울케니아 라디에이트, 울케니아 사카리아나, 울케니아 비수르젠시스를 포함한 모든 트라우스토카이트리움 종. 특히 이들 속에서도 바람직한 종은 이에 제한되는 것은 아니지만, 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔, 스키조카이트리움 미누툼을 포함한 모든 스키조카이트리움 종; (U. 비수르젠시스, U. 아메보이다, U. 사카리아나, U. 프로펀다, U. 라디에이타, U. 미누타 및 울케니아 sp. BP-5601과 같은 이전의 울케니아 종을 포함한) 그리고 트라우스토카이트리움 스트리아툼, 트라우스토카이트리움 오레움, 트라우스토카이트리움 로세움을 포함한 모든 트라우스토카이트리움 종 및 모든 자포노카이트리움 종을 포함한다. 특히 트라우스토카이트리얼의 바람직한 균주는 이에 제한되는 것은 아니지만, 다음과 같다: 스키조카이트리움 sp. (S31)(ATCC 20888); 스키조카이트리움 sp . (S8)(ATCC 20889); 스키조카이트리움 sp . (LC-RM)(ATCC 18915); 스키조카이트리움 sp . (SR21); 스키조카이트리움 아그레가툼 (Goldstein et Belsky)(ATCC 28209); 스키조카이트리움 리마시눔(Honda et Yokochi)(IFO 32693); 트라우스토카이트리움 sp . (23B)(ATCC 28210); 트라우스토카이트리움 스트라이툼(Schneider)(ATCC 24473); 트라우스토카이트리움 오레움 (Goldstein)(ATCC 34304); 트라우스토카이트리움 로세움 (Goldstein)(ATCC 28210); 및 자포노카이트리움 sp. (L1)(ATCC 28207)을 포함한다. 이외의 유전적인 변형을 위한 숙주 미생물로 적합한 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로미세스 세레비시애, 사카로미세스 칼스버젠시스 또는 칸디다, 클루베로미세스와 같은 다른 효모를 포함한 효모 또는 아스퍼질러스, 뉴로스포라, 페니실리움 등과 같은 섬사상의 진균류를 포함한다. 박테리아 세포도 숙주로 사용될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 발효 과정에 유용할 수 있는 대장균을 포함한다. 일례로 락토바실러스 종 또는 바실러스 종과 같은 숙주를 사용할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 한 양태는 유전적으로 변형된 식물에 관한 것으로서, 상기 식물은 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함한 PKS 시스템을 재조으로 발현하기 위해 유전적으로 변형되었다. 상기 PUFA PKS 시스템의 도메인은 전술한(예, 스키조카이트리움 및/또는 트라우스토카이트리움에 있어서) PUFA PKS 시스템과 관련된 상동체를 포함하여, 도메인을 포함하고, 또한 (진핵의 미생물 또는 다른 트라우스토카이트리드 미생물을 포함한) 비박테리아 미생물 유래의 PUFA PKS 시스템의 도메인 또는 상기된 미국특허출원 제10/124,800호에 개시된 스크리닝 방법으로 동정된 미생물 유래의 PUFA PKS 시스템의 도메인을 포함한다. 상기 식물은 또한 이에 제한되는 것은 아니지만, 박테리아의 PUFA PKS 또는 PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템, 및/또는 모든 비박테리아의 PUFA PKS 시스템(예로 들면 진핵의, 트라스토카이트리드, 트라우스토카이트리아세 혹은 라비린툴라시애, 스키조카이트리움 등)을 포함한 다른 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인 또는 생물학적으로 활성인 단편으로 추가로 변형될 수 있다.
본 발명에서 유전적으로 변형된 식물은 고등식물, 특히 소모할 수 있는 식물 또는 본 발명의 목적한 생활성 분자를 제조하는데 유용한 식물을 포함하여 유전적으로 변형된 식물을 포함할 수 있다. 상기 유전적으로 변형된 식물은 목적한 결과가 달성되도록(즉, PUFA PKS의 활성 및/또는 PKS 시스템을 사용하여 목적한 생산물의 제조를 증가 또는 변형시키기) 정상(야생형 또는 천연적으로 존재하는) 형태로부터 변형된(돌연변이 또는 변화시킨) 게놈을 가지고 있다. 식물의 유전적인 변형은 전통적인 균주의 개발 및/또는 분자 유전학적 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 목적한 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 핵산 분자가 식물의 게놈에 통합된 유전자 도입 식물의 제조 방법이 당업계에 알려져 있다. 본 발명에 따라 유전적으로 변형시킬 식물은 사람을 포함한 동물에 의해 소비되는 식물이 바람직하다.
* 본 발명에 따라 유전적으로 변형시킬 바람직한 식물(즉, 식물의 숙주세포)은 이에 제한되는 것은 아니지만, 고등식물, 특히 농작물, 특히 이의 기름이 이용되는 식물을 포함하여 소비가 가능한 식물을 포함한다. 상기 식물의 예는 다음을 포함한다: 카놀라, 콩, 평지씨, 아마씨, 옥수수, 홍화, 해바라기와 담배. 이외의 바람직한 식물은 약제학적 에이전트, 향발산 에이전트, 약효식품 에이트전트, 기능성 식품의 성분 또는 화장용으로 활성인 에이전트로 이용되는 화합물을 제조하는 것으로 공지된 식물 또는 상기 화합물/에이전트를 제조하도록 유전적으로 변형된 식물을 포함한다.
본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물 혹은 식물은 재조합 기술을 사용하거나 전통적인 돌연변이 유발과 스크리닝 기술에 의해 변형된 미생물 또는 식물을 포함한다. 본 발명에서 유전자 발현, 유전자의 기능 또는 유전자 생산물(즉, 유전자에 의해 코딩된 단백질)의 기능의 감소를 야기하는 유전적인 변형은 유전자의 (완전한 또는 부분적인) 불활성화, 결실, 파괴(interruption), 차단 또는 하향 조절로 기재될 수 있다. 예로 들어 유전자에 의해 코딩된 단백질의 기능 감소를 야기하는 유전자에서의 유전적 변형은 유전자의 완전한 결실(즉, 유전자가 존재하지 않으므로 단백질이 존재하지 않는다), 단백질의 불완전하거나 전혀 해독되지 않도록 하는(즉, 단백질이 발현되지 않는다)유전자에서의 돌연변이 또는 단백질의 천연 기능을 감소시키거나 파괴시키는(예로 들어, 효소의 활성 또는 작용이 감소되거나 전혀 없는 단백질이 발현된 경우) 돌연변이의 결과일 수 있다. 유전자의 발현 또는 기능에서의 증가를 초래하는 유전적 변형은 유전자의 증폭, 과잉 생산, 과잉 발현, 활성화, 개선, 첨가 또는 상향 조절로서 기재될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 또는 식물의 유전적인 변형은 바람직하게는 PKS 시스템이 내인성이고 유전적으로 변형되었는지, 유기체(내생적인 시스템의 변형 여부에 따라)로의 재조합 핵산 분자의 도입이 내인성인지 또는 재조합 기술에 의해 완전히 제공되었는지 여부에 상관없이 미생물 또는 식물에 의해 발현된 PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다. 상기 시스템을 발현하는 PUFA PKS 시스템 또는 유기체의 PUFA 생산물 프로필을 변경시키는 것은 유전적인 변형이 부재된(즉, 변형되지 않은 야생형 미생물 또는 식물, 또는 적어도 PUFA 합성에 관련해서는 변형되지 않은 미생물 또는 식물 - 즉, 유기체는 PUFA 합성과 관련되지 않은 다른 변형을 가질 수 있다)경우와 비교하였을 때 숙주 미생물 또는 식물에 의한 하나 이상의 PUFA 제조에서의 검출 또는 측정할 수 있는 변화를 유발하는 것을 포함한다. PKS 시스템의 활성에 영향을 미치기 위해서는 유전적 변형이 부재된 경우와 비교하였을 때 유기체에 의해 발현되는 PKS 시스템에서의 검출하거나 측정할 수 있는 변화 또는 변형을 유발하는 유전적 변형을 포함한다. PKS 시스템 내에서의 검출할 수 있는 변화 또는 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만 다음을 포함할 수 있다: 유전적 변형이 부재된 내인성 PUFA PKS 시스템과 비교하였을 때 변형된 PUFA PKS 시스템내 하나 이상의 도메인의 발현 및/또는 생물학적 활성의 변화 또는 변형(도입, 증가 또는 감소), 유기체가 검출/측정할 수 있는 PKS 시스템 활성을 가지도록 (즉, 유기체가 유전적 변형 이전에는 PKS 시스템을 보유하고 있지 않다) 유기체로의 PKS 시스템을 도입, PKS 시스템 활동이 변형되도록 유기체에 의해 내인적으로 발현되는 PKS 시스템과는 상이한 PKS 시스템으로부터 유래된 기능적인 도메인을 유기체로 도입(예를 들면, 내생적으로 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 발현하는 유기체로 박테리아의 PUFA PKS 도메인 또는 타입 I PKS의 도메인이 도입된다), PKS 시스템(예를 들면, 유전적 변형이 부재된 경우와 비교하였을 때 시스템이 더 많은 (증가된 양) 또는 더 적은 (감소된 양)을 제조한다)에 의해 제조되는 생활성 분자(예, PUFA)의 양에서의 변화, PKS 시스템에 의해 제조된 생활성 분자의 타입(예, PUFA 타입의 변화)에서의 변화(예를 들면, 시스템은 추가의 또는 상이한 PUFA, 신규하거나 상이한 생산물 또는 상기 시스템에 의해 천연적으로 제조되는 PUFA의 변이체 또는 다른 생산물을 제조한다), PKS 시스템에 의해 제조되는 다수의 생활성 분자의 비율에서의 변화(예를 들면, 시스템이 한 PUFA에 대한 다른 PUFA을 상이한 비율로 제조하거나, 유전적 변형이 부재된 경우와 비교했을 때 완전히 상이한 리피드 프로필을 제조하거나, 천연의 배형과 비교하였을 때 트리아실글리세롤 상에서 상이한 위치에 다양한 PUFA를 배치시킨다). 상기의 유전적 변형은 모든 타입의 유전적인 변형, 특히 재조합 기술과 전통적인 돌연변이에 의한 변형을 포함한다.
PUFA PKS 시스템의 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시킨다는 것은 유기체의 다음과 같은 유전적 변형을 의미한다. 이 유기체는 도메인이나 단백질 시스템의 기능성의 증가를 가져오는 도메인이나 단백질(혹은 도메인이나 단백질이 도입되는)을 보유하고 도메인이나 단백질의 상위의 활동(예로 들면 특정한 활동 혹은 생체 안에서의 효소에 의한 활동), 도메인이나 단백질 시스템의 감소된 억제 혹은 퇴화, 그리고 도메인이나 단백질의 과잉 발현을 포함한다. 예로 들면, 유전자의 카피 수가 증가되거나, 본래의 프로모터에 비하여 높은 수준의 발현을 제공하는 프로모터의 사용으로 발현 수준을 증가시키거나, 유전자는 그 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 도메인의 활동을 증가시키도록 유전자 공학 또는 전통적인 돌연변이 유발에 의해 변이될 수 있다.
유사하게 PUFA PKS 시스템에 있는 기능성 도메인 또는 단백질의 활성을 감소시킨다는 것은 도메인 또는 단백질의 감소된 기능을 유발하는 도메인 또는 단백질을 포함한 (또는 도메인 또는 단백질이 도입될) 유기체에서의 임의의 유전적 변형을 의미하고, 도메인 또는 단백질의 감소된 활성, 도메인 또는 단백질의 증가된 억제 또는 분해, 및 도메인 또는 단백질의 발현의 감소 또는 제거를 포함한다. 예를 들어 본 발명에 따른 도메인 또는 단백질의 작용은 도메인 또는 단백질의 제조를 차단 또는 감소시키거나, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 일부분을 "녹아웃(knocking out)"하거나, 도메인 또는 단백질 활성을 감소시키거나, 도메인 또는 단백질의 활성을 감소시킴으로써 감소될 수 있다. 도메인 또는 단백질의 제조를 차단 또는 감소시키는 것은 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자를, 성장 배지 중 유도하는 화합물의 존재를 필요로 하는 프로모터의 조절 하에 위치시키는 것을 포함한다. 유도인자가 배지로부터 고갈되도록 조건을 설정함으로써 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 턴오프(turn off)될 것이다. 본 발명자들은 실시예 부분에서 트라우스토카이트리드 미생물의 표적 유전자를 결실시키는 능력을 증명하였다. 도메인 또는 단백질의 활성을 차단 또는 감소시키는 것은 미국특허 제4,743,546호에 개시된 바와 유사한 절제(excision) 기술 방식을 사용하는 것을 또한 포함한다. 이러한 방식을 이용하기 위하여 대상 단백질을 코딩하는 유전자가 게놈으로부터 그 유전자의 특이적이고 조절된 절제를 가능하게 하는 특정 유전자 서열 사이에 클로닝한다. 절제는 예를 들어 미국특허 4,743,546호에서처럼 배양시에 배양 온도의 전환 또는 몇 가지 다른 물리적 또는 영양소의 신호에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서 유전적 변형은 본 발명에서 기술된 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 적어도 한 도메인(예로 들면 트라우스토카이트리드 숙주의 내인성 PUFA PKS 시스템의 한 도메인, 하나 이상의 도메인, 단백질, 전체 PUFA PKS 시스템)의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 내인적으로(자연적으로) 발현되는 비박테리아의 PUFA PKS 시스템 내의 아미노산 서열에 실행되어져, 그러한 시스템을 천연적으로 포함한 미생물은, 예를 들면 전통적인 돌연변이 및 선택 기술 및/또는 유전 공학 기술을 포함한 분자 유전학 기술에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 유전 공학 기술은 예로 들면, (실시예에서 보여지는) 내인성 유전자의 일부분을 결실하기 위해 표적의 재조합 벡터를 사용하거나 (실시예에서 보여지는) 이종의 서열로 내인성 유전자의 일부분을 대체하는 것을 포함한다. 숙주 게놈에 도입할 수 있는 이종의 서열의 예로는 다른 비박테리아의 PUFA PKS 시스템(예로 들면 다른 트라우스토카이트리드를 포함한 진핵세포 유래), 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템 또는 모듈라 PKS 시스템과 같은 다른 PKS 시스템의 적어도 하나의 기능적 도메인을 코딩한 서열을 포함한다. 또한 이종의 서열은 숙주에 있는 전체 내인성 PUFA PKS 시스템(예, 내인성 PUFA PKS 시스템의 모든 유전자)을 대체하기 위해서 이용되는 전체 PUFA PKS 시스템(예, PUFA PKS 시스템과 관련된 모든 유전자)을 포함할 수 있다. 또한, 이종의 서열은 숙주 트라우스토카이트리드의 PUFA PKS 시스템에서 유래된 천연의 도메인의 변형된 기능적 도메인(상동체)을 코딩하는 서열(예를 들어, 스키조카이트리움의 OrfB 유래의 변형된 도메인을 코딩한 핵산 서열, 여기서, 변형된 도메인은 스키조카이트리움에서 발현되는 천연적으로 존재하는 도메인을 대체하기 위해 사용되었을 때 스키조카이트리움에 의한 PUFA 산물 프로필을 변이시킬 것이다)을 포함한다. 숙주의 게놈에 도입되는 다른 이종의 서열은 PKS 시스템의 도메인은 아니지만 내인성 PKS 시스템의 성동에 영향을 끼치는, 기능적 도메인 또는 단백질을 코딩한 서열을 포함한다. 예를 들어, 숙주 게놈에 포스포판테테인 트랜스퍼라제를 코딩한 핵산 분자를 도입할 수 있다(이하에서 설명됨). 내인성 PUFA PKS 시스템에 실행할 수 있는 특별한 변형을 이하에서 상세히 설명된다.
본 발명의 다른 양태에서, 유전적 변형은 (1)PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적인 활동을 가진 아미노산 서열을 코딩한 재조합 핵산 분자의 도입; 및/또는 (2)PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질 또는 기능적 도메인을 코딩한 재조합 핵산 분자의 숙주로의 도입을 포함한다. 숙주는 다음을 포함할 수 있다: (1) PKS 시스템을 발현하지 않되, PKS 시스템의 모든 기능적 도메인이 숙주 세포로 도입된, 여기서 적어도 하나의 기능적 도메인은 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 숙주; (2) (내인성 또는 재조합으로) 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 기능적 도메인을 가진 PKS 시스템을 발현하되, 도입된 재조합 핵산 분자가 적어도 하나의 추가 비박테리아 PUFA PKS 도메인 또는 숙주의 PSK 시스템의 활성에 영향을 미치는 다른 단백질 또는 도메인을 코딩하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포; (3) (내인성 또는 재조합으로) 비박테리아 유래의 도메인을 기능을 필수적으로 포함하지 않은 PKS 시스템을 발현하되, 도입된 핵산 분자는 비박테리아 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 기능적 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포. 즉, 본 발명은 유전적으로 변형된 유기체(예, 미생물 또는 식물)를 포함하되, 상기 유기체는 (내인적 또는 재조합 변형에 의해 도입된) 적어도 하나의 비박테리아의 PUFA PKS 도메인 기능을 포함하며, 상기 유전적 변형은 유기체가 기능적 PKS 시스템을 포함할 때 비박테리의 PUFA PKS 도메인 기능 또는 PKS 시스템에 측정할 수 있는 영향을 미친다.
본 발명은 본 발명에서 기술된 PUFA PKS 시스템을 위한 가능한 숙주 세포로서 및/또는 본 발명에서 기술된 유전적 변형 및 방법에 이용되는 PUFA PKS 시스템 단백질 및 도메인을 코딩하는 추가의 유전적 물질을 위한 원천으로서 가능한 많은 비박테리아 및 박테리아의 미생물을 포함한다. 예를 들어, 실시예 1에서 설명되고 본 발명자들에 의해 발견된 트라우스토카이트리움 미생물과 같은 스키조카이트리움에서 발견된 것과 유사한 PUFA PKS 시스템을 가진 미생물 유기체가 (미국특허출원 제10/124,800에 대응되는) 미국특허공개 제20020194641호에 자세히 기술된, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템을 가진 다른 비박테리아의 미생물을 동정하기 위한 방법에 따라 용이하게 동정/분리/스크리닝될 수 있다.
본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템을 스크리닝하기에 바람직한 타입의 미생물을 수집할 수 있는 장소로는 다음을 포함한다: 저산소 환경((필터 통과 유기체를 포함한)미생물 또는 미생물을 포함한 음식물을 소비하는 무척추동물의 위장을 포함한, 저산소 환경에 가까운 장소, (민물, 염수와 해수를 포함한) 무산소 또는 저산소의 수상 서식지 및 대양의 저산소 또는 저산소에 가까운 환경(영역). 상기 미생물 균주는 무기성 생물로만 적합하기보다는 호기성과 저산소 또는 산소가 결핍된 환경 모두에서 적응해 생존하는 것이 바람직하다. 호기성과 저산소 또는 산소가 결핍된 환경을 모두 가진 토양 환경은, 특히 수상 서식지 또는 일시적 수상 서식지에 있는 토양은 상기 유기체를 발견할 수 있는 탁월한 환경일 것이다.
본 발명에 따라 숙주로서 및/또는 PUFA PKS 유전자의 원천으로 사용하기 위하여 스크리닝될 특히 바람직한 비박테리아의 미생물 균주는 생존 주기 중의 일부 동안에 파고사이토시스, 파고트로피시스(phagotrophic) 또는 엔도사이토시스 능력과 같은 메커니즘에 의해 전체 박테리아 세포를 소비(bacterivory)할 수 있고/거나 생존 주기 중에 아메바 단계 또는 프로토플라스토로서 존재하는 단계를 가지는(조류, 진균(효모), 프로토조아 또는 원생생물로 이루어진 그룹으로부터 선택된) 균주일 것이다. 이러한 영양물 섭취 방법은 실수가 발생한다면, 박테리아의 PKS 시스템을 진핵 세포로 전달할 가능성을 증가시키고 박테리아의 세포(또는 이의 DNA)는 소화되지 않고 기능적으로 진핵 세포로 통합된다.
본 발명에서는 PUFA PKS 유전자(이에 의해 코딩된 단백질과 도메인)의 공급원으로서 본 발명에서 기술된 것 이외의 PUFA PKS 시스템을 포함하는 임의의 트라우스토카이트리드를 포함한다. 그러한 트라우스토카이트리드에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 트라우스토카이트리움, 자포노카이트리움, 아플라노카이트리움, 트라우스토카이트리아시애 및 라비린툴라 내의 엘리나 및 스키조카이트리움, 라빌린툴로이드 및 라빌린툴라시애 내의 라빌린토믹사를 포함한 속을 포함한 트라우스토카이트리아세 및 라빌린툴라시애 과에 있는 임의의 미생물을 포함한 트라우스토카이트리얼 목의 미생물을 포함한다. 상기 속 내의 바람직한 종은 이에 제한되는 것은 아니지만, 라빌린툴라 sp., 라비린툴라 알게리엔시스, 라비린툴라 시엔콥스키, 라비린툴라 샤토니, 라비린툴라 코엔카이시스티스, 라비린툴라 마크로시스티스, 라비린툴라 마크로시스티스 아틀란티카, 라비린툴라 마크로시스티스 마크로시스티스, 라비린툴라 마그니피카, 라비린툴라 미누타, 라비린툴라 로스코펜시스, 라비린툴라 발카노비, 라비린툴라 비텔리나, 라비린툴라 비텔리나 파시피카, 라비린툴라 비텔리나 비텔리나, 라비린툴라 좁피를 포함한 라비린툴라 내의 모든 종들; 라비린툴로이데스 sp., 라비린툴로이데스 미누타, 라비린툴로이데스 스키조카이트로프스를 포함한 모든 라비린툴로이데스 종; 라비린토믹사 sp., 라비린토믹사 폴리아, 라비린토믹사 사우바게유를 포함한 모든 라비린토믹사 종, 아플라노카이트리움 sp. 와 아플라노카이트리움 케르구엘렌시스를 포함한 모든 아플라노카이트리움 종; 엘리나 sp., 엘리나 마리살바, 엘리나 시노리피카를 포함한 모든 엘리나 종; 자파노카이트리움 sp., 자파노카이트리움 마리눔을 포함한 모든 자파노카이트리움 종; 스키조카이트리움 sp., 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔, 스키조카이트리움 미누툼, 스키조카이트리움 옥토스포룸을 포함한 모든 스키조카이트리움종; 트라우스토카이트리움 sp., 트라우스토카이트리움 아그레가툼, 트라우스토카이트리움 아루디멘탈레, 트라우스토카이트리움 오레움, 트라우스토카이트리움 벤티콜라, 트라우스토카이트리움 글로버섬, 트라우스토카이트리움 킨네이, 트라우스토카이트리움 모티븀, 트라우스토카이트리움 파카이더문, 트라우스토카이트리움 프로리페움, 트라우스토카이트리움 로제움, 트라우스토카이트리움 스트리아툼, 울케니아 sp., 울케니아 미누타, 울케니아 프로펀다, 울케니아 라디에이트, 울케니아 사카리아나 및 울케니아 비수르젠시스를 포함한 트라우스토카이트리움 종.
이론과 상관없이 본 발명자들은 라비린툴라시애가 PUFA PKS 유전자를 보유하는 것으로 공지된 트라우스토카이트리아세와 밀접하게 관련되어 있고, 라비린툴라시애는 박테리오보로스/파고사이토시스 하는 것으로 공지되어 있고, 라비린툴라시애의 일부 멤버는 PUFA PKS 시스템 가진 것과 일관된 지방산/PUFA 프로필을 가지고 있기 때문에 라비린툴라와 다른 라비린툴라시애를 PUFA PKS 유전자의 공급원으로 간주한다.
(특히, 파고사이토시스 또는 엔도사이토시스에 의해) 박테리오보리를 할 수 있는 (트라우스토카이트리드의 멤버가 아닌)미생물 균주는 (예시의 속에 포함되지만 이에 제한적이지는 않은) 다음 미생물의 부류에서 발견될 수 있다:
( Stramenopiles 를 포함한) 조류 및 이와 유사한 미생물에서: 유글레노파이시애 부류 (예, 유글레나속과 페라네마속), 크라이소파이시애 부류(예, 오크로모나스속), 디노브라이아시애 부류 (예, 디노브라이온, 플라타이크라이시스와 크라이소크로물리나속), (크라이데코디늄, 짐노디늄, 페리디늄, 세라티움, 자이로디늄 및 옥시르피스속을 포함한) 디노파이시애 부류, 크립토파이시애 (예, 크립토모나스와 로도모나스속), 크산토파이시애 부류 (예, 올리스토디스쿠스속)(그리고 아메바의 단계가 편모충 리조클로리다시애에서처럼 존재하는 조류의 형태 및 아파노캐트 파스케리, 부밀레리아스티게오클로늄과 바우케리아 제미나타의 유주자/배우자(gamete)을 포함한), 유스티가토파이시애 부류, (프라임네슘과 디아크로네마속을 포함한) 프라임네시오파이시애 부류.
Stramenopiles 에서 다음을 포함한다: 프로테로모나드, 오팔린, 데벨로파옐라, 디프로포리, 라빌린툴로이드, 트라우스토카이트리드, 비코세키즈, 우마이세트, 하이포크라이크리디오마이세트, 코마티온, 레티쿨로스패라, 펠라고모나스, 펠라포코쿠스, 올리콜라, 아우레코쿠스, 파라레스, 라피디오파이트, 사이누리드, 리조크로물리날레스, 페디넬알레, 딕티오칼레스, 크라이소머리달레스, 사르시노크라이시달레스, 하이드루랄레스, 히버디알레스 및 크로물리날레스.
진균류에서: 믹소마이세트 부류 (점액 아메바 형태) -- 점균류, 아크라시애목(예, 사피니아 속)을 포함한 아크라시애 부류, 구툴리나시애(예, 구툴리노프시스와 구툴리나속) 부류, 딕탁이스텔리아시애(예, 아크라시스, 딕타이오스텔륨, 폴리스폰딜륨 및 코에노니아 속) 부류, 크라이트리디알레스, 안크라일리스탈레스, 블라스토클라디알레스, 모노블레파리달레스, 사프로레그니알레스, 페로노스포랄레스, 무코랄레스 및 엔토모프톨라레스 목을 포함한 피코마이세스 부류.
프로토조아에서: (파고사이토시스를 포함한) 박테리오보리를 할 수 있는 생존 단계를 가진 프로토조아 균주가 섬모충, 편모충, 아메바로 분류된 타입으로부터 선택될 수 있다. 섬모충 프로토조아는 코노트리크, 콜포디드, 카이르토포레스, 합토리드, 카리오렐릭트, 올리고하이메노포, 폴리하이메노포(스피로트리크), 프로스토메스와 숙토리아 그룹을 포함한다. 편모충 프로토조아는 비오속시드, 보도니스, 세르코모나드, 크라이소파이트(예를 들면 안소파이사, 크립사아메바, 크립토패렐라, 덴드로모나스, 디노브라이온, 말로모나스, 오크로모나스, 파라파이소모나스, 포테리오우크로모나스, 스푸멜라, 신크립타, 시누라 및 우로글레나 속), 콜라 플라겔레이트, 크립토파이트(예로 들면 킬로모나스, 크립토모나스, 시아노모나스 및 고니오모나스 속), 디노플라겔레이트, 디플로모나드, 유글레노이드, 헤테롤로보새, 페디넬리드, 펠로비온트, 팔란스테리드, 슈도덴드로모나드, 스폰고모나드 및 볼보칼레스 (그리고 아토디스쿠스, 클라우트리아비아, 헬케시마스틱스, 카사블레파리스 및 멀티실라의 지정되지 않은 편모충 속을 포함한 다른 편모충)를 포함한다. 아메바 프로토조아는 악티노파이리드, 센트로헬리드, 데스모토리시드, 디플로파이리드, 움아메바, 헤테로보새, 렙토믹시드, 뉴클레아리드 필로세 아메바, 펠레비온트, 테스타테 아메바 및 밤파이렐리드를 포함한다(그리고 짐노프리스, 비오믹사, 마이크로코미드, 레티클로믹사, 벨로노시스티스, 엘래오르하니스, 알레오그로미아, 그로미아 또는 라이버쿠니아의 지정되지 않은 아메바 속을 포함한다). 프로토조아 목은 퍼콜로모나대, 헤테롤로보새, 라이로모나대, 슈도실리아타, 트리코모나대, 하이퍼마스티개, 헤테로미테애, 텔로네매, 카이아토보도내, 에브리대, 피토믹새, 오팔리내, 카네토모나대, 헤미나스티개, 프로토슬레래, 믹사가스트래, 딕토이오스텔래, 코아노모나대, 아피코모나대, 에오그레가리내, 네오그레가리내, 코엘로트롤패, 유코키대, 해모스포래, 피로플라스매, 스피록트리캐, 프로스토마태, 리토스토마태, 필로파린개, 나소포래, 올리고하이메노포래, 콜포대, 카이로레릭타, 뉴클레오헬, 센트로헬래, 아칸타래야, 스티코론캐, 폴리시스티내, 패오다래, 로보새, 필로새, 아탈라매, 모노탈라매, 폴리탈라매, 섹노파이오포래, 스키조클라대, 홀로새, 엔트아메바, 믹소포래, 악티노믹새, 할로스포래, 파라믹새, 롬보조아 및 오르소넥태를 포함한다.
본 발명의 바람직한 양태는 앞서 나열된 바람직한 서식지 중 하나로부터 수집된 상기된 미생물의 균주를 포함한다.
본 발명의 방법의 몇 가지 양태에서 박테리아의 PUFA PKS 시스템은 (전체 PUFA PKS 시스템, 단백질 및/또는 도메인을 코딩하는) 그의 유전자 및 일부분을 포함하여, 다른 PUFA PKS 시스템(예, 비박테리아의 PUFA PKS 시스템) 및/또는 본 발명의 양태에서 동일한 (또는 그와는 다른) 것을 포함한 미생물을 유전적으로 변형시키는데 사용할 수 있다. 한 측면에서, 유전적으로 변형된 미생물(예, 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드)을 생성하는데 특히 유용할 것으로 예상되는 신규한 PUFA PKS 시스템 및/또는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물과 식물 및 방법에서 유용한 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 신규한 하이브리드 작제물을 박테리아에서 동정할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명에 따른 양태에서 특히 유용한 박테리아는 PUFA PKS 시스템을 가지되, 상기 PUFA PKS 시스템은 약 20℃이상, 바람직하게는 25℃이상, 보다 더 바람직하게는 30℃이상에서 PUFA를 제조할 수 있다. 전술된 미국특허 제 6,140,486호에서 개시된 해양 박테리아인 쉐와넬라와 비브리오 마리누스는 더 높은 온도에서 PUFA를 제조하지 않아 이러한 박테리아로부터 유래된 PUFA PKS 시스템의 실용성은, 특히 필드(field)의 조건하의 식물에 적용할 때, 제한된다. 따라서 한 양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 박테리아가 더 높은 온도(예로 들면 약 15℃, 20℃, 25℃ 또는 30℃ 또는 그 이상)에서 성장과 PUFA 제조할 수 있는 PUFA PKS 시스템을 가진 박테리아를 동정하는데 이용될 수 있다. 그러나 박테리아 원천이 상기 높은 온도에서 잘 성장되지 않고/PUFA를 제조하지 못할지라도, 본 발명은 상기 박테리아 유래의 PUFA PKS 시스템이 약 15℃, 20℃, 25℃ 또는 30℃ 또는 그 이상의 온도에서 효소/생물학적 활성을 가지고 있는 한, 상기 PUFA PKS 시스템(유전자 및 이에 의해 코딩된 단백질/도메인)의 동정, 분리 및 이용을 포함한다. 본 양태의 다른 측면에서 (항진균성의) 나이스틴(nystatin), 또는 사이클로헥시미드(cycloheximide: 진핵세포의 단백질 합성 억제제)와 같은 진핵생물의 성장의 억제제가 해양 또는 하구와 같은 타입의 서식지/적소 또는 상기 박테리아가 발견될 수 있는 다른 서식지에서 수집된 물 샘플/토양 샘플 유래의 초기 균주를 배양하고/선택하는데 이용되는 아가 플레이트에 첨가될 수 있다. 이러한 과정은 진핵의 균주의 오염 없이 (또는 최소화된 오염으로) 박테리아 균주를 풍부하게 선택할 수 있게 한다. 상기 선택 과정은 상승된 온도 (예, 30℃)에서 플레이트를 배양하고 적어도 하나의 PUFA를 제조하는 균주를 선택하는 것과 조합되어져, (약 20℃이하, 보다 바람직하게는 약 5℃이하의 낮은 온도에서만 PUFA 제조를 보여주는 이전의 박테리아의 균주와는 달리) 상승된 온도에서 작동하는 PUFA PKS 시스템을 가진 후보 박테리아 균주를 동정할 것이다.
그러나 높은 온도에서 잘 자라지 않는(또는 전혀 자라지 않는) 박테리아 또는 높은 온도에서 저어도 하나의 PUFA를 제조하지 않는 박테리아에서, 상기 균주는 임의의 조건에서 PUFA를 제조하는 박테리아의 능력을 동정하고/거나 박테리아 또는 비박테리아의 유기체에서 유래된 다른 공지된 PUFA PKS 유전자와 상동성을 가진 유전자에 대하여 상기 박테테리아의 게놈을 스크리닝함으로써 PUFA PKS 시스템을 포함하는 것으로써 동정되고 선택될 수 있다(실시예 7 참조). 임의의 박테리아의 원천에서 유래된 PUFA PKS 기능을 평가하기 위하여 세포가 제거된 추출물을 제조하고 다양한 온도에서 PUFA 제조 여부에 대하여 테스트한 후, 이어서 높은 온도(예, 15℃, 20℃, 25℃ 또는 30℃ 또는 그 이상)에서 효소의/생물학적 활성을 가진 PUFA PKS 유전자를 포함한 미생물을 선택할 수 있다.
유전적 변형을 위한 숙주로 사용하기에 적합한 박테리아는 앞서 기술된 모든 박테리아의 균주를 포함한다. 특히 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 서열과 유기체의 제조를 위한 PUFA PKS 유전자(그리고 이에 코딩된 단백질과 도메인)의 원천으로 사용하기에 적합한 박테리아는 PUFA PKS 시스템을 포함하는 박테리아를 포함한다. 이러한 박테리아는 전형적으로 바다 또는 하구의 서식지로부터 분리되고, PUFA를 제조하는 능력에 의해 및/또는 상기 유기체내에 공지된 PUFA PKS 유전자와 상동성을 가진 적어도 하나 이상의 유전자의 존재에 동정될 수 있다. 이러한 박테리아는 이에 제한되는 것은 아니지만, 쉐와넬라 및 비브리오 속의 박테리아를 포함한다. 본 발명에 사용하기 바람직한 박테리아는 높은 온도(예, 15℃, 20℃, 25℃ 또는 30℃ 또는 그 이상)에서 생물학적으로 활성인 PUFA PKS 시스템을 가진 것을 포함한다. 본 발명자들은 PUFA PKS 유전자의 원천으로 사용하기에 특히 적합할 두 개의 예시적인 박테리아(예, 쉐와넬라 올레야냐 및 쉐와넬라 자포니카; 실시예 7 및 8 참조)를 동정하였고, 다른 박테리아가 용이하게 동정될 수 있고 PUFA PKS 유전자를 포함한 것으로 공지되어 있으며 본 발명의 한 양태(예, 쉐와넬라 겔리디마리나)에서 유용할 것이다.
추가로, 모든 박테리아 또는 비박테리아의 미생물이 천연의 서식지에서 용이하게 배양될 수 있는 것은 아니다. 그러나 이와 같이 배양할 수 없는 미생물의 유전자적인 특징은, 혼합된 또는 천연 그대로의 샘플로부터 엔 매스(en mass) 준비한 DNA로부터 유전자를 분리함으로써 평가될 수 있다. 본 발명에 특히 적합한 배양할 수 없는 미생물로부터 유래된 PUFA PKS 유전자는 공지된 PUFA PKS 유전자에 있는 높은 상동성의 영역을 매치하도록 일반적으로 고안된 프라이머를 사용하여 디제너러티브(degenerative) PCR함으로써 환경적(environmental) DNA 샘플로부터 분리될 수 있다(예, 실시예 7 참조). 대안으로는, DNA 단편의 전체가 당업계에 공지된 몇 가지 방법에 의해 정제된 환경적 DNA로부터 클로닝될 수 있다. 이렇게 입수된 DNA 단편의 서열은 PUFA PKS 유전자와 같은 공지된 유전자에 상동성을 밝혀줄 수 있다. OrfB 와 OrfC (예를 들면, 스키조카이트리움 과 트라우스토카이트리움의 도메인 구조를 참조하여)의 상동체가 PUFA PKS 최종 생산물을 정의하는데 특히 유용할 것이다. PUFA PKS 유전자의 전체 코딩 영역들은 상호간 또는 공지된 PUFA PKS 유전자와 함께 또는 유전자 단편의 조합물와 조합으로 숙주 유기체(예, 대장균 또는 효모)에서 발현되어 PUFA 제조에 미치는 이들의 영향을 평가할 수 있다. 전술된 바와 같이, 세포가 제거된 추출물에서의 활성이 목적한 온도에서 기능을 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 분리된 PUFA PKS 유전자가 적절한 스키조카이트리움 또는 기능을 측정하기에 적합한 균주로 직접적으로 형질전환될 수 있다. 이러한 방식으로 동정 또는 제조된 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 작제물은 하이브리드 작제물을 포함하여, 식물과 같은 다른 유기체를 형질전환시키는데 이용할 수 있다.
따라서, 예를 들어 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템 뿐만 아니라 박테리아의 PUFA PKS 시스템과 PKS 시스템을 사용하는 것과 같이, 본 발명에 따른 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 사용한 유전자의 혼합은 (하기에서 상세히 설명되는) EPA, DHA, ARA, GLA, SDA 등을 포함한 PUFA 생산물 범위를 확장할 뿐만 아니라 항생제, 다른 약제학적 화합물 및 다른 적합한 생산물을 포함한 광범위한 생활성 분자를 제조하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 생활성 분자를 수득하기 위한 방법은 다양한 유기체로부터의 유전자를 혼합하는 것 뿐만 아니라 본 발명에서 기술된 비박테리아의 PUFA PKS 유전자를 유전적으로 변형하는 다양한 방법도 포함한다. 본 발명에 따른 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 유전적 기초와 도메인 구조에 관한 지식은 다양한 생활성 분자를 제조하는 신규한 유전적으로 변형된 유기체를 고안하는 기초를 제공한다. PKS 도메인 및 관련된 유전자의 혼합과 변형이 본 발명자들에 의해 고려되었지만, 예시를 통해, PUFA-PKS 시스템의 다양한 가능한 조작이 유전적 변형과 대생물 분자 제조와 관련하여 하기에서 상세히 설명된다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 기능적 도메인의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 유기체에서 적어도 하나의 핵산 서열을 유전적으로 변형시키고/거나 그러한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 발현시킴으로써 미생물 또는 식물의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법을 포함한다. 그러한 서열의 다양한 양태, 유기체를 유전적으로 변형시키는 방법 및 특정한 변형이 앞서 기술되었다. 전형적으로 상기 방법은 특히 생활성 분자를 제조하는 유전적으로 변형된 유기체를 제조하는데 이용된다.
본 발명의 한 양태는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물에 관한 것으로, 상기 미생물은 내인성 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케티드 신타제(PKS) 시스템을 가지되, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 변형되지 않은 트라우스토카이트리드 미생물과 비교하였을 때 미생물에 의한 다중불포화 지방산(PUFA)의 발현 프로필을 변이시키기 위해 유전적으로 변형된 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 숙주 유기체로서 유용한 트라우스토카이트리드 미생물은 내생적으로 PUFA PKS 시스템을 가지며 발현한다. 유전적 변형은 내인성 PUFA PKS 시스템의 하나 이상의 기능적인 도메인의 유전적 변형일 수 있으며, 이로써 상기 변형은 내인성 PUFA PKS 시스템의 PUFA 제조 프로필을 변이시킨다. 추가로 또는 대안으로 유전적 변형은 미생물로의, 적어도 하나의 외인성 핵산 서열(예, 재조합 핵산 분자)의 도입일 수 있는데, 여기서 상기 외인성 핵산 서열은 제 2의 PKS 시스템에서 유래된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인 또는 단백질 및/또는 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질(예, 포스포판테테인 트랜스퍼라제(PPTase))을 코딩한다. 상기 제 2의 PKS 시스템은 다른 PUFA PKS 시스템을 포함한 그리고 유전적으로 변형될 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템 유래의 유전자의 상동체를 포함한 임의의 PKS 시스템일 수 있다.
본 발명의 이러한 양태는 본 발명자들에 의한 PUFA가 풍부한 리피드(멤브레인 관련 포스포리피드(PL) 뿐만 아니라 트리아실글리세롤(TAG))를 효과적으로 제조하는 유전적으로 변형된 미생물 및 방법의 개발을 통하여 EPA와 같은 목적한 PUFA가 풍부한 상업적으로 가치있는 리피드의 제조에 특히 유용하다.
본 발명의 이러한 특정 양태는 다음 지식으로부터 일부 유추된 것이다:(1) 선택된 미생물, 특히 본 발명에서 기술된 상업적으로 개발된 스키조카이트리움 균주와 트라우스토카이트리드의 내재된 TAG 제조 능력의 활용; (2) 진핵세포, 트라우스토카이트리얼 목의 멤버에서의 PUFA PKS 생합성 경로(즉, PUFA PKS 시스템)에 대한 본 발명자들의 상세한 이해; (3)스키조카이트리움에서의 상동성의 유전적 재조합 시스템의 활용. 관련된 본 발명자들의 시스템에 대한 지식을 기반으로 하여, 동일한 일반적 방식이 EPA가 아닌 PUFA를 제조하기 위하여 개발될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 정상적으로 DHA 및 DPA를 제조하는 PUFA PKS 효소를 코딩하는 스키조카이트리움 유전자와 같은 내인성 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 유전자가 무작위적 또는 표적 돌연변이에 의해 변형되거나, 다른 유기체(예, 박테리아 또는 다른 원천)에서 유래된 상동성의 PKS 단백질을 코딩하는 유전자로 대체되거나, 유전적으로 변형된 스키조카이트리움, 트라우스토카이트리움 또는 다른 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 유전자로 대체된다. 이렇게 도입 및/또는 변형된 유전자에 의해 코딩된 효소의 생산물은 예를 들면 EPA이거나, 다른 PUFA를 포함한 다른 관련된 분자일 수 있다. 이러한 방법의 한 특징은 PUFA의 효율적인 제조 및 PUFA의 PL과 TAG로으로의 통합에 필수적인 트라우스토카이트리드 PUFA 합성의 내인성 요소와 축적 기구들을 활용하는 것이다. 특히, 본 발명의 이러한 양태는 유기체에 의해 제조되는 PUFA의 타입에 변형을 지시하지만, 부모 균주에 의한 높은 오일 제조를 유지한다.
하기 일부 설명은 예시적인 숙주 유기체로서 유기체 스키조카이트리움을 사용하지만, 트라우스토카이트리움, 라비린툴로이데스 및 자포포노카이트리움 속의 멤버를 포함한 임의의 트라우스토카이트리드가 본 발명에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 트라우스토카이트리움 PKS 유전자가 스키조카이트리움과 같은 다른 트라우스토카이트리드의 내인성 PUFA PKS 유전자를 변형시키는데 이용될 가능성이 높지만, 트라우스토카이트리움 종과 관련하여 PUFA PKS 시스템을 코딩한 유전자가 동정되었고(실시예 6 참조), 상기 유기체는 본 발명에서 기술된 방법을 사용하여 유전적 변형을 위한 숙주 유기체로 사용될 수 있다. 더 나아가, 미국특허출원 제10/124,800호에서 개시된 바와 같이 유기체를 스크리닝하는 방법을 사용하여 본 방법에 유용한 유기체를 동정할 수 있고, 그러한 유기체는 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 한 양태는 다음과 같이 예시될 수 있다. 일례로 스키조카이트리움에서의 PUFA 합성과 축척에 대한 본 발명자들의 현재의 이해를 기반으로 하여 전반적인 생화학 과정은 세 부분으로 나뉠 수 있다.
첫 번째, 스키조카이트리움 오일 (DHA 와 DPA)로 축적한 PUFA는 상기된 PUFA PKS 시스템의 생산물이다. 스키조카이트리움에서 PUFA PKS 시스템은 말로닐-CoA를 상당량의 중간체 화합물의 방출 없이 최종 생산물인 PUFA로 전환시킨다. 스키조카이트리움에서 PUFA의 실제적인 합성에 필요한 것으로 알려진 효소의 도메인 모두를 코딩하는 세 개의 유전자(Orfs A, B 및 C; 또한 서열번호: 1, 서열번호: 3 및 서열번호: 5로 각각 나타내었다)가 동정되었다. (효소 도메인의 상동성 세트를 포함한 단백질을 코딩하는) 유사한 유전자 세트가 클로닝되었고 PUFA를 제조하는 다른 비진핵의 유기체, 즉 몇 개의 해양 박테리아 균주로부터 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 (이하에서 상세히 설명되는) 적어도 하나의 다른 해양 원생생물(트라우스토카이트리움 계통 23B)의 PUFA PKS 유전자를 동정하고 서열분석하였다.
해양 박테리아의 PUFA 생산물은 (미국특허 제6,140,486호; 미국특허 제6,566,583호에 개시된)(지금은 모리텔라 마리나로 알려진 비브리오 마리누스에 의해 제조되는) DHA 뿐만 아니라 (예를 들어, 쉐와넬라 SRC2738과 포토박터 프로펀듐에 의해 제조되는) EPA를 포함한다. 발효 조건에서 제조 유기체(예, 스키조카이트리움)의 생리학적 성장 요구조건이 충족되는 한, 임의의 PUFA PKS 유전자 세트는 본 발명의 실시예에서 기술된 스키조카이트리움 유전자를 대신하도록 구상될 수 있다는 것이 본 발명의 한 양태이다. 특히, 상기된 PUFA-제조 박테리아의 균주가 비교적 낮은 온도(일반적으로 20℃이하)에서만 성장하며, 이는 추가로 이들의 PUFA PKS 유전자 생산물이 스키조카이트리움의 표준 성장 온도(25-30℃)에서는 기능을 하지 않을 것임을 시사한다. 그러나 본 발명자들은 최근에 스키조카이트리움 및 다른 트라우스토카이트리드(실시예 7 참조)의 표준 성장 온도에서 성장하고 EPA를 제조하는 적어도 두 개의 다른 해양 박테리아를 확인하였다. 상기 대체 해양 박테리아는 본 발명에서 기술된 방법에 의해 스키조카이트리움 및 다른 트라우스토카이트리드의 변형을 위한 재료로 사용될 수 있는 PUFA-PKS 유사 유전자를 보유한 것으로 여겨진다. 따라서 현재 연구되지 않거나 동정되지 않은 PUFA-제조 박테리아가 트라우스토카이트리드의 변형에 유용한 PUFA PKS 유전자를 또한 포함할 수 있음이 당업자에는 자명할 것이다.
두 번째, PUFA 합성에 직접적으로 관련된 효소를 코딩하는 유전자 외에 "보조" 효소가 필요하다. 유전자는 포스포판테테인 트랜스퍼라제(PPTase)를 코딩하고 이는 PUFA PKS 복합체에 존재하는 아실-캐리어 단백질(ACP) 도메인을 활성화한다. 이러한 보조인자의 추가에 의한 ACP 도메인의 활성화는 PUFA PKS 효소 복합체가 기능을 발휘하는데 필요하다. 지금까지 확인된 PUFA PKS 시스템의 모든 ACP 도메인이 높은 수준의 아미노산 서열 보존성을 보임에 따라 이론에 관계없이, 본 발명자들은 스키조카이트리움과 다른 트라우스토카이트리드의 PPTase가 다른 PUFA PKS 시스템의 ACP 도메인을 인식하고 활성화할 것으로 예상한다. 이종의 PPTases와 PUFA PKS 유전자가 PUFA 생산물을 제조하기 위해 같이 기능한다는 원칙의 증거로, 본 발명가들은 스키조카이트리움 유래의 PUFA PKS 유전자와 두 가지 상이한 이종성 PPtase를 이용하여 박테리아의 숙주세포에서 PUFA를 제조하는 것을 증명한다.
세 번째로, 스키조카이트리움에서 PUFA PKS 시스템의 생산물은 효과적으로 포스포리피드(PL)와 트리아실글리세롤(TAG) 모두로 보내진다. 본 발명자들의 데이터는 PUFA가 PKS 복합체의 ACP 도메인으로부터 조효소A(CoA)로 전달되었다는 것을 보여준다. 다른 진핵의 유기체에서, 상기 아실-CoA는 PL 과 TAG 분자를 형성하는 다양한 아실-트랜스퍼라제의 기질로서 작용한다. 대조적으로, 상기 데이터는 박테리아에서는 CoA로의 전달이 일어나지 않으며; 오히려 PKS 복합체의 ACP도메인으로부터, PL을 형성하는 아실-트랜스퍼라제로의 직접적인 전달이 있었다. PUFA를 ACP로부터 CoA로 전달하는 스키조카이트리움의 효소 시스템은 DHA와 DPA 모두를 인식할 수 있고, 그래서 본 발명가들은 (PUFA PKS ACP 도메인에 부착된) PUFA PKS 시스템의 PUFA 생산물이 기질로서 작용하는 것은 예측할 수 있다고 여긴다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 본 발명자들은 PUFA PKS 효소 복합체의 성분(첫번째 부분)를 코딩하는 유전자를 변이시키는 한편, 스키조카이트리움 또는 다른 트라우스토카이트리드 숙주 유래의 내인성 PPTase(두번째 부분) 및 PUFA-ACP에서 PUFA-CoA로의 트랜스퍼라제 활성 및 TAG/PL 합성 시스템(또는 내인성 PUFA ACP 내지 TAG/PL 메카니즘)(세번째 부분)을 활용할 것을 제안한다다. 본 발명에 따른 이러한 방법은 실험 데이터에 의해 지지되고, 이의 일부분은 실시예 부분에서 자세히 설명된다.
첫 번째, 본 발명자들은 PUFA PKS 시스템이 유기체간에 전달될 수 있고, 일부분은 상호교환적임을 발견하였다. 특히, 앞에서 전술한 것 같이 쉐와넬라 SCR2738 (Yazawa, 1996, lipids 31:S297-300)와 비브리오 마리누스(쉐와넬라의 PPTase와 더불어)(미국특허 제6,140,486호) 같은 해양 박테리아의 PUFA PKS 경로가 이종의 숙주(즉, 대장균)에 성공적으로 전달될 수 있다는 것을 앞서 보여주었다. 또한, 상기 두 가지 유기체(쉐와넬라 SCR2738과 비브리오 마리누스)에서 유래된 PUFA PKS 효소의 서브유니트 간의 구조적 상동성의 정도는 두 시스템의 유전자를 혼합하고 매치하는 것이 가능할 정도이다(미국특허 제6,140,486호). 혼합된 유전자의 세트의 PUFA 최종 생산물은 특정한 유전자 상동체의 기원에 따라 달라진다. 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임(쉐와넬라의 Orf7 및 이의 비브리오 마리누스 상동체; 미국특허 제6,140,486호의 도 13 참조; 상기 Orf의 명명법이 달라졌음을 주목; 상기 특허에서는 Orf8로 표기되었지만, Genbank에 Orf7로 제출되어, GenBank에 의해 그와 같이 지칭된다)이 DHA 또는 EPA가 복합적인 시스템의 생산물이 될지를 결정하는 것과 연관될 수 있다. 지금까지 동정된 모든 PUFA PKS 효소의 기능성 도메인은 서로 서열 상동을 보여준다. 이와 유사하게, 상기 데이터는 해양 박테리아에서 유래된 PUFA PKS 시스템을 포함한 시스템이 스키조카이트리움과 다른 트라우스토카이트리드로 전달되고, 기능할 수 있음을 보여준다.
본 발명자들은 대장균에서 스키조카이트리움 유래의 PUFA PKS 유전자 (Orfs A, B 및 C)를 발현하고, 상기 세포는 스키조카이트리움의 이러한 PUFA의 내인성 제조와 거의 동일한 비율로 DHA와 DPA를 만든다는 것을 증명했다(실시예 2 참조). 따라서 재조합 스키조카이트리움 PUFA PKS 유전자가 기능성의 PUFA 합성 시스템을 코딩한다는 것이 증명되었다. 또한, 트라우스토카이트리움 23B OrfA 및 OrfC 유전자의 전부 혹은 일부가 스키조카이트리움에서 기능을 발휘한다는 것을 보여주었다(실시예 6 참조).
두 번째, 본 발명자들은 PPTase가 이종의 PUFA PKS ACP 도메인을 활성화시킬 수 있는 것을 이전에 발견했다. 비브리오 마리누스의 PUFA PKS 유전자로 형질전환된 대장균에서의 DHA의 제조는 적절한 (이 경우에는 쉐와넬라 SCRC2738 유래의) PPTase 유전자가 존재할 때에만 일어난다(미국특허 제6,140,486호). 이는 쉐와넬라 PPTase가 비브리오 PUFA PKS ACP 도메인을 활성화시킬 수 있다는 것을 증명하였다. 또한, 본 발명자들은 바실루스 섭틸러스의 PPTase(sfp)를 사용한 스키조카이트리움 OrfA 유래 ACP 도메인의 활성화(판테테닐화)를 증명하였다(실시예 2 참조). 본 발명자들은 또한 노스톡에서 유래된 Het I이라 불리는 PPTase에 의한 스키조카이트리움 OrfA 유래 ACP 도메인의 활성화(판테테닐화)를 증명하였다(실시예 2참조). HetI효소는 재조합 스키조카이트리움 PUFA PKS 유전자를 사용하여 대장균에서 DHA와 DPA를 제조하기 위하여 앞서 언급된 실험에서 PPTase로서 사용되었다(실시예 2).
세 번째, 데이터는 DHA-CoA와 DPA-CoA가 스키조카이트리움 TAG 및 PL 합성 경로에서 대사 중간체임을 보여준다. 공개된 생화학 데이터는 박테리아의 경우에 새로 합성된 PUFA는 PUFA PKS ACP 도메인으로부터 직접 포스포리피드 합성 효소로 전달된다는 것을 지지한다. 대조적으로, 본 발명자들의 데이터는 스키조카이트리움, 즉 진핵 유기체의 경우에 PUFA PKS ACP 도메인의 PUFA와 표적 TAG와 PL 분자 사이에 중간체가 있을 수 있다는 것을 암시한다. 진핵의 사이토플라즘에서 지방산의 전형적인 캐리어는 CoA이다. 본 발명자들은 스키조카이트리움 세포의 추출물을 검사하여 DHA-CoA, DPA-CoA, 16:0-CoA와 18:1-CoA의 인증된 기준으로 HPLC 분획 중에 함께 이동하는 수준을 발견했다. DHA-CoA와 DPA-CoA로 추정되는 피크의 동정이 질량 분석기를 사용하여 확인되었다. 이와는 대조적으로 발명자들은 비브리오 마리누스의 추출물에서 DHA-CoA를 검출할 수 없었는데, 이는 박테리아에 최종 목적지로의 PUFA 이동을 위한 다른 메카니즘이 존재한다는 것을 보여준다(예로 들면 PL로의 직접 전달). 상기 데이터는 새로 합성된 PUFA가 (아마도 ACP로부터 CoA로의 직접 전달을 통하여) CoA로 전달되는 메카니즘이 스키조카이트리움에 존재할 것이라는 것을 암시한다. TAG와 PL 합성 효소 모두는 그런 다음 PUFA-CoA에 접근할 수 있다. DHA와 DPA CoA 모두 제조된다는 관측은 효소의 전달 기구가 PUFA의 범위를 인식함을 지지한다.
네 번째, 본 발명자들은 스키조카이트리움에서 OrfA, OrfB 및 OrfC의 녹아웃을 생성하였다(실시예 3 참조).　녹아웃 전략은 스키조카이트리움에 일어나는 것으로 증명된 상동성 재조합에 기초한다(미국특허출원 제10/124,807호). 몇 가지 전략이 녹아웃 작제물의 설계에 도입될 수 있다. 상기 세 가지 유전자를 비활성화하는데 이용되는 특별한 전략은 튜블린 프로모터에(pMON50000에서 유래된, 미국특허출원 제10/124,807호 참조)와 짝을 이룬 Zeocin™ 저항 유전자를 Orf의 클로닝 부분에 삽입하는 것을 활용하는 것이다. 파괴된 코딩 영역을 포함한 새로운 작제물이 입자 사격(particle bombardment)을 통한 야생형 스키조카이트리움 세포의 형질전환에 사용하였다(미국특허출원 제10/124,807호). 이렇게 사격된 세포는 Zeocin™ 과 PUFA 공급을 포함한 플레이트에 도말되었고(하기 참조). 상기 플레이트에서 성장한 콜로니들은 PUFA로 보충되지 않은 Zeocin™ 플레이트 상으로 스트리킹(streaking)되었다. 성장을 위해 PUFA 보충을 필요로 하는 상기 콜로니들은 상동성 재조합을 통하여 PUFA PKS Orf가 비활성화된 후보자이다. 상기된 세 가지 경우에서, 이러한 전제는 각각의 스키조카이트리움 Orf의 전장 게놈의 DNA 클론으로 세포를 형질전환함으로써 녹아웃을 복구함으로써 확인되었다. 추가로, 일부 경우에는 Zeocin™ 저항 유전자가 제거된다는 것이 발견되었는데(실시예 5 참조), 이는 도입된 기능성 유전자가 이중의 상동성 재조합에 의해 원래의 위치로 통합된다는 것(즉, 저항 마커를 결실함)을 의미한다. 이러한 전략의 성공을 위한 핵심은 PUFA로 성장 배지를 보충하는 것이다. 이러한 경우에, 효율적인 보충 수단은 PUFA를 성장 배지에 첨가하기 전에 부분적으로 메틸화된 베타-사이클로덱스트린을 혼합함으로써 격리되게 하는 것임을 발견하였다(실시예 5 참조). 동시에, 상기 실험들은 본 발명에서 제공된 가이드라인에 의해 당업자라면 스키조카이트리움과 같은 PUFA PKS를 포함하는 미생물의 하나 이상의 PUFA PKS 유전자를 불활성화시키고, 본 발명에 따라 추가 유전적 변형을 위해 이용될 수 있는 PUFA 영양요구체를 생성할 수 있는 원리를 증명한다.
본 발명의 유기체의 유전적 변형에 있어서 중요한 요소는 트라우스토카이트리드 게놈을 직접적으로 형질전환시키는 능력이다. 미국특허출원 제 10/124,807호에 단일 크로스오버 상동성 재조합을 통한 스키조카이트리움의 형질전환과 이중 크로스오버 상동성 재조합을 통한 표적화된 유전자 치환이 증명되었다. 상기된 바, 본 발명자들은 스키조카이트리움에 있는 PUFA PKA 시스템의 OrfA, OrfB 및 OrfC를 비활성화시킨 상동성 재조합에서 상기 기술을 이용하였다. 결과적으로 얻는 돌연변이체는 PUFA를 가진 배지의 보충물에 의존적이 되었다. 몇 개의 형질전환 마커, 도입된 유전자의 높은 발현율을 위한 프로모터 요소 및 외인성 유전자 물질의 전달을 위한 방법이 개발되었고 이용 가능하다. 따라서 상기 기술은 트라우스토카이트리드 및 유사한 PUFA PKS 시스템을 가진 다른 진핵에서 내인성 PUFA PKS 유전자를 녹아웃하고 이를 다른 유기체에서 유래된 유전자로 (또는 변형된 스키조카이트리움 유전자로) 대체하는 위치에 이르렀다.
EPA로 풍부한 TAG의 제조를 위한 한 방식에서, 스키조카이트리움의 PUFA PKS 시스템은 EPA 생산물을 제조하는 PUFA PKS를 코딩하는 이종의 유전자를 추가함으로써 치환될 수 있다. 내인성의 PPTase가 이종의 PUFA PKS 시스템의 ACP 도메인을 활성화시킬 것으로 예상된다. 추가로, EPA가 EPA-CoA로 전환되어 스키조카이트리움 TAG와 PL 멤브레인으로 통합될 것으로 예상된다. 이러한 방식의 한 변형에서 기술은 최종 생산물이 DHA와 DPA보다는 EPA이도록 (이종 유전자의 특정 영역의 도입에 의해 또는 스키조카이트리움 유전자 자체의 돌연변이에 의해) 내인성 스키조카이트리움 시스템의 관련 도메인을 변형하는데 사용될 수 있다. 이는 예시적인 방식으로서, 상기 기술은 다른 PUFA의 최종 생산물의 제조 및 PUFA PKS 시스템을 포함하고 PUFA PKS 시스템의 생산물을 포스포리피드(PL)와 트리아실글리세롤(TAG)의 두 가지 모두로 효율적으로 보내는 능력이 있는 진핵의 미생물에 적용될 수 있다. 특히, 본 발명은 하기에서 예시로서 설명되는 트라우스토카이트리드 미생물 또는 내인성 PUFA PKS 시스템을 가진 다른 진핵 생물에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에서 기술된 다양한 PUFA 프로필의 제조를 위하여 변형된 유전 물질로 형질전환될 수 있는 임의의 적합한 숙주 유기체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 실시예에서는 스키조카이트리움의 PUFA PKS 시스템이 대장균으로 형질전환되었다. 이렇게 형질전환된 유기체는 앞서 기술된 방법을 사용하여 PUFA 제조 프로필을 변이시키기 위하여 추가로 변형될 수 있다.
본 발명은 유전자와 본 발명과 미국특허출원 제10/124,800호에 기술된 PUFA PKS 시스템 이외의 PKS 시스템 유래의 단백질 또는 도메인을 코딩하는 유전자 및 핵산서열을 이용할 수 있게 하며, 앞서 기술된 타입 II, 타입 I 및 모듈라 PKS 시스템을 포함한 박테리아 및 비박테리아의 PKS 시스템 유래의 유전자 및 핵산 서열을 포함한다. PKS 시스템의 이러한 타입의 각각을 발현하는 유기체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 유전적 변형 과정에서 유용한 핵산의 원천으로 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, PUFA PKS 시스템 이외의 PKS 시스템 또는 다른 PUFA PKS 시스템으로부터 유래된 단백질 또는 도메인을 코딩하는 유전자와 핵산 서열은 PUFA의 제조에 바람직한 성장 특징을 가진 유기체로부터 분리되거나 추출한 것이다. 특히, 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물을 약 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 40℃ 이상에서 또는 한 양태에서는 약 20℃ 내지 40℃ 사이의 임의의 온도에서 배양할 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 온도에서 기능성 효소 활성을 가진 PKS 단백질 또는 도메인이 바람직하다. 예로 들어, 본 발명자들은 각각 30℃ 및 35℃까지의 온도에서 천연적으로 EPA를 제조하고 성장하는 해양 박테리아인 쉐와넬라 올레야나 또는 쉐와넬라 자포니카에서 유래된 PKS 유전자의 사용을 설명한다(실시예 7). 상기 유기체로부터 유래된 PKS 단백질 또는 도메인은 특별히 고안 또는 변형된 PUFA 제조 프로필을 가진 유전적으로 변형된 유기체를 제조하기 위하여 본 발명에서 기술된 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 단백질 및 도메인과 혼합될 수 있는 단백질 및 도메인의 예시이다.
다른 바람직한 양태에서, 하나의 지방산 프로필을 제조하는 PUFA PKS 시스템에서 유래된 단백질 또는 도메인을 코딩하는 유전자와 핵산 서열은 다른 PUFA PKS 시스템을 변형시키는데 이용되어, 이에 의해 숙주의 지방산 프로필을 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 트라우스토카이트리움 23B(ATCC 20892)는 스키조카이트리움 sp. (ATCC 20888)과 지방산 프로필에 있어서 현격히 다르다. 트라우스토카이트리움 23B는 DHA:DPA(n-6) 비율이 스키조카이트리움(ATCC 20888)의 2-3:1과 비교하였을 때, 40:1로 상당히 높다. 트라우스토카이트리움 23B는 C20:5(n-3)로 역시 높은 수준을 보인다. 그러나 스키조카이트리움 (ATCC 20888)은 트라우스토카이트리움 23B에 비교하였을 때 탁월한 오일 생산자이다. 스키조카이트리움은 도코사펜타엔산과 DHA(DPA;22:5ω6)가 풍부한, 예를 들어 건조 중량으로 30% DHA + DPA인, 다량의 트리아실글리세롤을 축적한다. 따라서 본 발명자들은 트라우스토카이트리움 23B과 보다 유사한 DHA:DPA 프로파일을 가진 유전적으로 변형된 스키조카이트리움을 생성하기 위해서 트라우스토카이트리움 23B PUFA PKS 유전자로 스키조카이트리움 내인성 PUFA PKS 시스템을 변형시키는 것을 설명한다(즉, "초-DHA-생산자" 스키조카이트리움으로, 여기서 스키조카이트리움의 제조 능력이 트라우스토카이트리움의 DHA:DPA 비율과 조합된다).
따라서 본 발명은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템에서 유래된 유전자를 이용하게 하고, 추가로 EPA, DHA, DPA, ARA, GLA, SDA 및 기타를 포함한 PUFA 생산물의 범위를 연장 및/또는 변이시키기 위하여 유전자 혼합을 활용한다. 이와 같이 변이된 PUFA 제조 프로필을 수득하기 위한 방법은 다양한 유기체 유래의 유전자를 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 유전자로 혼합하는 것뿐만 아니라, 본 발명에서 기술된 내인성 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 유전자를 유전적으로 변형시키는 다양한 방법을 포함한다. 본 발명의 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템의 (예를 들어 상기 스키조카이트리움에 대하여 상세히 기술된) 유전적 기초와 도메인의 구조에 관한 지식은 다양한 PUFA 프로필을 제조하는 신규한 유전적으로 변형된 유기체를 고안하는데 기초를 제공한다. 트라우스토카이트리드와 같은 미생물에서 제조된 신규한 PUFA PKS 작제물은 분리될 수 있으며, 식물에 유사한 PUFA 제조 성질을 부여하기 위하여 식물을 형질전환시키는데 이용될 수 있다.
변형이 목적한 결과(즉, 미생물의 PUFA 제조 프로필의 변이)를 가져온다면, 본 발명에 따라 하나 이상의 내인성 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 도메인이 변이되거나 대체될 수 있다. 변이 또는 대체될 특히 바람직한 도메인은 이에 제한되는 것은 아니지만, 스키조카이트리움 OrfB 또는 OrfC에 있는 도메인(β-케토 아실-ACP 신타제 (KS), 아실트랜스퍼라제(AT), FabA-유사 β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소(DH), 쇄 길이 인자(CLF), 엔오일 ACP-환원효소(ER), 트랜스-2-아실-ACP의 합성을 촉진시키는 효소, 트랜스-2-아실-ACP의 시스-3-아실-ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소, 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실-ACP로의 연장을 촉매하는 효소)에 대응되는 임의의 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 변이 또는 대체하기에 바람직한 도메인은 이에 제한되는 것은 아니지만 β-케토 아실-ACP 신타제(KS), FabA-유사 β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소(DH) 및 쇄 길이 인자(CLF)를 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, 트라우스토카이트리드 PUFA-PKS PUFA 제조는 CLF(쇄 길이 인자) 도메인을 변형시킴으로 변이된다. 상기 도메인은 타입II(분리되는 효소) PKS 시스템의 특징이다. 이의 아미노산 서열은 KS(케토 신타제 쌍) 도메인에 상동성을 보이지만, 활성 부위 시스테인이 결여되어 있다. CLF는 연장 사이클의 회수를, 그리하여 최종 생산물의 쇄 길이를 결정하는 기능을 한다. 본 발명의 한 양태에서 FAS 및 PKS 합성과 관련된 현재의 지식을 이용하여, 비박테리아의 PUFA-PKS 시스템의 지정된 변형에 의한 ARA 제조의 합리적인 전략이 제공된다. PKS 시스템에서 CLF 기능과 관련된 문헌(Bisang et al. Nature 401, 502(1999); Yi et al. J. Am . Chem . Soc . 125, 12708(2003))에는 여전히 논란이 있는데, 이는 다른 도메인이 최종 생산물의 쇄 길이 결정에 관여할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나 스키조카이트리움이 DHA(C22:6, ω-3)와 DPA(C22:5, ω-6) 두 가지 모두를 제조한다는 것이 중요하다. PUFA-PKS 시스템에서 시스 이중결합은 성장하는 탄소쇄의 합성 중에 도입된다. ω-3과 ω-6의 이중결합의 배치는 분자의 합성 초기에 일어나므로 최종 생산물의 쇄길이 결정에 영향을 미칠 것이라고 예상되지 않는다. 따라서 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 스키조카이트리움 PUFA-PKS로 (C22 단위 대신에) C20 단위의 합성을 지시하는 인자(예, CLF)를 도입하는 것은 EPA(C20:5, ω-3)와 ARA(C20:4, ω-6)의 제조로 이어질 것으로 예상한다. 예를 들어, 이종의 시스템에서, (포토박테리움 또는 바람직하게는 이하에서 기술되는 바람직한 성장 필요조건을 가진 미생물에서 유래된 것과 같은) EPA 제조 시스템 유래의 CLF를 스키조카이트리움 유전자 세트로 직접적으로 치환함으로써 CLF를 개발할 수 있다. 이렇게 얻은 형질전환체의 지방산은 EPA 및/또는 ARA를 제조하는 형질전환체를 동정하기 위하여 프로필에서의 변경에 대하여 분석될 수 있다.
예시로 발명의 한 측면은 C20 PUFA-PKS 시스템 유래의 CLF로 대체된 OrfB의 CLF을 가진 클론을 작제할 수 있다. 마커 유전자가 코딩 영역의 다운 스트림에 삽입될 수 있다. 보다 자세하게는 본 발명에서 기술된 그리고 미국특허출원 제10/124,807호에 상세히 개시된 바에 따라 트라우스토카이트리드의 형질전환을 위하여 상동성 재조합 시스템을 사용할 수 있다. 야생형 트라우스토카이트리드 세포(예, 스키조카이트리움 세포)를 형질전환하고, 마커 표현형에 대하여 선택하고, 새로운 CLF를 병합시킨 이들을 스크리닝할 수 있다. EPA 및/또는 ARA를 제조하는 형질전환체를 동정하기 위하여 지방산 프로필에 대한 영향과 관련해서 상기 형질전환체를 분석할 것이다. CLF와 관련된 것 이외의 인자가 최종 생산물의 쇄 길이에 영향을 미친다는 것이 발견되면, 유사한 전략이 상기 인자를 변이시키기 위하여 도입될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소/케토 신타제 쌍의 변형 또는 치환이 고려된다. 대장균에서 시스-바센산(C18:1,Δ11) 합성 중에 시스 이중결합의 생성은 특정한 DH 효소, 즉 fabA 유전자의 생산물인 β-하이드록시 아실-ACP 환원효소에 따라 결정되는 것으로 여겨진다. 상기 효소는 β-케토 아실-ACP로부터 HOH를 제거하고 탄소쇄에 트랜스 이중결합을 남긴다. FabA-유사 DH의 소집합은 시스-트랜스 이소머라제 활성을 가진다(Heath et al. 1996). 박테리아 및 비박테리아의 PUFA-PKS 시스템의 새로운 측면은 두 가지 FabA-유사 DH 도메인의 존재이다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 하나 또는 둘 모두의 DH 도메인이 시스-트랜스 이성질화 활성을 보유할 것이라고 여긴다(DH 도메인의 조작은 이하에서 상세히 설명될 것이다).
대장균에서 불포화 지방산 합성의 다른 측면은 특정한 KS 효소, 즉 fabB 유전자의 생산물인 β-케토아실-ACP 신타제에 대한 필요이다. 이는 말로닐-ACP와, (티오-에스테르에 의해) 활성 부위에 있는 시스테인 잔기에 연결된 지방산의 축합을 수행하는 효소이다. 다단계 반응으로 CO2가 방출되면서 선형의 쇄는 2개의 탄소로 확장된다. 상기 KS만이 이중 결합을 포함한 탄소 쇄를 연장시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 확장은 이중 결합이 시스 배형일 때에만 일어난다; 트랜스 배형이라면 연장되기 전에 이중결합은 엔오일-ACP 환원효소(ER)에 의해 환원된다(Heath et al, 1996). 지금까지 확인된 모든 PUFA-PKS 시스템은 두 가지 KS 도메인을 가지고 있으며, 이중의 하나가 대장균의 FabB-유사 KS에 더 많은 상동을 보인다. 또한, 이론과 상관없이, 본 발명가들은 PUFA-PKS 시스템에서 DH(FabA-유사)와 KS(FabB-유사)의 효소의 도메인의 상호작용과 특이성이 최종 생산물에서 시스 이중결합의 수와 위치를 결정한다고 여긴다. 2-탄소 연장 반응의 회수가 PUFA-PKS 최종 생산물에 존재하는 이중결합의 수보다 크기 때문에, 어떤 연장 사이클에서 완전한 환원이 발생하는지 결정할 수 있다. 따라서, DH 와 KS도메인은 DHA/DPA 비율 또는 다른 장쇄 지방산의 비율의 변이를 위한 표적으로서 이용될 수 있다. 이는 다른 시스템에서 유래된 상동성 도메인의 도입 또는 이러한 유전자의 단편의 돌연변이 의해 변형되고/거나 평가될 수 있다.
다른 양태에서, ER(엔오일-ACP 환원효소-지방 아실-ACP에서의 트랜스-이중 결합을 환원시켜 완전히 포화된 탄소를 만드는 효소) 도메인은 PKS 시스템에 의해 만들어진 생산물의 타입을 변화시키기 위하여 변형되거나 치환될 수 있다. 예를 들어 본 발명자들은 스키조카이트리움 PUFA-PKS 시스템이 (하나가 아닌)두 개의 ER 도메인을 가지고 있다는 점에서 앞서 개시된 박테리아의 시스템과는 상이하다는 것을 인지한다. 이론과 관계없이 본 발명자들은 이러한 ER 도메인이 결과적인 PKS 제조 생산물에 강한 영향을 미친다고 여긴다. 결과적인 PKS 생산물은 각각의 도메인을 개별적으로 녹아웃시키거나 도메인의 뉴클레오티드 서열을 변형시키거나 다른 유기체로부터 유래된 ER 도메인을 치환시킴으로써 변화될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서 PUFA-PKS 시스템의 DH 도메인(FabA 유사) 중 하나를 이성질환 활성을 보유하지 않은 DH 도메인으로 치환하는 것을 고려하는데, 이는 시스-와 트랜스- 이중결합의 혼합을 가진 분자를 잠정적으로 생성한다. 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템의 현재 생산물은 DHA와 DPA(C22:5, ω6)이다. C20 지방산을 제조하기 위해 시스템을 조작한다면, EPA와 ARA(C20:4, ω6)을 생산물로 예상할 수 있다. 이는 ARA의 새로운 원천을 제공한다. 다른 DHA 대 DPA 비율을 제조하는, 예를 들면 트라우스토카이트리움 23B(미국특허출원 제10/124,800호에서 동정된 PUFA PKS 시스템)로부터의 유전자를 사용하여 관련된 PUFA-PKS 시스템으로부터의 도메인을 대체할 수 있다.
추가로, 한 양태에서 ER 도메인 중 하나가 최종 생산물의 프로필을 변이시키기 위해 (예를 들어, 제거 또는 비활성화함으로써) 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템에서 변이된다. 유사한 전략이 다소 정교한 방식을 이용하여 PUFA-PKS 단백질의 개별 도메인의 각각에 대하여 직접적인 방법으로 시도될 수 있다. 물론 단일 도메인에 대한 조작으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 새로운 PUFA 최종 생산물의 전체 범위를 생성하기 위하여 PUFA-PKS 시스템과 다른 PKS 또는 FAS 시스템(예를 들면 타입 I, 타입 II, 모듈라) 유래의 도메인을 혼합함으로써 방식을 확장시킬 수 있다.
본래의(내인성, 천연의) PKS 시스템으로 도입되는 무작위적 또는 지정된 많은 유전적 변형은 효소 기능의 비활성화를 초래할 수도 있다. 따라서 제어된 환경에서 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템의 유전적 조작의 영향에 대하여 테스트하기 위하여 대장균과 같은 다른 숙주의 재조합 시스템을 먼저 사용하여 시스템의 다양한 측면을 조작하고 그 결과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 대장균의 FabB-균주는 불포화 지방산을 합성할 수 없으며, 성장하기 위해서는 정상적인 불포화 지방산을 치환할 수 있는 지방산으로 배지를 보충할 필요가 있다(Metz et al. 2001). 그러나, (배지의 보충이라는) 상기 필요는 균주가 기능성 PUFA-PKS 시스템(즉, 대장균 숙주에서 PUFA 생산물을 제조하는 시스템 - Metz et al. 2001, 도 2A)으로 형질전환되었을 때 제거될 수 있다. 형질전환된 FabB-균주는 보충 없이 성장을 위한(불포화 지방산을 제조하기 위한) 기능성 PUFA-PKS 시스템을 필요로 한다. 이러한 예시에서 중요한 요소는 (분지된 쇄 지방산과 같은 다중불포화지방산 치환물까지) 다양한 다중불포화 지방산의 제조가 충족될 것이라는 것이다. 따라서 본 발명의 다른 바람직한 양태는 본 발명에서 언급된 하나 이상의 PUFA PKS 유전자에서 많은 변형을 생성시키고, 그 다음 적합하게 변형된 FabB-균주를 형질전환시켜(예를 들어, ER 도메인을 포함하는 발현 작제물에서 변형을 생성시키고 개별적인 플라즈미드에 필수적인 도메인을 가지고 있거나 염색체상에 통합된 FabB-균주를 형질전환시켜서) 배지의 보충 없이도 성장하는 (즉, FabB-결점을 보완하는 분자를 제조하는 능력을 보유한) 형질전환체만을 선택할 수 있다.
PUFA PKS의 유전적 변형을 위한 테스트 시스템이 실시예 부분에서 예시된다. 간략히 설명하면, 대장균과 같은 숙주 미생물이 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템(예를 들면, 스키조카이트리움의 OrfsA, B 및 C)의 모두 혹은 일부분을 포함하는 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 유전자와, PKS 시스템에서 활성의 홀로-ACP를 제조하기 해서는 포스포판테테인 보조인자의 부착이 요구되는 포스포판테테인 트랜스퍼라제(PPTase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된다. PKS 시스템을 코딩하는 유전자는 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 유전자에 적어도 하나 이상의 변형을 도입 및/또는 다른 PKS 시스템에서 유래된 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 트라우스토카이트리드 유전자(비-트라우스토카이트리드 미생물로부터의 유전자와 다른 트라우스토카이트리드 미생물로부터의 유전자를 포함한)로 도입하기 위해 유전적으로 조작될 수 있다. PUFA PKS 시스템은 대장균에서 발현될 수 있고 PUFA 제조 프로필이 측정될 수 있다. 이러한 방식으로 강력한 유전적 변형이 트라우스토카이트리드 PUFA 제조 유기체의 조작 이전에 평가될 수 있다.
본 발명은 내인성 핵산 분자의 조작 및/또는 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템 유래의 핵산 서열 또는 이의 상동체를 포함한 분리된 핵산 분자의 이용을 포함한다. 한 측면에서 말로닐-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제(MAT), β-케토 아실-ACP 신타제(KS), 케토환원효소(KR), 아실트랜스퍼라제(AT), FabA-유사 β-하이드록시-ACP 탈수소효소(DH), 포스포판테테인 트랜스페라제, 쇄길이인자(CLF), 아실 캐리어 단백질(ACP), 엔오일 ACP-환원효소(ER), 트랜스-2-아실-ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실-AC의 시스-3-아실-ACP로 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소 및/또는 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실-ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 PUFA PKS 시스템 유래의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 핵산 분자의 조작 및/또는 이용에 관한 것이다. 숙주 트라우스토카이트리드의 PUFA 제조 프로필을 변이시키기 위하여 변형될 바람직한 도메인은 앞서 설명되었다.
본 발명에 따른 트라우스토카이트리드 미생물의 유전자적인 변형은 바람직하게는 내인성 PUFA PKS 시스템이 유전적으로 변형되었는지 및/또는 재조합 핵산 분자가 유기체에 도입되었는지 여부에 상관없이 미생물에 의해 제조되는 PUFA의 타입, 양, 및/또는 활성에 영향을 미친다. 본 발명에서 PUFA 제조 프로필에 영향을 미치는 것과 같이, PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미친다는 것은 유전적 변형이 없는 경우와 비교하였을 때 미생물에 의해 발현되는 PUFA PKS 시스템의 생물학적 활성에서의 임의의 검출 또는 측정할 수 있는 변화 또는 변형을 일으키는 PUFA PKS 시스템과 관련된 PUFA PKS 시스템 또는 유전자에서의 임의의 변형을 포함한다. 본 발명에서 용어 "PUFA 프로필", "PUFA 발현 프로필" 및 "PUFA 제조 프로필은"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 미생물에 의해 발현/제조되는 PUFA의 전반적인 프로필을 설명할 수 있다. PUFA 발현 프로필은 미생물에 의해 발현되는 PUFA의 타입 뿐만 아니라 제조되는 PUFA의 절대적인 및 상대적인 양을 포함한다. 따라서 PUFA 프로파일은 미생물에 의해 제조되는 한 PUFA 대 다른 것의 비율의 관점, 미생물에 의해 제조된 PUFA의 타입의 관점, 및/또는 미생물에 의해 제조되는 PUFA의 절대적 또는 상대적인 양의 관점에서 설명될 수 있다.
상기에서 보여준 것 같이, 숙주 미생물은 내생적인 PUFA PKS 시스템을 가진 모든 진핵 미생물과 PUFA PKS 시스템의 산물을 포스포리피드(PS)과 트리아실글리세롤(TAG) 2가지 모두에게 효율적으로 흘려보내는 능력을 포함하는 한편, 바람직한 숙주 미생물은 트라우스토카이트리아세 와 라비린툴라시애과를 포함한 트라우스토카이트리알레목의 일원은 어느 것이라도 무방하다. 본 발명에 쓰일 특히 선호되는 숙주세포는, 제한적이지는 않지만, 다음의 속으로부터의 미생물을 포함한다: 트라우스토카이트리아세과내의 트라우스토카이트리움, 자포노카이트리움, 아플라노카이트리움, 엘리나, 스키조카이트리움과 라비린툴라시애과내의 라비린툴라, 라비린툴로이데스, 라비린토믹사. 위의 속 내에서의 바람직한 종은, 제한적이지는 않지만, 다음과 같다: 라비린툴라 sp., 라비린툴라 알게리엔시스, 라비린툴라 시엔콥스키, 라비린툴라 샤토니, 라비린툴라 코에노시스티스, 라비린툴라 마크로시스티스, 라비린툴라 마크로시스티스 아틀란티카, 라비린툴라 마크로시스티스 마크로시스티스, 라비린툴라 마그니피카, 라비린툴라 미누타, 라비린툴라 로스코펜시스, 라비린툴라 발카노비, 라비린툴라 비텔리나, 라비린툴라 비텔리나 파시피카, 라비린툴라 비텔리나 비텔리나, 라비린툴라 조피를 포함한 라비린툴라의 모든 종; 라비린툴로이데스 sp., 라비린툴로이데스 미누타, 라비린툴로이데스 스키조카이트로프를 포함한 라비린툴로이데스의 모든 종; 라비린토믹사 sp., 라비린토믹사 폴리아, 라비린토믹사 사우바개우이를 포함한 모든 라비린토믹사종; 아플라노카이트리움 sp. 과 아플라노카이트리움 케르구엘렌시스를 포함한 모든 아플라노카이트리움종; 엘리나 sp., 엘리나 마리살바, 엘리나 시노리피카를 포함한 모든 엘리나종; 야파노카이트리움 sp., 야파노카이트리움 마리눔을 포함한 모든 야파노카이트리움종; 스키조카이트리움 sp., 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔, 스키조카이트리움 미누툼, 스키조카이트리움 옥토스포룸을 포함한 모든 스키조카이트리움종; 트라우스토카이트리움 sp., 트라우스토카이트리움 아그레가툼, 트라우스토카이트리움 아루디멘탈레, 트라우스토카이트리움 오레움, 트라우스토카이트리움 벤티콜라, 트라우스토카이트리움 글로버섬, 트라우스토카이트리움 킨네이, 트라우스토카이트리움 모티붐, 트라우스토카이트리움 파카이더뭄, 트라우스토카이트리움 프로리페룸, 트라우스토카이트리움 로세움, 트라우스토카이트리움 스트리아툼, 울케니아 sp., 울케니아 미누타, 울케니아 프로펀다, 울케니아 라디에이트, 울케니아 사카리아나, 울케니아 비수르젠시스를 포함한 모든 트라우스토카이트리움종. 특히 이들 속에서도 바람직한 종은, 이에 제한되는 것은 아니지만: 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔, 스키조카이트리움 미누툼을 포함한 모든 스키조카이트리움 종; 트라우스토카이트리움 스티리아툼, 트라우스토카이트리움 오레움, 트라우스토카이트리움 로세움을 포함한 모든 트라우스토카이트리움 종(U. 비수르젠시스, U. 아메보이다, U. 사카리아나, U. 프로펀다, U. 라디아타, U. 미누타 와 울케니아 sp. BP-5601과 같은 이전의 울케니아 종을 포함한); 모든 자포노카이트리움 종. 특히 트라우스토카이트리알레의 바람직한 균주는 이에 제한되는 것은 아니지만 다음과 같다: 스키조카이트리움 sp. (S31)(ATCC 20888); 스키조카이트리움 sp. (S8)(ATCC 20889); 스키조카이트리움 sp. (LC-RM)(ATCC 18915); 스키조카이트리움 sp. (SR21); 스키조카이트리움 아그레가툼 (Goldstein et Belsky)(ATCC 28209); 스키조카이트리움 리마시눔(Honda et Yokochi)(IFO 32693); 트라우스토카이트리움 sp. (23B)(ATCC 28210); 트라우스토카이트리움 striatum (Schneider)(ATCC 24473); 트라우스토카이트리움 오레움 (Goldstein)(ATCC 34304); 트라우스토카이트리움 roseum (Goldstein)(ATCC 28210); 그리고 자포노카이트리움 sp. (L1)(ATCC 28207).
본 발명의 한 양태에서는 돌연변이 프로그램이 대상 PUFA 제조 프로필을 가진 트라우스토카이트리드 미생물을 수득하기 위한 선택적인 스크리닝 과정과 조합될 수 있다는 것을 고려할 수 있다. 돌연변이 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 화합물에 의한 돌연변이, 유전자 섞기(gene shuffling), 특정 효소의 도메인을 코딩하는 유전자의 영역을 스위치 또는 이러한 유전자의 특정 영역에 제한된 돌연변이 뿐만 아니라 다른 방법을 포함할 수 있다.
예를 들어, 고효율 돌연변이 방법(high throughput mutagenesis)이 목적한 PUFA 프로필의 제조를 최적화하거나 영향을 미치는데 이용될 수 있다. 일단 효율적인 모델 시스템이 개발되면, 고효율 방식으로 유전자들을 변형시킬 수 있다. 이러한 기술의 활용화는 두 단계로 나누어 볼 수 있다. 첫째로, 만일 대상 생산물(예, EPA)의 제조를 위하여 충분히 선택적인 스크리닝이 고안된다면, 이를 이러한 생산물을 제조하는 시스템을 변이시킬 시도에 이용될 수 있다(예를 들어 상기에서 설명한 다른 전략들 대신에 또는 협의하여). 추가로, 앞서 요약된 전략이 대상 PUFA 프로필을 제조하는 유전자 세트를 나오게 한다면, 고효율 기술이 상기 시스템을 최적화하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 도입된 도메인이 비교적 낮은 온도에서만 기능하다면, 선택 방법은 그러한 제한의 제거를 허용하도록 고안될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물은 목적한 PUFA를 합성하는데 개서된 능력을 가지고/거나 상이한 프로필의 PUFA를 합성할 수 있는 새롭게 도입된 능력을 가진다. 본 발명에서 생산물을 "합성하는데 개선된 능력"이란 상기 미생물이 동일한 조건하에서 배양 또는 성장된 야생형 미생물과 비교하였을 때 증가된 양의 (전혀 제조하지 않은 생산물의 제조도 포함해서) 생산물을 제조할 수 있도록 상기 생산물의 합성과 관련된 경로에서의 증진 또는 상향 조정을 의미한다. 그러한 유전적으로 변형된 유기체를 제조하기 위한 방법은 위에서 상세히 다루어졌다.
본 발명의 한 양태에서 유전적으로 변형된 미생물 또는 식물은 목적한 생활성 분자를(생산물) 합성하는데 개선된 능력을 가지거나 특정한 생산물을 합성할 수 있는(예를 들면, 특정한 항생제를 합성하는) 새롭게 도입된 능력을 가진 미생물 또는 식물을 포함한다. 본 발명에서 생산물을 "합성하는데 개선된 능력"이란 미생물 또는 식물이 동일한 조건하에서 배양 또는 성장된 야생형 미생물 또는 식물과 비교하였을 때 증가된 양의 (전혀 제조하지 않은 생산물의 제조도 포함해서) 생산물을 제조할 수 있도록 상기 생산물의 합성과 관련된 경로에서의 증진 또는 상향 조정을 의미한다. 그러한 유전적으로 변형된 유기체를 제조하기 위한 방법은 위에서 상세히 다루어졌다.
본 발명의 한 양태는 (앞서 설명된) 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물 또는 식물을 성장시키거나 배양함으로써 원하는 목적한 생활성 분자(또는 생산물 또는 화합물이라고 함)를 제조하는 방법이다. 이러한 방법은 앞서 설명된 바와 같이 그리고 본 발명에 따라 유전적 변형을 가진 미생물 또는 식물을 발효 배지에서 배양하거나 흙과 같은 적합한 환경에서 성장시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 PUFA PKS 시스템과 관련된 유전적 변형을 위해 바람직한 숙주 세포는 앞서 설명되어졌다.
본 발명의 한 양태는 (상기에서 상세히 설명된) 본 발명의 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물을 배양함으로써 목적한 PUFA를 제조하는 방법이다. 이러한 방법은 상기에서 설명된 바에 따라 그리고 본 발명에 따라 유전적 변형을 가진 트라우스토카이트리드 미생물을 PUFA를 제조하는데 효과적인 조건 및 발효 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기 적절한 또는 효과적인 배지는 트라우스토카이트리드와 다른 미생물을 포함하여 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물이 배양되었을 때 목적한 PUFA 생산물을 제조하는 배지를 의미한다. 이러한 배지는 일반적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 포스페이트 원을 포함한 수용성의 배지이다. 상기 배지는 적합한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양분을 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 미생물은 전통적인 발효 생물반응기에서 배양될 수 있다. 미생물은 이에 제한되는 것은 아니지만 회분식, 유가식, 세포 재순환 및 연속식 발효를 포함한 임의의 발효 공정에 의해 배양될 수 있다. 본 발명에 따른 트라우스토카이트리드 미생물의 바람직한 성장 조건은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들면, 미국특허 제5,130,242호, 미국특허 제5,340,742호 및 미국특허 제5,698,244호에 상세히 기술되어 있으며, 이들 각각의 전문은 본 발명에서 참조로서 인용된다.
한 양태에서 유전적으로 변형된 미생물은 약 15℃이상, 다른 양태에서는 약 20℃ 이상, 다른 양태에서는 약 25℃ 이상, 다른 양태에서는 약 30℃ 이상, 다른 양태에서는 약 35℃ 이상, 다른 양태에서는 약 40℃ 이상, 그리고 한 양태에서는 20℃에서 40℃사이의 임의의 온도에서 배양된다.
유전적으로 변형된 미생물에 의해 제조되는, 목적한 PUFA 및/또는 다른 생활성 분자는 전통적인 분리와 정제의 기술을 이용하여 발효 배지로부터 회수될 수 있다. 예를 들어 발효 배지는 미생물, 세포 파편 및 다른 미립자를 제거하기 위해 여과되거나 원심분리될 수 있으며, 생산물은 예를 들면, 이온 교환, 크로마토그래피, 추출, 용매추출, 상 분리, 멤브레인 분리, 전기투석, 역삼투, 증류, 화학적 유도(chemical derivatization) 및 결정화와 같은 전통적인 방법에 의해 세포가 제거된 상층액으로부터 회수될 수 있다. 선택적으로 PUFA를 제조하는 미생물 또는 추출물 및 이들의 다양한 분획물이 생산물로부터 미생물의 제거 없이 이용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물은 이에 제한되는 것은 아니지만: EPA(C20:5, ω-3), DHA(C22:6, ω-3), DPA(C22:5, ω-6), ARA(C20:4, ω-6), GLA(C18:3, n-6) 및 SDA(C18:4, n-3)를 포함한 적어도 하나 이상의 다중불포화 지방산을 제조한다. 하나의 바람직한 양태에서 높은 수준의 DHA와 DPA를 제조하는 야생형의 스키조카이트리움이 본 발명에 따라 유전적으로 변형되어 높은 수준의 EPA를 제조한다. PUFA를 제조하기 위해 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물을 사용하는 경우의 장점은 PUFA가 포스포글리세드(PL)와 트리아실글리세리드(TAG) 모두에 직접적으로 통합된다는 것이다.
바람직하게, PUFA는 미생물 건조 중량의 약 5% 이상, 한 측면에서는 6%이상, 다른 측면에서는 7% 이상, 다른 측면에서는 8% 이상, 다른 측면에서는 9%이상, 다른 측면에서는 10% 이상으로 제조되거나, 미생물의 건조 중량의 90% 이상이 될 때까지 정수의 백분율로 제조된다(예를 들어 15%, 20%, 30%, 40%, 50% 및 그 사이의 모든 백분율).
본 발명에 따른 목적한 생활성 화합물을 제조하는 방법에서 유전적으로 변형된 식물은 발효 배지에서 배양되거나 흙과 같이 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 또는 효율적인 발효 배지는 앞서 상세히 설명되어졌다. 고등식물을 위한 적합한 성장 배지는 이에 제한되는 것은 아니지만, 흙, 모래, 뿌리 성장(예를 들어 질석, 진주암, 등) 또는 수경 재배를 지지하는 미립자 매개물 뿐만 아니라 적합한 광, 물 및 고등식물의 성장을 최적화하는 영양학적 보충물이 포함된다. 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 식물은 본 발명에 따라 유전적으로 변형된 PKS 시스템의 활성을 통하여 상당한 양의 목적한 생산물을 제조하도록 조작된다. 상기 합성물은 식물로부터 화합물을 추출하는 정제 공정을 통해 회수될 수 있다. 바람직한 양태에서 화합물은 식물을 수확함으로써 회수된다. 이러한 양태에서 식물은 천연의 상태로 소비될 수 있거나 소비되는 생산물로 추가로 가공된다.
생활성 분자를 제조하는데 유용한 많은 유전적 변형은 본 발명에서 주어진 바와 같이 당업자에는 분명하고, 이외의 다양한 변형이 앞서 설명되었다. 본 발명은 목적한 생활성 분자의 제조를 유도하는 본 발명에서 언급된 PUFA PKS 시스템과 관련된 유전적 변형을 고려한다.
본 발명에 따른 생활성 분자는 생물학적 활성을 가진 분자(화합물, 생산물 등)를 포함하며, 이들은 본 발명에서 기술된 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 기능성 도메인의 생물학적 활성을 가진 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 PKS 시스템에 의해 제조될 수 있다. 그러한 생활성 분자는 이에 제한되는 것은 아니지만, 다중불포화 지방산(PUFA), 항염증 제형, 화학 요법제, 활성 부형제, 골다공증 약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파이로리 약, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약, 퇴행성 간질환의 치료를 위한 약, 항생제 및 콜레스테롤 저해 제형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 한 장점은 시스 배형의 탄소-탄소 이중결합과 세 번째 탄소마다 이중결합을 포함하는 분자를 도입하는 상기 시스템의 능력이다. 상기 능력은 다양한 화합물을 제조하는데 활용될 수 있다.
생활성 화합물은 미생물의 건조중량의 약 0.05%이상, 바람직하게는 약 0.1%이상, 보다 바람직하게는 약 0.25%이상, 보다 바람직하게는 약 0.5%이상, 보다 바람직하게는 약 0.75%이상, 보다 바람직하게는 약 1%이상, 보다 바람직하게는 약 2.5%이상, 보다 바람직하게는 약 5%이상, 보다 바람직하게는 약 10%이상, 보다 바람직하게는 약 15%이상, 보다 더 바람직하게는 약 20% 이상의 양으로 유전적으로 변형된 미생물에 의해 제조되는 것이 바람직하다. 지질 화합물의 경우, 그러한 화합물은 미생물의 건조 중량의 약 5%이상 제조되는 것이 바람직하다. 항생제 또는 보다 적은 양으로 합성되는 화합물과 같은 다른 생활성 화합물의 경우에는 이러한 합성물을 미생물의 건조중량의 무게만큼 소지한 계통은 위에서 설명한 타입의 새로운 PKS 시스템을 예상대로 가진 것으로 확인할 수 있다. 일부 양태에서, 특정 생활성 분자(화합물)는 축적되기 보다는 미생물에 의해 분비된다. 따라서, 이러한 생활성 분자는 작용의 분자는 배양 배지로부터 회수되며, 제조된 분자의 농도는 미생물과 배양의 크기에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 한 양태는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 제조되는 오일을 최종 생산물에 첨가하는 단계를 포함한 적어도 하나의 지방산을 포함하는 최종 생산물을 변형하는 방법에 관한 것이다. PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리움과 스키조카이트리움에서 유래된 PUFA PKS 시스템 또는 쉐와넬라 올레야나 또는 쉐와넬라 자포니카와 같이 22℃이상의 온도(즉, 정상 또는 천연의 조건)에서 정상적으로 성장하고 PUFA를 제조하는 박테리아에서 유래된 PUFA PKS 시스템을 포함한, 본 발명에서 개시된 적합한 박테리아 또는 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 포함한다.
바람직하게 최종 생산물은 음식, 식이 보조제, 약제학적 제형, 인간화된 동물 밀크와 분유로부터 선택된다. 적합한 약제학적 제형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 항염증 제형, 화학 요법제, 활성 부형제, 골다공증약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터파이로리약, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약, 퇴행성 간질환의 치료를 위한 약, 항생제, 콜레스테롤 저해 제형을 포함한다. 한 양태에서 최종 생산물은 만성 염증, 급성 염증, 위장관계 질환, 암, 카켁시아, 심장의 재협착증, 신경퇴행성 질환, 간의 퇴행성 질환, 혈액 리피드 질환, 골다공증, 동맥경화, 자가면역 질환, 자간전증, 조산, 노화와 연관된 황발변증, 호흡기계 질환 및 퍼옥시조말 질환으로부터 선택된 용태를 치료하는데 이용된다.
적합한 음식물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 제과점 제품, 빵과 롤, 아침식사용 시리얼, 가공된 및 가공되지 않은 치즈, 조미료(케첩, 마요네즈 등), 유제품(밀크, 요구르트), 푸딩과 젤라틴 후식, 탄산음료, 차, 분말화된 음료 믹스, 가공된 어류, 과일을 원료로 한 음료, 껌, 딱딱한 사탕, 냉동 유제품, 가공된 육류, 콩과 콩을 원료로 한 스프레드(spread), 파스타, 가공된 조류, 그레이비와 소스, 포테이토칩과 다른 칩 또는 비스켓, 초코렛과 다른 사탕, 스프와 스프 믹스, 콩을 원료로 한 제품(밀크, 음료, 크림, 표백제), 식물성 유지를 원료로 스프레드, 야채를 원료로 한 음료를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 인간화된 동물 밀크를 제조하는 방법과 연관되어 있다. 상기 방법은 본 발명에서 개시된 PUFA PKS시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 밀크-제조 동물의 밀크-제조 세포를 유전적으로 변형하는 단계를 포함한다.
숙주세포를 유전적으로 변형하는 방법과 유전적으로 변형된 비인간의 밀크 제조 동물을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변형시킬 숙주 동물의 예는 소, 양, 돼지, 염소, 야크 등을 포함하며, 이들은 유전적 조작과 트랜스 유전자를 발현하는 개체군의 급속한 위한 클로닝에 수정될 수 있다. 예를 들어, PKS-유사 트랜스 유전자는 유전자 조절 영역의 변형을 통하여 표적 세포내 소기관, 조직 및 체액에서의 발현을 위해 순응될 수 있다. 숙주 동물의 모유에서 PUFA를 제조하는 것이 적절하다.
하기의 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
도 1은 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템의 도메인 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 스키조카이트리움과 쉐와넬라에서 유래된 PUFA PKS 시스템의 도메인을 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 스키조카이트리움 유래의 PUFA PKS 시스템과 이중 결합을 함유하지 않은 장쇄의 지방산을 제조하는 노스톡 유래의 PKS 시스템의 도메인을 비교하여 나타낸 것이다.
<실시예1>
미국특허출원 제10/124,800호로부터의 하기의 실시예는 본 발명에 따른 PUFA PKS 시스템을 포함한 다른 비박테리아의 유기체를 동정하기 위한 본 발명의 스크리닝 과정의 이용을 보여준다.
트라우스토카이트리움 sp. 23B(ATCC 20892)은 본 발명에 하기에 상세히 개시된 것처럼 배양되어졌다. 트라우스토카이트리움 sp. 23B(ATCC 20892)의 냉동된 바이얼이 50mL의 RCA 배지를 담고 있는 250mL셰이크 프라스크를 접종하는데 사용되어졌다. 배양액은 셰이커 테이블에서 (200rpm) 72시간 동안 25℃에서 진탕시켰다. RCA 배지는 다음을 함유하고 있다:
RCA 배지
탈이온수 1000mL
Reef Crystals® 바다 소금 40g/L
글루코스 20g/L
모노소디움 글루타메이트(MSG) 20g/L
이스트 추출물 1g/L
PII 금속* 5mL/L
비타민 믹스* 1mL/L
pH 7.0
*PII 금속 믹스와 비타민 믹스는 본 발명에 본문 전체를 참고문헌으로 통합한 미국특허 제5,130,742호에 개시된 것과 동일하다.
25mL의 72시간된 배양액이 50mL의 낮은 질소 RCA 매개물(20g/L 대신10g/L MSG)을 함유한 또 다른 250mL의 셰이크 플라스크를 접종하는데 사용하였고, 다른 25mL의 배양액은 175mL의 낮은 질소 RCA 배지를 함유한 250mL의 셰이크 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 두 플라스크는 72시간 동안 25℃에서 셰이크 테이블에 놓여졌다. 세포는 원심분리를 통해 채취되었고 동결건조에 의해 건조되었다. 건조된 세포는 표준 가스 크로마토그래피 과정을 이용해서 지방 함유량과 지방산 프로파일과 함량이 분석되었다.
저산소의 조건하에 있을 때와 고산소 조건하에 있을 때 비교하는 트라우스토카이트리움 23B의 스크리닝 결과는 다음과 같다:
DHA의 %FAME은 증가했는가? 예(38->44%)
C14:0 + C16:0+C16:1은 40%의 TFA보다 큰가? 예(44%)
No C18:3(n-3) 혹은 C18:3(n-6)? 예(0%)
지방 함량은 증가했는가? 예(2배 증가)
DHA(혹은 다른 HUFA 함량이 증가했는가?) 예(2.3배 증가)
위의 결과는, 특히 저산소의 조건하에서 DHA 함량(%FAME)의 현저한 증가는 트라우스토카이트리움 균주에서 PKS를 제조하는 PUFA의 존재를 강력하게 보여주는 것이다.
PUFA PKS의 존재를 확인하는 추가의 정보를 제공하기 위해 PUFA를 제조하는 PKS 시스템(즉, 전술한 서열번호: 1-32)을 갖고 있는 것으로 이미 결정된 균주인 스키조카이트리움 계통 20888에서 유래한 PKS 프로브를 이용한 트라우스토카이트리움 23B의 서던 블롯이 수행되어졌다. 트라우스토카이트리움 23B 게놈의 DNA 단편은 PKS PUFA 합성 유전자에서 유래된 혼성 프로브와 상동성이 있는지, 이는 서던 블롯 기술을 통해 감지되었다. 트라우스토카이트리움 23B 게놈의 DNA는 ClaI 혹은 KpnI 제한 엔도뉴클레아제로 소화되어지고, 아가로스 겔 전기영동(0.7% 아가로스, 표준의 트리스아세테이트-EDTA 완충용액)에 의해 분리되고, 모세관의 전이에 의해 Schleicher & Schuell Nytran Supercharge 멤브레인으로 블롯되었다. 혼성 프로브로 표시한 두 가지의 디곡시게닌이 이용되어졌다. 하나는 스키조카이트리움 PKS OrfB(OrfB의 뉴클레오티드 5012-5511; 서열번호: 3)의 엔오일-ACP 환원효소(ER) 부위에 특이적이고, 다른 하나는 스키조카이트리움 PKS OrfC(OrfC의 뉴클레오티드 76-549; 서열번호: 5)의 개시점인 보존된 부위에 특이적이다.
OrfB-ER 프로브는 약 13kb ClaI 단편과 약 3.6kb KpnI 단편을 트라우스토카이트리움 23B 게놈의 DNA에서 감지했다. OrfC 프로브는 약 7.5kb ClaI 단편과 약 4.6kb KpnI 단편을 트라우스토카이트리움 23B 게놈의 DNA에서 감지했다.
마지막으로 벡터 람다 FIX II(Stratagene)으로 삽입된 트라우스토카이트리움 23B 게놈의 DNA 유래의 DNA 단편으로 구성된 재조합 게놈의 라이브러리는 스키조카이트리움 20888 PUFA-PKS 유전자의 다음의 절편에 상응하는 디곡시제닌으로 표시된 프로브를 이용하여 스크리닝되어졌다: OrfA의 뉴클레오티드 7385-7879(서열번호: 1), OrfB의 뉴클레오티드 5012-551(서열번호: 3), OrfC의 뉴클레오티드 76-549(서열번호: 5). 이러한 프로브는 각각 트라우스토카이트리움 23B 라이브러리에서 양성의 플라크를 감지했는데, 이는 스키조카이트리움 PUFA-PKS 유전자와 트라우스토카이트리움 23B의 유전자 사이에 상당한 상동성을 의미한다.
위의 결과는 트라우스토카이트리움 23B 게놈의 DNA가 스키조카이트리움 20888의 PKS 유전자와 상동성 있는 서열을 갖고 있음을 보여주었다.
<실시예 2>
다음의 실시예는 스키조카이트리움 Orfs A, B, C가 대장균에서 기능적인 발현을 통해 기능적인 DHA/DPA 합성 효소를 코딩한다는 사실을 보여준다.
대장균 형질전환체의 일반적인 제조
스키조카이트리움에서 DHA와 DPA를 제조(Orfs A, B & C; 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5, 각각)하는 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템을 코딩하는 세 개의 유전자는 단일 대장균 발현 벡터pET21c(Novagen))에 클론되었다. 유전자는 단일의 메시지로 (T7RNA-폴리메라제에 의해) 전사되고, 각각의 유전자 앞에서 클론을 만든 리보솜 결합 부위는 해독을 개시한다. OrfB 코딩 서열의 변형은 대장균에서 (아래에 서술한) OrfB 단백질 전장의 제조를 수득하기 위해 필요하였다. PPTase(아래에 서술한)를 코딩한 보조의(accessory) 유전자는 두 번째의 플라스미드(pACY184, New England Biolabs에서 유래한)에 클로닝되었다.
OrfB
OrfB 유전자는 ~224 kDa의 질량의 단백질을 코딩하는 것으로 예측할 수 있다. 대장균에서 유전자의 발현에의 최초의 시도는 겉보기 분자량 ~165kDa의 단백질(SDS-PAGE동안 공지된 질량의 단백질에 비교하여 판단했을 때)을 축적하는 것으로 귀착한다. OrfB 뉴클레오티드 서열의 조사는 15 연속의 세린 코돈-모두가 TCT 코돈-을 포함하고 있는 부분을 드러낸다. 유전자 코드는 6개의 다른 세린 코돈을 갖고 있고, 이중 3개는 대장균에서 자주 쓰인다. 본 발명자들은 4개의 겹치는 올리고뉴클레오티드를 폴리메라제 쇄 반응 프로토콜과 조합해서 사용하여 세린 코돈 반복 영역을 갖고 있는 OrfB 유전자의 작은 부분(~195 base pair, BspHI에서 SacII제한 효소 단편)을 재합성한다. 합성된 OrfB 단편에서, 대장균에서 흔히 사용되는, 3 세린 코돈의 임의적인 혼합이 이용되고, 잠정적으로 문제가 있는 다른 코돈(즉, 대장균에 의해 거의 이용되지 않은 기타 코돈)도 역시 교체된다. 원래의 OrfB에 존재하는 BspHI에서 SacII단편은 재합성된 단편(OrfB*를 얻는)에 의해 대체되고 변형된 유전자는 관련된 발현 벡터로 클로닝된다. 변형된 OrfB*는 여전히 서열번호: 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 대장균에서 변형된 OrfB* 클론의 발현은 ~224 kDa 단백질의 출현으로 이어지는데, 이는 OrfB의 전장 산물이 제조되었음을 나타내는 것이다. OrfB* BspHI에서 SacII 단편의 재합성된 서열은 서열번호: 80에서 나타내진다. 서열번호: 80에 언급하여, 재합성된 OrfB의 BspHI에서 SacII 영역의 뉴클레오티드 서열이 나타내진다. BspHI 제한 부위와 SacII 제한 부위 동정된다. BspHI 부위는 OrfB CDS의 뉴클레오티드 4415에서 시작된다(서열번호: 3)(주의: SacII 부위가 독특한 반면, OrfB CDS에 총 3개의 BspHI 부위가 있다). 변형되지 않은 OrfB CDS의 서열이 GenBank Accession No. AF378328와 서열번호: 3으로 주어진다.
PPtase
OrfA 단백질(스키조카이트리움에서 서열번호: 2)의 ACP 도메인은 기능을 발휘하기 위해 포스판테테인 그룹의 첨가에 의해 활성화되어야 한다. 이러한 반응의 일반적인 유형을 촉매하는 효소는 포스판테테인 트랜스퍼라제라 불린다(PPTase). 대장균은 2 가지의 내인성의 PPTase를 갖고 있는데, 이 PPTase는 스키조카이트리움에서 유래하는 OrfA ACP 도메인을 인식하지 못할 것으로 예상되었다. 이는 대장균에서서 OrfA, B*(상기 참조) 및 C를 추가의 PPTase없이 발현하는 것으로 확증되었다. 이러한 형질전환체에서 DHA 제조는 감지되지 않았다. 발명자들은 대장균 PUFA PKS 발현 시스템에서 두 개의 (이형성의)-PPTase를 시험해봤다: (1)sfp (바실러스 섭틸리스 유래) 그리고 (2) Het I (시아노박테리아 노스톡 균주 7120 유래)
sfp PPTase는 잘 특징지워졌고 다양한 영역의 기질을 인지하는 능력 때문에 널리 사용되고 있다. 발표된 서열 정보를 기초로(Nakana, et al. 1992, Molecular and General Genetics 232:313-321), 한정된 업스트림 또는 다운스트림 측면에 위치한 DNA 서열과 함께, sfp를 위한 발현 벡터가 코딩한 영역을 클로닝함으로써 구축되어 pACYC-184 클로닝 벡터가 되었다. 다음의 올리고뉴클레오티드가 게놈의 B. 섭틸리스 DNA로부터의 관심 부분을 확장하기 위해 쓰였다.
CGGGGTACCCGGGAGCCGCCTTGGCTTTGT(정방향; 서열번호: 73)
그리고
AAACTGCAGCCCGGGTCCAGCTGGCAGGCACCCTG(역방향; 서열번호: 74)
편리한 제한 효소 부위는 올리고뉴클레오티드에 포함되어 있어 중간 정도로 높은 카피수의 벡터에 클로닝을 용이하게 하였다. 그리고 마침내 플라스미드: pBR 301을 제조하기 위해 pACYC184의 EcoRV 부위에 포함되었다. 플라스미드와 함께 형질전환된 대장균 추출물의 조사는 sfp에 기대되는 이동성을 지닌 신규한 단백질의 존재를 드러냈다. 특정한 조건하에, Orf A, B*, C 단백질을 발현하는, 세포에서의 sfp 작제물의 공동발현은 DHA 제조를 결과로 가져온다. 이 실험은 sfp가 스키조카이트리움 Orf A ACP 도메인을 활성화시킬 수 있음을 입증한다. 뿐만 아니라, sfp 유전자와 관련된 조절 요소는 다른 유전자를 삽입할 수 있는 발현 카세트를 제조하는데 사용되어졌다. 특히, pBR 301에서 sfp 코딩 영역(ATG 바로 업스트림의 3개 뉴클레오타이드)은 여러 독특한(이 작제물에 관한한) 제한 효소 부위를 갖도록 설계된 DNA의 53 염기쌍 섹션으로 대체되었다. 이 영역의 초기 제한 효소 부위는 NdeI(CATATG; 서열번호: 79)이다. 이 부위에 삽입된 ATG 서열은 도입된 유전자의 개시 메티오닌 코돈으로 사용되어질 수 있다. 추가의 제한 부위(BglLL, NotI, SmaI, PmelI, HindIII, SpeI 그리고 XhoI)는 클로닝 과정을 촉진하게 하는데 포함된다. 이 발현 벡터 카세트의 기능성은 5'말단의 NdeI 부위와 3'말단의 XhoI 부위로 sfp 버전을 생성시키기 위해 PCR을 사용하여 시험되었다. 이 단편은 발현 카세트로 클로닝되고 Orf A, B* 및 C 발현 벡터와 함께 대장균으로 전달되었다. DHA로 축적된 이 세포들은 적절한 조건 하에 기능적인 sfp가 제조되었음을 입증하였다.
본 발명자들은 아는 한도 내에서는, Het I는 이형성의 상황에서는 이전에 시험되어보지 않았다. Het I는 장쇄 하이드록시 지방산의 합성에 책임 있는 것으로 알려진 노스톡에 있는 유전자 무리(cluster)에 존재한다. 상기 장쇄 하이드록시 지방산은 유기체의 헤테로사이트(heterocyte)에 존재하는 글리코 리피드 층의 구성요소이다. 본 발명자들은, 이론과 상관없이, Het I가 무리에 존재하는 단백질, Hgl E의 ACP 도메인을 활성화시키는 것으로 믿는다. Hgl E의 두 ACP 도메인은 스키조카이트리움 OrfA에서 볼 수 있는 ACP 도메인에 고도의 서열 상동성을 갖는다. Het I의 내인성 개시 코돈은 동정되지 않았다(추정의 단백질에 메티오닌이 존재하지 않는다). 오픈 리딩 프레임의 5'말단 근방에 여러 잠재적인 대안의 개시 코돈(예를 들어 TTG와 ATT)이 존재한다. HetI 유전자를 코딩한 노스톡 DNA 영역의 서열은 서열번호: 81에서 볼 수 있다. 서열번호: 82는 서열번호: 81에 의해 코딩된 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 81을 참조하면, 구조의 의미없는 세 개(TAA)로 나타내지는 업스트림 코딩 영역을 서열번호:81의 위치 1-3으로 제한하고, 정지 코돈(TGA)으로 서열번호: 81의 위치 715-717에서 종결한다. 이 서열에는 메티오닌 코돈(ATG)은 존재하지 않는다. 잠재적인 대안의 개시 코돈은: TTG 코돈(서열번호: 81의 위치 4-6, 7-9 그리고 49-51), ATT(서열번호: 81의 위치 76-78) 그리고 GTG(서열번호: 81의 위치 235-237). Het I 발현 작제물은 PCR을 이용해 가장 먼 5' 잠재적인 대행 개시 코돈(TTG)을 메티오닌 코돈(ATG, 상기에서 설명한 NdeI 제한 효소 인식 부위의 일부)으로 대체하고 코딩 서열의 3'말단에 XhoI 부위를 도입함으로 만들어졌다. 변형된 HetI 코딩 서열은 sfp 조절 요소를 포함하고 있는 pACYC 184 벡터 작제물의 NdeI와 XhoI 부위로 삽입되었다. 대장균에 있는 이 HetI 작제물의 발현은 서열 데이터로부터 기대했던 크기의 신규한 단백질의 출현을 결과로 가져온다. 여러 조건 하에 대장균에서 스키조카이트리움 Orfs A, B*, C와 함께 HetI의 공동발현은 이러한 세포들에 DHA와 DPA의 축적을 결과로 가져온다. sfp와 Het I가 비교된 모든 실험에서, HetI 작제물을 포함하는 경우, sfp 작제물을 포함하는 경우보다 세포에 DHA 와 DPA가 많이 축적되었다.
대장균 형질전환체에서 DHA 와 DPA 의 제조
코딩하는 두개의 플라스미드: (1)스키조카이트리움 PUFA PKS 유전자 (Orfs A, B* 및 C) 그리고 (2) 유도할 수 있는 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하고 있는 대장균 균주 BL21로 PPTase(sfp 혹은 HetI으로부터)가 형질전환되었다. PPTase의 발현이 별도의 조절하는 요소에 의해 통제되는 동안, 스키조카이트리움 단백질의 합성은 IPTG의 배지로의 첨가에 의해 유도되었다(위를 참조). 두 가지 이형성의 PPTase 유전자 중에서 하나를 이용하면서 세포는 다양한 한정된 조건하에서 성장하였다. 세포는 채취되었고, 지방산은 메틸에스테르(FAME)로 전환되었고 기체-액체 크로마토그래피를 사용해서 분석되어졌다.
여러 가지 조건 하에, DHA와 DPA가 스키조카이트리움 PUFA PKS 유전자와 두 가지 이형성의 PPTase 둘 중 하나를 발현하는 대장균 세포에서 감지되었다. DHA 혹은 DPA가 대조군 세포로부터 만들어진 FAME에서는 감지되지 않았다(즉, Orf 중 하나가 부족한 플라스미드로 형질전환된 세포). 대장균에서 관찰된 DHA대 DPA의 비율은 스키조카이트리움에서 관찰되는 내인성의 DHA와 DPA 제조 비율에 근접했다. 전체 FAME의 ~17%를 나타내는, PUFA(DHA 더하기 DPA)의 가장 높은 수준이 10%(중량) 글리세린으로 보충된 765 배지(American Type Culture Collection에서 방법을 입수할 수 있는)에서 32℃에서 성장한 세포에서 발견되었다. PUFA 축적은 또한 세포가 5 내지 10% 글리세린으로 보충된 루리아 브로스(Luria Broth)에서 20℃에서 성장하였을 때 관찰될 수 있음을 주목한다. 각각의 플라스미드의 존재를 위한 선별은 성장하는 동안 적절한 항생제를 포함시킴으로써 유지되었고 IPTG(0.5mM의 최종 농도)는 Orf A, B* 및 C의 발현을 유도하게 위해 이용되어졌다.
도 4는 대조군 세포와 스키조카이트리움 PUFA PKS 유전자 더하기 PPTase(이 경우 Het I)를 발현하는 세포 및 대조군 세포로부터 추출한 FAME의 기체-액체 크로마토그래피에 의한 예로서의 크로마토그램을 보여준다. 표지된 FAME의 동정은 질량 분석기를 이용해 확인되었다.
실시예3
다음의 실시예는 스키조카이트리움 PUFA PKS 효소 복합체를 코딩한 유전자가 선별적으로 비활성화(녹아웃)될 수 있음을 보여주는데, 이는 배지가 다중불포화지방산으로 보충되지 않는 한 치명적인 표현형이다.
상동성의 재조합은 스키조카이트리움(미국특허출원 제10/124,807호, 인용문으로 전문이 여기 실렸다)에서 보여주었다. 스키조카이트리움 OrfA(서열번호: 1)를 비활성화하도록 설계된 플라스미드가 Zeocin™ 저항 마커를 Orf A코딩 서열을 포함하는 클론의 Sma I 부위로 삽입함으로써 만들어졌다. Zeocin™ 저항 마커는 플라스미드 pMON50000으로부터 얻었고 - Zeocin™저항 유전자의 발현은 튜불린 프로모터 요소로부터 추출된 스키조카이트리움에 의해 추진되었다(미국특허출원 제10/124,807호 참조). 녹아웃 작제물은 다음과 같이 구성된다: 5' 스키조카이트리움 OrfA 코딩 서열, tub-Zeocin™ 저항 요소 그리고 3'스키조카이트리움 OrfA 코딩 서열, 모두 pBluescript II SK (+)벡터(유전자층)으로 클론화.
플라스미드는 입자 사격(particle bombardment)에 의해 스키조카이트리움에 도입되었고, 형질전환체는 Zeocin™을 함유한 플레이트에 선별되어지고, 다중불포화지방산(PUFA)으로 보충되어졌다(실시예 4 참조). Zeocin™ 더하기 PUFA 플레이트에서 성장하는 콜로니는 PUFA 보충물 없이도 플레이트에서 성장하는 능력을 테스트 받았고 여러 PUFA를 필요로 함을 발견하였다. 이러한 PUFA 영양 요구체는 추정되고 있는 OrfA 녹아웃이다. 이러한 몇몇의 돌연변이체로부터 추출한 RNA의 노던 블롯 분석은 전장의 OrfA 메시지가 이러한 돌연변이체에서는 제조되지 않았음을 확증해주었다. 이러한 실험은 스키조카이트리움 유전자(예를 들면, OrfA)가 상동성의 재조합을 통해 비활성화할 수 있고, OrfA의 비활성화는 치명적인 표현형의 결과를 낳고, 이러한 돌연변이체는 PUFA를 가지고 있는 배지의 보충물을 통해 제조될 수 있다는 사실을 보여준다.
스키조카이트리움 OrfB(서열번호: 3)과 OrfC(서열번호: 5)의 비활성화를 지시한 유사한 세트의 실험은 유사한 결과를 가져왔다. 즉 OrfB와 OrfC는 상동성의 재조합에 의해 개별적으로 비활성화될 수 있고 이러한 세포는 성장을 위해 PUFA 보충을 필요로 한다.
실시예 4
다음의 실시예는 PUFA 영양요구체가 EPA로 보충된 배지에서 유지될 수 있음을 보여주는데, 이는 EPA가 스키조카이트리움에서 DHA를 대체할 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 3에서 설명했듯이, PUFA PKS 복합체가 비활성화된 스키조카이트리움 세포는 PUFA가 생존하기 위해서는 보충물이 필요하다. 스키조카이트리움이 성장을 위해 본 시스템의 생산물에 의존한다는 것을 입증하는 것 외에, 이 실험적인 시스템은 이 돌연변이체를 구제할 수 있는 다양한 지방산의 능력을 시험해보는 것을 허용한다. 돌연변이 세포(세 유전자 중 어느 것이든 비활성화된)가 DHA로 보충한 배지에서 잘 성장하였듯이 EPA로 보충한 배지서도 잘 성장함을 발견하였다. 이러한 결과는 DHA를 제조하는 내인성의 PUFA PKS 복합물이 EPA를 제조하는 물질로 대체되었을 때, 세포가 생존 가능함을 의미한다. 또한, 이러한 돌연변이 세포는 ARA 혹은 GLA의 보충에 의해 구제될 수 있는데, 이는 이러한 생산물을 제조하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움을 제조하는 실행성 여부를 입증하는 것이다. PUFA로 보충하는 바람직한 방법은 PUFA를 배지에 첨가하기 전에 유리 지방산을 부분적으로 메틸화된 베타-사이클로덱스트린과 합치는 것에 관계한다.
실시예 5
다음의 실시예는 비활성화된 PUFA 유전자가, PUFA 합성을 복원하기 위해 같은 부위에서 유전자의 활성화된 형태로 대체될 수 있음을 보여준다.
아세토락테이트 신타제 유전자 부위에서의 이중의 상동성의 재조합은 스키조카이트리움에서 입증되었다 (미국특허출원 제10/124,807호 참조). 본 발명자들은 스키조카이트리움 OrfA 녹아웃 균주의 형질전환에 의한 스키조카이트리움 PUFA 유전자의 대체를 전장의 스키조카이트리움 OrfA 게놈 클론으로 하는 개념을 테스트해봤다. 형질전환체가 보충하는 PUFA 없이 배지에서 성장하는 능력에 따라 선별되어졌다. 이러한 PUFA 원시영양체(prototroph)는 Zeocin™에 대한 내성에 대해 테스트 받고 항생제에 민감한 몇 가지를 찾았다. 이러한 결과는 도입된 스키조카이트리움 OrfA가 Zeocin™ 저항 유전자를 녹아웃 균주에서 이중의 상동성의 재조합을 통해 대체하였음을 보여준다. 이러한 실험은 PUFA PKS 유전자내에서 유전자 대체에 대한 개념의 입증을 보여준다. 스키조카이트리움 OrfB와 OrfC의 녹아웃에 대한 유사한 실험도 같은 결과를 가져왔다.
실시예 6
이 실시예는 트라우스토카이트리움 23B PUFA PKS 유전자 전부 혹은 일부가 스키조카이트리움에서 기능할 수 있음을 보인다.
미국특허출원 10/124,800호에 개시된 것처럼, DHA를 제조하는 원생생물 트라우스토카이트리움 23B(Th.23B)는 orfA, orfB 및 orfC의 상동체를 포함하고 있음을 보여준다. 3개의 Th.23B 유전자의 완전한 게놈의 클론이 동족의 orf "녹-아웃"을 포함한 스키조카이트리움 균주를 형질전환하는데 사용하곤 하였다. 보완해주는 형질전환체에 대한 직접적인 선별이 PUFA 보충의 부재중에 행해졌다. 이 방법에 의해 Th. 23B orfA와 orfC 유전자는 PUFA 원시영양으로의, 각각, 스키조카이트리움 orfA, orfC 녹아웃 균주를 보완할 수 있음을 보인다. 보완의 형질전환체가 Zeocin™ 내성을 보유하거나 잃어버린 것으로 발견되었다(스키조카이트리움 유전자에 삽입된 마커는 그래서 녹아웃을 규정한다). Zeocin™ 내성 보완의 형질전환체는 각각의 orf 영역의 스키조카이트리움 게놈 외부로 전체 트라우스토카이트리움 유전자의 단독의 크로스오버 통합에 의해 발생하는 경향이 있다. 이러한 결과는 전체의 트라우스토카이트리움 유전자가 스키조카이트리움에 기능하고 있음을 보인다. Zeocin™ -민감한 보완의 형질전환체는 트라우스토카이트리움 유전자의 부분(혹은 인지할 수 있는 전부)이 중단된 Zeocin™ 내성 마커를 포함하는 스키조카이트리움 유전자의 동족 영역을 기능적으로 대체하는 이중의 크로스오버 이벤트에 의해 발생하는 경향이 있다. 이러한 결과는 트라우스토카이트리움 유전자의 분획이 스키조카이트리움에서 기능함을 보인다.
실시예 7
다음의 실시예는 PUFA PKS 유사한 유전자를 포함한 일정한 EPA를 제조하는 박테리아가 스키조카이트리움의 변형에 적합함을 보여준다.
쉐와넬라 속의 두 가지의 EPA-제조하는 해양 박테리아 균주는 스키조카이트리움 발효의 전형적인 온도에서 성장하고 PUFA PKS와 유사한 유전자를 갖고 있음을 보여준다. 쉐와넬라 올레야나(Australian Collection of Antarctic Microorganism (ACAM) 균주번호 644; SKerratt et al. Int . J. Syst . Evol . Microbiol . 52,2101(2002))는 EPA를 제조하고 30℃에서까지 성장한다. 쉐와넬라 자포니카(American Type Culture Collection(ATCC) 균주번호 BAA-316; Ivanova et al. Int. J. Syst . Evol . Microbiol . 51, 1027(2001))는 EPA를 제조하고 35℃에서까지 성장한다.
이러한 박테리아 균주로부터 PUFA-PKS 유전자를 동정하고 분리시키기 위해서는, orf5/pfaA유전자의 KS-MAT 영역과 박테리아의 orf7/pfaC 유전자의 DH-DH 영역을 위한 PCR 프라이머 쌍을 축퇴시키고, 이 유전자들은 쉐와넬라 SCRC-2738, 쉐와넬라 오네이덴시스 MR-1; 쉐와넬라 sp. GA-22; 포토박터 프로펀둠, 그리고 모리텔라 마리나 (상기의 설명 참조)를 위한 공개된 유전자 서열에 기초한다. 특히 프라이머 및 PCR 조건은 다음과 같이 설계되었다.
KS / AT 영역을 위한 프라이머; 이하의 공개된 서열을 기초하여: 쉐와넬라 sp. SCRC-2738; 쉐와넬라 오네이덴시스 MR-1; 포토박터 프로펀둠; 모리텔라 마리나:
prRZ23 GGYATGMTGRTTGGTGAAGG (정방향: 서열번호: 69)
prRZ24 TRTTSASRTAYTGYGAACCTTG (역방향; 서열번호: 70)
DH 영역을 위한 프라이머: 이하의 공개된 서열을 기초하여: 쉐와넬라 sp. GA-22; 쉐와넬라 sp. SCRC-2738; 포토박터 프로펀둠; 모리텔라 마리나:
prRZ28 ATGKCNGAAGGTTGTGGCCA (정방향; 서열번호: 71)
prRZ29 CCWGARATRAAGCCRTTDGGTTG (역방향; 서열번호: 72)
PCR 조건(주형으로서의 박테리아 염색체 DNA)은 다음과 같았다:
반응 혼합물:
0.2 μM dNTPs
0.1 μM 각 프라이머
8% DMSO
250ng 염색체의 DNA
2.5U Herculaseㄾ DNA polymerase (Stratagene)
1X Herculaseㄾ 완충액
50μL 총 부피
PCR 프로토콜:(1) 98℃에서 3분; (2) 98℃에서 40초; (3) 56℃에서 30초; (4) 72℃에서 90초; (5) 2-4단계를 29 사이클로 반복; (6) 72℃에서 10분; (7) 6℃에서 보존.
양 프라이머 쌍을 위해, PCR은 쉐와넬라 올레야나 혹을 쉐와넬라 자포니카 둘중 하나로부터 염색체의 DNA 주형을 이용하여 예상의 크기를 가진 별개의 생산물을 주었다. 4가지 각기의 PCR 산물은 pCR-BLUNT II-TOPO(Invitrogen)으로 클로닝되고 서열을 삽입하는 것은 M13 정방향과 역방향의 프라이머를 이용해 결정되었다. 이 모든 경우, 수득한 DNA 서열은 공지된 박테리아의 PUFA PKS 유전자 영역에 매우 상동성이 있었다.
박테리아의 PCR 산물로부터 수득한 DNA 서열은 공지된 서열과, 그리고 표준의 Blastx 조사(BLAST 파라미터: 낮은 복잡성 필터; 온 ; 매트릭스; BLOSUM62; 단어 크기 3; 캡-cost: 존재 11, 연장 1(Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J.(1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: "A new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 전문을 인용문으로 실었다))에서 스키조카이트리움 ATCC 20888에서 유래한 PUFA PKS 유전자와 비교되었다.
아미노산 수준에서, 서열번호: 76에 의해 코딩된 아미노산 서열을 추론한 쉐와넬라 올레야나 ACAM644 케토아실 신타제/아실 트랜스페라제(KS-AT)에 고도로 상동성 있는 서열은: 포토박터 프로펀둠 pfaA(동일성 = 70%; 파지티브=81%);쉐와넬라 오네이덴시스 MR-1 "복수 도메인 ㅯ-케토아실 신타제"(동일성=66%; 파지티브=77%); 모리텔라 마리나 ORF8(동일성=56%; 파지티브=71%). 스키조카이트리움 sp. ATCC 20888 orfA는 서열번호: 76에 의해 코딩된 추론된 아미노산 서열에 41% 동일하고 56% 파지티브했다.
아미노산 수준에서 서열번호: 78에 의해 코딩된 아미노산 서열을 추론한 쉐와넬라 자포니카 ATCCBAA-316 케토아실 신타제/아실 트랜스퍼라제(KS-AT)에 고도로 상동성 있는 서열은: 쉐와넬라 오네이덴시스 MR-1 "복수 도메인 β-케토아실 신타제"(동일성=67%; 파지티브=79%); 쉐와넬라 sp. SCRC-2738 orf5(동일성=69%;파지티브=79%); 모리텔라 마리나 ORF8(동일성=56%; 파지티브=70%). 스키조카이트리움 sp. ATCC 20888 orfA는 서열번호: 78에 의해 코딩된 추론된 아미노산 서열에 41% 동일하고 55% 파지티브했다.
아미노산 수준에서, 서열번호: 75에 의해 코딩된 아미노산 서열을 추론한 쉐와넬라 올레야나 ACAM644 탈수소효소(DH)에 고도로 상동성 있는 서열은: 쉐와넬라 sp. SCRC-2738 orf7(동일성=77%; 파지티브=86%); 포토박터 프로펀둠 pfaC(동일성=72%; 파지티브=81%);쉐와넬라 오네이덴시스 MR-1 "복수 도메인 ㅯ-케토아실 신타제"(동일성=75%; 파지티브=83%). 스키조카이트리움 sp. ATCC 20888 orfC는 서열번호: 75에 의해 코딩된 추론된 아미노산 서열에 26% 동일하고 42% 파지티브했다.
아미노산 수준에서, 서열번호: 77에 의해 코딩된 아미노산 서열을 추론한 쉐와넬라 자포니카 ATCC BAA-316 탈수소효소(DH)에 고도로 상동성 있는 서열은: 쉐와넬라 sp. SCRC-2738 orf7(동일성=77%; 파지티브=86%); 포토박터 프로펀둠 pfaC(동일성=73%; 파지티브=83%); 쉐와넬라 오네이덴시스 MR-1 "복수 도메인 ㅯ-케토아실 신타제"(동일성=74%; 파지티브=81%). 스키조카이트리움 sp. ATCC 20888 orfC는 서열번호: 77에 의해 코딩된 추론된 아미노산 서열에 27% 동일하고 42% 파지티브했다.
상기 두 가지 쉐와넬라 균주의 PUFA PKS 유전자 세트는 스키조카이트리움 PUFA 제조의 변형을 위한 개별적인 도메인이나 전체 유전자의 유익한 원천을 제공할 것이다. 그 때문에 쉐와넬라 올레야나 혹을 쉐와넬라 자포니카에 의해 코딩된 PUFA PKS 유전자와 단백질과 도메인은 본 발명에 명백하게 포함될 것이다.
실시예8
본 실시예는 실시예 7에서 설명한 박테리아의 PUFA PKS 유전자 단편이 스키조카이트리움에서 PUFA 제조를 변형하는데 어떻게 이용될지를 보여준다.
현재까지 알려진 박테리아의 PUFA PKS 유전자 예는 3개의 유전자로 된 스키조카이트리움과 같은 도메인을 포함한 4개의 가깝게 연결되 유전자로 존재한다. 쉐와넬라 올레야나 그리고 쉐와넬라 자포니카에서의 PUFA PKS유전자는 빽빽하게 밀집된 배열에서 찾기가 쉽다. 실시예 7에서 동정한 상동성의 영역은 쉐와넬라 올레야나와 쉐와넬라 자포니카 DNA의 클론 은행으로부터 PUFA PKS 유전자 무리를 분리시키는데 쓰인다. 클론 은행은 박테리오파지 람다 벡터, 코스미드 벡터, 박테리아의 인공의 염색체 ("BAC")벡터, 혹은 당업계에 공지된 다른 방법으로 작제될 수 있다. 박테리아의 PUFA PKS 유전자를 포함한 바람직한 클론은 유전자 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 실시예 7의 부분적인 유전자 서열의 PCR에서 생성된 프로브를 이용하여 콜로니나 플라크 혼성화(실시예 1에서 설명한 것 처럼)에 의해 동정될 수 있다. 신규한 박테리아의 PUFA PKS 유전자 세트의 전체의 DNA 서열은 내인성의 PUFA PKS 유전자(실시예 3, 5 및 6을 참조)에 결여된 스키조카이트리움 균주의 형질전환을 위하여 벡터를 설계하는데 이용된다. 전체의 박테리아 유전자(서열을 코딩하는)는 스키조카이트리움 유전자 전체를 대체하는데 이용될 수 있다. 그래서 스키조카이트리움 유전자 발현 영역을 활용하고, 4번째의 박테리아 유전자는 게놈내에서 다른 위치로 표적화할 수도 있다. 대안으로 개별적인 박테리아의 PUFA PKS 기능적인 도메인은 "스왑(swapped)" 또는 상동성의 재조합 기술과 유사한, 유사의 스키조카이트리움 도메인과 교환될 수도 있다. 박테리아의 PUFA PKS 유전자 또는 도메인의 서열은 스키조카이트리움 코돈 사용의 세세한 내용을 수용하기 위해서는 변형되어야 할지 모르지만, 이는 당업계의 기술능력 내에서이다.
인용되거나 설명되어진 각각의 공개적인 논문은 전문을 인용문으로 실었다. 본 출원은 다음의 출원을 참조하여 병합한다. 2003년 3월 26일에 출원한 미국 가출원 제60/457,979호; 2002년 4월 16일에 출원한 미국특허출원 제10/124,800호; 2001년 6월 15일에 출원한 미국 가출원 제60/298,796호; 2001년 9월 18일에 출원한 미국 가출원 제60/323,269호; 현재 미국특허출원 제6,566,583호이고, 1999년 1월 14일에 출원한 미국특허출원 제09/231,899호, 미국특허출원 제6,140,486호이고, 1998년 6월4일에 출원한 미국특허출원 제09/090,793호.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업계에서는 본 발명 양태의 변형이나 각색이 일어날 수 있음은 자명한 일이다. 그러므로 모든 변경 또는 변형은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 하고, 이는 후술하는 특허청구범위에 설명되어있다.
<110> MARTEK BIOSCIENCES CORPORATION <120> PUFA polyketide synthase systems and uses thereof <130> 2997-49-pct <150> US 60/457,979 <151> 2003-03-26 <160> 82 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8730 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(8730) <400> 1 atg gcg gcc cgt ctg cag gag caa aag gga ggc gag atg gat acc cgc 48 Met Ala Ala Arg Leu Gln Glu Gln Lys Gly Gly Glu Met Asp Thr Arg 1 5 10 15 att gcc atc atc ggc atg tcg gcc atc ctc ccc tgc ggc acg acc gtg 96 Ile Ala Ile Ile Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Cys Gly Thr Thr Val 20 25 30 cgc gag tcg tgg gag acc atc cgc gcc ggc atc gac tgc ctg tcg gat 144 Arg Glu Ser Trp Glu Thr Ile Arg Ala Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp 35 40 45 ctc ccc gag gac cgc gtc gac gtg acg gcg tac ttt gac ccc gtc aag 192 Leu Pro Glu Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Phe Asp Pro Val Lys 50 55 60 acc acc aag gac aag atc tac tgc aag cgc ggt ggc ttc att ccc gag 240 Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Glu 65 70 75 80 tac gac ttt gac gcc cgc gag ttc gga ctc aac atg ttc cag atg gag 288 Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu 85 90 95 gac tcg gac gca aac cag acc atc tcg ctt ctc aag gtc aag gag gcc 336 Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys Glu Ala 100 105 110 ctc cag gac gcc ggc atc gac gcc ctc ggc aag gaa aag aag aac atc 384 Leu Gln Asp Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Lys Glu Lys Lys Asn Ile 115 120 125 ggc tgc gtg ctc ggc att ggc ggc ggc caa aag tcc agc cac gag ttc 432 Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ser Ser His Glu Phe 130 135 140 tac tcg cgc ctt aat tat gtt gtc gtg gag aag gtc ctc cgc aag atg 480 Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met 145 150 155 160 ggc atg ccc gag gag gac gtc aag gtc gcc gtc gaa aag tac aag gcc 528 Gly Met Pro Glu Glu Asp Val Lys Val Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala 165 170 175 aac ttc ccc gag tgg cgc ctc gac tcc ttc cct ggc ttc ctc ggc aac 576 Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn 180 185 190 gtc acc gcc ggt cgc tgc acc aac acc ttc aac ctc gac ggc atg aac 624 Val Thr Ala Gly Arg Cys Thr Asn Thr Phe Asn Leu Asp Gly Met Asn 195 200 205 tgc gtt gtc gac gcc gca tgc gcc tcg tcc ctc atc gcc gtc aag gtc 672 Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile Ala Val Lys Val 210 215 220 gcc atc gac gag ctg ctc tac ggt gac tgc gac atg atg gtc acc ggt 720 Ala Ile Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Met Met Val Thr Gly 225 230 235 240 gcc acc tgc acg gat aac tcc atc ggc atg tac atg gcc ttc tcc aag 768 Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys 245 250 255 acc ccc gtg ttc tcc acg gac ccc agc gtg cgc gcc tac gac gaa aag 816 Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys 260 265 270 aca aag ggc atg ctc atc ggc gag ggc tcc gcc atg ctc gtc ctc aag 864 Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met Leu Val Leu Lys 275 280 285 cgc tac gcc gac gcc gtc cgc gac ggc gat gag atc cac gct gtt att 912 Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Glu Ile His Ala Val Ile 290 295 300 cgc ggc tgc gcc tcc tcc agt gat ggc aag gcc gcc ggc atc tac acg 960 Arg Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr 305 310 315 320 ccc acc att tcg ggc cag gag gag gcc ctc cgc cgc gcc tac aac cgc 1008 Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Asn Arg 325 330 335 gcc tgt gtc gac ccg gcc acc gtc act ctc gtc gag ggt cac ggc acc 1056 Ala Cys Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu Gly His Gly Thr 340 345 350 ggt act ccc gtt ggc gac cgc atc gag ctc acc gcc ttg cgc aac ctc 1104 Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu 355 360 365 ttt gac aag gcc tac ggc gag ggc aac acc gaa aag gtc gct gtg ggc 1152 Phe Asp Lys Ala Tyr Gly Glu Gly Asn Thr Glu Lys Val Ala Val Gly 370 375 380 agc atc aag tcc agc atc ggc cat ctc aag gcc gtc gcc ggt ctc gcc 1200 Ser Ile Lys Ser Ser Ile Gly His Leu Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala 385 390 395 400 ggt atg atc aag gtc atc atg gcg ctc aag cac aag act ctc ccg ggc 1248 Gly Met Ile Lys Val Ile Met Ala Leu Lys His Lys Thr Leu Pro Gly 405 410 415 acc atc aac gtc gac aac cca ccc aac ctc tac gac aac acg ccc atc 1296 Thr Ile Asn Val Asp Asn Pro Pro Asn Leu Tyr Asp Asn Thr Pro Ile 420 425 430 aac gag tcc tcg ctc tac att aac acc atg aac cgc ccc tgg ttc ccg 1344 Asn Glu Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Thr Met Asn Arg Pro Trp Phe Pro 435 440 445 ccc cct ggt gtg ccc cgc cgc gcc ggc att tcg agc ttt ggc ttt ggt 1392 Pro Pro Gly Val Pro Arg Arg Ala Gly Ile Ser Ser Phe Gly Phe Gly 450 455 460 ggc gcc aac tac cac gcc gtc ctc gag gag gcc gag ccc gag cac acg 1440 Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu Glu Ala Glu Pro Glu His Thr 465 470 475 480 acc gcg tac cgc ctc aac aag cgc ccg cag ccc gtg ctc atg atg gcc 1488 Thr Ala Tyr Arg Leu Asn Lys Arg Pro Gln Pro Val Leu Met Met Ala 485 490 495 gcc acg ccc gcg gcc ctc cag tcg ctc tgc gag gcc cag ctc aag gag 1536 Ala Thr Pro Ala Ala Leu Gln Ser Leu Cys Glu Ala Gln Leu Lys Glu 500 505 510 ttc gag gcc gcc atc aag gag aac gag acc gtc aag aac acc gcc tac 1584 Phe Glu Ala Ala Ile Lys Glu Asn Glu Thr Val Lys Asn Thr Ala Tyr 515 520 525 atc aag tgc gtc aag ttc ggc gag cag ttc aaa ttc cct ggc tcc atc 1632 Ile Lys Cys Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Lys Phe Pro Gly Ser Ile 530 535 540 ccg gcc aca aac gcg cgc ctc ggc ttc ctc gtc aag gat gct gag gat 1680 Pro Ala Thr Asn Ala Arg Leu Gly Phe Leu Val Lys Asp Ala Glu Asp 545 550 555 560 gcc tgc tcc acc ctc cgt gcc atc tgc gcc caa ttc gcc aag gat gtc 1728 Ala Cys Ser Thr Leu Arg Ala Ile Cys Ala Gln Phe Ala Lys Asp Val 565 570 575 acc aag gag gcc tgg cgc ctc ccc cgc gag ggc gtc agc ttc cgc gcc 1776 Thr Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Arg Ala 580 585 590 aag ggc atc gcc acc aac ggc gct gtc gcc gcg ctc ttc tcc ggc cag 1824 Lys Gly Ile Ala Thr Asn Gly Ala Val Ala Ala Leu Phe Ser Gly Gln 595 600 605 ggc gcg cag tac acg cac atg ttt agc gag gtg gcc atg aac tgg ccc 1872 Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Glu Val Ala Met Asn Trp Pro 610 615 620 cag ttc cgc cag agc att gcc gcc atg gac gcc gcc cag tcc aag gtc 1920 Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser Lys Val 625 630 635 640 gct gga agc gac aag gac ttt gag cgc gtc tcc cag gtc ctc tac ccg 1968 Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu Tyr Pro 645 650 655 cgc aag ccg tac gag cgt gag ccc gag cag aac ccc aag aag atc tcc 2016 Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asn Pro Lys Lys Ile Ser 660 665 670 ctc acc gcc tac tcg cag ccc tcg acc ctg gcc tgc gct ctc ggt gcc 2064 Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu Gly Ala 675 680 685 ttt gag atc ttc aag gag gcc ggc ttc acc ccg gac ttt gcc gcc ggc 2112 Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala Ala Gly 690 695 700 cat tcg ctc ggt gag ttc gcc gcc ctc tac gcc gcg ggc tgc gtc gac 2160 His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys Val Asp 705 710 715 720 cgc gac gag ctc ttt gag ctt gtc tgc cgc cgc gcc cgc atc atg ggc 2208 Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile Met Gly 725 730 735 ggc aag gac gca ccg gcc acc ccc aag gga tgc atg gcc gcc gtc att 2256 Gly Lys Asp Ala Pro Ala Thr Pro Lys Gly Cys Met Ala Ala Val Ile 740 745 750 ggc ccc aac gcc gag aac atc aag gtc cag gcc gcc aac gtc tgg ctc 2304 Gly Pro Asn Ala Glu Asn Ile Lys Val Gln Ala Ala Asn Val Trp Leu 755 760 765 ggc aac tcc aac tcg cct tcg cag acc gtc atc acc ggc tcc gtc gaa 2352 Gly Asn Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Ser Val Glu 770 775 780 ggt atc cag gcc gag agc gcc cgc ctc cag aag gag ggc ttc cgc gtc 2400 Gly Ile Gln Ala Glu Ser Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val 785 790 795 800 gtg cct ctt gcc tgc gag agc gcc ttc cac tcg ccc cag atg gag aac 2448 Val Pro Leu Ala Cys Glu Ser Ala Phe His Ser Pro Gln Met Glu Asn 805 810 815 gcc tcg tcg gcc ttc aag gac gtc atc tcc aag gtc tcc ttc cgc acc 2496 Ala Ser Ser Ala Phe Lys Asp Val Ile Ser Lys Val Ser Phe Arg Thr 820 825 830 ccc aag gcc gag acc aag ctc ttc agc aac gtc tct ggc gag acc tac 2544 Pro Lys Ala Glu Thr Lys Leu Phe Ser Asn Val Ser Gly Glu Thr Tyr 835 840 845 ccc acg gac gcc cgc gag atg ctt acg cag cac atg acc agc agc gtc 2592 Pro Thr Asp Ala Arg Glu Met Leu Thr Gln His Met Thr Ser Ser Val 850 855 860 aag ttc ctc acc cag gtc cgc aac atg cac cag gcc ggt gcg cgc atc 2640 Lys Phe Leu Thr Gln Val Arg Asn Met His Gln Ala Gly Ala Arg Ile 865 870 875 880 ttt gtc gag ttc gga ccc aag cag gtg ctc tcc aag ctt gtc tcc gag 2688 Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Lys Leu Val Ser Glu 885 890 895 acc ctc aag gat gac ccc tcg gtt gtc acc gtc tct gtc aac ccg gcc 2736 Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Val Thr Val Ser Val Asn Pro Ala 900 905 910 tcg ggc acg gat tcg gac atc cag ctc cgc gac gcg gcc gtc cag ctc 2784 Ser Gly Thr Asp Ser Asp Ile Gln Leu Arg Asp Ala Ala Val Gln Leu 915 920 925 gtt gtc gct ggc gtc aac ctt cag ggc ttt gac aag tgg gac gcc ccc 2832 Val Val Ala Gly Val Asn Leu Gln Gly Phe Asp Lys Trp Asp Ala Pro 930 935 940 gat gcc acc cgc atg cag gcc atc aag aag aag cgc act acc ctc cgc 2880 Asp Ala Thr Arg Met Gln Ala Ile Lys Lys Lys Arg Thr Thr Leu Arg 945 950 955 960 ctt tcg gcc gcc acc tac gtc tcg gac aag acc aag aag gtc cgc gac 2928 Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val Ser Asp Lys Thr Lys Lys Val Arg Asp 965 970 975 gcc gcc atg aac gat ggc cgc tgc gtc acc tac ctc aag ggc gcc gca 2976 Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly Ala Ala 980 985 990 ccg ctc atc aag gcc ccg gag ccc gtt gtc gac gag gcc gcc aag cgc 3024 Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro Val Val Asp Glu Ala Ala Lys Arg 995 1000 1005 gag gcc gag cgt ctc cag aag gag ctt cag gat gcc cag cgc cag 3069 Glu Ala Glu Arg Leu Gln Lys Glu Leu Gln Asp Ala Gln Arg Gln 1010 1015 1020 ctc gac gac gcc aag cgc gcc gcc gcc gag gcc aac tcc aag ctc 3114 Leu Asp Asp Ala Lys Arg Ala Ala Ala Glu Ala Asn Ser Lys Leu 1025 1030 1035 gcc gct gcc aag gag gag gcc aag acc gcc gct gct tcg gcc aag 3159 Ala Ala Ala Lys Glu Glu Ala Lys Thr Ala Ala Ala Ser Ala Lys 1040 1045 1050 ccc gca gtt gac act gct gtt gtc gaa aag cat cgt gcc atc ctc 3204 Pro Ala Val Asp Thr Ala Val Val Glu Lys His Arg Ala Ile Leu 1055 1060 1065 aag tcc atg ctc gcg gag ctc gat ggc tac gga tcg gtc gac gct 3249 Lys Ser Met Leu Ala Glu Leu Asp Gly Tyr Gly Ser Val Asp Ala 1070 1075 1080 tct tcc ctc cag cag cag cag cag cag cag acg gcc ccc gcc ccg 3294 Ser Ser Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Thr Ala Pro Ala Pro 1085 1090 1095 gtc aag gct gct gcg cct gcc gcc ccc gtt gcc tcg gcc cct gcc 3339 Val Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser Ala Pro Ala 1100 1105 1110 ccg gct gtc tcg aac gag ctt ctt gag aag gcc gag act gtc gtc 3384 Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val 1115 1120 1125 atg gag gtc ctc gcc gcc aag acc ggc tac gag acc gac atg atc 3429 Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile 1130 1135 1140 gag gct gac atg gag ctc gag acc gag ctc ggc att gac tcc atc 3474 Glu Ala Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile 1145 1150 1155 aag cgt gtc gag atc ctc tcc gag gtc cag gcc atg ctc aat gtc 3519 Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val 1160 1165 1170 gag gcc aag gat gtc gat gcc ctc agc cgc act cgc act gtt ggt 3564 Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly 1175 1180 1185 gag gtt gtc aac gcc atg aag gcc gag atc gct ggc agc tct gcc 3609 Glu Val Val Asn Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ala 1190 1195 1200 ccg gcg cct gct gcc gct gct ccg gct ccg gcc aag gct gcc cct 3654 Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Lys Ala Ala Pro 1205 1210 1215 gcc gcc gct gcg cct gct gtc tcg aac gag ctt ctc gag aag gcc 3699 Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala 1220 1225 1230 gag acc gtc gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag act ggc tac gag 3744 Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu 1235 1240 1245 act gac atg atc gag tcc gac atg gag ctc gag act gag ctc ggc 3789 Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly 1250 1255 1260 att gac tcc atc aag cgt gtc gag atc ctc tcc gag gtt cag gcc 3834 Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala 1265 1270 1275 atg ctc aac gtc gag gcc aag gac gtc gac gct ctc agc cgc act 3879 Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1280 1285 1290 cgc act gtg ggt gag gtc gtc aac gcc atg aag gct gag atc gct 3924 Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asn Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala 1295 1300 1305 ggt ggc tct gcc ccg gcg cct gcc gcc gct gcc cca ggt ccg gct 3969 Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Gly Pro Ala 1310 1315 1320 gct gcc gcc cct gcg cct gcc gcc gcc gcc cct gct gtc tcg aac 4014 Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn 1325 1330 1335 gag ctt ctt gag aag gcc gag acc gtc gtc atg gag gtc ctc gcc 4059 Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala 1340 1345 1350 gcc aag act ggc tac gag act gac atg atc gag tcc gac atg gag 4104 Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu 1355 1360 1365 ctc gag acc gag ctc ggc att gac tcc atc aag cgt gtc gag att 4149 Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile 1370 1375 1380 ctc tcc gag gtc cag gcc atg ctc aac gtc gag gcc aag gac gtc 4194 Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val 1385 1390 1395 gac gct ctc agc cgc acc cgc act gtt ggc gag gtc gtc gat gcc 4239 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 1400 1405 1410 atg aag gcc gag atc gct ggt ggc tct gcc ccg gcg cct gcc gcc 4284 Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala 1415 1420 1425 gct gct cct gct ccg gct gct gcc gcc cct gcg cct gcc gcc cct 4329 Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 1430 1435 1440 gcg cct gct gtc tcg agc gag ctt ctc gag aag gcc gag act gtc 4374 Ala Pro Ala Val Ser Ser Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val 1445 1450 1455 gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag act ggc tac gag act gac atg 4419 Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met 1460 1465 1470 atc gag tcc gac atg gag ctc gag acc gag ctc ggc att gac tcc 4464 Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser 1475 1480 1485 atc aag cgt gtc gag att ctc tcc gag gtc cag gcc atg ctc aac 4509 Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn 1490 1495 1500 gtc gag gcc aag gac gtc gac gct ctc agc cgc acc cgc act gtt 4554 Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val 1505 1510 1515 ggc gag gtc gtc gat gcc atg aag gcc gag atc gct ggt ggc tct 4599 Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser 1520 1525 1530 gcc ccg gcg cct gcc gcc gct gct cct gct ccg gct gct gcc gcc 4644 Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala 1535 1540 1545 cct gcg cct gcc gcc cct gcg cct gcc gcc cct gcg cct gct gtc 4689 Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Val 1550 1555 1560 tcg agc gag ctt ctc gag aag gcc gag act gtc gtc atg gag gtc 4734 Ser Ser Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val 1565 1570 1575 ctc gcc gcc aag act ggc tac gag act gac atg att gag tcc gac 4779 Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp 1580 1585 1590 atg gag ctc gag acc gag ctc ggc att gac tcc atc aag cgt gtc 4824 Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 1595 1600 1605 gag att ctc tcc gag gtt cag gcc atg ctc aac gtc gag gcc aag 4869 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys 1610 1615 1620 gac gtc gac gct ctc agc cgc act cgc act gtt ggt gag gtc gtc 4914 Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val 1625 1630 1635 gat gcc atg aag gct gag atc gct ggc agc tcc gcc tcg gcg cct 4959 Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ala Pro 1640 1645 1650 gcc gcc gct gct cct gct ccg gct gct gcc gct cct gcg ccc gct 5004 Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1655 1660 1665 gcc gcc gcc cct gct gtc tcg aac gag ctt ctc gag aaa gcc gag 5049 Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu 1670 1675 1680 act gtc gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag act ggc tac gag act 5094 Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr 1685 1690 1695 gac atg atc gag tcc gac atg gag ctc gag act gag ctc ggc att 5139 Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile 1700 1705 1710 gac tcc atc aag cgt gtc gag atc ctc tcc gag gtt cag gcc atg 5184 Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met 1715 1720 1725 ctc aac gtc gag gcc aag gac gtc gat gcc ctc agc cgc acc cgc 5229 Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg 1730 1735 1740 act gtt ggc gag gtt gtc gat gcc atg aag gcc gag atc gct ggt 5274 Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly 1745 1750 1755 ggc tct gcc ccg gcg cct gcc gcc gct gcc cct gct ccg gct gcc 5319 Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala 1760 1765 1770 gcc gcc cct gct gtc tcg aac gag ctt ctc gag aag gcc gag act 5364 Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr 1775 1780 1785 gtc gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag act ggc tac gag acc gac 5409 Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp 1790 1795 1800 atg atc gag tcc gac atg gag ctc gag acc gag ctc ggc att gac 5454 Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp 1805 1810 1815 tcc atc aag cgt gtc gag att ctc tcc gag gtt cag gcc atg ctc 5499 Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu 1820 1825 1830 aac gtc gag gcc aag gac gtc gat gct ctc agc cgc act cgc act 5544 Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr 1835 1840 1845 gtt ggc gag gtc gtc gat gcc atg aag gct gag atc gcc ggc agc 5589 Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser 1850 1855 1860 tcc gcc ccg gcg cct gcc gcc gct gct cct gct ccg gct gct gcc 5634 Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala 1865 1870 1875 gct cct gcg ccc gct gcc gct gcc cct gct gtc tcg agc gag ctt 5679 Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Ser Glu Leu 1880 1885 1890 ctc gag aag gcc gag acc gtc gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag 5724 Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys 1895 1900 1905 act ggc tac gag act gac atg att gag tcc gac atg gag ctc gag 5769 Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu 1910 1915 1920 act gag ctc ggc att gac tcc atc aag cgt gtc gag atc ctc tcc 5814 Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser 1925 1930 1935 gag gtt cag gcc atg ctc aac gtc gag gcc aag gac gtc gat gcc 5859 Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala 1940 1945 1950 ctc agc cgc acc cgc act gtt ggc gag gtt gtc gat gcc atg aag 5904 Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys 1955 1960 1965 gcc gag atc gct ggt ggc tct gcc ccg gcg cct gcc gcc gct gcc 5949 Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala 1970 1975 1980 cct gct ccg gct gcc gcc gcc cct gct gtc tcg aac gag ctt ctt 5994 Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu 1985 1990 1995 gag aag gcc gag acc gtc gtc atg gag gtc ctc gcc gcc aag act 6039 Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr 2000 2005 2010 ggc tac gag acc gac atg atc gag tcc gac atg gag ctc gag acc 6084 Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr 2015 2020 2025 gag ctc ggc att gac tcc atc aag cgt gtc gag att ctc tcc gag 6129 Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu 2030 2035 2040 gtt cag gcc atg ctc aac gtc gag gcc aag gac gtc gac gct ctc 6174 Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu 2045 2050 2055 agc cgc act cgc act gtt ggc gag gtc gtc gat gcc atg aag gct 6219 Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala 2060 2065 2070 gag atc gct ggt ggc tct gcc ccg gcg cct gcc gcc gct gct cct 6264 Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro 2075 2080 2085 gcc tcg gct ggc gcc gcg cct gcg gtc aag att gac tcg gtc cac 6309 Ala Ser Ala Gly Ala Ala Pro Ala Val Lys Ile Asp Ser Val His 2090 2095 2100 ggc gct gac tgt gat gat ctt tcc ctg atg cac gcc aag gtg gtt 6354 Gly Ala Asp Cys Asp Asp Leu Ser Leu Met His Ala Lys Val Val 2105 2110 2115 gac atc cgc cgc ccg gac gag ctc atc ctg gag cgc ccc gag aac 6399 Asp Ile Arg Arg Pro Asp Glu Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Asn 2120 2125 2130 cgc ccc gtt ctc gtt gtc gat gac ggc agc gag ctc acc ctc gcc 6444 Arg Pro Val Leu Val Val Asp Asp Gly Ser Glu Leu Thr Leu Ala 2135 2140 2145 ctg gtc cgc gtc ctc ggc gcc tgc gcc gtt gtc ctg acc ttt gag 6489 Leu Val Arg Val Leu Gly Ala Cys Ala Val Val Leu Thr Phe Glu 2150 2155 2160 ggt ctc cag ctc gct cag cgc gct ggt gcc gct gcc atc cgc cac 6534 Gly Leu Gln Leu Ala Gln Arg Ala Gly Ala Ala Ala Ile Arg His 2165 2170 2175 gtg ctc gcc aag gat ctt tcc gcg gag agc gcc gag aag gcc atc 6579 Val Leu Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Ser Ala Glu Lys Ala Ile 2180 2185 2190 aag gag gcc gag cag cgc ttt ggc gct ctc ggc ggc ttc atc tcg 6624 Lys Glu Ala Glu Gln Arg Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser 2195 2200 2205 cag cag gcg gag cgc ttc gag ccc gcc gaa atc ctc ggc ttc acg 6669 Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr 2210 2215 2220 ctc atg tgc gcc aag ttc gcc aag gct tcc ctc tgc acg gct gtg 6714 Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val 2225 2230 2235 gct ggc ggc cgc ccg gcc ttt atc ggt gtg gcg cgc ctt gac ggc 6759 Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly Val Ala Arg Leu Asp Gly 2240 2245 2250 cgc ctc gga ttc act tcg cag ggc act tct gac gcg ctc aag cgt 6804 Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser Asp Ala Leu Lys Arg 2255 2260 2265 gcc cag cgt ggt gcc atc ttt ggc ctc tgc aag acc atc ggc ctc 6849 Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys Thr Ile Gly Leu 2270 2275 2280 gag tgg tcc gag tct gac gtc ttt tcc cgc ggc gtg gac att gct 6894 Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val Asp Ile Ala 2285 2290 2295 cag ggc atg cac ccc gag gat gcc gcc gtg gcg att gtg cgc gag 6939 Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val Arg Glu 2300 2305 2310 atg gcg tgc gct gac att cgc att cgc gag gtc ggc att ggc gca 6984 Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly Ala 2315 2320 2325 aac cag cag cgc tgc acg atc cgt gcc gcc aag ctc gag acc ggc 7029 Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 2330 2335 2340 aac ccg cag cgc cag atc gcc aag gac gac gtg ctg ctc gtt tct 7074 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser 2345 2350 2355 ggc ggc gct cgc ggc atc acg cct ctt tgc atc cgg gag atc acg 7119 Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Ile Arg Glu Ile Thr 2360 2365 2370 cgc cag atc gcg ggc ggc aag tac att ctg ctt ggc cgc agc aag 7164 Arg Gln Ile Ala Gly Gly Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Arg Ser Lys 2375 2380 2385 gtc tct gcg agc gaa ccg gca tgg tgc gct ggc atc act gac gag 7209 Val Ser Ala Ser Glu Pro Ala Trp Cys Ala Gly Ile Thr Asp Glu 2390 2395 2400 aag gct gtg caa aag gct gct acc cag gag ctc aag cgc gcc ttt 7254 Lys Ala Val Gln Lys Ala Ala Thr Gln Glu Leu Lys Arg Ala Phe 2405 2410 2415 agc gct ggc gag ggc ccc aag ccc acg ccc cgc gct gtc act aag 7299 Ser Ala Gly Glu Gly Pro Lys Pro Thr Pro Arg Ala Val Thr Lys 2420 2425 2430 ctt gtg ggc tct gtt ctt ggc gct cgc gag gtg cgc agc tct att 7344 Leu Val Gly Ser Val Leu Gly Ala Arg Glu Val Arg Ser Ser Ile 2435 2440 2445 gct gcg att gaa gcg ctc ggc ggc aag gcc atc tac tcg tcg tgc 7389 Ala Ala Ile Glu Ala Leu Gly Gly Lys Ala Ile Tyr Ser Ser Cys 2450 2455 2460 gac gtg aac tct gcc gcc gac gtg gcc aag gcc gtg cgc gat gcc 7434 Asp Val Asn Ser Ala Ala Asp Val Ala Lys Ala Val Arg Asp Ala 2465 2470 2475 gag tcc cag ctc ggt gcc cgc gtc tcg ggc atc gtt cat gcc tcg 7479 Glu Ser Gln Leu Gly Ala Arg Val Ser Gly Ile Val His Ala Ser 2480 2485 2490 ggc gtg ctc cgc gac cgt ctc atc gag aag aag ctc ccc gac gag 7524 Gly Val Leu Arg Asp Arg Leu Ile Glu Lys Lys Leu Pro Asp Glu 2495 2500 2505 ttc gac gcc gtc ttt ggc acc aag gtc acc ggt ctc gag aac ctc 7569 Phe Asp Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu Glu Asn Leu 2510 2515 2520 ctc gcc gcc gtc gac cgc gcc aac ctc aag cac atg gtc ctc ttc 7614 Leu Ala Ala Val Asp Arg Ala Asn Leu Lys His Met Val Leu Phe 2525 2530 2535 agc tcg ctc gcc ggc ttc cac ggc aac gtc ggc cag tct gac tac 7659 Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser Asp Tyr 2540 2545 2550 gcc atg gcc aac gag gcc ctt aac aag atg ggc ctc gag ctc gcc 7704 Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Met Gly Leu Glu Leu Ala 2555 2560 2565 aag gac gtc tcg gtc aag tcg atc tgc ttc ggt ccc tgg gac ggt 7749 Lys Asp Val Ser Val Lys Ser Ile Cys Phe Gly Pro Trp Asp Gly 2570 2575 2580 ggc atg gtg acg ccg cag ctc aag aag cag ttc cag gag atg ggc 7794 Gly Met Val Thr Pro Gln Leu Lys Lys Gln Phe Gln Glu Met Gly 2585 2590 2595 gtg cag atc atc ccc cgc gag ggc ggc gct gat acc gtg gcg cgc 7839 Val Gln Ile Ile Pro Arg Glu Gly Gly Ala Asp Thr Val Ala Arg 2600 2605 2610 atc gtg ctc ggc tcc tcg ccg gct gag atc ctt gtc ggc aac tgg 7884 Ile Val Leu Gly Ser Ser Pro Ala Glu Ile Leu Val Gly Asn Trp 2615 2620 2625 cgc acc ccg tcc aag aag gtc ggc tcg gac acc atc acc ctg cac 7929 Arg Thr Pro Ser Lys Lys Val Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu His 2630 2635 2640 cgc aag att tcc gcc aag tcc aac ccc ttc ctc gag gac cac gtc 7974 Arg Lys Ile Ser Ala Lys Ser Asn Pro Phe Leu Glu Asp His Val 2645 2650 2655 atc cag ggc cgc cgc gtg ctg ccc atg acg ctg gcc att ggc tcg 8019 Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu Pro Met Thr Leu Ala Ile Gly Ser 2660 2665 2670 ctc gcg gag acc tgc ctc ggc ctc ttc ccc ggc tac tcg ctc tgg 8064 Leu Ala Glu Thr Cys Leu Gly Leu Phe Pro Gly Tyr Ser Leu Trp 2675 2680 2685 gcc att gac gac gcc cag ctc ttc aag ggt gtc act gtc gac ggc 8109 Ala Ile Asp Asp Ala Gln Leu Phe Lys Gly Val Thr Val Asp Gly 2690 2695 2700 gac gtc aac tgc gag gtg acc ctc acc ccg tcg acg gcg ccc tcg 8154 Asp Val Asn Cys Glu Val Thr Leu Thr Pro Ser Thr Ala Pro Ser 2705 2710 2715 ggc cgc gtc aac gtc cag gcc acg ctc aag acc ttt tcc agc ggc 8199 Gly Arg Val Asn Val Gln Ala Thr Leu Lys Thr Phe Ser Ser Gly 2720 2725 2730 aag ctg gtc ccg gcc tac cgc gcc gtc atc gtg ctc tcc aac cag 8244 Lys Leu Val Pro Ala Tyr Arg Ala Val Ile Val Leu Ser Asn Gln 2735 2740 2745 ggc gcg ccc ccg gcc aac gcc acc atg cag ccg ccc tcg ctc gat 8289 Gly Ala Pro Pro Ala Asn Ala Thr Met Gln Pro Pro Ser Leu Asp 2750 2755 2760 gcc gat ccg gcg ctc cag ggc tcc gtc tac gac ggc aag acc ctc 8334 Ala Asp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Val Tyr Asp Gly Lys Thr Leu 2765 2770 2775 ttc cac ggc ccg gcc ttc cgc ggc atc gat gac gtg ctc tcg tgc 8379 Phe His Gly Pro Ala Phe Arg Gly Ile Asp Asp Val Leu Ser Cys 2780 2785 2790 acc aag agc cag ctt gtg gcc aag tgc agc gct gtc ccc ggc tcc 8424 Thr Lys Ser Gln Leu Val Ala Lys Cys Ser Ala Val Pro Gly Ser 2795 2800 2805 gac gcc gct cgc ggc gag ttt gcc acg gac act gac gcc cat gac 8469 Asp Ala Ala Arg Gly Glu Phe Ala Thr Asp Thr Asp Ala His Asp 2810 2815 2820 ccc ttc gtg aac gac ctg gcc ttt cag gcc atg ctc gtc tgg gtg 8514 Pro Phe Val Asn Asp Leu Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Val 2825 2830 2835 cgc cgc acg ctc ggc cag gct gcg ctc ccc aac tcg atc cag cgc 8559 Arg Arg Thr Leu Gly Gln Ala Ala Leu Pro Asn Ser Ile Gln Arg 2840 2845 2850 atc gtc cag cac cgc ccg gtc ccg cag gac aag ccc ttc tac att 8604 Ile Val Gln His Arg Pro Val Pro Gln Asp Lys Pro Phe Tyr Ile 2855 2860 2865 acc ctc cgc tcc aac cag tcg ggc ggt cac tcc cag cac aag cac 8649 Thr Leu Arg Ser Asn Gln Ser Gly Gly His Ser Gln His Lys His 2870 2875 2880 gcc ctt cag ttc cac aac gag cag ggc gat ctc ttc att gat gtc 8694 Ala Leu Gln Phe His Asn Glu Gln Gly Asp Leu Phe Ile Asp Val 2885 2890 2895 cag gct tcg gtc atc gcc acg gac agc ctt gcc ttc 8730 Gln Ala Ser Val Ile Ala Thr Asp Ser Leu Ala Phe 2900 2905 2910 <210> 2 <211> 2910 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 2 Met Ala Ala Arg Leu Gln Glu Gln Lys Gly Gly Glu Met Asp Thr Arg 1 5 10 15 Ile Ala Ile Ile Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Cys Gly Thr Thr Val 20 25 30 Arg Glu Ser Trp Glu Thr Ile Arg Ala Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp 35 40 45 Leu Pro Glu Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Phe Asp Pro Val Lys 50 55 60 Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Glu 65 70 75 80 Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu 85 90 95 Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Asp Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Lys Glu Lys Lys Asn Ile 115 120 125 Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ser Ser His Glu Phe 130 135 140 Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met 145 150 155 160 Gly Met Pro Glu Glu Asp Val Lys Val Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala 165 170 175 Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn 180 185 190 Val Thr Ala Gly Arg Cys Thr Asn Thr Phe Asn Leu Asp Gly Met Asn 195 200 205 Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile Ala Val Lys Val 210 215 220 Ala Ile Asp Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Met Met Val Thr Gly 225 230 235 240 Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys 245 250 255 Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys 260 265 270 Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met Leu Val Leu Lys 275 280 285 Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Glu Ile His Ala Val Ile 290 295 300 Arg Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr 305 310 315 320 Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Asn Arg 325 330 335 Ala Cys Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu Gly His Gly Thr 340 345 350 Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Tyr Gly Glu Gly Asn Thr Glu Lys Val Ala Val Gly 370 375 380 Ser Ile Lys Ser Ser Ile Gly His Leu Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala 385 390 395 400 Gly Met Ile Lys Val Ile Met Ala Leu Lys His Lys Thr Leu Pro Gly 405 410 415 Thr Ile Asn Val Asp Asn Pro Pro Asn Leu Tyr Asp Asn Thr Pro Ile 420 425 430 Asn Glu Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Thr Met Asn Arg Pro Trp Phe Pro 435 440 445 Pro Pro Gly Val Pro Arg Arg Ala Gly Ile Ser Ser Phe Gly Phe Gly 450 455 460 Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu Glu Ala Glu Pro Glu His Thr 465 470 475 480 Thr Ala Tyr Arg Leu Asn Lys Arg Pro Gln Pro Val Leu Met Met Ala 485 490 495 Ala Thr Pro Ala Ala Leu Gln Ser Leu Cys Glu Ala Gln Leu Lys Glu 500 505 510 Phe Glu Ala Ala Ile Lys Glu Asn Glu Thr Val Lys Asn Thr Ala Tyr 515 520 525 Ile Lys Cys Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Lys Phe Pro Gly Ser Ile 530 535 540 Pro Ala Thr Asn Ala Arg Leu Gly Phe Leu Val Lys Asp Ala Glu Asp 545 550 555 560 Ala Cys Ser Thr Leu Arg Ala Ile Cys Ala Gln Phe Ala Lys Asp Val 565 570 575 Thr Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Arg Ala 580 585 590 Lys Gly Ile Ala Thr Asn Gly Ala Val Ala Ala Leu Phe Ser Gly Gln 595 600 605 Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Glu Val Ala Met Asn Trp Pro 610 615 620 Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser Lys Val 625 630 635 640 Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu Tyr Pro 645 650 655 Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asn Pro Lys Lys Ile Ser 660 665 670 Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu Gly Ala 675 680 685 Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala Ala Gly 690 695 700 His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys Val Asp 705 710 715 720 Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile Met Gly 725 730 735 Gly Lys Asp Ala Pro Ala Thr Pro Lys Gly Cys Met Ala Ala Val Ile 740 745 750 Gly Pro Asn Ala Glu Asn Ile Lys Val Gln Ala Ala Asn Val Trp Leu 755 760 765 Gly Asn Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Ser Val Glu 770 775 780 Gly Ile Gln Ala Glu Ser Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val 785 790 795 800 Val Pro Leu Ala Cys Glu Ser Ala Phe His Ser Pro Gln Met Glu Asn 805 810 815 Ala Ser Ser Ala Phe Lys Asp Val Ile Ser Lys Val Ser Phe Arg Thr 820 825 830 Pro Lys Ala Glu Thr Lys Leu Phe Ser Asn Val Ser Gly Glu Thr Tyr 835 840 845 Pro Thr Asp Ala Arg Glu Met Leu Thr Gln His Met Thr Ser Ser Val 850 855 860 Lys Phe Leu Thr Gln Val Arg Asn Met His Gln Ala Gly Ala Arg Ile 865 870 875 880 Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Lys Leu Val Ser Glu 885 890 895 Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Val Thr Val Ser Val Asn Pro Ala 900 905 910 Ser Gly Thr Asp Ser Asp Ile Gln Leu Arg Asp Ala Ala Val Gln Leu 915 920 925 Val Val Ala Gly Val Asn Leu Gln Gly Phe Asp Lys Trp Asp Ala Pro 930 935 940 Asp Ala Thr Arg Met Gln Ala Ile Lys Lys Lys Arg Thr Thr Leu Arg 945 950 955 960 Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val Ser Asp Lys Thr Lys Lys Val Arg Asp 965 970 975 Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly Ala Ala 980 985 990 Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro Val Val Asp Glu Ala Ala Lys Arg 995 1000 1005 Glu Ala Glu Arg Leu Gln Lys Glu Leu Gln Asp Ala Gln Arg Gln 1010 1015 1020 Leu Asp Asp Ala Lys Arg Ala Ala Ala Glu Ala Asn Ser Lys Leu 1025 1030 1035 Ala Ala Ala Lys Glu Glu Ala Lys Thr Ala Ala Ala Ser Ala Lys 1040 1045 1050 Pro Ala Val Asp Thr Ala Val Val Glu Lys His Arg Ala Ile Leu 1055 1060 1065 Lys Ser Met Leu Ala Glu Leu Asp Gly Tyr Gly Ser Val Asp Ala 1070 1075 1080 Ser Ser Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Thr Ala Pro Ala Pro 1085 1090 1095 Val Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser Ala Pro Ala 1100 1105 1110 Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val 1115 1120 1125 Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile 1130 1135 1140 Glu Ala Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile 1145 1150 1155 Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val 1160 1165 1170 Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly 1175 1180 1185 Glu Val Val Asn Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ala 1190 1195 1200 Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Lys Ala Ala Pro 1205 1210 1215 Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala 1220 1225 1230 Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu 1235 1240 1245 Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly 1250 1255 1260 Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala 1265 1270 1275 Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1280 1285 1290 Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asn Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala 1295 1300 1305 Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Gly Pro Ala 1310 1315 1320 Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn 1325 1330 1335 Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala 1340 1345 1350 Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu 1355 1360 1365 Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile 1370 1375 1380 Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val 1385 1390 1395 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 1400 1405 1410 Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala 1415 1420 1425 Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 1430 1435 1440 Ala Pro Ala Val Ser Ser Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val 1445 1450 1455 Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met 1460 1465 1470 Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser 1475 1480 1485 Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn 1490 1495 1500 Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val 1505 1510 1515 Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser 1520 1525 1530 Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala 1535 1540 1545 Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Val 1550 1555 1560 Ser Ser Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val 1565 1570 1575 Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp 1580 1585 1590 Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 1595 1600 1605 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys 1610 1615 1620 Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val 1625 1630 1635 Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ala Pro 1640 1645 1650 Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1655 1660 1665 Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu 1670 1675 1680 Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr 1685 1690 1695 Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile 1700 1705 1710 Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met 1715 1720 1725 Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg 1730 1735 1740 Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly 1745 1750 1755 Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala 1760 1765 1770 Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr 1775 1780 1785 Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp 1790 1795 1800 Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp 1805 1810 1815 Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu 1820 1825 1830 Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr 1835 1840 1845 Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Ala Gly Ser 1850 1855 1860 Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala 1865 1870 1875 Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Ser Glu Leu 1880 1885 1890 Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys 1895 1900 1905 Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu 1910 1915 1920 Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser 1925 1930 1935 Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala 1940 1945 1950 Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys 1955 1960 1965 Ala Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala 1970 1975 1980 Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu 1985 1990 1995 Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu Val Leu Ala Ala Lys Thr 2000 2005 2010 Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ser Asp Met Glu Leu Glu Thr 2015 2020 2025 Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu 2030 2035 2040 Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu 2045 2050 2055 Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala 2060 2065 2070 Glu Ile Ala Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro 2075 2080 2085 Ala Ser Ala Gly Ala Ala Pro Ala Val Lys Ile Asp Ser Val His 2090 2095 2100 Gly Ala Asp Cys Asp Asp Leu Ser Leu Met His Ala Lys Val Val 2105 2110 2115 Asp Ile Arg Arg Pro Asp Glu Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Asn 2120 2125 2130 Arg Pro Val Leu Val Val Asp Asp Gly Ser Glu Leu Thr Leu Ala 2135 2140 2145 Leu Val Arg Val Leu Gly Ala Cys Ala Val Val Leu Thr Phe Glu 2150 2155 2160 Gly Leu Gln Leu Ala Gln Arg Ala Gly Ala Ala Ala Ile Arg His 2165 2170 2175 Val Leu Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Ser Ala Glu Lys Ala Ile 2180 2185 2190 Lys Glu Ala Glu Gln Arg Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser 2195 2200 2205 Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr 2210 2215 2220 Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val 2225 2230 2235 Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly Val Ala Arg Leu Asp Gly 2240 2245 2250 Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser Asp Ala Leu Lys Arg 2255 2260 2265 Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys Thr Ile Gly Leu 2270 2275 2280 Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val Asp Ile Ala 2285 2290 2295 Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val Arg Glu 2300 2305 2310 Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly Ala 2315 2320 2325 Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 2330 2335 2340 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser 2345 2350 2355 Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Ile Arg Glu Ile Thr 2360 2365 2370 Arg Gln Ile Ala Gly Gly Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Arg Ser Lys 2375 2380 2385 Val Ser Ala Ser Glu Pro Ala Trp Cys Ala Gly Ile Thr Asp Glu 2390 2395 2400 Lys Ala Val Gln Lys Ala Ala Thr Gln Glu Leu Lys Arg Ala Phe 2405 2410 2415 Ser Ala Gly Glu Gly Pro Lys Pro Thr Pro Arg Ala Val Thr Lys 2420 2425 2430 Leu Val Gly Ser Val Leu Gly Ala Arg Glu Val Arg Ser Ser Ile 2435 2440 2445 Ala Ala Ile Glu Ala Leu Gly Gly Lys Ala Ile Tyr Ser Ser Cys 2450 2455 2460 Asp Val Asn Ser Ala Ala Asp Val Ala Lys Ala Val Arg Asp Ala 2465 2470 2475 Glu Ser Gln Leu Gly Ala Arg Val Ser Gly Ile Val His Ala Ser 2480 2485 2490 Gly Val Leu Arg Asp Arg Leu Ile Glu Lys Lys Leu Pro Asp Glu 2495 2500 2505 Phe Asp Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu Glu Asn Leu 2510 2515 2520 Leu Ala Ala Val Asp Arg Ala Asn Leu Lys His Met Val Leu Phe 2525 2530 2535 Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser Asp Tyr 2540 2545 2550 Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Met Gly Leu Glu Leu Ala 2555 2560 2565 Lys Asp Val Ser Val Lys Ser Ile Cys Phe Gly Pro Trp Asp Gly 2570 2575 2580 Gly Met Val Thr Pro Gln Leu Lys Lys Gln Phe Gln Glu Met Gly 2585 2590 2595 Val Gln Ile Ile Pro Arg Glu Gly Gly Ala Asp Thr Val Ala Arg 2600 2605 2610 Ile Val Leu Gly Ser Ser Pro Ala Glu Ile Leu Val Gly Asn Trp 2615 2620 2625 Arg Thr Pro Ser Lys Lys Val Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu His 2630 2635 2640 Arg Lys Ile Ser Ala Lys Ser Asn Pro Phe Leu Glu Asp His Val 2645 2650 2655 Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu Pro Met Thr Leu Ala Ile Gly Ser 2660 2665 2670 Leu Ala Glu Thr Cys Leu Gly Leu Phe Pro Gly Tyr Ser Leu Trp 2675 2680 2685 Ala Ile Asp Asp Ala Gln Leu Phe Lys Gly Val Thr Val Asp Gly 2690 2695 2700 Asp Val Asn Cys Glu Val Thr Leu Thr Pro Ser Thr Ala Pro Ser 2705 2710 2715 Gly Arg Val Asn Val Gln Ala Thr Leu Lys Thr Phe Ser Ser Gly 2720 2725 2730 Lys Leu Val Pro Ala Tyr Arg Ala Val Ile Val Leu Ser Asn Gln 2735 2740 2745 Gly Ala Pro Pro Ala Asn Ala Thr Met Gln Pro Pro Ser Leu Asp 2750 2755 2760 Ala Asp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Val Tyr Asp Gly Lys Thr Leu 2765 2770 2775 Phe His Gly Pro Ala Phe Arg Gly Ile Asp Asp Val Leu Ser Cys 2780 2785 2790 Thr Lys Ser Gln Leu Val Ala Lys Cys Ser Ala Val Pro Gly Ser 2795 2800 2805 Asp Ala Ala Arg Gly Glu Phe Ala Thr Asp Thr Asp Ala His Asp 2810 2815 2820 Pro Phe Val Asn Asp Leu Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Val 2825 2830 2835 Arg Arg Thr Leu Gly Gln Ala Ala Leu Pro Asn Ser Ile Gln Arg 2840 2845 2850 Ile Val Gln His Arg Pro Val Pro Gln Asp Lys Pro Phe Tyr Ile 2855 2860 2865 Thr Leu Arg Ser Asn Gln Ser Gly Gly His Ser Gln His Lys His 2870 2875 2880 Ala Leu Gln Phe His Asn Glu Gln Gly Asp Leu Phe Ile Asp Val 2885 2890 2895 Gln Ala Ser Val Ile Ala Thr Asp Ser Leu Ala Phe 2900 2905 2910 <210> 3 <211> 6177 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(6177) <400> 3 atg gcc gct cgg aat gtg agc gcc gcg cat gag atg cac gat gaa aag 48 Met Ala Ala Arg Asn Val Ser Ala Ala His Glu Met His Asp Glu Lys 1 5 10 15 cgc atc gcc gtc gtc ggc atg gcc gtc cag tac gcc gga tgc aaa acc 96 Arg Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys Thr 20 25 30 aag gac gag ttc tgg gag gtg ctc atg aac ggc aag gtc gag tcc aag 144 Lys Asp Glu Phe Trp Glu Val Leu Met Asn Gly Lys Val Glu Ser Lys 35 40 45 gtg atc agc gac aaa cga ctc ggc tcc aac tac cgc gcc gag cac tac 192 Val Ile Ser Asp Lys Arg Leu Gly Ser Asn Tyr Arg Ala Glu His Tyr 50 55 60 aaa gca gag cgc agc aag tat gcc gac acc ttt tgc aac gaa acg tac 240 Lys Ala Glu Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Thr Tyr 65 70 75 80 ggc acc ctt gac gag aac gag atc gac aac gag cac gaa ctc ctc ctc 288 Gly Thr Leu Asp Glu Asn Glu Ile Asp Asn Glu His Glu Leu Leu Leu 85 90 95 aac ctc gcc aag cag gca ctc gca gag aca tcc gtc aaa gac tcg aca 336 Asn Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Glu Thr Ser Val Lys Asp Ser Thr 100 105 110 cgc tgc ggc atc gtc agc ggc tgc ctc tcg ttc ccc atg gac aac ctc 384 Arg Cys Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu 115 120 125 cag ggt gaa ctc ctc aac gtg tac caa aac cat gtc gag aaa aag ctc 432 Gln Gly Glu Leu Leu Asn Val Tyr Gln Asn His Val Glu Lys Lys Leu 130 135 140 ggg gcc cgc gtc ttc aag gac gcc tcc cat tgg tcc gaa cgc gag cag 480 Gly Ala Arg Val Phe Lys Asp Ala Ser His Trp Ser Glu Arg Glu Gln 145 150 155 160 tcc aac aaa ccc gag gcc ggt gac cgc cgc atc ttc atg gac ccg gcc 528 Ser Asn Lys Pro Glu Ala Gly Asp Arg Arg Ile Phe Met Asp Pro Ala 165 170 175 tcc ttc gtc gcc gaa gaa ctc aac ctc ggc gcc ctt cac tac tcc gtc 576 Ser Phe Val Ala Glu Glu Leu Asn Leu Gly Ala Leu His Tyr Ser Val 180 185 190 gac gca gca tgc gcc acg gcg ctc tac gtg ctc cgc ctc gcg cag gat 624 Asp Ala Ala Cys Ala Thr Ala Leu Tyr Val Leu Arg Leu Ala Gln Asp 195 200 205 cat ctc gtc tcc ggc gcc gcc gac gtc atg ctc tgc ggt gcc acc tgc 672 His Leu Val Ser Gly Ala Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys 210 215 220 ctg ccg gag ccc ttt ttc atc ctt tcg ggc ttt tcc acc ttc cag gcc 720 Leu Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala 225 230 235 240 atg ccc gtc ggc acg ggc cag aac gtg tcc atg ccg ctg cac aag gac 768 Met Pro Val Gly Thr Gly Gln Asn Val Ser Met Pro Leu His Lys Asp 245 250 255 agc cag ggc ctc acc ccg ggt gag ggc ggc tcc atc atg gtc ctc aag 816 Ser Gln Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile Met Val Leu Lys 260 265 270 cgt ctc gat gat gcc atc cgc gac ggc gac cac att tac ggc acc ctt 864 Arg Leu Asp Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asp His Ile Tyr Gly Thr Leu 275 280 285 ctc ggc gcc aat gtc agc aac tcc ggc aca ggt ctg ccc ctc aag ccc 912 Leu Gly Ala Asn Val Ser Asn Ser Gly Thr Gly Leu Pro Leu Lys Pro 290 295 300 ctt ctc ccc agc gag aaa aag tgc ctc atg gac acc tac acg cgc att 960 Leu Leu Pro Ser Glu Lys Lys Cys Leu Met Asp Thr Tyr Thr Arg Ile 305 310 315 320 aac gtg cac ccg cac aag att cag tac gtc gag tgc cac gcc acc ggc 1008 Asn Val His Pro His Lys Ile Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly 325 330 335 acg ccc cag ggt gat cgt gtg gaa atc gac gcc gtc aag gcc tgc ttt 1056 Thr Pro Gln Gly Asp Arg Val Glu Ile Asp Ala Val Lys Ala Cys Phe 340 345 350 gaa ggc aag gtc ccc cgt ttc ggt acc aca aag ggc aac ttt gga cac 1104 Glu Gly Lys Val Pro Arg Phe Gly Thr Thr Lys Gly Asn Phe Gly His 355 360 365 acc cts gyc gca gcc ggc ttt gcc ggt atg tgc aag gtc ctc ctc tcc 1152 Thr Xaa Xaa Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Cys Lys Val Leu Leu Ser 370 375 380 atg aag cat ggc atc atc ccg ccc acc ccg ggt atc gat gac gag acc 1200 Met Lys His Gly Ile Ile Pro Pro Thr Pro Gly Ile Asp Asp Glu Thr 385 390 395 400 aag atg gac cct ctc gtc gtc tcc ggt gag gcc atc cca tgg cca gag 1248 Lys Met Asp Pro Leu Val Val Ser Gly Glu Ala Ile Pro Trp Pro Glu 405 410 415 acc aac ggc gag ccc aag cgc gcc ggt ctc tcg gcc ttt ggc ttt ggt 1296 Thr Asn Gly Glu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly 420 425 430 ggc acc aac gcc cat gcc gtc ttt gag gag cat gac ccc tcc aac gcc 1344 Gly Thr Asn Ala His Ala Val Phe Glu Glu His Asp Pro Ser Asn Ala 435 440 445 gcc tgc acg ggc cac gac tcc att tct gcg ctc tcg gcc cgc tgc ggc 1392 Ala Cys Thr Gly His Asp Ser Ile Ser Ala Leu Ser Ala Arg Cys Gly 450 455 460 ggt gaa agc aac atg cgc atc gcc atc act ggt atg gac gcc acc ttt 1440 Gly Glu Ser Asn Met Arg Ile Ala Ile Thr Gly Met Asp Ala Thr Phe 465 470 475 480 ggc gct ctc aag gga ctc gac gcc ttc gag cgc gcc att tac acc ggc 1488 Gly Ala Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Arg Ala Ile Tyr Thr Gly 485 490 495 gct cac ggt gcc atc cca ctc cca gaa aag cgc tgg cgc ttt ctc ggc 1536 Ala His Gly Ala Ile Pro Leu Pro Glu Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly 500 505 510 aag gac aag gac ttt ctt gac ctc tgc ggc gtc aag gcc acc ccg cac 1584 Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Leu Cys Gly Val Lys Ala Thr Pro His 515 520 525 ggc tgc tac att gaa gat gtt gag gtc gac ttc cag cgc ctc cgc acg 1632 Gly Cys Tyr Ile Glu Asp Val Glu Val Asp Phe Gln Arg Leu Arg Thr 530 535 540 ccc atg acc cct gaa gac atg ctc ctc cct cag cag ctt ctg gcc gtc 1680 Pro Met Thr Pro Glu Asp Met Leu Leu Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val 545 550 555 560 acc acc att gac cgc gcc atc ctc gac tcg gga atg aaa aag ggt ggc 1728 Thr Thr Ile Asp Arg Ala Ile Leu Asp Ser Gly Met Lys Lys Gly Gly 565 570 575 aat gtc gcc gtc ttt gtc ggc ctc ggc acc gac ctc gag ctc tac cgt 1776 Asn Val Ala Val Phe Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg 580 585 590 cac cgt gct cgc gtc gct ctc aag gag cgc gtc cgc cct gaa gcc tcc 1824 His Arg Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Arg Val Arg Pro Glu Ala Ser 595 600 605 aag aag ctc aat gac atg atg cag tac att aac gac tgc ggc aca tcc 1872 Lys Lys Leu Asn Asp Met Met Gln Tyr Ile Asn Asp Cys Gly Thr Ser 610 615 620 aca tcg tac acc tcg tac att ggc aac ctc gtc gcc acg cgc gtc tcg 1920 Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Val Ser 625 630 635 640 tcg cag tgg ggc ttc acg ggc ccc tcc ttt acg atc acc gag ggc aac 1968 Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Ile Thr Glu Gly Asn 645 650 655 aac tcc gtc tac cgc tgc gcc gag ctc ggc aag tac ctc ctc gag acc 2016 Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Leu Glu Thr 660 665 670 ggc gag gtc gat ggc gtc gtc gtt gcg ggt gtc gat ctc tgc ggc agt 2064 Gly Glu Val Asp Gly Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu Cys Gly Ser 675 680 685 gcc gaa aac ctt tac gtc aag tct cgc cgc ttc aag gtg tcc acc tcc 2112 Ala Glu Asn Leu Tyr Val Lys Ser Arg Arg Phe Lys Val Ser Thr Ser 690 695 700 gat acc ccg cgc gcc agc ttt gac gcc gcc gcc gat ggc tac ttt gtc 2160 Asp Thr Pro Arg Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ala Asp Gly Tyr Phe Val 705 710 715 720 ggc gag ggc tgc ggt gcc ttt gtg ctc aag cgt gag act agc tgc acc 2208 Gly Glu Gly Cys Gly Ala Phe Val Leu Lys Arg Glu Thr Ser Cys Thr 725 730 735 aag gac gac cgt atc tac gct tgc atg gat gcc atc gtc cct ggc aac 2256 Lys Asp Asp Arg Ile Tyr Ala Cys Met Asp Ala Ile Val Pro Gly Asn 740 745 750 gtc cct agc gcc tgc ttg cgc gag gcc ctc gac cag gcg cgc gtc aag 2304 Val Pro Ser Ala Cys Leu Arg Glu Ala Leu Asp Gln Ala Arg Val Lys 755 760 765 ccg ggc gat atc gag atg ctc gag ctc agc gcc gac tcc gcc cgc cac 2352 Pro Gly Asp Ile Glu Met Leu Glu Leu Ser Ala Asp Ser Ala Arg His 770 775 780 ctc aag gac ccg tcc gtc ctg ccc aag gag ctc act gcc gag gag gaa 2400 Leu Lys Asp Pro Ser Val Leu Pro Lys Glu Leu Thr Ala Glu Glu Glu 785 790 795 800 atc ggc ggc ctt cag acg atc ctt cgt gac gat gac aag ctc ccg cgc 2448 Ile Gly Gly Leu Gln Thr Ile Leu Arg Asp Asp Asp Lys Leu Pro Arg 805 810 815 aac gtc gca acg ggc agt gtc aag gcc acc gtc ggt gac acc ggt tat 2496 Asn Val Ala Thr Gly Ser Val Lys Ala Thr Val Gly Asp Thr Gly Tyr 820 825 830 gcc tct ggt gct gcc agc ctc atc aag gct gcg ctt tgc atc tac aac 2544 Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu Cys Ile Tyr Asn 835 840 845 cgc tac ctg ccc agc aac ggc gac gac tgg gat gaa ccc gcc cct gag 2592 Arg Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Asp Asp Trp Asp Glu Pro Ala Pro Glu 850 855 860 gcg ccc tgg gac agc acc ctc ttt gcg tgc cag acc tcg cgc gct tgg 2640 Ala Pro Trp Asp Ser Thr Leu Phe Ala Cys Gln Thr Ser Arg Ala Trp 865 870 875 880 ctc aag aac cct ggc gag cgt cgc tat gcg gcc gtc tcg ggc gtc tcc 2688 Leu Lys Asn Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Ala Ala Val Ser Gly Val Ser 885 890 895 gag acg cgc tcg tgc tat tcc gtg ctc ctc tcc gaa gcc gag ggc cac 2736 Glu Thr Arg Ser Cys Tyr Ser Val Leu Leu Ser Glu Ala Glu Gly His 900 905 910 tac gag cgc gag aac cgc atc tcg ctc gac gag gag gcg ccc aag ctc 2784 Tyr Glu Arg Glu Asn Arg Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Pro Lys Leu 915 920 925 att gtg ctt cgc gcc gac tcc cac gag gag atc ctt ggt cgc ctc gac 2832 Ile Val Leu Arg Ala Asp Ser His Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp 930 935 940 aag atc cgc gag cgc ttc ttg cag ccc acg ggc gcc gcc ccg cgc gag 2880 Lys Ile Arg Glu Arg Phe Leu Gln Pro Thr Gly Ala Ala Pro Arg Glu 945 950 955 960 tcc gag ctc aag gcg cag gcc cgc cgc atc ttc ctc gag ctc ctc ggc 2928 Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ala Arg Arg Ile Phe Leu Glu Leu Leu Gly 965 970 975 gag acc ctt gcc cag gat gcc gct tct tca ggc tcg caa aag ccc ctc 2976 Glu Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ala Ser Ser Gly Ser Gln Lys Pro Leu 980 985 990 gct ctc agc ctc gtc tcc acg ccc tcc aag ctc cag cgc gag gtc gag 3024 Ala Leu Ser Leu Val Ser Thr Pro Ser Lys Leu Gln Arg Glu Val Glu 995 1000 1005 ctc gcg gcc aag ggt atc ccg cgc tgc ctc aag atg cgc cgc gat 3069 Leu Ala Ala Lys Gly Ile Pro Arg Cys Leu Lys Met Arg Arg Asp 1010 1015 1020 tgg agc tcc cct gct ggc agc cgc tac gcg cct gag ccg ctc gcc 3114 Trp Ser Ser Pro Ala Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Leu Ala 1025 1030 1035 agc gac cgc gtc gcc ttc atg tac ggc gaa ggt cgc agc cct tac 3159 Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr 1040 1045 1050 tac ggc atc acc caa gac att cac cgc att tgg ccc gaa ctc cac 3204 Tyr Gly Ile Thr Gln Asp Ile His Arg Ile Trp Pro Glu Leu His 1055 1060 1065 gag gtc atc aac gaa aag acg aac cgt ctc tgg gcc gaa ggc gac 3249 Glu Val Ile Asn Glu Lys Thr Asn Arg Leu Trp Ala Glu Gly Asp 1070 1075 1080 cgc tgg gtc atg ccg cgc gcc agc ttc aag tcg gag ctc gag agc 3294 Arg Trp Val Met Pro Arg Ala Ser Phe Lys Ser Glu Leu Glu Ser 1085 1090 1095 cag cag caa gag ttt gat cgc aac atg att gaa atg ttc cgt ctt 3339 Gln Gln Gln Glu Phe Asp Arg Asn Met Ile Glu Met Phe Arg Leu 1100 1105 1110 gga atc ctc acc tca att gcc ttc acc aat ctg gcg cgc gac gtt 3384 Gly Ile Leu Thr Ser Ile Ala Phe Thr Asn Leu Ala Arg Asp Val 1115 1120 1125 ctc aac atc acg ccc aag gcc gcc ttt ggc ctc agt ctt ggc gag 3429 Leu Asn Ile Thr Pro Lys Ala Ala Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu 1130 1135 1140 att tcc atg att ttt gcc ttt tcc aag aag aac ggt ctc atc tcc 3474 Ile Ser Met Ile Phe Ala Phe Ser Lys Lys Asn Gly Leu Ile Ser 1145 1150 1155 gac cag ctc acc aag gat ctt cgc gag tcc gac gtg tgg aac aag 3519 Asp Gln Leu Thr Lys Asp Leu Arg Glu Ser Asp Val Trp Asn Lys 1160 1165 1170 gct ctg gcc gtt gaa ttt aat gcg ctg cgc gag gcc tgg ggc att 3564 Ala Leu Ala Val Glu Phe Asn Ala Leu Arg Glu Ala Trp Gly Ile 1175 1180 1185 cca cag agt gtc ccc aag gac gag ttc tgg caa ggc tac att gtg 3609 Pro Gln Ser Val Pro Lys Asp Glu Phe Trp Gln Gly Tyr Ile Val 1190 1195 1200 cgc ggc acc aag cag gat atc gag gcg gcc atc gcc ccg gac agc 3654 Arg Gly Thr Lys Gln Asp Ile Glu Ala Ala Ile Ala Pro Asp Ser 1205 1210 1215 aag tac gtg cgc ctc acc atc atc aat gat gcc aac acc gcc ctc 3699 Lys Tyr Val Arg Leu Thr Ile Ile Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu 1220 1225 1230 att agc ggc aag ccc gac gcc tgc aag gct gcg atc gcg cgt ctc 3744 Ile Ser Gly Lys Pro Asp Ala Cys Lys Ala Ala Ile Ala Arg Leu 1235 1240 1245 ggt ggc aac att cct gcg ctt ccc gtg acc cag ggc atg tgc ggc 3789 Gly Gly Asn Ile Pro Ala Leu Pro Val Thr Gln Gly Met Cys Gly 1250 1255 1260 cac tgc ccc gag gtg gga cct tat acc aag gat atc gcc aag atc 3834 His Cys Pro Glu Val Gly Pro Tyr Thr Lys Asp Ile Ala Lys Ile 1265 1270 1275 cat gcc aac ctt gag ttc ccc gtt gtc gac ggc ctt gac ctc tgg 3879 His Ala Asn Leu Glu Phe Pro Val Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp 1280 1285 1290 acc aca atc aac cag aag cgc ctc gtg cca cgc gcc acg ggc gcc 3924 Thr Thr Ile Asn Gln Lys Arg Leu Val Pro Arg Ala Thr Gly Ala 1295 1300 1305 aag gac gaa tgg gcc cct tct tcc ttt ggc gag tac gcc ggc cag 3969 Lys Asp Glu Trp Ala Pro Ser Ser Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Gln 1310 1315 1320 ctc tac gag aag cag gct aac ttc ccc caa atc gtc gag acc att 4014 Leu Tyr Glu Lys Gln Ala Asn Phe Pro Gln Ile Val Glu Thr Ile 1325 1330 1335 tac aag caa aac tac gac gtc ttt gtc gag gtt ggg ccc aac aac 4059 Tyr Lys Gln Asn Tyr Asp Val Phe Val Glu Val Gly Pro Asn Asn 1340 1345 1350 cac cgt agc acc gca gtg cgc acc acg ctt ggt ccc cag cgc aac 4104 His Arg Ser Thr Ala Val Arg Thr Thr Leu Gly Pro Gln Arg Asn 1355 1360 1365 cac ctt gct ggc gcc atc gac aag cag aac gag gat gct tgg acg 4149 His Leu Ala Gly Ala Ile Asp Lys Gln Asn Glu Asp Ala Trp Thr 1370 1375 1380 acc atc gtc aag ctt gtg gct tcg ctc aag gcc cac ctt gtt cct 4194 Thr Ile Val Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Ala His Leu Val Pro 1385 1390 1395 ggc gtc acg atc tcg ccg ctg tac cac tcc aag ctt gtg gcg gag 4239 Gly Val Thr Ile Ser Pro Leu Tyr His Ser Lys Leu Val Ala Glu 1400 1405 1410 gct cag gct tgc tac gct gcg ctc tgc aag ggt gaa aag ccc aag 4284 Ala Gln Ala Cys Tyr Ala Ala Leu Cys Lys Gly Glu Lys Pro Lys 1415 1420 1425 aag aac aag ttt gtg cgc aag att cag ctc aac ggt cgc ttc aac 4329 Lys Asn Lys Phe Val Arg Lys Ile Gln Leu Asn Gly Arg Phe Asn 1430 1435 1440 agc aag gcg gac ccc atc tcc tcg gcc gat ctt gcc agc ttt ccg 4374 Ser Lys Ala Asp Pro Ile Ser Ser Ala Asp Leu Ala Ser Phe Pro 1445 1450 1455 cct gcg gac cct gcc att gaa gcc gcc atc tcg agc cgc atc atg 4419 Pro Ala Asp Pro Ala Ile Glu Ala Ala Ile Ser Ser Arg Ile Met 1460 1465 1470 aag cct gtc gct ccc aag ttc tac gcg cgt ctc aac att gac gag 4464 Lys Pro Val Ala Pro Lys Phe Tyr Ala Arg Leu Asn Ile Asp Glu 1475 1480 1485 cag gac gag acc cga gat ccg atc ctc aac aag gac aac gcg ccg 4509 Gln Asp Glu Thr Arg Asp Pro Ile Leu Asn Lys Asp Asn Ala Pro 1490 1495 1500 tct tct tct tct tct tct tct tct tct tct tct tct tct tct tct 4554 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1505 1510 1515 ccg tcg cct gct cct tcg gcc ccc gtg caa aag aag gct gct ccc 4599 Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Val Gln Lys Lys Ala Ala Pro 1520 1525 1530 gcc gcg gag acc aag gct gtt gct tcg gct gac gca ctt cgc agt 4644 Ala Ala Glu Thr Lys Ala Val Ala Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser 1535 1540 1545 gcc ctg ctc gat ctc gac agt atg ctt gcg ctg agc tct gcc agt 4689 Ala Leu Leu Asp Leu Asp Ser Met Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ser 1550 1555 1560 gcc tcc ggc aac ctt gtt gag act gcg cct agc gac gcc tcg gtc 4734 Ala Ser Gly Asn Leu Val Glu Thr Ala Pro Ser Asp Ala Ser Val 1565 1570 1575 att gtg ccg ccc tgc aac att gcg gat ctc ggc agc cgc gcc ttc 4779 Ile Val Pro Pro Cys Asn Ile Ala Asp Leu Gly Ser Arg Ala Phe 1580 1585 1590 atg aaa acg tac ggt gtt tcg gcg cct ctg tac acg ggc gcc atg 4824 Met Lys Thr Tyr Gly Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met 1595 1600 1605 gcc aag ggc att gcc tct gcg gac ctc gtc att gcc gcc ggc cgc 4869 Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Arg 1610 1615 1620 cag ggc atc ctt gcg tcc ttt ggc gcc ggc gga ctt ccc atg cag 4914 Gln Gly Ile Leu Ala Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met Gln 1625 1630 1635 gtt gtg cgt gag tcc atc gaa aag att cag gcc gcc ctg ccc aat 4959 Val Val Arg Glu Ser Ile Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Asn 1640 1645 1650 ggc ccg tac gct gtc aac ctt atc cat tct ccc ttt gac agc aac 5004 Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 1655 1660 1665 ctc gaa aag ggc aat gtc gat ctc ttc ctc gag aag ggt gtc acc 5049 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly Val Thr 1670 1675 1680 ttt gtc gag gcc tcg gcc ttt atg acg ctc acc ccg cag gtc gtg 5094 Phe Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln Val Val 1685 1690 1695 cgg tac cgc gcg gct ggc ctc acg cgc aac gcc gac ggc tcg gtc 5139 Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Thr Arg Asn Ala Asp Gly Ser Val 1700 1705 1710 aac atc cgc aac cgt atc att ggc aag gtc tcg cgc acc gag ctc 5184 Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu 1715 1720 1725 gcc gag atg ttc atg cgt cct gcg ccc gag cac ctt ctt cag aag 5229 Ala Glu Met Phe Met Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu Gln Lys 1730 1735 1740 ctc att gct tcc ggc gag atc aac cag gag cag gcc gag ctc gcc 5274 Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn Gln Glu Gln Ala Glu Leu Ala 1745 1750 1755 cgc cgt gtt ccc gtc gct gac gac atc gcg gtc gaa gct gac tcg 5319 Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 1760 1765 1770 ggt ggc cac acc gac aac cgc ccc atc cac gtc att ctg ccc ctc 5364 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu 1775 1780 1785 atc atc aac ctt cgc gac cgc ctt cac cgc gag tgc ggc tac ccg 5409 Ile Ile Asn Leu Arg Asp Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro 1790 1795 1800 gcc aac ctt cgc gtc cgt gtg ggc gcc ggc ggt ggc att ggg tgc 5454 Ala Asn Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys 1805 1810 1815 ccc cag gcg gcg ctg gcc acc ttc aac atg ggt gcc tcc ttt att 5499 Pro Gln Ala Ala Leu Ala Thr Phe Asn Met Gly Ala Ser Phe Ile 1820 1825 1830 gtc acc ggc acc gtg aac cag gtc gcc aag cag tcg ggc acg tgc 5544 Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys 1835 1840 1845 gac aat gtg cgc aag cag ctc gcg aag gcc act tac tcg gac gta 5589 Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val 1850 1855 1860 tgc atg gcc ccg gct gcc gac atg ttc gag gaa ggc gtc aag ctt 5634 Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Glu Gly Val Lys Leu 1865 1870 1875 cag gtc ctc aag aag gga acc atg ttt ccc tcg cgc gcc aac aag 5679 Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys 1880 1885 1890 ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac gac tcg ttc gag tcc atg ccc 5724 Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ser Met Pro 1895 1900 1905 ccc gca gag ctt gcg cgc gtc gag aag cgc atc ttc agc cgc gcg 5769 Pro Ala Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Ser Arg Ala 1910 1915 1920 ctc gaa gag gtc tgg gac gag acc aaa aac ttt tac att aac cgt 5814 Leu Glu Glu Val Trp Asp Glu Thr Lys Asn Phe Tyr Ile Asn Arg 1925 1930 1935 ctt cac aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag cgc gac ccc aag 5859 Leu His Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu Arg Asp Pro Lys 1940 1945 1950 ctc aag atg tcg ctg tgc ttt cgc tgg tac ctg agc ctg gcg agc 5904 Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser Leu Ala Ser 1955 1960 1965 cgc tgg gcc aac act gga gct tcc gat cgc gtc atg gac tac cag 5949 Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln 1970 1975 1980 gtc tgg tgc ggt cct gcc att ggt tcc ttc aac gat ttc atc aag 5994 Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Ile Lys 1985 1990 1995 gga act tac ctt gat ccg gcc gtc gca aac gag tac ccg tgc gtc 6039 Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ala Asn Glu Tyr Pro Cys Val 2000 2005 2010 gtt cag att aac aag cag atc ctt cgt gga gcg tgc ttc ttg cgc 6084 Val Gln Ile Asn Lys Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Phe Leu Arg 2015 2020 2025 cgt ctc gaa att ctg cgc aac gca cgc ctt tcc gat ggc gct gcc 6129 Arg Leu Glu Ile Leu Arg Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gly Ala Ala 2030 2035 2040 gct ctt gtg gcc agc atc gat gac aca tac gtc ccg gcc gag aag 6174 Ala Leu Val Ala Ser Ile Asp Asp Thr Tyr Val Pro Ala Glu Lys 2045 2050 2055 ctg 6177 Leu <210> 4 <211> 2059 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (370)..(370) <223> The 'Xaa' at location 370 stands for Leu. <220> <221> misc_feature <222> (371)..(371) <223> The 'Xaa' at location 371 stands for Ala, or Val. <400> 4 Met Ala Ala Arg Asn Val Ser Ala Ala His Glu Met His Asp Glu Lys 1 5 10 15 Arg Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys Thr 20 25 30 Lys Asp Glu Phe Trp Glu Val Leu Met Asn Gly Lys Val Glu Ser Lys 35 40 45 Val Ile Ser Asp Lys Arg Leu Gly Ser Asn Tyr Arg Ala Glu His Tyr 50 55 60 Lys Ala Glu Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Thr Tyr 65 70 75 80 Gly Thr Leu Asp Glu Asn Glu Ile Asp Asn Glu His Glu Leu Leu Leu 85 90 95 Asn Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Glu Thr Ser Val Lys Asp Ser Thr 100 105 110 Arg Cys Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu 115 120 125 Gln Gly Glu Leu Leu Asn Val Tyr Gln Asn His Val Glu Lys Lys Leu 130 135 140 Gly Ala Arg Val Phe Lys Asp Ala Ser His Trp Ser Glu Arg Glu Gln 145 150 155 160 Ser Asn Lys Pro Glu Ala Gly Asp Arg Arg Ile Phe Met Asp Pro Ala 165 170 175 Ser Phe Val Ala Glu Glu Leu Asn Leu Gly Ala Leu His Tyr Ser Val 180 185 190 Asp Ala Ala Cys Ala Thr Ala Leu Tyr Val Leu Arg Leu Ala Gln Asp 195 200 205 His Leu Val Ser Gly Ala Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys 210 215 220 Leu Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala 225 230 235 240 Met Pro Val Gly Thr Gly Gln Asn Val Ser Met Pro Leu His Lys Asp 245 250 255 Ser Gln Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile Met Val Leu Lys 260 265 270 Arg Leu Asp Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asp His Ile Tyr Gly Thr Leu 275 280 285 Leu Gly Ala Asn Val Ser Asn Ser Gly Thr Gly Leu Pro Leu Lys Pro 290 295 300 Leu Leu Pro Ser Glu Lys Lys Cys Leu Met Asp Thr Tyr Thr Arg Ile 305 310 315 320 Asn Val His Pro His Lys Ile Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly 325 330 335 Thr Pro Gln Gly Asp Arg Val Glu Ile Asp Ala Val Lys Ala Cys Phe 340 345 350 Glu Gly Lys Val Pro Arg Phe Gly Thr Thr Lys Gly Asn Phe Gly His 355 360 365 Thr Xaa Xaa Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Cys Lys Val Leu Leu Ser 370 375 380 Met Lys His Gly Ile Ile Pro Pro Thr Pro Gly Ile Asp Asp Glu Thr 385 390 395 400 Lys Met Asp Pro Leu Val Val Ser Gly Glu Ala Ile Pro Trp Pro Glu 405 410 415 Thr Asn Gly Glu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly 420 425 430 Gly Thr Asn Ala His Ala Val Phe Glu Glu His Asp Pro Ser Asn Ala 435 440 445 Ala Cys Thr Gly His Asp Ser Ile Ser Ala Leu Ser Ala Arg Cys Gly 450 455 460 Gly Glu Ser Asn Met Arg Ile Ala Ile Thr Gly Met Asp Ala Thr Phe 465 470 475 480 Gly Ala Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Arg Ala Ile Tyr Thr Gly 485 490 495 Ala His Gly Ala Ile Pro Leu Pro Glu Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly 500 505 510 Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Leu Cys Gly Val Lys Ala Thr Pro His 515 520 525 Gly Cys Tyr Ile Glu Asp Val Glu Val Asp Phe Gln Arg Leu Arg Thr 530 535 540 Pro Met Thr Pro Glu Asp Met Leu Leu Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val 545 550 555 560 Thr Thr Ile Asp Arg Ala Ile Leu Asp Ser Gly Met Lys Lys Gly Gly 565 570 575 Asn Val Ala Val Phe Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg 580 585 590 His Arg Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Arg Val Arg Pro Glu Ala Ser 595 600 605 Lys Lys Leu Asn Asp Met Met Gln Tyr Ile Asn Asp Cys Gly Thr Ser 610 615 620 Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Val Ser 625 630 635 640 Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Ile Thr Glu Gly Asn 645 650 655 Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Leu Glu Thr 660 665 670 Gly Glu Val Asp Gly Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu Cys Gly Ser 675 680 685 Ala Glu Asn Leu Tyr Val Lys Ser Arg Arg Phe Lys Val Ser Thr Ser 690 695 700 Asp Thr Pro Arg Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ala Asp Gly Tyr Phe Val 705 710 715 720 Gly Glu Gly Cys Gly Ala Phe Val Leu Lys Arg Glu Thr Ser Cys Thr 725 730 735 Lys Asp Asp Arg Ile Tyr Ala Cys Met Asp Ala Ile Val Pro Gly Asn 740 745 750 Val Pro Ser Ala Cys Leu Arg Glu Ala Leu Asp Gln Ala Arg Val Lys 755 760 765 Pro Gly Asp Ile Glu Met Leu Glu Leu Ser Ala Asp Ser Ala Arg His 770 775 780 Leu Lys Asp Pro Ser Val Leu Pro Lys Glu Leu Thr Ala Glu Glu Glu 785 790 795 800 Ile Gly Gly Leu Gln Thr Ile Leu Arg Asp Asp Asp Lys Leu Pro Arg 805 810 815 Asn Val Ala Thr Gly Ser Val Lys Ala Thr Val Gly Asp Thr Gly Tyr 820 825 830 Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu Cys Ile Tyr Asn 835 840 845 Arg Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Asp Asp Trp Asp Glu Pro Ala Pro Glu 850 855 860 Ala Pro Trp Asp Ser Thr Leu Phe Ala Cys Gln Thr Ser Arg Ala Trp 865 870 875 880 Leu Lys Asn Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Ala Ala Val Ser Gly Val Ser 885 890 895 Glu Thr Arg Ser Cys Tyr Ser Val Leu Leu Ser Glu Ala Glu Gly His 900 905 910 Tyr Glu Arg Glu Asn Arg Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Pro Lys Leu 915 920 925 Ile Val Leu Arg Ala Asp Ser His Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp 930 935 940 Lys Ile Arg Glu Arg Phe Leu Gln Pro Thr Gly Ala Ala Pro Arg Glu 945 950 955 960 Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ala Arg Arg Ile Phe Leu Glu Leu Leu Gly 965 970 975 Glu Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ala Ser Ser Gly Ser Gln Lys Pro Leu 980 985 990 Ala Leu Ser Leu Val Ser Thr Pro Ser Lys Leu Gln Arg Glu Val Glu 995 1000 1005 Leu Ala Ala Lys Gly Ile Pro Arg Cys Leu Lys Met Arg Arg Asp 1010 1015 1020 Trp Ser Ser Pro Ala Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Leu Ala 1025 1030 1035 Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr 1040 1045 1050 Tyr Gly Ile Thr Gln Asp Ile His Arg Ile Trp Pro Glu Leu His 1055 1060 1065 Glu Val Ile Asn Glu Lys Thr Asn Arg Leu Trp Ala Glu Gly Asp 1070 1075 1080 Arg Trp Val Met Pro Arg Ala Ser Phe Lys Ser Glu Leu Glu Ser 1085 1090 1095 Gln Gln Gln Glu Phe Asp Arg Asn Met Ile Glu Met Phe Arg Leu 1100 1105 1110 Gly Ile Leu Thr Ser Ile Ala Phe Thr Asn Leu Ala Arg Asp Val 1115 1120 1125 Leu Asn Ile Thr Pro Lys Ala Ala Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu 1130 1135 1140 Ile Ser Met Ile Phe Ala Phe Ser Lys Lys Asn Gly Leu Ile Ser 1145 1150 1155 Asp Gln Leu Thr Lys Asp Leu Arg Glu Ser Asp Val Trp Asn Lys 1160 1165 1170 Ala Leu Ala Val Glu Phe Asn Ala Leu Arg Glu Ala Trp Gly Ile 1175 1180 1185 Pro Gln Ser Val Pro Lys Asp Glu Phe Trp Gln Gly Tyr Ile Val 1190 1195 1200 Arg Gly Thr Lys Gln Asp Ile Glu Ala Ala Ile Ala Pro Asp Ser 1205 1210 1215 Lys Tyr Val Arg Leu Thr Ile Ile Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu 1220 1225 1230 Ile Ser Gly Lys Pro Asp Ala Cys Lys Ala Ala Ile Ala Arg Leu 1235 1240 1245 Gly Gly Asn Ile Pro Ala Leu Pro Val Thr Gln Gly Met Cys Gly 1250 1255 1260 His Cys Pro Glu Val Gly Pro Tyr Thr Lys Asp Ile Ala Lys Ile 1265 1270 1275 His Ala Asn Leu Glu Phe Pro Val Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp 1280 1285 1290 Thr Thr Ile Asn Gln Lys Arg Leu Val Pro Arg Ala Thr Gly Ala 1295 1300 1305 Lys Asp Glu Trp Ala Pro Ser Ser Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Gln 1310 1315 1320 Leu Tyr Glu Lys Gln Ala Asn Phe Pro Gln Ile Val Glu Thr Ile 1325 1330 1335 Tyr Lys Gln Asn Tyr Asp Val Phe Val Glu Val Gly Pro Asn Asn 1340 1345 1350 His Arg Ser Thr Ala Val Arg Thr Thr Leu Gly Pro Gln Arg Asn 1355 1360 1365 His Leu Ala Gly Ala Ile Asp Lys Gln Asn Glu Asp Ala Trp Thr 1370 1375 1380 Thr Ile Val Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Ala His Leu Val Pro 1385 1390 1395 Gly Val Thr Ile Ser Pro Leu Tyr His Ser Lys Leu Val Ala Glu 1400 1405 1410 Ala Gln Ala Cys Tyr Ala Ala Leu Cys Lys Gly Glu Lys Pro Lys 1415 1420 1425 Lys Asn Lys Phe Val Arg Lys Ile Gln Leu Asn Gly Arg Phe Asn 1430 1435 1440 Ser Lys Ala Asp Pro Ile Ser Ser Ala Asp Leu Ala Ser Phe Pro 1445 1450 1455 Pro Ala Asp Pro Ala Ile Glu Ala Ala Ile Ser Ser Arg Ile Met 1460 1465 1470 Lys Pro Val Ala Pro Lys Phe Tyr Ala Arg Leu Asn Ile Asp Glu 1475 1480 1485 Gln Asp Glu Thr Arg Asp Pro Ile Leu Asn Lys Asp Asn Ala Pro 1490 1495 1500 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1505 1510 1515 Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ala Pro Val Gln Lys Lys Ala Ala Pro 1520 1525 1530 Ala Ala Glu Thr Lys Ala Val Ala Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser 1535 1540 1545 Ala Leu Leu Asp Leu Asp Ser Met Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ser 1550 1555 1560 Ala Ser Gly Asn Leu Val Glu Thr Ala Pro Ser Asp Ala Ser Val 1565 1570 1575 Ile Val Pro Pro Cys Asn Ile Ala Asp Leu Gly Ser Arg Ala Phe 1580 1585 1590 Met Lys Thr Tyr Gly Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met 1595 1600 1605 Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Arg 1610 1615 1620 Gln Gly Ile Leu Ala Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met Gln 1625 1630 1635 Val Val Arg Glu Ser Ile Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Asn 1640 1645 1650 Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 1655 1660 1665 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly Val Thr 1670 1675 1680 Phe Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln Val Val 1685 1690 1695 Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Thr Arg Asn Ala Asp Gly Ser Val 1700 1705 1710 Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu 1715 1720 1725 Ala Glu Met Phe Met Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu Gln Lys 1730 1735 1740 Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn Gln Glu Gln Ala Glu Leu Ala 1745 1750 1755 Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 1760 1765 1770 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu 1775 1780 1785 Ile Ile Asn Leu Arg Asp Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro 1790 1795 1800 Ala Asn Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys 1805 1810 1815 Pro Gln Ala Ala Leu Ala Thr Phe Asn Met Gly Ala Ser Phe Ile 1820 1825 1830 Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys 1835 1840 1845 Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val 1850 1855 1860 Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Glu Gly Val Lys Leu 1865 1870 1875 Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys 1880 1885 1890 Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ser Met Pro 1895 1900 1905 Pro Ala Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Ser Arg Ala 1910 1915 1920 Leu Glu Glu Val Trp Asp Glu Thr Lys Asn Phe Tyr Ile Asn Arg 1925 1930 1935 Leu His Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu Arg Asp Pro Lys 1940 1945 1950 Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser Leu Ala Ser 1955 1960 1965 Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln 1970 1975 1980 Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Ile Lys 1985 1990 1995 Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ala Asn Glu Tyr Pro Cys Val 2000 2005 2010 Val Gln Ile Asn Lys Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Phe Leu Arg 2015 2020 2025 Arg Leu Glu Ile Leu Arg Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gly Ala Ala 2030 2035 2040 Ala Leu Val Ala Ser Ile Asp Asp Thr Tyr Val Pro Ala Glu Lys 2045 2050 2055 Leu <210> 5 <211> 4509 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(4509) <400> 5 atg gcg ctc cgt gtc aag acg aac aag aag cca tgc tgg gag atg acc 48 Met Ala Leu Arg Val Lys Thr Asn Lys Lys Pro Cys Trp Glu Met Thr 1 5 10 15 aag gag gag ctg acc agc ggc aag acc gag gtg ttc aac tat gag gaa 96 Lys Glu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Thr Glu Val Phe Asn Tyr Glu Glu 20 25 30 ctc ctc gag ttc gca gag ggc gac atc gcc aag gtc ttc gga ccc gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ala Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 ttc gcc gtc atc gac aag tac ccg cgc cgc gtg cgc ctg ccc gcc cgc 192 Phe Ala Val Ile Asp Lys Tyr Pro Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 gag tac ctg ctc gtg acc cgc gtc acc ctc atg gac gcc gag gtc aac 240 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn 65 70 75 80 aac tac cgc gtc ggc gcc cgc atg gtc acc gag tac gat ctc ccc gtc 288 Asn Tyr Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Leu Pro Val 85 90 95 aac gga gag ctc tcc gag ggc gga gac tgc ccc tgg gcc gtc ctg gtc 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Cys Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gag agt ggc cag tgc gat ctc atg ctc atc tcc tac atg ggc att gac 384 Glu Ser Gly Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag aac cag ggc gac cgc gtc tac cgc ctg ctc aac acc acg ctc 432 Phe Gln Asn Gln Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acc ttt tac ggc gtg gcc cac gag ggc gag acc ctc gag tac gac att 480 Thr Phe Tyr Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Glu Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acc ggc ttc gcc aag cgt ctc gac ggc ggc atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Leu Asp Gly Gly Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttc ttc gag tac gac tgc tac gtc aac ggc cgc ctc ctc atc gag atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Val Asn Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cgc gat ggc tgc gcc ggc ttc ttc acc aac gag gag ctc gac gcc ggc 624 Arg Asp Gly Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asn Glu Glu Leu Asp Ala Gly 195 200 205 aag ggc gtc gtc ttc acc cgc ggc gac ctc gcc gcc cgc gcc aag atc 672 Lys Gly Val Val Phe Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ala Arg Ala Lys Ile 210 215 220 cca aag cag gac gtc tcc ccc tac gcc gtc gcc ccc tgc ctc cac aag 720 Pro Lys Gln Asp Val Ser Pro Tyr Ala Val Ala Pro Cys Leu His Lys 225 230 235 240 acc aag ctc aac gaa aag gag atg cag acc ctc gtc gac aag gac tgg 768 Thr Lys Leu Asn Glu Lys Glu Met Gln Thr Leu Val Asp Lys Asp Trp 245 250 255 gca tcc gtc ttt ggc tcc aag aac ggc atg ccg gaa atc aac tac aaa 816 Ala Ser Val Phe Gly Ser Lys Asn Gly Met Pro Glu Ile Asn Tyr Lys 260 265 270 ctc tgc gcg cgt aag atg ctc atg att gac cgc gtc acc agc att gac 864 Leu Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr Ser Ile Asp 275 280 285 cac aag ggc ggt gtc tac ggc ctc ggt cag ctc gtc ggt gaa aag atc 912 His Lys Gly Gly Val Tyr Gly Leu Gly Gln Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 ctc gag cgc gac cac tgg tac ttt ccc tgc cac ttt gtc aag gat cag 960 Leu Glu Arg Asp His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Lys Asp Gln 305 310 315 320 gtc atg gcc gga tcc ctc gtc tcc gac ggc tgc agc cag atg ctc aag 1008 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Met Leu Lys 325 330 335 atg tac atg atc tgg ctc ggc ctc cac ctc acc acc gga ccc ttt gac 1056 Met Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Thr Thr Gly Pro Phe Asp 340 345 350 ttc cgc ccg gtc aac ggc cac ccc aac aag gtc cgc tgc cgc ggc caa 1104 Phe Arg Pro Val Asn Gly His Pro Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 atc tcc ccg cac aag ggc aag ctc gtc tac gtc atg gag atc aag gag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu 370 375 380 atg ggc ttc gac gag gac aac gac ccg tac gcc att gcc gac gtc aac 1200 Met Gly Phe Asp Glu Asp Asn Asp Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val Asn 385 390 395 400 atc att gat gtc gac ttc gaa aag ggc cag gac ttt agc ctc gac cgc 1248 Ile Ile Asp Val Asp Phe Glu Lys Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Arg 405 410 415 atc agc gac tac ggc aag ggc gac ctc aac aag aag atc gtc gtc gac 1296 Ile Ser Asp Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Asn Lys Lys Ile Val Val Asp 420 425 430 ttt aag ggc atc gct ctc aag atg cag aag cgc tcc acc aac aag aac 1344 Phe Lys Gly Ile Ala Leu Lys Met Gln Lys Arg Ser Thr Asn Lys Asn 435 440 445 ccc tcc aag gtt cag ccc gtc ttt gcc aac ggc gcc gcc act gtc ggc 1392 Pro Ser Lys Val Gln Pro Val Phe Ala Asn Gly Ala Ala Thr Val Gly 450 455 460 ccc gag gcc tcc aag gct tcc tcc ggc gcc agc gcc agc gcc agc gcc 1440 Pro Glu Ala Ser Lys Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala 465 470 475 480 gcc ccg gcc aag cct gcc ttc agc gcc gat gtt ctt gcg ccc aag ccc 1488 Ala Pro Ala Lys Pro Ala Phe Ser Ala Asp Val Leu Ala Pro Lys Pro 485 490 495 gtt gcc ctt ccc gag cac atc ctc aag ggc gac gcc ctc gcc ccc aag 1536 Val Ala Leu Pro Glu His Ile Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ala Pro Lys 500 505 510 gag atg tcc tgg cac ccc atg gcc cgc atc ccg ggc aac ccg acg ccc 1584 Glu Met Ser Trp His Pro Met Ala Arg Ile Pro Gly Asn Pro Thr Pro 515 520 525 tct ttt gcg ccc tcg gcc tac aag ccg cgc aac atc gcc ttt acg ccc 1632 Ser Phe Ala Pro Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Asn Ile Ala Phe Thr Pro 530 535 540 ttc ccc ggc aac ccc aac gat aac gac cac acc ccg ggc aag atg ccg 1680 Phe Pro Gly Asn Pro Asn Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Lys Met Pro 545 550 555 560 ctc acc tgg ttc aac atg gcc gag ttc atg gcc ggc aag gtc agc atg 1728 Leu Thr Trp Phe Asn Met Ala Glu Phe Met Ala Gly Lys Val Ser Met 565 570 575 tgc ctc ggc ccc gag ttc gcc aag ttc gac gac tcg aac acc agc cgc 1776 Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Lys Phe Asp Asp Ser Asn Thr Ser Arg 580 585 590 agc ccc gct tgg gac ctc gct ctc gtc acc cgc gcc gtg tct gtg tct 1824 Ser Pro Ala Trp Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Ala Val Ser Val Ser 595 600 605 gac ctc aag cac gtc aac tac cgc aac atc gac ctc gac ccc tcc aag 1872 Asp Leu Lys His Val Asn Tyr Arg Asn Ile Asp Leu Asp Pro Ser Lys 610 615 620 ggt acc atg gtc ggc gag ttc gac tgc ccc gcg gac gcc tgg ttc tac 1920 Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Tyr 625 630 635 640 aag ggc gcc tgc aac gat gcc cac atg ccg tac tcg atc ctc atg gag 1968 Lys Gly Ala Cys Asn Asp Ala His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu 645 650 655 atc gcc ctc cag acc tcg ggt gtg ctc acc tcg gtg ctc aag gcg ccc 2016 Ile Ala Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro 660 665 670 ctg acc atg gag aag gac gac atc ctc ttc cgc aac ctc gac gcc aac 2064 Leu Thr Met Glu Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asn 675 680 685 gcc gag ttc gtg cgc gcc gac ctc gac tac cgc ggc aag act atc cgc 2112 Ala Glu Phe Val Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ile Arg 690 695 700 aac gtc acc aag tgc act ggc tac agc atg ctc ggc gag atg ggc gtc 2160 Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Glu Met Gly Val 705 710 715 720 cac cgc ttc acc ttt gag ctc tac gtc gat gat gtg ctc ttt tac aag 2208 His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Tyr Val Asp Asp Val Leu Phe Tyr Lys 725 730 735 ggc tcg acc tcg ttc ggc tgg ttc gtg ccc gag gtc ttt gcc gcc cag 2256 Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Ala Ala Gln 740 745 750 gcc ggc ctc gac aac ggc cgc aag tcg gag ccc tgg ttc att gag aac 2304 Ala Gly Leu Asp Asn Gly Arg Lys Ser Glu Pro Trp Phe Ile Glu Asn 755 760 765 aag gtt ccg gcc tcg cag gtc tcc tcc ttt gac gtg cgc ccc aac ggc 2352 Lys Val Pro Ala Ser Gln Val Ser Ser Phe Asp Val Arg Pro Asn Gly 770 775 780 agc ggc cgc acc gcc atc ttc gcc aac gcc ccc agc ggc gcc cag ctc 2400 Ser Gly Arg Thr Ala Ile Phe Ala Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gln Leu 785 790 795 800 aac cgc cgc acg gac cag ggc cag tac ctc gac gcc gtc gac att gtc 2448 Asn Arg Arg Thr Asp Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Val Asp Ile Val 805 810 815 tcc ggc agc ggc aag aag agc ctc ggc tac gcc cac ggt tcc aag acg 2496 Ser Gly Ser Gly Lys Lys Ser Leu Gly Tyr Ala His Gly Ser Lys Thr 820 825 830 gtc aac ccg aac gac tgg ttc ttc tcg tgc cac ttt tgg ttt gac tcg 2544 Val Asn Pro Asn Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Ser 835 840 845 gtc atg ccc gga agt ctc ggt gtc gag tcc atg ttc cag ctc gtc gag 2592 Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Val Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu 850 855 860 gcc atc gcc gcc cac gag gat ctc gct ggc aaa gca cgg cat tgc caa 2640 Ala Ile Ala Ala His Glu Asp Leu Ala Gly Lys Ala Arg His Cys Gln 865 870 875 880 ccc cac ctt tgt gca cgc ccc cgg gca aga tca agc tgg aag tac cgc 2688 Pro His Leu Cys Ala Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ser Trp Lys Tyr Arg 885 890 895 ggc cag ctc acg ccc aag agc aag aag atg gac tcg gag gtc cac atc 2736 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Ser Lys Lys Met Asp Ser Glu Val His Ile 900 905 910 gtg tcc gtg gac gcc cac gac ggc gtt gtc gac ctc gtc gcc gac ggc 2784 Val Ser Val Asp Ala His Asp Gly Val Val Asp Leu Val Ala Asp Gly 915 920 925 ttc ctc tgg gcc gac agc ctc cgc gtc tac tcg gtg agc aac att cgc 2832 Phe Leu Trp Ala Asp Ser Leu Arg Val Tyr Ser Val Ser Asn Ile Arg 930 935 940 gtg cgc atc gcc tcc ggt gag gcc cct gcc gcc gcc tcc tcc gcc gcc 2880 Val Arg Ile Ala Ser Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala 945 950 955 960 tct gtg ggc tcc tcg gct tcg tcc gtc gag cgc acg cgc tcg agc ccc 2928 Ser Val Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Glu Arg Thr Arg Ser Ser Pro 965 970 975 gct gtc gcc tcc ggc ccg gcc cag acc atc gac ctc aag cag ctc aag 2976 Ala Val Ala Ser Gly Pro Ala Gln Thr Ile Asp Leu Lys Gln Leu Lys 980 985 990 acc gag ctc ctc gag ctc gat gcc ccg ctc tac ctc tcg cag gac ccg 3024 Thr Glu Leu Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Gln Asp Pro 995 1000 1005 acc agc ggc cag ctc aag aag cac acc gac gtg gcc tcc ggc cag 3069 Thr Ser Gly Gln Leu Lys Lys His Thr Asp Val Ala Ser Gly Gln 1010 1015 1020 gcc acc atc gtg cag ccc tgc acg ctc ggc gac ctc ggt gac cgc 3114 Ala Thr Ile Val Gln Pro Cys Thr Leu Gly Asp Leu Gly Asp Arg 1025 1030 1035 tcc ttc atg gag acc tac ggc gtc gtc gcc ccg ctg tac acg ggc 3159 Ser Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val Ala Pro Leu Tyr Thr Gly 1040 1045 1050 gcc atg gcc aag ggc att gcc tcg gcg gac ctc gtc atc gcc gcc 3204 Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala 1055 1060 1065 ggc aag cgc aag atc ctc ggc tcc ttt ggc gcc ggc ggc ctc ccc 3249 Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 1070 1075 1080 atg cac cac gtg cgc gcc gcc ctc gag aag atc cag gcc gcc ctg 3294 Met His His Val Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu 1085 1090 1095 cct cag ggc ccc tac gcc gtc aac ctc atc cac tcg cct ttt gac 3339 Pro Gln Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp 1100 1105 1110 agc aac ctc gag aag ggc aac gtc gat ctc ttc ctc gag aag ggc 3384 Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly 1115 1120 1125 gtc act gtg gtg gag gcc tcg gca ttc atg acc ctc acc ccg cag 3429 Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 1130 1135 1140 gtc gtg cgc tac cgc gcc gcc ggc ctc tcg cgc aac gcc gac ggt 3474 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly 1145 1150 1155 tcg gtc aac atc cgc aac cgc atc atc ggc aag gtc tcg cgc acc 3519 Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr 1160 1165 1170 gag ctc gcc gag atg ttc atc cgc ccg gcc ccg gag cac ctc ctc 3564 Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 1175 1180 1185 gag aag ctc atc gcc tcg ggc gag atc acc cag gag cag gcc gag 3609 Glu Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu 1190 1195 1200 ctc gcg cgc cgc gtt ccc gtc gcc gac gat atc gct gtc gag gct 3654 Leu Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala 1205 1210 1215 gac tcg ggc ggc cac acc gac aac cgc ccc atc cac gtc atc ctc 3699 Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu 1220 1225 1230 ccg ctc atc atc aac ctc cgc aac cgc ctg cac cgc gag tgc ggc 3744 Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu His Arg Glu Cys Gly 1235 1240 1245 tac ccc gcg cac ctc cgc gtc cgc gtt ggc gcc ggc ggt ggc gtc 3789 Tyr Pro Ala His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Val 1250 1255 1260 ggc tgc ccg cag gcc gcc gcc gcc gcg ctc acc atg ggc gcc gcc 3834 Gly Cys Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Leu Thr Met Gly Ala Ala 1265 1270 1275 ttc atc gtc acc ggc act gtc aac cag gtc gcc aag cag tcc ggc 3879 Phe Ile Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly 1280 1285 1290 acc tgc gac aac gtg cgc aag cag ctc tcg cag gcc acc tac tcg 3924 Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Tyr Ser 1295 1300 1305 gat atc tgc atg gcc ccg gcc gcc gac atg ttc gag gag ggc gtc 3969 Asp Ile Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Glu Gly Val 1310 1315 1320 aag ctc cag gtc ctc aag aag gga acc atg ttc ccc tcg cgc gcc 4014 Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala 1325 1330 1335 aac aag ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac gac tcc ttc gac tcc 4059 Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Asp Ser 1340 1345 1350 atg cct cct gcc gag ctc gag cgc atc gag aag cgt atc ttc aag 4104 Met Pro Pro Ala Glu Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Ile Phe Lys 1355 1360 1365 cgc gca ctc cag gag gtc tgg gag gag acc aag gac ttt tac att 4149 Arg Ala Leu Gln Glu Val Trp Glu Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile 1370 1375 1380 aac ggt ctc aag aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag cac gac 4194 Asn Gly Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu His Asp 1385 1390 1395 ccc aag ctc aag atg tcg ctc tgc ttc cgc tgg tac ctt ggt ctt 4239 Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu 1400 1405 1410 gcc agc cgc tgg gcc aac atg ggc gcc ccg gac cgc gtc atg gac 4284 Ala Ser Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp 1415 1420 1425 tac cag gtc tgg tgt ggc ccg gcc att ggc gcc ttc aac gac ttc 4329 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe 1430 1435 1440 atc aag ggc acc tac ctc gac ccc gct gtc tcc aac gag tac ccc 4374 Ile Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro 1445 1450 1455 tgt gtc gtc cag atc aac ctg caa atc ctc cgt ggt gcc tgc tac 4419 Cys Val Val Gln Ile Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr 1460 1465 1470 ctg cgc cgt ctc aac gcc ctg cgc aac gac ccg cgc att gac ctc 4464 Leu Arg Arg Leu Asn Ala Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu 1475 1480 1485 gag acc gag gat gct gcc ttt gtc tac gag ccc acc aac gcg ctc 4509 Glu Thr Glu Asp Ala Ala Phe Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 1490 1495 1500 <210> 6 <211> 1503 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 6 Met Ala Leu Arg Val Lys Thr Asn Lys Lys Pro Cys Trp Glu Met Thr 1 5 10 15 Lys Glu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Thr Glu Val Phe Asn Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ala Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Ala Val Ile Asp Lys Tyr Pro Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Leu Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Cys Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ser Gly Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Asn Gln Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Tyr Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Glu Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Leu Asp Gly Gly Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Val Asn Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asn Glu Glu Leu Asp Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Phe Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ala Arg Ala Lys Ile 210 215 220 Pro Lys Gln Asp Val Ser Pro Tyr Ala Val Ala Pro Cys Leu His Lys 225 230 235 240 Thr Lys Leu Asn Glu Lys Glu Met Gln Thr Leu Val Asp Lys Asp Trp 245 250 255 Ala Ser Val Phe Gly Ser Lys Asn Gly Met Pro Glu Ile Asn Tyr Lys 260 265 270 Leu Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr Ser Ile Asp 275 280 285 His Lys Gly Gly Val Tyr Gly Leu Gly Gln Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Glu Arg Asp His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Lys Asp Gln 305 310 315 320 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Met Leu Lys 325 330 335 Met Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Thr Thr Gly Pro Phe Asp 340 345 350 Phe Arg Pro Val Asn Gly His Pro Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu 370 375 380 Met Gly Phe Asp Glu Asp Asn Asp Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val Asn 385 390 395 400 Ile Ile Asp Val Asp Phe Glu Lys Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Arg 405 410 415 Ile Ser Asp Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Asn Lys Lys Ile Val Val Asp 420 425 430 Phe Lys Gly Ile Ala Leu Lys Met Gln Lys Arg Ser Thr Asn Lys Asn 435 440 445 Pro Ser Lys Val Gln Pro Val Phe Ala Asn Gly Ala Ala Thr Val Gly 450 455 460 Pro Glu Ala Ser Lys Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala 465 470 475 480 Ala Pro Ala Lys Pro Ala Phe Ser Ala Asp Val Leu Ala Pro Lys Pro 485 490 495 Val Ala Leu Pro Glu His Ile Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ala Pro Lys 500 505 510 Glu Met Ser Trp His Pro Met Ala Arg Ile Pro Gly Asn Pro Thr Pro 515 520 525 Ser Phe Ala Pro Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Asn Ile Ala Phe Thr Pro 530 535 540 Phe Pro Gly Asn Pro Asn Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Lys Met Pro 545 550 555 560 Leu Thr Trp Phe Asn Met Ala Glu Phe Met Ala Gly Lys Val Ser Met 565 570 575 Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Lys Phe Asp Asp Ser Asn Thr Ser Arg 580 585 590 Ser Pro Ala Trp Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Ala Val Ser Val Ser 595 600 605 Asp Leu Lys His Val Asn Tyr Arg Asn Ile Asp Leu Asp Pro Ser Lys 610 615 620 Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Tyr 625 630 635 640 Lys Gly Ala Cys Asn Asp Ala His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu 645 650 655 Ile Ala Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro 660 665 670 Leu Thr Met Glu Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asn 675 680 685 Ala Glu Phe Val Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ile Arg 690 695 700 Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Glu Met Gly Val 705 710 715 720 His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Tyr Val Asp Asp Val Leu Phe Tyr Lys 725 730 735 Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Ala Ala Gln 740 745 750 Ala Gly Leu Asp Asn Gly Arg Lys Ser Glu Pro Trp Phe Ile Glu Asn 755 760 765 Lys Val Pro Ala Ser Gln Val Ser Ser Phe Asp Val Arg Pro Asn Gly 770 775 780 Ser Gly Arg Thr Ala Ile Phe Ala Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gln Leu 785 790 795 800 Asn Arg Arg Thr Asp Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Val Asp Ile Val 805 810 815 Ser Gly Ser Gly Lys Lys Ser Leu Gly Tyr Ala His Gly Ser Lys Thr 820 825 830 Val Asn Pro Asn Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Ser 835 840 845 Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Val Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu 850 855 860 Ala Ile Ala Ala His Glu Asp Leu Ala Gly Lys Ala Arg His Cys Gln 865 870 875 880 Pro His Leu Cys Ala Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ser Trp Lys Tyr Arg 885 890 895 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Ser Lys Lys Met Asp Ser Glu Val His Ile 900 905 910 Val Ser Val Asp Ala His Asp Gly Val Val Asp Leu Val Ala Asp Gly 915 920 925 Phe Leu Trp Ala Asp Ser Leu Arg Val Tyr Ser Val Ser Asn Ile Arg 930 935 940 Val Arg Ile Ala Ser Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala 945 950 955 960 Ser Val Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Glu Arg Thr Arg Ser Ser Pro 965 970 975 Ala Val Ala Ser Gly Pro Ala Gln Thr Ile Asp Leu Lys Gln Leu Lys 980 985 990 Thr Glu Leu Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Gln Asp Pro 995 1000 1005 Thr Ser Gly Gln Leu Lys Lys His Thr Asp Val Ala Ser Gly Gln 1010 1015 1020 Ala Thr Ile Val Gln Pro Cys Thr Leu Gly Asp Leu Gly Asp Arg 1025 1030 1035 Ser Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val Ala Pro Leu Tyr Thr Gly 1040 1045 1050 Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala 1055 1060 1065 Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 1070 1075 1080 Met His His Val Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu 1085 1090 1095 Pro Gln Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp 1100 1105 1110 Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly 1115 1120 1125 Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 1130 1135 1140 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly 1145 1150 1155 Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr 1160 1165 1170 Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 1175 1180 1185 Glu Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu 1190 1195 1200 Leu Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala 1205 1210 1215 Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu 1220 1225 1230 Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu His Arg Glu Cys Gly 1235 1240 1245 Tyr Pro Ala His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Val 1250 1255 1260 Gly Cys Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Leu Thr Met Gly Ala Ala 1265 1270 1275 Phe Ile Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly 1280 1285 1290 Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Tyr Ser 1295 1300 1305 Asp Ile Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Glu Gly Val 1310 1315 1320 Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala 1325 1330 1335 Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Asp Ser 1340 1345 1350 Met Pro Pro Ala Glu Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Ile Phe Lys 1355 1360 1365 Arg Ala Leu Gln Glu Val Trp Glu Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile 1370 1375 1380 Asn Gly Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu His Asp 1385 1390 1395 Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu 1400 1405 1410 Ala Ser Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp 1415 1420 1425 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe 1430 1435 1440 Ile Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro 1445 1450 1455 Cys Val Val Gln Ile Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr 1460 1465 1470 Leu Arg Arg Leu Asn Ala Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu 1475 1480 1485 Glu Thr Glu Asp Ala Ala Phe Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 1490 1495 1500 <210> 7 <211> 600 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(600) <400> 7 atg gcg gcc cgt ctg cag gag caa aag gga ggc gag atg gat acc cgc 48 Met Ala Ala Arg Leu Gln Glu Gln Lys Gly Gly Glu Met Asp Thr Arg 1 5 10 15 att gcc atc atc ggc atg tcg gcc atc ctc ccc tgc ggc acg acc gtg 96 Ile Ala Ile Ile Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Cys Gly Thr Thr Val 20 25 30 cgc gag tcg tgg gag acc atc cgc gcc ggc atc gac tgc ctg tcg gat 144 Arg Glu Ser Trp Glu Thr Ile Arg Ala Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp 35 40 45 ctc ccc gag gac cgc gtc gac gtg acg gcg tac ttt gac ccc gtc aag 192 Leu Pro Glu Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Phe Asp Pro Val Lys 50 55 60 acc acc aag gac aag atc tac tgc aag cgc ggt ggc ttc att ccc gag 240 Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Glu 65 70 75 80 tac gac ttt gac gcc cgc gag ttc gga ctc aac atg ttc cag atg gag 288 Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu 85 90 95 gac tcg gac gca aac cag acc atc tcg ctt ctc aag gtc aag gag gcc 336 Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys Glu Ala 100 105 110 ctc cag gac gcc ggc atc gac gcc ctc ggc aag gaa aag aag aac atc 384 Leu Gln Asp Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Lys Glu Lys Lys Asn Ile 115 120 125 ggc tgc gtg ctc ggc att ggc ggc ggc caa aag tcc agc cac gag ttc 432 Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ser Ser His Glu Phe 130 135 140 tac tcg cgc ctt aat tat gtt gtc gtg gag aag gtc ctc cgc aag atg 480 Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met 145 150 155 160 ggc atg ccc gag gag gac gtc aag gtc gcc gtc gaa aag tac aag gcc 528 Gly Met Pro Glu Glu Asp Val Lys Val Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala 165 170 175 aac ttc ccc gag tgg cgc ctc gac tcc ttc cct ggc ttc ctc ggc aac 576 Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn 180 185 190 gtc acc gcc ggt cgc tgc acc aac 600 Val Thr Ala Gly Arg Cys Thr Asn 195 200 <210> 8 <211> 200 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 8 Met Ala Ala Arg Leu Gln Glu Gln Lys Gly Gly Glu Met Asp Thr Arg 1 5 10 15 Ile Ala Ile Ile Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Cys Gly Thr Thr Val 20 25 30 Arg Glu Ser Trp Glu Thr Ile Arg Ala Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp 35 40 45 Leu Pro Glu Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Phe Asp Pro Val Lys 50 55 60 Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Glu 65 70 75 80 Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu 85 90 95 Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Asp Ala Gly Ile Asp Ala Leu Gly Lys Glu Lys Lys Asn Ile 115 120 125 Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ser Ser His Glu Phe 130 135 140 Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met 145 150 155 160 Gly Met Pro Glu Glu Asp Val Lys Val Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala 165 170 175 Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn 180 185 190 Val Thr Ala Gly Arg Cys Thr Asn 195 200 <210> 9 <211> 1278 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1278) <400> 9 gat gtc acc aag gag gcc tgg cgc ctc ccc cgc gag ggc gtc agc ttc 48 Asp Val Thr Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe 1 5 10 15 cgc gcc aag ggc atc gcc acc aac ggc gct gtc gcc gcg ctc ttc tcc 96 Arg Ala Lys Gly Ile Ala Thr Asn Gly Ala Val Ala Ala Leu Phe Ser 20 25 30 ggc cag ggc gcg cag tac acg cac atg ttt agc gag gtg gcc atg aac 144 Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Glu Val Ala Met Asn 35 40 45 tgg ccc cag ttc cgc cag agc att gcc gcc atg gac gcc gcc cag tcc 192 Trp Pro Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser 50 55 60 aag gtc gct gga agc gac aag gac ttt gag cgc gtc tcc cag gtc ctc 240 Lys Val Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu 65 70 75 80 tac ccg cgc aag ccg tac gag cgt gag ccc gag cag aac ccc aag aag 288 Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asn Pro Lys Lys 85 90 95 atc tcc ctc acc gcc tac tcg cag ccc tcg acc ctg gcc tgc gct ctc 336 Ile Ser Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu 100 105 110 ggt gcc ttt gag atc ttc aag gag gcc ggc ttc acc ccg gac ttt gcc 384 Gly Ala Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala 115 120 125 gcc ggc cat tcg ctc ggt gag ttc gcc gcc ctc tac gcc gcg ggc tgc 432 Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys 130 135 140 gtc gac cgc gac gag ctc ttt gag ctt gtc tgc cgc cgc gcc cgc atc 480 Val Asp Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile 145 150 155 160 atg ggc ggc aag gac gca ccg gcc acc ccc aag gga tgc atg gcc gcc 528 Met Gly Gly Lys Asp Ala Pro Ala Thr Pro Lys Gly Cys Met Ala Ala 165 170 175 gtc att ggc ccc aac gcc gag aac atc aag gtc cag gcc gcc aac gtc 576 Val Ile Gly Pro Asn Ala Glu Asn Ile Lys Val Gln Ala Ala Asn Val 180 185 190 tgg ctc ggc aac tcc aac tcg cct tcg cag acc gtc atc acc ggc tcc 624 Trp Leu Gly Asn Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Ser 195 200 205 gtc gaa ggt atc cag gcc gag agc gcc cgc ctc cag aag gag ggc ttc 672 Val Glu Gly Ile Gln Ala Glu Ser Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gly Phe 210 215 220 cgc gtc gtg cct ctt gcc tgc gag agc gcc ttc cac tcg ccc cag atg 720 Arg Val Val Pro Leu Ala Cys Glu Ser Ala Phe His Ser Pro Gln Met 225 230 235 240 gag aac gcc tcg tcg gcc ttc aag gac gtc atc tcc aag gtc tcc ttc 768 Glu Asn Ala Ser Ser Ala Phe Lys Asp Val Ile Ser Lys Val Ser Phe 245 250 255 cgc acc ccc aag gcc gag acc aag ctc ttc agc aac gtc tct ggc gag 816 Arg Thr Pro Lys Ala Glu Thr Lys Leu Phe Ser Asn Val Ser Gly Glu 260 265 270 acc tac ccc acg gac gcc cgc gag atg ctt acg cag cac atg acc agc 864 Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Arg Glu Met Leu Thr Gln His Met Thr Ser 275 280 285 agc gtc aag ttc ctc acc cag gtc cgc aac atg cac cag gcc ggt gcg 912 Ser Val Lys Phe Leu Thr Gln Val Arg Asn Met His Gln Ala Gly Ala 290 295 300 cgc atc ttt gtc gag ttc gga ccc aag cag gtg ctc tcc aag ctt gtc 960 Arg Ile Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 tcc gag acc ctc aag gat gac ccc tcg gtt gtc acc gtc tct gtc aac 1008 Ser Glu Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Val Thr Val Ser Val Asn 325 330 335 ccg gcc tcg ggc acg gat tcg gac atc cag ctc cgc gac gcg gcc gtc 1056 Pro Ala Ser Gly Thr Asp Ser Asp Ile Gln Leu Arg Asp Ala Ala Val 340 345 350 cag ctc gtt gtc gct ggc gtc aac ctt cag ggc ttt gac aag tgg gac 1104 Gln Leu Val Val Ala Gly Val Asn Leu Gln Gly Phe Asp Lys Trp Asp 355 360 365 gcc ccc gat gcc acc cgc atg cag gcc atc aag aag aag cgc act acc 1152 Ala Pro Asp Ala Thr Arg Met Gln Ala Ile Lys Lys Lys Arg Thr Thr 370 375 380 ctc cgc ctt tcg gcc gcc acc tac gtc tcg gac aag acc aag aag gtc 1200 Leu Arg Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val Ser Asp Lys Thr Lys Lys Val 385 390 395 400 cgc gac gcc gcc atg aac gat ggc cgc tgc gtc acc tac ctc aag ggc 1248 Arg Asp Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly 405 410 415 gcc gca ccg ctc atc aag gcc ccg gag ccc 1278 Ala Ala Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro 420 425 <210> 10 <211> 426 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 10 Asp Val Thr Lys Glu Ala Trp Arg Leu Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe 1 5 10 15 Arg Ala Lys Gly Ile Ala Thr Asn Gly Ala Val Ala Ala Leu Phe Ser 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Glu Val Ala Met Asn 35 40 45 Trp Pro Gln Phe Arg Gln Ser Ile Ala Ala Met Asp Ala Ala Gln Ser 50 55 60 Lys Val Ala Gly Ser Asp Lys Asp Phe Glu Arg Val Ser Gln Val Leu 65 70 75 80 Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Glu Pro Glu Gln Asn Pro Lys Lys 85 90 95 Ile Ser Leu Thr Ala Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Leu Ala Cys Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Phe Glu Ile Phe Lys Glu Ala Gly Phe Thr Pro Asp Phe Ala 115 120 125 Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Cys 130 135 140 Val Asp Arg Asp Glu Leu Phe Glu Leu Val Cys Arg Arg Ala Arg Ile 145 150 155 160 Met Gly Gly Lys Asp Ala Pro Ala Thr Pro Lys Gly Cys Met Ala Ala 165 170 175 Val Ile Gly Pro Asn Ala Glu Asn Ile Lys Val Gln Ala Ala Asn Val 180 185 190 Trp Leu Gly Asn Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Ser 195 200 205 Val Glu Gly Ile Gln Ala Glu Ser Ala Arg Leu Gln Lys Glu Gly Phe 210 215 220 Arg Val Val Pro Leu Ala Cys Glu Ser Ala Phe His Ser Pro Gln Met 225 230 235 240 Glu Asn Ala Ser Ser Ala Phe Lys Asp Val Ile Ser Lys Val Ser Phe 245 250 255 Arg Thr Pro Lys Ala Glu Thr Lys Leu Phe Ser Asn Val Ser Gly Glu 260 265 270 Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Arg Glu Met Leu Thr Gln His Met Thr Ser 275 280 285 Ser Val Lys Phe Leu Thr Gln Val Arg Asn Met His Gln Ala Gly Ala 290 295 300 Arg Ile Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 Ser Glu Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Val Thr Val Ser Val Asn 325 330 335 Pro Ala Ser Gly Thr Asp Ser Asp Ile Gln Leu Arg Asp Ala Ala Val 340 345 350 Gln Leu Val Val Ala Gly Val Asn Leu Gln Gly Phe Asp Lys Trp Asp 355 360 365 Ala Pro Asp Ala Thr Arg Met Gln Ala Ile Lys Lys Lys Arg Thr Thr 370 375 380 Leu Arg Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val Ser Asp Lys Thr Lys Lys Val 385 390 395 400 Arg Asp Ala Ala Met Asn Asp Gly Arg Cys Val Thr Tyr Leu Lys Gly 405 410 415 Ala Ala Pro Leu Ile Lys Ala Pro Glu Pro 420 425 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Xaa = any amino acid <400> 11 Gly His Ser Xaa Gly 1 5 <210> 12 <211> 258 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(258) <400> 12 gct gtc tcg aac gag ctt ctt gag aag gcc gag act gtc gtc atg gag 48 Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu 1 5 10 15 gtc ctc gcc gcc aag acc ggc tac gag acc gac atg atc gag gct gac 96 Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ala Asp 20 25 30 atg gag ctc gag acc gag ctc ggc att gac tcc atc aag cgt gtc gag 144 Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 35 40 45 atc ctc tcc gag gtc cag gcc atg ctc aat gtc gag gcc aag gat gtc 192 Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val 50 55 60 gat gcc ctc agc cgc act cgc act gtt ggt gag gtt gtc aac gcc atg 240 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asn Ala Met 65 70 75 80 aag gcc gag atc gct ggc 258 Lys Ala Glu Ile Ala Gly 85 <210> 13 <211> 86 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 13 Ala Val Ser Asn Glu Leu Leu Glu Lys Ala Glu Thr Val Val Met Glu 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Met Ile Glu Ala Asp 20 25 30 Met Glu Leu Glu Thr Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 35 40 45 Ile Leu Ser Glu Val Gln Ala Met Leu Asn Val Glu Ala Lys Asp Val 50 55 60 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asn Ala Met 65 70 75 80 Lys Ala Glu Ile Ala Gly 85 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 14 Leu Gly Ile Asp Ser 1 5 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 15 Ala Pro Ala Pro Val Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Ala Ser 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala 20 <210> 16 <211> 3006 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 16 gcccccgccc cggtcaaggc tgctgcgcct gccgcccccg ttgcctcggc ccctgccccg 60 gctgtctcga acgagcttct tgagaaggcc gagactgtcg tcatggaggt cctcgccgcc 120 aagaccggct acgagaccga catgatcgag gctgacatgg agctcgagac cgagctcggc 180 attgactcca tcaagcgtgt cgagatcctc tccgaggtcc aggccatgct caatgtcgag 240 gccaaggatg tcgatgccct cagccgcact cgcactgttg gtgaggttgt caacgccatg 300 aaggccgaga tcgctggcag ctctgccccg gcgcctgctg ccgctgctcc ggctccggcc 360 aaggctgccc ctgccgccgc tgcgcctgct gtctcgaacg agcttctcga gaaggccgag 420 accgtcgtca tggaggtcct cgccgccaag actggctacg agactgacat gatcgagtcc 480 gacatggagc tcgagactga gctcggcatt gactccatca agcgtgtcga gatcctctcc 540 gaggttcagg ccatgctcaa cgtcgaggcc aaggacgtcg acgctctcag ccgcactcgc 600 actgtgggtg aggtcgtcaa cgccatgaag gctgagatcg ctggtggctc tgccccggcg 660 cctgccgccg ctgccccagg tccggctgct gccgcccctg cgcctgccgc cgccgcccct 720 gctgtctcga acgagcttct tgagaaggcc gagaccgtcg tcatggaggt cctcgccgcc 780 aagactggct acgagactga catgatcgag tccgacatgg agctcgagac cgagctcggc 840 attgactcca tcaagcgtgt cgagattctc tccgaggtcc aggccatgct caacgtcgag 900 gccaaggacg tcgacgctct cagccgcacc cgcactgttg gcgaggtcgt cgatgccatg 960 aaggccgaga tcgctggtgg ctctgccccg gcgcctgccg ccgctgctcc tgctccggct 1020 gctgccgccc ctgcgcctgc cgcccctgcg cctgctgtct cgagcgagct tctcgagaag 1080 gccgagactg tcgtcatgga ggtcctcgcc gccaagactg gctacgagac tgacatgatc 1140 gagtccgaca tggagctcga gaccgagctc ggcattgact ccatcaagcg tgtcgagatt 1200 ctctccgagg tccaggccat gctcaacgtc gaggccaagg acgtcgacgc tctcagccgc 1260 acccgcactg ttggcgaggt cgtcgatgcc atgaaggccg agatcgctgg tggctctgcc 1320 ccggcgcctg ccgccgctgc tcctgctccg gctgctgccg cccctgcgcc tgccgcccct 1380 gcgcctgccg cccctgcgcc tgctgtctcg agcgagcttc tcgagaaggc cgagactgtc 1440 gtcatggagg tcctcgccgc caagactggc tacgagactg acatgattga gtccgacatg 1500 gagctcgaga ccgagctcgg cattgactcc atcaagcgtg tcgagattct ctccgaggtt 1560 caggccatgc tcaacgtcga ggccaaggac gtcgacgctc tcagccgcac tcgcactgtt 1620 ggtgaggtcg tcgatgccat gaaggctgag atcgctggca gctccgcctc ggcgcctgcc 1680 gccgctgctc ctgctccggc tgctgccgct cctgcgcccg ctgccgccgc ccctgctgtc 1740 tcgaacgagc ttctcgagaa agccgagact gtcgtcatgg aggtcctcgc cgccaagact 1800 ggctacgaga ctgacatgat cgagtccgac atggagctcg agactgagct cggcattgac 1860 tccatcaagc gtgtcgagat cctctccgag gttcaggcca tgctcaacgt cgaggccaag 1920 gacgtcgatg ccctcagccg cacccgcact gttggcgagg ttgtcgatgc catgaaggcc 1980 gagatcgctg gtggctctgc cccggcgcct gccgccgctg cccctgctcc ggctgccgcc 2040 gcccctgctg tctcgaacga gcttctcgag aaggccgaga ctgtcgtcat ggaggtcctc 2100 gccgccaaga ctggctacga gaccgacatg atcgagtccg acatggagct cgagaccgag 2160 ctcggcattg actccatcaa gcgtgtcgag attctctccg aggttcaggc catgctcaac 2220 gtcgaggcca aggacgtcga tgctctcagc cgcactcgca ctgttggcga ggtcgtcgat 2280 gccatgaagg ctgagatcgc cggcagctcc gccccggcgc ctgccgccgc tgctcctgct 2340 ccggctgctg ccgctcctgc gcccgctgcc gctgcccctg ctgtctcgag cgagcttctc 2400 gagaaggccg agaccgtcgt catggaggtc ctcgccgcca agactggcta cgagactgac 2460 atgattgagt ccgacatgga gctcgagact gagctcggca ttgactccat caagcgtgtc 2520 gagatcctct ccgaggttca ggccatgctc aacgtcgagg ccaaggacgt cgatgccctc 2580 agccgcaccc gcactgttgg cgaggttgtc gatgccatga aggccgagat cgctggtggc 2640 tctgccccgg cgcctgccgc cgctgcccct gctccggctg ccgccgcccc tgctgtctcg 2700 aacgagcttc ttgagaaggc cgagaccgtc gtcatggagg tcctcgccgc caagactggc 2760 tacgagaccg acatgatcga gtccgacatg gagctcgaga ccgagctcgg cattgactcc 2820 atcaagcgtg tcgagattct ctccgaggtt caggccatgc tcaacgtcga ggccaaggac 2880 gtcgacgctc tcagccgcac tcgcactgtt ggcgaggtcg tcgatgccat gaaggctgag 2940 atcgctggtg gctctgcccc ggcgcctgcc gccgctgctc ctgcctcggc tggcgccgcg 3000 cctgcg 3006 <210> 17 <211> 2133 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2133) <400> 17 ttt ggc gct ctc ggc ggc ttc atc tcg cag cag gcg gag cgc ttc gag 48 Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu 1 5 10 15 ccc gcc gaa atc ctc ggc ttc acg ctc atg tgc gcc aag ttc gcc aag 96 Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys 20 25 30 gct tcc ctc tgc acg gct gtg gct ggc ggc cgc ccg gcc ttt atc ggt 144 Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly 35 40 45 gtg gcg cgc ctt gac ggc cgc ctc gga ttc act tcg cag ggc act tct 192 Val Ala Arg Leu Asp Gly Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser 50 55 60 gac gcg ctc aag cgt gcc cag cgt ggt gcc atc ttt ggc ctc tgc aag 240 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys 65 70 75 80 acc atc ggc ctc gag tgg tcc gag tct gac gtc ttt tcc cgc ggc gtg 288 Thr Ile Gly Leu Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val 85 90 95 gac att gct cag ggc atg cac ccc gag gat gcc gcc gtg gcg att gtg 336 Asp Ile Ala Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val 100 105 110 cgc gag atg gcg tgc gct gac att cgc att cgc gag gtc ggc att ggc 384 Arg Glu Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly 115 120 125 gca aac cag cag cgc tgc acg atc cgt gcc gcc aag ctc gag acc ggc 432 Ala Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 130 135 140 aac ccg cag cgc cag atc gcc aag gac gac gtg ctg ctc gtt tct ggc 480 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 ggc gct cgc ggc atc acg cct ctt tgc atc cgg gag atc acg cgc cag 528 Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Ile Arg Glu Ile Thr Arg Gln 165 170 175 atc gcg ggc ggc aag tac att ctg ctt ggc cgc agc aag gtc tct gcg 576 Ile Ala Gly Gly Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Arg Ser Lys Val Ser Ala 180 185 190 agc gaa ccg gca tgg tgc gct ggc atc act gac gag aag gct gtg caa 624 Ser Glu Pro Ala Trp Cys Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Ala Val Gln 195 200 205 aag gct gct acc cag gag ctc aag cgc gcc ttt agc gct ggc gag ggc 672 Lys Ala Ala Thr Gln Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ser Ala Gly Glu Gly 210 215 220 ccc aag ccc acg ccc cgc gct gtc act aag ctt gtg ggc tct gtt ctt 720 Pro Lys Pro Thr Pro Arg Ala Val Thr Lys Leu Val Gly Ser Val Leu 225 230 235 240 ggc gct cgc gag gtg cgc agc tct att gct gcg att gaa gcg ctc ggc 768 Gly Ala Arg Glu Val Arg Ser Ser Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Gly 245 250 255 ggc aag gcc atc tac tcg tcg tgc gac gtg aac tct gcc gcc gac gtg 816 Gly Lys Ala Ile Tyr Ser Ser Cys Asp Val Asn Ser Ala Ala Asp Val 260 265 270 gcc aag gcc gtg cgc gat gcc gag tcc cag ctc ggt gcc cgc gtc tcg 864 Ala Lys Ala Val Arg Asp Ala Glu Ser Gln Leu Gly Ala Arg Val Ser 275 280 285 ggc atc gtt cat gcc tcg ggc gtg ctc cgc gac cgt ctc atc gag aag 912 Gly Ile Val His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Arg Leu Ile Glu Lys 290 295 300 aag ctc ccc gac gag ttc gac gcc gtc ttt ggc acc aag gtc acc ggt 960 Lys Leu Pro Asp Glu Phe Asp Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly 305 310 315 320 ctc gag aac ctc ctc gcc gcc gtc gac cgc gcc aac ctc aag cac atg 1008 Leu Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Asp Arg Ala Asn Leu Lys His Met 325 330 335 gtc ctc ttc agc tcg ctc gcc ggc ttc cac ggc aac gtc ggc cag tct 1056 Val Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser 340 345 350 gac tac gcc atg gcc aac gag gcc ctt aac aag atg ggc ctc gag ctc 1104 Asp Tyr Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Met Gly Leu Glu Leu 355 360 365 gcc aag gac gtc tcg gtc aag tcg atc tgc ttc ggt ccc tgg gac ggt 1152 Ala Lys Asp Val Ser Val Lys Ser Ile Cys Phe Gly Pro Trp Asp Gly 370 375 380 ggc atg gtg acg ccg cag ctc aag aag cag ttc cag gag atg ggc gtg 1200 Gly Met Val Thr Pro Gln Leu Lys Lys Gln Phe Gln Glu Met Gly Val 385 390 395 400 cag atc atc ccc cgc gag ggc ggc gct gat acc gtg gcg cgc atc gtg 1248 Gln Ile Ile Pro Arg Glu Gly Gly Ala Asp Thr Val Ala Arg Ile Val 405 410 415 ctc ggc tcc tcg ccg gct gag atc ctt gtc ggc aac tgg cgc acc ccg 1296 Leu Gly Ser Ser Pro Ala Glu Ile Leu Val Gly Asn Trp Arg Thr Pro 420 425 430 tcc aag aag gtc ggc tcg gac acc atc acc ctg cac cgc aag att tcc 1344 Ser Lys Lys Val Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu His Arg Lys Ile Ser 435 440 445 gcc aag tcc aac ccc ttc ctc gag gac cac gtc atc cag ggc cgc cgc 1392 Ala Lys Ser Asn Pro Phe Leu Glu Asp His Val Ile Gln Gly Arg Arg 450 455 460 gtg ctg ccc atg acg ctg gcc att ggc tcg ctc gcg gag acc tgc ctc 1440 Val Leu Pro Met Thr Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ala Glu Thr Cys Leu 465 470 475 480 ggc ctc ttc ccc ggc tac tcg ctc tgg gcc att gac gac gcc cag ctc 1488 Gly Leu Phe Pro Gly Tyr Ser Leu Trp Ala Ile Asp Asp Ala Gln Leu 485 490 495 ttc aag ggt gtc act gtc gac ggc gac gtc aac tgc gag gtg acc ctc 1536 Phe Lys Gly Val Thr Val Asp Gly Asp Val Asn Cys Glu Val Thr Leu 500 505 510 acc ccg tcg acg gcg ccc tcg ggc cgc gtc aac gtc cag gcc acg ctc 1584 Thr Pro Ser Thr Ala Pro Ser Gly Arg Val Asn Val Gln Ala Thr Leu 515 520 525 aag acc ttt tcc agc ggc aag ctg gtc ccg gcc tac cgc gcc gtc atc 1632 Lys Thr Phe Ser Ser Gly Lys Leu Val Pro Ala Tyr Arg Ala Val Ile 530 535 540 gtg ctc tcc aac cag ggc gcg ccc ccg gcc aac gcc acc atg cag ccg 1680 Val Leu Ser Asn Gln Gly Ala Pro Pro Ala Asn Ala Thr Met Gln Pro 545 550 555 560 ccc tcg ctc gat gcc gat ccg gcg ctc cag ggc tcc gtc tac gac ggc 1728 Pro Ser Leu Asp Ala Asp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Val Tyr Asp Gly 565 570 575 aag acc ctc ttc cac ggc ccg gcc ttc cgc ggc atc gat gac gtg ctc 1776 Lys Thr Leu Phe His Gly Pro Ala Phe Arg Gly Ile Asp Asp Val Leu 580 585 590 tcg tgc acc aag agc cag ctt gtg gcc aag tgc agc gct gtc ccc ggc 1824 Ser Cys Thr Lys Ser Gln Leu Val Ala Lys Cys Ser Ala Val Pro Gly 595 600 605 tcc gac gcc gct cgc ggc gag ttt gcc acg gac act gac gcc cat gac 1872 Ser Asp Ala Ala Arg Gly Glu Phe Ala Thr Asp Thr Asp Ala His Asp 610 615 620 ccc ttc gtg aac gac ctg gcc ttt cag gcc atg ctc gtc tgg gtg cgc 1920 Pro Phe Val Asn Asp Leu Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Val Arg 625 630 635 640 cgc acg ctc ggc cag gct gcg ctc ccc aac tcg atc cag cgc atc gtc 1968 Arg Thr Leu Gly Gln Ala Ala Leu Pro Asn Ser Ile Gln Arg Ile Val 645 650 655 cag cac cgc ccg gtc ccg cag gac aag ccc ttc tac att acc ctc cgc 2016 Gln His Arg Pro Val Pro Gln Asp Lys Pro Phe Tyr Ile Thr Leu Arg 660 665 670 tcc aac cag tcg ggc ggt cac tcc cag cac aag cac gcc ctt cag ttc 2064 Ser Asn Gln Ser Gly Gly His Ser Gln His Lys His Ala Leu Gln Phe 675 680 685 cac aac gag cag ggc gat ctc ttc att gat gtc cag gct tcg gtc atc 2112 His Asn Glu Gln Gly Asp Leu Phe Ile Asp Val Gln Ala Ser Val Ile 690 695 700 gcc acg gac agc ctt gcc ttc 2133 Ala Thr Asp Ser Leu Ala Phe 705 710 <210> 18 <211> 711 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 18 Phe Gly Ala Leu Gly Gly Phe Ile Ser Gln Gln Ala Glu Arg Phe Glu 1 5 10 15 Pro Ala Glu Ile Leu Gly Phe Thr Leu Met Cys Ala Lys Phe Ala Lys 20 25 30 Ala Ser Leu Cys Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg Pro Ala Phe Ile Gly 35 40 45 Val Ala Arg Leu Asp Gly Arg Leu Gly Phe Thr Ser Gln Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Gln Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu Cys Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gly Leu Glu Trp Ser Glu Ser Asp Val Phe Ser Arg Gly Val 85 90 95 Asp Ile Ala Gln Gly Met His Pro Glu Asp Ala Ala Val Ala Ile Val 100 105 110 Arg Glu Met Ala Cys Ala Asp Ile Arg Ile Arg Glu Val Gly Ile Gly 115 120 125 Ala Asn Gln Gln Arg Cys Thr Ile Arg Ala Ala Lys Leu Glu Thr Gly 130 135 140 Asn Pro Gln Arg Gln Ile Ala Lys Asp Asp Val Leu Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Ile Arg Glu Ile Thr Arg Gln 165 170 175 Ile Ala Gly Gly Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Arg Ser Lys Val Ser Ala 180 185 190 Ser Glu Pro Ala Trp Cys Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Ala Val Gln 195 200 205 Lys Ala Ala Thr Gln Glu Leu Lys Arg Ala Phe Ser Ala Gly Glu Gly 210 215 220 Pro Lys Pro Thr Pro Arg Ala Val Thr Lys Leu Val Gly Ser Val Leu 225 230 235 240 Gly Ala Arg Glu Val Arg Ser Ser Ile Ala Ala Ile Glu Ala Leu Gly 245 250 255 Gly Lys Ala Ile Tyr Ser Ser Cys Asp Val Asn Ser Ala Ala Asp Val 260 265 270 Ala Lys Ala Val Arg Asp Ala Glu Ser Gln Leu Gly Ala Arg Val Ser 275 280 285 Gly Ile Val His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Arg Leu Ile Glu Lys 290 295 300 Lys Leu Pro Asp Glu Phe Asp Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly 305 310 315 320 Leu Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Asp Arg Ala Asn Leu Lys His Met 325 330 335 Val Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser 340 345 350 Asp Tyr Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Met Gly Leu Glu Leu 355 360 365 Ala Lys Asp Val Ser Val Lys Ser Ile Cys Phe Gly Pro Trp Asp Gly 370 375 380 Gly Met Val Thr Pro Gln Leu Lys Lys Gln Phe Gln Glu Met Gly Val 385 390 395 400 Gln Ile Ile Pro Arg Glu Gly Gly Ala Asp Thr Val Ala Arg Ile Val 405 410 415 Leu Gly Ser Ser Pro Ala Glu Ile Leu Val Gly Asn Trp Arg Thr Pro 420 425 430 Ser Lys Lys Val Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu His Arg Lys Ile Ser 435 440 445 Ala Lys Ser Asn Pro Phe Leu Glu Asp His Val Ile Gln Gly Arg Arg 450 455 460 Val Leu Pro Met Thr Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ala Glu Thr Cys Leu 465 470 475 480 Gly Leu Phe Pro Gly Tyr Ser Leu Trp Ala Ile Asp Asp Ala Gln Leu 485 490 495 Phe Lys Gly Val Thr Val Asp Gly Asp Val Asn Cys Glu Val Thr Leu 500 505 510 Thr Pro Ser Thr Ala Pro Ser Gly Arg Val Asn Val Gln Ala Thr Leu 515 520 525 Lys Thr Phe Ser Ser Gly Lys Leu Val Pro Ala Tyr Arg Ala Val Ile 530 535 540 Val Leu Ser Asn Gln Gly Ala Pro Pro Ala Asn Ala Thr Met Gln Pro 545 550 555 560 Pro Ser Leu Asp Ala Asp Pro Ala Leu Gln Gly Ser Val Tyr Asp Gly 565 570 575 Lys Thr Leu Phe His Gly Pro Ala Phe Arg Gly Ile Asp Asp Val Leu 580 585 590 Ser Cys Thr Lys Ser Gln Leu Val Ala Lys Cys Ser Ala Val Pro Gly 595 600 605 Ser Asp Ala Ala Arg Gly Glu Phe Ala Thr Asp Thr Asp Ala His Asp 610 615 620 Pro Phe Val Asn Asp Leu Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Val Arg 625 630 635 640 Arg Thr Leu Gly Gln Ala Ala Leu Pro Asn Ser Ile Gln Arg Ile Val 645 650 655 Gln His Arg Pro Val Pro Gln Asp Lys Pro Phe Tyr Ile Thr Leu Arg 660 665 670 Ser Asn Gln Ser Gly Gly His Ser Gln His Lys His Ala Leu Gln Phe 675 680 685 His Asn Glu Gln Gly Asp Leu Phe Ile Asp Val Gln Ala Ser Val Ile 690 695 700 Ala Thr Asp Ser Leu Ala Phe 705 710 <210> 19 <211> 1350 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1350) <400> 19 atg gcc gct cgg aat gtg agc gcc gcg cat gag atg cac gat gaa aag 48 Met Ala Ala Arg Asn Val Ser Ala Ala His Glu Met His Asp Glu Lys 1 5 10 15 cgc atc gcc gtc gtc ggc atg gcc gtc cag tac gcc gga tgc aaa acc 96 Arg Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys Thr 20 25 30 aag gac gag ttc tgg gag gtg ctc atg aac ggc aag gtc gag tcc aag 144 Lys Asp Glu Phe Trp Glu Val Leu Met Asn Gly Lys Val Glu Ser Lys 35 40 45 gtg atc agc gac aaa cga ctc ggc tcc aac tac cgc gcc gag cac tac 192 Val Ile Ser Asp Lys Arg Leu Gly Ser Asn Tyr Arg Ala Glu His Tyr 50 55 60 aaa gca gag cgc agc aag tat gcc gac acc ttt tgc aac gaa acg tac 240 Lys Ala Glu Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Thr Tyr 65 70 75 80 ggc acc ctt gac gag aac gag atc gac aac gag cac gaa ctc ctc ctc 288 Gly Thr Leu Asp Glu Asn Glu Ile Asp Asn Glu His Glu Leu Leu Leu 85 90 95 aac ctc gcc aag cag gca ctc gca gag aca tcc gtc aaa gac tcg aca 336 Asn Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Glu Thr Ser Val Lys Asp Ser Thr 100 105 110 cgc tgc ggc atc gtc agc ggc tgc ctc tcg ttc ccc atg gac aac ctc 384 Arg Cys Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu 115 120 125 cag ggt gaa ctc ctc aac gtg tac caa aac cat gtc gag aaa aag ctc 432 Gln Gly Glu Leu Leu Asn Val Tyr Gln Asn His Val Glu Lys Lys Leu 130 135 140 ggg gcc cgc gtc ttc aag gac gcc tcc cat tgg tcc gaa cgc gag cag 480 Gly Ala Arg Val Phe Lys Asp Ala Ser His Trp Ser Glu Arg Glu Gln 145 150 155 160 tcc aac aaa ccc gag gcc ggt gac cgc cgc atc ttc atg gac ccg gcc 528 Ser Asn Lys Pro Glu Ala Gly Asp Arg Arg Ile Phe Met Asp Pro Ala 165 170 175 tcc ttc gtc gcc gaa gaa ctc aac ctc ggc gcc ctt cac tac tcc gtc 576 Ser Phe Val Ala Glu Glu Leu Asn Leu Gly Ala Leu His Tyr Ser Val 180 185 190 gac gca gca tgc gcc acg gcg ctc tac gtg ctc cgc ctc gcg cag gat 624 Asp Ala Ala Cys Ala Thr Ala Leu Tyr Val Leu Arg Leu Ala Gln Asp 195 200 205 cat ctc gtc tcc ggc gcc gcc gac gtc atg ctc tgc ggt gcc acc tgc 672 His Leu Val Ser Gly Ala Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys 210 215 220 ctg ccg gag ccc ttt ttc atc ctt tcg ggc ttt tcc acc ttc cag gcc 720 Leu Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala 225 230 235 240 atg ccc gtc ggc acg ggc cag aac gtg tcc atg ccg ctg cac aag gac 768 Met Pro Val Gly Thr Gly Gln Asn Val Ser Met Pro Leu His Lys Asp 245 250 255 agc cag ggc ctc acc ccg ggt gag ggc ggc tcc atc atg gtc ctc aag 816 Ser Gln Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile Met Val Leu Lys 260 265 270 cgt ctc gat gat gcc atc cgc gac ggc gac cac att tac ggc acc ctt 864 Arg Leu Asp Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asp His Ile Tyr Gly Thr Leu 275 280 285 ctc ggc gcc aat gtc agc aac tcc ggc aca ggt ctg ccc ctc aag ccc 912 Leu Gly Ala Asn Val Ser Asn Ser Gly Thr Gly Leu Pro Leu Lys Pro 290 295 300 ctt ctc ccc agc gag aaa aag tgc ctc atg gac acc tac acg cgc att 960 Leu Leu Pro Ser Glu Lys Lys Cys Leu Met Asp Thr Tyr Thr Arg Ile 305 310 315 320 aac gtg cac ccg cac aag att cag tac gtc gag tgc cac gcc acc ggc 1008 Asn Val His Pro His Lys Ile Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly 325 330 335 acg ccc cag ggt gat cgt gtg gaa atc gac gcc gtc aag gcc tgc ttt 1056 Thr Pro Gln Gly Asp Arg Val Glu Ile Asp Ala Val Lys Ala Cys Phe 340 345 350 gaa ggc aag gtc ccc cgt ttc ggt acc aca aag ggc aac ttt gga cac 1104 Glu Gly Lys Val Pro Arg Phe Gly Thr Thr Lys Gly Asn Phe Gly His 355 360 365 acc cts gyc gca gcc ggc ttt gcc ggt atg tgc aag gtc ctc ctc tcc 1152 Thr Xaa Xaa Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Cys Lys Val Leu Leu Ser 370 375 380 atg aag cat ggc atc atc ccg ccc acc ccg ggt atc gat gac gag acc 1200 Met Lys His Gly Ile Ile Pro Pro Thr Pro Gly Ile Asp Asp Glu Thr 385 390 395 400 aag atg gac cct ctc gtc gtc tcc ggt gag gcc atc cca tgg cca gag 1248 Lys Met Asp Pro Leu Val Val Ser Gly Glu Ala Ile Pro Trp Pro Glu 405 410 415 acc aac ggc gag ccc aag cgc gcc ggt ctc tcg gcc ttt ggc ttt ggt 1296 Thr Asn Gly Glu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly 420 425 430 ggc acc aac gcc cat gcc gtc ttt gag gag cat gac ccc tcc aac gcc 1344 Gly Thr Asn Ala His Ala Val Phe Glu Glu His Asp Pro Ser Asn Ala 435 440 445 gcc tgc 1350 Ala Cys 450 <210> 20 <211> 450 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (370)..(370) <223> The 'Xaa' at location 370 stands for Leu. <220> <221> misc_feature <222> (371)..(371) <223> The 'Xaa' at location 371 stands for Ala, or Val. <400> 20 Met Ala Ala Arg Asn Val Ser Ala Ala His Glu Met His Asp Glu Lys 1 5 10 15 Arg Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys Thr 20 25 30 Lys Asp Glu Phe Trp Glu Val Leu Met Asn Gly Lys Val Glu Ser Lys 35 40 45 Val Ile Ser Asp Lys Arg Leu Gly Ser Asn Tyr Arg Ala Glu His Tyr 50 55 60 Lys Ala Glu Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Thr Tyr 65 70 75 80 Gly Thr Leu Asp Glu Asn Glu Ile Asp Asn Glu His Glu Leu Leu Leu 85 90 95 Asn Leu Ala Lys Gln Ala Leu Ala Glu Thr Ser Val Lys Asp Ser Thr 100 105 110 Arg Cys Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu 115 120 125 Gln Gly Glu Leu Leu Asn Val Tyr Gln Asn His Val Glu Lys Lys Leu 130 135 140 Gly Ala Arg Val Phe Lys Asp Ala Ser His Trp Ser Glu Arg Glu Gln 145 150 155 160 Ser Asn Lys Pro Glu Ala Gly Asp Arg Arg Ile Phe Met Asp Pro Ala 165 170 175 Ser Phe Val Ala Glu Glu Leu Asn Leu Gly Ala Leu His Tyr Ser Val 180 185 190 Asp Ala Ala Cys Ala Thr Ala Leu Tyr Val Leu Arg Leu Ala Gln Asp 195 200 205 His Leu Val Ser Gly Ala Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys 210 215 220 Leu Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala 225 230 235 240 Met Pro Val Gly Thr Gly Gln Asn Val Ser Met Pro Leu His Lys Asp 245 250 255 Ser Gln Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile Met Val Leu Lys 260 265 270 Arg Leu Asp Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asp His Ile Tyr Gly Thr Leu 275 280 285 Leu Gly Ala Asn Val Ser Asn Ser Gly Thr Gly Leu Pro Leu Lys Pro 290 295 300 Leu Leu Pro Ser Glu Lys Lys Cys Leu Met Asp Thr Tyr Thr Arg Ile 305 310 315 320 Asn Val His Pro His Lys Ile Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly 325 330 335 Thr Pro Gln Gly Asp Arg Val Glu Ile Asp Ala Val Lys Ala Cys Phe 340 345 350 Glu Gly Lys Val Pro Arg Phe Gly Thr Thr Lys Gly Asn Phe Gly His 355 360 365 Thr Xaa Xaa Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Cys Lys Val Leu Leu Ser 370 375 380 Met Lys His Gly Ile Ile Pro Pro Thr Pro Gly Ile Asp Asp Glu Thr 385 390 395 400 Lys Met Asp Pro Leu Val Val Ser Gly Glu Ala Ile Pro Trp Pro Glu 405 410 415 Thr Asn Gly Glu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly 420 425 430 Gly Thr Asn Ala His Ala Val Phe Glu Glu His Asp Pro Ser Asn Ala 435 440 445 Ala Cys 450 <210> 21 <211> 1323 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1323) <400> 21 tcg gcc cgc tgc ggc ggt gaa agc aac atg cgc atc gcc atc act ggt 48 Ser Ala Arg Cys Gly Gly Glu Ser Asn Met Arg Ile Ala Ile Thr Gly 1 5 10 15 atg gac gcc acc ttt ggc gct ctc aag gga ctc gac gcc ttc gag cgc 96 Met Asp Ala Thr Phe Gly Ala Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Arg 20 25 30 gcc att tac acc ggc gct cac ggt gcc atc cca ctc cca gaa aag cgc 144 Ala Ile Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala Ile Pro Leu Pro Glu Lys Arg 35 40 45 tgg cgc ttt ctc ggc aag gac aag gac ttt ctt gac ctc tgc ggc gtc 192 Trp Arg Phe Leu Gly Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Leu Cys Gly Val 50 55 60 aag gcc acc ccg cac ggc tgc tac att gaa gat gtt gag gtc gac ttc 240 Lys Ala Thr Pro His Gly Cys Tyr Ile Glu Asp Val Glu Val Asp Phe 65 70 75 80 cag cgc ctc cgc acg ccc atg acc cct gaa gac atg ctc ctc cct cag 288 Gln Arg Leu Arg Thr Pro Met Thr Pro Glu Asp Met Leu Leu Pro Gln 85 90 95 cag ctt ctg gcc gtc acc acc att gac cgc gcc atc ctc gac tcg gga 336 Gln Leu Leu Ala Val Thr Thr Ile Asp Arg Ala Ile Leu Asp Ser Gly 100 105 110 atg aaa aag ggt ggc aat gtc gcc gtc ttt gtc ggc ctc ggc acc gac 384 Met Lys Lys Gly Gly Asn Val Ala Val Phe Val Gly Leu Gly Thr Asp 115 120 125 ctc gag ctc tac cgt cac cgt gct cgc gtc gct ctc aag gag cgc gtc 432 Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Arg Val 130 135 140 cgc cct gaa gcc tcc aag aag ctc aat gac atg atg cag tac att aac 480 Arg Pro Glu Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asp Met Met Gln Tyr Ile Asn 145 150 155 160 gac tgc ggc aca tcc aca tcg tac acc tcg tac att ggc aac ctc gtc 528 Asp Cys Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val 165 170 175 gcc acg cgc gtc tcg tcg cag tgg ggc ttc acg ggc ccc tcc ttt acg 576 Ala Thr Arg Val Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr 180 185 190 atc acc gag ggc aac aac tcc gtc tac cgc tgc gcc gag ctc ggc aag 624 Ile Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Glu Leu Gly Lys 195 200 205 tac ctc ctc gag acc ggc gag gtc gat ggc gtc gtc gtt gcg ggt gtc 672 Tyr Leu Leu Glu Thr Gly Glu Val Asp Gly Val Val Val Ala Gly Val 210 215 220 gat ctc tgc ggc agt gcc gaa aac ctt tac gtc aag tct cgc cgc ttc 720 Asp Leu Cys Gly Ser Ala Glu Asn Leu Tyr Val Lys Ser Arg Arg Phe 225 230 235 240 aag gtg tcc acc tcc gat acc ccg cgc gcc agc ttt gac gcc gcc gcc 768 Lys Val Ser Thr Ser Asp Thr Pro Arg Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ala 245 250 255 gat ggc tac ttt gtc ggc gag ggc tgc ggt gcc ttt gtg ctc aag cgt 816 Asp Gly Tyr Phe Val Gly Glu Gly Cys Gly Ala Phe Val Leu Lys Arg 260 265 270 gag act agc tgc acc aag gac gac cgt atc tac gct tgc atg gat gcc 864 Glu Thr Ser Cys Thr Lys Asp Asp Arg Ile Tyr Ala Cys Met Asp Ala 275 280 285 atc gtc cct ggc aac gtc cct agc gcc tgc ttg cgc gag gcc ctc gac 912 Ile Val Pro Gly Asn Val Pro Ser Ala Cys Leu Arg Glu Ala Leu Asp 290 295 300 cag gcg cgc gtc aag ccg ggc gat atc gag atg ctc gag ctc agc gcc 960 Gln Ala Arg Val Lys Pro Gly Asp Ile Glu Met Leu Glu Leu Ser Ala 305 310 315 320 gac tcc gcc cgc cac ctc aag gac ccg tcc gtc ctg ccc aag gag ctc 1008 Asp Ser Ala Arg His Leu Lys Asp Pro Ser Val Leu Pro Lys Glu Leu 325 330 335 act gcc gag gag gaa atc ggc ggc ctt cag acg atc ctt cgt gac gat 1056 Thr Ala Glu Glu Glu Ile Gly Gly Leu Gln Thr Ile Leu Arg Asp Asp 340 345 350 gac aag ctc ccg cgc aac gtc gca acg ggc agt gtc aag gcc acc gtc 1104 Asp Lys Leu Pro Arg Asn Val Ala Thr Gly Ser Val Lys Ala Thr Val 355 360 365 ggt gac acc ggt tat gcc tct ggt gct gcc agc ctc atc aag gct gcg 1152 Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Ala Ala 370 375 380 ctt tgc atc tac aac cgc tac ctg ccc agc aac ggc gac gac tgg gat 1200 Leu Cys Ile Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Asp Asp Trp Asp 385 390 395 400 gaa ccc gcc cct gag gcg ccc tgg gac agc acc ctc ttt gcg tgc cag 1248 Glu Pro Ala Pro Glu Ala Pro Trp Asp Ser Thr Leu Phe Ala Cys Gln 405 410 415 acc tcg cgc gct tgg ctc aag aac cct ggc gag cgt cgc tat gcg gcc 1296 Thr Ser Arg Ala Trp Leu Lys Asn Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Ala Ala 420 425 430 gtc tcg ggc gtc tcc gag acg cgc tcg 1323 Val Ser Gly Val Ser Glu Thr Arg Ser 435 440 <210> 22 <211> 441 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 22 Ser Ala Arg Cys Gly Gly Glu Ser Asn Met Arg Ile Ala Ile Thr Gly 1 5 10 15 Met Asp Ala Thr Phe Gly Ala Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Arg 20 25 30 Ala Ile Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala Ile Pro Leu Pro Glu Lys Arg 35 40 45 Trp Arg Phe Leu Gly Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Leu Cys Gly Val 50 55 60 Lys Ala Thr Pro His Gly Cys Tyr Ile Glu Asp Val Glu Val Asp Phe 65 70 75 80 Gln Arg Leu Arg Thr Pro Met Thr Pro Glu Asp Met Leu Leu Pro Gln 85 90 95 Gln Leu Leu Ala Val Thr Thr Ile Asp Arg Ala Ile Leu Asp Ser Gly 100 105 110 Met Lys Lys Gly Gly Asn Val Ala Val Phe Val Gly Leu Gly Thr Asp 115 120 125 Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Arg Val 130 135 140 Arg Pro Glu Ala Ser Lys Lys Leu Asn Asp Met Met Gln Tyr Ile Asn 145 150 155 160 Asp Cys Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val 165 170 175 Ala Thr Arg Val Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr 180 185 190 Ile Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Glu Leu Gly Lys 195 200 205 Tyr Leu Leu Glu Thr Gly Glu Val Asp Gly Val Val Val Ala Gly Val 210 215 220 Asp Leu Cys Gly Ser Ala Glu Asn Leu Tyr Val Lys Ser Arg Arg Phe 225 230 235 240 Lys Val Ser Thr Ser Asp Thr Pro Arg Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ala 245 250 255 Asp Gly Tyr Phe Val Gly Glu Gly Cys Gly Ala Phe Val Leu Lys Arg 260 265 270 Glu Thr Ser Cys Thr Lys Asp Asp Arg Ile Tyr Ala Cys Met Asp Ala 275 280 285 Ile Val Pro Gly Asn Val Pro Ser Ala Cys Leu Arg Glu Ala Leu Asp 290 295 300 Gln Ala Arg Val Lys Pro Gly Asp Ile Glu Met Leu Glu Leu Ser Ala 305 310 315 320 Asp Ser Ala Arg His Leu Lys Asp Pro Ser Val Leu Pro Lys Glu Leu 325 330 335 Thr Ala Glu Glu Glu Ile Gly Gly Leu Gln Thr Ile Leu Arg Asp Asp 340 345 350 Asp Lys Leu Pro Arg Asn Val Ala Thr Gly Ser Val Lys Ala Thr Val 355 360 365 Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Ala Ala 370 375 380 Leu Cys Ile Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ser Asn Gly Asp Asp Trp Asp 385 390 395 400 Glu Pro Ala Pro Glu Ala Pro Trp Asp Ser Thr Leu Phe Ala Cys Gln 405 410 415 Thr Ser Arg Ala Trp Leu Lys Asn Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Ala Ala 420 425 430 Val Ser Gly Val Ser Glu Thr Arg Ser 435 440 <210> 23 <211> 1500 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 23 tgc tat tcc gtg ctc ctc tcc gaa gcc gag ggc cac tac gag cgc gag 48 Cys Tyr Ser Val Leu Leu Ser Glu Ala Glu Gly His Tyr Glu Arg Glu 1 5 10 15 aac cgc atc tcg ctc gac gag gag gcg ccc aag ctc att gtg ctt cgc 96 Asn Arg Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Pro Lys Leu Ile Val Leu Arg 20 25 30 gcc gac tcc cac gag gag atc ctt ggt cgc ctc gac aag atc cgc gag 144 Ala Asp Ser His Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp Lys Ile Arg Glu 35 40 45 cgc ttc ttg cag ccc acg ggc gcc gcc ccg cgc gag tcc gag ctc aag 192 Arg Phe Leu Gln Pro Thr Gly Ala Ala Pro Arg Glu Ser Glu Leu Lys 50 55 60 gcg cag gcc cgc cgc atc ttc ctc gag ctc ctc ggc gag acc ctt gcc 240 Ala Gln Ala Arg Arg Ile Phe Leu Glu Leu Leu Gly Glu Thr Leu Ala 65 70 75 80 cag gat gcc gct tct tca ggc tcg caa aag ccc ctc gct ctc agc ctc 288 Gln Asp Ala Ala Ser Ser Gly Ser Gln Lys Pro Leu Ala Leu Ser Leu 85 90 95 gtc tcc acg ccc tcc aag ctc cag cgc gag gtc gag ctc gcg gcc aag 336 Val Ser Thr Pro Ser Lys Leu Gln Arg Glu Val Glu Leu Ala Ala Lys 100 105 110 ggt atc ccg cgc tgc ctc aag atg cgc cgc gat tgg agc tcc cct gct 384 Gly Ile Pro Arg Cys Leu Lys Met Arg Arg Asp Trp Ser Ser Pro Ala 115 120 125 ggc agc cgc tac gcg cct gag ccg ctc gcc agc gac cgc gtc gcc ttc 432 Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Leu Ala Ser Asp Arg Val Ala Phe 130 135 140 atg tac ggc gaa ggt cgc agc cct tac tac ggc atc acc caa gac att 480 Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Ile Thr Gln Asp Ile 145 150 155 160 cac cgc att tgg ccc gaa ctc cac gag gtc atc aac gaa aag acg aac 528 His Arg Ile Trp Pro Glu Leu His Glu Val Ile Asn Glu Lys Thr Asn 165 170 175 cgt ctc tgg gcc gaa ggc gac cgc tgg gtc atg ccg cgc gcc agc ttc 576 Arg Leu Trp Ala Glu Gly Asp Arg Trp Val Met Pro Arg Ala Ser Phe 180 185 190 aag tcg gag ctc gag agc cag cag caa gag ttt gat cgc aac atg att 624 Lys Ser Glu Leu Glu Ser Gln Gln Gln Glu Phe Asp Arg Asn Met Ile 195 200 205 gaa atg ttc cgt ctt gga atc ctc acc tca att gcc ttc acc aat ctg 672 Glu Met Phe Arg Leu Gly Ile Leu Thr Ser Ile Ala Phe Thr Asn Leu 210 215 220 gcg cgc gac gtt ctc aac atc acg ccc aag gcc gcc ttt ggc ctc agt 720 Ala Arg Asp Val Leu Asn Ile Thr Pro Lys Ala Ala Phe Gly Leu Ser 225 230 235 240 ctt ggc gag att tcc atg att ttt gcc ttt tcc aag aag aac ggt ctc 768 Leu Gly Glu Ile Ser Met Ile Phe Ala Phe Ser Lys Lys Asn Gly Leu 245 250 255 atc tcc gac cag ctc acc aag gat ctt cgc gag tcc gac gtg tgg aac 816 Ile Ser Asp Gln Leu Thr Lys Asp Leu Arg Glu Ser Asp Val Trp Asn 260 265 270 aag gct ctg gcc gtt gaa ttt aat gcg ctg cgc gag gcc tgg ggc att 864 Lys Ala Leu Ala Val Glu Phe Asn Ala Leu Arg Glu Ala Trp Gly Ile 275 280 285 cca cag agt gtc ccc aag gac gag ttc tgg caa ggc tac att gtg cgc 912 Pro Gln Ser Val Pro Lys Asp Glu Phe Trp Gln Gly Tyr Ile Val Arg 290 295 300 ggc acc aag cag gat atc gag gcg gcc atc gcc ccg gac agc aag tac 960 Gly Thr Lys Gln Asp Ile Glu Ala Ala Ile Ala Pro Asp Ser Lys Tyr 305 310 315 320 gtg cgc ctc acc atc atc aat gat gcc aac acc gcc ctc att agc ggc 1008 Val Arg Leu Thr Ile Ile Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu Ile Ser Gly 325 330 335 aag ccc gac gcc tgc aag gct gcg atc gcg cgt ctc ggt ggc aac att 1056 Lys Pro Asp Ala Cys Lys Ala Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asn Ile 340 345 350 cct gcg ctt ccc gtg acc cag ggc atg tgc ggc cac tgc ccc gag gtg 1104 Pro Ala Leu Pro Val Thr Gln Gly Met Cys Gly His Cys Pro Glu Val 355 360 365 gga cct tat acc aag gat atc gcc aag atc cat gcc aac ctt gag ttc 1152 Gly Pro Tyr Thr Lys Asp Ile Ala Lys Ile His Ala Asn Leu Glu Phe 370 375 380 ccc gtt gtc gac ggc ctt gac ctc tgg acc aca atc aac cag aag cgc 1200 Pro Val Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp Thr Thr Ile Asn Gln Lys Arg 385 390 395 400 ctc gtg cca cgc gcc acg ggc gcc aag gac gaa tgg gcc cct tct tcc 1248 Leu Val Pro Arg Ala Thr Gly Ala Lys Asp Glu Trp Ala Pro Ser Ser 405 410 415 ttt ggc gag tac gcc ggc cag ctc tac gag aag cag gct aac ttc ccc 1296 Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Gln Leu Tyr Glu Lys Gln Ala Asn Phe Pro 420 425 430 caa atc gtc gag acc att tac aag caa aac tac gac gtc ttt gtc gag 1344 Gln Ile Val Glu Thr Ile Tyr Lys Gln Asn Tyr Asp Val Phe Val Glu 435 440 445 gtt ggg ccc aac aac cac cgt agc acc gca gtg cgc acc acg ctt ggt 1392 Val Gly Pro Asn Asn His Arg Ser Thr Ala Val Arg Thr Thr Leu Gly 450 455 460 ccc cag cgc aac cac ctt gct ggc gcc atc gac aag cag aac gag gat 1440 Pro Gln Arg Asn His Leu Ala Gly Ala Ile Asp Lys Gln Asn Glu Asp 465 470 475 480 gct tgg acg acc atc gtc aag ctt gtg gct tcg ctc aag gcc cac ctt 1488 Ala Trp Thr Thr Ile Val Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Ala His Leu 485 490 495 gtt cct ggc gtc 1500 Val Pro Gly Val 500 <210> 24 <211> 500 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 24 Cys Tyr Ser Val Leu Leu Ser Glu Ala Glu Gly His Tyr Glu Arg Glu 1 5 10 15 Asn Arg Ile Ser Leu Asp Glu Glu Ala Pro Lys Leu Ile Val Leu Arg 20 25 30 Ala Asp Ser His Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp Lys Ile Arg Glu 35 40 45 Arg Phe Leu Gln Pro Thr Gly Ala Ala Pro Arg Glu Ser Glu Leu Lys 50 55 60 Ala Gln Ala Arg Arg Ile Phe Leu Glu Leu Leu Gly Glu Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Asp Ala Ala Ser Ser Gly Ser Gln Lys Pro Leu Ala Leu Ser Leu 85 90 95 Val Ser Thr Pro Ser Lys Leu Gln Arg Glu Val Glu Leu Ala Ala Lys 100 105 110 Gly Ile Pro Arg Cys Leu Lys Met Arg Arg Asp Trp Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Gly Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Leu Ala Ser Asp Arg Val Ala Phe 130 135 140 Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Ile Thr Gln Asp Ile 145 150 155 160 His Arg Ile Trp Pro Glu Leu His Glu Val Ile Asn Glu Lys Thr Asn 165 170 175 Arg Leu Trp Ala Glu Gly Asp Arg Trp Val Met Pro Arg Ala Ser Phe 180 185 190 Lys Ser Glu Leu Glu Ser Gln Gln Gln Glu Phe Asp Arg Asn Met Ile 195 200 205 Glu Met Phe Arg Leu Gly Ile Leu Thr Ser Ile Ala Phe Thr Asn Leu 210 215 220 Ala Arg Asp Val Leu Asn Ile Thr Pro Lys Ala Ala Phe Gly Leu Ser 225 230 235 240 Leu Gly Glu Ile Ser Met Ile Phe Ala Phe Ser Lys Lys Asn Gly Leu 245 250 255 Ile Ser Asp Gln Leu Thr Lys Asp Leu Arg Glu Ser Asp Val Trp Asn 260 265 270 Lys Ala Leu Ala Val Glu Phe Asn Ala Leu Arg Glu Ala Trp Gly Ile 275 280 285 Pro Gln Ser Val Pro Lys Asp Glu Phe Trp Gln Gly Tyr Ile Val Arg 290 295 300 Gly Thr Lys Gln Asp Ile Glu Ala Ala Ile Ala Pro Asp Ser Lys Tyr 305 310 315 320 Val Arg Leu Thr Ile Ile Asn Asp Ala Asn Thr Ala Leu Ile Ser Gly 325 330 335 Lys Pro Asp Ala Cys Lys Ala Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asn Ile 340 345 350 Pro Ala Leu Pro Val Thr Gln Gly Met Cys Gly His Cys Pro Glu Val 355 360 365 Gly Pro Tyr Thr Lys Asp Ile Ala Lys Ile His Ala Asn Leu Glu Phe 370 375 380 Pro Val Val Asp Gly Leu Asp Leu Trp Thr Thr Ile Asn Gln Lys Arg 385 390 395 400 Leu Val Pro Arg Ala Thr Gly Ala Lys Asp Glu Trp Ala Pro Ser Ser 405 410 415 Phe Gly Glu Tyr Ala Gly Gln Leu Tyr Glu Lys Gln Ala Asn Phe Pro 420 425 430 Gln Ile Val Glu Thr Ile Tyr Lys Gln Asn Tyr Asp Val Phe Val Glu 435 440 445 Val Gly Pro Asn Asn His Arg Ser Thr Ala Val Arg Thr Thr Leu Gly 450 455 460 Pro Gln Arg Asn His Leu Ala Gly Ala Ile Asp Lys Gln Asn Glu Asp 465 470 475 480 Ala Trp Thr Thr Ile Val Lys Leu Val Ala Ser Leu Lys Ala His Leu 485 490 495 Val Pro Gly Val 500 <210> 25 <211> 1530 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1530) <400> 25 ctg ctc gat ctc gac agt atg ctt gcg ctg agc tct gcc agt gcc tcc 48 Leu Leu Asp Leu Asp Ser Met Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 ggc aac ctt gtt gag act gcg cct agc gac gcc tcg gtc att gtg ccg 96 Gly Asn Leu Val Glu Thr Ala Pro Ser Asp Ala Ser Val Ile Val Pro 20 25 30 ccc tgc aac att gcg gat ctc ggc agc cgc gcc ttc atg aaa acg tac 144 Pro Cys Asn Ile Ala Asp Leu Gly Ser Arg Ala Phe Met Lys Thr Tyr 35 40 45 ggt gtt tcg gcg cct ctg tac acg ggc gcc atg gcc aag ggc att gcc 192 Gly Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 50 55 60 tct gcg gac ctc gtc att gcc gcc ggc cgc cag ggc atc ctt gcg tcc 240 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Arg Gln Gly Ile Leu Ala Ser 65 70 75 80 ttt ggc gcc ggc gga ctt ccc atg cag gtt gtg cgt gag tcc atc gaa 288 Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met Gln Val Val Arg Glu Ser Ile Glu 85 90 95 aag att cag gcc gcc ctg ccc aat ggc ccg tac gct gtc aac ctt atc 336 Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Asn Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 100 105 110 cat tct ccc ttt gac agc aac ctc gaa aag ggc aat gtc gat ctc ttc 384 His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe 115 120 125 ctc gag aag ggt gtc acc ttt gtc gag gcc tcg gcc ttt atg acg ctc 432 Leu Glu Lys Gly Val Thr Phe Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu 130 135 140 acc ccg cag gtc gtg cgg tac cgc gcg gct ggc ctc acg cgc aac gcc 480 Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Thr Arg Asn Ala 145 150 155 160 gac ggc tcg gtc aac atc cgc aac cgt atc att ggc aag gtc tcg cgc 528 Asp Gly Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg 165 170 175 acc gag ctc gcc gag atg ttc atg cgt cct gcg ccc gag cac ctt ctt 576 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Met Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 180 185 190 cag aag ctc att gct tcc ggc gag atc aac cag gag cag gcc gag ctc 624 Gln Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn Gln Glu Gln Ala Glu Leu 195 200 205 gcc cgc cgt gtt ccc gtc gct gac gac atc gcg gtc gaa gct gac tcg 672 Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 210 215 220 ggt ggc cac acc gac aac cgc ccc atc cac gtc att ctg ccc ctc atc 720 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile 225 230 235 240 atc aac ctt cgc gac cgc ctt cac cgc gag tgc ggc tac ccg gcc aac 768 Ile Asn Leu Arg Asp Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro Ala Asn 245 250 255 ctt cgc gtc cgt gtg ggc gcc ggc ggt ggc att ggg tgc ccc cag gcg 816 Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 260 265 270 gcg ctg gcc acc ttc aac atg ggt gcc tcc ttt att gtc acc ggc acc 864 Ala Leu Ala Thr Phe Asn Met Gly Ala Ser Phe Ile Val Thr Gly Thr 275 280 285 gtg aac cag gtc gcc aag cag tcg ggc acg tgc gac aat gtg cgc aag 912 Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys 290 295 300 cag ctc gcg aag gcc act tac tcg gac gta tgc atg gcc ccg gct gcc 960 Gln Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala 305 310 315 320 gac atg ttc gag gaa ggc gtc aag ctt cag gtc ctc aag aag gga acc 1008 Asp Met Phe Glu Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr 325 330 335 atg ttt ccc tcg cgc gcc aac aag ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac 1056 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr 340 345 350 gac tcg ttc gag tcc atg ccc ccc gca gag ctt gcg cgc gtc gag aag 1104 Asp Ser Phe Glu Ser Met Pro Pro Ala Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys 355 360 365 cgc atc ttc agc cgc gcg ctc gaa gag gtc tgg gac gag acc aaa aac 1152 Arg Ile Phe Ser Arg Ala Leu Glu Glu Val Trp Asp Glu Thr Lys Asn 370 375 380 ttt tac att aac cgt ctt cac aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag 1200 Phe Tyr Ile Asn Arg Leu His Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu 385 390 395 400 cgc gac ccc aag ctc aag atg tcg ctg tgc ttt cgc tgg tac ctg agc 1248 Arg Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 405 410 415 ctg gcg agc cgc tgg gcc aac act gga gct tcc gat cgc gtc atg gac 1296 Leu Ala Ser Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp 420 425 430 tac cag gtc tgg tgc ggt cct gcc att ggt tcc ttc aac gat ttc atc 1344 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Ile 435 440 445 aag gga act tac ctt gat ccg gcc gtc gca aac gag tac ccg tgc gtc 1392 Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ala Asn Glu Tyr Pro Cys Val 450 455 460 gtt cag att aac aag cag atc ctt cgt gga gcg tgc ttc ttg cgc cgt 1440 Val Gln Ile Asn Lys Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Phe Leu Arg Arg 465 470 475 480 ctc gaa att ctg cgc aac gca cgc ctt tcc gat ggc gct gcc gct ctt 1488 Leu Glu Ile Leu Arg Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gly Ala Ala Ala Leu 485 490 495 gtg gcc agc atc gat gac aca tac gtc ccg gcc gag aag ctg 1530 Val Ala Ser Ile Asp Asp Thr Tyr Val Pro Ala Glu Lys Leu 500 505 510 <210> 26 <211> 510 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 26 Leu Leu Asp Leu Asp Ser Met Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 Gly Asn Leu Val Glu Thr Ala Pro Ser Asp Ala Ser Val Ile Val Pro 20 25 30 Pro Cys Asn Ile Ala Asp Leu Gly Ser Arg Ala Phe Met Lys Thr Tyr 35 40 45 Gly Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 50 55 60 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Arg Gln Gly Ile Leu Ala Ser 65 70 75 80 Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Met Gln Val Val Arg Glu Ser Ile Glu 85 90 95 Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro Asn Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 100 105 110 His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe 115 120 125 Leu Glu Lys Gly Val Thr Phe Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu 130 135 140 Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Thr Arg Asn Ala 145 150 155 160 Asp Gly Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg 165 170 175 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Met Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 180 185 190 Gln Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Asn Gln Glu Gln Ala Glu Leu 195 200 205 Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 210 215 220 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile 225 230 235 240 Ile Asn Leu Arg Asp Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro Ala Asn 245 250 255 Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 260 265 270 Ala Leu Ala Thr Phe Asn Met Gly Ala Ser Phe Ile Val Thr Gly Thr 275 280 285 Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys 290 295 300 Gln Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala 305 310 315 320 Asp Met Phe Glu Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr 325 330 335 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr 340 345 350 Asp Ser Phe Glu Ser Met Pro Pro Ala Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys 355 360 365 Arg Ile Phe Ser Arg Ala Leu Glu Glu Val Trp Asp Glu Thr Lys Asn 370 375 380 Phe Tyr Ile Asn Arg Leu His Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu 385 390 395 400 Arg Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 405 410 415 Leu Ala Ser Arg Trp Ala Asn Thr Gly Ala Ser Asp Arg Val Met Asp 420 425 430 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Ile 435 440 445 Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ala Asn Glu Tyr Pro Cys Val 450 455 460 Val Gln Ile Asn Lys Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Phe Leu Arg Arg 465 470 475 480 Leu Glu Ile Leu Arg Asn Ala Arg Leu Ser Asp Gly Ala Ala Ala Leu 485 490 495 Val Ala Ser Ile Asp Asp Thr Tyr Val Pro Ala Glu Lys Leu 500 505 510 <210> 27 <211> 4512 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(4512) <400> 27 atg gcg ctc cgt gtc aag acg aac aag aag cca tgc tgg gag atg acc 48 Met Ala Leu Arg Val Lys Thr Asn Lys Lys Pro Cys Trp Glu Met Thr 1 5 10 15 aag gag gag ctg acc agc ggc aag acc gag gtg ttc aac tat gag gaa 96 Lys Glu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Thr Glu Val Phe Asn Tyr Glu Glu 20 25 30 ctc ctc gag ttc gca gag ggc gac atc gcc aag gtc ttc gga ccc gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ala Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 ttc gcc gtc atc gac aag tac ccg cgc cgc gtg cgc ctg ccc gcc cgc 192 Phe Ala Val Ile Asp Lys Tyr Pro Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 gag tac ctg ctc gtg acc cgc gtc acc ctc atg gac gcc gag gtc aac 240 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn 65 70 75 80 aac tac cgc gtc ggc gcc cgc atg gtc acc gag tac gat ctc ccc gtc 288 Asn Tyr Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Leu Pro Val 85 90 95 aac gga gag ctc tcc gag ggc gga gac tgc ccc tgg gcc gtc ctg gtc 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Cys Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gag agt ggc cag tgc gat ctc atg ctc atc tcc tac atg ggc att gac 384 Glu Ser Gly Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag aac cag ggc gac cgc gtc tac cgc ctg ctc aac acc acg ctc 432 Phe Gln Asn Gln Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acc ttt tac ggc gtg gcc cac gag ggc gag acc ctc gag tac gac att 480 Thr Phe Tyr Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Glu Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acc ggc ttc gcc aag cgt ctc gac ggc ggc atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Leu Asp Gly Gly Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttc ttc gag tac gac tgc tac gtc aac ggc cgc ctc ctc atc gag atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Val Asn Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cgc gat ggc tgc gcc ggc ttc ttc acc aac gag gag ctc gac gcc ggc 624 Arg Asp Gly Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asn Glu Glu Leu Asp Ala Gly 195 200 205 aag ggc gtc gtc ttc acc cgc ggc gac ctc gcc gcc cgc gcc aag atc 672 Lys Gly Val Val Phe Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ala Arg Ala Lys Ile 210 215 220 cca aag cag gac gtc tcc ccc tac gcc gtc gcc ccc tgc ctc cac aag 720 Pro Lys Gln Asp Val Ser Pro Tyr Ala Val Ala Pro Cys Leu His Lys 225 230 235 240 acc aag ctc aac gaa aag gag atg cag acc ctc gtc gac aag gac tgg 768 Thr Lys Leu Asn Glu Lys Glu Met Gln Thr Leu Val Asp Lys Asp Trp 245 250 255 gca tcc gtc ttt ggc tcc aag aac ggc atg ccg gaa atc aac tac aaa 816 Ala Ser Val Phe Gly Ser Lys Asn Gly Met Pro Glu Ile Asn Tyr Lys 260 265 270 ctc tgc gcg cgt aag atg ctc atg att gac cgc gtc acc agc att gac 864 Leu Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr Ser Ile Asp 275 280 285 cac aag ggc ggt gtc tac ggc ctc ggt cag ctc gtc ggt gaa aag atc 912 His Lys Gly Gly Val Tyr Gly Leu Gly Gln Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 ctc gag cgc gac cac tgg tac ttt ccc tgc cac ttt gtc aag gat cag 960 Leu Glu Arg Asp His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Lys Asp Gln 305 310 315 320 gtc atg gcc gga tcc ctc gtc tcc gac ggc tgc agc cag atg ctc aag 1008 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Met Leu Lys 325 330 335 atg tac atg atc tgg ctc ggc ctc cac ctc acc acc gga ccc ttt gac 1056 Met Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Thr Thr Gly Pro Phe Asp 340 345 350 ttc cgc ccg gtc aac ggc cac ccc aac aag gtc cgc tgc cgc ggc caa 1104 Phe Arg Pro Val Asn Gly His Pro Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 atc tcc ccg cac aag ggc aag ctc gtc tac gtc atg gag atc aag gag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu 370 375 380 atg ggc ttc gac gag gac aac gac ccg tac gcc att gcc gac gtc aac 1200 Met Gly Phe Asp Glu Asp Asn Asp Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val Asn 385 390 395 400 atc att gat gtc gac ttc gaa aag ggc cag gac ttt agc ctc gac cgc 1248 Ile Ile Asp Val Asp Phe Glu Lys Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Arg 405 410 415 atc agc gac tac ggc aag ggc gac ctc aac aag aag atc gtc gtc gac 1296 Ile Ser Asp Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Asn Lys Lys Ile Val Val Asp 420 425 430 ttt aag ggc atc gct ctc aag atg cag aag cgc tcc acc aac aag aac 1344 Phe Lys Gly Ile Ala Leu Lys Met Gln Lys Arg Ser Thr Asn Lys Asn 435 440 445 ccc tcc aag gtt cag ccc gtc ttt gcc aac ggc gcc gcc act gtc ggc 1392 Pro Ser Lys Val Gln Pro Val Phe Ala Asn Gly Ala Ala Thr Val Gly 450 455 460 ccc gag gcc tcc aag gct tcc tcc ggc gcc agc gcc agc gcc agc gcc 1440 Pro Glu Ala Ser Lys Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala 465 470 475 480 gcc ccg gcc aag cct gcc ttc agc gcc gat gtt ctt gcg ccc aag ccc 1488 Ala Pro Ala Lys Pro Ala Phe Ser Ala Asp Val Leu Ala Pro Lys Pro 485 490 495 gtt gcc ctt ccc gag cac atc ctc aag ggc gac gcc ctc gcc ccc aag 1536 Val Ala Leu Pro Glu His Ile Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ala Pro Lys 500 505 510 gag atg tcc tgg cac ccc atg gcc cgc atc ccg ggc aac ccg acg ccc 1584 Glu Met Ser Trp His Pro Met Ala Arg Ile Pro Gly Asn Pro Thr Pro 515 520 525 tct ttt gcg ccc tcg gcc tac aag ccg cgc aac atc gcc ttt acg ccc 1632 Ser Phe Ala Pro Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Asn Ile Ala Phe Thr Pro 530 535 540 ttc ccc ggc aac ccc aac gat aac gac cac acc ccg ggc aag atg ccg 1680 Phe Pro Gly Asn Pro Asn Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Lys Met Pro 545 550 555 560 ctc acc tgg ttc aac atg gcc gag ttc atg gcc ggc aag gtc agc atg 1728 Leu Thr Trp Phe Asn Met Ala Glu Phe Met Ala Gly Lys Val Ser Met 565 570 575 tgc ctc ggc ccc gag ttc gcc aag ttc gac gac tcg aac acc agc cgc 1776 Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Lys Phe Asp Asp Ser Asn Thr Ser Arg 580 585 590 agc ccc gct tgg gac ctc gct ctc gtc acc cgc gcc gtg tct gtg tct 1824 Ser Pro Ala Trp Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Ala Val Ser Val Ser 595 600 605 gac ctc aag cac gtc aac tac cgc aac atc gac ctc gac ccc tcc aag 1872 Asp Leu Lys His Val Asn Tyr Arg Asn Ile Asp Leu Asp Pro Ser Lys 610 615 620 ggt acc atg gtc ggc gag ttc gac tgc ccc gcg gac gcc tgg ttc tac 1920 Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Tyr 625 630 635 640 aag ggc gcc tgc aac gat gcc cac atg ccg tac tcg atc ctc atg gag 1968 Lys Gly Ala Cys Asn Asp Ala His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu 645 650 655 atc gcc ctc cag acc tcg ggt gtg ctc acc tcg gtg ctc aag gcg ccc 2016 Ile Ala Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro 660 665 670 ctg acc atg gag aag gac gac atc ctc ttc cgc aac ctc gac gcc aac 2064 Leu Thr Met Glu Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asn 675 680 685 gcc gag ttc gtg cgc gcc gac ctc gac tac cgc ggc aag act atc cgc 2112 Ala Glu Phe Val Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ile Arg 690 695 700 aac gtc acc aag tgc act ggc tac agc atg ctc ggc gag atg ggc gtc 2160 Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Glu Met Gly Val 705 710 715 720 cac cgc ttc acc ttt gag ctc tac gtc gat gat gtg ctc ttt tac aag 2208 His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Tyr Val Asp Asp Val Leu Phe Tyr Lys 725 730 735 ggc tcg acc tcg ttc ggc tgg ttc gtg ccc gag gtc ttt gcc gcc cag 2256 Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Ala Ala Gln 740 745 750 gcc ggc ctc gac aac ggc cgc aag tcg gag ccc tgg ttc att gag aac 2304 Ala Gly Leu Asp Asn Gly Arg Lys Ser Glu Pro Trp Phe Ile Glu Asn 755 760 765 aag gtt ccg gcc tcg cag gtc tcc tcc ttt gac gtg cgc ccc aac ggc 2352 Lys Val Pro Ala Ser Gln Val Ser Ser Phe Asp Val Arg Pro Asn Gly 770 775 780 agc ggc cgc acc gcc atc ttc gcc aac gcc ccc agc ggc gcc cag ctc 2400 Ser Gly Arg Thr Ala Ile Phe Ala Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gln Leu 785 790 795 800 aac cgc cgc acg gac cag ggc cag tac ctc gac gcc gtc gac att gtc 2448 Asn Arg Arg Thr Asp Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Val Asp Ile Val 805 810 815 tcc ggc agc ggc aag aag agc ctc ggc tac gcc cac ggt tcc aag acg 2496 Ser Gly Ser Gly Lys Lys Ser Leu Gly Tyr Ala His Gly Ser Lys Thr 820 825 830 gtc aac ccg aac gac tgg ttc ttc tcg tgc cac ttt tgg ttt gac tcg 2544 Val Asn Pro Asn Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Ser 835 840 845 gtc atg ccc gga agt ctc ggt gtc gag tcc atg ttc cag ctc gtc gag 2592 Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Val Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu 850 855 860 gcc atc gcc gcc cac gag gat ctc gct ggc aaa gca cgg cat tgc caa 2640 Ala Ile Ala Ala His Glu Asp Leu Ala Gly Lys Ala Arg His Cys Gln 865 870 875 880 ccc cac ctt tgt gca cgc ccc cgg gca aga tca agc tgg aag tac cgc 2688 Pro His Leu Cys Ala Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ser Trp Lys Tyr Arg 885 890 895 ggc cag ctc acg ccc aag agc aag aag atg gac tcg gag gtc cac atc 2736 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Ser Lys Lys Met Asp Ser Glu Val His Ile 900 905 910 gtg tcc gtg gac gcc cac gac ggc gtt gtc gac ctc gtc gcc gac ggc 2784 Val Ser Val Asp Ala His Asp Gly Val Val Asp Leu Val Ala Asp Gly 915 920 925 ttc ctc tgg gcc gac agc ctc cgc gtc tac tcg gtg agc aac att cgc 2832 Phe Leu Trp Ala Asp Ser Leu Arg Val Tyr Ser Val Ser Asn Ile Arg 930 935 940 gtg cgc atc gcc tcc ggt gag gcc cct gcc gcc gcc tcc tcc gcc gcc 2880 Val Arg Ile Ala Ser Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala 945 950 955 960 tct gtg ggc tcc tcg gct tcg tcc gtc gag cgc acg cgc tcg agc ccc 2928 Ser Val Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Glu Arg Thr Arg Ser Ser Pro 965 970 975 gct gtc gcc tcc ggc ccg gcc cag acc atc gac ctc aag cag ctc aag 2976 Ala Val Ala Ser Gly Pro Ala Gln Thr Ile Asp Leu Lys Gln Leu Lys 980 985 990 acc gag ctc ctc gag ctc gat gcc ccg ctc tac ctc tcg cag gac ccg 3024 Thr Glu Leu Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Gln Asp Pro 995 1000 1005 acc agc ggc cag ctc aag aag cac acc gac gtg gcc tcc ggc cag 3069 Thr Ser Gly Gln Leu Lys Lys His Thr Asp Val Ala Ser Gly Gln 1010 1015 1020 gcc acc atc gtg cag ccc tgc acg ctc ggc gac ctc ggt gac cgc 3114 Ala Thr Ile Val Gln Pro Cys Thr Leu Gly Asp Leu Gly Asp Arg 1025 1030 1035 tcc ttc atg gag acc tac ggc gtc gtc gcc ccg ctg tac acg ggc 3159 Ser Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val Ala Pro Leu Tyr Thr Gly 1040 1045 1050 gcc atg gcc aag ggc att gcc tcg gcg gac ctc gtc atc gcc gcc 3204 Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala 1055 1060 1065 ggc aag cgc aag atc ctc ggc tcc ttt ggc gcc ggc ggc ctc ccc 3249 Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 1070 1075 1080 atg cac cac gtg cgc gcc gcc ctc gag aag atc cag gcc gcc ctg 3294 Met His His Val Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu 1085 1090 1095 cct cag ggc ccc tac gcc gtc aac ctc atc cac tcg cct ttt gac 3339 Pro Gln Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp 1100 1105 1110 agc aac ctc gag aag ggc aac gtc gat ctc ttc ctc gag aag ggc 3384 Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly 1115 1120 1125 gtc act gtg gtg gag gcc tcg gca ttc atg acc ctc acc ccg cag 3429 Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 1130 1135 1140 gtc gtg cgc tac cgc gcc gcc ggc ctc tcg cgc aac gcc gac ggt 3474 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly 1145 1150 1155 tcg gtc aac atc cgc aac cgc atc atc ggc aag gtc tcg cgc acc 3519 Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr 1160 1165 1170 gag ctc gcc gag atg ttc atc cgc ccg gcc ccg gag cac ctc ctc 3564 Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 1175 1180 1185 gag aag ctc atc gcc tcg ggc gag atc acc cag gag cag gcc gag 3609 Glu Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu 1190 1195 1200 ctc gcg cgc cgc gtt ccc gtc gcc gac gat atc gct gtc gag gct 3654 Leu Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala 1205 1210 1215 gac tcg ggc ggc cac acc gac aac cgc ccc atc cac gtc atc ctc 3699 Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu 1220 1225 1230 ccg ctc atc atc aac ctc cgc aac cgc ctg cac cgc gag tgc ggc 3744 Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu His Arg Glu Cys Gly 1235 1240 1245 tac ccc gcg cac ctc cgc gtc cgc gtt ggc gcc ggc ggt ggc gtc 3789 Tyr Pro Ala His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Val 1250 1255 1260 ggc tgc ccg cag gcc gcc gcc gcc gcg ctc acc atg ggc gcc gcc 3834 Gly Cys Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Leu Thr Met Gly Ala Ala 1265 1270 1275 ttc atc gtc acc ggc act gtc aac cag gtc gcc aag cag tcc ggc 3879 Phe Ile Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly 1280 1285 1290 acc tgc gac aac gtg cgc aag cag ctc tcg cag gcc acc tac tcg 3924 Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Tyr Ser 1295 1300 1305 gat atc tgc atg gcc ccg gcc gcc gac atg ttc gag gag ggc gtc 3969 Asp Ile Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Glu Gly Val 1310 1315 1320 aag ctc cag gtc ctc aag aag gga acc atg ttc ccc tcg cgc gcc 4014 Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala 1325 1330 1335 aac aag ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac gac tcc ttc gac tcc 4059 Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Asp Ser 1340 1345 1350 atg cct cct gcc gag ctc gag cgc atc gag aag cgt atc ttc aag 4104 Met Pro Pro Ala Glu Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Ile Phe Lys 1355 1360 1365 cgc gca ctc cag gag gtc tgg gag gag acc aag gac ttt tac att 4149 Arg Ala Leu Gln Glu Val Trp Glu Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile 1370 1375 1380 aac ggt ctc aag aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag cac gac 4194 Asn Gly Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu His Asp 1385 1390 1395 ccc aag ctc aag atg tcg ctc tgc ttc cgc tgg tac ctt ggt ctt 4239 Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu 1400 1405 1410 gcc agc cgc tgg gcc aac atg ggc gcc ccg gac cgc gtc atg gac 4284 Ala Ser Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp 1415 1420 1425 tac cag gtc tgg tgt ggc ccg gcc att ggc gcc ttc aac gac ttc 4329 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe 1430 1435 1440 atc aag ggc acc tac ctc gac ccc gct gtc tcc aac gag tac ccc 4374 Ile Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro 1445 1450 1455 tgt gtc gtc cag atc aac ctg caa atc ctc cgt ggt gcc tgc tac 4419 Cys Val Val Gln Ile Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr 1460 1465 1470 ctg cgc cgt ctc aac gcc ctg cgc aac gac ccg cgc att gac ctc 4464 Leu Arg Arg Leu Asn Ala Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu 1475 1480 1485 gag acc gag gat gct gcc ttt gtc tac gag ccc acc aac gcg ctc 4509 Glu Thr Glu Asp Ala Ala Phe Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 1490 1495 1500 taa 4512 <210> 28 <211> 1503 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 28 Met Ala Leu Arg Val Lys Thr Asn Lys Lys Pro Cys Trp Glu Met Thr 1 5 10 15 Lys Glu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Thr Glu Val Phe Asn Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ala Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Ala Val Ile Asp Lys Tyr Pro Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Leu Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Cys Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ser Gly Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Asn Gln Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Tyr Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Glu Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Leu Asp Gly Gly Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Val Asn Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asn Glu Glu Leu Asp Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Phe Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ala Arg Ala Lys Ile 210 215 220 Pro Lys Gln Asp Val Ser Pro Tyr Ala Val Ala Pro Cys Leu His Lys 225 230 235 240 Thr Lys Leu Asn Glu Lys Glu Met Gln Thr Leu Val Asp Lys Asp Trp 245 250 255 Ala Ser Val Phe Gly Ser Lys Asn Gly Met Pro Glu Ile Asn Tyr Lys 260 265 270 Leu Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr Ser Ile Asp 275 280 285 His Lys Gly Gly Val Tyr Gly Leu Gly Gln Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Glu Arg Asp His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Lys Asp Gln 305 310 315 320 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Met Leu Lys 325 330 335 Met Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Thr Thr Gly Pro Phe Asp 340 345 350 Phe Arg Pro Val Asn Gly His Pro Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu 370 375 380 Met Gly Phe Asp Glu Asp Asn Asp Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val Asn 385 390 395 400 Ile Ile Asp Val Asp Phe Glu Lys Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Arg 405 410 415 Ile Ser Asp Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Asn Lys Lys Ile Val Val Asp 420 425 430 Phe Lys Gly Ile Ala Leu Lys Met Gln Lys Arg Ser Thr Asn Lys Asn 435 440 445 Pro Ser Lys Val Gln Pro Val Phe Ala Asn Gly Ala Ala Thr Val Gly 450 455 460 Pro Glu Ala Ser Lys Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala 465 470 475 480 Ala Pro Ala Lys Pro Ala Phe Ser Ala Asp Val Leu Ala Pro Lys Pro 485 490 495 Val Ala Leu Pro Glu His Ile Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ala Pro Lys 500 505 510 Glu Met Ser Trp His Pro Met Ala Arg Ile Pro Gly Asn Pro Thr Pro 515 520 525 Ser Phe Ala Pro Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Asn Ile Ala Phe Thr Pro 530 535 540 Phe Pro Gly Asn Pro Asn Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Lys Met Pro 545 550 555 560 Leu Thr Trp Phe Asn Met Ala Glu Phe Met Ala Gly Lys Val Ser Met 565 570 575 Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Lys Phe Asp Asp Ser Asn Thr Ser Arg 580 585 590 Ser Pro Ala Trp Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Ala Val Ser Val Ser 595 600 605 Asp Leu Lys His Val Asn Tyr Arg Asn Ile Asp Leu Asp Pro Ser Lys 610 615 620 Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Tyr 625 630 635 640 Lys Gly Ala Cys Asn Asp Ala His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu 645 650 655 Ile Ala Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro 660 665 670 Leu Thr Met Glu Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asn 675 680 685 Ala Glu Phe Val Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ile Arg 690 695 700 Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Glu Met Gly Val 705 710 715 720 His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Tyr Val Asp Asp Val Leu Phe Tyr Lys 725 730 735 Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Ala Ala Gln 740 745 750 Ala Gly Leu Asp Asn Gly Arg Lys Ser Glu Pro Trp Phe Ile Glu Asn 755 760 765 Lys Val Pro Ala Ser Gln Val Ser Ser Phe Asp Val Arg Pro Asn Gly 770 775 780 Ser Gly Arg Thr Ala Ile Phe Ala Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gln Leu 785 790 795 800 Asn Arg Arg Thr Asp Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Val Asp Ile Val 805 810 815 Ser Gly Ser Gly Lys Lys Ser Leu Gly Tyr Ala His Gly Ser Lys Thr 820 825 830 Val Asn Pro Asn Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Ser 835 840 845 Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Val Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu 850 855 860 Ala Ile Ala Ala His Glu Asp Leu Ala Gly Lys Ala Arg His Cys Gln 865 870 875 880 Pro His Leu Cys Ala Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ser Trp Lys Tyr Arg 885 890 895 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Ser Lys Lys Met Asp Ser Glu Val His Ile 900 905 910 Val Ser Val Asp Ala His Asp Gly Val Val Asp Leu Val Ala Asp Gly 915 920 925 Phe Leu Trp Ala Asp Ser Leu Arg Val Tyr Ser Val Ser Asn Ile Arg 930 935 940 Val Arg Ile Ala Ser Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala 945 950 955 960 Ser Val Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Glu Arg Thr Arg Ser Ser Pro 965 970 975 Ala Val Ala Ser Gly Pro Ala Gln Thr Ile Asp Leu Lys Gln Leu Lys 980 985 990 Thr Glu Leu Leu Glu Leu Asp Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Gln Asp Pro 995 1000 1005 Thr Ser Gly Gln Leu Lys Lys His Thr Asp Val Ala Ser Gly Gln 1010 1015 1020 Ala Thr Ile Val Gln Pro Cys Thr Leu Gly Asp Leu Gly Asp Arg 1025 1030 1035 Ser Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val Ala Pro Leu Tyr Thr Gly 1040 1045 1050 Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala 1055 1060 1065 Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 1070 1075 1080 Met His His Val Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu 1085 1090 1095 Pro Gln Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp 1100 1105 1110 Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly 1115 1120 1125 Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 1130 1135 1140 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly 1145 1150 1155 Ser Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr 1160 1165 1170 Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu 1175 1180 1185 Glu Lys Leu Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu 1190 1195 1200 Leu Ala Arg Arg Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala 1205 1210 1215 Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu 1220 1225 1230 Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu His Arg Glu Cys Gly 1235 1240 1245 Tyr Pro Ala His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Val 1250 1255 1260 Gly Cys Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Leu Thr Met Gly Ala Ala 1265 1270 1275 Phe Ile Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Val Ala Lys Gln Ser Gly 1280 1285 1290 Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Tyr Ser 1295 1300 1305 Asp Ile Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Glu Gly Val 1310 1315 1320 Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala 1325 1330 1335 Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Asp Ser 1340 1345 1350 Met Pro Pro Ala Glu Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Ile Phe Lys 1355 1360 1365 Arg Ala Leu Gln Glu Val Trp Glu Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile 1370 1375 1380 Asn Gly Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu His Asp 1385 1390 1395 Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu 1400 1405 1410 Ala Ser Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp 1415 1420 1425 Tyr Gln Val Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe 1430 1435 1440 Ile Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro 1445 1450 1455 Cys Val Val Gln Ile Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr 1460 1465 1470 Leu Arg Arg Leu Asn Ala Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu 1475 1480 1485 Glu Thr Glu Asp Ala Ala Phe Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 1490 1495 1500 <210> 29 <211> 1500 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 29 aag gtt cag ccc gtc ttt gcc aac ggc gcc gcc act gtc ggc ccc gag 48 Lys Val Gln Pro Val Phe Ala Asn Gly Ala Ala Thr Val Gly Pro Glu 1 5 10 15 gcc tcc aag gct tcc tcc ggc gcc agc gcc agc gcc agc gcc gcc ccg 96 Ala Ser Lys Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 gcc aag cct gcc ttc agc gcc gat gtt ctt gcg ccc aag ccc gtt gcc 144 Ala Lys Pro Ala Phe Ser Ala Asp Val Leu Ala Pro Lys Pro Val Ala 35 40 45 ctt ccc gag cac atc ctc aag ggc gac gcc ctc gcc ccc aag gag atg 192 Leu Pro Glu His Ile Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ala Pro Lys Glu Met 50 55 60 tcc tgg cac ccc atg gcc cgc atc ccg ggc aac ccg acg ccc tct ttt 240 Ser Trp His Pro Met Ala Arg Ile Pro Gly Asn Pro Thr Pro Ser Phe 65 70 75 80 gcg ccc tcg gcc tac aag ccg cgc aac atc gcc ttt acg ccc ttc ccc 288 Ala Pro Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Asn Ile Ala Phe Thr Pro Phe Pro 85 90 95 ggc aac ccc aac gat aac gac cac acc ccg ggc aag atg ccg ctc acc 336 Gly Asn Pro Asn Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Lys Met Pro Leu Thr 100 105 110 tgg ttc aac atg gcc gag ttc atg gcc ggc aag gtc agc atg tgc ctc 384 Trp Phe Asn Met Ala Glu Phe Met Ala Gly Lys Val Ser Met Cys Leu 115 120 125 ggc ccc gag ttc gcc aag ttc gac gac tcg aac acc agc cgc agc ccc 432 Gly Pro Glu Phe Ala Lys Phe Asp Asp Ser Asn Thr Ser Arg Ser Pro 130 135 140 gct tgg gac ctc gct ctc gtc acc cgc gcc gtg tct gtg tct gac ctc 480 Ala Trp Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Ala Val Ser Val Ser Asp Leu 145 150 155 160 aag cac gtc aac tac cgc aac atc gac ctc gac ccc tcc aag ggt acc 528 Lys His Val Asn Tyr Arg Asn Ile Asp Leu Asp Pro Ser Lys Gly Thr 165 170 175 atg gtc ggc gag ttc gac tgc ccc gcg gac gcc tgg ttc tac aag ggc 576 Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Tyr Lys Gly 180 185 190 gcc tgc aac gat gcc cac atg ccg tac tcg atc ctc atg gag atc gcc 624 Ala Cys Asn Asp Ala His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala 195 200 205 ctc cag acc tcg ggt gtg ctc acc tcg gtg ctc aag gcg ccc ctg acc 672 Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr 210 215 220 atg gag aag gac gac atc ctc ttc cgc aac ctc gac gcc aac gcc gag 720 Met Glu Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asn Ala Glu 225 230 235 240 ttc gtg cgc gcc gac ctc gac tac cgc ggc aag act atc cgc aac gtc 768 Phe Val Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Val 245 250 255 acc aag tgc act ggc tac agc atg ctc ggc gag atg ggc gtc cac cgc 816 Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Glu Met Gly Val His Arg 260 265 270 ttc acc ttt gag ctc tac gtc gat gat gtg ctc ttt tac aag ggc tcg 864 Phe Thr Phe Glu Leu Tyr Val Asp Asp Val Leu Phe Tyr Lys Gly Ser 275 280 285 acc tcg ttc ggc tgg ttc gtg ccc gag gtc ttt gcc gcc cag gcc ggc 912 Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Ala Ala Gln Ala Gly 290 295 300 ctc gac aac ggc cgc aag tcg gag ccc tgg ttc att gag aac aag gtt 960 Leu Asp Asn Gly Arg Lys Ser Glu Pro Trp Phe Ile Glu Asn Lys Val 305 310 315 320 ccg gcc tcg cag gtc tcc tcc ttt gac gtg cgc ccc aac ggc agc ggc 1008 Pro Ala Ser Gln Val Ser Ser Phe Asp Val Arg Pro Asn Gly Ser Gly 325 330 335 cgc acc gcc atc ttc gcc aac gcc ccc agc ggc gcc cag ctc aac cgc 1056 Arg Thr Ala Ile Phe Ala Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gln Leu Asn Arg 340 345 350 cgc acg gac cag ggc cag tac ctc gac gcc gtc gac att gtc tcc ggc 1104 Arg Thr Asp Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Val Asp Ile Val Ser Gly 355 360 365 agc ggc aag aag agc ctc ggc tac gcc cac ggt tcc aag acg gtc aac 1152 Ser Gly Lys Lys Ser Leu Gly Tyr Ala His Gly Ser Lys Thr Val Asn 370 375 380 ccg aac gac tgg ttc ttc tcg tgc cac ttt tgg ttt gac tcg gtc atg 1200 Pro Asn Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Ser Val Met 385 390 395 400 ccc gga agt ctc ggt gtc gag tcc atg ttc cag ctc gtc gag gcc atc 1248 Pro Gly Ser Leu Gly Val Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu Ala Ile 405 410 415 gcc gcc cac gag gat ctc gct ggc aaa gca cgg cat tgc caa ccc cac 1296 Ala Ala His Glu Asp Leu Ala Gly Lys Ala Arg His Cys Gln Pro His 420 425 430 ctt tgt gca cgc ccc cgg gca aga tca agc tgg aag tac cgc ggc cag 1344 Leu Cys Ala Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ser Trp Lys Tyr Arg Gly Gln 435 440 445 ctc acg ccc aag agc aag aag atg gac tcg gag gtc cac atc gtg tcc 1392 Leu Thr Pro Lys Ser Lys Lys Met Asp Ser Glu Val His Ile Val Ser 450 455 460 gtg gac gcc cac gac ggc gtt gtc gac ctc gtc gcc gac ggc ttc ctc 1440 Val Asp Ala His Asp Gly Val Val Asp Leu Val Ala Asp Gly Phe Leu 465 470 475 480 tgg gcc gac agc ctc cgc gtc tac tcg gtg agc aac att cgc gtg cgc 1488 Trp Ala Asp Ser Leu Arg Val Tyr Ser Val Ser Asn Ile Arg Val Arg 485 490 495 atc gcc tcc ggt 1500 Ile Ala Ser Gly 500 <210> 30 <211> 500 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 30 Lys Val Gln Pro Val Phe Ala Asn Gly Ala Ala Thr Val Gly Pro Glu 1 5 10 15 Ala Ser Lys Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Pro 20 25 30 Ala Lys Pro Ala Phe Ser Ala Asp Val Leu Ala Pro Lys Pro Val Ala 35 40 45 Leu Pro Glu His Ile Leu Lys Gly Asp Ala Leu Ala Pro Lys Glu Met 50 55 60 Ser Trp His Pro Met Ala Arg Ile Pro Gly Asn Pro Thr Pro Ser Phe 65 70 75 80 Ala Pro Ser Ala Tyr Lys Pro Arg Asn Ile Ala Phe Thr Pro Phe Pro 85 90 95 Gly Asn Pro Asn Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Lys Met Pro Leu Thr 100 105 110 Trp Phe Asn Met Ala Glu Phe Met Ala Gly Lys Val Ser Met Cys Leu 115 120 125 Gly Pro Glu Phe Ala Lys Phe Asp Asp Ser Asn Thr Ser Arg Ser Pro 130 135 140 Ala Trp Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Ala Val Ser Val Ser Asp Leu 145 150 155 160 Lys His Val Asn Tyr Arg Asn Ile Asp Leu Asp Pro Ser Lys Gly Thr 165 170 175 Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Tyr Lys Gly 180 185 190 Ala Cys Asn Asp Ala His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala 195 200 205 Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr 210 215 220 Met Glu Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asn Ala Glu 225 230 235 240 Phe Val Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Val 245 250 255 Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Glu Met Gly Val His Arg 260 265 270 Phe Thr Phe Glu Leu Tyr Val Asp Asp Val Leu Phe Tyr Lys Gly Ser 275 280 285 Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Ala Ala Gln Ala Gly 290 295 300 Leu Asp Asn Gly Arg Lys Ser Glu Pro Trp Phe Ile Glu Asn Lys Val 305 310 315 320 Pro Ala Ser Gln Val Ser Ser Phe Asp Val Arg Pro Asn Gly Ser Gly 325 330 335 Arg Thr Ala Ile Phe Ala Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gln Leu Asn Arg 340 345 350 Arg Thr Asp Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Val Asp Ile Val Ser Gly 355 360 365 Ser Gly Lys Lys Ser Leu Gly Tyr Ala His Gly Ser Lys Thr Val Asn 370 375 380 Pro Asn Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp Ser Val Met 385 390 395 400 Pro Gly Ser Leu Gly Val Glu Ser Met Phe Gln Leu Val Glu Ala Ile 405 410 415 Ala Ala His Glu Asp Leu Ala Gly Lys Ala Arg His Cys Gln Pro His 420 425 430 Leu Cys Ala Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ser Trp Lys Tyr Arg Gly Gln 435 440 445 Leu Thr Pro Lys Ser Lys Lys Met Asp Ser Glu Val His Ile Val Ser 450 455 460 Val Asp Ala His Asp Gly Val Val Asp Leu Val Ala Asp Gly Phe Leu 465 470 475 480 Trp Ala Asp Ser Leu Arg Val Tyr Ser Val Ser Asn Ile Arg Val Arg 485 490 495 Ile Ala Ser Gly 500 <210> 31 <211> 1512 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1512) <400> 31 gcc ccg ctc tac ctc tcg cag gac ccg acc agc ggc cag ctc aag aag 48 Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Gln Asp Pro Thr Ser Gly Gln Leu Lys Lys 1 5 10 15 cac acc gac gtg gcc tcc ggc cag gcc acc atc gtg cag ccc tgc acg 96 His Thr Asp Val Ala Ser Gly Gln Ala Thr Ile Val Gln Pro Cys Thr 20 25 30 ctc ggc gac ctc ggt gac cgc tcc ttc atg gag acc tac ggc gtc gtc 144 Leu Gly Asp Leu Gly Asp Arg Ser Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val 35 40 45 gcc ccg ctg tac acg ggc gcc atg gcc aag ggc att gcc tcg gcg gac 192 Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp 50 55 60 ctc gtc atc gcc gcc ggc aag cgc aag atc ctc ggc tcc ttt ggc gcc 240 Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala 65 70 75 80 ggc ggc ctc ccc atg cac cac gtg cgc gcc gcc ctc gag aag atc cag 288 Gly Gly Leu Pro Met His His Val Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ile Gln 85 90 95 gcc gcc ctg cct cag ggc ccc tac gcc gtc aac ctc atc cac tcg cct 336 Ala Ala Leu Pro Gln Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro 100 105 110 ttt gac agc aac ctc gag aag ggc aac gtc gat ctc ttc ctc gag aag 384 Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys 115 120 125 ggc gtc act gtg gtg gag gcc tcg gca ttc atg acc ctc acc ccg cag 432 Gly Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 130 135 140 gtc gtg cgc tac cgc gcc gcc ggc ctc tcg cgc aac gcc gac ggt tcg 480 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly Ser 145 150 155 160 gtc aac atc cgc aac cgc atc atc ggc aag gtc tcg cgc acc gag ctc 528 Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu 165 170 175 gcc gag atg ttc atc cgc ccg gcc ccg gag cac ctc ctc gag aag ctc 576 Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu Glu Lys Leu 180 185 190 atc gcc tcg ggc gag atc acc cag gag cag gcc gag ctc gcg cgc cgc 624 Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu Leu Ala Arg Arg 195 200 205 gtt ccc gtc gcc gac gat atc gct gtc gag gct gac tcg ggc ggc cac 672 Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 210 215 220 acc gac aac cgc ccc atc cac gtc atc ctc ccg ctc atc atc aac ctc 720 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn Leu 225 230 235 240 cgc aac cgc ctg cac cgc gag tgc ggc tac ccc gcg cac ctc cgc gtc 768 Arg Asn Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro Ala His Leu Arg Val 245 250 255 cgc gtt ggc gcc ggc ggt ggc gtc ggc tgc ccg cag gcc gcc gcc gcc 816 Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Cys Pro Gln Ala Ala Ala Ala 260 265 270 gcg ctc acc atg ggc gcc gcc ttc atc gtc acc ggc act gtc aac cag 864 Ala Leu Thr Met Gly Ala Ala Phe Ile Val Thr Gly Thr Val Asn Gln 275 280 285 gtc gcc aag cag tcc ggc acc tgc gac aac gtg cgc aag cag ctc tcg 912 Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ser 290 295 300 cag gcc acc tac tcg gat atc tgc atg gcc ccg gcc gcc gac atg ttc 960 Gln Ala Thr Tyr Ser Asp Ile Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe 305 310 315 320 gag gag ggc gtc aag ctc cag gtc ctc aag aag gga acc atg ttc ccc 1008 Glu Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro 325 330 335 tcg cgc gcc aac aag ctc tac gag ctc ttt tgc aag tac gac tcc ttc 1056 Ser Arg Ala Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe 340 345 350 gac tcc atg cct cct gcc gag ctc gag cgc atc gag aag cgt atc ttc 1104 Asp Ser Met Pro Pro Ala Glu Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Ile Phe 355 360 365 aag cgc gca ctc cag gag gtc tgg gag gag acc aag gac ttt tac att 1152 Lys Arg Ala Leu Gln Glu Val Trp Glu Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile 370 375 380 aac ggt ctc aag aac ccg gag aag atc cag cgc gcc gag cac gac ccc 1200 Asn Gly Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu His Asp Pro 385 390 395 400 aag ctc aag atg tcg ctc tgc ttc cgc tgg tac ctt ggt ctt gcc agc 1248 Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ala Ser 405 410 415 cgc tgg gcc aac atg ggc gcc ccg gac cgc gtc atg gac tac cag gtc 1296 Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Val 420 425 430 tgg tgt ggc ccg gcc att ggc gcc ttc aac gac ttc atc aag ggc acc 1344 Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Lys Gly Thr 435 440 445 tac ctc gac ccc gct gtc tcc aac gag tac ccc tgt gtc gtc cag atc 1392 Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro Cys Val Val Gln Ile 450 455 460 aac ctg caa atc ctc cgt ggt gcc tgc tac ctg cgc cgt ctc aac gcc 1440 Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr Leu Arg Arg Leu Asn Ala 465 470 475 480 ctg cgc aac gac ccg cgc att gac ctc gag acc gag gat gct gcc ttt 1488 Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu Glu Thr Glu Asp Ala Ala Phe 485 490 495 gtc tac gag ccc acc aac gcg ctc 1512 Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 500 <210> 32 <211> 504 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 32 Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Gln Asp Pro Thr Ser Gly Gln Leu Lys Lys 1 5 10 15 His Thr Asp Val Ala Ser Gly Gln Ala Thr Ile Val Gln Pro Cys Thr 20 25 30 Leu Gly Asp Leu Gly Asp Arg Ser Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val 35 40 45 Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp 50 55 60 Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala 65 70 75 80 Gly Gly Leu Pro Met His His Val Arg Ala Ala Leu Glu Lys Ile Gln 85 90 95 Ala Ala Leu Pro Gln Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro 100 105 110 Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Val Thr Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Thr Leu Thr Pro Gln 130 135 140 Val Val Arg Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Ser Arg Asn Ala Asp Gly Ser 145 150 155 160 Val Asn Ile Arg Asn Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu 165 170 175 Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro Ala Pro Glu His Leu Leu Glu Lys Leu 180 185 190 Ile Ala Ser Gly Glu Ile Thr Gln Glu Gln Ala Glu Leu Ala Arg Arg 195 200 205 Val Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 210 215 220 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn Leu 225 230 235 240 Arg Asn Arg Leu His Arg Glu Cys Gly Tyr Pro Ala His Leu Arg Val 245 250 255 Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Cys Pro Gln Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Leu Thr Met Gly Ala Ala Phe Ile Val Thr Gly Thr Val Asn Gln 275 280 285 Val Ala Lys Gln Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Lys Gln Leu Ser 290 295 300 Gln Ala Thr Tyr Ser Asp Ile Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe 305 310 315 320 Glu Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro 325 330 335 Ser Arg Ala Asn Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe 340 345 350 Asp Ser Met Pro Pro Ala Glu Leu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Ile Phe 355 360 365 Lys Arg Ala Leu Gln Glu Val Trp Glu Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile 370 375 380 Asn Gly Leu Lys Asn Pro Glu Lys Ile Gln Arg Ala Glu His Asp Pro 385 390 395 400 Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ala Ser 405 410 415 Arg Trp Ala Asn Met Gly Ala Pro Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Val 420 425 430 Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Lys Gly Thr 435 440 445 Tyr Leu Asp Pro Ala Val Ser Asn Glu Tyr Pro Cys Val Val Gln Ile 450 455 460 Asn Leu Gln Ile Leu Arg Gly Ala Cys Tyr Leu Arg Arg Leu Asn Ala 465 470 475 480 Leu Arg Asn Asp Pro Arg Ile Asp Leu Glu Thr Glu Asp Ala Ala Phe 485 490 495 Val Tyr Glu Pro Thr Asn Ala Leu 500 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Xaa = any amino acid <400> 33 Trp Xaa Xaa Lys Glu Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> Xaa = Ile or Leu or Val <400> 34 Phe Asn Xaa Ser His Ser 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Xaa = Ile or Leu or Val <400> 35 Xaa Gly Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 36 <211> 4244 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 36 tttctctctc tcgagctgtt gctgctgctg ctgctgctgc tgcttccttg ctggttctca 60 cgtccgttcg atcaagcgct cgctcgctcg accgatcggt gcgtgcgtgc gtgcgtgagt 120 cttgttgcca ggcagccgca ggctgtctgt ctgtttgtgt agttttaccc tcggggttcg 180 gggtctgcct gcctcccgct cccgcccgcc gccgcccgta tccaccccgc tcgcctccgc 240 ccatcgggcc tcgcctcctc gcgccgcacg catcgcgcgc atcgcatgca tcatgctgcc 300 acgcacgggg ggacgcgcgc cccgcgtccc ccgccgccgc cgtcgtcgtc tggcgatgcc 360 gtcgccgccc tccttccttc cctcgcctcc tcttcctccc gagcccccct gtcttccttc 420 gcccccgcag cggcgcgcag gaagcgagga gagcggggag gagagaagaa aagaaaagaa 480 aagaaaagaa aataacagcg ccgtctcgcg cagacgcgcg cggccgcgtg cgaggcggcg 540 tgatggggct tctcgtggcg cggctgcggc ctggcccggc ctcgcctttg aggtgcaggc 600 tttgggagag aagagtggga cgcggagaag ataagatggt gccatggcgc aggacggaga 660 ggttgctgaa acttcttcga gcggcacagg cgatggcgag agaccgacag ctgccggcgc 720 ggaggggatg gatacctccc gaggctggca tggacgagct ggccgcgcgg atctggctgg 780 ccgcgcggcg gtgggtccgg aggcgcgagg ttggttttct tcatacctga taccatacgg 840 tattcattct tcctctccag gaaggaagca agtcacatag agtatcacta gcctaatgat 900 ggactctatg ttttagggca cgtcggagca gaaggcgcga gcgattcgaa tgcgagcgat 960 agatacagca cagagacctt gccggcgacg cggatgcagg cgagcacgca cgcaccgcac 1020 gcacggcagc ggtgcacgcg ctcctcggca gatgcacggt tctgcgccgc gcctttacat 1080 tttttgattt taggtggtgt gcctgccact ttgaacatca tccacaagtc aacgcagcat 1140 caagaggcaa gcaagtacat acatccattc gaattcaagt tcaagagacg cagcaacagc 1200 cgccgctccg ctcaagctgc agctagctgg ctgacagggc tcgctggctg tagtggaaaa 1260 ttccattcac ttttctgcat ccgcggccag caggcccgta cgcacgttct ctcgtttgtt 1320 tgttcgttcg tgcgtgcgtg cgtgcgtccc agctgcctgt ctaatctgcc gcgcgatcca 1380 acgaccctcg gtcgtcgccg caagcgaaac ccgacgccga cctggccaat gccgcaagaa 1440 tgctaagcgc gcagcaatgc tgagagtaat cttcagccca ccaagtcatt atcgctgccc 1500 aagtctccat cgcagccaca ttcaggcttt ctctctctct ccctccctct ctttctgccg 1560 ggagagaagg aaagacccgc cgccgccgcc tctgcgcctg tgacgggctg tccgttgtaa 1620 gccctcttag acagttccta ggtgccgggc gccgccgcgc ctccgtcgca ggcacacgta 1680 ggcggccacg ggttcccccc gcaccttcca caccttcttc ccccgcagcc ggaccgcgcg 1740 ccgtctgctt acgcacttcg cgcggccgcc gcccgcgaac ccgagcgcgt gctgtgggcg 1800 ccgtcttccg gccgcgtcgg aggtcgtccc cgcgccgcgc tactccgggt cctgtgcggt 1860 acgtacttaa tattaacagt gggacctcgc acaggacctg acggcagcac agacgtcgcc 1920 gcctcgcatc gctggggacg caggcgaggc atcccggcgc ggccccgcac cggggaggct 1980 gcggggcggc ctcttccggc cggcggccgc atcaggcgga tgacgcaaga gccctcgcag 2040 tcgctcgctc gcgggagcgc agcgcggcgc cagcgtggcc aagctcccgc cccttctggc 2100 tggctgcatg cctgcctgcc tgcctgcctg cgtgcgtgcg tgcgtgcgtg ccttcgtgcg 2160 tgcctgcctt cgtgcgtgcg tgcgtgagtg cggcggaaga gggatcatgc gaggatcaat 2220 cacccgccgc acctcgactt ttgaagaagc cgcgatgcga tgcgatgcga tgcgatgcga 2280 cgcgataccg tgcgaggcta cgaagcgagt ctggccggcc gtcatacaac gcacgttttc 2340 gagaaggagg gctggcggag gcgtgcatgc cggcgaccat tgcgaacgcg gcgtctcgtg 2400 gctggcgaag gtgcctggag gatctaacga tcgctgctat gatgctatag ctgtgctgat 2460 ccccggtcca ttccaccacg tctgtgcctg ccgcctgacc tgcgcttggc tttccttcaa 2520 gttctcctcc gccgggcctt caggaccgag acgagacctg cagctgcagc tagactcgcg 2580 ctcgctcgcg gaggattcgc cggccgccgg gccggacggg actcgcgagg tcacacggcc 2640 gccggcgatc gcgatggctg tgctgacgta ctcgtgcgtg gcagccgtac gtcagcgacg 2700 ccgcctccgt attgtggatt cgttagttgg ttgttggttg atttgttgat taattttttt 2760 gttcgtaggc ttggttatag ctaatagttt agtttatact ggtgctcttc ggtgctgatt 2820 tagctcgact tgggtccaca ccactgcccc tctactgtga atggatcaat ggacgcacga 2880 cgggccgacg aaagtgcgcg agtgaggtaa cctaagcaac ggcggtcttc agaggggacg 2940 cacgccctcc gtcgcagtca gtccagacag gcagaaaagc gtcttaggga ccacgcacgc 3000 acgcacgcac gcacgcacgc ccgcacgcac gctccctccc tcgcgtgcct atttttttag 3060 gcttccttcc gcacgggcct acctctcgct ccctcgcctc gccgcaccag gcggcagcag 3120 cgatacctgc cggtgccgcc tccgtcacgc gctcagccgc agctcagccc agccgcgagc 3180 tagggtttgt tcgtcctgaa ttgtttgatt tgatttgatt tgatttgatc cgatccgatc 3240 cgatctgatc tgatttgctt tgctttgctt tgtctccctc ccggcgcgga ccaagcgtcc 3300 gtctgcgcgc cgcagcttcc cttcttctcc cagccctcct tctgctcccg cctctcgcgc 3360 aagcacgcag cttcgccgcc gcatccggtc ggtcggtcgg tcgatcgacc cgcctgccgc 3420 tgctgctgtg gccgggcttt tctccatcgg cgactctttc ttctccatac gtcctactac 3480 gtacatacat actgccggct tcctcctctt ccagcgcggc gacggcggca ggctgcgacg 3540 tcgtcgccgc cgcgggcgcc gcgcgcgccg ccgccgccgc ccgcgtcgca gggcctcgtc 3600 gccgccgccg ctccgctccg ctccgaggcc gcgagagggc cgcggcggcg cgatggatgg 3660 atggatggat ggatggatgg atggattttg ttgatcgatg gcggcgcatg ggcggagatg 3720 agcgaggacg agcgcgcgag cgcggcagcc ggattcgcag ggcctcgctc gcctcgcgcc 3780 cgctgccgcg cccgccttgc gagcctgcgc cgcgagcgag cgagcgagcg agcggggctt 3840 tctttgtctc gcgcgccgct tggcctcgtg tgtcttgtgc ttgcgtagcg ggcgccgcgg 3900 tggaagatgg ctcattcaat cgacccattc acgcacgcac tccggcgcgc agagaaggcc 3960 gaggaggagc agcaagcaaa ccaaaagctc tcgcgctcgc ggtctcgggc tcgagcggtc 4020 tcggagagag agtcttgcgg cgaccaccgg cagcagcagc agcagcagca gcgctgtcga 4080 gcacgagcac gagcacgagc acgagcacga gcattcgagc aagaggacag acacggttgt 4140 cagcgcctag ctcgctcgat acagaaagag gcgggttggg cgtaaaaaaa aaggagcacg 4200 caagccgcca gccagccagc tagctagcca gcctgcctgc caaa 4244 <210> 37 <211> 3886 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3886) <223> n = a, c, g, or t <400> 37 gatcttgatt gccaagctct ggattgtcga ttccgatgaa tcgagctctt tgttgtcgag 60 ctctggcttg ccgagctttc agaaatagac aaaattgccg agttcctgat tgcggggctc 120 tcgattgcca aggtctggtg gattctcgaa ctctcgattg tcaaaatctt ggtcgtctcg 180 tcggattctt tcctgatttg ttttgtcaag accttgagat tgtgcaaaac cttgatcgtt 240 gacaaaccct tgatcgacag cagcctttca tcacgctcag ctcttgtcat tgattatatt 300 ccccctgaca gccaacacct tgatgcaggg tctcaacctt gatttttgga ggccatcatc 360 agcatcacgc cccggcactc accctcaaca ttcgacagcc aacgcttttt tttcttcgac 420 taggatctga gaataaaagc aggtcaccac gaccgtaggc caacgcgaca accatggaaa 480 taaagtgaca acgaacgact tgcaagttta aatgtaaaga gcagcaattg cccgcccaca 540 gacaaatgaa agcaggcgcc gagtcttatt tgaggaggtg ggcctgtggc aatgggcgaa 600 agaaaatcaa ggacaaggag agcaggttac gtaccggtat actggtatac gtacatggat 660 ggttcttggc aagttgacgg gatgtgtgcg agtgaccgtg gtagttaacg aaagagccgc 720 aagggcaagg aaagcaagag aatgcagact tttccacagg atggatgggt ccgcagcttg 780 ccgcatgatg aaacgctgta tttcacctgg cacgtggtgg cgcacgcgcc cacatatgat 840 cgcggcggcg ggtgtattat acattttccc cctcaggtct actgccatcc ctccatgcgt 900 cgctcgtgcg aacgacgcaa gcctttcgca tcgtgcagcc tctttctggt aaggcaagag 960 ctaaacccaa acctaaacga aagaacattt ttacctctct ctctctccca ttggtcgcgt 1020 gcgctccgcc gctcgctcct cctcctgcca gtgtcgcgcc ctaacttccc ccctccctcc 1080 ctccctccct ccctccctct ctcctgccac cgcccctctc tccgcgctgc gtgcggtgct 1140 gccctggacc aatggcatgc tgctgcacgc tcggcggatg acgcaagccg cttcgcaatt 1200 tccggatcag atctcggcgg ggcgtgcgcc gcggggtcac tgcggacctg ccgcggcccc 1260 tgcttctttc acatccatca tgtcctccaa acctccgcct cctccacgca cgtacgcacg 1320 cccgctcgca cgcgcgcact gccgctgcga aagcaagcgc ccgcccgccg cccggcgacg 1380 ggaaggcggc cgcggtctcc ctccgcggtt gcctcgctcc cgcgcggggc tgggcgggca 1440 gcagaaggcg ggtggcggcg gcggcttccg tcttcgtcag cggcctacgt cggcggcggc 1500 gcgcgagact acgcatgccc ttgcgtcatg cgctcgcagg tagccgccgc gggcctagcg 1560 tttccgctgg cgccgcgcct aagcccccgg cgcgcacggt attgccgcga taccgtacgg 1620 ccaagaccgc cgcagacgtc ggccctctcg cggccagcca gccagcagcg cagcggagga 1680 agagcgcgca ggcgcggcgg gagggcggcc gcggagcagc gcagagcggg gcggagcagc 1740 gcggagcaga acgggcagac tcggagcggg cagggcgggc agagctttgg ggtttaagga 1800 ccgggttacc ggcgaagtga gcggctgcgg ggagcggctg tgggaggggt gagtacgcaa 1860 gcacgatgcg agcgagagag agacgctgcc gcgaatcaag aaggtaggcg cgctgcgagg 1920 cgcggcggcg gagcggagcg agggagaggg agagggagag agagggaggg agacgtcgcc 1980 gcggcggggc ctggcctggc ctggtttggc ttggtcagcg cggccttgtc cgagcgtgca 2040 gctggagttg ggtggattca tttggatttt cttttgtttt tgtttttctc tctttcccgg 2100 aaagtgttgg ccggncggtg ttctttgttt tgatttcttc aaaagttttg gtggttggtt 2160 ctctctcttg gctctctgtc aggcggtccg gtccacgccc cggcctctcc tctcctctcc 2220 tctcctctcc tctccgtgcg tatacgtacg tacgtttgta tacgtacata catcccgccc 2280 gccgtgccgg cgagggtttg ctcagcctgg agcaatgcga tgcgatgcga tgcgatgcga 2340 cgcgacgcga cgcgagtcac tggttcgcgc tgtggctgtg gcttgcttgc ttacttgctt 2400 tcgagctctc ccgctttctt ctttccttct cacgccacca ccaacgaaag aagatcggcc 2460 ccggcacgcc gctgagaagg gctggcggcg atgacggcac gcgcgcccgc tgccacgttg 2520 gcgctcgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgcttct 2580 gcgcgcaggc tttgccacga ggccggcgtg ctggccgctg ccgcttccag tccgcgtgga 2640 gagatcgaat gagagataaa ctggatggat tcatcgaggg atgaatgaac gatggttgga 2700 tgcctttttc ctttttcagg tccacagcgg gaagcaggag cgcgtgaatc tgccgccatc 2760 cgcatacgtc tgcatcgcat cgcatcgcat gcacgcatcg ctcgccggga gccacagacg 2820 ggcgacaggg cggccagcca gccaggcagc cagccaggca ggcaccagag ggccagagag 2880 cgcgcctcac gcacgcgccg cagtgcgcgc atcgctcgca gtgcagacct tgattccccg 2940 cgcggatctc cgcgagcccg aaacgaagag cgccgtacgg gcccatccta gcgtcgcctc 3000 gcaccgcatc gcatcgcatc gcgttcccta gagagtagta ctcgacgaag gcaccatttc 3060 cgcgctcctc ttcggcgcga tcgaggcccc cggcgccgcg acgatcgcgg cggccgcggc 3120 gctggcggcg gccctggcgc tcgcgctggc ggccgccgcg ggcgtctggc cctggcgcgc 3180 gcgggcgccg caggaggagc ggcagcggct gctcgccgcc agagaagagc gcgccgggcc 3240 cggggaggga cggggaggag aaggagaagg cgcgcaaggc ggccccgaaa gagaagaccc 3300 tggacttgaa cgcgaagaag aagaagaagg agaagaagtt gaagaagaag aagaagaagg 3360 agaggaagtt gaagaagacg aggagcaggc gcgttccaag gcgcgttctc ttccggaggc 3420 gcgttccagc tgcggcggcg gggcgggctg cggggcgggc gcgggcgcgg gtgcgggcag 3480 aggggacgcg cgcgcggagg cggagggggc cgagcgggag cccctgctgc tgcggggcgc 3540 ccgggccgca ggtgtggcgc gcgcgacgac ggaggcgacg acgccagcgg ccgcgacgac 3600 aaggccggcg gcgtcggcgg gcggaaggcc ccgcgcggag caggggcggg agcaggacaa 3660 ggcgcaggag caggagcagg gccgggagcg ggagcgggag cgggcggcgg agcccgaggc 3720 agaacccaat cgagatccag agcgagcaga ggccggccgc gagcccgagc ccgcgccgca 3780 gatcactagt accgctgcgg aatcacagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 3840 gcagcagcag ccacgagagg gagataaaga aaaagcggca gagacg 3886 <210> 38 <211> 8436 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(8433) <400> 38 atg aag gac atg gaa gat aga cgg gtc gct att gtg ggc atg tca gct 48 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 cac ttg cct tgt ggg aca gat gtg aag gaa tca tgg cag gct att cgc 96 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 gat gga atc gac tgt cta agt gac cta ccc gcg gat cgt ctc gac gtt 144 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 aca gct tac tac aat ccc aac aaa gcc acg aaa gac aag atc tac tgc 192 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 aaa cgg ggt ggc ttc atc ccg aac tat gac ttc gac ccc cgc gaa ttt 240 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 ggg ctc aac atg ttt caa atg gaa gac tct gat gcg aat cag aca ctt 288 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 acc ttg ctc aaa gtc aaa caa gct ctc gaa gat gca agc ata gag cct 336 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 ttc acc aag gag aag aag aac att gga tgt gtt tta ggt att ggt ggg 384 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 ggc caa aag gcg agt cat gag ttc tac tct cgt ctc aac tac gtt gtc 432 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 gtt gaa aag gta ctt cgg aaa atg ggt tta cca gat gct gat gtt gaa 480 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 gaa gct gtg gag aaa tac aag gca aat ttt ccc gag tgg cgc cta gac 528 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 tct ttc cct ggg ttt ctt ggg aat gta acg gct ggt cgg tgc agt aac 576 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 acc ttc aac atg gaa ggt atg aac tgc gtt gtg gat gct gca tgt gcc 624 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 agt tct cta att gca atc aag gtt gca gtt gaa gag cta ctc ttt ggt 672 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 gac tgt gac acc atg att gca ggt gcc acc tgc acg gac aat tca ctt 720 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 ggc atg tac atg gcc ttc tct aaa acg cca gtt ttt tct act gac cca 768 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 agt gtc cgc gcg tat gat gag aaa aca aaa ggg atg cta att gga gaa 816 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 ggt tca gca atg ttc gtt ctt aaa cgc tat gcg gat gcc gta cgt gat 864 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 ggc gac aca att cac gcg gtt ctg cgt tct tgc tct tcg tct agt gat 912 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 gga aaa gcg gca gga att tat act cct act ata tct gga caa gaa gaa 960 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 gct ttg cgt cga gcg tat gcc cgt gcg ggg gta tgt cca tct acg atc 1008 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 ggg ctt gtt gag ggt cac ggg aca ggg acc cct gtt gga gat cgc att 1056 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 gag tta aca gct ctg cgg aac ttg ttt gac aaa gct ttt ggt agc aag 1104 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 aag gaa caa ata gca gtt ggc agc ata aag tct cag ata ggt cac ctg 1152 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 aaa tct gtt gcc ggc ttt gcc ggc ttg gtc aaa gct gtg ctt gcg ctt 1200 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 aaa cac aaa acg ctc cca ggt tcg att aat gtc gac cag cca cct ttg 1248 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 ttg tat gac ggt act caa att caa gac tct tct tta tat atc aac aag 1296 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 aca aat aga cca tgg ttt acg caa aac aag ctt ccg cgt cgg gct ggt 1344 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 gtc tca agt ttt gga ttt gga ggt gca aac tac cac gcg gtt ctg gaa 1392 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 gaa ttc gag ccc gag cat gaa aaa cca tac cgc ctc aat act gtt gga 1440 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 cat cct gtc ctc ttg tac gct ccg tct gtg gaa gcc ctc aaa gta ctt 1488 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 tgc aac gac cag ctt gcg gag ctc aca att gca ttg gaa gag gca aaa 1536 Cys Asn Asp Gln Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys 500 505 510 aca cat aaa aat gtt gac aaa gtt tgt ggc tac aag ttt att gac gaa 1584 Thr His Lys Asn Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu 515 520 525 ttt cag ctc caa gga agc tgt cct cca gaa aat ccg aga gta gga ttt 1632 Phe Gln Leu Gln Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe 530 535 540 tta gca aca ctg cct act tca aat atc att gtc gcg ctt aag gca att 1680 Leu Ala Thr Leu Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile 545 550 555 560 ctc gcg cag ctt gat gca aaa cca gat gcg aag aaa tgg gat ttg cct 1728 Leu Ala Gln Leu Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro 565 570 575 cat aaa aag gct ttt ggg gct acc ttc gca tcg tct tca gtg aaa ggc 1776 His Lys Lys Ala Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly 580 585 590 tct gtt gct gcg ctc ttc gca gga cag ggt acc cag tac tta aac atg 1824 Ser Val Ala Ala Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met 595 600 605 ttc tct gat gtg gca atg aac tgg cca ccg ttc cgt gac agc att gtc 1872 Phe Ser Asp Val Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val 610 615 620 gca atg gaa gaa gct caa act gag gta ttt gag ggc caa gtt gaa cca 1920 Ala Met Glu Glu Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro 625 630 635 640 att agc aaa gtt ctg ttt cca cga gag cgc tat gca tcc gaa agt gaa 1968 Ile Ser Lys Val Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu 645 650 655 cag ggg aat gaa ctt ctt tgc tta aca gag tac tct cag cca act acg 2016 Gln Gly Asn Glu Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr 660 665 670 ata gca gcc gca gta ggg gcc ttc gat att ttc aaa gcg gct ggc ttt 2064 Ile Ala Ala Ala Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe 675 680 685 aag cca gac atg gtt gga ggg cat tca ctt ggc gaa ttt gct gct ttg 2112 Lys Pro Asp Met Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu 690 695 700 tac gcg gct ggg tcc att tcg cgt gac gac ctg tac aag ctt gtg tgc 2160 Tyr Ala Ala Gly Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys 705 710 715 720 aaa cgg gca aag gca atg gcg aac gct agt gac gga gct atg gca gca 2208 Lys Arg Ala Lys Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala 725 730 735 gtg att ggc cca gat gca cgt cta gtt acg cca caa aat agt gac gtt 2256 Val Ile Gly Pro Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val 740 745 750 tat gtc gca aac ttc aac tcc gca act caa gta gtc atc agt ggc act 2304 Tyr Val Ala Asn Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr 755 760 765 gtt caa ggt gtg aaa gaa gag tcg aaa ttg ctc att tca aag ggg ttc 2352 Val Gln Gly Val Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe 770 775 780 cgc gta ctg cca ctt aaa tgc cag ggc gcc ttc cat tct cct ttg atg 2400 Arg Val Leu Pro Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met 785 790 795 800 ggg cct tct gag gat agt ttc aaa tca ctt gtg gag act tgt acc atc 2448 Gly Pro Ser Glu Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile 805 810 815 tcg ccg cca aaa aat gtg aaa ttc ttt tgc aat gtt agt ggc aag gaa 2496 Ser Pro Pro Lys Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu 820 825 830 agc cca aac cca aaa cag acc ctc aag tca cac atg acg tct agc gtt 2544 Ser Pro Asn Pro Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val 835 840 845 cag ttc gag gag cag att cgt aac atg tac gat gcc gga gca cgt gtt 2592 Gln Phe Glu Glu Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val 850 855 860 ttt ctg gag ttt gga ccc cgc caa gtc ctt gca aag ctt atc gcg gaa 2640 Phe Leu Glu Phe Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu 865 870 875 880 atg ttt ccc tcg tgt aca gct atc agc gtt aac ccc gcg agc agt ggt 2688 Met Phe Pro Ser Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly 885 890 895 gac agt gac gtg caa ctc cgc ctc gcc gcc gta aaa ttc gcg gtc tcg 2736 Asp Ser Asp Val Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser 900 905 910 ggt gca gcc ctt agc acc ttt gat cca tgg gag tat cgc aag cca caa 2784 Gly Ala Ala Leu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln 915 920 925 gat ctt ctt att cga aaa cca cga aaa act gcc ctt gtt cta tca gca 2832 Asp Leu Leu Ile Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala 930 935 940 gca aca tat gtt tcc cca aag act ctt gca gaa cgt aaa aag gct atg 2880 Ala Thr Tyr Val Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met 945 950 955 960 gaa gat atc aag cta gta tcc att aca cca aga gat agt atg gta tca 2928 Glu Asp Ile Lys Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser 965 970 975 att gga aaa atc gcg caa gaa gta cgg aca gct aaa cag cct tta gaa 2976 Ile Gly Lys Ile Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu 980 985 990 acc gaa att cga aga ctc aac aaa gaa tta gaa cat ctc aag aga gag 3024 Thr Glu Ile Arg Arg Leu Asn Lys Glu Leu Glu His Leu Lys Arg Glu 995 1000 1005 cta gca gca gcc aaa gcg agt gtc aag tct gca tca aaa agc tct 3069 Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Val Lys Ser Ala Ser Lys Ser Ser 1010 1015 1020 aaa gag cga tct gtc cta tca aag cac cgc gct ttg ctt caa aac 3114 Lys Glu Arg Ser Val Leu Ser Lys His Arg Ala Leu Leu Gln Asn 1025 1030 1035 att ttg caa gac tac gat gat ctt cgt gtg gtg cca ttc gct gtt 3159 Ile Leu Gln Asp Tyr Asp Asp Leu Arg Val Val Pro Phe Ala Val 1040 1045 1050 cgt tct gtt gca gtg gac aac acc gcg ccg tat gct gac caa gtt 3204 Arg Ser Val Ala Val Asp Asn Thr Ala Pro Tyr Ala Asp Gln Val 1055 1060 1065 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa 3249 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys 1070 1075 1080 cgc agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg 3294 Arg Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala 1085 1090 1095 gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg 3339 Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met 1100 1105 1110 atc gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc 3384 Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 1115 1120 1125 atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc 3429 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser 1130 1135 1140 gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt 3474 Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val 1145 1150 1155 ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa 3519 Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln 1160 1165 1170 ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc 3564 Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 1175 1180 1185 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt 3609 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val 1190 1195 1200 tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gct gcg gta ctg agc gtt 3654 Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val 1205 1210 1215 ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac 3699 Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp 1220 1225 1230 atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 3744 Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 1235 1240 1245 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc 3789 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser 1250 1255 1260 gac gtt gac gct ctg tca aga act aag act gtt ggc gac gtc atc 3834 Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile 1265 1270 1275 gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg 3879 Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu 1280 1285 1290 acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 3924 Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 1295 1300 1305 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc 3969 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg 1310 1315 1320 ctc gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag 4014 Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys 1325 1330 1335 aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag 4059 Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu 1340 1345 1350 agc gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 4104 Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 1355 1360 1365 gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct 4149 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala 1370 1375 1380 ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag 4194 Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys 1385 1390 1395 ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg 4239 Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser 1400 1405 1410 atc cgt cag cca ccg gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 4284 Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 1415 1420 1425 tca agc agt att gct aat gtt ttg tca gca cgc ctc gct gaa gct 4329 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala 1430 1435 1440 gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac 4374 Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp 1445 1450 1455 agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc 4419 Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly 1460 1465 1470 gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg 4464 Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 1475 1480 1485 ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc 4509 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1490 1495 1500 aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt 4554 Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly 1505 1510 1515 gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca 4599 Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro 1520 1525 1530 ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att 4644 Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 1535 1540 1545 gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta 4689 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val 1550 1555 1560 ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc 4734 Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile 1565 1570 1575 gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc 4779 Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile 1580 1585 1590 aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 4824 Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 1595 1600 1605 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc 4869 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly 1610 1615 1620 gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc 4914 Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly 1625 1630 1635 cag act ttg acc tct gaa ccg atc cat cag cca cca gtg tcc gag 4959 Gln Thr Leu Thr Ser Glu Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu 1640 1645 1650 cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tct 5004 Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 1655 1660 1665 tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc 5049 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu 1670 1675 1680 gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg 5094 Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met 1685 1690 1695 gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gaa 5139 Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 1700 1705 1710 atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 5184 Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 1715 1720 1725 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag 5229 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu 1730 1735 1740 gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc 5274 Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr 1745 1750 1755 gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg 5319 Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro 1760 1765 1770 acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 5364 Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 1775 1780 1785 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca 5409 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr 1790 1795 1800 ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc 5454 Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser 1805 1810 1815 gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag 5499 Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu 1820 1825 1830 gtt caa gcg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 5544 Val Gln Ala Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 1835 1840 1845 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag atg 5589 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met 1850 1855 1860 gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gca gaa tcg atc 5634 Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile 1865 1870 1875 cgt gag cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca 5679 Arg Glu Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser 1880 1885 1890 agt agt atc gct aat gtt tct tca gct cgc ctc gct gaa gct gaa 5724 Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 1895 1900 1905 gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc 5769 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser 1910 1915 1920 tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc 5814 Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val 1925 1930 1935 gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ttg 5859 Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu 1940 1945 1950 ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 5904 Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 1955 1960 1965 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctt ggg gaa 5949 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Glu 1970 1975 1980 tca tca agt att gag act ctc aat tgt acc gag gtt gag cac acg 5994 Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu His Thr 1985 1990 1995 agc tac aaa agt gtc aag gct tca ggg tgt gag aat gta gat acc 6039 Ser Tyr Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr 2000 2005 2010 cgt ttc gct aag gtt gta caa atc tcg ctt cct agc aag ctg aaa 6084 Arg Phe Ala Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys 2015 2020 2025 tcc act gtg tcg cac gat cga cct gta att gtt gta gat gat gga 6129 Ser Thr Val Ser His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly 2030 2035 2040 acg ccc tta acc acg gag ctt tgt aaa att ctt ggg ggt aat att 6174 Thr Pro Leu Thr Thr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile 2045 2050 2055 gtg gtt ctc tct tat caa ggg aag ccc gct ggt cca cgg gga gtc 6219 Val Val Leu Ser Tyr Gln Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val 2060 2065 2070 gag gtg cca gat ctt tcc gag gaa gcc cta att caa gct ctt gca 6264 Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala 2075 2080 2085 ttg att cgg tct aca tat gga gtt cca att ggt ttt att tgt cag 6309 Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln 2090 2095 2100 caa gtg tct aat gtg agc acc aag gca cag ctt tgt tgg gca ctc 6354 Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala Gln Leu Cys Trp Ala Leu 2105 2110 2115 ctc gca gcg aag cat ctc aag aag gat ttg aat gct gtc tta ccc 6399 Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu Asn Ala Val Leu Pro 2120 2125 2130 gat tca aga tcc ttc ttc gtc gga gtt gta cgc ttg aac ggg aaa 6444 Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg Leu Asn Gly Lys 2135 2140 2145 ctt gga act ttc gaa aac atc agc gac ttc tct aaa ttt gat ttg 6489 Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys Phe Asp Leu 2150 2155 2160 acg aaa gcc cta gat tac gga cag cgt ggt tct ctc tta ggc ctg 6534 Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu Gly Leu 2165 2170 2175 tgc aag tca cta gac tta gaa tgg gaa cag gtg ttt tgc cgt gga 6579 Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg Gly 2180 2185 2190 ata gat ctt gcg tgt gat ctt atg cca ctc cag gcc gca agg ata 6624 Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 2195 2200 2205 ctc aga aat gag ctt cag tgt ccc aat atg cgc ctt cgc gag gtt 6669 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val 2210 2215 2220 ggg tac gat att tct ggc gcc agg tac acc att tca acc gat gac 6714 Gly Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp 2225 2230 2235 ctg cta tgt gga ccc tcg aag gct aaa gta gag gcc gca gac ttg 6759 Leu Leu Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu 2240 2245 2250 ttt ctt gtg aca ggt ggc gca cga ggt att aca cct cat tgt gtt 6804 Phe Leu Val Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val 2255 2260 2265 cgt gag att gca agt cga tcc ccc gga acc aca ttt gtg ctg gtt 6849 Arg Glu Ile Ala Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val 2270 2275 2280 gga aga agc gaa atg tcc gac gag cct gac tgg gct gtt ggc cac 6894 Gly Arg Ser Glu Met Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His 2285 2290 2295 tac aat aaa gac ctg gac caa agc aca atg aaa cac ttg aaa gca 6939 Tyr Asn Lys Asp Leu Asp Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala 2300 2305 2310 acg cat gct gct gga ggg gta aaa cct acg cct aaa gca cat cgt 6984 Thr His Ala Ala Gly Gly Val Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg 2315 2320 2325 gca ctt gtg aac agg gtc act ggc tca cgg gag gta cga gaa tct 7029 Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser 2330 2335 2340 ctt aga gca atc cag gag gca ggg gca aat gtc gaa tat atc gcc 7074 Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala Asn Val Glu Tyr Ile Ala 2345 2350 2355 tgt gat gtt tcg gat gaa aac aag gtc cgc caa ctt gtg caa aga 7119 Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg Gln Leu Val Gln Arg 2360 2365 2370 gtg gag caa aag tat ggc tgt gaa ata act ggg att tgg cat gca 7164 Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly Ile Trp His Ala 2375 2380 2385 agc ggg gtt ctt cgt gac aaa ctt gtc gag caa aag act aca gac 7209 Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys Thr Thr Asp 2390 2395 2400 gac ttt gag gca gtt ttt ggg acc aag gtg act ggc ctt gta aac 7254 Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu Val Asn 2405 2410 2415 atc gtg tca caa gtc aat atg tct aag cta cga cac ttc atc ctc 7299 Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile Leu 2420 2425 2430 ttc agt tct ttg gct gga ttt cat ggg aac aag ggc caa acg gat 7344 Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 2435 2440 2445 tat gca att gct aat gaa gcc ttg aac aaa atc gcg cat act ctc 7389 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu 2450 2455 2460 tca gcg ttt ttg ccc aaa ctg aat gca aag gtg cta gac ttc ggt 7434 Ser Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly 2465 2470 2475 ccg tgg gta ggt tca gga atg gta acc gaa aca ctt gag aag cat 7479 Pro Trp Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His 2480 2485 2490 ttt aaa gct atg ggg gtt cag act att cct ctc gag cca gga gca 7524 Phe Lys Ala Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala 2495 2500 2505 cgg act gtt gcg caa atc att ttg gca agt tcg cca ccg caa tcg 7569 Arg Thr Val Ala Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser 2510 2515 2520 ctt ttg ggg aac tgg ggc ttt cca gcc acc aaa ccg cta caa cgc 7614 Leu Leu Gly Asn Trp Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg 2525 2530 2535 tct aat gta gtc acg ggc aca ctc tct ccg gaa gag ata gaa ttc 7659 Ser Asn Val Val Thr Gly Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe 2540 2545 2550 atc gca gac cac aaa att caa ggc cgc aag gtg ctt ccc atg atg 7704 Ile Ala Asp His Lys Ile Gln Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met 2555 2560 2565 gct gca atc ggg ttc atg gcc tct att gcg gaa gga ctc tac ccg 7749 Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro 2570 2575 2580 ggg tac aat ctg caa ggc gtg gaa aat gct cag ctc ttt caa ggc 7794 Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn Ala Gln Leu Phe Gln Gly 2585 2590 2595 ttg act atc aac caa gag aca aaa ttt caa atc act ctc att gag 7839 Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln Ile Thr Leu Ile Glu 2600 2605 2610 gag cac aac tct gag gaa aac ctg gat gtc ctg aca tcc ctt ggt 7884 Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu Thr Ser Leu Gly 2615 2620 2625 gta atg ttg gaa agc ggg aag gtg ctt ccc gct tac cga tgt gtt 7929 Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr Arg Cys Val 2630 2635 2640 gta tgc ttg aat aca acc cag cag cag ccc aag cta tct cca aaa 7974 Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser Pro Lys 2645 2650 2655 att ctt aac ttg gaa gtt gac cct gca tgc gag gtt aac ccc tat 8019 Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro Tyr 2660 2665 2670 gat gga aag tcg ttg ttc cac ggt ccg ctt ttg caa ttc gtt caa 8064 Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 2675 2680 2685 caa gtg ttg cac tca agt acc aaa ggc ctc gtt gcc aag tgc cgc 8109 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg 2690 2695 2700 gcg ctt cca atc aaa gaa gcc atc cga ggg cca ttt atc aag caa 8154 Ala Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln 2705 2710 2715 aca ctc cat gat cca att cta gac gac gtc att ttt cag cta atg 8199 Thr Leu His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met 2720 2725 2730 ctc gtg tgg tgt cgt aat gct cta gga agt gca tcg cta ccc aac 8244 Leu Val Trp Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn 2735 2740 2745 aga att gaa aag atg tca tac ttt ggg aat gtc tca gaa ggt agc 8289 Arg Ile Glu Lys Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser 2750 2755 2760 act ttc ttt gcc tca gtt aca cct gtg gga cca aga gta cca aag 8334 Thr Phe Phe Ala Ser Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys 2765 2770 2775 gat ccc gtg atc aaa atg cag ttt ctt ctc caa gat gaa tcc ggc 8379 Asp Pro Val Ile Lys Met Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly 2780 2785 2790 aac aca ttt tca tcg ggg gag ggc tcg gtt gtg ctt agt gac gaa 8424 Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu 2795 2800 2805 ctc gtc ttt tga 8436 Leu Val Phe 2810 <210> 39 <211> 2811 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 39 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 Cys Asn Asp Gln Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys 500 505 510 Thr His Lys Asn Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu 515 520 525 Phe Gln Leu Gln Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe 530 535 540 Leu Ala Thr Leu Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile 545 550 555 560 Leu Ala Gln Leu Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro 565 570 575 His Lys Lys Ala Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly 580 585 590 Ser Val Ala Ala Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met 595 600 605 Phe Ser Asp Val Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val 610 615 620 Ala Met Glu Glu Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro 625 630 635 640 Ile Ser Lys Val Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu 645 650 655 Gln Gly Asn Glu Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr 660 665 670 Ile Ala Ala Ala Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe 675 680 685 Lys Pro Asp Met Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu 690 695 700 Tyr Ala Ala Gly Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys 705 710 715 720 Lys Arg Ala Lys Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala 725 730 735 Val Ile Gly Pro Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val 740 745 750 Tyr Val Ala Asn Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr 755 760 765 Val Gln Gly Val Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe 770 775 780 Arg Val Leu Pro Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met 785 790 795 800 Gly Pro Ser Glu Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile 805 810 815 Ser Pro Pro Lys Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu 820 825 830 Ser Pro Asn Pro Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val 835 840 845 Gln Phe Glu Glu Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val 850 855 860 Phe Leu Glu Phe Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu 865 870 875 880 Met Phe Pro Ser Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly 885 890 895 Asp Ser Asp Val Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser 900 905 910 Gly Ala Ala Leu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln 915 920 925 Asp Leu Leu Ile Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala 930 935 940 Ala Thr Tyr Val Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met 945 950 955 960 Glu Asp Ile Lys Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser 965 970 975 Ile Gly Lys Ile Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu 980 985 990 Thr Glu Ile Arg Arg Leu Asn Lys Glu Leu Glu His Leu Lys Arg Glu 995 1000 1005 Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Val Lys Ser Ala Ser Lys Ser Ser 1010 1015 1020 Lys Glu Arg Ser Val Leu Ser Lys His Arg Ala Leu Leu Gln Asn 1025 1030 1035 Ile Leu Gln Asp Tyr Asp Asp Leu Arg Val Val Pro Phe Ala Val 1040 1045 1050 Arg Ser Val Ala Val Asp Asn Thr Ala Pro Tyr Ala Asp Gln Val 1055 1060 1065 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys 1070 1075 1080 Arg Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala 1085 1090 1095 Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met 1100 1105 1110 Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 1115 1120 1125 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser 1130 1135 1140 Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val 1145 1150 1155 Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln 1160 1165 1170 Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 1175 1180 1185 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val 1190 1195 1200 Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val 1205 1210 1215 Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp 1220 1225 1230 Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 1235 1240 1245 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser 1250 1255 1260 Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile 1265 1270 1275 Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu 1280 1285 1290 Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 1295 1300 1305 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg 1310 1315 1320 Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys 1325 1330 1335 Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu 1340 1345 1350 Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 1355 1360 1365 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala 1370 1375 1380 Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys 1385 1390 1395 Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser 1400 1405 1410 Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 1415 1420 1425 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala 1430 1435 1440 Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp 1445 1450 1455 Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly 1460 1465 1470 Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 1475 1480 1485 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1490 1495 1500 Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly 1505 1510 1515 Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro 1520 1525 1530 Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 1535 1540 1545 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val 1550 1555 1560 Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile 1565 1570 1575 Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile 1580 1585 1590 Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 1595 1600 1605 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly 1610 1615 1620 Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly 1625 1630 1635 Gln Thr Leu Thr Ser Glu Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu 1640 1645 1650 Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 1655 1660 1665 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu 1670 1675 1680 Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met 1685 1690 1695 Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 1700 1705 1710 Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 1715 1720 1725 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu 1730 1735 1740 Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr 1745 1750 1755 Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro 1760 1765 1770 Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 1775 1780 1785 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr 1790 1795 1800 Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser 1805 1810 1815 Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu 1820 1825 1830 Val Gln Ala Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 1835 1840 1845 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met 1850 1855 1860 Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile 1865 1870 1875 Arg Glu Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser 1880 1885 1890 Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 1895 1900 1905 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser 1910 1915 1920 Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val 1925 1930 1935 Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu 1940 1945 1950 Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 1955 1960 1965 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Glu 1970 1975 1980 Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu His Thr 1985 1990 1995 Ser Tyr Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr 2000 2005 2010 Arg Phe Ala Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys 2015 2020 2025 Ser Thr Val Ser His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly 2030 2035 2040 Thr Pro Leu Thr Thr Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile 2045 2050 2055 Val Val Leu Ser Tyr Gln Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val 2060 2065 2070 Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala 2075 2080 2085 Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln 2090 2095 2100 Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala Gln Leu Cys Trp Ala Leu 2105 2110 2115 Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu Asn Ala Val Leu Pro 2120 2125 2130 Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg Leu Asn Gly Lys 2135 2140 2145 Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys Phe Asp Leu 2150 2155 2160 Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu Gly Leu 2165 2170 2175 Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg Gly 2180 2185 2190 Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 2195 2200 2205 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val 2210 2215 2220 Gly Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp 2225 2230 2235 Leu Leu Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu 2240 2245 2250 Phe Leu Val Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val 2255 2260 2265 Arg Glu Ile Ala Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val 2270 2275 2280 Gly Arg Ser Glu Met Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His 2285 2290 2295 Tyr Asn Lys Asp Leu Asp Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala 2300 2305 2310 Thr His Ala Ala Gly Gly Val Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg 2315 2320 2325 Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser 2330 2335 2340 Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala Asn Val Glu Tyr Ile Ala 2345 2350 2355 Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg Gln Leu Val Gln Arg 2360 2365 2370 Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly Ile Trp His Ala 2375 2380 2385 Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys Thr Thr Asp 2390 2395 2400 Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu Val Asn 2405 2410 2415 Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile Leu 2420 2425 2430 Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 2435 2440 2445 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu 2450 2455 2460 Ser Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly 2465 2470 2475 Pro Trp Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His 2480 2485 2490 Phe Lys Ala Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala 2495 2500 2505 Arg Thr Val Ala Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser 2510 2515 2520 Leu Leu Gly Asn Trp Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg 2525 2530 2535 Ser Asn Val Val Thr Gly Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe 2540 2545 2550 Ile Ala Asp His Lys Ile Gln Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met 2555 2560 2565 Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro 2570 2575 2580 Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn Ala Gln Leu Phe Gln Gly 2585 2590 2595 Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln Ile Thr Leu Ile Glu 2600 2605 2610 Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu Thr Ser Leu Gly 2615 2620 2625 Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr Arg Cys Val 2630 2635 2640 Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser Pro Lys 2645 2650 2655 Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro Tyr 2660 2665 2670 Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 2675 2680 2685 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg 2690 2695 2700 Ala Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln 2705 2710 2715 Thr Leu His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met 2720 2725 2730 Leu Val Trp Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn 2735 2740 2745 Arg Ile Glu Lys Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser 2750 2755 2760 Thr Phe Phe Ala Ser Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys 2765 2770 2775 Asp Pro Val Ile Lys Met Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly 2780 2785 2790 Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu 2795 2800 2805 Leu Val Phe 2810 <210> 40 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 40 atg aag gac atg gaa gat aga cgg gtc gct att gtg ggc atg tca gct 48 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 cac ttg cct tgt ggg aca gat gtg aag gaa tca tgg cag gct att cgc 96 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 gat gga atc gac tgt cta agt gac cta ccc gcg gat cgt ctc gac gtt 144 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 aca gct tac tac aat ccc aac aaa gcc acg aaa gac aag atc tac tgc 192 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 aaa cgg ggt ggc ttc atc ccg aac tat gac ttc gac ccc cgc gaa ttt 240 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 ggg ctc aac atg ttt caa atg gaa gac tct gat gcg aat cag aca ctt 288 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 acc ttg ctc aaa gtc aaa caa gct ctc gaa gat gca agc ata gag cct 336 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 ttc acc aag gag aag aag aac att gga tgt gtt tta ggt att ggt ggg 384 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 ggc caa aag gcg agt cat gag ttc tac tct cgt ctc aac tac gtt gtc 432 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 gtt gaa aag gta ctt cgg aaa atg ggt tta cca gat gct gat gtt gaa 480 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 gaa gct gtg gag aaa tac aag gca aat ttt ccc gag tgg cgc cta gac 528 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 tct ttc cct ggg ttt ctt ggg aat gta acg gct ggt cgg tgc agt aac 576 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 acc ttc aac atg gaa ggt atg aac tgc gtt gtg gat gct gca tgt gcc 624 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 agt tct cta att gca atc aag gtt gca gtt gaa gag cta ctc ttt ggt 672 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 gac tgt gac acc atg att gca ggt gcc acc tgc acg gac aat tca ctt 720 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 ggc atg tac atg gcc ttc tct aaa acg cca gtt ttt tct act gac cca 768 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 agt gtc cgc gcg tat gat gag aaa aca aaa ggg atg cta att gga gaa 816 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 ggt tca gca atg ttc gtt ctt aaa cgc tat gcg gat gcc gta cgt gat 864 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 ggc gac aca att cac gcg gtt ctg cgt tct tgc tct tcg tct agt gat 912 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 gga aaa gcg gca gga att tat act cct act ata tct gga caa gaa gaa 960 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 gct ttg cgt cga gcg tat gcc cgt gcg ggg gta tgt cca tct acg atc 1008 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 ggg ctt gtt gag ggt cac ggg aca ggg acc cct gtt gga gat cgc att 1056 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 gag tta aca gct ctg cgg aac ttg ttt gac aaa gct ttt ggt agc aag 1104 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 aag gaa caa ata gca gtt ggc agc ata aag tct cag ata ggt cac ctg 1152 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 aaa tct gtt gcc ggc ttt gcc ggc ttg gtc aaa gct gtg ctt gcg ctt 1200 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 aaa cac aaa acg ctc cca ggt tcg att aat gtc gac cag cca cct ttg 1248 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 ttg tat gac ggt act caa att caa gac tct tct tta tat atc aac aag 1296 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 aca aat aga cca tgg ttt acg caa aac aag ctt ccg cgt cgg gct ggt 1344 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 gtc tca agt ttt gga ttt gga ggt gca aac tac cac gcg gtt ctg gaa 1392 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 gaa ttc gag ccc gag cat gaa aaa cca tac cgc ctc aat act gtt gga 1440 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 cat cct gtc ctc ttg tac gct ccg tct gtg gaa gcc ctc aaa gta ctt 1488 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 tgc aac gac cag 1500 Cys Asn Asp Gln 500 <210> 41 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 41 Met Lys Asp Met Glu Asp Arg Arg Val Ala Ile Val Gly Met Ser Ala 1 5 10 15 His Leu Pro Cys Gly Thr Asp Val Lys Glu Ser Trp Gln Ala Ile Arg 20 25 30 Asp Gly Ile Asp Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Leu Asp Val 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Asn Lys Ala Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys 50 55 60 Lys Arg Gly Gly Phe Ile Pro Asn Tyr Asp Phe Asp Pro Arg Glu Phe 65 70 75 80 Gly Leu Asn Met Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Leu 85 90 95 Thr Leu Leu Lys Val Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Ser Ile Glu Pro 100 105 110 Phe Thr Lys Glu Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Lys Ala Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val 130 135 140 Val Glu Lys Val Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Asp Ala Asp Val Glu 145 150 155 160 Glu Ala Val Glu Lys Tyr Lys Ala Asn Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp 165 170 175 Ser Phe Pro Gly Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Ser Asn 180 185 190 Thr Phe Asn Met Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Ile Ala Ile Lys Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Phe Gly 210 215 220 Asp Cys Asp Thr Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Leu 225 230 235 240 Gly Met Tyr Met Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro 245 250 255 Ser Val Arg Ala Tyr Asp Glu Lys Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu 260 265 270 Gly Ser Ala Met Phe Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp 275 280 285 Gly Asp Thr Ile His Ala Val Leu Arg Ser Cys Ser Ser Ser Ser Asp 290 295 300 Gly Lys Ala Ala Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu 305 310 315 320 Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Val Cys Pro Ser Thr Ile 325 330 335 Gly Leu Val Glu Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Arg Ile 340 345 350 Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asn Leu Phe Asp Lys Ala Phe Gly Ser Lys 355 360 365 Lys Glu Gln Ile Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 Lys Ser Val Ala Gly Phe Ala Gly Leu Val Lys Ala Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 Lys His Lys Thr Leu Pro Gly Ser Ile Asn Val Asp Gln Pro Pro Leu 405 410 415 Leu Tyr Asp Gly Thr Gln Ile Gln Asp Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Lys 420 425 430 Thr Asn Arg Pro Trp Phe Thr Gln Asn Lys Leu Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Lys Pro Tyr Arg Leu Asn Thr Val Gly 465 470 475 480 His Pro Val Leu Leu Tyr Ala Pro Ser Val Glu Ala Leu Lys Val Leu 485 490 495 Cys Asn Asp Gln 500 <210> 42 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 42 ctt gcg gag ctc aca att gca ttg gaa gag gca aaa aca cat aaa aat 48 Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Thr His Lys Asn 1 5 10 15 gtt gac aaa gtt tgt ggc tac aag ttt att gac gaa ttt cag ctc caa 96 Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu Phe Gln Leu Gln 20 25 30 gga agc tgt cct cca gaa aat ccg aga gta gga ttt tta gca aca ctg 144 Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe Leu Ala Thr Leu 35 40 45 cct act tca aat atc att gtc gcg ctt aag gca att ctc gcg cag ctt 192 Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 gat gca aaa cca gat gcg aag aaa tgg gat ttg cct cat aaa aag gct 240 Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro His Lys Lys Ala 65 70 75 80 ttt ggg gct acc ttc gca tcg tct tca gtg aaa ggc tct gtt gct gcg 288 Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly Ser Val Ala Ala 85 90 95 ctc ttc gca gga cag ggt acc cag tac tta aac atg ttc tct gat gtg 336 Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met Phe Ser Asp Val 100 105 110 gca atg aac tgg cca ccg ttc cgt gac agc att gtc gca atg gaa gaa 384 Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val Ala Met Glu Glu 115 120 125 gct caa act gag gta ttt gag ggc caa gtt gaa cca att agc aaa gtt 432 Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro Ile Ser Lys Val 130 135 140 ctg ttt cca cga gag cgc tat gca tcc gaa agt gaa cag ggg aat gaa 480 Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Gln Gly Asn Glu 145 150 155 160 ctt ctt tgc tta aca gag tac tct cag cca act acg ata gca gcc gca 528 Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ala 165 170 175 gta ggg gcc ttc gat att ttc aaa gcg gct ggc ttt aag cca gac atg 576 Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe Lys Pro Asp Met 180 185 190 gtt gga ggg cat tca ctt ggc gaa ttt gct gct ttg tac gcg gct ggg 624 Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly 195 200 205 tcc att tcg cgt gac gac ctg tac aag ctt gtg tgc aaa cgg gca aag 672 Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys Lys Arg Ala Lys 210 215 220 gca atg gcg aac gct agt gac gga gct atg gca gca gtg att ggc cca 720 Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Pro 225 230 235 240 gat gca cgt cta gtt acg cca caa aat agt gac gtt tat gtc gca aac 768 Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val Tyr Val Ala Asn 245 250 255 ttc aac tcc gca act caa gta gtc atc agt ggc act gtt caa ggt gtg 816 Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr Val Gln Gly Val 260 265 270 aaa gaa gag tcg aaa ttg ctc att tca aag ggg ttc cgc gta ctg cca 864 Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Pro 275 280 285 ctt aaa tgc cag ggc gcc ttc cat tct cct ttg atg ggg cct tct gag 912 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met Gly Pro Ser Glu 290 295 300 gat agt ttc aaa tca ctt gtg gag act tgt acc atc tcg ccg cca aaa 960 Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile Ser Pro Pro Lys 305 310 315 320 aat gtg aaa ttc ttt tgc aat gtt agt ggc aag gaa agc cca aac cca 1008 Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu Ser Pro Asn Pro 325 330 335 aaa cag acc ctc aag tca cac atg acg tct agc gtt cag ttc gag gag 1056 Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val Gln Phe Glu Glu 340 345 350 cag att cgt aac atg tac gat gcc gga gca cgt gtt ttt ctg gag ttt 1104 Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val Phe Leu Glu Phe 355 360 365 gga ccc cgc caa gtc ctt gca aag ctt atc gcg gaa atg ttt ccc tcg 1152 Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu Met Phe Pro Ser 370 375 380 tgt aca gct atc agc gtt aac ccc gcg agc agt ggt gac agt gac gtg 1200 Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly Asp Ser Asp Val 385 390 395 400 caa ctc cgc ctc gcc gcc gta aaa ttc gcg gtc tcg ggt gca gcc ctt 1248 Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser Gly Ala Ala Leu 405 410 415 agc acc ttt gat cca tgg gag tat cgc aag cca caa gat ctt ctt att 1296 Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln Asp Leu Leu Ile 420 425 430 cga aaa cca cga aaa act gcc ctt gtt cta tca gca gca aca tat gtt 1344 Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val 435 440 445 tcc cca aag act ctt gca gaa cgt aaa aag gct atg gaa gat atc aag 1392 Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met Glu Asp Ile Lys 450 455 460 cta gta tcc att aca cca aga gat agt atg gta tca att gga aaa atc 1440 Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser Ile Gly Lys Ile 465 470 475 480 gcg caa gaa gta cgg aca gct aaa cag cct tta gaa acc gaa att cga 1488 Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu Thr Glu Ile Arg 485 490 495 aga ctc aac aaa 1500 Arg Leu Asn Lys 500 <210> 43 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 43 Leu Ala Glu Leu Thr Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Thr His Lys Asn 1 5 10 15 Val Asp Lys Val Cys Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Glu Phe Gln Leu Gln 20 25 30 Gly Ser Cys Pro Pro Glu Asn Pro Arg Val Gly Phe Leu Ala Thr Leu 35 40 45 Pro Thr Ser Asn Ile Ile Val Ala Leu Lys Ala Ile Leu Ala Gln Leu 50 55 60 Asp Ala Lys Pro Asp Ala Lys Lys Trp Asp Leu Pro His Lys Lys Ala 65 70 75 80 Phe Gly Ala Thr Phe Ala Ser Ser Ser Val Lys Gly Ser Val Ala Ala 85 90 95 Leu Phe Ala Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Leu Asn Met Phe Ser Asp Val 100 105 110 Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Asp Ser Ile Val Ala Met Glu Glu 115 120 125 Ala Gln Thr Glu Val Phe Glu Gly Gln Val Glu Pro Ile Ser Lys Val 130 135 140 Leu Phe Pro Arg Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Ser Glu Gln Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Leu Cys Leu Thr Glu Tyr Ser Gln Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ala 165 170 175 Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Phe Lys Pro Asp Met 180 185 190 Val Gly Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly 195 200 205 Ser Ile Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Lys Leu Val Cys Lys Arg Ala Lys 210 215 220 Ala Met Ala Asn Ala Ser Asp Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Pro 225 230 235 240 Asp Ala Arg Leu Val Thr Pro Gln Asn Ser Asp Val Tyr Val Ala Asn 245 250 255 Phe Asn Ser Ala Thr Gln Val Val Ile Ser Gly Thr Val Gln Gly Val 260 265 270 Lys Glu Glu Ser Lys Leu Leu Ile Ser Lys Gly Phe Arg Val Leu Pro 275 280 285 Leu Lys Cys Gln Gly Ala Phe His Ser Pro Leu Met Gly Pro Ser Glu 290 295 300 Asp Ser Phe Lys Ser Leu Val Glu Thr Cys Thr Ile Ser Pro Pro Lys 305 310 315 320 Asn Val Lys Phe Phe Cys Asn Val Ser Gly Lys Glu Ser Pro Asn Pro 325 330 335 Lys Gln Thr Leu Lys Ser His Met Thr Ser Ser Val Gln Phe Glu Glu 340 345 350 Gln Ile Arg Asn Met Tyr Asp Ala Gly Ala Arg Val Phe Leu Glu Phe 355 360 365 Gly Pro Arg Gln Val Leu Ala Lys Leu Ile Ala Glu Met Phe Pro Ser 370 375 380 Cys Thr Ala Ile Ser Val Asn Pro Ala Ser Ser Gly Asp Ser Asp Val 385 390 395 400 Gln Leu Arg Leu Ala Ala Val Lys Phe Ala Val Ser Gly Ala Ala Leu 405 410 415 Ser Thr Phe Asp Pro Trp Glu Tyr Arg Lys Pro Gln Asp Leu Leu Ile 420 425 430 Arg Lys Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Ala Thr Tyr Val 435 440 445 Ser Pro Lys Thr Leu Ala Glu Arg Lys Lys Ala Met Glu Asp Ile Lys 450 455 460 Leu Val Ser Ile Thr Pro Arg Asp Ser Met Val Ser Ile Gly Lys Ile 465 470 475 480 Ala Gln Glu Val Arg Thr Ala Lys Gln Pro Leu Glu Thr Glu Ile Arg 485 490 495 Arg Leu Asn Lys 500 <210> 44 <211> 351 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 44 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa cgc 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 96 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 144 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 192 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 240 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 288 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa 336 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 tcg atc cgt cag cca 351 Ser Ile Arg Gln Pro 115 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 45 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 Ser Ile Arg Gln Pro 115 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> Xaa = any amino acid <400> 46 Leu Gly Xaa Asp Ser 1 5 <210> 47 <211> 2790 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2790) <400> 47 tcg acc cca gcg tca gag cgg tcg gct tca ccg ctt ttc gag aaa cgc 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 agt tcg gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 96 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 144 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg 192 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 240 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 288 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa 336 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 384 Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 115 120 125 tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa 432 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 130 135 140 gct gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca 480 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 145 150 155 160 atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc 528 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 165 170 175 atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 576 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 180 185 190 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga act aag act gtt ggc gac 624 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 195 200 205 gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act 672 Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 210 215 220 ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 720 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 225 230 235 240 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 768 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 245 250 255 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc 816 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 260 265 270 tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt 864 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 275 280 285 ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa acg 912 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 290 295 300 ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 960 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 305 310 315 320 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc 1008 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro 325 330 335 caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tcc 1056 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 340 345 350 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt ttg 1104 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu 355 360 365 tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca 1152 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 370 375 380 gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg 1200 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 385 390 395 400 gag agc gag ctt ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 1248 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 405 410 415 gag gtt caa acg ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 1296 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 420 425 430 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa 1344 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 435 440 445 ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag 1392 Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln 450 455 460 cca ccg gtg tct gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agc agt att 1440 Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 465 470 475 480 gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg 1488 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 485 490 495 agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg 1536 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 500 505 510 gac atg gac ctg gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg 1584 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 515 520 525 gag atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac 1632 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 530 535 540 gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg 1680 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 545 550 555 560 atg aag ctg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act ttg acc tct gaa 1728 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ser Glu 565 570 575 ccg atc cat cag cca cca gtg tcc gag cct gct gta ccg acc tca tcg 1776 Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 580 585 590 tca agc agt att gct aat gtt tct tca gca cgc ctc gct gaa gct gaa 1824 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 595 600 605 gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc tac gac agc tca 1872 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 610 615 620 atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt ggc gtt gat agc 1920 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 625 630 635 640 atc aaa cgc gtg gaa atc atg agc gag gtt caa acg ctg ctc agc gtg 1968 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 645 650 655 gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag act gtt ggc gac 2016 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 660 665 670 gtc atc gag gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc caa ggc cag act 2064 Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 675 680 685 ttg acc gcg gaa tcg atc cgt cag cca ccg gtg tct gag cct gct gta 2112 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 690 695 700 ccg acc tca tcg tca agc agt att gct aat gtt tcg tca gca cgc ctc 2160 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 705 710 715 720 gct gaa gct gaa gcg gcg gta ctg agc gtt ctc gca gac aag aca ggc 2208 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 725 730 735 tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg gag agc gag ctt 2256 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 740 745 750 ggc gtt gat agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc gag gtt caa gcg 2304 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Ala 755 760 765 ctg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg tca aga acc aag 2352 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 770 775 780 act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag atg gaa ctc ggt gga ccc 2400 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 caa ggc cag act ttg acc gca gaa tcg atc cgt gag cca ccg gtg tct 2448 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Glu Pro Pro Val Ser 805 810 815 gag cct gct gta ccg acc tca tcg tca agt agt atc gct aat gtt tct 2496 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 820 825 830 tca gct cgc ctc gct gaa gct gaa gcc gcg gta ctg agc gtt ctc gca 2544 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 835 840 845 gac aag aca ggc tac gac agc tca atg atc gag atg gac atg gac ctg 2592 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 850 855 860 gag agt gag ctt ggc gtc gac agc atc aaa cgc gtg gag atc atg agc 2640 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 865 870 875 880 gag gtt caa acg ttg ctc agc gtg gaa gtc tcc gac gtt gac gct ctg 2688 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 885 890 895 tca aga acc aag act gtt ggc gac gtc atc gag gcg atg aag ctg gaa 2736 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 900 905 910 ctt ggg gaa tca tca agt att gag act ctc aat tgt acc gag gtt gag 2784 Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu 915 920 925 cac acg 2790 His Thr 930 <210> 48 <211> 930 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 48 Ser Thr Pro Ala Ser Glu Arg Ser Ala Ser Pro Leu Phe Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ser Ser Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 20 25 30 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 35 40 45 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 50 55 60 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 85 90 95 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu 100 105 110 Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 115 120 125 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 130 135 140 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 145 150 155 160 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 165 170 175 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 180 185 190 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 195 200 205 Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 210 215 220 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 225 230 235 240 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 260 265 270 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 275 280 285 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr 290 295 300 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 305 310 315 320 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro 325 330 335 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser 340 345 350 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Leu 355 360 365 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 370 375 380 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 385 390 395 400 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 405 410 415 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 420 425 430 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 435 440 445 Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln 450 455 460 Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile 465 470 475 480 Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu 485 490 495 Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met 500 505 510 Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val 515 520 525 Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp 530 535 540 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala 545 550 555 560 Met Lys Leu Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ser Glu 565 570 575 Pro Ile His Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser 580 585 590 Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu 595 600 605 Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser 610 615 620 Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser 625 630 635 640 Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val 645 650 655 Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp 660 665 670 Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro Gln Gly Gln Thr 675 680 685 Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Gln Pro Pro Val Ser Glu Pro Ala Val 690 695 700 Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser Ser Ala Arg Leu 705 710 715 720 Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala Asp Lys Thr Gly 725 730 735 Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu Glu Ser Glu Leu 740 745 750 Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser Glu Val Gln Ala 755 760 765 Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Lys 770 775 780 Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Gly Gly Pro 785 790 795 800 Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ala Glu Ser Ile Arg Glu Pro Pro Val Ser 805 810 815 Glu Pro Ala Val Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ala Asn Val Ser 820 825 830 Ser Ala Arg Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Val Leu Ser Val Leu Ala 835 840 845 Asp Lys Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Met Ile Glu Met Asp Met Asp Leu 850 855 860 Glu Ser Glu Leu Gly Val Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Met Ser 865 870 875 880 Glu Val Gln Thr Leu Leu Ser Val Glu Val Ser Asp Val Asp Ala Leu 885 890 895 Ser Arg Thr Lys Thr Val Gly Asp Val Ile Glu Ala Met Lys Leu Glu 900 905 910 Leu Gly Glu Ser Ser Ser Ile Glu Thr Leu Asn Cys Thr Glu Val Glu 915 920 925 His Thr 930 <210> 49 <211> 2433 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2433) <400> 49 aaa agt gtc aag gct tca ggg tgt gag aat gta gat acc cgt ttc gct 48 Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr Arg Phe Ala 1 5 10 15 aag gtt gta caa atc tcg ctt cct agc aag ctg aaa tcc act gtg tcg 96 Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys Ser Thr Val Ser 20 25 30 cac gat cga cct gta att gtt gta gat gat gga acg ccc tta acc acg 144 His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly Thr Pro Leu Thr Thr 35 40 45 gag ctt tgt aaa att ctt ggg ggt aat att gtg gtt ctc tct tat caa 192 Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile Val Val Leu Ser Tyr Gln 50 55 60 ggg aag ccc gct ggt cca cgg gga gtc gag gtg cca gat ctt tcc gag 240 Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu 65 70 75 80 gaa gcc cta att caa gct ctt gca ttg att cgg tct aca tat gga gtt 288 Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val 85 90 95 cca att ggt ttt att tgt cag caa gtg tct aat gtg agc acc aag gca 336 Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala 100 105 110 cag ctt tgt tgg gca ctc ctc gca gcg aag cat ctc aag aag gat ttg 384 Gln Leu Cys Trp Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu 115 120 125 aat gct gtc tta ccc gat tca aga tcc ttc ttc gtc gga gtt gta cgc 432 Asn Ala Val Leu Pro Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg 130 135 140 ttg aac ggg aaa ctt gga act ttc gaa aac atc agc gac ttc tct aaa 480 Leu Asn Gly Lys Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys 145 150 155 160 ttt gat ttg acg aaa gcc cta gat tac gga cag cgt ggt tct ctc tta 528 Phe Asp Leu Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu 165 170 175 ggc ctg tgc aag tca cta gac tta gaa tgg gaa cag gtg ttt tgc cgt 576 Gly Leu Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg 180 185 190 gga ata gat ctt gcg tgt gat ctt atg cca ctc cag gcc gca agg ata 624 Gly Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 195 200 205 ctc aga aat gag ctt cag tgt ccc aat atg cgc ctt cgc gag gtt ggg 672 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val Gly 210 215 220 tac gat att tct ggc gcc agg tac acc att tca acc gat gac ctg cta 720 Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp Leu Leu 225 230 235 240 tgt gga ccc tcg aag gct aaa gta gag gcc gca gac ttg ttt ctt gtg 768 Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu Phe Leu Val 245 250 255 aca ggt ggc gca cga ggt att aca cct cat tgt gtt cgt gag att gca 816 Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val Arg Glu Ile Ala 260 265 270 agt cga tcc ccc gga acc aca ttt gtg ctg gtt gga aga agc gaa atg 864 Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val Gly Arg Ser Glu Met 275 280 285 tcc gac gag cct gac tgg gct gtt ggc cac tac aat aaa gac ctg gac 912 Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His Tyr Asn Lys Asp Leu Asp 290 295 300 caa agc aca atg aaa cac ttg aaa gca acg cat gct gct gga ggg gta 960 Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala Thr His Ala Ala Gly Gly Val 305 310 315 320 aaa cct acg cct aaa gca cat cgt gca ctt gtg aac agg gtc act ggc 1008 Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly 325 330 335 tca cgg gag gta cga gaa tct ctt aga gca atc cag gag gca ggg gca 1056 Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala 340 345 350 aat gtc gaa tat atc gcc tgt gat gtt tcg gat gaa aac aag gtc cgc 1104 Asn Val Glu Tyr Ile Ala Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg 355 360 365 caa ctt gtg caa aga gtg gag caa aag tat ggc tgt gaa ata act ggg 1152 Gln Leu Val Gln Arg Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly 370 375 380 att tgg cat gca agc ggg gtt ctt cgt gac aaa ctt gtc gag caa aag 1200 Ile Trp His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys 385 390 395 400 act aca gac gac ttt gag gca gtt ttt ggg acc aag gtg act ggc ctt 1248 Thr Thr Asp Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu 405 410 415 gta aac atc gtg tca caa gtc aat atg tct aag cta cga cac ttc atc 1296 Val Asn Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile 420 425 430 ctc ttc agt tct ttg gct gga ttt cat ggg aac aag ggc caa acg gat 1344 Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 435 440 445 tat gca att gct aat gaa gcc ttg aac aaa atc gcg cat act ctc tca 1392 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu Ser 450 455 460 gcg ttt ttg ccc aaa ctg aat gca aag gtg cta gac ttc ggt ccg tgg 1440 Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly Pro Trp 465 470 475 480 gta ggt tca gga atg gta acc gaa aca ctt gag aag cat ttt aaa gct 1488 Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His Phe Lys Ala 485 490 495 atg ggg gtt cag act att cct ctc gag cca gga gca cgg act gtt gcg 1536 Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala Arg Thr Val Ala 500 505 510 caa atc att ttg gca agt tcg cca ccg caa tcg ctt ttg ggg aac tgg 1584 Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Gly Asn Trp 515 520 525 ggc ttt cca gcc acc aaa ccg cta caa cgc tct aat gta gtc acg ggc 1632 Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ser Asn Val Val Thr Gly 530 535 540 aca ctc tct ccg gaa gag ata gaa ttc atc gca gac cac aaa att caa 1680 Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe Ile Ala Asp His Lys Ile Gln 545 550 555 560 ggc cgc aag gtg ctt ccc atg atg gct gca atc ggg ttc atg gcc tct 1728 Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser 565 570 575 att gcg gaa gga ctc tac ccg ggg tac aat ctg caa ggc gtg gaa aat 1776 Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn 580 585 590 gct cag ctc ttt caa ggc ttg act atc aac caa gag aca aaa ttt caa 1824 Ala Gln Leu Phe Gln Gly Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln 595 600 605 atc act ctc att gag gag cac aac tct gag gaa aac ctg gat gtc ctg 1872 Ile Thr Leu Ile Glu Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu 610 615 620 aca tcc ctt ggt gta atg ttg gaa agc ggg aag gtg ctt ccc gct tac 1920 Thr Ser Leu Gly Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr 625 630 635 640 cga tgt gtt gta tgc ttg aat aca acc cag cag cag ccc aag cta tct 1968 Arg Cys Val Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser 645 650 655 cca aaa att ctt aac ttg gaa gtt gac cct gca tgc gag gtt aac ccc 2016 Pro Lys Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro 660 665 670 tat gat gga aag tcg ttg ttc cac ggt ccg ctt ttg caa ttc gtt caa 2064 Tyr Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 675 680 685 caa gtg ttg cac tca agt acc aaa ggc ctc gtt gcc aag tgc cgc gcg 2112 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg Ala 690 695 700 ctt cca atc aaa gaa gcc atc cga ggg cca ttt atc aag caa aca ctc 2160 Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln Thr Leu 705 710 715 720 cat gat cca att cta gac gac gtc att ttt cag cta atg ctc gtg tgg 2208 His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met Leu Val Trp 725 730 735 tgt cgt aat gct cta gga agt gca tcg cta ccc aac aga att gaa aag 2256 Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn Arg Ile Glu Lys 740 745 750 atg tca tac ttt ggg aat gtc tca gaa ggt agc act ttc ttt gcc tca 2304 Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser Thr Phe Phe Ala Ser 755 760 765 gtt aca cct gtg gga cca aga gta cca aag gat ccc gtg atc aaa atg 2352 Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys Asp Pro Val Ile Lys Met 770 775 780 cag ttt ctt ctc caa gat gaa tcc ggc aac aca ttt tca tcg ggg gag 2400 Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu 785 790 795 800 ggc tcg gtt gtg ctt agt gac gaa ctc gtc ttt 2433 Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu Leu Val Phe 805 810 <210> 50 <211> 811 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 50 Lys Ser Val Lys Ala Ser Gly Cys Glu Asn Val Asp Thr Arg Phe Ala 1 5 10 15 Lys Val Val Gln Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Lys Ser Thr Val Ser 20 25 30 His Asp Arg Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly Thr Pro Leu Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Cys Lys Ile Leu Gly Gly Asn Ile Val Val Leu Ser Tyr Gln 50 55 60 Gly Lys Pro Ala Gly Pro Arg Gly Val Glu Val Pro Asp Leu Ser Glu 65 70 75 80 Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Ala Leu Ile Arg Ser Thr Tyr Gly Val 85 90 95 Pro Ile Gly Phe Ile Cys Gln Gln Val Ser Asn Val Ser Thr Lys Ala 100 105 110 Gln Leu Cys Trp Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Lys Asp Leu 115 120 125 Asn Ala Val Leu Pro Asp Ser Arg Ser Phe Phe Val Gly Val Val Arg 130 135 140 Leu Asn Gly Lys Leu Gly Thr Phe Glu Asn Ile Ser Asp Phe Ser Lys 145 150 155 160 Phe Asp Leu Thr Lys Ala Leu Asp Tyr Gly Gln Arg Gly Ser Leu Leu 165 170 175 Gly Leu Cys Lys Ser Leu Asp Leu Glu Trp Glu Gln Val Phe Cys Arg 180 185 190 Gly Ile Asp Leu Ala Cys Asp Leu Met Pro Leu Gln Ala Ala Arg Ile 195 200 205 Leu Arg Asn Glu Leu Gln Cys Pro Asn Met Arg Leu Arg Glu Val Gly 210 215 220 Tyr Asp Ile Ser Gly Ala Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Asp Asp Leu Leu 225 230 235 240 Cys Gly Pro Ser Lys Ala Lys Val Glu Ala Ala Asp Leu Phe Leu Val 245 250 255 Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro His Cys Val Arg Glu Ile Ala 260 265 270 Ser Arg Ser Pro Gly Thr Thr Phe Val Leu Val Gly Arg Ser Glu Met 275 280 285 Ser Asp Glu Pro Asp Trp Ala Val Gly His Tyr Asn Lys Asp Leu Asp 290 295 300 Gln Ser Thr Met Lys His Leu Lys Ala Thr His Ala Ala Gly Gly Val 305 310 315 320 Lys Pro Thr Pro Lys Ala His Arg Ala Leu Val Asn Arg Val Thr Gly 325 330 335 Ser Arg Glu Val Arg Glu Ser Leu Arg Ala Ile Gln Glu Ala Gly Ala 340 345 350 Asn Val Glu Tyr Ile Ala Cys Asp Val Ser Asp Glu Asn Lys Val Arg 355 360 365 Gln Leu Val Gln Arg Val Glu Gln Lys Tyr Gly Cys Glu Ile Thr Gly 370 375 380 Ile Trp His Ala Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Gln Lys 385 390 395 400 Thr Thr Asp Asp Phe Glu Ala Val Phe Gly Thr Lys Val Thr Gly Leu 405 410 415 Val Asn Ile Val Ser Gln Val Asn Met Ser Lys Leu Arg His Phe Ile 420 425 430 Leu Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Lys Gly Gln Thr Asp 435 440 445 Tyr Ala Ile Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Ile Ala His Thr Leu Ser 450 455 460 Ala Phe Leu Pro Lys Leu Asn Ala Lys Val Leu Asp Phe Gly Pro Trp 465 470 475 480 Val Gly Ser Gly Met Val Thr Glu Thr Leu Glu Lys His Phe Lys Ala 485 490 495 Met Gly Val Gln Thr Ile Pro Leu Glu Pro Gly Ala Arg Thr Val Ala 500 505 510 Gln Ile Ile Leu Ala Ser Ser Pro Pro Gln Ser Leu Leu Gly Asn Trp 515 520 525 Gly Phe Pro Ala Thr Lys Pro Leu Gln Arg Ser Asn Val Val Thr Gly 530 535 540 Thr Leu Ser Pro Glu Glu Ile Glu Phe Ile Ala Asp His Lys Ile Gln 545 550 555 560 Gly Arg Lys Val Leu Pro Met Met Ala Ala Ile Gly Phe Met Ala Ser 565 570 575 Ile Ala Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Val Glu Asn 580 585 590 Ala Gln Leu Phe Gln Gly Leu Thr Ile Asn Gln Glu Thr Lys Phe Gln 595 600 605 Ile Thr Leu Ile Glu Glu His Asn Ser Glu Glu Asn Leu Asp Val Leu 610 615 620 Thr Ser Leu Gly Val Met Leu Glu Ser Gly Lys Val Leu Pro Ala Tyr 625 630 635 640 Arg Cys Val Val Cys Leu Asn Thr Thr Gln Gln Gln Pro Lys Leu Ser 645 650 655 Pro Lys Ile Leu Asn Leu Glu Val Asp Pro Ala Cys Glu Val Asn Pro 660 665 670 Tyr Asp Gly Lys Ser Leu Phe His Gly Pro Leu Leu Gln Phe Val Gln 675 680 685 Gln Val Leu His Ser Ser Thr Lys Gly Leu Val Ala Lys Cys Arg Ala 690 695 700 Leu Pro Ile Lys Glu Ala Ile Arg Gly Pro Phe Ile Lys Gln Thr Leu 705 710 715 720 His Asp Pro Ile Leu Asp Asp Val Ile Phe Gln Leu Met Leu Val Trp 725 730 735 Cys Arg Asn Ala Leu Gly Ser Ala Ser Leu Pro Asn Arg Ile Glu Lys 740 745 750 Met Ser Tyr Phe Gly Asn Val Ser Glu Gly Ser Thr Phe Phe Ala Ser 755 760 765 Val Thr Pro Val Gly Pro Arg Val Pro Lys Asp Pro Val Ile Lys Met 770 775 780 Gln Phe Leu Leu Gln Asp Glu Ser Gly Asn Thr Phe Ser Ser Gly Glu 785 790 795 800 Gly Ser Val Val Leu Ser Asp Glu Leu Val Phe 805 810 <210> 51 <211> 5808 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(5805) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5808) <223> n = a c t or g <400> 51 atg caa ctt cct cca gcg cat tct gcc gat gag aat cgc atc gcg gtc 48 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 gtg ggc atg gcc gtc aaa tat gcg ggc tgt gac aat aaa gaa gag ttt 96 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 tgg aag act ttg atg aat ggt agt atc aat acc aag tcg att tcg gca 144 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 gca agg ttg ggc agc aat aag cgt gac gaa cac tat gtt cct gaa cga 192 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 tcg aaa tat gca gat acg ttc tgt aac gaa agg tac ggt tgt atc cag 240 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 caa ggt acg gat aat gag cat gac ctc ctc cta ggt ctt gct caa gaa 288 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 gct ctc gct gac gct gcc ggg cgg atg gag aaa caa cct tcg gag gcg 336 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 ttc gat ctg gaa aat act ggc atc gtg agt ggg tgc tta tct ttt cca 384 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 atg gat aac ctg caa gga gag ttg ttg aac ttg tat caa agc cat gtg 432 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 gag aaa caa ctt cca cct agt gcc ttg gta gaa gcc gtg aag ctt tgg 480 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 tct gag cga cag aaa tct acg aaa gca cat gca ggg gac aag cgc cgg 528 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 ttc att gac cca gct tct ttt gta gct gat aaa ctg aac cta ggc cca 576 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 cta cat tat gcg atc gat gca gca tgc gct tct gca ttg tac gtg tta 624 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 aaa tta gct caa gac cac ctt gtt tca ggt gcc gtt gat atg atg tta 672 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 tgt gga gcg acg tgc ttc cca gaa cca ttc ttc atc ttg tct ggg ttc 720 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 tcg act ttt caa gcg atg cct gnt ggg gca gat gga gtc tca cta cct 768 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 ctc cat aaa acg agt gct ggg ctc act cca ggt gaa ggg ggg tcc att 816 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 atg gtg ctc aag cga ctg aaa gac gct atc aga gat gga aat cac att 864 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 tat ggt gtg ctc ctt gaa gca aat tta agt aac gca ggt tgt ggg ctt 912 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 cca ctc agc ccg cac tta ccg agc gaa gaa tca tgt att cgt gat acc 960 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 tac cgc cgt gct gga gtt gct gca gat caa agt att cag tat att gag 1008 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 tgc cac gct acg gga acc cct cga ggg gat gtc gtg gaa att gag gcg 1056 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 gtt gaa aga gtt ttc aag aaa aac gtt cca cgc tta ggc tcg acg aaa 1104 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 gga aat ttt ggt cac tcg tta gtt gcg gct ggt ttc gca ggt atg gca 1152 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 aag ctt ctt ctt gca atg gaa cat gga gtg att cct ccc aca cca ggt 1200 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 ctt gat gct tcg aac cag gca agt gag cac gtt gtg aca aag gct atc 1248 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 act tgg cct gag aca cat ggg gct cca aaa cga gct ggc ctt tca gca 1296 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 ttt gga ttt ggt ggg act aat gcg cat gca ctc ttc gaa gag ttt aat 1344 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 gcc gag ggc ata agt tat cgc cct gga aag cct cca gtc gaa tcg aat 1392 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 acc cgt cct tcc gtc gta ata act ggg atg gac tgt acc ttt ggg agc 1440 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 ctt gaa ggg att gat gcg ttc gag act gcc ctg tac gag ggg cgt gac 1488 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 gca gct cgt gac tta ccc gcc aaa cgt tgg agg ttc cta ggt gag gac 1536 Ala Ala Arg Asp Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp 500 505 510 ttg gag ttt ctc cga gcc atc agg ctc aag gaa aag cct agg ggt tgt 1584 Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys 515 520 525 ttt gtg gag agt gtt gac gtt aac ttt aga cgg ctg aaa acg ccc ttg 1632 Phe Val Glu Ser Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu 530 535 540 aca cca gaa gat atg ttg cgg ccc caa caa ctc ttg gcg gtt tct acg 1680 Thr Pro Glu Asp Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr 545 550 555 560 atg gac cga gca att atc gat gca ggt cta aag aag ggc caa cat gta 1728 Met Asp Arg Ala Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val 565 570 575 gca gtt ctt gtt ggc cta gga act gac ctg gaa ctt tac cgt cat cga 1776 Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg 580 585 590 gca aga gtc gcg ctt aaa gag gtt ttg cac ccg agc tta aag tca gac 1824 Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp 595 600 605 act gca att ctc cag aaa ata atg caa tat gtg aat gat gca gga act 1872 Thr Ala Ile Leu Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr 610 615 620 tcg act tca tac aca tct tac att gga aac ctc gtt gcc acg cgt att 1920 Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile 625 630 635 640 tcg tct cag tgg gga ttc aca ggg ccg tcc ttt act gtc aca gaa gga 1968 Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly 645 650 655 aat aat tcc gtg tac aga tgt gca caa cta gcc aaa gat atg ctt cag 2016 Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln 660 665 670 gtt aac cga gtt gat gct gtc gtc atc gca ggc gtt gat ctc aac gga 2064 Val Asn Arg Val Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly 675 680 685 agc gcc gaa agt ttt ttt gtc cga gca aat cgt caa aag ata tcc aag 2112 Ser Ala Glu Ser Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys 690 695 700 cta agt cat cca tgt gca agc ttc gac aga gat gca gat gga ttt ttc 2160 Leu Ser His Pro Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe 705 710 715 720 gca ggt gag ggc tgt ggt gcc cta gtt ttc aag agg tta gaa gac tgt 2208 Ala Gly Glu Gly Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys 725 730 735 gct cct cag gaa aaa att tat gct agt ata gac tct atc gca ata gat 2256 Ala Pro Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp 740 745 750 aaa gag cct act agc tca gct gtg aaa gct gtc tac caa agt gat tcg 2304 Lys Glu Pro Thr Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser 755 760 765 agt ctc tcc gat att gag ctg tta gaa atc agt gga gac tcc aaa cgg 2352 Ser Leu Ser Asp Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg 770 775 780 ttt gca gca ttc gaa ggc gct gtg gaa att caa tca agt gtg gaa gcc 2400 Phe Ala Ala Phe Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala 785 790 795 800 cag cta aaa gga ctt tcc aaa gtc ctt gaa cct gca aaa ggc caa ggc 2448 Gln Leu Lys Gly Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly 805 810 815 gta gcg gtg gga agt act cga gca acc gtt ggg gat ata ggg tat gct 2496 Val Ala Val Gly Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala 820 825 830 aca gga gcg gca agc ctg att aaa act gca ctc tgc tta tat aat cgc 2544 Thr Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg 835 840 845 tac ctt ccg gca tta gca aac tgg agt ggc cca tgt gaa cag tcc gcc 2592 Tyr Leu Pro Ala Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala 850 855 860 tgg ggc tca aac atg ttc gtt tgc cat gaa aca cgg ccg tgg atg aaa 2640 Trp Gly Ser Asn Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys 865 870 875 880 aac cag aat gaa aag aga tgt gcc ctc att tct gga aca gat cca tct 2688 Asn Gln Asn Glu Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser 885 890 895 cat aca tgc ttt tcc ctc gta cta tcg gat act ggg tgt tat gaa gag 2736 His Thr Cys Phe Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu 900 905 910 cac aat cga acg tgc ttt gat gtg caa gcg cca cag cta gtt ctg ata 2784 His Asn Arg Thr Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile 915 920 925 cac gga ttc gat gga aaa act att gtg cgg cga ctt gaa gga tat ctc 2832 His Gly Phe Asp Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu 930 935 940 ctt gaa ctt gtt gaa ggg cat gca agc cct tca gag tat ttc cac aaa 2880 Leu Glu Leu Val Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys 945 950 955 960 ctg att gga caa agt cta ctt gag aac tcg aaa gaa agt aaa ctc aca 2928 Leu Ile Gly Gln Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr 965 970 975 ctt tcg ctt gtg tgc aat ccg aac cag ctc caa aag gag ctc atg ctt 2976 Leu Ser Leu Val Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu 980 985 990 gct atc aaa gga gta caa cga agc atg tta aca ggg aag gat tgg gtc 3024 Ala Ile Lys Gly Val Gln Arg Ser Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val 995 1000 1005 agt cca tca gga agt tgt ttt gcc cca aat ccg tta tca agc gca 3069 Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala 1010 1015 1020 aaa gtg gca ttc atg tac gga gaa ggc cga agc ccg tac tgt ggt 3114 Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Cys Gly 1025 1030 1035 gta ggc ttg ggt cta cat cgt ttg tgg ccc ggt ctc cat gaa aat 3159 Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro Gly Leu His Glu Asn 1040 1045 1050 gtg aac aat aag aca gtc gat tta tgg acg gaa gga gat ggt tgg 3204 Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu Gly Asp Gly Trp 1055 1060 1065 tta tat cct cga acg ttg aca cga gaa gag cat aca aaa gcc atc 3249 Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr Lys Ala Ile 1070 1075 1080 gaa tct ttc aac gca aat caa att gaa atg ttt cgc gct ggg att 3294 Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala Gly Ile 1085 1090 1095 ttc atc tca atg tgt cag aca gac tat gtc atg aat gtt ctc ggt 3339 Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu Gly 1100 1105 1110 gtc cag cct aag gcc gga ttt ggg ctg agc ttg gga gaa att tca 3384 Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 1115 1120 1125 atg ctc ttt gcg atg tca aag gag aac tgc agg cag tca cag gaa 3429 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu 1130 1135 1140 atg acc aat cgt ttg cgc ggt tct cca gtg tgg tct aac gag ctt 3474 Met Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu 1145 1150 1155 gct atc aac ttc aat gca att cgc aag tta tgg aaa atc ccc cga 3519 Ala Ile Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg 1160 1165 1170 gga gct ccc tta gaa tcc ttt tgg caa gga tac ttg gtt cac ggc 3564 Gly Ala Pro Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly 1175 1180 1185 aca aga gaa gaa gta gag cat gct att ggt ctt tct gag cct tat 3609 Thr Arg Glu Glu Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr 1190 1195 1200 gta cgt ctg ctt att gtg aac gat tca agg agt gcc ttg att gct 3654 Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala 1205 1210 1215 gga aaa cca gac gcc tgt cag gca gta atc agt aga cta aac tcc 3699 Gly Lys Pro Asp Ala Cys Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser 1220 1225 1230 aag ttc cct tct ctg ccg gta aag caa gga atg att ggt cat tgc 3744 Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys 1235 1240 1245 cca gaa gtt cgt gcg ttc atc aaa gat att ggg tac atc cat gaa 3789 Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu 1250 1255 1260 aca ctc cga att tcc aat gac tat tcg gat tgt cag ctt ttc tca 3834 Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser Asp Cys Gln Leu Phe Ser 1265 1270 1275 gcg gta acc aag ggc gca ctt gac agc tcc aca atg gaa atc aaa 3879 Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser Thr Met Glu Ile Lys 1280 1285 1290 cac ttt gtg gga gag gtc tac tcc cgg atc gca gac ttt cct caa 3924 His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala Asp Phe Pro Gln 1295 1300 1305 atc gtc aac acg gtg cat tcg gct ggt tat gac gta ttt ctt gag 3969 Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val Phe Leu Glu 1310 1315 1320 ctt ggc tgt gat gct tct aga tct gca gca gtt caa aac att ctt 4014 Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn Ile Leu 1325 1330 1335 ggt ggt caa gga aag ttc ttg tct aca gct att gac aaa aaa gga 4059 Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys Gly 1340 1345 1350 cac tcc gcc tgg tca caa gta ctt cgg gct acc gca tca tta gct 4104 His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 1355 1360 1365 gca cat cga gta ccg gga atc tca att ttg gat ttg ttt cac cca 4149 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro 1370 1375 1380 aat ttc cga gaa atg tgc tgt aca atg gca acc aca cct aaa gtg 4194 Asn Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val 1385 1390 1395 gaa gat aag ttc ctg cgc acg att caa atc aat ggt cgg ttt gaa 4239 Glu Asp Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu 1400 1405 1410 aaa gaa atg att cac cta gaa gat aca aca tta agt tgc tta ccc 4284 Lys Glu Met Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro 1415 1420 1425 gct cca agt gaa gca aat atc gca gct att caa tct cgg tca att 4329 Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile 1430 1435 1440 cga tct gct gcg gcg cgt tct gga caa tcc cat gat tgt gca tcc 4374 Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser 1445 1450 1455 cat agc cat gaa gaa aat aag gat tca tgc cct gaa aag ctg aag 4419 His Ser His Glu Glu Asn Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys 1460 1465 1470 ctt gat tct gtg tcc gtc gcc ata aat ttc gac aat gat gac cgc 4464 Leu Asp Ser Val Ser Val Ala Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg 1475 1480 1485 att cag ctt ggg cac gcg ggt ttt cgg gag atg tac aat aca aga 4509 Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe Arg Glu Met Tyr Asn Thr Arg 1490 1495 1500 tat agc ttg tac aca ggg gcg atg gca aag gga att gca tct gca 4554 Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 1505 1510 1515 gat ctt gtc att gcc gct ggg aaa gag ggc atc cta gct tcc tat 4599 Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser Tyr 1520 1525 1530 gga gct gga gga cta cct ctt gct act gtt cga aag gga ata gac 4644 Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 1535 1540 1545 aaa att caa caa gcc ttg cca agt ggc cca tat gct gta aat ctt 4689 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu 1550 1555 1560 att cac tct ccc ttt gac ggc aac ttg gag cag gga aac gtc gat 4734 Ile His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp 1565 1570 1575 ttg ttc ttg gaa aag aac gtc cgc gtg gcg gaa tgt tcc gcg ttt 4779 Leu Phe Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe 1580 1585 1590 aca acg cta aca gtg cca gta gta cac tat cgt gct gca ggg ctt 4824 Thr Thr Leu Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu 1595 1600 1605 gtt cgg cgc caa gat gga agc att ttg atc aag aac cga atc att 4869 Val Arg Arg Gln Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile 1610 1615 1620 gct aaa gta tct agg aca gaa ctc gct gag atg ttc ctt cgt ccg 4914 Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro 1625 1630 1635 gca cct caa atc atc ctc gaa aaa ctg gta gca gca gaa atc att 4959 Ala Pro Gln Ile Ile Leu Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile 1640 1645 1650 tca tct gac caa gcg cgt atg gca gcc aaa gtt ccc atg gcg gac 5004 Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp 1655 1660 1665 gac atc gca gtc gaa gcc gac tct ggt ggg cac acg gat aat cgg 5049 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1670 1675 1680 cct atg cac gtc att ttg ccc ctg ata att caa ctc cgc aat act 5094 Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Gln Leu Arg Asn Thr 1685 1690 1695 ata ctt gca gag tat ggc tgt gcc acg gct ttt cgt acc cgt ata 5139 Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala Phe Arg Thr Arg Ile 1700 1705 1710 ggc gct gga gga ggc att ggt tgt cct tca gcg gcc ctc gca gcc 5184 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala Ala Leu Ala Ala 1715 1720 1725 ttt gat atg ggt gcg agt ttt gtc gtg act gga agc ata aat caa 5229 Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser Ile Asn Gln 1730 1735 1740 att tgc cgc gag gca ggg act tgc gat act gtt cgg gag cta ctt 5274 Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu 1745 1750 1755 gcc aac tca agc tac tcg gac gtg acg atg gcg cca gca gca gac 5319 Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1760 1765 1770 atg ttt gac caa ggt gtg aaa ctc caa gtc tta aaa cga gga acg 5364 Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 1775 1780 1785 atg ttt cca agc aga gca aat aaa ctc cgg aag ctc ttt gtg aac 5409 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn 1790 1795 1800 tac gaa tct cta gaa aca ctc ccg tcg aaa gag ttg aaa tac ctg 5454 Tyr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu 1805 1810 1815 gaa aac atc ata ttc aag caa gca gta gac cag gtg tgg gag gaa 5499 Glu Asn Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu 1820 1825 1830 aca aag cgc ttt tac tgt gaa aaa ctg aac aat cca gat aaa att 5544 Thr Lys Arg Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile 1835 1840 1845 gca agg gcc atg aaa gat cct aaa ttg aag atg tcg ctt tgc ttt 5589 Ala Arg Ala Met Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe 1850 1855 1860 cgg tgg tat ctc tcc aag agc tct ggg tgg gcc aac gca gga att 5634 Arg Trp Tyr Leu Ser Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile 1865 1870 1875 aaa tct cgt gca ctc gac tac cag atc tgg tgt ggc ccg gca atg 5679 Lys Ser Arg Ala Leu Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met 1880 1885 1890 ggc tcg ttc aac aat ttc gcc agc ggc aca tcc ctc gat tgg aaa 5724 Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys 1895 1900 1905 gtg act ggg gtt ttc cct ggc gtt gcg gaa gta aac atg gcc att 5769 Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val Ala Glu Val Asn Met Ala Ile 1910 1915 1920 tta gat ggc gcg cga gaa cta gct gct aaa cga aat taa 5808 Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala Lys Arg Asn 1925 1930 1935 <210> 52 <211> 1935 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> The 'Xaa' at location 248 stands for Asp, Gly, Ala, or Val. <400> 52 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 Ala Ala Arg Asp Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp 500 505 510 Leu Glu Phe Leu Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys 515 520 525 Phe Val Glu Ser Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu 530 535 540 Thr Pro Glu Asp Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr 545 550 555 560 Met Asp Arg Ala Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val 565 570 575 Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg 580 585 590 Ala Arg Val Ala Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp 595 600 605 Thr Ala Ile Leu Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr 610 615 620 Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile 625 630 635 640 Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly 645 650 655 Asn Asn Ser Val Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln 660 665 670 Val Asn Arg Val Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly 675 680 685 Ser Ala Glu Ser Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys 690 695 700 Leu Ser His Pro Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe 705 710 715 720 Ala Gly Glu Gly Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys 725 730 735 Ala Pro Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp 740 745 750 Lys Glu Pro Thr Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser 755 760 765 Ser Leu Ser Asp Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg 770 775 780 Phe Ala Ala Phe Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala 785 790 795 800 Gln Leu Lys Gly Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly 805 810 815 Val Ala Val Gly Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala 820 825 830 Thr Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg 835 840 845 Tyr Leu Pro Ala Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala 850 855 860 Trp Gly Ser Asn Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys 865 870 875 880 Asn Gln Asn Glu Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser 885 890 895 His Thr Cys Phe Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu 900 905 910 His Asn Arg Thr Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile 915 920 925 His Gly Phe Asp Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu 930 935 940 Leu Glu Leu Val Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys 945 950 955 960 Leu Ile Gly Gln Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr 965 970 975 Leu Ser Leu Val Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu 980 985 990 Ala Ile Lys Gly Val Gln Arg Ser Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val 995 1000 1005 Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala 1010 1015 1020 Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Cys Gly 1025 1030 1035 Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro Gly Leu His Glu Asn 1040 1045 1050 Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu Gly Asp Gly Trp 1055 1060 1065 Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr Lys Ala Ile 1070 1075 1080 Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala Gly Ile 1085 1090 1095 Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu Gly 1100 1105 1110 Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 1115 1120 1125 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu 1130 1135 1140 Met Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu 1145 1150 1155 Ala Ile Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg 1160 1165 1170 Gly Ala Pro Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly 1175 1180 1185 Thr Arg Glu Glu Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr 1190 1195 1200 Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala 1205 1210 1215 Gly Lys Pro Asp Ala Cys Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser 1220 1225 1230 Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys 1235 1240 1245 Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu 1250 1255 1260 Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser Asp Cys Gln Leu Phe Ser 1265 1270 1275 Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser Thr Met Glu Ile Lys 1280 1285 1290 His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala Asp Phe Pro Gln 1295 1300 1305 Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val Phe Leu Glu 1310 1315 1320 Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn Ile Leu 1325 1330 1335 Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys Gly 1340 1345 1350 His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 1355 1360 1365 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro 1370 1375 1380 Asn Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val 1385 1390 1395 Glu Asp Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu 1400 1405 1410 Lys Glu Met Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro 1415 1420 1425 Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile 1430 1435 1440 Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser 1445 1450 1455 His Ser His Glu Glu Asn Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys 1460 1465 1470 Leu Asp Ser Val Ser Val Ala Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg 1475 1480 1485 Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe Arg Glu Met Tyr Asn Thr Arg 1490 1495 1500 Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 1505 1510 1515 Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser Tyr 1520 1525 1530 Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 1535 1540 1545 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu 1550 1555 1560 Ile His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp 1565 1570 1575 Leu Phe Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe 1580 1585 1590 Thr Thr Leu Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu 1595 1600 1605 Val Arg Arg Gln Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile 1610 1615 1620 Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro 1625 1630 1635 Ala Pro Gln Ile Ile Leu Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile 1640 1645 1650 Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp 1655 1660 1665 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1670 1675 1680 Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Gln Leu Arg Asn Thr 1685 1690 1695 Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala Phe Arg Thr Arg Ile 1700 1705 1710 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala Ala Leu Ala Ala 1715 1720 1725 Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser Ile Asn Gln 1730 1735 1740 Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu 1745 1750 1755 Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1760 1765 1770 Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 1775 1780 1785 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn 1790 1795 1800 Tyr Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu 1805 1810 1815 Glu Asn Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu 1820 1825 1830 Thr Lys Arg Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile 1835 1840 1845 Ala Arg Ala Met Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe 1850 1855 1860 Arg Trp Tyr Leu Ser Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile 1865 1870 1875 Lys Ser Arg Ala Leu Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met 1880 1885 1890 Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys 1895 1900 1905 Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val Ala Glu Val Asn Met Ala Ile 1910 1915 1920 Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala Lys Arg Asn 1925 1930 1935 <210> 53 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1500) <223> n = a c t or g <400> 53 atg caa ctt cct cca gcg cat tct gcc gat gag aat cgc atc gcg gtc 48 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 gtg ggc atg gcc gtc aaa tat gcg ggc tgt gac aat aaa gaa gag ttt 96 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 tgg aag act ttg atg aat ggt agt atc aat acc aag tcg att tcg gca 144 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 gca agg ttg ggc agc aat aag cgt gac gaa cac tat gtt cct gaa cga 192 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 tcg aaa tat gca gat acg ttc tgt aac gaa agg tac ggt tgt atc cag 240 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 caa ggt acg gat aat gag cat gac ctc ctc cta ggt ctt gct caa gaa 288 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 gct ctc gct gac gct gcc ggg cgg atg gag aaa caa cct tcg gag gcg 336 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 ttc gat ctg gaa aat act ggc atc gtg agt ggg tgc tta tct ttt cca 384 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 atg gat aac ctg caa gga gag ttg ttg aac ttg tat caa agc cat gtg 432 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 gag aaa caa ctt cca cct agt gcc ttg gta gaa gcc gtg aag ctt tgg 480 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 tct gag cga cag aaa tct acg aaa gca cat gca ggg gac aag cgc cgg 528 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 ttc att gac cca gct tct ttt gta gct gat aaa ctg aac cta ggc cca 576 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 cta cat tat gcg atc gat gca gca tgc gct tct gca ttg tac gtg tta 624 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 aaa tta gct caa gac cac ctt gtt tca ggt gcc gtt gat atg atg tta 672 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 tgt gga gcg acg tgc ttc cca gaa cca ttc ttc atc ttg tct ggg ttc 720 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 tcg act ttt caa gcg atg cct gnt ggg gca gat gga gtc tca cta cct 768 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 ctc cat aaa acg agt gct ggg ctc act cca ggt gaa ggg ggg tcc att 816 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 atg gtg ctc aag cga ctg aaa gac gct atc aga gat gga aat cac att 864 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 tat ggt gtg ctc ctt gaa gca aat tta agt aac gca ggt tgt ggg ctt 912 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 cca ctc agc ccg cac tta ccg agc gaa gaa tca tgt att cgt gat acc 960 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 tac cgc cgt gct gga gtt gct gca gat caa agt att cag tat att gag 1008 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 tgc cac gct acg gga acc cct cga ggg gat gtc gtg gaa att gag gcg 1056 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 gtt gaa aga gtt ttc aag aaa aac gtt cca cgc tta ggc tcg acg aaa 1104 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 gga aat ttt ggt cac tcg tta gtt gcg gct ggt ttc gca ggt atg gca 1152 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 aag ctt ctt ctt gca atg gaa cat gga gtg att cct ccc aca cca ggt 1200 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 ctt gat gct tcg aac cag gca agt gag cac gtt gtg aca aag gct atc 1248 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 act tgg cct gag aca cat ggg gct cca aaa cga gct ggc ctt tca gca 1296 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 ttt gga ttt ggt ggg act aat gcg cat gca ctc ttc gaa gag ttt aat 1344 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 gcc gag ggc ata agt tat cgc cct gga aag cct cca gtc gaa tcg aat 1392 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 acc cgt cct tcc gtc gta ata act ggg atg gac tgt acc ttt ggg agc 1440 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 ctt gaa ggg att gat gcg ttc gag act gcc ctg tac gag ggg cgt gac 1488 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 gca gct cgt gac 1500 Ala Ala Arg Asp 500 <210> 54 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> The 'Xaa' at location 248 stands for Asp, Gly, Ala, or Val. <400> 54 Met Gln Leu Pro Pro Ala His Ser Ala Asp Glu Asn Arg Ile Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Met Ala Val Lys Tyr Ala Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Phe 20 25 30 Trp Lys Thr Leu Met Asn Gly Ser Ile Asn Thr Lys Ser Ile Ser Ala 35 40 45 Ala Arg Leu Gly Ser Asn Lys Arg Asp Glu His Tyr Val Pro Glu Arg 50 55 60 Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Glu Arg Tyr Gly Cys Ile Gln 65 70 75 80 Gln Gly Thr Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ala Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Ala Ala Gly Arg Met Glu Lys Gln Pro Ser Glu Ala 100 105 110 Phe Asp Leu Glu Asn Thr Gly Ile Val Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro 115 120 125 Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr Gln Ser His Val 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Ser Ala Leu Val Glu Ala Val Lys Leu Trp 145 150 155 160 Ser Glu Arg Gln Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Gly Asp Lys Arg Arg 165 170 175 Phe Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asp Lys Leu Asn Leu Gly Pro 180 185 190 Leu His Tyr Ala Ile Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Leu Ala Gln Asp His Leu Val Ser Gly Ala Val Asp Met Met Leu 210 215 220 Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Glu Pro Phe Phe Ile Leu Ser Gly Phe 225 230 235 240 Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Xaa Gly Ala Asp Gly Val Ser Leu Pro 245 250 255 Leu His Lys Thr Ser Ala Gly Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ser Ile 260 265 270 Met Val Leu Lys Arg Leu Lys Asp Ala Ile Arg Asp Gly Asn His Ile 275 280 285 Tyr Gly Val Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu 290 295 300 Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Glu Ser Cys Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Arg Ala Gly Val Ala Ala Asp Gln Ser Ile Gln Tyr Ile Glu 325 330 335 Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Glu Ile Glu Ala 340 345 350 Val Glu Arg Val Phe Lys Lys Asn Val Pro Arg Leu Gly Ser Thr Lys 355 360 365 Gly Asn Phe Gly His Ser Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala 370 375 380 Lys Leu Leu Leu Ala Met Glu His Gly Val Ile Pro Pro Thr Pro Gly 385 390 395 400 Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ala Ser Glu His Val Val Thr Lys Ala Ile 405 410 415 Thr Trp Pro Glu Thr His Gly Ala Pro Lys Arg Ala Gly Leu Ser Ala 420 425 430 Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Ala Leu Phe Glu Glu Phe Asn 435 440 445 Ala Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Pro Val Glu Ser Asn 450 455 460 Thr Arg Pro Ser Val Val Ile Thr Gly Met Asp Cys Thr Phe Gly Ser 465 470 475 480 Leu Glu Gly Ile Asp Ala Phe Glu Thr Ala Leu Tyr Glu Gly Arg Asp 485 490 495 Ala Ala Arg Asp 500 <210> 55 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 55 tta ccc gcc aaa cgt tgg agg ttc cta ggt gag gac ttg gag ttt ctc 48 Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp Leu Glu Phe Leu 1 5 10 15 cga gcc atc agg ctc aag gaa aag cct agg ggt tgt ttt gtg gag agt 96 Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys Phe Val Glu Ser 20 25 30 gtt gac gtt aac ttt aga cgg ctg aaa acg ccc ttg aca cca gaa gat 144 Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu Thr Pro Glu Asp 35 40 45 atg ttg cgg ccc caa caa ctc ttg gcg gtt tct acg atg gac cga gca 192 Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr Met Asp Arg Ala 50 55 60 att atc gat gca ggt cta aag aag ggc caa cat gta gca gtt ctt gtt 240 Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val Ala Val Leu Val 65 70 75 80 ggc cta gga act gac ctg gaa ctt tac cgt cat cga gca aga gtc gcg 288 Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala 85 90 95 ctt aaa gag gtt ttg cac ccg agc tta aag tca gac act gca att ctc 336 Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp Thr Ala Ile Leu 100 105 110 cag aaa ata atg caa tat gtg aat gat gca gga act tcg act tca tac 384 Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 aca tct tac att gga aac ctc gtt gcc acg cgt att tcg tct cag tgg 432 Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile Ser Ser Gln Trp 130 135 140 gga ttc aca ggg ccg tcc ttt act gtc aca gaa gga aat aat tcc gtg 480 Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val 145 150 155 160 tac aga tgt gca caa cta gcc aaa gat atg ctt cag gtt aac cga gtt 528 Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Val Asn Arg Val 165 170 175 gat gct gtc gtc atc gca ggc gtt gat ctc aac gga agc gcc gaa agt 576 Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu Ser 180 185 190 ttt ttt gtc cga gca aat cgt caa aag ata tcc aag cta agt cat cca 624 Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys Leu Ser His Pro 195 200 205 tgt gca agc ttc gac aga gat gca gat gga ttt ttc gca ggt gag ggc 672 Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe Ala Gly Glu Gly 210 215 220 tgt ggt gcc cta gtt ttc aag agg tta gaa gac tgt gct cct cag gaa 720 Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys Ala Pro Gln Glu 225 230 235 240 aaa att tat gct agt ata gac tct atc gca ata gat aaa gag cct act 768 Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp Lys Glu Pro Thr 245 250 255 agc tca gct gtg aaa gct gtc tac caa agt gat tcg agt ctc tcc gat 816 Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser Ser Leu Ser Asp 260 265 270 att gag ctg tta gaa atc agt gga gac tcc aaa cgg ttt gca gca ttc 864 Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg Phe Ala Ala Phe 275 280 285 gaa ggc gct gtg gaa att caa tca agt gtg gaa gcc cag cta aaa gga 912 Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala Gln Leu Lys Gly 290 295 300 ctt tcc aaa gtc ctt gaa cct gca aaa ggc caa ggc gta gcg gtg gga 960 Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly Val Ala Val Gly 305 310 315 320 agt act cga gca acc gtt ggg gat ata ggg tat gct aca gga gcg gca 1008 Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala 325 330 335 agc ctg att aaa act gca ctc tgc tta tat aat cgc tac ctt ccg gca 1056 Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ala 340 345 350 tta gca aac tgg agt ggc cca tgt gaa cag tcc gcc tgg ggc tca aac 1104 Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala Trp Gly Ser Asn 355 360 365 atg ttc gtt tgc cat gaa aca cgg ccg tgg atg aaa aac cag aat gaa 1152 Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys Asn Gln Asn Glu 370 375 380 aag aga tgt gcc ctc att tct gga aca gat cca tct cat aca tgc ttt 1200 Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser His Thr Cys Phe 385 390 395 400 tcc ctc gta cta tcg gat act ggg tgt tat gaa gag cac aat cga acg 1248 Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu His Asn Arg Thr 405 410 415 tgc ttt gat gtg caa gcg cca cag cta gtt ctg ata cac gga ttc gat 1296 Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile His Gly Phe Asp 420 425 430 gga aaa act att gtg cgg cga ctt gaa gga tat ctc ctt gaa ctt gtt 1344 Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Glu Leu Val 435 440 445 gaa ggg cat gca agc cct tca gag tat ttc cac aaa ctg att gga caa 1392 Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys Leu Ile Gly Gln 450 455 460 agt cta ctt gag aac tcg aaa gaa agt aaa ctc aca ctt tcg ctt gtg 1440 Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr Leu Ser Leu Val 465 470 475 480 tgc aat ccg aac cag ctc caa aag gag ctc atg ctt gct atc aaa gga 1488 Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu Ala Ile Lys Gly 485 490 495 gta caa cga agc 1500 Val Gln Arg Ser 500 <210> 56 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 56 Leu Pro Ala Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Glu Asp Leu Glu Phe Leu 1 5 10 15 Arg Ala Ile Arg Leu Lys Glu Lys Pro Arg Gly Cys Phe Val Glu Ser 20 25 30 Val Asp Val Asn Phe Arg Arg Leu Lys Thr Pro Leu Thr Pro Glu Asp 35 40 45 Met Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ser Thr Met Asp Arg Ala 50 55 60 Ile Ile Asp Ala Gly Leu Lys Lys Gly Gln His Val Ala Val Leu Val 65 70 75 80 Gly Leu Gly Thr Asp Leu Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg Val Ala 85 90 95 Leu Lys Glu Val Leu His Pro Ser Leu Lys Ser Asp Thr Ala Ile Leu 100 105 110 Gln Lys Ile Met Gln Tyr Val Asn Asp Ala Gly Thr Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Ile Ser Ser Gln Trp 130 135 140 Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Asn Asn Ser Val 145 150 155 160 Tyr Arg Cys Ala Gln Leu Ala Lys Asp Met Leu Gln Val Asn Arg Val 165 170 175 Asp Ala Val Val Ile Ala Gly Val Asp Leu Asn Gly Ser Ala Glu Ser 180 185 190 Phe Phe Val Arg Ala Asn Arg Gln Lys Ile Ser Lys Leu Ser His Pro 195 200 205 Cys Ala Ser Phe Asp Arg Asp Ala Asp Gly Phe Phe Ala Gly Glu Gly 210 215 220 Cys Gly Ala Leu Val Phe Lys Arg Leu Glu Asp Cys Ala Pro Gln Glu 225 230 235 240 Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Asp Ser Ile Ala Ile Asp Lys Glu Pro Thr 245 250 255 Ser Ser Ala Val Lys Ala Val Tyr Gln Ser Asp Ser Ser Leu Ser Asp 260 265 270 Ile Glu Leu Leu Glu Ile Ser Gly Asp Ser Lys Arg Phe Ala Ala Phe 275 280 285 Glu Gly Ala Val Glu Ile Gln Ser Ser Val Glu Ala Gln Leu Lys Gly 290 295 300 Leu Ser Lys Val Leu Glu Pro Ala Lys Gly Gln Gly Val Ala Val Gly 305 310 315 320 Ser Thr Arg Ala Thr Val Gly Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Ala 325 330 335 Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu Tyr Asn Arg Tyr Leu Pro Ala 340 345 350 Leu Ala Asn Trp Ser Gly Pro Cys Glu Gln Ser Ala Trp Gly Ser Asn 355 360 365 Met Phe Val Cys His Glu Thr Arg Pro Trp Met Lys Asn Gln Asn Glu 370 375 380 Lys Arg Cys Ala Leu Ile Ser Gly Thr Asp Pro Ser His Thr Cys Phe 385 390 395 400 Ser Leu Val Leu Ser Asp Thr Gly Cys Tyr Glu Glu His Asn Arg Thr 405 410 415 Cys Phe Asp Val Gln Ala Pro Gln Leu Val Leu Ile His Gly Phe Asp 420 425 430 Gly Lys Thr Ile Val Arg Arg Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Glu Leu Val 435 440 445 Glu Gly His Ala Ser Pro Ser Glu Tyr Phe His Lys Leu Ile Gly Gln 450 455 460 Ser Leu Leu Glu Asn Ser Lys Glu Ser Lys Leu Thr Leu Ser Leu Val 465 470 475 480 Cys Asn Pro Asn Gln Leu Gln Lys Glu Leu Met Leu Ala Ile Lys Gly 485 490 495 Val Gln Arg Ser 500 <210> 57 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 57 atg tta aca ggg aag gat tgg gtc agt cca tca gga agt tgt ttt gcc 48 Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala 1 5 10 15 cca aat ccg tta tca agc gca aaa gtg gca ttc atg tac gga gaa ggc 96 Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly 20 25 30 cga agc ccg tac tgt ggt gta ggc ttg ggt cta cat cgt ttg tgg ccc 144 Arg Ser Pro Tyr Cys Gly Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro 35 40 45 ggt ctc cat gaa aat gtg aac aat aag aca gtc gat tta tgg acg gaa 192 Gly Leu His Glu Asn Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu 50 55 60 gga gat ggt tgg tta tat cct cga acg ttg aca cga gaa gag cat aca 240 Gly Asp Gly Trp Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr 65 70 75 80 aaa gcc atc gaa tct ttc aac gca aat caa att gaa atg ttt cgc gct 288 Lys Ala Ile Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala 85 90 95 ggg att ttc atc tca atg tgt cag aca gac tat gtc atg aat gtt ctc 336 Gly Ile Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu 100 105 110 ggt gtc cag cct aag gcc gga ttt ggg ctg agc ttg gga gaa att tca 384 Gly Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 115 120 125 atg ctc ttt gcg atg tca aag gag aac tgc agg cag tca cag gaa atg 432 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu Met 130 135 140 acc aat cgt ttg cgc ggt tct cca gtg tgg tct aac gag ctt gct atc 480 Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu Ala Ile 145 150 155 160 aac ttc aat gca att cgc aag tta tgg aaa atc ccc cga gga gct ccc 528 Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg Gly Ala Pro 165 170 175 tta gaa tcc ttt tgg caa gga tac ttg gtt cac ggc aca aga gaa gaa 576 Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly Thr Arg Glu Glu 180 185 190 gta gag cat gct att ggt ctt tct gag cct tat gta cgt ctg ctt att 624 Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr Val Arg Leu Leu Ile 195 200 205 gtg aac gat tca agg agt gcc ttg att gct gga aaa cca gac gcc tgt 672 Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro Asp Ala Cys 210 215 220 cag gca gta atc agt aga cta aac tcc aag ttc cct tct ctg ccg gta 720 Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val 225 230 235 240 aag caa gga atg att ggt cat tgc cca gaa gtt cgt gcg ttc atc aaa 768 Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys 245 250 255 gat att ggg tac atc cat gaa aca ctc cga att tcc aat gac tat tcg 816 Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser 260 265 270 gat tgt cag ctt ttc tca gcg gta acc aag ggc gca ctt gac agc tcc 864 Asp Cys Gln Leu Phe Ser Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser 275 280 285 aca atg gaa atc aaa cac ttt gtg gga gag gtc tac tcc cgg atc gca 912 Thr Met Glu Ile Lys His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala 290 295 300 gac ttt cct caa atc gtc aac acg gtg cat tcg gct ggt tat gac gta 960 Asp Phe Pro Gln Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 ttt ctt gag ctt ggc tgt gat gct tct aga tct gca gca gtt caa aac 1008 Phe Leu Glu Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn 325 330 335 att ctt ggt ggt caa gga aag ttc ttg tct aca gct att gac aaa aaa 1056 Ile Leu Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys 340 345 350 gga cac tcc gcc tgg tca caa gta ctt cgg gct acc gca tca tta gct 1104 Gly His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 355 360 365 gca cat cga gta ccg gga atc tca att ttg gat ttg ttt cac cca aat 1152 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro Asn 370 375 380 ttc cga gaa atg tgc tgt aca atg gca acc aca cct aaa gtg gaa gat 1200 Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val Glu Asp 385 390 395 400 aag ttc ctg cgc acg att caa atc aat ggt cgg ttt gaa aaa gaa atg 1248 Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu Lys Glu Met 405 410 415 att cac cta gaa gat aca aca tta agt tgc tta ccc gct cca agt gaa 1296 Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro Ala Pro Ser Glu 420 425 430 gca aat atc gca gct att caa tct cgg tca att cga tct gct gcg gcg 1344 Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile Arg Ser Ala Ala Ala 435 440 445 cgt tct gga caa tcc cat gat tgt gca tcc cat agc cat gaa gaa aat 1392 Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser His Ser His Glu Glu Asn 450 455 460 aag gat tca tgc cct gaa aag ctg aag ctt gat tct gtg tcc gtc gcc 1440 Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys Leu Asp Ser Val Ser Val Ala 465 470 475 480 ata aat ttc gac aat gat gac cgc att cag ctt ggg cac gcg ggt ttt 1488 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe 485 490 495 cgg gag atg tac 1500 Arg Glu Met Tyr 500 <210> 58 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 58 Met Leu Thr Gly Lys Asp Trp Val Ser Pro Ser Gly Ser Cys Phe Ala 1 5 10 15 Pro Asn Pro Leu Ser Ser Ala Lys Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly 20 25 30 Arg Ser Pro Tyr Cys Gly Val Gly Leu Gly Leu His Arg Leu Trp Pro 35 40 45 Gly Leu His Glu Asn Val Asn Asn Lys Thr Val Asp Leu Trp Thr Glu 50 55 60 Gly Asp Gly Trp Leu Tyr Pro Arg Thr Leu Thr Arg Glu Glu His Thr 65 70 75 80 Lys Ala Ile Glu Ser Phe Asn Ala Asn Gln Ile Glu Met Phe Arg Ala 85 90 95 Gly Ile Phe Ile Ser Met Cys Gln Thr Asp Tyr Val Met Asn Val Leu 100 105 110 Gly Val Gln Pro Lys Ala Gly Phe Gly Leu Ser Leu Gly Glu Ile Ser 115 120 125 Met Leu Phe Ala Met Ser Lys Glu Asn Cys Arg Gln Ser Gln Glu Met 130 135 140 Thr Asn Arg Leu Arg Gly Ser Pro Val Trp Ser Asn Glu Leu Ala Ile 145 150 155 160 Asn Phe Asn Ala Ile Arg Lys Leu Trp Lys Ile Pro Arg Gly Ala Pro 165 170 175 Leu Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val His Gly Thr Arg Glu Glu 180 185 190 Val Glu His Ala Ile Gly Leu Ser Glu Pro Tyr Val Arg Leu Leu Ile 195 200 205 Val Asn Asp Ser Arg Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro Asp Ala Cys 210 215 220 Gln Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ser Lys Phe Pro Ser Leu Pro Val 225 230 235 240 Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Arg Ala Phe Ile Lys 245 250 255 Asp Ile Gly Tyr Ile His Glu Thr Leu Arg Ile Ser Asn Asp Tyr Ser 260 265 270 Asp Cys Gln Leu Phe Ser Ala Val Thr Lys Gly Ala Leu Asp Ser Ser 275 280 285 Thr Met Glu Ile Lys His Phe Val Gly Glu Val Tyr Ser Arg Ile Ala 290 295 300 Asp Phe Pro Gln Ile Val Asn Thr Val His Ser Ala Gly Tyr Asp Val 305 310 315 320 Phe Leu Glu Leu Gly Cys Asp Ala Ser Arg Ser Ala Ala Val Gln Asn 325 330 335 Ile Leu Gly Gly Gln Gly Lys Phe Leu Ser Thr Ala Ile Asp Lys Lys 340 345 350 Gly His Ser Ala Trp Ser Gln Val Leu Arg Ala Thr Ala Ser Leu Ala 355 360 365 Ala His Arg Val Pro Gly Ile Ser Ile Leu Asp Leu Phe His Pro Asn 370 375 380 Phe Arg Glu Met Cys Cys Thr Met Ala Thr Thr Pro Lys Val Glu Asp 385 390 395 400 Lys Phe Leu Arg Thr Ile Gln Ile Asn Gly Arg Phe Glu Lys Glu Met 405 410 415 Ile His Leu Glu Asp Thr Thr Leu Ser Cys Leu Pro Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Asn Ile Ala Ala Ile Gln Ser Arg Ser Ile Arg Ser Ala Ala Ala 435 440 445 Arg Ser Gly Gln Ser His Asp Cys Ala Ser His Ser His Glu Glu Asn 450 455 460 Lys Asp Ser Cys Pro Glu Lys Leu Lys Leu Asp Ser Val Ser Val Ala 465 470 475 480 Ile Asn Phe Asp Asn Asp Asp Arg Ile Gln Leu Gly His Ala Gly Phe 485 490 495 Arg Glu Met Tyr 500 <210> 59 <211> 1305 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1305) <400> 59 aat aca aga tat agc ttg tac aca ggg gcg atg gca aag gga att gca 48 Asn Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 1 5 10 15 tct gca gat ctt gtc att gcc gct ggg aaa gag ggc atc cta gct tcc 96 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser 20 25 30 tat gga gct gga gga cta cct ctt gct act gtt cga aag gga ata gac 144 Tyr Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 35 40 45 aaa att caa caa gcc ttg cca agt ggc cca tat gct gta aat ctt att 192 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 50 55 60 cac tct ccc ttt gac ggc aac ttg gag cag gga aac gtc gat ttg ttc 240 His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp Leu Phe 65 70 75 80 ttg gaa aag aac gtc cgc gtg gcg gaa tgt tcc gcg ttt aca acg cta 288 Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe Thr Thr Leu 85 90 95 aca gtg cca gta gta cac tat cgt gct gca ggg ctt gtt cgg cgc caa 336 Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Val Arg Arg Gln 100 105 110 gat gga agc att ttg atc aag aac cga atc att gct aaa gta tct agg 384 Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile Ala Lys Val Ser Arg 115 120 125 aca gaa ctc gct gag atg ttc ctt cgt ccg gca cct caa atc atc ctc 432 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro Ala Pro Gln Ile Ile Leu 130 135 140 gaa aaa ctg gta gca gca gaa atc att tca tct gac caa gcg cgt atg 480 Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met 145 150 155 160 gca gcc aaa gtt ccc atg gcg gac gac atc gca gtc gaa gcc gac tct 528 Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 165 170 175 ggt ggg cac acg gat aat cgg cct atg cac gtc att ttg ccc ctg ata 576 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile 180 185 190 att caa ctc cgc aat act ata ctt gca gag tat ggc tgt gcc acg gct 624 Ile Gln Leu Arg Asn Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala 195 200 205 ttt cgt acc cgt ata ggc gct gga gga ggc att ggt tgt cct tca gcg 672 Phe Arg Thr Arg Ile Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala 210 215 220 gcc ctc gca gcc ttt gat atg ggt gcg agt ttt gtc gtg act gga agc 720 Ala Leu Ala Ala Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser 225 230 235 240 ata aat caa att tgc cgc gag gca ggg act tgc gat act gtt cgg gag 768 Ile Asn Gln Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu 245 250 255 cta ctt gcc aac tca agc tac tcg gac gtg acg atg gcg cca gca gca 816 Leu Leu Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala 260 265 270 gac atg ttt gac caa ggt gtg aaa ctc caa gtc tta aaa cga gga acg 864 Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 275 280 285 atg ttt cca agc aga gca aat aaa ctc cgg aag ctc ttt gtg aac tac 912 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn Tyr 290 295 300 gaa tct cta gaa aca ctc ccg tcg aaa gag ttg aaa tac ctg gaa aac 960 Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Glu Asn 305 310 315 320 atc ata ttc aag caa gca gta gac cag gtg tgg gag gaa aca aag cgc 1008 Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu Thr Lys Arg 325 330 335 ttt tac tgt gaa aaa ctg aac aat cca gat aaa att gca agg gcc atg 1056 Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile Ala Arg Ala Met 340 345 350 aaa gat cct aaa ttg aag atg tcg ctt tgc ttt cgg tgg tat ctc tcc 1104 Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 355 360 365 aag agc tct ggg tgg gcc aac gca gga att aaa tct cgt gca ctc gac 1152 Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile Lys Ser Arg Ala Leu Asp 370 375 380 tac cag atc tgg tgt ggc ccg gca atg ggc tcg ttc aac aat ttc gcc 1200 Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala 385 390 395 400 agc ggc aca tcc ctc gat tgg aaa gtg act ggg gtt ttc cct ggc gtt 1248 Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val 405 410 415 gcg gaa gta aac atg gcc att tta gat ggc gcg cga gaa cta gct gct 1296 Ala Glu Val Asn Met Ala Ile Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala 420 425 430 aaa cga aat 1305 Lys Arg Asn 435 <210> 60 <211> 435 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 60 Asn Thr Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala 1 5 10 15 Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Glu Gly Ile Leu Ala Ser 20 25 30 Tyr Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ala Thr Val Arg Lys Gly Ile Asp 35 40 45 Lys Ile Gln Gln Ala Leu Pro Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 50 55 60 His Ser Pro Phe Asp Gly Asn Leu Glu Gln Gly Asn Val Asp Leu Phe 65 70 75 80 Leu Glu Lys Asn Val Arg Val Ala Glu Cys Ser Ala Phe Thr Thr Leu 85 90 95 Thr Val Pro Val Val His Tyr Arg Ala Ala Gly Leu Val Arg Arg Gln 100 105 110 Asp Gly Ser Ile Leu Ile Lys Asn Arg Ile Ile Ala Lys Val Ser Arg 115 120 125 Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Leu Arg Pro Ala Pro Gln Ile Ile Leu 130 135 140 Glu Lys Leu Val Ala Ala Glu Ile Ile Ser Ser Asp Gln Ala Arg Met 145 150 155 160 Ala Ala Lys Val Pro Met Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser 165 170 175 Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Met His Val Ile Leu Pro Leu Ile 180 185 190 Ile Gln Leu Arg Asn Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Cys Ala Thr Ala 195 200 205 Phe Arg Thr Arg Ile Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Ser Ala 210 215 220 Ala Leu Ala Ala Phe Asp Met Gly Ala Ser Phe Val Val Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ile Asn Gln Ile Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Asp Thr Val Arg Glu 245 250 255 Leu Leu Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Asp Val Thr Met Ala Pro Ala Ala 260 265 270 Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Lys Leu Gln Val Leu Lys Arg Gly Thr 275 280 285 Met Phe Pro Ser Arg Ala Asn Lys Leu Arg Lys Leu Phe Val Asn Tyr 290 295 300 Glu Ser Leu Glu Thr Leu Pro Ser Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Glu Asn 305 310 315 320 Ile Ile Phe Lys Gln Ala Val Asp Gln Val Trp Glu Glu Thr Lys Arg 325 330 335 Phe Tyr Cys Glu Lys Leu Asn Asn Pro Asp Lys Ile Ala Arg Ala Met 340 345 350 Lys Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Ser 355 360 365 Lys Ser Ser Gly Trp Ala Asn Ala Gly Ile Lys Ser Arg Ala Leu Asp 370 375 380 Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala Met Gly Ser Phe Asn Asn Phe Ala 385 390 395 400 Ser Gly Thr Ser Leu Asp Trp Lys Val Thr Gly Val Phe Pro Gly Val 405 410 415 Ala Glu Val Asn Met Ala Ile Leu Asp Gly Ala Arg Glu Leu Ala Ala 420 425 430 Lys Arg Asn 435 <210> 61 <211> 4410 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(4410) <400> 61 atg ggc ccg cga gtg gcg tca ggc aag gtg ccg gct tgg gag atg agc 48 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 aag tcc gag ctg tgt gat gac cgc acg gta gtc ttt gac tat gag gag 96 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 ctg ctg gag ttc gct gag ggc gat atc agt aag gtt ttt ggg ccg gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 ttc aaa gtg gtg gac ggg ttt agg cgc agg gtg agg ttg ccc gct cga 192 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 gag tac ctg ctg gtg acc cgg gtt acg ctg atg gat gcc gag gtg ggc 240 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 aac ttt cga gtg gga gca cgt atg gtg aca gag tat gac gta cct gtg 288 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 aac gga gag ctc tcg gaa ggg gga gat gtg ccg tgg gct gtg ttg gtg 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gaa gcc ggg cag tgc gac ttg ctg cta att tct tac atg ggc atc gat 384 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag tgc aaa gga gag cgg gtc tac cgg ctg ctg aac acc acc ttg 432 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acg ttt ttt ggc gtc gcg aaa gaa ggg gaa acg ctt gtg tac gat att 480 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acg ggt ttc gcc aag agg ccg gac gga gat atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttt ttc gaa tat gat tgc tac tgc aat ggc aag ctt ctc atc gaa atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cga gat ggc tct gca ggc ttc ttc acg gac gaa gag ctc gct gcc ggc 624 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 aaa gga gtg gtc gtc act cgt gca cag caa aac atg cgg gac aaa att 672 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 gta cgg cag tcc att gag cct ttt gca ctg gcg gct tgc acg cac aaa 720 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 acg act ctg aac gag agt gac atg cag tcc ctt gtg gag cga aac tgg 768 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 gca aac gtt ttt ggc acc agt aac aag atg gcg gag ctc aac tat aaa 816 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 att tgc gcc agg aaa atg ctc atg atc gac agg gtt acc cac att gac 864 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 cac cac ggt ggg gcg tat ggc ctc gga cta ctt gtt gga gag aag atc 912 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 ttg gat cga aac cat tgg tac ttt cct tgt cac ttt gtc aat gat caa 960 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 gtc atg gca ggg tca ctg gtc agc gat ggt tgc agc cag ctc tta aaa 1008 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 ctc tat atg atc tgg ctt ggc ctc cac ctg aaa atg gag gaa ttt gat 1056 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 ttt ctc cca gtt agc ggc cac aaa aac aag gtg cga tgc agg gga caa 1104 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 att tca ccg cat aaa ggc aag ctt gtc tac gtc atg gaa atc aaa aag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 atg ggt tac gat caa gca tct gga agc cca tac gcc atc gcg gac gtt 1200 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 gat atc att gac gtc aac gaa gag ctg ggt caa agt ttt gac atc aac 1248 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 gac ctt gcg agc tac gga aaa ggt gac ctg agc aaa aaa atc gtg gtt 1296 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 gac ttc aaa gga att gct ttg cag ctc aaa ggc cgc gct ttt tca cgc 1344 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 atg agt tcc agc tcg tcc ttg aac gaa gga tgg caa tgt gtt cca aaa 1392 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 cca agc cag aga atg gaa cac gaa cag ccc cct gct cac tgc ctt gca 1440 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 agc gac ccc gaa gcc cct tca act gtg acc tgg cac cca atg tca aag 1488 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 ctt cct ggc aac cct acg ccg ttc ttc tcc cct tca tct tac cct ccg 1536 Leu Pro Gly Asn Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro 500 505 510 agg gca att tgc ttc atc cct ttc ccg ggc aat ccc ctt gac aac aac 1584 Arg Ala Ile Cys Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn 515 520 525 tgc aag gct gga gaa atg ccc ctg aac tgg tac aac atg tca gag ttc 1632 Cys Lys Ala Gly Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe 530 535 540 atg tgt ggc aag gtt tct aac tgc ttg ggc cca gaa ttc gca cgc ttt 1680 Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe 545 550 555 560 gac aag tcg aac acc agc cgg agc cct gct ttt gac ttg gct ctg gtg 1728 Asp Lys Ser Asn Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val 565 570 575 acc cga gtt gtt gaa gtc aca aac atg gaa cac ggc aag ttt cta aac 1776 Thr Arg Val Val Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn 580 585 590 gtt gat tgc aat cca agc aaa ggc aca atg gtg ggg gag ttt gac tgt 1824 Val Asp Cys Asn Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys 595 600 605 ccc caa gac gcg tgg ttc ttt gat ggt tcg tgc aac gac ggc cat atg 1872 Pro Gln Asp Ala Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met 610 615 620 ccg tat tcc att atc atg gaa atc gga ctg caa acc tca ggt gtt ctc 1920 Pro Tyr Ser Ile Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu 625 630 635 640 acc tcg gtg ttg aag gca ccg ctg act atg gac aag gat gac att ctc 1968 Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu 645 650 655 ttt cga aac ctc gat gca agt gct gaa atg gtg cgt cca gac gtg gat 2016 Phe Arg Asn Leu Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp 660 665 670 gtt cgc ggc aaa acg att cga aac gtg acc aag tgt acc ggc tat gca 2064 Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala 675 680 685 atg ttg gga aag atg ggg att cac cgg ttc acg ttt gag ttg agc gtt 2112 Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val 690 695 700 gac ggc gtg gta ttt tat aaa gga tcc act tcc ttt gga tgg ttc act 2160 Asp Gly Val Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr 705 710 715 720 ccc gag gtg ttt gct cag caa gct gga ctc gac aac ggg aaa aag acg 2208 Pro Glu Val Phe Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr 725 730 735 gag ccc tgg tgc aag act aac aac acc tcg gtt cga aga gtt gaa atc 2256 Glu Pro Trp Cys Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile 740 745 750 gca tcc gcc aaa gga aaa gag cag ctg act gag aag ctt ccc gac gca 2304 Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala 755 760 765 act aat gct caa gtt ctt cgg cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat 2352 Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp 770 775 780 tac ctc aat att gcc cct gac tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc 2400 Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala 785 790 795 800 cac gga cac aaa gac gtt aac ccg caa gac tgg ttc ttc tct tgc cac 2448 His Gly His Lys Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His 805 810 815 ttt tgg ttc gat cct gta atg cca gga tct tta gga att gaa tca atg 2496 Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met 820 825 830 ttc cag ctt atc gag gcc ttt gcg gtg gac caa aac att cct gga gag 2544 Phe Gln Leu Ile Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu 835 840 845 tac aac gta tcc aat ccg acc ttt gcc cat gca cca ggc aaa acg gcg 2592 Tyr Asn Val Ser Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala 850 855 860 tgg aaa tac cga ggc cag ctc aca cca aag aac cgt gcg atg gac tgc 2640 Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys 865 870 875 880 gag gtg cat atc gtt tca att acc gcc tcc ccc gag aac ggg ggc tac 2688 Glu Val His Ile Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr 885 890 895 gtt gac atc gtg gcc gat gga gcg ctt tgg gta gat gga ctt cgc gtg 2736 Val Asp Ile Val Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val 900 905 910 tac gaa gcc aaa gag ctt cga gtt cgt gtc gtt tcg gca aaa cct caa 2784 Tyr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln 915 920 925 gca att ccg gat gta caa caa cag cca cct agc gca aag gcg gac ccg 2832 Ala Ile Pro Asp Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro 930 935 940 ggg aaa aca gga gtt gca ctt tcg ccc act cag cta cgc gac gtc ctg 2880 Gly Lys Thr Gly Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu 945 950 955 960 ctt gaa gtg gac aat cca ttg tat ctt ggt gta gag aac tcc aat ttg 2928 Leu Glu Val Asp Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu 965 970 975 gtg cag ttt gag tcg aaa cct gca act tct tca cgt atc gtt tcg atc 2976 Val Gln Phe Glu Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile 980 985 990 aaa ccg tgc tcg att agt gac ctt ggc gat aag tct ttt atg gaa acg 3024 Lys Pro Cys Ser Ile Ser Asp Leu Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr 995 1000 1005 tac aac gtg tca gca cct ctg tat act gga gca atg gcc aag ggc 3069 Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly 1010 1015 1020 att gca tcc gcc gac ttg gtc att gct gct ggg aaa cgc aag ata 3114 Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Arg Lys Ile 1025 1030 1035 ctt gga tcg ttt ggt gcg gga ggg ctg cct att tcc ata gtc cgt 3159 Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ile Ser Ile Val Arg 1040 1045 1050 gaa gca ctg gag aaa att caa caa cac ctg ccc cac ggc ccc tac 3204 Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro His Gly Pro Tyr 1055 1060 1065 gct gtt aac ctc att cac tcg cct ttc gac agc aac ttg gaa aag 3249 Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys 1070 1075 1080 ggc aac gtt gac ctc ttt ctc gag atg ggc gtg aca gtg gta gaa 3294 Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val Val Glu 1085 1090 1095 tgc agc gcg ttc atg gaa ctc acg gcc cag gtt gtc cgg tac cgc 3339 Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr Arg 1100 1105 1110 gcg tct ggt cta agc aaa agt gcg gac ggt tcg att cgc att gct 3384 Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 1115 1120 1125 cac cgt att att ggc aag gtt tcc aga acc gag ctg gca gaa atg 3429 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met 1130 1135 1140 ttt att cgt cca gca cca cag cac ctc ctc caa aaa ctc gta gcc 3474 Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala 1145 1150 1155 tcc ggc gag ctg aca gct gag caa gcc gag ctt gca aca cag gtt 3519 Ser Gly Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val 1160 1165 1170 ccg gtg gcg gat gac att gcg gtc gaa gcc gac tcg ggg ggg cat 3564 Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 1175 1180 1185 acc gac aac agg cct att cac gtc att ctt cct cta atc atc aac 3609 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn 1190 1195 1200 cta cgc aac cgt ttg cat aaa gag ctt gac tac cct tcg cat ctc 3654 Leu Arg Asn Arg Leu His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu 1205 1210 1215 cgg gta cgt gtg ggt gct ggt ggt ggt att gga tgt cct caa gcc 3699 Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 1220 1225 1230 gct ctt gca gca ttt caa atg ggg gca gcg ttt tta atc act gga 3744 Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly 1235 1240 1245 acg gtg aac cag ctt gct cgt gaa agt ggc act tgt gac aac gtc 3789 Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val 1250 1255 1260 cgg tta cag ctc tca aag gcc acg tat agc gac gtg tgt atg gct 3834 Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala 1265 1270 1275 cct gct gcc gat atg ttt gac caa ggc gtg gag ctg caa gta ttg 3879 Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu 1280 1285 1290 aag aaa ggc acg ctg ttc cca agt cgt gct aag aag ctg tac gag 3924 Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Tyr Glu 1295 1300 1305 ctg ttc tgc aag tat gac tcg ttt gag gca atg ccg gct gaa gaa 3969 Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Glu Glu 1310 1315 1320 ttg caa cgg gtt gaa aag cgg att ttt caa aag tcg ctt gct gaa 4014 Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu Ala Glu 1325 1330 1335 gtt tgg cag gag acc agt gac ttt tac att cat cgt atc aag aac 4059 Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys Asn 1340 1345 1350 cct gag aaa atc aat cgt gct gca agc gat ggc aaa ctg aaa atg 4104 Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 1355 1360 1365 tcg ctt tgc ttt cgc tgg tac ctt ggg ctt tcc tca ttt tgg gcc 4149 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala 1370 1375 1380 aac tct ggg gca caa gat cgc gtc atg gac tat caa att tgg tgt 4194 Asn Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 1385 1390 1395 ggc cct gct att ggc gct ttc aat gat ttt acc aag ggc acg tac 4239 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr 1400 1405 1410 ctt gac gtg act gtt gca aag agt tac cct tgt gtg gca cag atc 4284 Leu Asp Val Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile 1415 1420 1425 aat ttg caa att ttg caa gga gct gcg tat ctg aaa cgc ctt ggt 4329 Asn Leu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly 1430 1435 1440 gtc att cgt ttt gac cgc atg ctg ctg cag gcc gtc gat atc gac 4374 Val Ile Arg Phe Asp Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp 1445 1450 1455 gat cct gta ttt act tac gtg ccg acc cag cca ctt 4410 Asp Pro Val Phe Thr Tyr Val Pro Thr Gln Pro Leu 1460 1465 1470 <210> 62 <211> 1470 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 62 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 Leu Pro Gly Asn Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro 500 505 510 Arg Ala Ile Cys Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn 515 520 525 Cys Lys Ala Gly Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe 530 535 540 Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe 545 550 555 560 Asp Lys Ser Asn Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val 565 570 575 Thr Arg Val Val Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn 580 585 590 Val Asp Cys Asn Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys 595 600 605 Pro Gln Asp Ala Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met 610 615 620 Pro Tyr Ser Ile Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu 625 630 635 640 Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu 645 650 655 Phe Arg Asn Leu Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp 660 665 670 Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala 675 680 685 Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val 690 695 700 Asp Gly Val Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr 705 710 715 720 Pro Glu Val Phe Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr 725 730 735 Glu Pro Trp Cys Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile 740 745 750 Ala Ser Ala Lys Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala 755 760 765 Thr Asn Ala Gln Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp 770 775 780 Tyr Leu Asn Ile Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala 785 790 795 800 His Gly His Lys Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His 805 810 815 Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met 820 825 830 Phe Gln Leu Ile Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu 835 840 845 Tyr Asn Val Ser Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala 850 855 860 Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys 865 870 875 880 Glu Val His Ile Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr 885 890 895 Val Asp Ile Val Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val 900 905 910 Tyr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln 915 920 925 Ala Ile Pro Asp Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro 930 935 940 Gly Lys Thr Gly Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu 945 950 955 960 Leu Glu Val Asp Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu 965 970 975 Val Gln Phe Glu Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile 980 985 990 Lys Pro Cys Ser Ile Ser Asp Leu Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr 995 1000 1005 Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly 1010 1015 1020 Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala Ala Gly Lys Arg Lys Ile 1025 1030 1035 Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ile Ser Ile Val Arg 1040 1045 1050 Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro His Gly Pro Tyr 1055 1060 1065 Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn Leu Glu Lys 1070 1075 1080 Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val Val Glu 1085 1090 1095 Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr Arg 1100 1105 1110 Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 1115 1120 1125 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met 1130 1135 1140 Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala 1145 1150 1155 Ser Gly Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val 1160 1165 1170 Pro Val Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His 1175 1180 1185 Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn 1190 1195 1200 Leu Arg Asn Arg Leu His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu 1205 1210 1215 Arg Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala 1220 1225 1230 Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly 1235 1240 1245 Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val 1250 1255 1260 Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr Ser Asp Val Cys Met Ala 1265 1270 1275 Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu 1280 1285 1290 Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Tyr Glu 1295 1300 1305 Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Glu Glu 1310 1315 1320 Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu Ala Glu 1325 1330 1335 Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys Asn 1340 1345 1350 Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 1355 1360 1365 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala 1370 1375 1380 Asn Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 1385 1390 1395 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr 1400 1405 1410 Leu Asp Val Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile 1415 1420 1425 Asn Leu Gln Ile Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly 1430 1435 1440 Val Ile Arg Phe Asp Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp 1445 1450 1455 Asp Pro Val Phe Thr Tyr Val Pro Thr Gln Pro Leu 1460 1465 1470 <210> 63 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 63 atg ggc ccg cga gtg gcg tca ggc aag gtg ccg gct tgg gag atg agc 48 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 aag tcc gag ctg tgt gat gac cgc acg gta gtc ttt gac tat gag gag 96 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 ctg ctg gag ttc gct gag ggc gat atc agt aag gtt ttt ggg ccg gag 144 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 ttc aaa gtg gtg gac ggg ttt agg cgc agg gtg agg ttg ccc gct cga 192 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 gag tac ctg ctg gtg acc cgg gtt acg ctg atg gat gcc gag gtg ggc 240 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 aac ttt cga gtg gga gca cgt atg gtg aca gag tat gac gta cct gtg 288 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 aac gga gag ctc tcg gaa ggg gga gat gtg ccg tgg gct gtg ttg gtg 336 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 gaa gcc ggg cag tgc gac ttg ctg cta att tct tac atg ggc atc gat 384 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 ttc cag tgc aaa gga gag cgg gtc tac cgg ctg ctg aac acc acc ttg 432 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 acg ttt ttt ggc gtc gcg aaa gaa ggg gaa acg ctt gtg tac gat att 480 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 cgc gtc acg ggt ttc gcc aag agg ccg gac gga gat atc tcc atg ttc 528 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 ttt ttc gaa tat gat tgc tac tgc aat ggc aag ctt ctc atc gaa atg 576 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 cga gat ggc tct gca ggc ttc ttc acg gac gaa gag ctc gct gcc ggc 624 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 aaa gga gtg gtc gtc act cgt gca cag caa aac atg cgg gac aaa att 672 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 gta cgg cag tcc att gag cct ttt gca ctg gcg gct tgc acg cac aaa 720 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 acg act ctg aac gag agt gac atg cag tcc ctt gtg gag cga aac tgg 768 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 gca aac gtt ttt ggc acc agt aac aag atg gcg gag ctc aac tat aaa 816 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 att tgc gcc agg aaa atg ctc atg atc gac agg gtt acc cac att gac 864 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 cac cac ggt ggg gcg tat ggc ctc gga cta ctt gtt gga gag aag atc 912 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 ttg gat cga aac cat tgg tac ttt cct tgt cac ttt gtc aat gat caa 960 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 gtc atg gca ggg tca ctg gtc agc gat ggt tgc agc cag ctc tta aaa 1008 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 ctc tat atg atc tgg ctt ggc ctc cac ctg aaa atg gag gaa ttt gat 1056 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 ttt ctc cca gtt agc ggc cac aaa aac aag gtg cga tgc agg gga caa 1104 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 att tca ccg cat aaa ggc aag ctt gtc tac gtc atg gaa atc aaa aag 1152 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 atg ggt tac gat caa gca tct gga agc cca tac gcc atc gcg gac gtt 1200 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 gat atc att gac gtc aac gaa gag ctg ggt caa agt ttt gac atc aac 1248 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 gac ctt gcg agc tac gga aaa ggt gac ctg agc aaa aaa atc gtg gtt 1296 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 gac ttc aaa gga att gct ttg cag ctc aaa ggc cgc gct ttt tca cgc 1344 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 atg agt tcc agc tcg tcc ttg aac gaa gga tgg caa tgt gtt cca aaa 1392 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 cca agc cag aga atg gaa cac gaa cag ccc cct gct cac tgc ctt gca 1440 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 agc gac ccc gaa gcc cct tca act gtg acc tgg cac cca atg tca aag 1488 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 ctt cct ggc aac 1500 Leu Pro Gly Asn 500 <210> 64 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 64 Met Gly Pro Arg Val Ala Ser Gly Lys Val Pro Ala Trp Glu Met Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Leu Cys Asp Asp Arg Thr Val Val Phe Asp Tyr Glu Glu 20 25 30 Leu Leu Glu Phe Ala Glu Gly Asp Ile Ser Lys Val Phe Gly Pro Glu 35 40 45 Phe Lys Val Val Asp Gly Phe Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Tyr Leu Leu Val Thr Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Gly 65 70 75 80 Asn Phe Arg Val Gly Ala Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val 85 90 95 Asn Gly Glu Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val 100 105 110 Glu Ala Gly Gln Cys Asp Leu Leu Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp 115 120 125 Phe Gln Cys Lys Gly Glu Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Phe Phe Gly Val Ala Lys Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile 145 150 155 160 Arg Val Thr Gly Phe Ala Lys Arg Pro Asp Gly Asp Ile Ser Met Phe 165 170 175 Phe Phe Glu Tyr Asp Cys Tyr Cys Asn Gly Lys Leu Leu Ile Glu Met 180 185 190 Arg Asp Gly Ser Ala Gly Phe Phe Thr Asp Glu Glu Leu Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Gly Val Val Val Thr Arg Ala Gln Gln Asn Met Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Val Arg Gln Ser Ile Glu Pro Phe Ala Leu Ala Ala Cys Thr His Lys 225 230 235 240 Thr Thr Leu Asn Glu Ser Asp Met Gln Ser Leu Val Glu Arg Asn Trp 245 250 255 Ala Asn Val Phe Gly Thr Ser Asn Lys Met Ala Glu Leu Asn Tyr Lys 260 265 270 Ile Cys Ala Arg Lys Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Ile Asp 275 280 285 His His Gly Gly Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile 290 295 300 Leu Asp Arg Asn His Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Met Ala Gly Ser Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys 325 330 335 Leu Tyr Met Ile Trp Leu Gly Leu His Leu Lys Met Glu Glu Phe Asp 340 345 350 Phe Leu Pro Val Ser Gly His Lys Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln 355 360 365 Ile Ser Pro His Lys Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Lys 370 375 380 Met Gly Tyr Asp Gln Ala Ser Gly Ser Pro Tyr Ala Ile Ala Asp Val 385 390 395 400 Asp Ile Ile Asp Val Asn Glu Glu Leu Gly Gln Ser Phe Asp Ile Asn 405 410 415 Asp Leu Ala Ser Tyr Gly Lys Gly Asp Leu Ser Lys Lys Ile Val Val 420 425 430 Asp Phe Lys Gly Ile Ala Leu Gln Leu Lys Gly Arg Ala Phe Ser Arg 435 440 445 Met Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asn Glu Gly Trp Gln Cys Val Pro Lys 450 455 460 Pro Ser Gln Arg Met Glu His Glu Gln Pro Pro Ala His Cys Leu Ala 465 470 475 480 Ser Asp Pro Glu Ala Pro Ser Thr Val Thr Trp His Pro Met Ser Lys 485 490 495 Leu Pro Gly Asn 500 <210> 65 <211> 1500 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1500) <400> 65 cct acg ccg ttc ttc tcc cct tca tct tac cct ccg agg gca att tgc 48 Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro Arg Ala Ile Cys 1 5 10 15 ttc atc cct ttc ccg ggc aat ccc ctt gac aac aac tgc aag gct gga 96 Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn Cys Lys Ala Gly 20 25 30 gaa atg ccc ctg aac tgg tac aac atg tca gag ttc atg tgt ggc aag 144 Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys 35 40 45 gtt tct aac tgc ttg ggc cca gaa ttc gca cgc ttt gac aag tcg aac 192 Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Lys Ser Asn 50 55 60 acc agc cgg agc cct gct ttt gac ttg gct ctg gtg acc cga gtt gtt 240 Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Val 65 70 75 80 gaa gtc aca aac atg gaa cac ggc aag ttt cta aac gtt gat tgc aat 288 Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn Val Asp Cys Asn 85 90 95 cca agc aaa ggc aca atg gtg ggg gag ttt gac tgt ccc caa gac gcg 336 Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Gln Asp Ala 100 105 110 tgg ttc ttt gat ggt tcg tgc aac gac ggc cat atg ccg tat tcc att 384 Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met Pro Tyr Ser Ile 115 120 125 atc atg gaa atc gga ctg caa acc tca ggt gtt ctc acc tcg gtg ttg 432 Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu 130 135 140 aag gca ccg ctg act atg gac aag gat gac att ctc ttt cga aac ctc 480 Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu 145 150 155 160 gat gca agt gct gaa atg gtg cgt cca gac gtg gat gtt cgc ggc aaa 528 Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Lys 165 170 175 acg att cga aac gtg acc aag tgt acc ggc tat gca atg ttg gga aag 576 Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala Met Leu Gly Lys 180 185 190 atg ggg att cac cgg ttc acg ttt gag ttg agc gtt gac ggc gtg gta 624 Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Val Val 195 200 205 ttt tat aaa gga tcc act tcc ttt gga tgg ttc act ccc gag gtg ttt 672 Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr Pro Glu Val Phe 210 215 220 gct cag caa gct gga ctc gac aac ggg aaa aag acg gag ccc tgg tgc 720 Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Pro Trp Cys 225 230 235 240 aag act aac aac acc tcg gtt cga aga gtt gaa atc gca tcc gcc aaa 768 Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile Ala Ser Ala Lys 245 250 255 gga aaa gag cag ctg act gag aag ctt ccc gac gca act aat gct caa 816 Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala Thr Asn Ala Gln 260 265 270 gtt ctt cgg cgt tca gag cag tgt gaa tac ctc gat tac ctc aat att 864 Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile 275 280 285 gcc cct gac tct ggg ctg cat ggg aag ggc tac gcc cac gga cac aaa 912 Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala His Gly His Lys 290 295 300 gac gtt aac ccg caa gac tgg ttc ttc tct tgc cac ttt tgg ttc gat 960 Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp 305 310 315 320 cct gta atg cca gga tct tta gga att gaa tca atg ttc cag ctt atc 1008 Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu Ile 325 330 335 gag gcc ttt gcg gtg gac caa aac att cct gga gag tac aac gta tcc 1056 Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Asn Val Ser 340 345 350 aat ccg acc ttt gcc cat gca cca ggc aaa acg gcg tgg aaa tac cga 1104 Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala Trp Lys Tyr Arg 355 360 365 ggc cag ctc aca cca aag aac cgt gcg atg gac tgc gag gtg cat atc 1152 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys Glu Val His Ile 370 375 380 gtt tca att acc gcc tcc ccc gag aac ggg ggc tac gtt gac atc gtg 1200 Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Asp Ile Val 385 390 395 400 gcc gat gga gcg ctt tgg gta gat gga ctt cgc gtg tac gaa gcc aaa 1248 Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Glu Ala Lys 405 410 415 gag ctt cga gtt cgt gtc gtt tcg gca aaa cct caa gca att ccg gat 1296 Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln Ala Ile Pro Asp 420 425 430 gta caa caa cag cca cct agc gca aag gcg gac ccg ggg aaa aca gga 1344 Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro Gly Lys Thr Gly 435 440 445 gtt gca ctt tcg ccc act cag cta cgc gac gtc ctg ctt gaa gtg gac 1392 Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu Leu Glu Val Asp 450 455 460 aat cca ttg tat ctt ggt gta gag aac tcc aat ttg gtg cag ttt gag 1440 Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu Val Gln Phe Glu 465 470 475 480 tcg aaa cct gca act tct tca cgt atc gtt tcg atc aaa ccg tgc tcg 1488 Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile Lys Pro Cys Ser 485 490 495 att agt gac ctt 1500 Ile Ser Asp Leu 500 <210> 66 <211> 500 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 66 Pro Thr Pro Phe Phe Ser Pro Ser Ser Tyr Pro Pro Arg Ala Ile Cys 1 5 10 15 Phe Ile Pro Phe Pro Gly Asn Pro Leu Asp Asn Asn Cys Lys Ala Gly 20 25 30 Glu Met Pro Leu Asn Trp Tyr Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys 35 40 45 Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Lys Ser Asn 50 55 60 Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Val 65 70 75 80 Glu Val Thr Asn Met Glu His Gly Lys Phe Leu Asn Val Asp Cys Asn 85 90 95 Pro Ser Lys Gly Thr Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Gln Asp Ala 100 105 110 Trp Phe Phe Asp Gly Ser Cys Asn Asp Gly His Met Pro Tyr Ser Ile 115 120 125 Ile Met Glu Ile Gly Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu 130 135 140 Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu 145 150 155 160 Asp Ala Ser Ala Glu Met Val Arg Pro Asp Val Asp Val Arg Gly Lys 165 170 175 Thr Ile Arg Asn Val Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ala Met Leu Gly Lys 180 185 190 Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Val Val 195 200 205 Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Thr Pro Glu Val Phe 210 215 220 Ala Gln Gln Ala Gly Leu Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Pro Trp Cys 225 230 235 240 Lys Thr Asn Asn Thr Ser Val Arg Arg Val Glu Ile Ala Ser Ala Lys 245 250 255 Gly Lys Glu Gln Leu Thr Glu Lys Leu Pro Asp Ala Thr Asn Ala Gln 260 265 270 Val Leu Arg Arg Ser Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile 275 280 285 Ala Pro Asp Ser Gly Leu His Gly Lys Gly Tyr Ala His Gly His Lys 290 295 300 Asp Val Asn Pro Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe Asp 305 310 315 320 Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu Ile 325 330 335 Glu Ala Phe Ala Val Asp Gln Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Asn Val Ser 340 345 350 Asn Pro Thr Phe Ala His Ala Pro Gly Lys Thr Ala Trp Lys Tyr Arg 355 360 365 Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Arg Ala Met Asp Cys Glu Val His Ile 370 375 380 Val Ser Ile Thr Ala Ser Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Asp Ile Val 385 390 395 400 Ala Asp Gly Ala Leu Trp Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Glu Ala Lys 405 410 415 Glu Leu Arg Val Arg Val Val Ser Ala Lys Pro Gln Ala Ile Pro Asp 420 425 430 Val Gln Gln Gln Pro Pro Ser Ala Lys Ala Asp Pro Gly Lys Thr Gly 435 440 445 Val Ala Leu Ser Pro Thr Gln Leu Arg Asp Val Leu Leu Glu Val Asp 450 455 460 Asn Pro Leu Tyr Leu Gly Val Glu Asn Ser Asn Leu Val Gln Phe Glu 465 470 475 480 Ser Lys Pro Ala Thr Ser Ser Arg Ile Val Ser Ile Lys Pro Cys Ser 485 490 495 Ile Ser Asp Leu 500 <210> 67 <211> 1410 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <400> 67 ggc gat aag tct ttt atg gaa acg tac aac gtg tca gca cct ctg tat 48 Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr 1 5 10 15 act gga gca atg gcc aag ggc att gca tcc gcc gac ttg gtc att gct 96 Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala 20 25 30 gct ggg aaa cgc aag ata ctt gga tcg ttt ggt gcg gga ggg ctg cct 144 Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 35 40 45 att tcc ata gtc cgt gaa gca ctg gag aaa att caa caa cac ctg ccc 192 Ile Ser Ile Val Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro 50 55 60 cac ggc ccc tac gct gtt aac ctc att cac tcg cct ttc gac agc aac 240 His Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 65 70 75 80 ttg gaa aag ggc aac gtt gac ctc ttt ctc gag atg ggc gtg aca gtg 288 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val 85 90 95 gta gaa tgc agc gcg ttc atg gaa ctc acg gcc cag gtt gtc cgg tac 336 Val Glu Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr 100 105 110 cgc gcg tct ggt cta agc aaa agt gcg gac ggt tcg att cgc att gct 384 Arg Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 115 120 125 cac cgt att att ggc aag gtt tcc aga acc gag ctg gca gaa atg ttt 432 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe 130 135 140 att cgt cca gca cca cag cac ctc ctc caa aaa ctc gta gcc tcc ggc 480 Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 gag ctg aca gct gag caa gcc gag ctt gca aca cag gtt ccg gtg gcg 528 Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val Pro Val Ala 165 170 175 gat gac att gcg gtc gaa gcc gac tcg ggg ggg cat acc gac aac agg 576 Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 180 185 190 cct att cac gtc att ctt cct cta atc atc aac cta cgc aac cgt ttg 624 Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu 195 200 205 cat aaa gag ctt gac tac cct tcg cat ctc cgg gta cgt gtg ggt gct 672 His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala 210 215 220 ggt ggt ggt att gga tgt cct caa gcc gct ctt gca gca ttt caa atg 720 Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met 225 230 235 240 ggg gca gcg ttt tta atc act gga acg gtg aac cag ctt gct cgt gaa 768 Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu 245 250 255 agt ggc act tgt gac aac gtc cgg tta cag ctc tca aag gcc acg tat 816 Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr 260 265 270 agc gac gtg tgt atg gct cct gct gcc gat atg ttt gac caa ggc gtg 864 Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val 275 280 285 gag ctg caa gta ttg aag aaa ggc acg ctg ttc cca agt cgt gct aag 912 Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys 290 295 300 aag ctg tac gag ctg ttc tgc aag tat gac tcg ttt gag gca atg ccg 960 Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro 305 310 315 320 gct gaa gaa ttg caa cgg gtt gaa aag cgg att ttt caa aag tcg ctt 1008 Ala Glu Glu Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu 325 330 335 gct gaa gtt tgg cag gag acc agt gac ttt tac att cat cgt atc aag 1056 Ala Glu Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys 340 345 350 aac cct gag aaa atc aat cgt gct gca agc gat ggc aaa ctg aaa atg 1104 Asn Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 355 360 365 tcg ctt tgc ttt cgc tgg tac ctt ggg ctt tcc tca ttt tgg gcc aac 1152 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn 370 375 380 tct ggg gca caa gat cgc gtc atg gac tat caa att tgg tgt ggc cct 1200 Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro 385 390 395 400 gct att ggc gct ttc aat gat ttt acc aag ggc acg tac ctt gac gtg 1248 Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Val 405 410 415 act gtt gca aag agt tac cct tgt gtg gca cag atc aat ttg caa att 1296 Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile Asn Leu Gln Ile 420 425 430 ttg caa gga gct gcg tat ctg aaa cgc ctt ggt gtc att cgt ttt gac 1344 Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Ile Arg Phe Asp 435 440 445 cgc atg ctg ctg cag gcc gtc gat atc gac gat cct gta ttt act tac 1392 Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp Asp Pro Val Phe Thr Tyr 450 455 460 gtg ccg acc cag cca ctt 1410 Val Pro Thr Gln Pro Leu 465 470 <210> 68 <211> 470 <212> PRT <213> Thraustochytrium sp. <400> 68 Gly Asp Lys Ser Phe Met Glu Thr Tyr Asn Val Ser Ala Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 35 40 45 Ile Ser Ile Val Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile Gln Gln His Leu Pro 50 55 60 His Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ser Asn 65 70 75 80 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Met Gly Val Thr Val 85 90 95 Val Glu Cys Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Ala Gln Val Val Arg Tyr 100 105 110 Arg Ala Ser Gly Leu Ser Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ile Arg Ile Ala 115 120 125 His Arg Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe 130 135 140 Ile Arg Pro Ala Pro Gln His Leu Leu Gln Lys Leu Val Ala Ser Gly 145 150 155 160 Glu Leu Thr Ala Glu Gln Ala Glu Leu Ala Thr Gln Val Pro Val Ala 165 170 175 Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 180 185 190 Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Ile Asn Leu Arg Asn Arg Leu 195 200 205 His Lys Glu Leu Asp Tyr Pro Ser His Leu Arg Val Arg Val Gly Ala 210 215 220 Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Ala Ala Phe Gln Met 225 230 235 240 Gly Ala Ala Phe Leu Ile Thr Gly Thr Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu 245 250 255 Ser Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Leu Gln Leu Ser Lys Ala Thr Tyr 260 265 270 Ser Asp Val Cys Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Asp Gln Gly Val 275 280 285 Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Leu Phe Pro Ser Arg Ala Lys 290 295 300 Lys Leu Tyr Glu Leu Phe Cys Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro 305 310 315 320 Ala Glu Glu Leu Gln Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Gln Lys Ser Leu 325 330 335 Ala Glu Val Trp Gln Glu Thr Ser Asp Phe Tyr Ile His Arg Ile Lys 340 345 350 Asn Pro Glu Lys Ile Asn Arg Ala Ala Ser Asp Gly Lys Leu Lys Met 355 360 365 Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn 370 375 380 Ser Gly Ala Gln Asp Arg Val Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro 385 390 395 400 Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Leu Asp Val 405 410 415 Thr Val Ala Lys Ser Tyr Pro Cys Val Ala Gln Ile Asn Leu Gln Ile 420 425 430 Leu Gln Gly Ala Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Gly Val Ile Arg Phe Asp 435 440 445 Arg Met Leu Leu Gln Ala Val Asp Ile Asp Asp Pro Val Phe Thr Tyr 450 455 460 Val Pro Thr Gln Pro Leu 465 470 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 69 ggyatgmtgr ttggtgaagg 20 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 70 trttsasrta ytgygaacct tg 22 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = a c g or t <400> 71 atgkcngaag gttgtggcca 20 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 72 ccwgaratra agccrttdgg ttg 23 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 cggggtaccc gggagccgcc ttggctttgt 30 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 aaactgcagc ccgggtccag ctggcaggca ccctg 35 <210> 75 <211> 798 <212> DNA <213> Shewanella olleyana <400> 75 atggcagaag gttgtggcca attattgcag ttcttcatgc tgcacattgg tatgcacacc 60 ttagttgaaa acggacgttt ccagccttta gaaaatgctt cacaaaaagt acgttgtcgt 120 ggccaagtac tgccacaaca tggtgaactg acgtaccgca tggaagtcac agaaattggt 180 actcaccctc gcccatacgc caaagccaat attgaaatat tgctcaatgg taaagcggtc 240 gtggacttcc aaaatcttgg ggtgatgatt aaagaagaag gtgaatgtac tcgttacact 300 gccgactcta ctgaaacaca tacaacctca ggcacagtcc aaaaaaacaa cagccacaac 360 acaccagcat cattaaatgc accgttaatg gcacaagtgc cagacttaag tgaaccagcc 420 aataaaggcg ttatcccgct gcaacatgtt gaagcgccta tgctgccaga ctacccaaat 480 cgaacccctg atacgctgcc gttcaccgcg taccatatgt ttgagtttgc aacaggtgac 540 atcgaaaact gttttggacc tgactttagt atttaccggg gctttattcc gccgcgcacg 600 ccatgtggtg acttacagct aacaacccgt gttgttgata ttcaaggtaa acgtggcgag 660 cttaaaaaac cgtcatcgtg tatcgctgaa tatgaagtgc caaccgatgc gtggtatttt 720 gctaaaaaca gtcacgcttc agtgatgcct tactcggtat taatggaaat atcactgcaa 780 cccaacggct tcatctca 798 <210> 76 <211> 1042 <212> DNA <213> Shewanella olleyana <400> 76 ggcatgatgg ttggtgaagg tatcggcatg gtagcactta agcgcctaga agatgctgag 60 cgtgatggcg accgtattta ttctgtgatt aaaggtgtcg gcgcttcatc agacggtaaa 120 tttaagagta tttatgcacc gcgccctgaa ggccaagcaa aagcattaaa acgagcttat 180 gatgacgctg gttttgcccc tgaaacagtt ggcttaatcg aagctcacgg tacgggtact 240 gctgcaggtg atgtagccga atttaacggc cttaaatctg tatttggtga aaacgatcca 300 actaagcaac acatcgcttt aggttcagtg aaatcacaag tgggtcacac gaaatcaacc 360 gctggtactg ctggcgtgat taaagctgcc cttgccctgc accataaagt attgccaccg 420 accattaacg tctctaagcc aaaccctaag cttaatgttg aggattcacc gtttttcgtt 480 aataccgaaa cacgcccatg gatgcctcgc cctgacggca ctcctcgccg tgctggtatt 540 agctcgttcg gttttggtgg aactaacttc cacttagtat tagaagaata cacccctgag 600 cacagccatg atgagaaata ccgtcaacgc caagtggctc aaagcttatt aatgagtgct 660 gataataaag cagccttgat tgcagaagtg aataagctaa ctgcagacat cagcgcgctt 720 aaaggcacag ataacagcag cattgaacaa gctgaacttg ctcgcattgc taaactatat 780 gctgttcgca ccatagatac ttcagcagcc cgtttaggtc ttgtggtatc aagccttaat 840 gaattaacca ctcagcttgg tttagcgtta aagcagctta ataatgatgt tgatgcatgg 900 caactgccat cagggactag ctaccgctct tcagcactca tcacgattaa tgcaaaccaa 960 aaggcgacta aaggtaaaaa agcgactaac gcaccgaaag ttgcagcatt gtttgcaggt 1020 caaggttcac aatacctcaa ca 1042 <210> 77 <211> 806 <212> DNA <213> Shewanella japonica <400> 77 atggcggaag gttgtggcca attactgcaa ttctttatgc tgcacattgg tatgcacacg 60 ctcgttgaaa atggccgttt ccaaccactt gaaaatgctt cacaaaaagt gcgttgtcgt 120 ggtcaagttc tgccgcagca cggtgaactg acttaccgga tggaaatcac tgaaattggc 180 attcaccctc gcccatatgc caaagcgaat attgatattt tgcttaacgg taaagcggtt 240 gtcgacttcc aaaacttagg tgtcatgatc aaagaagaaa gcgaatgtac gcgctacctt 300 aatgatacgc ccgctgtcga tgcctcagct gatcgaatta attcagcaac caataatatt 360 ctatacccag cggcttcaac caatgcgcca ctcatggctc aactgcctga tttgaatgcc 420 ccaacgaata aaggcgttat cccactgcaa catgttgaag cgccgataat tccagattat 480 ccaaatcgta ctcctgatac cctgccattc acggcgtatc acatgttcga atttgccact 540 ggcaatattg aaaactgctt tggaccggac tttagtattt accgtggttt cattccaccg 600 cgcacaccat gtggcgactt acagctaacg actcgtattg ttgatattca aggtaaacgt 660 ggcgaattga aaaagccatc atcgtgtatc gcagaatatg aagtgccaac tgatgcatgg 720 tatttcgcta aaaacagcca cgcctcggtc ataccttatt cagtgttgat ggaaatttca 780 ctgcaaccca atggcttcat ctcagg 806 <210> 78 <211> 1042 <212> DNA <213> Shewanella japonica <400> 78 ggtatgctgg ttggtgaagg cattggcatg gtggcattaa aacgtcttga agatgctgag 60 cgtgacggtg accgtattta ctcagtcatt aaaggggtcg gcgcttcatc tgatggtaag 120 ttcaaatcaa tttatgcacc tcgacctgaa ggccaagcta aagcgctgaa gcgtgcttat 180 gatgacgccg gctttgcacc tgaaaccgtt ggcttaattg aagctcacgg aacaggcact 240 gcagcgggtg atgtggcaga atttaatggt cttaaatctg tatttggtga gaatgactca 300 acaaagcaac acattgcttt aggttcagtt aagtcacaag tgggccatac taaatcaact 360 gcgggaaccg cgggtgtgat taaagcggcg ttagcactgc atcataaagt gctgccgcca 420 accatcaacg tctctaagcc taaccctaag cttaatgttg aggattcacc gtttttcatt 480 aacactgaaa ctcgcccttg gatgcctcgc cctgatggca caccacgccg agctggtata 540 agttcgttcg gttttggtgg cacaaacttc cacttagtac tagaagaata cagcccagag 600 cacagccgtg atgagaaata tcgtcagcgc caagtagcac aaagcttatt gattagcgct 660 gacaataaag ctgagctcat tgcagaaatc aacaagctta acgctgacat cagcgcgctt 720 aaaggcacag ataacagcag catcgaacaa gctgaacttg cccgcattgc taaactatat 780 gctgttcgca ctttagatac ttcagcagtc cgtttgggtc ttgtggtctc aagccttaat 840 gaattaacca ctcaacttgg tttagcgtta aagcagctaa gtaacgacgc tgaagcatgg 900 caattaccat caggtacgag ctatcgctca tctgcgctca tcacgattaa tgccaaccaa 960 aagacgacta aaggtaaaaa agcagctaac acaccgaaag tagcagcatt atttgcaggt 1020 caaggttcgc aatatctcaa ca 1042 <210> 79 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> restriction enzyme site <400> 79 catatg 6 <210> 80 <211> 192 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> BspHI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (188)..(192) <223> SacII restriction site <400> 80 tcatgaagcc ggttgctccg aagttctacg cgcgtctcaa cattgacgag caggacgaga 60 cccgtgatcc gatcctcaac aaggacaacg cgccgtcttc cagctctagc tcctcttcca 120 gctcttccag ctcttccagc ccgtcgccag ctccgtccgc cccagtgcaa aagaaggctg 180 ctccggccgc gg 192 <210> 81 <211> 717 <212> DNA <213> Nostoc sp. <220> <221> CDS <222> (4)..(714) <400> 81 taa ttg ttg cag cat act tgg cta cca aaa ccc cca aat tta acc tta 48 Leu Leu Gln His Thr Trp Leu Pro Lys Pro Pro Asn Leu Thr Leu 1 5 10 15 ttg tca gat gaa gtt cat ctc tgg cgc att ccc ctt gac caa cca gaa 96 Leu Ser Asp Glu Val His Leu Trp Arg Ile Pro Leu Asp Gln Pro Glu 20 25 30 tca cag cta cag gat tta gcc gct acc tta tct agt gac gaa tta gcc 144 Ser Gln Leu Gln Asp Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ser Asp Glu Leu Ala 35 40 45 cgt gca aac aga ttt tat ttt ccc gaa cat cgc cgg cgt ttt act gct 192 Arg Ala Asn Arg Phe Tyr Phe Pro Glu His Arg Arg Arg Phe Thr Ala 50 55 60 ggt cgt ggt att ctc cgc agt atc ttg ggg ggc tat ttg ggt gtg gaa 240 Gly Arg Gly Ile Leu Arg Ser Ile Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Val Glu 65 70 75 cca ggg caa gtt aaa ttt gat tat gaa tcc cgt ggt aaa cca ata tta 288 Pro Gly Gln Val Lys Phe Asp Tyr Glu Ser Arg Gly Lys Pro Ile Leu 80 85 90 95 ggc gat cgc ttt gcc gag agt ggt tta tta ttt aac ttg tca cac tcc 336 Gly Asp Arg Phe Ala Glu Ser Gly Leu Leu Phe Asn Leu Ser His Ser 100 105 110 cag aac ttg gcc ttg tgt gca gtc aat tac acg cgc caa atc ggc atc 384 Gln Asn Leu Ala Leu Cys Ala Val Asn Tyr Thr Arg Gln Ile Gly Ile 115 120 125 gat tta gaa tat ctc cgc ccc aca tct gat tta gaa tcc ctt gcc aaa 432 Asp Leu Glu Tyr Leu Arg Pro Thr Ser Asp Leu Glu Ser Leu Ala Lys 130 135 140 agg ttc ttt tta ccg cga gaa tat gaa tta ttg cga tcg cta ccc gat 480 Arg Phe Phe Leu Pro Arg Glu Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Asp 145 150 155 gag caa aaa caa aaa att ttc ttt cgt tac tgg act tgt aaa gag gct 528 Glu Gln Lys Gln Lys Ile Phe Phe Arg Tyr Trp Thr Cys Lys Glu Ala 160 165 170 175 tat ctt aaa gca acg ggt gac ggc atc gct aaa tta gag gaa att gaa 576 Tyr Leu Lys Ala Thr Gly Asp Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Ile Glu 180 185 190 ata gca cta act ccc aca gaa cca gct aag tta cag aca gct cca gcg 624 Ile Ala Leu Thr Pro Thr Glu Pro Ala Lys Leu Gln Thr Ala Pro Ala 195 200 205 tgg agt ctc cta gag cta gtg cca gat gat aat tgt gtt gct gct gtt 672 Trp Ser Leu Leu Glu Leu Val Pro Asp Asp Asn Cys Val Ala Ala Val 210 215 220 gcc gtg gcg ggt ttt ggc tgg cag cca aaa ttc tgg cat tat tga 717 Ala Val Ala Gly Phe Gly Trp Gln Pro Lys Phe Trp His Tyr 225 230 235 <210> 82 <211> 237 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 82 Leu Leu Gln His Thr Trp Leu Pro Lys Pro Pro Asn Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Asp Glu Val His Leu Trp Arg Ile Pro Leu Asp Gln Pro Glu Ser 20 25 30 Gln Leu Gln Asp Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ser Asp Glu Leu Ala Arg 35 40 45 Ala Asn Arg Phe Tyr Phe Pro Glu His Arg Arg Arg Phe Thr Ala Gly 50 55 60 Arg Gly Ile Leu Arg Ser Ile Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Val Glu Pro 65 70 75 80 Gly Gln Val Lys Phe Asp Tyr Glu Ser Arg Gly Lys Pro Ile Leu Gly 85 90 95 Asp Arg Phe Ala Glu Ser Gly Leu Leu Phe Asn Leu Ser His Ser Gln 100 105 110 Asn Leu Ala Leu Cys Ala Val Asn Tyr Thr Arg Gln Ile Gly Ile Asp 115 120 125 Leu Glu Tyr Leu Arg Pro Thr Ser Asp Leu Glu Ser Leu Ala Lys Arg 130 135 140 Phe Phe Leu Pro Arg Glu Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Asp Glu 145 150 155 160 Gln Lys Gln Lys Ile Phe Phe Arg Tyr Trp Thr Cys Lys Glu Ala Tyr 165 170 175 Leu Lys Ala Thr Gly Asp Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Ile Glu Ile 180 185 190 Ala Leu Thr Pro Thr Glu Pro Ala Lys Leu Gln Thr Ala Pro Ala Trp 195 200 205 Ser Leu Leu Glu Leu Val Pro Asp Asp Asn Cys Val Ala Ala Val Ala 210 215 220 Val Ala Gly Phe Gly Trp Gln Pro Lys Phe Trp His Tyr 225 230 235

Claims (114)

  1. a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
    b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
    c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
    d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 한 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
    e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및
    f) (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 핵산 서열과 완전히 상보적인 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열.
  2. 제 1항에 있어서,
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열; 및
    b) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
  3. 제 1항에 있어서,
    서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
  4. 제 1항에 있어서,
    서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
  5. 제 1항에 있어서,
    서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
  6. 제 1항에 있어서,
    서열번호: 38, 서열번호: 40, 서열번호: 42, 서열번호: 44, 서열번호: 47, 서열번호: 49, 서열번호: 51, 서열번호: 53, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 서열번호: 65 및 서열번호: 67로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  7. 제 1항에 따른 핵산 분자가 적어도 하나의 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 핵산 분자.
  8. 제 7항에 따른 재조합 핵산 분자로 형질감염된 재조합 세포.
  9. 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하되, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인으로는
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열;
    b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되,
    PKS 시스템의 활성에 영향을 미치도록 PKS 시스템을 발현하는 유전적으로 변형된 미생물.
  10. 제 9항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    b) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  11. 제 9항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  12. 제 9항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  13. 제 9항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 미생물은 적어도 하나의 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질감염됨으로써 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 미생물은 트라우스토카이트리인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 미생물은 스키조카이트리움인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 미생물은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 재조합으로 발현하도록 추가로 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 비박테리아의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템은 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  20. 제 9항에 있어서,
    상기 미생물은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 내인적으로 발현하되, 유전적 변형은 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 있는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 미생물은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 재조합으로 발현하도록 추가로 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 비박테리아의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템은 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  24. 제 9항에 있어서,
    상기 미생물은 내인적으로 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PUFA PKS 시스템을 발현하되, 유전적 변형은 제 2의 PKS 시스템 유래의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자 및 내인성 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재조합 핵산 분자의 발현을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  25. 제 24항에 있어서,
    제 2의 PKS 시스템 유래의 생물학적으로 활성인 도메인은
    a) 트라우스토카이트리드 미생물 유래의 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템의 도메인;
    b) (i) 적어도 하나의 PUFA를 제조하는 미생물을 선택하는 단계; 및
    (ii) 발효 배지 중 약 5% 이상의 용존 산소 포화 농도에서 미생물에 의한 PUFA 제조와 비교하였을 때 발효 배지 중 약 5% 이하의 용존 산소 포화 농도에서 증가된 PUFA를 제조하는 능력을 가진 미생물을 동정하는 단계 (i)에 의해 동정된 미생물로부터 유래된 PUFA PKS 시스템의 도메인;
    c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호:13, 서열번호:18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 도메인;
    d) (c)의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 재조합 핵산 분자는 포스포판테테인 트랜스퍼라제를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  27. 제 24항에 있어서,
    상기 제 2의 PKS 시스템은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 비박테리아의 PUFA PKS 시스템은 진핵 생물의 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 진핵 생물의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템은 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 미생물.
  31. 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하되, 상기 도메인으로는
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열;
    b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 PKS 시스템을 재조합으로 발현하도록 유전적으로 변형된 식물.
  32. 제 31항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    b) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  33. 제 31항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  34. 제 31항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  35. 제 31항에 있어서,
    PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66 및 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  36. 제 31항에 있어서,
    상기 식물은 박테리아의 PUFA PKS 시스템, 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템에서 유래된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자를 재조합으로 발현하도록 추가로 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 비박테리아의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  38. 제 37항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템은 스키조카이트리움 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 식물.
  39. 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하되, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인으로는
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열;
    b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 PKS 시스템을 발현하는 유전적으로 변형된 유기체를 생활성 분자를 제조하기에 효과적인 조건하에서 배양하는 단계를 포함한 폴리케타이드 신타제 시스템에 의해 제조되는 생활성 분자를 제조하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 내인적으로 발현하되, 유전적 변형은 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 유전적으로 변형되지 않는 PUFA PKS 시스템을 가진 유기체와 비교하였을 때 내인성 PKS 시스템에 의해 제조되는 적어도 하나의 생산물을 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 39항에 있어서,
    유기체는 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 PKS 시스템을 내인적으로 발현하되, 유전적 변형은 제 2의 PKS 시스템에서 유래된 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자와 PUFA PKS 시스템의 활성에 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재조합 핵산 분자로 유기체를 형질감염시킨 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 PUFA 제조에 영향을 미치도록 유전적으로 변형되지 않은 유기체와 비교하였을 때 내인성 PKS 시스템에 의해 제조되는 적어도 하나의 생산물을 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질감염됨으로써 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 유전적 변형이 없는 천연적으로 존재하는 유기체와는 상이한 다중불포화 지방산(PUFA) 프로필을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 내인적으로 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 발현하되, 유전적 변형은 상기 비박테리아의 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 상이한 PKS 시스템에서 유래된 도메인으로 치환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 PUFA PKS 시스템에 의해 제조되는 지방산의 쇄 길이를 조절하는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자로 유기체를 형질감염시킴으로써 변형된 비박테리아의 PUFA PKS 시스템을 내인적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 39항에 있어서,
    상기 생활성 분자는 항염증 제형, 화학 요법제, 활성 부형제, 골다공증 약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파이로리 약, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약, 퇴행성 간 질환의 치료를 위한 약, 항생제 및 콜레스테롤 저하 제형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 39항에 있어서,
    상기 생활성 분자는 항생제인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 39항에 있어서,
    상기 생활성 분자는 다중불포화 지방산(PUFA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 39항에 있어서,
    상기 생활성 분자는 시스 배형의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 39항에 있어서,
    상기 생활성 분자는 매 세 번째 탄소마다 이중 결합을 포함하는 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 39항에 있어서,
    상기 유기체는 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 포함하는 PKS 시스템을 발현하도록 식물의 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하되, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인으로는
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열;
    b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 천연적으로 존재하는 식물과는 상이한 다중불포화 지방산(PUFA) 프로필을 가진 식물을 제조하는 방법.
  56. PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자를 발현하는 재조합 숙주 세포에 의해 제조된 오일을 최종 산물에 첨가하는 단계를 포함하되, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인으로는
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열;
    b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    (d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 지방산을 포함하는 최종 생산물을 변형시키는 방법.
  57. 제 56항에 있어서,
    상기 최종 생산물은 식이 보조제, 식료품, 약제학적 제형, 인성화된 동물의 밀크 및 분유로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서,
    상기 약제학적 제형은 항염증 제형, 화학 요법제, 활성 부형제, 골다공증 약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파이로리 약, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약, 퇴행성 간 질환의 치료를 위한 약, 항생제, 콜레스테롤 저해 제형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 56항에 있어서,
    최종 생산물은 만성 염증, 급성 염증, 위장관계 질환, 암, 카켁시아, 심장의 재협착증, 신경퇴행성 질환, 간의 퇴행성 질환, 혈액 리피드 질환, 골다공증, 동맥경화, 자가면역 질환, 자간전증, 조산, 노화와 연관된 황발변증, 호흡기계 질환 및 퍼옥시조말 질환으로부터 선택된 용태를 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 핵산 분자로 밀크를 제조하는 동물의 밀크를 제조하는 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하되, 상기 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은
    a) 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열;
    (b) 서열번호: 39, 서열번호: 43, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 56 및 서열번호: 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    (c) 서열번호: 54와 적어도 약 65% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열;
    d) 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호:60, 서열번호: 62 및 서열번호: 64로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열; 및
    (e) 서열번호: 41, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하되, 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 인성화된 동물 밀크를 제조하는 방법.
  61. 내인성 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템을 발현하되, 상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 유전적으로 변형되지 않은 트라우스토카이트리드 미생물과 비교하였을 때 트라우스카이트리드 미생물에 의한 다중불포화 지방산 (PUFA)의 발현 프로필을 변이시키도록 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  62. 제 61항에 있어서,
    상기 내인성 PUFA PKS 시스템은 내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 돌연변이에 의해 변형된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  63. 제 61항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 미생물의 PUFA 제조 프로필을 변이시키기 위하여 내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 결실하고 상기 내인성 도메인의 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 유전적으로 변형시키되, 상기 상동체는 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  64. 제 61항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템은 내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 결실하고 다른 미생물에서 유래된 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 변형된 것을 특징으로 하는 트라우스토카이트리드 미생물.
  65. 제 62항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 PUFA-PKS 시스템의 도메인은 말로닐-CoA: ACP 아실트랜스퍼라제(MAT), β-케토 아실-ACP 신타제(KS), 케토환원효소(KR), 아실트랜스퍼라제(AT), FabA-유사 β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소(DH), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄길이 인자(CLF), 아실 캐리어 단백질(ACP), 엔오일 ACP-환원효소(ER), 트랜스-2-아실 ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실-ACP의 시스-3-아실 ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소 및 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실 ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 적어도 하나의 생물학적 활성을 가진 도메인인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  66. 제 62항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템의 도메인은
    a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 및
    (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일하되, 다중불포화 지방산 (PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템의 적어도 하나의 도메인의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  67. 제 62항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템의 도메인은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  68. 제 62항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템의 도메인은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  69. 제 62항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템의 도메인은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  70. 제 62항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템의 도메인은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 22, 서열번호: 24, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 39, 서열번호: 41, 서열번호: 43, 서열번호: 45, 서열번호: 48, 서열번호: 50, 서열번호: 52, 서열번호: 54, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 64, 서열번호: 66, 서열번호: 68 및 이의 생물학적으로 활성인 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  71. 제 62항에 있어서,
    상기 변형은 표적화된 돌연변이에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  72. 제 62항에 있어서,
    상기 변형은 전통적인 돌연변이 및 스크리닝에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  73. 제 63항에 있어서,
    내인성 도메인의 상동체는 내인성 도메인과 비교하였을 때 미생물에 의한 PUFA 제조 프로필의 변이를 초래하는 적어도 하나의 결실, 삽입 또는 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  74. 제 63항에 있어서,
    상기 상동체의 아미노산 서열은 내인성 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  75. 제 63항에 있어서,
    상기 상동체의 아미노산 서열은 내인성 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  76. 제 63항에 있어서,
    상기 상동체의 아미노산 서열은 내인성 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  77. 제 63항에 있어서,
    상기 상동체의 아미노산 서열은 내인성 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  78. 제 63항에 있어서,
    내인성 도메인의 상동체는 다른 트라우스토카이트리드 미생물의 PUFA PKS 시스템 유래의 도메인인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  79. 제 64항에 있어서,
    상이한 미생물에서 유래된 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 박테리아의 PUFA PKS 시스템 유래인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  80. 제 79항에 있어서,
    상이한 미생물은 약 25℃ 이상의 온도에서 PUFA를 천연적으로 제조하는 PUFA PKS 시스템을 가진 해양 박테리아인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  81. 제 80항에 있어서,
    상기 해양 미생물은 쉐와넬라 올레야나 및 쉐와넬라 자포니카로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  82. 제 64항에 있어서,
    상이한 미생물 유래의 PKS 시스템의 도메인은 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 다른 트라우스토카이트리드 미생물 유래의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 PKS 시스템에서 유래된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  83. 제 61항에 있어서,
    PUFA 제조 프로필이 미생물에 의한 에이코사펜타엔산(EPA)의 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  84. 제 61항에 있어서,
    PUFA 제조 프로필이 미생물에 의한 도코사헥사엔산(DHA)의 제조 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  85. 제 61항에 있어서,
    PUFA 제조 프로필이 미생물에 의한 하나 또는 둘 모두의 도코사펜타엔산(DPA) 이성질체 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  86. 제 61항에 있어서,
    PUFA 제조 프로필이 미생물에 의한 아라키돈산(ARA)의 제조를 개시, 증가 또는 감소시키도록 변이된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  87. 제 61항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드는 스키조카이트리움, 트라우스토카이트리움 및 자포노카이트리움으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속에서 유래된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  88. 제 61항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드는 스키조카이트리움 속에서 유래된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  89. 제 61항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드는 스키조카이트리움 아그레가툼, 스키조카이트리움 리마시눔 및 스키조카이트리움 미너툼으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 스키조카이트리움 종에서 유래된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  90. 제 61항에 있어서,
    상기 트라우스토카이트리드는 트라우스토카이트리움 속에서 유래된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물.
  91. 스키조카이트리움에 의한 에이코사펜타엔산(EPA) 제조를 초래하는 내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서의 유전적 변형을 포함하는 내인성 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템을 가지는 것을 특징으로 하여 에이코사펜타엔산(EPA)을 제조하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  92. 제 91항에 있어서,
    상기 스키조카이트리움은 말로닐-CoA: ACP 아실트랜스퍼라제(MAT), β-케토 아실-ACP 신타제(KS), 케토환원효소(KR), 아실트랜스퍼라제(AT), FabA-유사 β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소(DH), 포스포판테테인 트랜스퍼라제, 쇄길이인자(CLF), 아실 캐리어 단백질(ACP), 엔오일 ACP-환원효소(ER), 트랜스2-아실-ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실 ACP의 시스-3-아실 ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소 및 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실 ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 것은 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  93. 제 91항에 있어서,
    스키조카이트리움은 내인성 PUFA PKS 시스템의 서열번호: 2를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 유래의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  94. 제 91항에 있어서,
    스키조카이트리움은 내인성 PUFA PKS 시스템의 서열번호: 4를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 유래의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  95. 제 91항에 있어서,
    스키조카이트리움은 내인성 PUFA PKS 시스템의 서열번호: 6을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 유래의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  96. 제 91항에 있어서,
    상기 스키조카이트리움은 β-케토 아실-ACP 신타제(KS), FabA-유사 β-하이드록시 아실-ACP 탈수소효소(DH), 쇄길이인자(CLF), 트랜스-2-아실-ACP의 합성을 촉매하는 효소, 트랜스-2-아실-ACP의 시스-3-아실-ACP로의 가역적인 이성질화를 촉매하는 효소, 시스-3-아실-ACP의 시스-5-β-케토-아실-ACP로의 연장을 촉매하는 효소 중 적어도 하나의 생물학적 활성을 가지는 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  97. 제 91항에 있어서,
    상기 스키조카이트리움은 내인성 PUFA PKS 시스템의 서열번호 : 20, 서열번호 : 22, 서열번호 : 28 및 서열번호 : 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  98. 제 91항에 있어서,
    스키조카이트리움은 내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 결실하고 비스키조카이트리움 미생물 유래의 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 변형되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  99. 제 98항에 있어서,
    상기 비스키조카이트리움 미생물은 적어도 약 15℃의 온도에서 성장하고 PUFA를 제조하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  100. 제 98항에 있어서,
    상기 비스키조카이트리움 미생물은 적어도 약 20℃의 온도에서 성장하고 PUFA를 제조하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  101. 제 98항에 있어서,
    상기 비스키조카이트리움 미생물은 적어도 약 25℃의 온도에서 성장하고 PUFA를 제조하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  102. 제 98항에 있어서,
    상기 비스키조카이트리움 미생물은 적어도 약 30℃의 온도에서 성장하고 PUFA를 제조하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  103. 제 98항에 있어서,
    상기 비스키조카이트리움 미생물은 적어도 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 성장하고 PUFA를 제조하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  104. 제 98항에 있어서,
    비스키조카이트리움 미생물에서 유래된 PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 박테리아의 PUFA PKS 시스템 유래인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  105. 제 104항에 있어서,
    상기 박테리아의 PUFA PKS 시스템은 쉐와넬라 올레야나 및 쉐와넬라 자포니카로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아에서 유래된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  106. 제 98항에 있어서,
    PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 타입 I PKS 시스템, 타입 II PKS 시스템, 모듈라 PKS 시스템 및 비박테리아의 PUFA PKS 시스템으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  107. 제 106항에 있어서,
    상기 비박테리아의 PUFA-PKS 시스템은 진핵생물의 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  108. 제 107항에 있어서,
    상기 진핵생물의 PUFA PKS 시스템은 트라우스토카이트리드 PUFA PKS 시스템인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  109. 스키조카이트리움에 의한 도코사헥사엔산(DHA)의 증가된 제조를 초래하는 내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에서 유전적 변형을 포함하는 내인성 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제 (PKS) 시스템을 가지는 것을 특징으로 하여 유전적으로 변형되지 않은 스키조카이트리움과 비교하였을 때 증가된 양의 도코사헥사엔산(DHA)을 제조하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  110. 제 109항에 있어서,
    내인성 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인은 트라우스토카이트리움 유래 PUFA PKS 시스템의 적어도 하나의 도메인 대신에 치환됨으로써 변형된 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  111. 제 109항에 있어서,
    스키조카이트리움에 의해 제조된 DHA 대 DPA의 비율은 유전적으로 변형되지 않은 스키조카이트리움과 비교하였을 때 증가되는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 스키조카이트리움.
  112. 제 61항에 따른 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물 또는 제 91항 또는 제 109항에 따른 유전적으로 변형된 스키조카이트리움을 리피드를 제조하기에 효과적인 조건하에서 배양하는 단계를 포함하여 적어도 하나의 선택된 다중불포화 지방산(PUFA)으로 풍부한 리피드를 제조하는 방법.
  113. 제 12항에 있어서,
    선택된 PUFA는 에이코사펜타엔산(EPA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 내인성 다중불포화 지방산(PUFA) 폴리케타이드 신타제(PKS) 시스템을 가지되, 유전적으로 변형되지 않은 미생물과 비교하였을 때 상기 내인성 PUFA PKS 시스템이 미생물의 리피드에서 EPA의 제조를 개시 또는 증가시키도록 적어도 하나의 도메인에서 유전적으로 변형된 트라우스토카이트리드 미생물을 EPA가 풍부한 리피드를 제조하기에 효과적인 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 에이코사펜타엔산(EPA)이 풍부한 리피드를 제조하는 방법.
KR1020127026179A 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도 KR101234200B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45797903P 2003-03-26 2003-03-26
US60/457,979 2003-03-26
PCT/US2004/009323 WO2004087879A2 (en) 2003-03-26 2004-03-26 Pufa polyketide synthase systems and uses thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127012277A Division KR101234199B1 (ko) 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120123726A true KR20120123726A (ko) 2012-11-09
KR101234200B1 KR101234200B1 (ko) 2013-02-19

Family

ID=33131738

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127012277A KR101234199B1 (ko) 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도
KR1020127026179A KR101234200B1 (ko) 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도
KR1020057018067A KR101234198B1 (ko) 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127012277A KR101234199B1 (ko) 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057018067A KR101234198B1 (ko) 2003-03-26 2004-03-26 Ｐｕｆａ 폴리케타이드 신타제 시스템 및 이의 용도

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP1623008B1 (ko)
JP (3) JP2007524377A (ko)
KR (3) KR101234199B1 (ko)
CN (1) CN101389213B (ko)
AU (2) AU2004225485B2 (ko)
BR (1) BRPI0409046A (ko)
CA (1) CA2520396C (ko)
ES (1) ES2516641T3 (ko)
HK (1) HK1088632A1 (ko)
IL (1) IL200625A0 (ko)
MX (2) MXPA05010214A (ko)
WO (1) WO2004087879A2 (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
EP2341127B1 (en) 2000-01-28 2015-05-27 DSM IP Assets B.V. Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acids by high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors
CA2614095A1 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid-containing oil product and uses and production thereof
GB0603160D0 (en) * 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
JP2009529891A (ja) 2006-03-15 2009-08-27 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション 多価不飽和脂肪酸を含む植物種子油
CA2662260C (en) * 2006-08-29 2015-10-27 Martek Biosciences Corporation Use of dpa(n-6) oils in infant formula
EP2405018A4 (en) * 2009-03-04 2013-02-20 Univ Miyazaki METHOD FOR DETERMINING FATTY ACID SYNTHESIS PATHWAYS OF A MICROORGANISM, AND PCR PRIMER GROUP USED IN SAID METHOD
EP2408795B1 (en) * 2009-03-16 2017-04-19 DSM IP Assets B.V. Protein production in microorganisms of the phylum labyrinthulomycota
TWI600762B (zh) 2009-03-19 2017-10-01 Ｄｓｍ智慧財產有限公司 多不飽和脂肪酸合成酶核酸分子及多肽，組成物，以及其製造方法與用途
EP2614829A1 (en) * 2012-01-11 2013-07-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Mammalian neural plate border stem cells capable of forming neural tube and neural crest cell lineages including central and peripheral neurons
KR101570771B1 (ko) 2013-11-18 2015-11-23 대한민국 고도불포화지방산 생합성을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 제작된 형질전환 식물체
WO2016111368A1 (ja) * 2015-01-09 2016-07-14 国立大学法人宮崎大学 ヤブレツボカビ類を用いたリグニン分解活性を有するタンパク質の製造方法
BR112018073164A2 (pt) * 2016-05-12 2019-04-30 Dsm Ip Assets Bv método de aumento de produção de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 em microalgas
JPWO2020032258A1 (ja) * 2018-08-10 2021-08-12 協和発酵バイオ株式会社 多価不飽和脂肪酸を生産する微生物及び多価不飽和脂肪酸の製造法
EP3835410A4 (en) * 2018-08-10 2022-05-18 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. EICOSAPENTAIC ACID PRODUCING MICROORGANISM AND PROCESS FOR PRODUCTION OF EICOSAPENTAIC ACID

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US6566583B1 (en) * 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
IN1998CH01219A (en) * 1997-06-04 2005-03-04 Calgene Llc Production of polyunsaturated fatty acid by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
US6677145B2 (en) * 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US7247461B2 (en) * 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
PT1322752E (pt) * 2000-09-28 2010-05-06 Bioriginal Food & Science Corp Fad4, fad5, fad5-2 e fad6, novos membros da família de dessaturases de ácidos gordos e susas utilizações
TWI337619B (en) * 2001-04-16 2011-02-21 Martek Biosciences Corp Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
JP2005508140A (ja) * 2001-05-21 2005-03-31 エコピア バイオサイエンシーズ インク エンジイン環構造の生合成に関与する遺伝子及びタンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
CN101389213B (zh) 2014-05-28
MX341785B (es) 2016-09-01
KR101234198B1 (ko) 2013-02-19
EP1623008B1 (en) 2014-07-30
JP2016000048A (ja) 2016-01-07
JP2007524377A (ja) 2007-08-30
AU2004225485B2 (en) 2008-08-21
JP2013143945A (ja) 2013-07-25
JP5890791B2 (ja) 2016-03-22
EP1623008A4 (en) 2009-05-27
HK1088632A1 (en) 2006-11-10
BRPI0409046A (pt) 2006-04-18
KR20060006014A (ko) 2006-01-18
AU2008249169A1 (en) 2008-12-11
KR20120097502A (ko) 2012-09-04
KR101234199B1 (ko) 2013-02-20
MXPA05010214A (es) 2005-12-14
IL200625A0 (en) 2011-07-31
AU2004225485A1 (en) 2004-10-14
KR101234200B1 (ko) 2013-02-19
WO2004087879A2 (en) 2004-10-14
CN101389213A (zh) 2009-03-18
AU2008249169B2 (en) 2012-03-15
WO2004087879A3 (en) 2008-07-24
EP1623008A2 (en) 2006-02-08
JP6134361B2 (ja) 2017-05-24
CA2520396C (en) 2016-08-09
ES2516641T3 (es) 2014-10-31
CA2520396A1 (en) 2004-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20040235127A1 (en) PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
JP5806259B2 (ja) Ｐｕｆａポリケチドシンターゼ系およびそれらの使用方法
JP6134361B2 (ja) Ｐｕｆａポリケチドシンターゼ系およびこれらの使用
US7605245B2 (en) PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
JP2005510203A6 (ja) Ｐｕｆａポリケチドシンターゼ系およびそれらの使用方法
AU2002303394A1 (en) PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
AU2012203480A1 (en) PUFA polyketide synthase systems and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151230

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161229

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171228

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee