CN101389213A - Pufa聚酮化合物合酶系统及其用途 - Google Patents

Pufa聚酮化合物合酶系统及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明一般涉及多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，其同源物，分离的核酸分子和编码该PUFA PKS系统的生物学活性结构域的重组核酸分子，含有PUFA PKS系统的经遗传修饰的生物体，制备和使用该系统用于生产所需生物活性分子的方法，和鉴定具有该PUFA PKS系统的细菌和非细菌微生物的新方法。

Description

PUFA聚酮化合物合酶系统及其用途
技术领域
本发明涉及来自微生物，包括诸如Thraustochytrid微生物的真核生物体的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统。更具体地说，本发明涉及编码非细菌PUFA PKS系统的核酸，涉及非细菌PUFA PKS系统，涉及含有非细菌PUFA PKS系统的经遗传修饰的生物体，且涉及制备和使用本文公开的非细菌PUFA PKS系统的方法。本发明还涉及经遗传修饰的微生物和通过操作PUFA聚酮化合物合酶(PKS)系统有效产生各种多不饱和脂肪酸，具体是二十碳五烯酸(C20：5，ω-3；EPA)富集型的脂质(三酰基甘油(TAG)以及膜结合磷酯(PL))的方法。
背景技术
聚酮化合物合酶(PKS)系统是本领域普遍已知的脂肪酸合酶(FAS)系统衍生的酶复合物，但它通常被高度修饰以产生通常与脂肪酸相似性很小的特异性产物。然而已证明聚酮化合物合酶系统存在于海洋细菌和某些能从丙二酸单酰辅酶A合成PUFA的微藻中。US 6,140,486详细描述了希瓦氏菌属(Shewanella)和另一种海洋细菌海产弧菌(Vibrio marinus)中PUFA合成的PKS途径。US6,566,583详细描述了真核Thraustochytrid，Schizochytrium中PUFA合成的PKS途径。最后，2002年12月19日公开的US申请专利20020194641(对应于2002年4月16日提交的US专利申请10/124,800)中详细描述了如Thraustochytriales成员的真核生物中PUFA合成的PKS途径，包括对Schizochytrium中PUFA PKS途径的完全结构描述和对破囊壶菌属(Thraustochytrium)中PUFA PKS途径的鉴别，其中包括关于这些途径的用途的细节。
研究人员尝试了开发在文献中描述过的聚酮化合物合酶(PKS)系统，它们属于一般称为II型，I型和模块的三种基本类型之一。II型系统的特征是可分离的蛋白质，各蛋白质执行不同的酶促反应。酶协调作用以产生最终产物，且该系统中的每个酶在最终产物的生产中一般参与数次。这类系统以类似于在植物和细菌中发现的脂肪酸合酶(FAS)系统的方式来进行。I型PKS系统与II型系统的相似之处在于酶以反复的方式用于生产最终产物。I型与II型的区别在于酶活性发生在更大蛋白质的结构域中，而不是与可分离的蛋白质相关。该系统类似于在动物和真菌中发现的I型FAS系统。
与I型和II型系统相反，在模块PKS系统中，各酶结构域在最终产物的生产中只使用一次。该结构域在极大型蛋白质中发现且各反应的产物传递到PKS蛋白质的另一结构域。另外，在上述所有PKS系统中，如果在最终产物中引入碳-碳双键，其总为反式构型。
在上述I型和II型PKS系统中，每次循环进行同一组反应直到获得最终产物。在生物合成过程中不允许导入特有反应。模块PKS系统需要不能利用节能型反复反应的巨大蛋白质(即，每次反应需要不同的结构域)。另外，如上所述，在所有以前所述PKS系统中以反式构型导入碳-碳双键。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是大多数真核生物中膜脂类的关键成份(Lauritzen et al.，Prog.Lipid Res.40 1(2001)；McConn et al.，Plant J.15，521(1998))且是某些激素和信号分子的前体(Heller et al.，Drugs 55，487(1998)；Creelman et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol Biol.48，355(1997))。PUFA合成的已知途径包括通过延长和需氧去饱和反应加工脂肪酸合酶(FAS)衍生的饱和16：0或18：0脂肪酸(缩写X：Y表示含有X个碳原子和Y个双键(在PUFA中通常是顺式)的酰基基团；PUFA的双键位置相对于具有双键的系统性亚甲基间断的脂肪酸链的甲基碳(ω3或ω6)进行标识)(Sprecher，Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.Care 2，135(1999)；Parker-Barneset al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，8284(2000)；Shanklin et al.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Nol.Biol.49，611(1998))。从乙酰-CoA开始，合成二十二碳六烯酸(DHA)需要约30种不同的酶活性和几乎70个反应，包括脂肪酸合成循环的4个重复步骤。聚酮化合物合酶(PKSs)完成一些与FAS相同的反应(Hopwood et al.，Annu.Rev.Genet.24，37(1990)；Bentley et al.，Annu.Rev.Microbiol.53，411(1999))，使用相同的小蛋白(或结构域)，酰基载体蛋白(ACP)，作为生长碳链的共价连接位点。然而，在这些酶系统中，通常省去了FAS中所见的还原、脱水和还原的整个循环，从而产生高度衍生化的碳链，一般含有许多酮基和羟基以及反式构型的碳-碳双键。PKS的线型产物通常环化以形成复杂的生化试剂，包括抗生素和许多其它次级产物(Hopwood et al.，(1990)出处同上；Bentley et al.，(1999)，出处同上；Keatinget al.，Curr.Opin.Chem.Biol.3，598(1999))。
已经报导了来自包括希瓦氏菌属的一些海洋细菌菌种的极长链PUFA，如二十二碳六烯酸(DHA；22：6ω3)和二十碳五烯酸(EPA；20：5ω3)(Nicholset al.，Curr.Op.Biotechnol.10，240(1999)；Yazawa，Lipids 31，S(1996)；DeLonget al.，Appl.Environ.Microbiol.51，730(1986))。分析希瓦氏菌属菌株SCRC2738的基因组片段(克隆为质粒pEPA)的结果是鉴定了5个开放阅读框(Orfs)，总计20Kb，它们是大肠杆菌中生产EPA的必要和充分条件(Yazawa，(1996)出处同上)。一些预测的蛋白结构域是FAS酶的同源物，而其它区域与已知功能的蛋白质无同源性。5个Orf中至少11个区域可鉴定为推定的酶结构域(参见Metz et al.，Science 293：290-293(2001))。与基因数据库中的序列比较时，其中7个与PKS蛋白的相关性比与FAS蛋白的相关性更强。公知该组中包含的结构域编码丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)，β-酮脂酰(ketoacyl)-ACP合酶(KS)，β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)，酰基转移酶(AT)，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，链长(或链起始)因子(CLF)和非常罕见的6个ACP结构域簇(即，以前未见报导PKS或FAS序列中存在两个以上簇集的ACP结构域)。希瓦氏菌属中鉴定的PUFA合成的PKS途径在海洋细菌中是普遍的。在Photobacterium profundum(Allen et al.，Appli.Environ.Microbiol.65：1710(1999))和Moritella marina(海产弧菌)(Tanaka etal.，Biotechnol.Lett.21：939(1999))中已经鉴定了与希瓦氏菌属基因簇高度同源的基因(参见US 6,140,486，出处同上和Tanaka et al.，Biotechnol.Lett.21：939(1999))。
认为多不饱和脂肪酸(PUFA)可用于营养，制药，工业，和其它目的。来自天然来源和化学合成的PUFA的昂贵供应不足以满足商业需要。目前PUFA的主要来源是来自海鱼；然而，鱼类储备在下降，因此可能不是持久的资源。此外，污染、重金属和毒性有机分子是从海鱼获得的油的严重问题。从油籽农作物获得的植物油相对便宜并且没有伴随鱼油的污染问题。然而，经济作物油类中发现的PUFA一般仅限为亚油酸(在δ9和δ12位具有2个双键的十八碳-18:2 δ9，12)和亚麻酸(18:3 δ9，12，15)。在PUFA合成的常规途径中，通过一系列延长和去饱和反应修饰中等链长度的饱和脂肪酸(脂肪酸合酶(FAS)系统的产物)。因为脂肪酸合成需要一些分离的去饱和酶和延长酶以便从亚油酸和亚麻酸产生更饱和的且链更长的PUFA，改造植物宿主细胞以表达PUFA如EPA和二十二碳六烯酸(DHA)需要表达一些分离的酶以实现合成。另外，为了生产有用量的这种PUFA，可能需要进行其它改造，例如，改造使得竞争底物的酶的下调，通过诸如诱变或者将酶靶向到质体细胞器而改造成具有更高的酶活性。因此有利的是从天然产生这些脂肪酸的物种获得参与PUFA生物合成的遗传材料，并在异源系统中单独或共同表达分离的物质，该异源系统可被操作以生产商品量的PUFA。
在如希瓦氏菌属和海产弧菌等的海洋细菌中发现的PUFA PKS系统(参见US 6,140,486，出处同上)为商品化PUFA生产的新方法提供了资源。然而，这些海洋细菌具有最终限制其在商业水平上应用的局限。首先，尽管US 6,140,486公开了这些海洋细菌PUFA PKS系统可用于对植物进行遗传修饰，但是海洋细菌在寒冷的海洋环境中自然生活和生长，且这些细菌的酶系统在22℃以上不能很好地发挥功能。相反，许多农作物植物作为使用PUFA PKS系统进行遗传改造的有吸引力靶标，其正常生长条件是22℃以上至高于40℃。因此，预期这些海洋细菌PUFA PKS系统不容易适应正常生长条件下的植物表达。另外，已知的海洋细菌PUFA PKS系统不能直接产生甘油三酯(TAG)，而直接产生TAG是所期望的，因为TAG是脂类储存产物并因此可在细胞中以极高水平积累，与一般仅以低水平积累的“结构”脂类产物(例如磷脂)相反。
具体关于生产二十碳五烯酸(EPA)，研究人员试图通过在光合和异养培养中使微生物生长而利用所述微生物生产EPA。他们还使用了经典的和定向遗传方法试图提高生物体在培养条件下的生产力。其他研究人员试图通过引入编码各种去饱和酶和延长酶的基因在油籽农作物中生产EPA。
研究人员试图使用红色微藻(Monodus)、硅藻(例如Phaeodactylum)、其他微藻和真菌(例如低温培养的被孢霉属(Mortierella))的培养物。然而在所有情况下，与其他长链PUFA诸如DHA等的现存商品化微生物生产系统相比较，生产率很低。在多数情况下，EPA主要存在于磷脂(PL)中而不是三酰基甘油(TAG)中。因为异养生长条件下微藻的生产率比光营养条件下的生产率高的多，研究人员尝试并实现了通过引入编码特定糖运载体的基因来进行营养转化。然而，即使具有新获得的异养能力，油的生产率仍然相对较低。
通过修饰内源脂肪酸生物合成途径在油籽农作物中生产EPA的努力仅仅产生其油中PUFA水平非常低的植物。如上面讨论的，一些海洋细菌生产PUFA(EPA和DHA)。然而，这些细菌不产生TAG，并且EPA主要存在于PL膜中。产生的EPA水平以及这些特定海洋细菌(上面讨论的)的生长特性限制了它们商业性生产EPA的应用。
因此，本领域需要具有更大灵活性的其它PUFA PKS系统用于商业用途，以及在商品化生产过程中有效生产大量所需的PUFA诸如EPA等富集型脂质(PL和TAG)的生物系统。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及分离的核酸分子。所述核酸分子包含选自如下序列组成的组的核酸序列：(a)核酸序列，其编码选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ IDNO：68及其生物学活性片段组成的组的氨基酸序列；(b)核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)编码与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列的核酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)编码与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列的核酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(e)编码与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列的核酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(f)与(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的核酸序列完全互补的核酸序列。一方面，所述核酸序列编码选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组的氨基酸序列。另一方面，所述核酸序列选自SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ IDNO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67组成的组。
本发明的另一实施方案涉及重组核酸分子，其含有与至少一个转录调控序列可操作连接的上述任意核酸分子。
本发明的另一实施方案涉及用上述任意重组核酸分子转染的重组细胞。
本发明的另一实施方案涉及经遗传修饰的微生物，其中该微生物表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物学活性结构域的PKS系统，其中PUFA PKS系统的至少一个结构域包含选自如下序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ IDNO：68及其生物学活性片段组成的组；(b)与选自SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(e)与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。微生物遗传修饰成影响PKS系统的活性。
一方面，所述微生物用重组核酸分子转染得以遗传修饰，其中所述重组核酸分子编码多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域。例如微生物可包括Thraustochytrid，诸如Schizochytrium等。一方面，该微生物进一步被遗传修饰成重组表达编码至少一段核酸分子，其编码选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFA PKS系统组成的组的PKS系统的至少一个生物学活性结构域。非细菌PUFA PKS系统可包括Thraustochytrid的PUFA PKS系统，并且一方面可包括Schizochytrium的PUFA PKS系统。
另一方面，微生物内源性表达含有PUFA PKS系统至少一个结构域的PKS系统，且其中遗传修饰存在于编码PUFA PKS系统的至少一个结构域的核酸序列中。另一方面，该微生物进一步被遗传修饰成重组表达至少一种下述核酸分子，所述核酸分子编码选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFA PKS系统(例如Thraustochytrid的PUFA PKS系统，如Schizochytrium的PUFA PKS系统)组成的组的PKS系统的至少一个生物学活性结构域。
另一方面，所述微生物内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个生物学活性结构域的PUFA PKS系统，且其中该遗传修饰包含表达选自如下核酸分子组成的组的重组核酸分子：编码来自第二种PKS系统的至少一个生物学活性结构域的重组核酸分子以及编码影响内源性PUFA PKS系统活性的蛋白质的重组核酸分子。来自第二种PKS系统的生物学活性结构域包括，但不限于：(a)来自Thraustochytrid微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的结构域；(b)来自用下述方法鉴别的微生物的PUFAPKS系统的结构域：(i)选择产生至少一种PUFA的微生物；和(ii)从(i)中鉴别与发酵培养基、大于约5％饱和度的溶氧条件下该微生物产生的PUFA相比，在发酵培养基中、小于约5％饱和度的溶氧条件下能够产生增加的PUFA的微生物；(c)结构域，其包含选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32及其生物学活性片段组成的组的氨基酸序列；和(d)包含与(c)的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列的结构域，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。一方面，重组核酸分子编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。一方面，第二种PKS系统选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFA PKS系统(例如真核PUFA PKS系统，如Thraustochytrid的PUFA PKS系统，包括但不限于Schizochytrium的PUFA PKS系统)组成的组。
本发明的另一实施方案涉及经遗传修饰的植物，其中该植物被遗传修饰成重组表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物学活性结构域的PKS系统，其中该结构域包含选自下述序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组；(b)与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(e)与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。一方面，PUFAPKS系统的至少一个结构域包含选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组的氨基酸序列。一方面，所述植物进一步被遗传修饰成重组表达编码至少一种核酸分子，所述核酸分子来自选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFA PKS系统(例如Thraustochytrid的pUFA PKS系统，如Schizochytrium的PUFA PKS系统)组成的组的PKS系统的至少一个生物学活性结构域。
本发明另一实施方案涉及生产由聚酮化合物合酶系统产生的生物活性分子的方法，包括在有效生产生物活性分子的条件下培养经遗传修饰的生物体，该生物体表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物活性结构域的PKS系统，其中PUFA PKS系统的至少一个结构域包含选自下述序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组；(b)与选自SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(e)与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
一方面，所述生物体内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个结构域的PKS系统，并且其中遗传修饰在编码PUFA PKS系统的至少一个结构域的核酸序列中。一方面，与PUFA PKS系统未经遗传修饰的生物体相比较，所述遗传修饰改变内源性PKS系统产生的至少一种产物。
另一方面，所述生物体内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的PKS系统，并且所述遗传修饰包括用选自下组的重组核酸分子转染该生物体：编码来自第二种PKS系统的至少一个生物学活性结构域的重组核酸分子以及编码影响PUFA PKS系统活性的蛋白质的重组核酸分子。一方面，与未经遗传修饰从而影响PUFA产生的生物体相比较，所述遗传修饰改变内源性PKS系统产生的至少一种产物。
另一方面，所述生物体用编码多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的重组核酸分子转染得以遗传修饰。
另一方面，所述生物体产生的多不饱和脂肪酸(PUFA)图谱不同于未经遗传修饰的天然生物体。
另一方面，所述生物体内源性表达非细菌PUFA PKS系统，且其中所述遗传修饰包括用来自不同PKS系统的结构域取代编码非细菌PUFA PKS系统的至少一个结构域的核酸序列。
另一方面，生物体内源性表达通过用重组核酸分子转染生物体从而被修饰的非细菌PUFA PKS系统，该重组核酸分子编码调节PUFA PKS系统产生的脂肪酸链长的蛋白质。
另一方面，生物活性分子选自：抗炎症配制品，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松症药物，抗抑郁剂，抗惊厥剂，抗幽门螺杆菌(Heliobactorpylori)药物，治疗神经变性疾病的药物，治疗肝脏变性疾病的药物，抗生素，和/或降胆固醇配制品。一方面，所述生物活性分子是抗生素。另一方面，所述生物活性分子是多不饱和脂肪酸(PUFA)。另一方面，所述生物活性分子是包含顺式构型的碳-碳双键的分子。一方面，所述生物活性分子是在每个第三个碳包含双键的分子。一方面，所述生物体是微生物。另一方面，所述生物体是植物。
本发明的另一实施方案涉及产生具有多不不同于天然植物的饱和脂肪酸(PUFA)图谱的植物的方法，包括遗传修饰植物细胞以表达含有至少一种重组核酸分子的PKS系统，该重组核酸分子含有编码PUFA PKS系统至少一个生物活性结构域的核酸序列，其中PUFA PKS系统的至少一个结构域包含选自下述序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组；(b)与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ IDNO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)与选自SEQ ID NO：45，SEQID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(e)与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
本发明另一实施方案涉及修饰含有至少一种脂肪酸的终产物的方法，包括向终产物中加入重组宿主细胞产生的油，所述重组细胞表达至少一种重组核酸分子该重组核酸分子含有编码PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的核酸序列，其中PUFA PKS系统的至少一个结构域包含选自下述序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：39，SEQID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组；(b)与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(e)与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。一方面，所述终产物选自：食品添加剂，食品，药物配制品，人源化动物乳汁，和婴儿代乳品。一方面，所述药物配制品选自抗炎症配制品，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松症药物，抗抑郁剂，抗惊厥剂，抗幽门螺杆菌药物，治疗神经变性疾病的药物，治疗肝脏变性疾病的药物，抗生素，和降胆固醇配制品组成的组。一方面，所述终产物用于治疗选自以下疾病组成的组的疾病：慢性炎症，急性炎症，胃肠疾病，癌症，恶病质，心脏再狭窄，神经变性疾病，肝脏变性疾病，血脂疾病，骨质疏松症，骨关节炎，自身免疫疾病，先兆子痫，早产，年老性黄斑病变，肺病，和过氧化物酶体疾病。
本发明另一实施方案涉及生产人源化动物乳汁的方法，包括用至少一个重组核酸分子遗传修饰产奶动物的产奶细胞所述重组核酸分子含有编码PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的核酸序列，其中PUFA PKS系统的至少一个结构域包含选自下述序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组；(b)与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(c)与SEQ ID NO：54至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；(d)与选自SEQID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和(e)与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
本发明另一实施方案涉及经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述微生物具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，并且与未经遗传修饰的Thraustochytrid微生物相比较，其中的内源性PUFAPKS系统被遗传修饰成改变Thraustochytrid微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)的表达图谱。
一方面，所述内源性PUFA PKS系统通过诱变编码内源性PUFA PKS系统至少一个结构域的核酸序列得以修饰。一方面，所述修饰通过靶向的诱变产生。另一方面，所述修饰通过常规诱变和筛选产生。
另一方面，如下修饰所述内源性PUFA PKS系统：缺失编码内源性PUFAPKS系统至少一个结构域的至少一段核酸序列，并因此插入编码内源性结构域同系物的核酸序列以改变Thraustochytrid微生物的PUFA产生图谱，其中所述同系物具有PKS系统至少一个结构域的生物学活性。一方面，与内源性结构域相比较，该内源性结构域的同系物包含修饰，所述修饰选自引起微生物PUFA生产图谱改变的至少一种缺失、插入或取代组成的组。另一方面，所述同系物的氨基酸序列与内源性结构域的氨基酸序列至少约60％相同，更优选约70％相同，更优选约80％相同，更优选约90％相同。一方面，所述内源性结构域的同系物是来自另一种Thraustochytrid微生物PUFA PKS系统的结构域。
另一方面，如下修饰内源性PUFA PKS系统：缺失编码内源性PUFA PKS系统至少一个结构域的至少一段核酸序列，并因此插入编码来自不同微生物的PKS系统的至少一个结构域的核酸序列。一方面，编码来自不同微生物的PKS系统的至少一个结构域的核酸序列是来自细菌PUFA PKS系统。例如，不同微生物可以是具有在约25℃或更高温度天然产生PUFA的PUFA PKS系统的海洋细菌。一方面，所述海洋细菌选自Shewanella olleyana和Shewanellajaponica组成的组。一方面，来自不同微生物的PKS系统结构域是选自I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和来自不同Thraustochytrid微生物的PUFAPKS系统组成的组的PKS系统。
在上述任意方面，内源性PUFA PKS系统的结构域可以包括，但不局限于，具有下述蛋白中至少一种蛋白的生物学活性的结构域：丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮还原酶(KR)，酰基转移酶(AT)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，链长因子(CLF)，酰基载体蛋白(ACP)，烯酰ACP-还原酶(ER)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶，和催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮脂酰-ACP的酶。在上述任意方面，内源性PUFA PKS系统的结构域可包括选自下述序列组成的组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：4l，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68及其生物学活性片段组成的组；和(b)与(a)的氨基酸序列至少约60％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
一方面，改变PUFA的生产图谱以引发、提高或降低微生物的二十碳五烯酸(EPA)产生。另一方面，改变PUFA的生产图谱以引发、提高或降低微生物产生二十二碳六烯酸(DHA)。另一方面，改变PUFA的生产图谱以引发、提高或降低微生物产生二十二碳五烯酸(DPA)的一种或两种异构体。另一方面，改变PUFA的生产图谱以引发、提高或降低微生物产生花生四烯酸(ARA)。另一方面，Thraustochytrid来自选自Schizochytrium属，破囊壶菌属和Japonochytrium属。另一方面，Thraustochytrid来自Schizochytrium属。另一方面，Thraustochytrid来自选自Schizochytrium aggregatum，Schizochytriumlimacinum和Schizochytrium minutum的Schizochytrium种。另一方面，Thraustochytrid来自破囊壶菌属。
本发明还有另一实施方案涉及产生二十碳五烯酸(EPA)的经遗传修饰的Schizochytrium，其中Schizochytrium具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，该系统包含在编码内源性PUFA PKS系统至少一个结构域的至少一段核酸序列中的遗传修饰，该遗传修饰导致Schizochytrium产生EPA。一方面，Schizochytrium包含在至少一段核酸序列中的遗传修饰，该核酸序列编码至少一个具有至少下述蛋白中至少一种蛋白的生物学活性的结构域：丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮还原酶(KR)，酰基转移酶(AT)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，链长因子(CLF)，酰基载体蛋白(ACP)，烯酰ACP-还原酶(ER)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶，和催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮脂酰-ACP的酶。一方面，Schizochytrium包含在编码至少一个下述结构域的至少一段核酸序列中的遗传修饰，该结构域来自编码内源性PUFA PKS系统SEQ ID NO：2的开放阅读框。一方面，Schizochytrium包含在编码至少一个下述结构域的至少一段核酸序列中的遗传修饰，该结构域来自编码内源性PUFA PKS系统SEQ ID NO：4的开放阅读框。一方面，Schizochytrium包含在编码至少一个下述结构域的至少一段核酸序列中的遗传修饰，该结构域来自编码内源性PUFA PKS系统SEQ ID NO：6的开放阅读框。一方面，Schizochytrium包含在至少一段核酸序列中的遗传修饰，该核酸序列编码至少一个具有下述蛋白中至少一种的生物学活性的结构域：β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，链长因子(CLF)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶，和催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮脂酰-ACP的酶。一方面，Schizochytrium包含在至少一段核酸序列中的遗传修饰，该核酸序列编码选自内源性PUFA PKS系统SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30组成的组的氨基酸序列。一方面，如下修饰Schizochytrium：缺失编码内源性PUFA PKS系统至少一个结构域的至少一段核酸序列，并因此插入编码来自非Schizochytrium微生物的PKS系统至少一个结构域的核酸序列。一方面，非Schizochytrium微生物在至少约15℃，更优选至少约20℃，更优选至少约25℃，更优选至少约30℃，更优选约20℃至40℃的温度生长并产生PUFA。一方面，编码来自非Schizochytrium微生物的PKS系统至少一个结构域的核酸序列来自细菌PUFA PKS系统。一方面，细菌PUFA PKS系统来自选自Shewanella olleyana和Shewanella japonica组成的组的细菌。另一方面，编码PKS系统至少一个结构域的核酸序列选自I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统，和非细菌PUFA PKS系统(例如真核PUFA PKS系统，如Thraustochytrid的PUFA PKS系统)组成的组。
本发明另一实施方案涉及经遗传修饰的Schizochytrium，其与非遗传修饰的Schizochytrium相比较，产生增加的量的二十二碳六烯酸(DHA)，其中Schizochytrium具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，该系统包含在编码内源性PUFA PKS系统至少一个结构域的核酸序列中的遗传修饰，其使得Schizochytrium产生的DHA增加。一方面，通过取代来自破囊壶菌属的PUFA PKS系统的至少一个结构域从而修饰内源性PUFAPKS系统的至少一个结构域。一方面，与非遗传修饰的Schizochytrium相比较，所述Schizochytrium产生的DHA/DPA比值增加。
本发明另一实施方案涉及一种生产富集至少一种所选多不饱和脂肪酸(PUFA)的脂质的方法，包括在有效生产所述脂质的条件下培养如上所述经遗传修饰的Thraustochytrid微生物或如上所述经遗传修饰的Schizochytrium。一方面，所选的PUFA是二十碳五烯酸(EPA)。
本发明还有另一实施方案涉及一种生产富含二十碳五烯酸(EPA)的脂质的方法，包括在有效生产富含EPA的脂质的条件下培养遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中微生物具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，并且其中内源性PUFA PKS系统在至少一个结构域中被遗传修饰，使得与未经修饰的微生物相比较，引发或增加了微生物生产脂质中的EPA。
附图简述
图1是Schizochytrium PUFA PKS系统的结构域结构的示意图。
图2显示了来自Schizochytrium和希瓦氏菌属的PUFA PKS系统的结构域的比较。
图3显示了来自Schizochytrium的PUFA PKS系统的结构域与来自念珠藻属(Nostoc)、其产物是不含任何双键的长链脂肪酸的相关PKS系统的比较。
发明详述
本发明概括地涉及多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，涉及含有该PUFA PKS系统的经遗传修饰的生物体，涉及制备和使用该系统以生产包括生物活性分子具体是PUFA诸如DHA、DPA和EPA的目的产物的方法。本文所用的PUFA PKS系统一般具有下列鉴定特征：(1)它产生作为该系统天然产物的PUFA；和(2)它含有组装进复合物中的数种多功能蛋白质，该复合物指导脂肪酸链的反复加工以及非反复加工，包括在选定循环中的反式-顺式异构化和烯酰还原反应(例如参见图1)。关于PUFA PKS系统的参考文献总体上涉及在复合物中起作用从而在生物体中产生PUFA的所有基因及其编码的产物。因此，PUFA PKS系统特指其天然产物是PUFA的PKS系统。
更具体地说，首先，构成本发明基础的PUFA PKS系统产生多不饱和脂肪酸(PUFA)作为产物(即，内源性(天然)含有该PKS系统的生物体使用该系统制备PUFA)。本文提及的PUFA优选是多不饱和脂肪酸，其碳链长度为至少16碳，更优选至少18碳，更优选至少20碳，更优选22或更多个碳，并且具有至少3个或更多个双键，优选4个或更多个，更优选5个或更多个，甚至更优选6个或更多个双键，其中所有双键是顺式构型。本发明的一个目的是通过遗传操作或对终产物的操作发现或创造这样的PKS系统，其产生具有所需链长和所需数目双键的多不饱和脂肪酸。PUFA的例子包括，但不限于，DHA(二十二碳六烯酸(C22：6，ω-3))，ARA(二十碳四烯酸(C20：4，n-6))，DPA(二十二碳五烯酸(C22：5，ω-6或ω-3))和EPA(二十碳五烯酸(C20：5，ω-3))。
其次，本文所述的PUFA PKS系统参与反复反应和非反复反应，使得该系统区别于以前所述的PKS系统(例如，I型，II型或模块型系统)。更具体地说，本文所述的PUFA PKS系统含有在每次循环中发挥功能的结构域以及仅在某些循环中发挥功能的结构域。这种功能性的一个关键方面涉及与细菌Fab A酶同源的结构域。例如，大肠杆菌的Fab A酶具有两种酶活性。它具有脱水活性，可从含有羟基的碳链减去一个水分子(H2O)，在该碳链中留下一个反式双键。另外，它具有异构酶活性，可将反式双键转变成顺式构型。这种异构化作用与双键位置迁移到相邻碳原子共同完成。在PKS(和FAS)系统中，主碳链以2个碳的增量延长。因此可预计产生这些PKS系统的PUFA产物所需的延长反应的次数。例如，产生DHA(C22：6，均为顺式)需要10次延长反应。由于终产物中仅有6个双键，这意味着在一些反应循环中，双键被保留(作为顺式异构体)，而在其它循环中，在下一步延长之前还原双键。
在发现海洋细菌的PUFA PKS系统(参见US 6,140,486)之前，还不了解PKS系统具有这种反复性酶反应和选择性酶反应的组合，且认为它们不能产生顺式构型的碳-碳双键。然而，本发明所述PUFA PKS系统具有导入顺式双键的能力和改变循环中反应顺序的能力。
本发明人提出利用PUFA PKS系统的这些特征来生产以前所述的(II型，I型和模块型)PKS系统不能产生的各种生物活性分子。这些生物活性分子包括，但不限于，多不饱和脂肪酸(PUFA)，抗生素或其它生物活性化合物，其中许多分子将在下文讨论。例如，利用本文所述的PUFA PKS基因结构的知识，可使用许多方法中的任一种改变PUFA PKS基因，或者将这些基因的部分与包括其它PKS系统的其它合成系统组合以便产生新产物。这种特定类型的系统进行反复性反应和选择性反应的固有能力使得该系统能够产生将相似方法用于其它类型的PKS系统所不能发现的产物。
US 6,566,583已经详细描述了真核Thraustochytrid，Schizochytrium中PUFA合成的PKS系统的大部分结构。本发明人提供的Schizochytrium的cDNA和基因组克隆的完整序列使得可以鉴别每个OrfA、OrfB和OrfC的全长基因组序列，并且可以完全地鉴别这些Schizochytrium的Orfs中与希瓦氏属同源的特定结构域(参见图2和US 10/124,800,出处同上)。在US 10/124,800中，发明人还鉴别了符合具有PUFA PKS系统这一标准的破囊壶菌属的种，并随后通过Southern印迹分析证明这个生物体很可能包含与Schizochytrium的PUFA PKS基因同源的基因。然而，US 10/124,800中没有描述分离和测定这种基因结构以及所述基因的结构域构成(organization)。在本发明中，发明人克隆并测序了破囊壶菌属的这种Thraustochytrid(具体是Thraustochytriumsp.23B(ATCC 20892))的同源开放阅读框(Orfs)的全长基因组序列，并且鉴别了该破囊壶菌属中包含PUFA PKS系统的结构域。因此，本发明解决了上述问题，提供了具有商业用途灵活性的其它PUFA PKS系统。破囊壶菌属的PUFA PKS系统在下文详细描述。
本发明还解决了上面提出的问题，通过本发明人研制的遗传修饰微生物和方法生产富含的所需PUFA，如EPA的有商业价值的脂质，所述方法通过操纵在真核生物中(包括Thraustochytriales目的成员诸如Schizochytrium和破囊壶菌属)中产生PUFA的聚酮合酶样系统，有效地生产富含PUFA的脂质(三酰基甘油(TAG)以及膜结合磷脂(PL))。具体地，通过举例的方式，本发明人在此描述了Schizochytrium菌株，以前将它优化为商业化生产富含PUFA，主要是二十二碳六烯酸(DHA；C22：6n-3)和二十二碳五烯酸(DPA；C22：5n-6)的油类，现在对它进行遗传修饰，使其产生EPA(C20：5n-3)(或产生其他PUFA)以取代产生DHA，而不牺牲该生物体的产油特性。此外，本发明人在此描述了对具有破囊壶菌属的PUFA PKS基因的Schizochytrium进行遗传修饰，从而改进Schizochytrium生物体的DHA产生，具体是通过修饰PUFA PKS系统改变微生物产生的DHA/DPA比值。这些仅仅是本发明所包括技术的一些例子，因为本发明的原理可以容易地应用于下文详细描述的其他生产生物体和其它所需的PUFA。
在一个实施方案中，本发明的PUFA PKS系统包含至少下列生物活性结构域：(a)至少两个烯酰ACP-还原酶(ER)结构域；(b)至少六个酰基载体蛋白(ACP)结构域；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)结构域；(e)至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)结构域；(f)至少两个FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)结构域；(g)至少一个链长因子(CLF)结构域；和(h)至少一个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)结构域。这些结构域的功能分别是本领域公知的且在下文关于本发明的PUFA PKS系统中将进行详细描述。
在另一个实施方案中，PUFA PKS系统包含至少下列生物活性结构域：(a)至少一个烯酰ACP-还原酶(ER)结构域；(b)多个酰基载体蛋白(ACP)结构域(至少1至4个，优选至少5个，更优选至少6个，甚至更优选7，8，9，或9个以上)；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)结构域；(e)至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)结构域；(f)至少两个FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)结构域；(g)至少一个链长因子(CLF)结构域；和(h)至少一个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)结构域。优选该PUFA PKS系统是非细菌PUFA-PKS系统。
在一个实施方案中，本发明的PUFA PKS系统是非细菌PUFA PKS系统。换句话说，在一个实施方案中，本发明的PUFA PKS系统从不是细菌的生物体中分离，或者是来自不是细菌的生物体，诸如真核生物或古细菌等的PUFA PKS系统的同源物或从其衍生得到。真核生物根据细胞分化程度与原核生物区分开来，真核生物具有分化程度较高的细胞，原核生物具有分化程度较低的细胞。一般来说，原核生物不具有核膜，细胞分裂过程中不进行有丝分裂，仅有一个染色体，其细胞质含有70S核糖体，它们不具有任何线粒体，内质网，叶绿体，溶酶体，或高尔基体，其鞭毛(如果存在)由单一原纤维组成。相反，真核生物具有核膜，它们在细胞分裂过程中进行有丝分裂，它们具有许多染色体，其细胞质含有80S核糖体，它们具有线粒体，内质网，叶绿体(在藻类中)，溶酶体和高尔基体，且其鞭毛(如果存在)由许多原纤维组成。一般来说，细菌是原核生物，而藻类，真菌，原生生物，原虫和高等植物是真核生物。
海洋细菌(例如，希瓦氏属菌株SCRC2738和海产弧菌)的PUFA PKS系统不是本发明的基础，尽管本发明确实包含使用来自这些细菌PUFA PKS系统的结构域与本发明的非细菌PUFA PKS系统结构域的组合。此外，本发明确实涉及分离和使用从其它细菌(例如Shewanella olleyana和Shewanella japonica)分离的PUFA PKS基因组(set)(及其编码的蛋白和功能域)，其特别适合用作修饰或与本文所述的非细菌PUFA PKS基因组合的PUFA PKS基因的来源，从而产生杂合构建体以及经遗传修饰的微生物和植物。例如，根据本发明，可产生遗传修饰的生物体，它合并了非细菌PUFAPKS功能域和细菌PUFA PKS功能域，以及来自其它PKS系统(I型，II型，模块型)或FAS系统的PKS功能域或蛋白质。如下文详细描述的，来自希瓦氏属两个菌种，即Shewanella olleyana或Shewanella japonica的PUFA PKS基因是优选用于本发明的经遗传修饰微生物、植物和方法的示例性细菌基因。来自这种海洋细菌(例如Shewanella olleyana或Shewanella japonica)的PUFA PKS系统(基因及其编码的蛋白和功能域)包括在本发明中作为新的PUFA PKS序列。
根据本发明，术语/短语“Thraustochytrid”“Thraustochytriales微生物”“Thraustochytriales目的微生物”可以交换使用，指Thraustochytriales目的任意成员，包括Thraustochytriaceae科和Labyrinthulaceae科。本文所用的术语“Labyrinthulid”和“Labyrinthulaceae”特指Labyrinthulaceae科的成员。为了具体说明Thraustochytriaceae科的成员Thraustochytrids，本文使用术语了“Thraustochytriaceae”。因此，对于本发明，认为Labyrinthulids科的成员包括在Thraustochytrids中。
研究导致频繁修定Thraustochytrids的分类。分类学家通常将Thraustochytrids放在藻类或藻样原生生物中。然而，由于分类的不确定，为本发明目的最好认为本发明所述的菌株是Thraustochytrids以包括以下生物体：目：Thraustochytriales；科：Thraustochytriaceae；(属：破囊壶菌属，Schizoclaytrium，Japonochytrium，Aplanochytrium或Elina)或Labyrinthulaceae(属Labyrinthula，Labyrinthuloides，或Labyrinthomyxa)。有时下列属也包括在Thraustochytriaceae科或Labyrinthulaceae科中：Althornia，Coralloclaytrium，Diplophyrys和Pyrrhosorus，并且为了本发明的目的包括在Thraustochytrid或Thraustochytriales目的成员中。本发明中Thraustochytrids的分类学修定将Labyrinthuloides属放在Labyrinthulaceae科中，并确定将Thraustochytriaceae和Labyrinthulaceae两个科放在Stramenopile谱系。应当注意的是，有时Labyrinthulaceae通常叫做labyrinthulids或labyrinthula或labyrinthuloides，Thraustochytriaceae通常叫做thraustochytrids，虽然如上所述，为使本发明清楚的目的，Thraustochytrids包括Thraustochytriales目的任意成员和/或包括Thraustochytriaceae和Labyrinthulaceae的成员。最新的分类学变化在下文中概括。
本文公开的某些单细胞微生物菌株是Thraustochytriales目的成员。Thraustochytrids是具有进化的分类史的海洋真核生物。Moss(1986)，Bahnweb和Jackle(1986)以及Chamberlain和Moss(1988)对Thraustochytrids的分类地位问题进行了综述。
为了方便，分类学家首先将Thraustochytrids与其它无色游动孢子真核生物放在藻状菌纲(藻样真菌)中。然而，藻状菌纲这一名称最后从分类学地位中去掉，Thraustochytrids保留在卵菌纲(Oomycete)(双鞭毛游动孢子真菌)中。最初假定卵菌纲与异鞭毛藻类(heterokont algae)有亲缘关系，并且Barr(Barr，1981，Biosystems 14：359-370)总结的，广泛的超微结构和生化研究最终支持了这一假定。事实上Leedale(Leedale，1974，Taxon 23：261-270)和其他藻类学家接受卵菌纲作为异鞭毛藻类的一部分。然而，事实上由于其异养特性的方便性，卵菌纲和Thraustochytrids被真菌学家(研究真菌的科学家)而不是藻类学家(研究藻类的科学家)大量研究。
从另一分类学角度来看，进化生物学家对于真核生物如何进化形成了两个系统学派。一个学说提出通过一系列内共生的外生膜结合细胞器起源(Margulis，1970，Origin of Eukaryotic Cells.Yale University Press，NewHaven)；例如线粒体起源于细菌的细胞内共生生物，叶绿体起源于蓝藻类(cyanophyte)，鞭毛起源于螺旋体(spirochaete)。另一学说提出膜结合细胞器从原核祖先的无膜结合系统通过自生过程逐渐进化(Cavalier-Smith，1975，Nature(Lond.)256：462-468)。然而两组进化生物学家都将卵菌纲和Thraustochytrids从真菌中去除并将它们与chromophyte藻类一起放在Chromophyta界中(Cavalier-Smith，1981，BioSystems 14：461-481)(该界最近扩展到包括其它原生生物且该界的成员，现在称为Stramenopiles)或与所有藻类一起放在Protoctista界中(Margulis和Sagen，1985，Biosystems18：141-147)。
随着电子显微镜的发展，对Thraustochytrids的两个属，即破囊壶菌属和Schizochytrium的游动孢子超微结构的研究(Perkins，1976，pp.279-312，“Recent Advances in Aquatic Mycology”(ed.E.B.G.Jones)，John Wiley & Sons，New York；Kazama，1980，Can.J.Bot.58：2434-2446；Barr，1981，Biosystems14：359-370)提供了良好证据证明Thraustochytriaceae与卵菌纲仅具有较远的亲缘关系。另外，对5S核糖体RNA序列的对应分析(多元统计形式)得到的遗传数据表明Thraustochytriales明显是一组独特的真核生物，完全独立于真菌，且与红藻和褐藻以及卵菌纲的成员有最近的亲缘关系(Mannella，etal.，1987，Mol.Evol.24：228-235)。大多数分类学家同意将Thraustochytrids从卵菌纲中取出(Bartnicki-Garcia，1987，pp.389-403页，“Evolutionary Biologyof the Fungi”(eds.Rayner，A.D.M.，Brasier，C.M.&Moore，D.)，CambridgeUniversity Press，Cambridge)。
总之，采用Cavalier-Smith的分类系统(Cavalier-Smith，1981，BioSystems14:461-481，1983；Cavalier-Smith，1993，Microbiol Rev.57：953-994)将Thraustochytrids与chromophyte藻类一起分类进Chromophyta(Stramenopiles)界中。最近Cavalier Smith等使用Heterokonta的18s rRNA标记证实Thraustochytrids是chromists而不是真菌，再次确认了这个分类地位(Cavalier-Smith et al.，1994，Phil.Tran.Roy.Soc.London Series BioSciences346：387-397)。该分类将它们放在与真菌完全不同的一个界中，而真菌都放在Eufungi界中。
目前，有71组不同的真核生物体(Patterson 1999)，在这些组中鉴定出四个主要谱系并具有一定可信度：(1)Alveolates，(2)Stramenopiles，(3)陆地植物(Land Plant)-绿藻(green algae)-Rhodophyte_Glaucophyte(“植物”)进化枝(clade)和(4)具后生鞭毛的进化枝(Opisthokont clade)(真菌和动物)。以前这四个主要谱系用界标记，但是一些研究人员认为使用“界”的概念不再有利。
如Armstrong提到的，Stramenopile指三分微管毛状物，这个谱系的多数成员具有带有这种毛状物的鞭毛。Stramenopiles(单细胞生物体，精子，游动孢子)的活动细胞是不对称的，有两个侧向插入的鞭毛，一个长，带有三分微管毛状物使鞭毛的推力逆转，一个短并且光滑。以前，当组不太宽广时，Stramenopiles叫做Chromista界或异鞭毛(＝不等鞭毛)藻类，因为这些组由褐藻或Phaeophytes，以及黄-绿藻(yellow-green Algae)，金-褐藻(Golden-brown Algae)，Eustigmatophytes和Diatoms一起组成。随后发现一些异养的、真菌样生物体、水藻菌和labyrinthulids(slime net amoebas)具有相似的活动细胞，所以以光合色素或藻类对组命名变得不合适了。现在，Stramenopile谱系中的两个科是Labyrinthulaceae和Thraustochytriaceae。历史上对这些独特微生物有许多分类策略，并且它们通常分在相同的目中(即Thraustochytriales)。这些组中成员的关系仍在发展。Porter和Leander研究了基于18S小亚基核糖体DNA的数据，其表明thraustochytrid-labyrinthulid进化枝。然而，进化枝由两个分枝支持；第一个包含破囊壶菌属和Ulkeniaprofunda的三个种，第二个包含Labyrinthula的三个种，Labyrinthuloides和Schizochytrium aggregatum的两个种。
因此本发明所用的Thraustochytrids的分类地位总结如下：
界：Chromophyta(Stramenopiles)
门：Heterokonta
目：Thraustochytriales(Thraustochytrids)
科：Thraustochytriaceae或Labyrinthulaceae
属：破囊壶菌属，Schizochytrium，Japonochytrium，Aplanoclaytriurn，Elina，Labyrinthula，Labyrinthuloides或Labyrinthuloinyxa
一些早期的分类学家将破囊壶菌属的一些原始成员(具有变形虫状生活阶段的成员)分入一个称为Ulkenia的独立属中。然而，现在知道大多数(如果不是全部的话)Thraustochytrids(包括破囊壶菌属和Schizochytrium)表现出变形虫状(amoeboid)阶段，因此有人认为Ulkenia不是一个正确的属。本文使用的破囊壶菌属包括Ulkenia。
尽管门和界中更高级分类的分类学地位不确定，但是Thraustochytrids保持特有的和特征性的分类，其成员可分类在Thraustochytriales目内。
Schizochytrium是Thraustochytrid海洋微生物，其积累大量富含DHA和二十二碳五烯酸(DPA；22:5 ω-6)的三酰基甘油，例如占干重的30％DHA+DPA(Barclay et al.，J.Appl.Phycol.6，123(1994))。在通过延长/去饱和途径合成20-碳和22-碳PUFA的真核生物中，18-碳，20-碳和22-碳中间体的分子库相当大，因此使用[14C]-乙酸盐的体内标记实验揭示了预期中间体的清楚的前体-产物动力学(Gellerman et al.，Biochim.Biophys.Acta 573：23(1979))。另外，外源性供给该生物体的放射标记中间体转变成最终的PUFA产物。本发明人已证明[1-14C]-乙酸盐迅速被Schizochytrium细胞吸收并掺入脂肪酸，但在最短标记时间(1分钟)时，DHA含有脂肪酸中回收的31％的标记，且该百分数在10-15分钟的[14C]-乙酸盐掺入和随后24小时的培养物生长期间基本上保持不变。类似的，实验中DPA代表10％的标记。没有证据表明在16-碳或18-碳脂肪酸与22-碳多不饱和脂肪酸之间存在前体-产物关系。这些结果与DHA、从包含极小(可能与酶结合的)中间体库的[14C]-乙酸盐迅速合成DHA相一致。来自Schizochytrium培养物的无细胞匀浆将[1-14C]-丙二酰-CoA掺入DHA、DPA和饱和脂肪酸中。相同的生物合成活性在100,000xg的上清级分中保留但在膜沉淀中不存在。因此，Schizochytrium中DHA和DPA合成不像其它真核生物那样，前者不涉及膜结合去饱和酶或脂肪酸延长酶(Parker-Barnes et al.，2000，出处同上；Shanklin et al.，1998，出处同上)。这些分级分离数据与从希瓦氏菌属酶获得的数据相反(参见Metzet al.，2001，出处同上)，且表明Schizochytrium酶使用不同的(可溶性)酰基受体分子，例如CoA。预期破囊壶菌属具有相似的生物化学。
在US专利6,566,583中，从Schizochytrium构建了cDNA文库且测序了约8500个随机克隆(ESTs)。图2中所示的与希瓦氏菌属PKS基因的11个结构域中的8个结构域同源的序列均以0.2-0.5％的频率被鉴定。在US专利6,566,583中，测序了与希瓦氏菌属PKS基因同源的来自Schizochytrium的几个cDNA克隆，且各种克隆装配成代表两个部分开放阅读框和一个完整开放阅读框的核酸序列。
本发明人对cDNA和基因组克隆的进一步测序使得可以鉴定Schizochytrium中每个OrfA，OrfB和OrfC的全长基因组序列，并可以完全鉴定Schizochytrium中与希瓦氏菌属同源的结构域(参见图2)。这些基因的详细描述见US专利申请10/124,800出处同上，在下文中也有详细描述。
发明人目前鉴定、克隆并测序了破囊壶菌属的Thraustochytrid(特别是Thraustochytrium sp.23B(ATCC 20892))中的同源Orfs的全长基因组序列，并且鉴别了该破囊壶菌属中包含PUFA PKS系统的结构域。
根据Schizochytrium PUFA PKS系统的结构域与希瓦氏属PUFA PKS系统的结构域的比较，显然Schizochytrium基因组编码与希瓦氏属中能够催化EPA合成的蛋白高度相似的蛋白。Schizochytrium中的蛋白组成催化DHA和DPA合成的PUFA PKS系统。简单修饰希瓦氏属的反应方案可以在Schizochytrium中合成DHA。原核希瓦氏属基因和真核Schizochytrium基因之间的同源性说明PUFA PKS已进行横向基因转移。
对破囊壶菌属可进行相类似的比较。在所有情况中，Thraustochytrium23B(Th.23B)PUFA PKS蛋白或结构域与其它已知序列的比较揭示最匹配的是US专利申请10/124,800(出处同上)所述的一种Schizochytrium PUFA PKS蛋白(OrfA，B或C，或其结构域)。在所有情况中，次最匹配的是来自海洋细菌(希瓦氏SCRC-2738，Shewanella oneidensis，Photobactef profundum和Moritella marina)或来自固氮蓝细菌(例如Nostoc punctiforme和Nostoc sp.PCC7120)中发现的相关系统的一种PUFA PKS蛋白。蓝细菌酶系统的产物没有双键，并且蛋白缺少与参与顺式双键形成的DH结构域相关的结构域(即FabA相关DH结构域)。
根据本发明，短语“开放阅读框”用缩写“Orf”表示。应当注意，开放阅读框编码的蛋白可以用全部大写的“ORF”表示，开放阅读框编码的核酸序列可以用全部小写的“orf”表示，但为了统一，拼写“Orf”在本文中优选用于描述核酸序列或其编码的蛋白。术语指蛋白还是核酸序列从上下文中是很明显的。
Schizochytrium PUFA PKS
图1是来自Schizochytrium PUFA PKS系统的三个开放阅读框的示意图，且包括该PUFA PKS系统的结构域结构。如US专利申请10/124,800详细描述的，每个开放阅读框的结构域结构如下：
开放阅读框A(OrfA)：
OrfA的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：1。OrfA是一个8730个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，它编码本文表示为SEQ ID NO：2的2910个氨基酸的序列。OrfA内有12个结构域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；(b)一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；(c)9个酰基载体蛋白(ACP))构域；和(d)一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)结构域。已保藏了OrfA的核苷酸序列，GenBank登录号AF378327(氨基酸序列登录号AAK728879)。
Schizochytrium OrfA的第一个结构域是β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域，本文也称为OrfA-KS。该结构域包含在从SEQ ID NO：1(OrfA)的大约1位和40位之间的起始位点到SEQ ID NO：1的大约1428位和1500位之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfA-KS结构域编码序列的核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：7(SEQ ID NO：1的1位-1500位)。含有KS结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：2(OrfA)的大约1位和14位之间的起始位点到SEQ ID NO：2的大约476位和500位之间的终止位点。含有OrfA-KS结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：2的1位-500位)。应注意OrfA-KS结构域含有一个活性位点基序：DXAC*(*酰基结合位点C215)。
根据本发明，具有β-酮脂酰-ACP合酶(KS)生物学活性(功能)的结构域或蛋白质，其特征是进行FAS(和PKS)延长反应循环起始步骤的酶。术语“β-酮脂酰-ACP合酶”与术语“3-酮酰基(keto acyl)-ACP合酶”、“β-酮酰基-ACP合酶”和“酮酰基ACP合酶”以及类似衍生词可以交换使用。用于延长的酰基基团通过硫酯键连接到酶活性位点的半胱氨酸残基上。在多步反应中，酰基酶与丙二酰-ACP缩合形成酮脂酰-ACP、CO2和游离酶。KS在延长循环中起关键作用且在许多系统中表现出比该反应循环中的其它酶具有更大的底物特异性。例如，大肠杆菌具有三个不同的KS酶，它们在生物体的生理学中分别具有各自特定的作用(Magnuson et al.，Microbiol.Rev.57,522(1993))。PUFA-PKS系统的两个KS结构域在PUFA生物合成反应程序中具有不同的作用。
作为一类酶，已经充分表征了KS的特性。许多证实的KS基因的序列是已知的，已经鉴定了活性位点基序且测定了一些序列的晶体结构。可通过与已知KS序列的同源性可容易地鉴定蛋白质(或蛋白的结构域)属于KS酶家族。
OrfA的第二个结构域是丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)结构域，本文也称为OrfA-MAT。该结构域包含在从SEQ ID NO：1(OrfA)的大约1723位和1798位之间的起始位点到SEQ ID NO：1的大约2805位和3000位之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfA-MAT结构域编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：9(SEQ ID NO：1的1723位-3000位)。含有MAT结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：2(OrfA)的大约575位和600位之间的起始位点到SEQ I DNO：2的大约935位和1000位之间的终止位点。含有OrfA-MAT结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：10(SEQ ID NO：2的575-1000位)。应注意OrfA-MAT结构域含有一个活性位点基序：GHS*XG(*酰基结合位点S706)，本文表示为SEQ ID NO：11。
根据本发明，具有丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)生物学活性(功能)的结构域或蛋白质，其特征是将丙二酰部分从丙二酰-CoA转移到ACP的结构域或蛋白质。术语“丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶”与“丙二酰酰基转移酶”以及类似衍生词可以交换使用。除了活性位点基序(GxSxG)，这些酶具有鉴定它们是MAT酶(与Schizochytrium Orf B的AT结构域相反)的延长基序(关键位置中的R和Q氨基酸)。在一些PKS系统(但不是PUFA PKS结构域)中，MAT结构域优先将甲基-丙二酰或乙基-丙二酰装载到ACP基团上(从相应的CoA酯)，从而在线型碳链中导入分支。通过其与已知MAT序列的同源性及其延长基序结构可以识别MAT结构域。
OrfA的3-11个结构域是9个串连的酰基载体蛋白(ACP)结构域，本文也称为OrfA-ACP(序列中第一个结构域是OrfA-ACP1，第二个结构域是OrfA-ACP2，第三个结构域是OrfA-ACP3，等等)。第一个ACP结构域，即OrfA-ACP1包含在从SEQ ID NO：1(OrfA)的大约3343位到约3600位的核苷酸序列内。含有OrfA-ACP1结构域的编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：12(SEQ ID NO：1的3343-3600位)。含有第一个ACP结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：2的约1115位到约1200位。含有OrfA-ACP1结构域的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：13(SEQ ID NO：2的1115-1200位)。应注意OrfA-ACP1结构域含有活性位点基序：LGIDS*(*泛酰巯基乙胺结合基序S1157)，本文以SEQ ID NO：14表示。
所有9个ACP结构域的核苷酸和氨基酸序列高度保守，因此每个结构域的序列在本文中没有用单独的序列标识符表示。然而，根据本文公开的信息，本领域技术人员可容易地测定含有其它8个ACP结构域中每个结构域的序列(参见下面的讨论)。
所有9个ACP结构域一起覆盖从SEQ ID NO：1的约3283位到约6288位的OrfA区域，它对应于SEQ ID NO：2的约1095位到约2096位的氨基酸位置。含有所有9个结构域的全部ACP区域的核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：16。以SEQ ID NO：16表示的区域包括各个ACP结构域之间的接头片段。9个结构域的重复间隔是SEQ ID NO：16中大约每330个核苷酸(相邻活性位点丝氨酸之间测定的实际氨基酸数目是104个至116个氨基酸)。9个ACP结构域中每一个都含有一个泛酰巯基乙胺结合基序LGIDS*(本文中以SEQ ID NO：14表示)，其中S*是泛酰巯基乙胺结合位点丝氨酸(S)。泛酰巯基乙胺结合位点丝氨酸(S)位于临近每个ACP结构域序列的中心。ACP结构域区域的每个末端和每个ACP结构域之间是高度富含脯氨酸(P)和丙氨酸(A)的区域，相信它是接头区域。例如ACP结构域1和2之间是序列：APAPVKAAAPAAPVASAPAPA，本文表示为SEQ ID NO：15。相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列，9个ACP结构域中每一个的活性位点丝氨酸残基(即泛酰巯基乙胺结合位点)的位置如下：ACP1＝S1157；ACP2＝S1266；ACP3＝S1377；ACP4＝S1488；ACP5＝S1604；ACP6＝S1715；ACP7＝S1819；ACP8＝S1930；和ACP9＝S2034。由于ACP结构域的平均大小在不包括接头的情况下是约85个氨基酸，包括接头则为约110个氨基酸，活性位点丝氨酸约位于结构域的中心，因此本领域技术人员可容易地测定OrfA中9个ACP结构域的每一个的位置。
根据本发明，具有酰基载体蛋白(ACP)生物学活性(功能)的结构域或蛋白质，其特征是小多肽(一般长80个至100个氨基酸)，其作用是作为载体通过硫酯键连接到与蛋白共价结合的辅因子来延长脂肪酸链。它们作为分离的单位或者作为更大蛋白质内的结构域存在。通过将CoA的磷酸泛酰巯基乙胺基部分转移到高度保守的ACP丝氨酸残基上，ACPs从失活的apo-形式转变成有功能的holo-形式。通过硫酯键连接、在磷酸泛酰巯基乙胺基部分的游离末端酰基基团附着到ACP上。通过用放射活性泛酰巯基乙胺标记以及与已知ACPs序列的同源性可鉴定ACPs。存在上述基序(LGIDS*)的变体也是ACP的一个标记。
OrfA的结构域12是β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)结构域，本文也称为OrfA-KR。该结构域包含在从SEQ ID NO：1的约6598位起始位点到SEQ IDNO：1的约8730位终止位点的核苷酸序列内。含有OrfA-KR结构域的编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：17(SEQ ID NO：1的6598-8730位)。含有KR结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：2(OrfA)的约2200位起始位点到SEQ ID NO：2的约2910位终止位点。含有OrfA-KR结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：18(SEQ ID NO：2的2200-2910位)。KR结构域内有与短链乙醛脱氢酶(KR是该家族的一个成员)同源的核心区。该核心区是从SEQ ID NO：1的约7198位至约7500位，对应于SEQ ID NO：2的2400-2500位氨基酸。
根据本发明，具有β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)活性(功能)的结构域或蛋白，其特征是催化ACP的3-酮脂酰形式的吡啶-核苷-依赖型还原的结构域或蛋白质。术语“β-酮脂酰-ACP还原酶”与术语“酮还原酶”、“3-酮脂酰-ACP还原酶”“酮酰基ACP还原酶”以及类似衍生词可以交换使用。它是脂肪酸从头生物合成延长循环中的第一个还原步骤以及通常在聚酮化合物生物合成中进行的反应。观察到与烯酰ACP还原酶(ER)的一个家族，另一种FAS还原酶(但不是PUFA PKS系统中的ER家族)，和短链乙醇脱氢酶家族有显著的序列相似性。对上述PUFAPKS区域的Pfam分析揭示在核心区中与短链乙醇脱氢酶家族同源。对相同区域的Blast分析揭示在核心区中与已知的KR酶以及延长区匹配，所述延长区与其它已鉴定的PUFA PKS系统的结构域同源。
开放阅读框B(OrfB)：
OrfB的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：3。OrfB是一个6177个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，编码2059个氨基酸的序列，本文表示为SEQ ID NO：4。OrfB内有4个结构域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；(b)一个链长因子(CLF)结构域；(c)一个酰基转移酶(AT)结构域；和(d)一个烯酰ACP-还原酶(ER)结构域。已保藏了OrfB的核苷酸序列，GenBank登录号AF378328(氨基酸序列登录号AAK728880)。
OrfB中的第一个结构域是β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域，本文也称为OrfB-KS。该结构域包含在从SEQ ID NO：3(OrfB)的约1位和43位之间的起始位点到SEQ ID NO：3的约1332位和1350位之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfB-KS结构域编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：19(SEQ ID NO：3的1-1350位)。含有KS结构域的氨基酸序列是从SEQ IDNO：4(OrfB)的约1位和15位之间的起始位点到SEQ ID NO：4的约444位和450位之间的终止位点。含有OrfB-KS结构域的氨基酸序列在本文表示为SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：4的1-450位)。应注意OrfB-KS结构域含有活性位点基序：DXAC*(*酰基结合位点C196)。KS的生物学活性以及鉴定具有该活性的蛋白质或结构域的方法已在上文中描述。
OrfB的第二个结构域是链长因子(CLF)结构域，本文也称为OrfB-CLF。该结构域包含在从SEQ ID NO：3(OrfB)的约1378位和1402位之间的起始位点到SEQ ID NO：3的约2682位和2700位之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfB-CLF结构域编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：21(SEQ ID NO：3的1378-2700位)。含有CLF结构域的氨基酸序列是从SEQIDNO：4(OrfB)的约460位和468位之间的起始位点到SEQ ID NO：4的约894位和900位之间的终止位点。含有OrfB-CLF结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：22(SEQ ID NO：4的460-900位)。应注意OrfB-CLF结构域含有不含酰基-结合型半胱氨酸的KS活性位点基序。
根据本发明，根据下述理论将结构域或蛋白质称为链长因子(CLF)。CLF最初被描述成是II型(分离的酶)PKS系统的特征且假定在确定延长循环的次数，从而在确定终产物的链长中起作用。CLF的氨基酸序列与KS结构域同源(且认为与KS蛋白质形成异二聚体)，但是它们没有活性位点半胱氨酸。CLF在PKS系统中的作用目前尚有争议。新证据(C.Bisang et al.，Nature401,502(1999))表明在引发PKS系统(提供将被延长的起始酰基基团)中起作用。在该作用中，认为CLF结构域使丙二酸盐(如丙二酰-ACP)去羧基化，从而形成可转移到KS活性位点的乙酸(acetate)基团。因此该乙酸盐作为可进行起始延长(缩合)反应的‘引发分子’。已经鉴定了II型CLF的同源物在一些模块型PKS系统中是‘装载’结构域。具有CLF序列特征的结构域在目前鉴定的所有PUFA PKS系统中均被发现且在各种情况下均发现它是多结构域蛋白的一部分。
OrfB的第三个结构域是AT结构域，本文也称为OrfB-AT。该结构域包含在从SEQ ID NO：3(OrfB)的约2701位和3598位之间的起始位点到SEQID NO：3的约3975位和4200位之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfB-AT结构域编码序列的核苷酸序列在本文表示为SEQ ID NO：23(SEQID NO：3的2701-4200位)。含有AT结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：4(OrfB)的约901位和1200位之间的起始位点到SEQ ID NO：4的约1325位和1400位之间的终止位点。含有OrfB-AT结构域的氨基酸序列在本文表示为SEQ ID NO：24(SEQ ID NO：4的901-1400位)。应注意OrfB-AT结构域含有活性位点基序GxS*xG(*酰基结合位S1140)，它是酰基转移酶(AT)蛋白的特征。
“酰基转移酶”或“AT”是指能进行许多不同酰基转移反应的一大类酶。术语“酰基转移酶”与术语“酰基转移因子”可以交换使用。Schizochytrium结构域与目前检查的所有其它PUFA PKS系统中存在的结构域具有较好的同源性，与鉴定了其特异性功能的一些酰基转移酶(例如，与丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶，MAT)的同源性很弱。尽管与MAT的同源性弱，相信该AT结构域不发挥MAT的作用，因为它不具有该酶的延长基序结构特征(参见上文的MAT结构域描述)。为了公开的目的，PUFA PKS系统中的AT结构域的功能包括，但不限于：将脂肪酰基基团从OrfA ACP结构域转移到水中(即硫酯酶-以游离脂肪酸形式释放脂肪酰基)，将脂肪酰基基团转移到诸如CoA的受体，在各种ACP结构域之间转移酰基基团，或者将脂肪酰基基团转移到亲脂受体分子(例如溶血磷脂酸)。
OrfB中的第四个结构域是ER结构域，本文也称为OrfB-ER。该结构域包含在从SEQ ID NO：3(OrfB)的约4648位的起始位点到SEQ ID NO：3的约6177位的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfB-ER结构域编码序列的核苷酸序列在本文表示为SEQ ID NO：25(SEQ ID NO：3的4648-6177位)。含有ER结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：4(OrfB)的约1550位的起始位点到SEQ ID NO：4的约2059位的终止位点。含有OrfB-ER结构域的氨基酸序列在本文表示为SEQ ID NO：26(SEQ ID NO：4的1550-2059位)。
根据本发明，该结构域具有烯酰(enoyl)-ACP还原酶(ER)的生物学活性。根据本发明，术语“烯酰(enoyl)-ACP还原酶”与“烯酰还原酶”“烯酰ACP-还原酶”“烯酰酰基(enoyl acyl)-ACP还原酶”可以交换使用。ER酶还原脂肪酰基(fatty acyl)-ACP中的反式双键(由DH活性导入)，导致这些碳完全饱和。PUFA PKS中的ER结构域与新鉴定的ER酶家族(Heath et al.，Nature406，145(2000))同源。Heath和Rock通过从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)克隆目的基因，纯化该基因表达的蛋白，并证明它在体外试验中具有ER活性，从而鉴定了这一新类ER酶。OrfB的Schizochytrium ER结构域的序列与肺炎链球菌ER蛋白质同源。目前检查的所有PUFA PKS系统均含有至少一个与Schizochytrium ER结构域的序列同源性极高的结构域。Schizochytrium PUFA PKS系统含有两个ER结构域(一个在OrfB上，一个在OrfC上)。
开放阅读框C(OrfC)：
OrfC的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：5。OrfC是4509个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，编码1503个氨基酸的序列，本文表示为SEQ ID NO：6。OrfC中有3个结构域：(a)两个FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)结构域；和(b)一个烯酰-ACP还原酶(ER)结构域。已保藏了OrfC的核苷酸序列，GenBank登录号AF378329(氨基酸序列登录号AAK728881)。
OrfC中的第一个结构域是DH结构域，本文也称为OrfC-DH1。它是OrfC中的两个DH结构域之一，因此命名为DH1。该结构域包含在从SEQID NO：5(OrfC)的约1位和778位之间的起始位点到SEQ ID NO：5的约1233位和1350位之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfC-DH1结构域编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：27(SEQ ID NO：5的1-1350位)。含有DH1结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：6(OrfC)的约1位和260位之间的起始位点到SEQ ID NO：6的约411位和450位之间的终止位点。含有OrfC-DH1结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：28(SEQ ID NO：6的1-450位)。
根据本发明，该结构域具有FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)的生物活性。术语“FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶”与术语“FabA-样β-羟基酰基-ACP脱水酶”、“β-羟酰-ACP脱水酶”、“脱水酶”以及类似衍生词可以交换使用。PUFA PKS系统中两个DH结构域的特征(DH2见下文)已经在前面部分中描述。这类酶从β-酮脂酰-ACP去掉HOH并在碳链中留下反式双键。PUFA PKS系统的DH结构域与细菌FAS系统相关性DH酶(而不是其它PKS系统的DH结构域)同源。细菌DH的一个亚型，即FabA-样DH，具有顺反异构酶活性(Heath et al.，J.Biol.Chem.，271，27795(1996)。它与FabA-样DH具有同源性表明一个或者两个DH结构域负责在PUFA PKS产物中插入顺式双键。
OrfC的第二个结构域是DH结构域，本文也称为OrfC-DH2。它是OrfC两个DH结构域的第二个，因此命名为DH2。该结构域包含在从SEQ ID NO：5(OrfC)的约1351位和2437位之间的起始位点到SEQ ID NO：5的约2607位和2850之间的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfC-DH2结构域编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：29(SEQ ID NO：5的1351-2850位)。含有DH2结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：6(OrfC)的约451位和813之间的起始位点到SEQ ID NO：6的约869位和950位之间的终止位点。含有OrfC-DH2结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：30(SEQ ID NO：6的451-950位)。DH的生物学活性已在上文中描述。
OrfC的第三个结构域是ER结构域，本文也称为OrfC-ER。该结构域包含在从SEQ ID NO：5(OrfC)的约2998位的起始位点到SEQ ID NO：5的约4509位的终止位点的核苷酸序列内。含有OrfC-ER结构域编码序列的核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：31(SEQ ID NO：5的2998-4509位)。含有ER结构域的氨基酸序列是从SEQ ID NO：6(OrfC)的约1000位的起始位点到SEQ ID NO：6的约1502位的终止位点。含有OrfC-ER结构域的氨基酸序列本文表示为SEQ ID NO：32(SEQ ID NO：6的1000-1502位)。ER的生物学活性已在上文中描述。
破囊壶菌23B PUFA PKS
Th.23B开放阅读框A(OrfA)：
Th.23B OrfA的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：38。SEQID NO：38编码Th.23B OrfA中的下列结构域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；(b)一个丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)结构域；(c)8个酰基载体蛋白(ACP))构域；和(d)一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)结构域。该结构域的组织与Schizochytrium OrfA(SEQ ID NO:1)中的相同，除了Th.23BOrfA有8个毗连的ACP结构域，而Schizochytrium OrfA有9个毗连的ACP结构域。Th.23B OrfA是8433个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，它编码本文表示为SEQ ID NO：39的2811个氨基酸的序列。Th.23B OrfA的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)与已知序列在标准BLAST检索中进行比较(BLAST参数：Blastp，low complexity filter Off，program-BLOSUM62，Gapcost-Existence:11，Extension1；(Altschul，S.F.，Madden，T.L.，
Figure A200480014646D0055154157QIETU
，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.”NucleicAcids Res.25：3389-3402所述的BLAST，全文内容包含在此作为参考)))。在氨基酸水平与Th.23B OrfA同源程度最高的序列是Schizochytrium OrfA(gb AAK72879.1)(SEQ ID NO：2)。所述比对延伸至全部查询但断成2片(由于ACP重复的数量不同)。SEQ ID NO：39首先在6至1985位(包括8个ACP结构域)与SEQ ID NO：2比对，并且与SEQ ID NO：2的序列同一性是2017个氨基酸中有54％相同。SEQ ID NO：39还在980至2811位与SEQ ID NO：2比对，并且与SEQ ID NO：2的序列同一性是1861个氨基酸中有43％相同。在第二组比对中，Th.23B8XACPs在保守泛酰巯基乙胺附着位点基序的区域内的匹配是明显的，但在Schizochytrium第一个ACP结构域的匹配非常弱(即Th.23B查询序列没有第9个ACP结构域，但Blastp输出在这些条件下试图无论如何比对它们)。SEQ ID NO：39显示出与来自Shewanellaoneidensis(登录号NP_717214)和Photobacter profundum(登录号AAL01060)的序列的次最接近同一性。
Th.23B OrfA的第一个结构域是KS结构域，本文也称为Th.23BOrfA-KS。KS结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：38的约1位至约1500位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：40。含有Th.23B KS结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：39中从约1位至约500位的区域，本文表示为SEQ ID NO：41。SEQ ID NO：39的这一区域与SEQ IDNO：39中从1位至约450位(也是SEQ ID NO：41的1位至约450位)的FabB(β-酮脂酰-ACP合酶)具有Pfam匹配。应注意Th.23B OrfA-KS结构域含有活性位点基序：DXAC*(*酰基结合位点C207)。Th.23B KS区域末端的特征基序GFGG位于SEQ ID NO：39的453-456位(也是SEQ ID NO：41的453-456位)。跨越SEQ ID NO：39中1-500位的氨基酸序列与SchizochytriumOrfA(SEQ ID NO：2)在496个氨基酸中约有79％相同。跨越SEQ ID NO：39中1-450位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfA(SEQ ID NO：2)在446个氨基酸中约有81％相同。
Th.23B OrfA的第二个结构域是MAT结构域，本文也称为Th.23BOrfA-MAT。MAT结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQID NO：38的约1503位至约3000位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：42。含有Th.23B MAT结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：39中从约501位至约1000位的区域，本文表示为SEQ ID NO：43。SEQ ID NO：39的这一区域与SEQ ID NO：39中从约580位至约900位(SEQ ID NO：43的80-400位)的FabD(丙二酰CoA:ACP酰基转移酶)具有Pfam匹配。应注意Th.23BOrfA-MAT结构域含有活性位点基序：GHS*XG(*酰基结合位点S697)，以SEQID NO：39的695-699位表示。跨越SEQ ID NO：39中501-1000位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfA(SEQ ID NO：2)在481个氨基酸中约有46％相同。跨越SEQ ID NO：39中580-900位的氨基酸序列与SchizochytriumOrfA(SEQ ID NO：2)在333个氨基酸中约有50％相同。
Th.23B OrfA的第3-10个结构域是8个串连的ACP结构域，本文也称为Th.23B OrfA-ACP(该序列中第一个结构域是OrfA-ACP1，第二个结构域是OrfA-ACP2，第三个结构域是OrfA-ACP3，等等)。ACP结构域的功能在上文详细描述了。第一个Th.23B ACP结构域，Th.23B OrfA-ACP1，包含在从SEQ ID NO：38(OrfA)的约3205位至约3555位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：44。含有第一个Th.23B ACP结构域的氨基酸序列是SEQID NO：39中从约1069位至约1185位的区域，本文表示为SEQ IDNO：45。跨越SEQ ID NO：39中1069-1185位的氨基酸序列与SchizochytriumOrfA(SEQ ID NO：2)在85个氨基酸中约有65％相同。Th.23B OrfA-ACP1与Schizochytrium OrfA中9个ACP结构域的任意一个具有相似的同一性。
Th.23B OrfA的8个ACP结构域彼此毗邻并可通过存在磷酸泛酰巯基乙胺结合位点基序LGXDS*(以SEQ ID NO：46表示)而鉴别，其中S*是磷酸泛酰巯基乙胺附着位点。参照SEQ ID NO：39，8个S*位点中每一个的氨基酸位置是1128(ACP1)，1244(ACP2)，1360(ACP3)，1476(ACP4)，1592(ACP5)，1708(ACP6)，1824(ACP7)和1940(ACP8)。所有8个Th.23B ACP结构域的核苷酸序列和氨基酸序列高度保守，因此每个结构域的序列在本文中没有用单独的序列标识符表示。然而，根据本文公开的信息，本领域技术人员可以容易地测定含有SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39的其它7个ACP结构域中每个结构域的序列。
所有8个Th.23B ACP结构域一起覆盖从SEQ ID NO：38的约3205位到约5994位的Th.23B OrfA，它对应于SEQ ID NO：39从约1069位到约1998位的氨基酸位置。含有所有8个结构域的全部ACP区域的核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：47。SEQ ID NO：47编码表示为SEQ ID NO：48的氨基酸序列。SEQ ID NO：48包括各个ACP结构域之间的接头片段。8个结构域的重复间隔是SEQ ID NO：48的约每116个氨基酸，并认为每个结构域由以活性位点基序(如上所述)为中心的约116个氨基酸组成。应注意Schizochytrium OrfA的9个毗邻ACP结构域之间的连接区域富含脯氨酸和丙氨酸残基，而破囊壶菌属OrfA中的8个毗邻ACP结构域之间的连接区域富含丝氨酸残基(没有脯氨酸或丙氨酸残基)。
Th.23B OrfA的最后一个结构域是KR结构域，本文也称为Th.23BOrfA-KR。KR结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：38的约6001位至约8433位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：49。含有Th.23B KR结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：39中从约2001位至约2811位的区域，本文表示为SEQ ID NO：50。SEQ ID NO：39的这一区域与SEQ ID NO：39中从约2300位至约2550位(SEQ ID NO：50的300-550位)的FabG(β-酮脂酰-ACP还原酶)具有Pfam匹配。跨越SEQ ID NO：39中2001-2811位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfA(SEQ ID NO：2)在831个氨基酸中约有40％相同。跨越SEQ ID NO：39中2300-2550位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfA(SEQ ID NO：2)在235个氨基酸中约有51％相同。
Th.23B开放阅读框B(OrfB)：
Th.23B OrfB的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：51。SEQID NO：51编码Th.23B OrfB中的下列结构域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)结构域；(b)一个链长因子(CLF)结构域；(c)一个酰基转移酶(AT)结构域；和(d)一个烯酰-ACP还原酶(ER))结构域。该结构域的组织与SchizochytriumOrfB(SEQ ID NO：3)中的相同，只是Schizochytrium蛋白AT和ER结构域之间的连接区域比Th.23B的长大约50-60个氨基酸。Schizochytrium的这个连接区域具有富含丝氨酸残基的特定区域(除了区域中的其它丝氨酸，它含有15个毗邻的丝氨酸残基)，而Th.23B OrfB的相应连接区域不富含丝氨酸残基。AT/ER连接区域中的这种不同很可能是由于Schizochytrium OrfB和Th.23B OrfB在该区域起始处的比对中的断裂。
Th.23B OrfB是5805个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，它编码本文表示为SEQ ID NO：52的1935个氨基酸的序列。Th.23B OrfB的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)与已知序列在标准BLAST检索中进行比较(BLAST参数：Blastp，low complexity filter Off，program-BLOSUM62，Gapcost-Existence:11，Extension1；(Altschul，S.F.，Madden，T.L.，
Figure A200480014646D0058154515QIETU
，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.”NucleicAcids Res.25：3389-3402所述的BLAST，全文包含在此作为参考)))。在氨基酸水平，在大部分OrfB区域与Th.23B OrfB同源程度最高的序列是Schizochytrium OrfB(gbAAK72880.1)(SEQ ID NO：4)，在最后一个区域与Th.23B OrfB同源程度最高的序列是Schizochytrium OrfC(gb AAK72881.1)(SEQID NO：6)(如上所述比对断成2片)。SEQ ID NO：52首先在10至约1479位(包括KS、CLF和AT结构域)与SEQ ID NO：4比对，并且与SEQ ID NO：4的序列同一性是1483个氨基酸中有52％相同。SEQ ID NO：52还在1491至1935位(包括ER结构域)与SEQ ID NO：4比对，并且与SEQ ID NO：4的序列同一性是448个氨基酸中有64％相同。
Th.23B OrfB的第一个结构域是KS结构域，本文也称为Th.23BOrfB-KS。KS结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：51(Th.23B OrfB)的约1位至约1500位的核苷酸序列内，本文表示为SEQID NO：53。含有Th.23B KS结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：52中从约1位至约500位的区域，本文表示为SEQ ID NO：54。SEQ ID NO：52的这一区域与FabB(β-酮脂酰-ACP合酶)从1位至约450位(SEQ ID NO：54的1-450位)具有Pfam匹配。应注意Th.23B OrfB-KS结构域含有一个活性位点基序：DXAC*，其中C*是酰基附着位点并且C*是SEQ ID NO：52的201位。KS区域末端的特征基序GFGG位于SEQ ID NO：52的434-437位。跨越SEQ IDNO：52中1-500位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在500个氨基酸中约有64％相同。跨越SEQ ID NO：52中1-450位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在442个氨基酸中约有67％相同。
Th.23B OrfB的第二个结构域是CLF结构域，本文也称为Th.23BOrfB-CLF。CLF结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：51(OrfB)的约1501位至约3000位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ IDNO：55。含有CLF结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：52中从约501位至约1000位的区域，本文表示为SEQ ID NO：56。SEQ ID NO：52的这一区域与FabB(β-酮脂酰-ACP合酶)从约550位至约910位(SEQ ID NO：56的50-410位)具有Pfam匹配。虽然CLF与KS同源，但它缺少KS蛋白中附着酰基基团的活性位点半胱氨酸。跨越SEQ ID NO：52中501-1000位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在517个氨基酸中约有49％相同。跨越SEQ ID NO：52中550-910位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ IDNO：4)在360个氨基酸中约有54％相同。
Th.23B OrfB的第三个结构域是AT结构域，本文也称为Th.23BOrfB-AT。AT结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：51(Th.23B OrfB)的约3001位至约4500位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：58。含有Th.23B AT结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：52中从约1001位至约1500位的区域，本文表示为SEQ ID NO：58。SEQ ID NO：52的这一区域与FabD(丙二酰CoA：ACP酰基转移酶)从约1100位至约1375位(SEQ ID NO：58的100-375位)具有Pfam匹配。虽然PUFA合酶的这个AT结构域与MAT蛋白同源，但它缺少MAT的延长的基序(关键精氨酸和谷氨酰胺残基)，并且认为它不参与丙二酰-CoA转移。存在酰基转移酶的GXS*XG基序，其中S*是酰基附着位点且位于SEQ ID NO：52的1123位。跨越SEQ ID NO：52中1001-1500位的氨基酸序列与SchizochytriumOrfB(SEQ ID NO：4)在459个氨基酸中约有44％相同。跨越SEQ ID NO：52中1100-1375位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在283个氨基酸中约有45％相同。
Th.23B OrfB的第四个结构域是ER结构域，本文也称为Th.23BOrfB-ER。ER结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：51(OrfB)的约4501位至约5805位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ IDNO：59。含有Th.23B ER结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：52中从约1501位至约1935位的区域，本文表示为SEQ ID NO：60。SEQ ID NO：52的这一区域与2-硝基丙烷二氧化酶相关的二氧化酶家族从约1501位至约1810位(SEQ ID NO：60的1-310位)具有Pfam匹配。由于与从肺炎链球菌新鉴别的ER酶同源，可以进一步预计这个结构域发挥ER的功能。跨越SEQ ID NO：52中1501-1935位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在433个氨基酸中约有66％相同。跨越SEQ ID NO：52中1501-1810位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在305个氨基酸中约有70％相同。
Th.23B开放阅读框C(OrfC)：
Th.23B OrfC的完整核苷酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：61。SEQID NO：61编码Th.23B OrfC中的下列结构域：(a)两个FabA样-β-羟酰-ACP脱水酶(DH)结构域，都与FabA蛋白同源(催化合成反式-2-癸烯酰(decenoyl)-ACP并催化该产物可逆异构化形成顺式-3-癸烯酰-ACP的酶)；(b)一个与Schizochytrium OrfB的ER结构域高度同源的烯酰-ACP还原酶(ER)结构域。该结构域的组织与Schizochytrium OrfC(SEQ ID NO：5)中的相同。
Th.23B OrfC是4410个核苷酸的序列(不包括终止密码子)，它编码本文表示为SEQ ID NO：62的1470个氨基酸的序列。Th.23B OrfC的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)与已知序列在标准BLAST检索中进行比较(BLAST参数：Blastp，low complexity filter Off，program-BLOSUM62，Gapcost-Existence：11，Extension 1；(Altschul，S.F.，Madden，T.L.，
Figure A200480014646D00611
A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.”NucleicAcids Res.25：3389-3402所述的BLAST，整体结合与此作为参考))。在氨基酸水平与Th.23B OrfC同源程度最高的序列是Schizochytrium OrfC(gbAAK72881.1)(SEQ ID NO：6)。SEQ ID NO：52与Schizochytrium OrfC(SEQ IDNO：6)有66％相同。
Th.23B OrfC的第一个结构域是DH结构域，本文也称为Th.23BOrfC-DH1。DH结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：61(OrfC)的约1位至约1500位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：63。含有Th.23B DH1结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：62的从约1位至约500位的区域，本文表示为SEQ ID NO：64。SEQ ID NO：62的这一区域与如上所述FabA的275位至约400位(SEQ ID NO：64的275-400位)具有Pfam匹配。跨越SEQ ID NO：62中1-500位的氨基酸序列与SchizochytriumOrfC(SEQ ID NO：6)在526个氨基酸中约有66％相同。跨越SEQ ID NO：62中275-400位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfC(SEQ ID NO：6)在126个氨基酸中约有81％相同。
Th.23B OrfC的第二个结构域也是DH结构域，本文也称为Th.23BOrfC-DH2。它是OrfC中两个DH结构域中的第二个，因此命名为DH2。该结构域包含在从SEQ ID NO：61(OrfC)的约1501位至约3000位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ ID NO：65。含有Th.23B DH2结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：62中从约501位至约1000位的区域，本文表示为SEQ ID NO：66。SEQ ID NO：62的这一区域与如上所述FabA的约800位至约925位(SEQID NO：66的300-425位)具有Pfam匹配。跨越SEQ ID NO：62中501-1000位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfC(SEQ ID NO：6)在518个氨基酸中约有56％相同。跨越SEQ ID NO：62中800-925位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfC(SEQ ID NO：6)在124个氨基酸中约有58％相同。
Th.23B OrfC的第三个结构域是ER结构域，本文也称为Th.23BOrfC-ER。ER结构域的功能在上文详细描述了。该结构域包含在从SEQ IDNO：61(OrfC)的约3001位至约4410位的核苷酸序列内，本文表示为SEQ IDNO：67。含有Th.23B ER结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO：62中从约1001位至约1470位的区域，本文表示为SEQ ID NO：68。SEQ ID NO：62的这一区域与如上所述的2-硝基丙烷二氧化酶相关的二氧化酶从约1025位至约1320位(SEQ ID NO：68的25-320位)具有Pfam匹配。由于与从肺炎链球菌新鉴别的ER酶同源，可以进一步估计这个结构域发挥ER酶的功能。跨越SEQ ID NO：62中1001-1470位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ IDNO：4)在474个氨基酸中约有75％相同。跨越SEQ ID NO：62中1025-1320位的氨基酸序列与Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：4)在296个氨基酸中约有81％相同。
本发明一个实施方案涉及来自非细菌PUFA PKS系统的分离蛋白或结构域，其同系物和/或其片段。发明还包括编码本文所述任意蛋白、结构域或肽的分离核酸分子(在下文详细讨论)。根据本发明，分离的蛋白或肽，如来自PUFA PKS系统的蛋白或肽是已经从其天然环境移去的(即对其进行了人工操作)的蛋白或其片段(包括多肽和肽)，并且可以包括例如纯化的蛋白、部分纯化的蛋白、重组产生的蛋白和合成产生的蛋白。因而，“分离”不反映蛋白纯化的程度。优选本发明的分离蛋白是重组产生的。分离的肽可以通过合成产生(例如化学合成，如通过肽合成)或重组产生。此外并通过举例的方式，“破囊壶菌属PUFA PKS蛋白”指来自破囊壶菌属微生物的PUFAPKS蛋白(通常包括天然PUFA PKS蛋白的同系物)，或根据对来自破囊壶菌属的天然PUFA PKS蛋白的结构(例如序列)，也许是对功能的认知而产生的PUFA PKS蛋白。换句话说，通常所指的破囊壶菌属PUFA PKS蛋白包括与破囊壶菌属的天然PUFA PKS蛋白的结构和功能基本相似的任何PUFA PKS蛋白，或者是如本文详细描述的来自破囊壶菌属的天然PUFA PKS蛋白的生物学活性(即具有生物学活性)同系物。因此，破囊壶菌属PUFA PKS蛋白可以包括纯化的、部分纯化的、重组的、突变的/修饰的和合成的蛋白。相同描述可以应用于本文所述的其他蛋白或肽，如来自Schizochytrium或来自其他微生物的PUFAPKS蛋白和结构域。
根据本发明，术语“修饰”和“突变”可以交换使用，特别是关于本文所述蛋白或肽(或核酸序列)一级氨基酸序列的修饰/突变。术语“修饰”还可以用来描述蛋白或肽的翻译后修饰，包括但不限于，甲基化、法呢基化(farnesylation)、羧甲基化、香叶基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酸化和/或酰胺化。修饰还可包括，例如蛋白或肽与另一化合物的络合。例如如果修饰不同于天然、野生型蛋白或肽中发生的翻译后修饰，可以认为这种修饰是突变。
本文所用的术语“同系物”用于指一种蛋白或肽，它由于对天然蛋白或肽的一种或多种较小的修饰或突变从而不同于天然蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)，但保持天然形式的全部基本蛋白和侧链结构(即因为与野生型蛋白相关，因此同系物是可识别的)。这种变化包括，但不限于：一个或一些氨基酸侧链的变化；一个或一些氨基酸的变化，包括缺失(例如蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；一个或一些原子立体化学方面的改变；和/或较小的衍生化作用，包括但不限于：甲基化、法呢基化、香叶基化(geranyl geranylation)、糖基化、羧甲基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酸化和/或酰胺化。与天然蛋白或肽相比较，同系物可以具有增强、降低或基本类似的特性。PUFA PKS蛋白或结构域的优选同系物在下文详细描述。应注意同系物可以包括合成产生的同系物，给定蛋白或结构域的天然等位变体，或来自获得参照序列的生物体之外的生物体的同源序列。
保守取代一般包括在下列基团的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。取代还可根据保守疏水性或亲水性进行(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(1982)157:105-132)，或根据设想类似多肽二级结构的能力进行(Chou和Fasman，Adv.Enzymol.(1978)47：45-148，1978)。
同系物可以是天然等位基因变异或天然突变的结果。编码蛋白的核酸的天然等位变体是一种基因，它存在于基因组中与编码这种蛋白的基因基本相同的基因座(或位置)，但由于例如突变或重组引起的天然变异，它具有相似的而不是相同的序列。等位变体一般编码与和它进行比较的基因编码的蛋白活性类似的蛋白。一种类型的等位变体可以编码由于遗传密码简并性具有不同核酸序列的相同的蛋白。等位变体还可以包括基因5′或3′非翻译区(例如在调节控制区域)的改变。等位变体是本领域技术人员公知的。
同系物可用本领域已知的蛋白生产技术生产，包括但不限于，直接修饰分离的天然蛋白，直接合成蛋白，或用例如经典的或重组DNA技术影响随机突变或定点突变从而修饰编码蛋白的核酸序列。
与野生型蛋白相比较，蛋白同系物中的修饰或突变提高、降低或基本不改变同系物与天然(野生型)蛋白相比较的基本生物学活性。通常，蛋白的生物学活性或生物学作用是指蛋白显示或执行的任意功能，所述功能是在体内(即在蛋白的天然生理环境)或体外(即在实验室的条件下)测量或观察到的该蛋白天然形式的功能。PUFA PKS系统的生物学活性和组成PUFA PKS系统的各个蛋白/结构域在本文其它部分已经详细描述了。蛋白的修饰，如同系物或模拟物中的修饰(下文讨论)，可以产生生物学活性与天然蛋白相同的蛋白，或产生与天然蛋白相比较生物学活性降低或提高的蛋白。引起蛋白表达降低或蛋白活性降低的修饰可以称作蛋白失活(完全或部分失活)，下调或功能(或活性)降低。类似地，引起蛋白表达增加或蛋白活性增加的修饰可以称作蛋白扩增、超量产生、激活、增强、上调或功能(或活性)提高。应注意通常所指的具有野生型蛋白生物学活性的同系物未必指该同系物与野生型蛋白的生物学活性相同，具体是关于生物学活性水平方面。相反地，同系物可以执行与野生型蛋白相同的生物学活性，但是在与野生型蛋白相比降低或提高的活性水平。PUFA PKS系统的功能域是能够执行生物学功能(即具有生物学活性)的结构域(即结构域可以是蛋白的一部分)。
检测和测量PUFA PKS蛋白或结构域生物学活性的方法包括，但不限于，测量PUFA PKS蛋白或结构域的转录，测量PUFA PKS蛋白或结构域的翻译，测量PUFA PKS蛋白或结构域的翻译后修饰，测量PUFA PKS蛋白或结构域的酶活性，和/或测量PUFA PKS系统一种或多种产物的产生(例如PUFA产生)。应注意没有要求本发明的分离蛋白(包括同系物)必须具有野生型蛋白的生物学活性。例如PUFA PKS蛋白或结构域可以是截短的、突变的或失活的蛋白。这种蛋白例如用于筛选试验，或用于其他目的，如产生抗体。在一个优选实施方案中，本发明的分离蛋白具有与野生型蛋白类似的生物学活性(虽然如上所述不必相等)。
测量蛋白表达水平的方法通常包括，但不限于：Western印迹，免疫印迹，酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，免疫沉淀，表面细质团共振(surface plasmon resonance)，化学发光，荧光偏振，磷光现象，免疫组织化学分析，基质-辅助激光解吸/飞行电离时间(MALDI-TOF)质谱测定法，微细胞计量，微阵列，显微镜检查法，荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞计数，以及根据蛋白特性的试验，所述特性包括但不限于酶活性或与其他蛋白伙伴(partner)的相互作用。结合试验是本领域公知的。例如BIAcore机器可用于测定两个蛋白的络合物的结合常数。通过监测当缓冲液流过芯片时，折射率相对时间的变化可以测定络合物的解离常数(O′Shannessy et al.Anal.Biochem.212：457-468(1993)；Schuster et al.，Nature365：343-347(1993)。测量一种蛋白与另一种蛋白结合的其他合适的试验包括，例如免疫测定诸如酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定(RIA)；或通过监测蛋白的荧光、UV吸收、循环二色性(circular dichrosim)或核磁共振(NMR)的光谱学或光学性质的变化从而测定结合。
本发明的一个实施方案涉及分离的蛋白，含有选自如下的氨基酸序列：(a)选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：62组成的组的氨基酸序列及其生物学活性片段；(b)选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：64，SEQ66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列及其生物学活性片段；(c)与(a)所述氨基酸序列的至少500个连续氨基酸至少约60％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和/或(d)与(b)所述氨基酸序列至少约60％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。在另一实施方案中，所述氨基酸序列包括本发明所包括的数个PUFA PKS结构域的上述活性位点结构域或其它功能基序。在一个实施方案中，上述氨基酸序列不包括下列氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32。
在本发明的一个方面，本发明包含的PUFA PKS蛋白质或结构域，包括本文所述的具体PUFA PKS蛋白质或结构域的同系物，含有与选自SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：62的氨基酸序列的至少500个连续氨基酸至少约60％相同的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。在另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：62中任一个的至少约600个连续氨基酸，更优选至少约700个连续氨基酸，更优选至少约800个连续氨基酸，更优选至少约900个连续氨基酸，更优选至少约1000个连续氨基酸，更优选至少约1100个连续氨基酸，更优选至少约1200个连续氨基酸，更优选至少约1300个连续氨基酸，更优选至少约1400个连续氨基酸，或与全长SEQ ID NO：62至少约60％相同。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：52中任一个的至少约1500个连续氨基酸，更优选至少约1600个连续氨基酸，更优选至少约1700个连续氨基酸，更优选至少约1800个连续氨基酸，更优选至少约1900个连续氨基酸，或与全长SEQ ID NO：52至少约60％相同。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：39的至少约2000个连续氨基酸，更优选至少约2100个连续氨基酸，更优选至少约2200个连续氨基酸，更优选至少约2300个连续氨基酸，更优选至少约2400个连续氨基酸，更优选至少约2500个连续氨基酸，更优选至少约2600个连续氨基酸，更优选至少约2700个连续氨基酸，更优选至少约2800个连续氨基酸，甚至更优选与全长SEQ ID NO：39至少约60％相同。在一个实施方案中，上述氨基酸序列不包括下列氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：32。
另一方面，本发明包含的PUFA PKS蛋白质或结构域，包括上述同系物，含有与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：62的氨基酸序列在上段所述任一连续氨基酸长度上至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约75％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约85％相同，更优选至少约90％相同，更优选至少约95％相同，更优选至少约96％相同，更优选至少约97％相同，更优选至少约98％相同，更优选至少约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。在一个实施方案中，上述氨基酸序列不包括下列氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32。
本发明的一个方面，本发明包含的PUFA PKS蛋白质或结构域，包括上述同系物，含有与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ 66，SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少约60％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ66，SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少约65％相同性，更优选至少约70％相同，更优选至少约75％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约85％相同，更优选至少约90％相同，更优选至少约95％相同，更优选至少约96％相同，更优选至少约97％相同，更优选至少约98％相同，更优选至少约99％相同，其中该氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。在一个实施方案中，上述氨基酸序列不包括下列氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32。
另一方面，本发明包含的PUFA PKS蛋白质或结构域，包括上述同系物，含有与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，和SEQ ID NO：58的氨基酸序列至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，和SEQ ID NO：58的氨基酸序列至少约55％相同，更优选至少约60％相同，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与选自SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，和SEQ ID NO：58的氨基酸序列至少约65％相同，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64的氨基酸序列至少约70％相同，更优选至少约75％相同，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：68的氨基酸序列至少约80％相同，更优选至少约85％相同，更优选至少约90％相同，更优选至少约95％相同，更优选至少约96％相同，更优选至少约97％相同，更优选至少约98％相同，更优选至少约99％相同，其中该氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。在一个实施方案中，上述氨基酸序列不包括下列氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32。
一个优选实施方案中，本发明的分离的蛋白或结构域包含下述氨基酸序列，基本由下述氨基酸序列组成，或由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，或其生物学活性片段，包括任意具有PUFA
PKS系统至少一个结构域的生物学活性的片段。
本发明的一个方面，下列Schizochytrium蛋白和结构域用于本发明的一个或多个实施方案，所有这些蛋白和结构域之前已在US专利申请10/124,800(出处同上)详细描述了。本发明的一个方面，用于本发明的PUFAPKS蛋白或结构域包含与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的至少500个连续氨基酸至少约60％相同的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：6中任一个的至少约600个连续氨基酸，更优选至少约700个连续氨基酸，更优选至少约800个连续氨基酸，更优选至少约900个连续氨基酸，更优选至少约1000个连续氨基酸，更优选至少约1100个连续氨基酸，更优选至少约1200个连续氨基酸，更优选至少约1300个连续氨基酸，更优选至少约1400个连续氨基酸，或与全长SEQ ID NO：6至少约60％相同。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中任一个的至少约1600个连续氨基酸，更优选至少约1700个连续氨基酸，更优选至少约1800个连续氨基酸，更优选至少约1900个连续氨基酸，更优选至少约2000个连续氨基酸，或与全长SEQ ID NO：4至少约60％相同。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的至少约2100个连续氨基酸，更优选至少约2200个连续氨基酸，更优选至少约2300个连续氨基酸，更优选至少约2400个连续氨基酸，更优选至少约2500个连续氨基酸，更优选至少约2600个连续氨基酸，更优选至少约2700个连续氨基酸，更优选至少约2800个连续氨基酸，甚至更优选与全长SEQ ID NO：4至少约60％相同。
另一方面，用于本发明一个或多个实施方案的PUFA PKS蛋白或结构域包含与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列在上段所述任一连续氨基酸长度上至少约65％相同，更优选至少约70％相同，更优选至少约75％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约85％相同，更优选至少约90％相同，更优选至少约95％相同，更优选至少约96％相同，更优选至少约97％相同，更优选至少约98％相同，更优选至少约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。
本发明的另一方面，用于本发明一个或多个实施方案的PUFA PKS蛋白或结构域包含与选自SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少约60％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。另一方面，所述蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少约65％相同性，更优选至少约70％相同，更优选至少约75％相同，更优选至少约80％相同，更优选至少约85％相同，更优选至少约90％相同，更优选至少约95％相同，更优选至少约96％相同，更优选至少约97％相同，更优选至少约98％相同，更优选至少约99％相同，其中该氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。
本发明另一方面，用于本发明一个或多个实施方案的PUFA PKS蛋白或结构域包含下述氨基酸序列，基本由下述氨基酸序列组成，或由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32或其生物学活性片段，包括任意具有PUFA PKS系统至少一个结构域的生物学活性的片段。
根据本发明，术语“相邻的”或“连续的”对于本文所述核酸或氨基酸序列是指以不中断的序列相连。例如，含有第二个序列的30个相邻(或连续)氨基酸的第一个序列，是指第一个序列包含与第二个序列中30个氨基酸残基的不中断序列100％相同的30个氨基酸残基的不中断序列。同样，与第二个序列“100％相同”的第一个序列是指第一个序列与第二个序列完全匹配，核苷酸或氨基酸之间没有缺口。
如本文所用，除非另有说明，同一性百分数(％)是指使用下述方法进行的同源性评估：(1)进行BLAST 2.0 Basic BLAST同源性检索，使用blastp进行氨基酸检索，blastn用于核酸检索，blastX用于核酸检索以及检索所有6个开放阅读框中的翻译的氨基酸，全部使用标准默认参数，其中通过默认来滤过查询序列的低复杂性区域(Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)，“Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs”NucleicAcids Res.25：3389-3402中描述的，整体引入此处作为参考)；(2)BLAST2比对(使用下述参数)；(3)和/或使用标准默认参数的PSI-BLAST(位置特异性重复BLAST)。应注意由于BLAST 2.0 Basic BLAST和BLAST2之间在标准参数上有一些区别，使用BLAST 2程序可能认为两个特定序列具有显著的同源性，而用BLAST 2.0 Basic BLAST进行检索时，以一个序列作为查询序列，可能没有鉴定出最匹配的第二个序列。另外，PSI-BLAST提供了自动的、易使用的“图谱(profile)”检索版本，它是寻找序列同系物的一个敏感途径。该程序首先进行有缺口的BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序使用来自任何有意义比对的信息，其被返回以构建位置特异性评分矩阵，所述信息可代替查询序列用于下一轮数据库检索。因此，应明白可使用这些程序中的任一种测定同一性百分数。
使用BLAST 2序列可以将两个具体序列彼此比对，如Tatusova和Madden，(1999)，“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174，247所述的，整体引入此处作为参考。在blastp或blastn进行BLAST 2序列比对，使用BLAST 2.0算法在两个序列之间进行有缺口的(Gapped)BLAST检索(BLAST 2.0)，允许在所得的序列排列中引入间隔(缺失和插入)。为了本文清楚的目的，使用如下标准默认参数进行BLAST 2序列排列。
对于blastn，使用0 BLOSUM6 2矩阵：
匹配得分＝1
错配罚分＝-2
开放缺口(5)和延伸缺口(2)罚分
缺口_x下降(dropoff)(50)期望(expect)(10)word size(11)筛选(filter)(开(on))
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：
开放缺口(11)和延伸缺口(1)罚分
缺口_x下降(50)期望(10)word size(3)筛选(开(on))
根据本发明，具有PUFA PKS系统至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列是具有本文详细描述的PUFA PKS系统至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列，如前面以Schizochytrium PUFA PKS系统作为例证或如以破囊壶菌属PUFA PKS系统作为本文另一例证所示的。Schizochytrium或破囊壶菌属PUFA PKS系统中各种结构域的生物学活性在上文中已详细描述。因此，用于本发明的分离的蛋白可以包括任意PUFA PKS开放阅读框的翻译产物，任意PUFA PKS结构域，及其生物学活性片段，或具有生物学活性的天然PUFA PKS开放阅读框产物或结构域的任意同系物。
在本发明的另一实施方案中，具有本发明PUFA PKS系统至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列包括与天然PUFA PKS蛋白质或多肽足够相似的氨基酸序列，以致于编码该氨基酸序列的核酸序列在中等，高度，或极高严格条件(下文描述)下，能够与编码天然PUFA PKS蛋白质或多肽的核酸分子杂交(即与编码天然PUFA PKS蛋白质或多肽的核酸链的互补链杂交)。优选具有本发明PUFA PKS系统至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列由这样一种核酸序列编码，该核酸序列在中等，高度或极高严格条件下与编码上述任意一种PUFA PKS蛋白或结构域的氨基酸序列的核酸序列的互补链杂交。推定互补序列的方法是本领域技术人员已知的。应注意由于氨基酸测序和核酸测序技术不是完全无误差的，因此本文提供的序列最多代表本发明PUFA PKS结构域和蛋白质的表观序列。
本文使用的杂交条件是指标准杂交条件，在该条件下核酸分子用于鉴定相似的核酸分子。例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989公开了这种标准条件。Sambrooket al.，(出处同上)整体引入此处作为参考(具体参见9.31-9.62页)。另外，例如Meinkoth et al.，1984，Anal.Biochem.138，267-284；Meinkoth et al.(出处同上)公开了计算合适的杂交条件和洗涤条件以完成允许各种程度核苷酸错配的杂交的公式，整体引入此处作为参考。
更具体地说，本文提及的中等严格的杂交条件和洗涤条件是指可以分离与在杂交反应中作为探针的核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约30％或更少核苷酸错配的条件)。本文提及的高度严格的杂交条件和洗涤条件是指可以分离与在杂交反应中作为探针的核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约20％或更少核苷酸错配的条件)。本文提及的极高严格的杂交条件和洗涤条件是指可以分离与在杂交反应中作为探针的核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约10％或更少核苷酸错配的条件)。如上所述，本领域技术人员可使用Meinkoth et al.(出处同上)的公式计算合适的杂交条件和洗涤条件以达到这些特定的核苷酸错配水平。该条件依赖于形成的是DNA:RNA杂交体还是DNA:DNA杂交体而变化。计算的DNA:DNA杂交体的解链温度比DNA:RNA杂交体低10℃。在具体实施方案中，DNA:DNA杂交体的严格杂交条件包括在6×SSC(0.9M Na+)的离子强度，约20℃至约35℃(较低度严格条件)，更优选约28℃至约40℃(更严格条件)，甚至更优选约35℃至约45℃(甚至更严格条件)，合适的洗涤条件下进行杂交。在具体实施方案中，DNA：RNA杂交体的严格杂交条件包括在6×SSC(0.9MNa+)的离子强度，约30℃至约45℃，更优选约38℃至约50℃，甚至更优选约45℃至约55℃，类似的严格洗涤条件下进行杂交。这些值是基于对大于约100个核苷酸，0％甲酰胺和约40％G+C含量的分子解链温度的计算。或者，可如Sambrook et al.，出处同上，9.31至9.62页所述根据经验计算Tm值。一般来说，洗涤条件应当尽可能严格，且对于选定的杂交条件应是合适的。例如，杂交条件可包括盐和温度条件的组合，该温度比计算的具体杂交体的Tm低约20-25℃，且洗涤条件一般包括盐和温度条件的组合，该温度比计算的具体杂交体的Tm低约12-20℃。适用于DNA：DNA杂交体的杂交条件的一个例子包括在6×SSC(50％甲酰胺)、约42℃杂交2-24小时，接着进行洗涤步骤，包括在室温、约2×SSC中洗涤一次或多次，然后在更高温度和更低离子强度的条件下进一步洗涤(例如在约37℃、约0.1X-0.5XSSC中洗涤至少一次，接着在约68℃、约0.1X-0.5X SSC中洗涤至少一次)。
本发明还包括融合蛋白，包含附着于一个或多个融合片段的任意PUFAPKS蛋白或结构域或其任意同系物或片段。用于本发明的适合的融合片段包括，但不限于，能增强蛋白稳定性的片段；能提供其它所需生物学活性的片段；和/或协助蛋白纯化的片段(例如通过亲和层析)。合适的融合片段可以是具有所需功能(例如给予提高的稳定性，溶解性，生物学活性；和/或简化蛋白纯化)的任意大小的结构域。融合蛋白可以与蛋白的氨基末端和/或羧基末端连接并且易于断裂从而可以直接回收所需蛋白。优选通过培养用融合核酸分子转染的重组细胞从而产生融合蛋白，所述融合核酸分子编码包括附着于如上所述本发明蛋白羧基末端或氨基末端的融合片段的蛋白。
在本发明的一个实施方案中，可产生任一上述PUFA PKS的氨基酸序列，以及该序列的同系物，其在给定氨基酸序列的C-末端和/或N-末端各自侧接从至少一个至多达约20个附加异源氨基酸。所得的蛋白质或多肽可称为“基本上由给定的氨基酸序列组成”。根据本发明，异源性氨基酸是天然状况下不与给定氨基酸序列侧接(即不见于天然状况、体内)的氨基酸序列，或在该基因中存在时如果使用产生该给定氨基酸序列所来源程序的生物体的标准密码子用法翻译天然序列中的该核苷酸时，不由编码给定氨基酸序列的天然核酸序列侧翼的核苷酸编码的氨基酸序列。同样，短语“基本上由其组成”在本文中当用于指核酸序列时，是指编码给定氨基酸序列的核酸序列在编码给定氨基酸序列的核酸序列5’和/或3’末端各侧带有从至少一个到多达约60个添加的异源核苷酸。异源性核苷酸是在天然基因中存在时不是在编码给定氨基酸序列的核酸序列侧翼天然发现(即，体内天然状况下未发现)的。
本发明蛋白或结构域和/或其同系物或片段的最小尺寸是，一方面其大小足以具有必需的生物学活性的，或其大小足以作为抗原以产生抗体或在体外试验中作为靶。在一个实施方案中，本发明蛋白长至少8个氨基酸(例如适用于抗体表位或作为试验中可检测的肽)，或至少约25个氨基酸，或至少约50个氨基酸，或至少约100个氨基酸，或至少约150个氨基酸，或至少约200个氨基酸，或至少约250氨基酸，或至少约300个氨基酸，或至少约350个氨基酸，或至少约400个氨基酸，或至少约450个氨基酸，或至少约500个氨基酸，或至少约750个氨基酸等等，长度在8个氨基酸直至本发明蛋白或结构域全长之间或更长，全部是整数长度(例如8，9，10，...25，26，...500，501...1234，1235，...)。除了实际限制，该蛋白的最大尺寸没有限制，因为如果需要，蛋白可以包括PUFA PKS蛋白、结构域的一部分，或其生物学活性或有用片段，或全长PUFA PKS蛋白或结构域加上附加序列(例如融合蛋白序列)。
本发明另一实施方案包括分离的核酸分子，包含、基本含有、或含有核酸序列及与其完全互补的核酸序列，所述核酸序列编码上述鉴别的任意蛋白或结构域，包括其同系物或片段。根据本发明，分离的核酸分子是从其天然环境中取出(即对其进行了人工操作)的核酸分子，其天然环境是天然状态下发现该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离”不反映核酸分子的纯化程度，但是表明该分子不包括天然状况下发现该核酸分子的完整基因组或完整染色体。分离的核酸分子可以包括基因。包括基因的分离的核酸分子不是包括该基因的染色体的一个片段，而是包括编码区和伴随基因的调控区，但是没有在同一染色体中天然发现的其它基因。分离的核酸分子也可以包括特定核酸序列，其侧翼(即序列的5’和/或3’端)是天然状况下一般不是该特定核酸序列侧翼的其它核酸(即异源序列)。分离的核酸分子可以包括DNA，RNA(例如mRNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要是指物理学核酸分子且短语“核酸序列”主要是指核酸分子的核苷酸序列，但是两个短语可交换使用，特别是对于能编码蛋白或蛋白结构域的核酸分子或核酸序列。
优选的是，使用重组DNA技术(例如聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成从而产生本发明的分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然的核酸分子及其同系物，包括但不限于，天然等位基因变体和修饰的核酸分子，其中核苷酸以这样的方式插入、缺失、取代和/或倒置，使修饰对本文所述PUFA PKS系统的生物学活性产生了所需的影响。蛋白质同系物(例如由核酸同系物编码的蛋白质)在上文中已有详细讨论。
使用本领域技术人员已知的许多方法可以产生核酸分子同系物(参见例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Labs Press，1989)。例如，可使用各种技术修饰核酸分子，该技术包括但不限于，传统诱变技术和重组DNA技术，例如定点诱变，化学处理核酸分子以诱导突变，限制性酶裂解核酸片段，连接核酸片段，核酸序列选定区域的PCR扩增和/或诱变，合成寡核苷酸混合物并连接混合物组以“构建”核酸分子混合体，及其组合。通过筛选核酸编码的蛋白质的功能和/或通过与野生型基因杂交可从修饰的核酸混合物中选择核酸分子同系物。
本发明核酸分子的最小尺寸是大小足以形成探针或寡核苷酸引物，该探针或寡核苷酸引物与用于本发明的核酸分子的互补序列能够形成稳定的杂交体(例如在中等、高度或极高严格条件下)，或者其大小足以编码具有本发明PUFA PKS系统至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列。因此，编码该蛋白的核酸分子的大小取决于核酸组成和核酸分子与互补序列之间的同源性或同一性百分数以及杂交条件本身(例如温度、盐浓度和甲酰胺浓度)。用作寡核苷酸引物或探针的核酸分子的最小尺寸一般是如果核酸分子富含GC则为至少约12个至约15个核苷酸，如果富含AT则为至少约15至约18个碱基。除了实际限制，本发明核酸分子的最大尺寸没有限制，因为核酸分子可以包含序列，该序列足以编码PUPA PKS系统的结构域的生物活性片段，PUFA PKS系统的完整结构域，PUFA PKS系统开放阅读框(Orf)内的几个结构域，PUFA PKS系统的完整Orf，或一个以上PUFA PKS系统的Orf。
本发明一个实施方案中，分离的核酸分子包含，基本含有，或含有编码上述任意氨基酸序列，包括本文所述的来自Schizochytrium或破囊壶菌属的任意氨基酸序列或其同系物的核酸序列。一方面，核酸序列选自SEQIDNO：1，SEQ ID NO：3，SEQID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQID NO：12，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ IDNO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：67，或同系物(包括与该序列至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列)，或其片段，或其任意互补序列。
本发明另一实施方案包括含有重组载体和核酸序列的重组核酸分子，所述核酸序列编码具有本文所述PUFAPKS系统至少一个结构域(或其同系物或片段)的生物学活性的蛋白或肽。该核酸序列在上文中有详细描述。根据本发明，重组载体是一种改造的(即人工产生的)核酸分子，它用作处理选定核酸序列并将该核酸序列导入宿主细胞的工具。因此重组载体适用于克隆，测序，和/或处理选定的核酸序列，例如通过表达和/或传递选定的核酸序列到宿主细胞中以形成重组细胞。该载体一般含有异源核酸序列，即天然状况下未发现与需要克隆的或传递的核酸序列相连的核酸序列，尽管载体也可含有天然状况下发现与本发明的核酸分子相连的或有利于本发明核酸分子表达的调控核酸序列(例如启动子，非翻译区)(下面详细讨论)。载体可以是RNA或DNA，是原核的或真核的，一般是质粒。载体可作为染色体外因子(例如质粒)维持或可整合进重组生物(例如微生物或植物)的染色体中。完整载体可以保留在宿主细胞内，或者在某些情况下，可以删除质粒DNA，留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可在染色体启动子控制下，在天然启动子或质粒启动子控制下，或者在一些启动子组合的控制下。核酸分子的单个或多个拷贝可以整合到染色体中。本发明的重组载体可含有至少一个选择标记。
在一个实施方案中，用于本发明重组核酸分子的重组载体是表达载体。本文所用的短语“表达载体”用于指适合于产生编码产物(例如目的蛋白)的载体。在该实施方案中，将编码需要产生的产物(例如PUFA PKS结构域)的核酸序列插入重组载体中以产生重组核酸分子。编码需要产生的蛋白质的核酸序列以这样的方式插入载体中，即将核酸序列与载体中的调控序列可操作地连接使得核酸序列能够在重组宿主细胞内转录和翻译。
在另一实施方案中，用于本发明重组核酸分子的重组载体是定向载体。本文所用的短语“定向载体”用于指这样一种载体，即它用于将特定核酸分子传递进重组宿主细胞，其中该核酸分子用于删除或灭活宿主细胞或微生物内的内源性基因(即用于定向基因破坏或敲除技术)。本领域也将该载体称为“敲除”载体。在该实施方案的一个方面，载体的一部分，但更典型的是插入载体的核酸分子(即插入片段)具有与宿主细胞靶基因(即定向删除或失活的基因)的核酸序列同源的核酸序列。载体插入片段的核酸序列设计成与靶基因结合以便靶基因与插入片段进行同源重组，从而删除，灭活或减弱内源性靶基因(即通过突变或删除至少一部分内源性靶基因)。实施例部分描述了使用这种类型的重组载体以重组基因取代内源性Schizochytrium基因，并且2003年9月4日以US 20030166207公开的美国专利申请No.10/124,807详细描述了Thraustochytrids遗传转化的一般技术。
一般来说，重组核酸分子包括与一个或多个表达调控序列可操作连接的至少一个本发明核酸分子。本文所用的短语“重组分子”或“重组核酸分子”主要是指与表达调控序列可操作连接的核酸分子或核酸序列，但是当该核酸分子是本文讨论的重组分子时，上述短语可与短语“核酸分子”交换使用。根据本发明，短语“可操作连接”是指将核酸分子与表达调控序列(例如转录调控序列和/或翻译调控序列)以这样的方式相连，即当转染(即转化、转导、转染、接合或导入)进宿主细胞时，分子能被表达。转录调控序列是控制转录开始、延长或终止的序列。特别重要的转录调控序列是控制转录开始的序列，例如启动子、增强子、操纵子和阻抑序列。合适的转录调控序列包括在导入重组核酸分子的宿主细胞或生物体中能起作用的任何转录调控序列。
本发明的重组核酸分子也可含有其它调控序列，例如翻译调控序列，复制起始点，和与重组细胞相容的其它调控序列。在一个实施方案中，本发明的重组分子，包括整合进宿主细胞染色体中的重组分子，还含有分泌信号(即信号片段核酸序列)使得表达的蛋白质能够从产生该蛋白的细胞中分泌出来。合适的信号片段包括天然伴随需表达蛋白的信号片段或能够指导本发明蛋白分泌的任何异源性信号片段。在另一实施方案中，本发明的重组分子包含使得表达蛋白能够传递并插入宿主细胞膜的前导序列。合适的前导序列包括天然伴随蛋白的前导序列，或者能够指导蛋白传递并插入细胞膜中的任何异源性前导序列。
本发明人发现Schizochytrium PUFA PKS Orfs A和B在基因组中紧密相连并测序了Orfs之间的区域。Orfs以相反的方向排列并且4244个碱基对分隔起始(ATG)密码子(即它们如下排列：3’OrfA5’-4244bp-5’OrfB3’)。检查4244bp的基因间区域没有揭示出任何明显的Orfs(在BlastX检索中没有发现明显的匹配)。Schizochytrium至少在产油期间高度表达OrfsA和OrfsB，意味着在该基因间区域包含活性启动子元件。相信这些遗传元件可用作转基因应用中的双向启动子序列。例如在优选实施方案中，可克隆该区域，在其各个末端放置任意目的基因并将该构建体导入Schizochytrium(或者启动子可发挥功能的一些其它宿主)中。预期调控元件在合适条件下可使两个导入的基因同等的高水平表达。含有Schizochytrium PUFA PKS调控元件(例如启动子)的调控区的完整核苷酸序列本文表示为SEQ ID NO：36。
同样，Schizochytrium在产油期间高度表达OrfC且预期调控元件在其起始密码子的上游区域。已克隆并测序了OrfC上游的基因组DNA区域并在本文中表示为(SEQ ID NO：37)。该序列含有3886nt，紧靠OrfC起始密码子的上游。检查该区域没有发现任何明显的Orfs(即BlastX检索中没有发现明显的匹配)。相信该区域包含的调控元件在合适的条件下可使放置在其后的基因高水平表达。另外，在合适条件下，表达水平与在A-B基因间区域(SEQ ID NO：36)控制下的基因等同。
因此，在一个实施方案中，如本文所述用于本发明的重组核酸分子可包括SEQ ID NO：36和/或SEQ ID NO：37内包含的PUFA PKS调控区。该调控区可包括至少具有基本PUFA PKS转录活性的SEQ ID NO：36和/或SEQID NO：37的任一部分(片段)。
本发明一种或多种重组分子可用于产生本发明的编码产物(例如PUFAPKS结构域、蛋白质或系统)。在一个实施方案中，通过在有效产生蛋白质的条件下表达本文所述核酸分子来生产编码产物。产生编码蛋白的优选方法是通过用一种或多种重组分子转染宿主细胞以形成重组细胞。用于转染的合适宿主细胞包括，但不限于，可被转染的任何细菌细胞，真菌细胞(例如酵母)，昆虫细胞，植物细胞或动物细胞。在本发明的一个实施方案中，优选的宿主细胞是Thraustochytrid宿主细胞(下文详细描述的)或植物细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或者是已被至少一个其它重组核酸分子转染的细胞。
根据本发明，术语“转染”用于指可将外源性核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任一方法。当术语“转化”用于指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母，或植物时，可与术语“转染”交换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物或植物获得外源性核酸的遗传改变且与术语“转染”基本同义。然而，在动物细胞中，转化被赋予了第二种含义，例如可指细胞变成癌细胞后在培养中生长特性的改变。因此，为了避免混淆，术语“转染”优选用于指将外源核酸导入动物细胞，且术语“转染”在本文中用于概括包含动物细胞转染、微生物细胞和植物细胞转化，该术语适用的范围是将外源性核酸导入细胞。因此，转染技术包括，但不限于，转化，粒子轰击，扩散，主动转运，声波浴，电穿孔，显微注射，脂质体转染，吸附，感染和原生质体融合。
本领域技术人员应当理解使用重组DNA技术通过操纵例如，宿主细胞内核酸分子的拷贝数，转录这些核酸分子的效率，翻译所得转录子的效率，和翻译后修饰的效率可改进转染的核酸分子的表达调控。另外，可遗传改造启动子序列以便与天然启动子相比表达水平提高。用于控制核酸分子表达的重组技术包括，但不限于，将该核酸分子整合进一个或多个宿主细胞染色体中，给质粒添加载体稳定性序列，取代或修饰转录控制信号(例如，启动子，操纵子，增强子)，取代或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点，Shine-Dalgarno序列)，修饰核酸分子以符合该宿主细胞的密码子用法，和缺失使转录子不稳定的序列。
上文对于重组核酸分子和宿主细胞转染方面的一般性讨论试图应用于本文讨论的任一重组核酸分子，包括编码具有PUFA PKS至少一个结构域的生物学活性的任一氨基酸序列的核酸分子，编码其它PKS系统氨基酸序列的核酸分子，和编码其它蛋白质或结构域的核酸分子。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是高等真核生物的基本膜成份和许多脂类衍生的信号分子的前体。本发明的PUFA PKS系统使用不需要去饱和并延长饱和脂肪酸的PUFA合成途径。该途径由结构和机制上均不同于以前认识的PKS的PUFA PKS催化。顺式双键的产生表明包含位置特异性异构酶，相信这些酶有利于产生新的抗生素家族。
为了产生明显高产的一种或多种所需的多不饱和脂肪酸或其它生物活性分子，可对生物体，优选微生物或植物，更优选Thraustochytrid微生物进行遗传修饰以改变微生物或植物中PUFA PKS系统的活性，具体是改变系统的终产物。
因此，本发明一个实施方案涉及经遗传修饰的微生物，其中该微生物表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统至少一个生物学活性结构域的PKS系统。PUFA PKS系统的结构域可以包括上述PUFAPKS系统(例如Schizochytrium和破囊壶菌属)的任意结构域，包括其同系物，还可以包括来自任意其它非细菌微生物，包括真核微生物，包括任意Thraustochytrid微生物的PUFA PKS系统的任意结构域，或用US专利申请10/124,800(出处同上)描述的筛选方法鉴别的微生物的PUFA PKS系统的任意结构域。遗传修饰影响生物体PKS系统的活性。US专利申请10/124,800描述的筛选方法包括以下步骤：(a)选择产生至少一种PUFA的微生物；和(b)从(a)中鉴定与在发酵培养基中、溶氧条件大于约5％饱和度，优选约10％，更优选约15％，更优选约20％饱和度的条件下微生物产生的PUFA相比，在发酵培养基中、溶氧条件小于约5％饱和度的情况下具有产生增加的PUFA能力的微生物。
一方面，所述生物体可以内源性地含有并且表达PUFA PKS系统，并且上述遗传修饰可以是一种上述内源性PUFA PKS系统的一个或多个功能域的遗传修饰，由此上述修饰对上述PUFA PKS系统的活性具有一定影响。另一方面，所述生物体可以内源性地含有并且表达PUFA PKS系统，并且上述遗传修饰可以是引入至少一种外源核酸序列(例如，一种重组核酸分子)，其中上述外源核酸序列编码来自一种第二PKS系统的至少一种生物学活性结构域或蛋白质和/或影响上述PUFA PKS系统活性的蛋白质(例如下面讨论的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase))。另一方面，上述生物体并非必需内源性地(天然地)含有PUFA PKS系统，但是经过遗传修饰，以引入至少一个编码具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列的重组核酸分子。在此方面，通过引入或增加生物体中PUFA PKS活性而影响PUFA PKS活性。下面将更详细地讨论与上述方面中每一项有关的各种实施方案。
应该理解，PUFA PKS系统或含有PUFA PKS系统的生物体的遗传修饰可以包括：修饰PUFA PKS系统的至少一个结构域(包括结构域的一部分)，PUFA PKS系统的多于一个或若干个结构域(包括相邻结构域，非相邻结构域，或PUFA PKS系统中不同蛋白质上的结构域)，PUFA PKS系统的所有蛋白质，和完整的PUFA PKS系统(例如，PUFA PKS基因编码的所有蛋白)。因而，修饰可以包括：对内源性PUFA PKS系统单一结构域的细微(small)修饰；置换，缺失或增加给定PUFA PKS系统的一个或多个结构域或蛋白质；多至在一种生物体中，用来自不同生物体的PUFAPKS系统取代完整的PUFA PKS系统。本领域技术人员将理解对PUFA PKS系统的任意遗传修饰都包括在本发明范围内。
本文所用的遗传修饰微生物可以包括遗传修饰的细菌，原生生物，微藻类，真菌，或其它微生物，并且特别是此处描述破囊壶菌属(Thraustochytrium)，Japonochytrium，Labyrinthula，Thraustochytriales目(例如，Thraustochytrid)中任何属的微生物(例如，Schizochytrium，Labyrinthuloides等)。上述遗传修饰微生物具有相对其正常形式(即，野生型或天然存在的)的经修饰的基因组(即，突变或改变)，由此达到所需的结果(即，增加或改变PUFA PKS活性和/或使用PKS系统生产所需的产物)。可以使用标准菌株形成和/或分子遗传技术对微生物进行遗传修饰。这些技术是本领域已知的，且通常被公开用于微生物，例如Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press。参考文献Sambrook et al.，出处同上，全文并入此处作为参考。经遗传修饰的微生物可以包括这样的微生物，其中的核酸分子被插入，缺失或修饰(即，突变的；例如，通过核苷酸的插入，缺失，置换和/或转换产生的突变)，以使该修饰在微生物中产生所需的效果。
根据本发明修饰的优选微生物宿主细胞包括，但不限于，任何细菌，原生生物，微藻，真菌，或原生动物。一方面，优选被遗传修饰的微生物包括，但不限于Thraustochytriales目的任何微生物，包括Thraustochytriaceae和Labyrinthulaceae科的任何微生物。用于本发明的具体优选的宿主细胞可以包括，但不限于下列属的微生物：Thraustochytriaceae科中的破囊壶菌属，Japonochytrium，Aplanochytrium，Elina和Schizochytrium，Labyrinthulaceae科中的Labyrinthula，Labyrinthuloides和Labyrinthomyxa。这些属中优选的种包括，但不限于：Labyrinthula属中的任何种，包括Labrinthula sp.，Labyrinthula algeriensis，Labyrintliula cienkowskii，Labyrinthula chattonii，Labyrinthula coenocystis，Labyrinthula macrocystis，Labyrinthula macrocystisatlantica，Labyrinthula macrocystis macrocystis，Labyrinthula magnifica，Labyrinthula minuta，Labyrinthula roscoffensis，Labyrinthula valkanovii，Labyrinthula vitellina，Labyrinthula vitellina pacifica，Labyrinthula vitellinavitellina，Labyrinthula zopfii；任意Labyrinthuloides种，包括Labyrinthuloidessp.，Labyrinthuloides minuta，Labyrinthuloides schizochytrops；任意Labyrinthomyxa种，包括Labyrinthomyxa sp.，Labyrinthomyxa pohila，Labyrinthomyxa sauvageaui；任意Aplanochytrium种，包括Aplanochytrium sp.和Aplanochytrium kerguelensis；任意Elina种，包括Elina sp.，Elina marisalba，Elina sinorifica；任意Japanochytriurn种，包括Japanochytrium sp.，Japanochytrium marinum；任意Schizochytrium种，包括Schizochytrium sp.，Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizoclaytriumminutum，Schizochytrium octosporum；和破囊壶菌属中的任何种，包括Thraustochytrium sp.，Thraustochytrium aggregatum，Thraustochytriumarudimentale，Thraustochytrium aureum，Thraustochytrium benthicola，Thraustochytrium globosum，Thraustochytrium kinnei，Thraustochytriummotivum，Thraustochytrium pachydermum，Thraustochytrium proliferum，Thraustochytrium roseum，Thraustochytrium striatum，Ulkenia sp.，Ulkeniaminuta，Ulkenia profunda，Ulkenia radiate，Ulkenia sarkariana，和Ulkeniavisurgensis。这些属内特别优选的种包括，但不限于：任意Schizochytrium种，包括Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizochytrium minutum；任意破囊壶菌属种(包括以前的Ulkenia种，如U.Visurgensis，U.Amoeboida，U.Sarkariana，U.Profunda，U.radiata，U.Minuta和Ulkenia sp.BP-5601)，且包括Thraustochytrium stratum，Thraustoch ytriumaureum，Thraustochytrium roseum；和任意Japonochytrium种。特别优选的Thraustochytriales菌株包括，但不限于：Schizochytrium sp.(S31)(ATCC20888)；Schizochytrium sp.(S8)(ATCC20889)；Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC 18915)；Schizochytrium sp.(SR21)；Schizochytriumaggregatum(Goldstein et Belsky)(ATCC 28209)；Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO 32693)；Thraustochytrium sp.(23B)(ATCC 20891)；Thraustochytrium striatum(Schneider)(ATCC 24473)；Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC 34304)；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC28210)；和Japonochytrium sp.(L1)(ATCC 28207)。用于遗传修饰的合适宿主微生物的其它例子包括，但不限于，酵母，包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，或诸如念珠菌属(Candida)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)的其它酵母，或其它真菌，例如，诸如曲霉属(Aspergillus)，链孢霉属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)的丝状真菌等。细菌细胞也可以用作宿主。这些包括，但不限于可以用于发酵过程的大肠杆菌。另外，只有通过实施例的方法，诸如乳杆菌(Lactobacillus)或芽孢杆菌(Bacillus)的宿主也可用作宿主。
本发明的另一个实施方案涉及经遗传修饰的植物，该植物被遗传修饰以重组表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物学活性结构域的PKS系统。PUFA PKS系统的结构域可以包括如上所述的PUFA PKS系统(例如Schizochytrium和/或破囊壶菌属的)的任何结构域，包括其同源物，并也可以包括来源于任何非细菌微生物(包括任何真核微生物和任何其它Thraustochytrid微生物)的PUFA PKS系统的任何结构域，或来源于根据如上美国专利申请序列号10/124,800描述的筛选法鉴定的微生物的PUFA PKS系统的任何结构域。植物也可以用来自另一种PKS系统的至少一个结构域或其生物学活性片段进一步修饰，包括但不限于，细菌PUFAPKS或PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统，和/或任何非细菌性PUFA PKS系统(例如，真核生物，Thraustochytrid，Thraustochytriaceae或Labyrinthulaceae，Schizochytrium，等等)。
如此处所用，经遗传修饰的植物可以包括任何经过遗传修饰的植物，包括高等植物且具体是任何可食用(consumable)植物或可用于产生本发明所需的生物活性分子的植物。所述经遗传修饰的植物具有对其正常形式(即野生型或天然存在的)进行了修饰(即突变或改变)的基因组，以便达到所需结果(即增加或修饰的PUFA PKS活性和/或使用PKS系统产生所需产物)。使用标准菌株形成和/或分子遗传技术可对植物进行遗传修饰。生产转基因植物的方法是本领域已知的，其中编码所需氨基酸序列的重组核酸分子被掺入该植物的基因组。根据本发明进行遗传修饰的优选植物是适于被包括人的动物食用的植物。
根据本发明进行遗传修饰的优选植物(即植物宿主细胞)包括，但不限于任何高等植物，并且具体是可食用的植物，包括禾谷类作物(crop plant)并且具体是用于产油的植物。所述植物可以包括，例如：canola，大豆，油菜籽，亚麻籽，玉米，红花，向日葵和烟草。其它优选的植物包括那些已知用于生产用作药物配制品，增味剂，neutraceutical试剂，功能性食品成分或化妆品活性剂的化合物的植物，或进行了遗传修饰以使其生产这些化合物/试剂的植物。
根据本发明，经遗传修饰的微生物或植物包括使用重组技术或通过传统诱变和筛选技术进行修饰的微生物或植物。本文中，导致基因表达，基因功能，或基因产物(即由该基因编码的蛋白质)功能降低的遗传修饰指基因的失活(完全或部分)，缺失，中断(interruption)，阻断或下调。例如，基因中导致其编码的蛋白质的功能降低的遗传修饰可由该基因的完全缺失(即该基因不存在，且因此该蛋白质不存在)，导致蛋白质不完全翻译或不翻译(例如蛋白质不表达)的基因中的突变，或降低或消除该蛋白的天然功能(即蛋白质的表达降低或无酶活性或功能)的基因中的突变引起。导致基因表达或功能增强的遗传修饰指基因的扩增，超量表达，过度表达，活化，增强，增加，或上调。
根据本发明的微生物或植物的遗传修饰优选影响微生物或植物表达的PKS系统的活性，无论该PKS系统是内源性并进行了遗传修饰，内源性并向生物体中导入了重组核酸分子(可选择修饰所述内源性系统或不修饰)，还是完全通过重组技术提供的系统。改变PUFA PKS系统或表达该系统的生物体的PUFA生产图谱包括：与无遗传修饰的情况(即与未修饰的，野生型微生物或植物，或与至少在PUFA合成方面未修饰(即该生物体可以具有其它不涉及PUFA合成的修饰)的微生物或植物相比)相比，引起宿主微生物或植物的一种或多种PUFA产生中的任何可检测的或可测量的变化。影响PKS系统的活性包括与无遗传修饰相比，引起该生物体表达的PKS系统中任何可检测的或可测量的改变或修饰的任何遗传修饰。PKS系统中可检测的改变或修饰包括，但不限于：与无遗传修饰的内源性PUFA PKS系统相比，修饰的PUFA PKS系统中的一个或多个结构域的表达和/或生物学活性的改变或修饰(引入，增加或降低)，将PKS系统活性引入生物体中使得该生物体目前具有可测量的/可检测的PKS系统活性(即进行遗传修饰前该生物体不含有PKS系统)，将来自与该生物体内源性表达的PKS系统不同的PKS系统的功能域引入该生物体中使得PKS系统的活性发生改变(例如将细菌PUFA PKS结构域或I型PKS结构域导入内源性表达非细菌PUFA PKS系统的生物体中)，PKS系统产生的生物活性分子(例如PUFA)的量改变(例如与无遗传修饰相比，该系统产生更多(增加的量)或更少(减少的量)的给定产物)，PKS系统产生的生物活性分子的类型的改变(例如PUFA类型的改变)(例如该系统产生其它的的或不同的PUFA，一种新的或不同的产物，或者PUFA变体或由该系统天然产生的其它产物的变体)，和/或PKS系统产生的多种生物活性分子之间的比例改变(例如与无遗传修饰相比，该系统产生的一种PUFA与另一PUFA的比例不同，产生完全不同的脂质图谱，或者与天然构型相比将各种PUFA置于三酰甘油的不同位置)。该遗传修饰包括任何类型的遗传修饰且具体包括通过重组技术和传统诱变进行的修饰。
应该注意，提及PUFA PKS系统中功能域或蛋白质的活性增加是指，在含有该结构域或蛋白质(或其中引入了该结构域或蛋白质)的生物体中导致该结构域或蛋白质系统的功能增强的任何遗传修饰，且所述功能增强可包括所述结构域或蛋白质的活性更高(例如比活性或体内酶活性)，对所述结构域或蛋白质系统的抑制或降解降低，和该结构域或蛋白质的过度表达。例如，增加基因拷贝数，通过使用比天然启动子产生更高表达水平的启动子来增加表达水平，或通过基因工程或传统诱变改变基因以增加该基因编码的结构域或蛋白质的活性。
同样，提及PUFA PKS系统中功能域或蛋白质的活性降低是指，在含有该结构域或蛋白质(或其中引入了该结构域或蛋白质)的生物体中导致该结构域或蛋白质功能降低的任何遗传修饰，且所述功能降低包括该结构域或蛋白质的活性降低，对该结构域或蛋白质的抑制或降解增加，以及减少或消除该结构域或蛋白质的表达。例如，通过阻断或降低该结构域或蛋白质的产生，“敲除”编码该结构域或蛋白质的基因或其部分，降低结构域或蛋白质活性，或抑制该结构域或蛋白质的活性，可降低本发明的结构域或蛋白质的作用。阻断或降低结构域或蛋白质的产生可包括将编码该结构域或蛋白质的基因置于需要在生长培养基中存在诱导化合物的启动子的控制下。通过建立耗尽培养基中的该诱导剂的条件，编码该结构域或蛋白质的基因表达(及由此的蛋白质合成)可被关闭。本发明人在实施例部分证明可以缺失(敲除)Thraustochytrid微生物中的靶基因。阻断或降低结构域或蛋白质的活性也可包括使用类似于US专利4,743,546所述的切除技术方法，并入此处作为参考。为使用该方法，可将编码目的蛋白的基因克隆到允许从基因组中特异性性受控切除该基因的特定基因序列之间。例如，通过按US4,743,546所述转换培养物的培养温度或者通过其它的物理或营养信号可以促进切除。
本发明的在一个实施方案中，遗传修饰包括修饰编码具有本文所述非细菌PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列的核酸序列(例如，Thraustochytrid宿主内源性PUFA PKS系统的一个结构域，多个结构域，一种蛋白质，或完整的PUFA PKS系统)。该修饰可针对内源性(天然)表达的非细菌PUFA PKS系统内的氨基酸序列，由此通过，例如，传统诱变和筛选技术和/或分子遗传技术，包括遗传工程技术可对天然含有该系统的微生物进行遗传修饰。遗传工程技术可包括，例如，使用定向重组载体缺失内源性基因的一部分(如实施例所示)，或者用异源序列取代内源基因的一部分(如实施例所示)。可导入宿主基因组的异源性序列的例子包括：编码来自另一PKS系统的至少一个功能域的序列，所述另一PKS系统诸如不同的非细菌PUFA PKS系统(例如，来自真核生物，包括另一种Thraustochytrid)，细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，或模块PKS系统。异源序列也可以包括用于取代宿主中完整内源性PUFA PKS系统(例如，内源性PUFA PKS系统的所有基因)的完整的PUFA PKS系统(例如，与PUFA PKS系统有关的所有基因)。异源序列还可以包括：编码宿主Thraustochytrid PUFA PKS系统天然结构域的修饰的功能域(同源物)的序列(例如，编码Schizochytrium中OrfB的修饰的结构域的核酸序列，其中当该修饰的结构域用于取代Schizochytrium表达的天然存在的结构域时，改变Schizochytrium的PUFA生产图谱。导入宿主基因组的其它异源性序列包括：编码非PKS系统结构域，但是将影响内源性PKS系统活性的蛋白质或功能域的序列。例如，可将编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核酸分子引入宿主基因组中(下文讨论)。下文中将详细讨论对内源性PUFA PKS系统进行的特异性修饰。
本发明该实施方案的另一方面，该遗传修饰包括：(1)向宿主中引入编码具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性的氨基酸序列的重组核酸分子；和/或(2)向宿主中导入编码影响PUFA PKS系统活性的蛋白质或功能域的重组核酸分子。所述宿主包括：(1)不表达任何PKS系统的宿主细胞，其中将PKS系统的所有功能域引入该宿主细胞中，且其中至少一个功能域来自非细菌PUFA PKS系统；(2)表达具有非细菌PUFA PKS系统的至少一个功能域的PKS系统(内源性或重组)的宿主细胞，其中引入的重组核酸分子可编码至少一种其它非细菌PUFA PKS功能域或者影响宿主PKS系统活性的其它蛋白质或结构域；和(3)表达不必包括来自非细菌PUFA PKS的功能域的PKS系统(内源性或重组)的宿主细胞，且其中引入的重组核酸分子包括编码非细菌PUFA PKS系统的至少一个功能域的核酸序列。换句话说，本发明意欲包括任何遗传修饰的生物体(例如微生物或植物)，其中该生物体含有至少一个非细菌PUFA PKS功能域(内源性或者通过重组修饰引入)，且其中当该生物体含有功能性PKS系统时，该遗传修饰对非细菌PUFA PKS功能域或PKS系统具有可测量的影响。
本发明包括许多可能的非细菌和细菌微生物，作为此处描述的PUFAPKS系统的可能的宿主细胞，和/或作为编码用于此处描述的遗传修饰和方法的PUFA PKS系统蛋白质和结构域的其它遗传物质来源。例如，可以通过用于鉴定如上美国专利申请公开号20020194641(相应于美国专利申请序列号10/124,800)中详细描述的具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的其它非细菌微生物的方法，容易地鉴定/分离/筛选具有类似于Schizochytrium中发现的PUFA PKS系统的微生物，例如由本发明人发现并在实施例1中描述的破囊壶菌属微生物。
收集用于筛选本发明PUFA PKS系统的优选类型的微生物的地点包括下列环境中任一种：低氧环境(或靠近此类低氧环境的地点，包括在动物的肠道中，所述动物包括消耗微生物或含有微生物的食物的无脊椎动物(包括滤食性生物类型))，低氧或无氧的含水(aquatic)环境(包括淡水，盐水和海洋)，具体是处于或者靠近海洋中低氧环境(区域)。该微生物菌株优选非专性厌氧菌，而是可适于在有氧及低氧或无氧环境中存活。有氧及低氧或无氧的土壤环境也是发现这些生物体的极好环境，特别在是含水环境或临时含水环境中的土壤类型中。
用于筛选本发明宿主和/或PUFA PKS基因来源的的具体优选的非细菌微生物菌株是：在其部分生活周期中能通过诸如吞噬作用，吞噬营养或内吞能力的机制消耗整个细菌细胞(食细菌生物)和/或在其生活周期中具有以变形虫状阶段或裸露原生质体存在的一个时期的菌株(选自藻类，真菌(包括酵母)，原生动物或原生生物)。如果发生错误且该细菌细胞(或其DNA)不能被消化反而有效掺入真核细胞中，该营养方法将极大地增加将细菌PKS系统转移入真核细胞的可能性。
本发明包括的PUFA PKS基因(及其编码的蛋白质及结构域)来源是：除本文具体描述的含有PUFA PKS系统之外的任何Thraustochytrids。所述Thraustochytrids包括，但不限于Thraustochytriales目的任何微生物，包括Thraustochytriaceae和Labyrinthulaceae科的任何微生物，其进一步包括，但不限于下列属：Thraustochytriaceae科中的破囊壶菌属，Japonochytrium，Aplanochytrium，Elina和Schizochytrium，和Labyrinthulaceae科中的Labyrinthula，Labyrinthuloides和Labyrinthomyxa。这些属中优选的种包括，但不限于：Labyrinthula属中的任何种，包括Labrinthula sp.，Labyrinthulaalgeriensis，Labyrintliula cienkowskii，Labyrinthula chattonii，Labyrinthulacoenocystis，Labyrinthula macrocystis，Labyrinthula macrocystis atlantica，Labyrinthula macrocystis macrocystis，Labyrinthula magnifica，Labyrinthulaminuta，Labyrinthula roscoffensis，Labyrinthula valkanovii，Labyrinthulavitellina，Labyrinthula vitellina pacifica，Labyrinthula vitellina vitellina，Labyrinthula zopfii；任意Labyrinthuloides种，包括Labyrinthuloides sp.，Labyrinthuloides minuta，Labyrinthuloides schizochytrops；任意Labyrinthomyxa种，包括Labyrinthomyxa sp.，Labyrinthomyxa pohlia，Labyrinthomyxasauvageaui，任意Aplanochytrium种，包括Aplanochytrium sp.和Aplanochytriumkerguelensis；任意Elina种，包括Elina sp.，Elina marisalba，Elina sinorifica；任意Japanochytrium种，包括Japanochytrium sp.，Japanochytrium marinum；任意Schizochytrium种，包括Schizochytrium sp.，Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizoclaytrium minutum，Schizochytriumoctosporum；和破囊壶菌属中的任何种，包括Thraustochytrium sp.，Thraustochytrium aggregatum，Thraustochytrium arudimentale，Thraustochytrium aureum，Thraustochytrium benthicola，Thraustochytriumglobosum，Thraustochytrium kinnei，Thraustochytrium motivum，Thraustochytrium pachydermum，Thraustochytrium proliferum，Thraustochytrium roseum，Thraustochytrium striatum，Ulkenia sp.，Ulkeniaminuta，Ulkenia profunda，Ulkenia radiate，Ulkenia sarkariana，和Ulkeniavisurgensis。
应该指出，没有受理论束缚，本发明人认为Labyrinthula以及其它Labyrinthulaceae是PUFA PKS基因来源，这是由于Labyrinthulaceae与已知具有PUFA PKS基因的Thraustochytriaceae密切相关，Labyrinthulaceae已知是食细菌的/吞噬作用的，而且Labyrinthulaceae中的某些成员的脂肪酸/PUFA图谱与具有PUFA PKS系统一致。
能够食细菌(bacterivory)(特别是通过吞噬作用或内吞)的微生物菌株(除了Thraustochytrids的成员)可在下列微生物纲(包括但不限于举例的属)中找到：
在藻类和藻类样微生物(包括Stramenopiles)中：裸藻纲(例如眼虫属(Euglena)，和Peranema)，金藻纲(例如赭单胞菌属(Ochromonas))，Dinobryaceae纲(例如锥囊藻属(Dinobryon)，Platychrysis，和Chrysochromulina属)，甲藻纲(包括Crypthecodinium，裸甲藻属(Gymnodinium)，多甲藻属(Peridinium)，Ceratium，Gyrodinium，和Oxyrrhis属)，隐藻纲(例如隐藻属(Cryptomonas)，和Rhodomonas)，黄藻纲(例如Olisthodiscus属)(且包括存在变形虫状阶段的藻类形式，如鞭毛虫Rhizochloridaceae，以及Aphanochaetepascheri，Bumilleria stigeoclonium和Vaucheria geminata的游动孢子/配子)，Eustigmatophyceae纲，和Prymnesiopyceae纲(包括定鞭金藻属(Prymnesium)和Diacronema属)。
在Stramenopiles中包括：Proteromonads，Opalines，Developayella，Diplophorys，Larbrinthulids，Thraustochytrids，Bicosecids，卵菌纲，Hypochytridiomycetes，Commation，Reticulosphaera，Pelagomonas，Pelapococcus，Ollicola，Aureococcus，Parmales，Raphidiophytes，Synurids，Rhizochromulinaales，Pedinellales，Dictyochales，Chrysomeridales，Sarcinochrysidales，Hydrurales，Hibberdiales，和Chromulinales。
在真菌中：粘菌纲(形成粘变形体)—粘液霉菌，聚粘菌亚纲，包括Acrasiceae目(例如Sappinia属)，Guttulinaceae纲(例如Guttulinopsis，和小滴虫属(Guttulina))，Dictysteliaceae纲(例如宿曲滴菌属(Acrasis)，盘基网柄菌属(Dictyostelium)，Polysphondylium，和Coenonia)，和Phycomyceae纲，包括壶菌目，Ancylistales，芽枝菌目(Blastocladiales)，单毛菌目(Monoblepharidales)，水霉目(Saprolegniales)，霜霉目(Peronosporales)，毛霉菌目(Mucorales)，和虫霉目(Entomophthorales)。
在原生动物中：具有能够食细菌(包括通过吞噬作用)的生活阶段的原生动物株可选自分类为纤毛虫，鞭毛虫或变形虫的类型。原生动物纤毛虫包括的种类：漏斗虫，肾形虫，管口虫，Haptorids，核残迹虫，寡膜虫，Polyhymenophora(旋毛虫)，Prostomes和吸管纲。原生动物鞭毛虫包括Biosoecids，Bodonids，单鞭滴虫，Chrysophytes(例如Anthophysa属，Chrysamoemba，金球藻虫属，树滴虫属，锥囊藻虫属，鱼鳞藻虫属，赭滴虫属，Paraphysomonas，Poterioochromonas，Spumella，Syncrypta，黄群藻虫属，和辐尾藻属)，领鞭毛虫，Cryptophytes(例如唇滴虫属，隐滴虫属，Cyanomonas，和Goniomonas)，腰鞭毛类，Diplomonads，Euglenoids，Heterolobosea，Pedinellids，Pelobionts，胶领鞭虫，Pseudodendromonads，Spongomonads和Volvocales(和其它鞭毛虫，包括未分类的鞭毛虫Artodiscus属，Clautriavia，曳鞭毛虫属，Kathablepharis和Multicilia)。变形虫状原生动物包括的种类有：太阳虫，Centrohelids，Desmothoricids，Diplophryids，Eumamoebae，Heterolobosea，Leptomyxids，Nucleariid filose阿米巴属，Pelebionts，Testate阿米巴属和Vampyrellids(且包括未分类的阿米巴属Gymnophrys，Biomyxa，Microcometes，Reticulomyxa，Belonocystis，Elaeorhanis，Allelogromia，Gromia或Lieberkuhnia)。原生动物包括如下的目：Percolomonadeae，Heterolobosea，Lyromonadea，Pseudociliata，Trichomonadea，Hypermastigea，Heteromiteae，Telonemea，Cyathobodonea，Ebridea，Pyytomyxea，Opalinea，Kinetomonadea，Hemimastigea，Protostelea，Myxagastrea，Dictyostelea，Choanomonadea，Apicomonadea，Eogregarinea，Neogregarinea，Coelotrolphea，Eucoccidea，血孢子虫亚目，Piroplasmea，Spirotrichea，Prostomatea，Litostomatea，Phyllopharyngea，Nassophorea，Oligohymenophorea，Colpodea，Karyorelicta，Nucleohelea，Centrohelea，Acantharea，Sticholonchea，Polycystinea，Phaeodarea，Lobosea，Filosea，Athalamea，Monothalamea，Polythalamea，Xenophyophorea，Schizocladea，Holosea，Entamoebea，粘盘孢目，纺线孢子目，Halosporea，Paramyxea，Rhombozoa和Orthonectea。
本发明优选的实施方案包括上述列举的从上述优选的生境收集的微生物。
在本发明所述方法的一些实施方案中，来自细菌的PUFA PKS系统，包括基因及其部分(编码完整的PUFA PKS系统，其蛋白质和/或其结构域)可以用于遗传修饰其它PUFA PKS系统(例如，任何非细菌PUFA PKS系统)和/或本发明实施方案中的含有所述系统的微生物(或反之亦然)。一方面，可以鉴定细菌中的新型PUFA PKS系统，其特别适用于构造经遗传修饰的微生物(例如，遗传修饰的Thraustochytrids)和/或编码用于本发明的方法和经遗传修饰的微生物及植物的PUFA PKS系统的新杂交构建体。一方面，具体适用于本发明实施方案的细菌具有PUFA PKS系统，其中PUFA PKS系统能够在超过大约20℃，优选超过大约25℃且更优选超过大约30℃的温度产生PUFA。如本文先前所述，US 6,140,486描述的海洋细菌，希瓦氏属和海产弧菌在较高的温度不产生PUFA，限制了来自这些细菌的PUFA PKS系统的使用，具体是在野外条件下的植物应用中。因此，在一个实施方案中，本发明的筛选方法可用于鉴定具有PUFA PKS系统的细菌，其中所述细菌能在较高温度(例如超过约15℃，20℃，25℃，或30℃或甚至更高)生长并产生PUFA。然而，即使细菌源在较高的温度生长不良和/或不产生PUFA，本发明包括鉴定，分离和使用PUFA PKS系统(基因和其编码的蛋白质/结构域)，其中来自细菌的PUFAPKS系统在高于大约15℃，20℃，25℃或30℃或甚至更高的温度具有酶活/生物学活性。在该实施方案的一方面中，可将诸如制霉菌素(抗真菌剂)或放线菌酮(真核生物蛋白合成抑制剂)的真核生物生长抑制剂加入琼脂板中，用于从水样品/土壤样品来培养/筛选起始菌株，所述水样品/土壤样品自生境/生态位(niches)，例如海洋或江河(estuarian)生境或任何其它可以得到所述细菌的生境收集。该方法可帮助筛选没有(或有最小的)真核菌株污染的细菌菌株富集物。该筛选方法结合在高温(例如30℃)下培养平板，然后筛选产生至少一种PUFA的菌株，可初步鉴定具有在升高的温度有效的具PUFA PKS系统的候选细菌菌株(与现有技术中仅在不超过约20℃且更优选低于约5℃的温度产生PUFA的那些细菌菌株相反)。
然而，即使在较高温度生长不良(或根本不生长)的细菌或那些在较高温度不产生至少一种PUFA的细菌中，也可以通过鉴定该细菌在任何条件下产生PUFA的能力和/或通过筛选该细菌基因组中与来自细菌或非细菌生物体的其它已知PUFA PKS基因同源的基因，来鉴定和筛选含有PUFA PKS系统的所述菌株(例如参见实施例7)。评价来自任何细菌源的基因在较高温度的情况下PUFA PKS的功能，可以制备无细胞提取物并且检验各种温度条件下的PUFA产生，然后筛选含有在较高温度范围(例如，15℃，20℃，25℃或30℃或更高温度)具有酶/生物学活性的PUFA PKS基因的微生物。
适合用作遗传修饰的宿主的细菌包括上述任何菌株。用作PUFA PKS基因来源(及其编码的蛋白质和结构域)以根据本发明产生遗传修饰的序列和生物体的具体合适的细菌包括任何含有PUFA PKS系统的细菌。所述细菌通常由海洋或江河生境分离，并且可以容易地通过其产生PUFA的能力和/或该生物体中与已知的PUFA PKS基因同源的一种或多种基因的存在进行鉴定。所述细菌包括，但不限于，希瓦氏菌属和弧菌属的细菌。优选用于本发明的细菌包括那些具有在较高温度(例如高于大约15℃，20℃，25℃，或30℃乃至更高)保持生物学活性的PUFA PKS系统的细菌。本发明人鉴定了两种示范性的细菌(例如Shewanella olleyana和Shewanella japonica；参见实施例7和8)(其特别适于用作PUFA PKS基因来源)，其他细菌也可以容易地鉴定或已知含有PUFA PKS基因并且可以用于本发明的实施方案(例如，Shewanellagelidimarina)。
此外，已认识到并非所有细菌或非细菌微生物都可以由天然生境容易地培养。然而，所述无法培养的微生物的遗传特性可以通过从DNA分离的基因进行评价，所述基因全部由混合或粗制的环境样品制备。使用设计成与已知PUFA PKS基因中的高度相似性区域相匹配的引物进行简并PCR，可以从环境DNA样品中分离来自无法培养的微生物的、具体适于本发明的PUFA PKS基因(例如，参见实施例7)。另外，全DNA片段可以通过该领域已知的任何方法直接从纯化的环境DNA克隆。由此获得的DNA片段的序列可显示与已知基因例如PUFA PKS基因的同源性。OrfB和OrfC的同源物(指例如Schizochytrium和破囊壶菌属的结构域)可以特别用于限定PUFAPKS最终产物。PUFA PKS基因的整个编码区能，互相结合或与已知PUFAPKS基因或基因片段结合而在宿主生物体(例如大肠杆菌或酵母)中表达，以评价它们对PUFA制备的影响。如上所述，无细胞提取物中的活性可以用于测定在所需温度下的功能。分离的PUFA PKS基因也可以直接转化入合适的Schizochytrium或其它合适的菌株以测定功能。以上述方法鉴定或制备的PUFA PKS系统-编码的构建体，包括杂交构建体，也可以用来转化其它生物体，例如植物。
因此，使用本发明的非细菌PUFA PKS系统，例如，使用来自Thraustochytrid PUFA PKS系统以及来自细菌的PUFA PKS系统和PKS系统的基因，基因混合可以使PUFA产物的范围扩大至包括EPA，DHA，ARA，GLA，SDA及其他(在下面详细描述)，以及制备多种生物活性分子，包括抗生素，其它药物化合物，以及其它需要的产物。获得上述生物活性分子的方法不仅包括混合来自各种生物的基因，而且还包括本文公开的遗传修饰非细菌PUFA PKS基因的各种方法。对本发明的非细菌PUFA PKS系统的遗传基础和结构域结构的了解提供了设计产生各种生物活性分子的新的经遗传修饰的生物体的基础。尽管本发明人预期可混合和修饰任何PKS结构域和有关基因，但是以举例的方式，下面讨论了在遗传修饰和生物活性分子产生中对PUFA-PKS系统的各种可能的操作。
因此，本发明包括的方法通过下列方式遗传修饰微生物或植物细胞：遗传修饰生物体中至少一个核酸序列，该序列编码具有本发明非细菌PUFAPKS系统至少一个功能域生物学活性的氨基酸序列，和/或表达含有编码所述氨基酸序列的核酸序列的至少一个重组核酸分子。上面详细描述了所述序列，遗传修饰生物体的方法，和特异性修饰的各种实施方案。通常，该方法用来制备特定的经遗传修饰的生物体，其产生特定的生物活性分子或分子。
本发明的一个实施方案涉及遗传修饰Thraustochytrid微生物，其中该微生物具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，并且与无修饰的Thraustochytrid微生物相比，其中内源性PUFA PKS系统经过遗传修饰以改变微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)表达图谱。本发明用作宿主生物体的Thraustochytrid微生物内源性地含有并且表达PUFA PKS系统。所述遗传修饰可以是对内源性PUFA PKS系统的一个或多个功能域的遗传修饰，由此所述修饰改变内源性PUFA PKS系统的PUFA生产图谱。此外，或作为选择，遗传修饰可以是向微生物中引入至少一个外源核酸序列(例如，重组核酸分子)，其中所述外源核酸序列编码影响PUFA PKS系统活性的第二PKS系统和/或蛋白质的至少一个生物学活性结构域或蛋白质(例如，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase))。第二PKS系统可以是任何PKS系统，包括其它PUFA PKS系统，且包括将被遗传修饰的Thraustochytrid PUFA PKS系统的基因同源物。
本发明的该实施方案对于制备商业上有价值的富含PUFA的脂质例如EPA特别有用，通过本发明人建立的遗传修饰微生物和方法有效地产生富含PUFA的脂质(三酰甘油酯(TAG)以及膜相关磷脂(PL))。
本发明的该具体实施方案在某种程度上得自以下知识：(1)利用选定微生物的固有TAG生产能力，所述微生物具体是Thraustochytrids，例如此处所述的商业上的Schizochytrium菌株；(2)本发明人对真核生物和具体是Thraustochytriales目的成员的PUFA PKS生物合成途径的详细了解；和(3)利用Schizochytrium中的同源遗传重组系统。基于发明人对所涉及的系统的认识，可以利用相同的方法产生EPA以外的PUFA。
本发明的一个实施方案中，内源性Thraustochytrid PUFA PKS基因，例如编码通常产生DHA和DPA的PUFA PKS酶的Schizochytzium基因，通过随机或靶向的诱变进行修饰，用编码同源PKS蛋白质(例如，来自细菌或其它来源)的来自其它生物体的基因替换，或用遗传修饰的Schizochytrium，破囊壶菌属或其它Thraustochytrid PUFA PKS基因替换。例如，由上述引入和/或修饰的基因编码的酶的产物可以是EPA，或可以是其它相关分子，包括其它PUFA。本方法的一个特点是利用Thraustochytrid PUFA合成和积累机制的内源性组分，所述内源性组分对PUFA的有效生产和将PUFA掺入PL和TAG是必需的。特别地，本发明的该实施方案涉及改变生物体产生的PUFA类型，同时保持亲代株的高的油产率。
虽然下列某些论述将生物体Schizochytrium作为示范性宿主生物体，可以根据本发明对任何Thraustochytrid进行修饰，包括破囊壶菌属，Labyrinthuloides和Japonochytrium的成员。例如，鉴定编码破囊壶菌属的一种的PUFA PKS系统的基因(参见实施例6)，并且该生物体也可以作为使用此处描述的方法进行遗传修饰的宿主生物体，虽然更可能的情况是破囊壶菌属PKS基因可以用于修饰另一Thraustochytrid，例如Schizochytrium的内源性PUFA PKS基因。此外，使用US申请10/124,800(出处同上)所述筛选生物体的方法，可以鉴定用于本方法的其它生物体，且此处包括所有此类生物体。
本发明的该实施方案举例说明如下。通过举例，基于发明人当前对Schizochytrium中PUFA合成和积累的理解，整个生化过程可以被分成三个部分。
首先，Schizochytrium油类(DHA和DPA)中积累的PUFA是上述PUFA PKS系统的产物。Schizochytrium的PUFA PKS系统在不产生大量中间化合物的的情况下将丙二酰基辅酶A转化为最终产物PUFA。Schizochytrium中，鉴定了三个基因(OrfsA，B和C；也分别以SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5表示)，所述基因编码已知在PUFA实际合成中所需的所有酶结构域。已经从若干其它产生PUFA的非真核生物，即海洋细菌的某些菌株克隆和鉴定了类似基因的组(编码含有同源酶结构域的蛋白质)。此外，本发明人已经鉴定并测序了至少一种其它海洋原生生物(破囊壶菌属菌株23B)中的PUFA PKS基因(在下面详细描述)。
海洋细菌的PUFA产物包括EPA(例如，希瓦氏属SRC2738和Photobacterprofundum产生的)和DHA(海产弧菌，现在已知是Moritella marina)(如US专利6,140,486(出处同上)和US专利6,566,583(出处同上)所述)。本发明的一个实施方案中，可设想用任何PUFA PKS基因的组取代本文实施例中描述的Schizochytrium基因，只要在发酵条件下满足生产生物体(例如Schizochytrium)的生理生长需求。具体地，上述产生PUFA的细菌菌株仅在相对较低的温度生长(通常低于20℃)，进一步表明其PUFA PKS基因产物在Schizochytrium的标准生长温度(25-30℃)无功能。然而，本发明人最近鉴定了至少两种其它海洋细菌，它们在Schizochytrium以及其它Thraustochytrids的标准生长温度生长并产生EPA(参见实施例7)。上述可选的海洋细菌已经显示：具有通过此处描述的方法作为Schizochytrium以及其它Thraustochytrids的修饰材料的PUFA-PKS-样基因。由上述公开，其它目前未研究的或未鉴定的产生PUFA的细菌也可以含有用于Thraustochytrids修饰的PUFA PKS基因对本领域技术人员是显而易见。
第二，除编码直接涉及PUFA合成的酶的基因之外，还需要一个“附加”酶。该基因编码活化PUFA PKS复合物中存在的酰基载体蛋白(ACP)结构域的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)。添加该辅因子活化ACP结构域对PUFAPKS酶复合物发挥功能是必需的。迄今为止鉴定的PUFA PKS系统的所有ACP结构域显示高度氨基酸序列保守性，且不受理论的约束，本发明人相信Schizochytrium以及其它Thraustochytrids的PPTase可以识别和激活其它PUFAPKS系统的ACP结构域。作为理论的证明，异源PPTases和PUFA PKS基因可以一起发挥功能以产生PUFA产物，本发明人在此证明使用来自Schizochytrium的两种不同的异源PPTases和PUFA PKS基因以在细菌宿主细胞中产生PUFA。
第三，Schizochytrium中，PUFA PKS系统的产物被有效地引入(channelinto)磷脂(PL)和三酰甘油酯(TAG)。本发明人的数据显示，PUFA从PKS复合物的ACP结构域转移至辅酶A(CoA)。如在其它真核生物中，所述酰基辅酶A作为形成PL和TAG分子的各种酰基转移酶的底物。相反，该数据表明在细菌中，不存在转入辅酶A；而存在从PKS复合物的ACP结构域直接转移至形成PL的酰基转移酶。将PUFA从ACP转移至CoA的Schizochytrium中酶系统可以识别DHA和DPA，因此本发明人相信可以预测PUFA PKS系统的任何PUFA产物(如附着于PUFA PKS ACP结构域)可以作为底物。
因此，在本发明一种实施方案中，本发明人建议，利用Schizochytrium或另一种Thraustochytrid宿主的内源性PPTase(部分2)和PUFA-ACP至PUFA-CoA转移酶活性以及TAG/PL合成系统(或其它内源性PUFA的ACP至TAG/PL机制)(部分3)，改变编码PUFA PKS酶复合物(部分1)的组分的基因。本发明的上述方法由试验数据支持，其中一些在实施例部分详细描述。
首先，本发明人发现PUFA PKS系统可以在生物体之间转移，且某些部分可以互换。更特别地，先前已经显示，海洋细菌，希瓦氏菌属SCR2738(Yazawa，1996，Lipids 31：S297-300)和海产弧菌(与希瓦氏菌属的PPTase一起)(US 6,140,486)的PUFA PKS途径可以成功地转入异源宿主(即转入大肠杆菌)。此外，上述两种生物体(希瓦氏菌属SCRC2738和海产弧菌)PUFA PKS酶亚单位之间的结构同源性程度使得可以混合和匹配上述两种系统的基因(US 6,140,486出处同上)。混合的成组基因的PUFA最终产物由于特定基因同源物的来源而不同。至少一个开放阅读框(希瓦氏属的Orf 7及其海产弧菌同源物，参见US 6,140,486的附图13；注意该Orf的命名法已经改变；本专利中其被标记为Orf 8，但是以Orf7提交Genbank，并且现在指其GenBank名称)与确定DHA还是EPA将要成为复合系统的产物有关。迄今为止鉴定的所有PUFA PKS酶的功能域显示相互之间的序列同源性。类似地，所述数据表明包括来自海洋细菌的PUFA PKS系统可以转入Schizochytrium以及其它Thraustochytrids中，并在其中发挥作用。
本发明人在大肠杆菌宿主中表达了来自Schizochytrium的PUFA PKS基因(OrfsA，B和C)，并且证明细胞产生的DHA和DPA比例与上述Schizochytrium中这些PUFA的内源性生产几乎相同(参见实施例2)。因此，已经证明重组Schizochytrium PUFA PKS基因编码功能性PUFA合成系统。此外，所有或部分破囊壶菌属23B OrfA和OrfC基因已经显示在Schizochytrium中发挥功能(参见实施例6)。
第二，本发明人之前已经发现PPTases可以活化异源PUFA PKS ACP结构域。用来自海产弧菌的PUFA PKS基因转化的大肠杆菌中，只有当还存在合适的PPTase基因(在这种情况下，来自希瓦氏菌属SCRC2738)时才产生DHA(参见US6,140,486，出处同上)。上述证明了希瓦氏菌属PPTase能够活化弧菌PUFA ACP结构域。此外，本发明人已经证明使用来自枯草芽孢杆菌的PPTase(sfp)对来自Schizochytrium Orf A的ACP结构域(参见实施例2)的活化(泛酰巯基乙胺化)。本发明人还证明了使用来自念珠藻属的称为Het的PPTase对来自Schizochytrium Orf A的ACP结构域(参见实施例2)的活化(泛酰巯基乙胺化)。上述实验中，HetI酶另外用作PPTase，以使用重组Schizochytrium PUFA PKS基因在大肠杆菌中产生DHA和DPA(实施例2)。
第三，数据表明DHA-CoA和DPA-CoA可以是Schizochytrium TAG和PL合成途径的代谢中间产物。公开的生化数据显示，细菌中新合成的PUFA直接从PUFA PKS ACP结构域转移至磷脂合成酶。相比之下，本发明人的数据表明真核生物生物体Schizoclzytrium中，可能在PUFA PKS ACP结构域的PUFA和目标TAG和PL分子之间存在一种中间体。真核生物细胞质中的常见脂肪酸载体是CoA。本发明人检验了Schizochytrium细胞的提取物，发现了显著性水平的一种化合物，其在HPLC分级分离中与标准DHA-CoA，DPA-CoA，16：0-CoA和18：1-CoA共迁移。使用质谱法确定推定的DHA-CoA和DPA-CoA峰。相比之下，本发明人无法检测海产弧菌提取物中的DHA-CoA，再次提示细菌中存在不同的PUFA转移至其最终靶(例如，直接转移至PL)的机制。上述数据表明Schizochytrium中可能存在将新合成的PUFA转移至CoA(可能直接从ACP转移至CoA)的机制。然后，TAG和PL合成酶可以接触上述PUFA-CoA。观察到产生了DHA和DPA两者说明：酶转移机制可能识别一系列PUFA。
第四，本发明人建立了Schizochytrium中的Orf A，Orf B和Orf C敲除(参见实施例3)。上述敲除策略取决于已经证明在Schizochytrium中存在的同源重组(参见美国专利申请10/124,807，出处同上)。若干策略可以用于设计敲除构建体。用于灭活上述三个基因的具体策略利用将与微管蛋白启动子(来自pMON50000，参见U.S.专利申请序列号10/124,807)偶联的ZeocinTM抗性基因插入Orf的克隆部分。然后，含有中断的编码区的新构建体通过粒子轰击用于转化野生型Schizochytrium细胞(参见U.S.专利申请序列号10/124,807)。轰击的细胞涂布至含有ZeocinTM和PUFA供应的平板上(如下)。然后将上述平板上生长的菌落划线至未补充PUFA的ZeocinTM平板上。需要补充PUFA以生长的菌落是具有因同源重组而失活的PUFA PKS Orf的候选物。在所有3种情况中，通过使用各个Schizochytrium Orfs的全长基因组DNA克隆转化细胞来挽救敲除，从而证实上述假定。此外，在一些情况中，人们发现ZeocinTM抗性基因已经被消除(参见实施例5)，表明上述引入的功能基因通过双重同源重组(即缺失抗性标记)整合至原始位点。该策略成功的关键是在菌种生长培养基中补充PUFA。在目前的情况下，已发现补充的有效方法是加入上述菌种生长培养基之前，通过与部分甲基化的β-环糊精混合来隔绝(sequestration)PUFA(参见实施例5)。这些实验证明一种原理，根据上述指导，本领域技术人员可以灭活含有PUFA PKS的微生物例如Schizochytrium的一个或多个PUFA PKS基因，并且根据本发明(例如，改变重组生物体的脂肪酸图谱)构建可以用于进一步遗传修饰的PUFA营养缺陷型(例如，通过引入其它PKS基因)。
本发明生物体遗传修饰的一个重要因素是能够直接转化Thraustochytrid基因组。U.S.申请序列号10/124,807(出处同上)中证明了通过单交换同源重组转化Schizochytrium和通过双交换同源重组进行定向基因替换。如上所述，本发明人将上述技术用于同源重组以灭活Schizochytrium中PUFA-PKA系统的Orf A，Orf B和OrfC。得到的变异体取决于在培养基中补充PUFA。已经发展并可得到某些转化标记，使引入基因高水平表达的启动子元件和传递外源遗传物质的方法。因此，所述工具用于敲除Thraustochytrids和其它具有类似PUFA PKS系统的真核生物中内源性PUFA PKS基因，并且如上面建议的用来自其它生物体(或者用修饰的Schizochytrium基因)的基因替换上述内源性PUFA PKS基因。
生产EPA富集的TAG的一种方法中，可以通过添加编码产物为EPA的PUFA PKS系统的异源基因来改变Schizoclzytrium PUFA PKS系统。可以预期内源性PPTase将激活异源PUFA PKS系统的ACP结构域。此外，可以预期EPA可以转化为EPA-CoA，并且容易地掺入Schizochytrium TAG和PL膜。在该方法的一种改变中，可以使用技术修饰内源Schizochytrium系统的相关结构域(通过引入异源基因的具体区域或者通过诱变Schizochytrium基因本身)，以使其最终产物是EPA而不是DHA和DPA。这是一种常规的方法，正如该技术可以被用于生产其它PUFA最终产物，和应用于任何含有PUFA PKS系统且具有有效地将PUFA PKS系统的产物引入磷脂(PL)和三酰甘油酯(TAG)能力的真核微生物。具体地，本发明适用于任何Thraustochytrid微生物或者任何其它具有内源性PUFA PKS系统的真核生物，下面通过实施例详细描述。此外，本发明适用于任何合适的宿主生物体，可以将用于产生上述各种PUFA图谱的经修饰的遗传物质转化入该宿主生物体。例如，在实施例中，来自Schizochytrium的PUFA PKS系统被转化入大肠杆菌。可以进一步修饰上述经转化的生物体，以使用上述方法改变PUFA生产图谱。
本发明可以使用编码来自除了此处所述PUFA PKS系统和U.S.专利申请序列号10/124,800中的PKS系统的蛋白质或结构域的基因和核酸序列，且包括来自细菌和非细菌PKS系统的基因和核酸序列，包括上述II型，I型和模块PKS系统。表达每一类PKS系统的生物体是本领域已知的，并且可以作为用于本发明遗传修饰过程的核酸来源。
在一个优选实施方案中，编码来自PUFA PKS系统以及PKS系统或者来自其它PUFA PKS系统的蛋白质或者结构域的基因和核酸序列被分离，或得自具有优选用于生长产生PUFA的特性的生物体。具体地，所希望的是能够在大于约15℃，大于20℃，大于30℃，大于35℃，大于40℃的温度或者在一个实施方案中，在20～40℃之间的任何温度，培养遗传修饰的Thraustochytrid微生物。因此，优选在这些温度具有功能性酶活的PKS蛋白质或者结构域。例如，本发明人在此处描述了来自Shewanella olleyana或Shewanella japonica的PKS基因的使用，所述细菌是天然产生EPA并且分别在高至30℃和35℃的温度生长的海洋细菌(参见实施例7)。来自这些生物体的PKS蛋白质或者结构域是下述蛋白质和结构域的实例，所述蛋白质和结构域可以与此处描述的Thraustochytrid PUFA PKS蛋白质和结构域混合以产生具有具体设计的或修饰的PUFA生产图谱的经遗传修饰的生物体。
在另一个优选实施方案中，来自可产生一种脂肪酸图谱的PUFA PKS系统的蛋白质或结构域的编码基因和核酸序列用来修饰另一种PUFA PKS系统，并由此改变宿主的脂肪酸图谱。例如，Thraustochytrium23B(ATCC20892)与Schizochytrium sp.(ATCC20888)的脂肪酸图谱显著不同。Thraustochytrium23B的DHA:DPA(n-6)比例可高达40:1，相比之下Schizoclzytrium(ATCC20888)中的仅为2-3:1。Thraustochytrium23B也可以具有更高水平的C20:5(n-3)。然而，与Thraustochytrium 23B相比，Schizochytrium(ATCC 20888)是一种极好的油类产生者。Schizochytrium积聚大量富含DHA和二十二碳五烯酸(DPA；22:5ω6)的三酰甘油酯；例如，30％干重的DHA+DPA。因此，本发明人于此处描述了使用Thraustochytrium 23B PUFA PKS基因修饰Schizochytrium内源性PUFA PKS系统，以构建遗传修饰的Schizochytrium，其DHA:DPA图谱更类似于Thraustochytrium 23B(即“超级DHA生产者”Schizochytrium，其具有Schizochytrium的生产能力和破囊壶菌属的DHA：DPA比例)。
因此，本发明使用来自Thraustochytrid PUFA PKS系统的基因，并且进一步使用基因混合以扩大和/或改变PUFA产物的范围以包括EPA，DHA，DPA，ARA，GLA，SDA等。获得上述改变的PUFA生产图谱的方法不仅包括将来自各种生物体的基因混合入Thrasustochytrid PUFA PKS基因，而且还包括各种遗传修饰此处公开的内源性Thraustochytrid PUFA PKS基因的方法。对本发明Thraustochytrid PUFA PKS系统的遗传基础和结构域结构的知识(例如上面详细描述的Schizochytrium)提供了设计新的产生各种PUFA图谱的经遗传修饰的生物体的依据。Thraustochytrid等微生物中制备的新PUFAPKS构建体可以被分离并且用于转化植物以赋予植物类似的PUFA产油特性。
可以根据本发明改变或替换任何一个或更多内源性ThraustochytridPUFA PKS结构域，条件是所述修饰产生所需的结果(即，改变微生物的PUFA生产图谱)。具体优选的待改变或替换的结构域包括，但不限于，任何相当于下列的结构域：Schizochytrium OrfB或OrfC结构域(β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，酰基转移酶(AT)，FabA-样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)，链长因子(CLF)，烯酰ACP-还原酶(ER)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基ACP向顺式-3-酰基ACP可逆异构化的酶，和催化顺式-3-酰基ACP延长至顺式-5-β-酮脂酰-ACP的酶)。在一个实施方案中，优选的用于改变或替换的结构域包括，但不限于，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，FabA-样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)和链长因子(CLF)。
在本发明一方面中，通过修饰CLF(链长因子)结构域改变ThraustochytridPUFA-PKS PUFA生产。该结构域是II型(分离的酶)PKS系统的特征。其氨基酸序列与KS(酮合酶对)结构域具有同源性，但它缺乏活性位点半胱氨酸。CLF可发挥确定延长循环次数，且因此确定最终产物的链长的功能。在本发明的该实施方案中，使用目前对FAS和PKS合成的了解情况，提供了通过定点修饰非细菌PUFA-PKS系统产生ARA的合理策略。在文献中关于CLF在PKS系统中的功能存在争论(C.Bisang等，Nature 401，502(1999))且认识到其它结构域可能与最终产物的链长确定相关。然而，有意义的是Schizochytrium同时产生DHA(C22：6，ω-3)和DPA(C22：5，ω-6)。在PUFA-PKS系统中，在碳链生长的合成期间导入顺式双键。由于在该分子合成的早期出现ω-3和ω-6双键的放置，因此预期它们不会影响随后的最终产物链长确定。因此，不受理论的约束，本发明人相信将指导C20单元(代替C22单元)合成的因子(例如，CLF)导入Schizochytrium PUFA-PKS系统中将导致产生EPA(C20：5，ω-3)和ARA(C20：4，ω-6)。例如，在异源性系统中，通过将来自产生EPA的系统的CLF(例如，来自发光菌属(Photobacterium)，或优选来自具有下述优选生长需求的微生物的CLF)直接取代进Schizochytrium基因组可利用该CLF。然后分析所得的转化子的脂肪酸图谱特征的变化以鉴定产生EPA和/或ARA的转化体。
例如，在本发明的这方面，可以构建一种克隆，其OrfB的CLF被来自C20PUFA-PKS系统的CLF替换。可以在编码区的下游插入标记基因。更具体地说，如本文所述且在如上U.S.专利申请序列号10/124,807中详细描述的，可以使用同源重组系统以转化Thraustochytrids。然后可以转化野生型Thraustochytrid细胞(例如，Schizochytrium细胞)，选择标记表型，然后筛选那些掺入了新CLF的细胞。此外，可以分析对上述转化体的脂肪酸图谱的任何影响以鉴定产生EPA和/或ARA的转化体。如果发现除了与CLF相关因素外的某些因素影响最终产物的链长，可以使用类似策略以改变那些因子。
在本发明的另一方面，涉及修饰或取代β-羟基酰基ACP脱水酶/酮合酶对。在大肠杆菌中合成顺式-11-十八碳烯酸(C18:1，△11)的过程中，形成顺式双键被认为依赖于具体的DH酶，fabA基因的产物β-羟基酰基-ACP脱水酶。该酶从β-酮脂酰-ACP移除HOH，并在碳链中产生反式双键。DH的一个亚型，FabA-样，具有顺反异构酶活性(如上Heath et al.，1996)。细菌和非细菌PUFA-PKS系统的一个新方面是存在两个FabA-样DH结构域。不受理论的约束，本发明人相信一个或所有两个所述DH结构域将具有顺反异构酶活性(下面将更详细地讨论操纵DH结构域)。
大肠杆菌中不饱和脂肪酸合成的另一个方面是需要具体的KS酶，β-酮脂酰-ACP合酶，fabB基因的产物。该酶是完成连接到活性位点的半胱氨酸残基(通过硫酯键)的脂肪酸与丙二酰-ACP进行缩合的酶。在多步骤反应中，释放CO2且以两个碳延长直链。据信只有该KS延长含有双键的碳链。只有当双键为顺式构型时发生该延长，如果为反式构型，在延长前双键被烯酰-ACP还原酶(ER)还原(Heath et al，1996，出处同上)。至今鉴定的所有PUFA-PKS系统都具有两个KS结构域，一个与大肠杆菌的FabB-样KS比与其它KS具有更高的同源性。同样，不受理论的约束，本发明人相信在PUFA-PKS系统中，DH(FabA-样)和KS(FabB-样)酶结构域的特异性和相互作用确定了终产物中顺式双键的数目和位置。由于2-碳延长反应的次数比PUFA PKS终产物中存在的双键数目更大，因此可确定在一些延长循环中发生了完全还原。因此DH和KS结构域可用作改变DHA/DPA比率或其它长链脂肪酸比率的靶。通过导入来自其它系统的同源性结构域或者通过对这些基因片段的诱变可修饰和/或评估它们。
在另一实施方案中，可修饰或取代ER(烯酰-ACP还原酶，一种还原脂肪酸-ACP中的反式双键产生完全饱和碳的酶)结构域以改变PKS系统制备的产物类型。例如，本发明人已知Schizochytrium PUFA-PKS系统与以前描述的细菌系统的区别在于它具有两个(而不是一个)ER结构域。不受理论的约束，本发明人相信这些ER结构域可有效影响所得的PKS生产产物。通过分别敲除单个结构域或者通过修饰其核苷酸序列或者通过用来自其它生物的ER结构域的取代可改变所得的PKS产物。
本发明的另一方面中，涉及用不具有异构化活性的DH结构域取代PUFAPKS系统中的一个DH(FabA-样)结构域，可能产生具有混合顺式和反式双键的分子。Schizochytrium PUFA PKS系统的当前产物是DHA和DPA(C22：5ω6)。如果操纵该系统产生C20脂肪酸，预期产物是EPA和ARA(C20：4ω6)。其可以提供一种新的ARA来源。还可以例如通过使用来自破囊壶菌属23B的基因，取代产生不同DHA/DPA比例的相关PUFA-PKS系统(U.S.专利申请序列号10/124,800(出处同上)鉴定了该PUFA PKS系统)。
另外，在一种实施方案中，改变Thraustochytrid PUPA PKS系统中的一个ER结构域(例如通过消除或灭活)以改变最终产物图谱。使用或多或少改进的方案，以直接的方式可以尝试对PUFA PKS蛋白质的不同结构域使用类似的策略。当然不应被限制于操纵单一结构域。最后，可以通过混合来自PUFAPKS系统以及其它PKS或FAS系统(例如，I型，II型，模块)的结构域来扩展该方法，以形成新PUFA最终产物的完整范围。
已经认识到，许多可引入天然(内源性的，天然的)PKS系统的随机的或定向的遗传改变将导致酶功能的失活。因此，为了检测受控环境中Thraustochytrid PUFA PKS遗传操纵的影响，可以首先在另一宿主例如大肠杆菌中使用重组系统，以操控该系统的各方面并评价结果。例如，大肠杆菌的FabB-菌株不能合成不饱和脂肪酸且为了生长需要向培养基中补充可代替其正常不饱和脂肪酸的脂肪酸(参见Metz et al，2001，出处同上)。然而，当用有功能的PUFA-PKS系统(即在大肠杆菌宿主中产生PUFA产物的系统一参见Metz et al，2001，出处同上，图2A)转化该菌株时可取消该需要(对培养基的补充的需要)。转化的FabB-菌株现在需要有功能的PUFA-PKS系统(以产生该不饱和脂肪酸)以在无补充的情况下生长。该例子中的关键因素在于可以产生大范围的不饱和脂肪酸(甚至是不饱和脂肪酸替代物，诸如支链脂肪酸)。因此，在本发明的另一优选的实施方案中，可在本文公开的一种或多种PUFA PKS基因中产生大量突变，然后转化适当修饰的FabB-菌株(例如在含有ER结构域的表达构建体中产生突变，并转化具有在独立的质粒上的或整合入染色体中的其它必需结构域的FabB菌株)，并仅选择不需培养基的补充就能生长(即仍然具有产生能弥补FabB-缺陷的分子的能力)的那些转化体。
实施例部分举例说明了PUFAPKS遗传修饰的一种测试系统。简要地，用编码含有全部或部分Thraustochytrid PUFA PKS系统(例如Schizochytrium的Orfs A，B和C)的PUFA PKS系统的基因以及编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)的基因转化大肠杆菌等宿主微生物，其中磷酸泛酰巯基乙胺辅因子的附着需要PPTase以产生有活性的，完整的-ACP。可以对编码PKS系统的基因进行基因改造，以在Thraustochytrid PUFA PKS基因中引入一种或多种修饰，和/或将编码来自其它PKS系统的结构域的核酸引入Thraustochytrid基因(包括来自非Thraustochytrid微生物和来自不同Thraustochytrid微生物的基因)。PUFA PKS系统可以在大肠杆菌中表达，并测定PUFA生产图谱。如此，在操纵Thraustochytrid PUFA生产生物体之前，可以评价潜在的遗传修饰。
本发明包括操纵内源核酸分子和/或使用分离的核酸分子，所述分离的核酸分子含有来自Thraustochytrid PUFA PKS系统或其同系物的核酸序列。在一方面，本发明涉及对核酸分子的修饰和/或使用，所述核酸分子含有编码具有以下蛋白质中至少一种蛋白质的生物的学活性的PUFA PKS系统的结构域的核酸序列：丙二酰基-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮还原酶(KR)，酰基转移酶(AT)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，链长因子(CLF)，酰基载体蛋白(ACP)，烯酰ACP-还原酶(ER)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶，和/或催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮基-酰基-ACP的酶。本文先前已经论述了被修饰以改变宿主Thraustochytrid的PUFA生产图谱的优选结构域。
根据本发明对Thraustochytrid微生物进行的遗传修饰优选影响该微生物产生的PUFA的类型，数量，和/或活性，是否对内源性PUFA PKS系统进行遗传修饰和/或是否在该生物体中引入重组核酸分子。根据本发明，影响PUFA PKS系统的活性，例如影响PUFA生产图谱，包括PUFA PKS系统或与PUFA PKS系统相互作用的基因中的任何遗传修饰，其与无遗传修饰相比，引起由生物体表达的PUFA PKS系统的任何生物活性的任何可检测或可测量的变化或修饰。根据本发明，术语“PUFA图谱”，“PUFA表达图谱”和“PUFA生产图谱”可以互换，并且描述所述微生物表达/产生的PUFA的整体图谱。PUFA表达图谱包括该微生物表达的PUFA类型，以及产生的PUFA的绝对和相对数量。因此，PUFA图谱可依据微生物产生的PUFA相互之间的比例，微生物产生的PUFA类型，和/或微生物产生的PUFA的类型以及绝对或相对数量来描述。
如上述讨论，宿主微生物可以包括任何具有内源性PUFA PKS系统并且能够有效地将该PUFA PKS系统的产物引入磷脂(PL)和三酰甘油(TAG)的真核微生物，优选的宿主微生物是Thraustochytriales目，包括Thraustochytriaceae和Labyrinthulaceae科的任何成员。用于本发明的具体优选的宿主细胞包括，但不限于下列属的微生物：Thraustochytriaceae科的破囊壶菌属，Japonochytrium，Aplanochytrium，Elina和Schizoclzytrium，和Labyrinthulaceae科的Labyrinthula，Labyrinthuloides，和Labyrinthomyxa。这些属内优选的种包括，但不限于：Labyrinthula属的任何种，包括Labrinthula sp.，labyrinthula algeriensis，Labyrinthula cienkowskii，Labyrinthula chattonii，Labyrinthula coenocystis，Labyrinthula macrocystis，Labyrinthula macrocystisatlantica，Labyrintlzula macrocystis macrocystis，Labyrinthula magnifica，Labyrinthula minuta，Labyrinthula roscoffensis，Labyrintlzula valkanovii，Labyrinthula vitellina，Labyrinthula vitellina pacifica，Labyrinthula vitellifaavitellina，Labyrinthula zopfii；任意Labyrinthuloides种，包括Labyrinthuloidessp.，Labyrinthuloides minuta，Labyrinthuloides schizochytrops；任意Labyrinthomyxa种，包括Labyrinthomyxa sp.，Labyrinthomyxa pohlia，Labyrinthomyxa sauvageaui，任意Aplanochytrium种，包括Aplanochytrium sp.和Aplanochytrium kerguelensis；任意Elina种，包括Elina sp.，Elina marisalba，Elina sinorifica；任意Japanochytrium种，包括Japanochytrium sp.，Japanochytrium marinum；任意Schizochytrium种，包括Schizochytrium sp.，Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinurn，Schizochytriunaminutum，Schizochytrium octosporum；任意破囊壶菌属的种，包括Thraustochytrium sp.，Thraustoclzytrium aggregatum，Thraustochytriumarudimentale，Thraustochytrium aureum，Thraustochytrium benthicola，Thraustochytrium globosum，Thraustochytrium kinnei，Thraustochytriummotivum，Thraustochytrium pachydermum，Thraustochytrium proliferum，Thraustochytrium roseum，Thraustochytrium striatum，Ulkenia sp.，Ulkeniaminuta，Ulkenia profunda，Ulkenia radiate，Ulkenia sarkariana和Ulkeniavisurgensis。这些属内具体优选的种包括，但不限于：Schizochytrium属的任何种，包括Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinurn，Schizochytriuna minutum；破囊壶菌属的任何种(包括先前的Ulkenia种例如U.visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.profunda，U.radiata，U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601)并且包括Thraustochytrium striatum，Thraustochytriumaureum，Thraustochytrium roseum；和Japonochytrium属的任何种。Thraustochytriales具体优选的菌株包括，但不限于：Schizochytrium sp.(S31)(ATCC20888)；Schizochytrium sp.(S8)(ATCC20889)；Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC18915)；Schizochytrium sp.(SR21)；Schizochytrium aggregatum(Goldstein et Belsky)(ATCC28209)；Schizochytrium limacinuin(Honda etYokochi)(IFO 32693)；Thraustochytrium sp.(23B)(ATCC20891)；Thraustochytrium stratum(Schneider)(ATCC 24473)；Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC 34304)；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC28210)；和Japonochytrium sp.(L1)(ATCC 28207)。
本发明的一个实施方案中，诱变过程可以与选择性筛选过程结合使用，以获得具有所需PUFA生产图谱的Thraustochytrid微生物。诱变方法包括，但不限于：化学诱变，基因改组，编码特定酶结构域的基因区域的转换，或局限于该基因特定区域的诱变，以及其他方法。
例如，高通量诱变方法可用于影响或优化所需PUFA图谱的产生。一旦建立了有效的模型系统，可以以高通量方式修饰这些基因。可以在2种水平上使用这些技术。首先，如果可以设计出所需产品(如EPA)产生的选择性充分的筛选，其可以用于试图改变该系统以产生所述产品(如代替或与上述讨论的其他策略一致)。此外，如果上述策略导致产生所需PUFA图谱的一组基因，高通量技术可以用于优化该系统。例如，如果引入的结构域仅在相对较低的温度发挥功能，可以设计筛选方法以允许消除上述限制。
本发明一个实施方案中，遗传修饰的Thraustochytrid微生物具有增强的合成所需PUFA的能力，和/或具有新引入的合成不同PUFA图谱的能力。根据本发明，对产品的“增强的合成能力”指与产品合成相关的途径中的任何增强或上调，使得与相同条件下培养或生长的野生型微生物相比，微生物产生的该产品的量增加(包括产生以前没有的产品)。上面已经详细描述了产生上述遗传修饰的生物体的方法。
如上所述，本发明一个实施方案中，经遗传修饰的微生物或植物包括具有增强的合成所需生物活性分子(产品)的能力的微生物或植物，或具有新引入的合成特定产品的能力(如合成特定抗生素)的微生物或植物。根据本发明，对产品的“增强的合成能力”指与产品合成相关的途径中的任何增强或上调，使得与相同条件下培养或生长的野生型微生物相比，微生物或植物产生的该产品的量增加(包括产生以前没有的产品)。上面已经详细描述了产生上述遗传修饰的生物体的方法。
本发明的一个实施方案是：通过生长或培养本发明的经遗传修饰的微生物或植物来产生所需生物活性分子(也称为产品或化合物)的方法(在上文详细描述)。上述方法包括分别在发酵培养基中培养微生物或在合适的环境例如土壤中使植物生长的步骤，所述微生物或植物具有本文先前所述的遗传修饰并且与本发明一致。优选用于与本发明PUFA PKS系统相关的经遗传修饰的宿主细胞在上文描述。
本发明的一个实施方案是：通过培养本发明经遗传修饰的Thraustochytrid微生物来产生所需PUFA的方法(上面详细描述)。上述方法包括在发酵培养基中、有利于产生PUFA的条件下培养Thraustochytrid微生物的步骤，所述微生物具有本文先前所述的遗传修饰并且与本发明一致。合适的或有效的培养基指本发明经遗传修饰微生物，包括Thraustochytrids及其他微生物在其中培养时能够产生所需PUFA产品的任何培养基。上述培养基一般是含有可同化碳，氮和磷酸盐源的液体培养基。所述培养基还可包括适当的盐，矿物质，金属及其他养分。本发明的任何微生物可以在传统的发酵生物反应器中培养。微生物可以通过任何发酵过程培养，包括但不限于分批发酵，补料分批发酵，细胞再循环和连续发酵。本发明Thraustochytrid微生物的优选生长条件是本领域熟知的，且在US 5,130,242，US 5,340,742和US 5,698,244中详细描述，每一篇并入此处作为参考。
一个实施方案中，在以下温度下培养经遗传修饰的微生物：大于约15℃的温度，且在另一个实施方案中，大于约20℃，且在另一个实施方案中大于约25℃，且在另一个实施方案中大于约30℃，且在另一个实施方案中大于约35℃，且在另一个实施方案中大于约40℃，且在另一个实施方案中，在20～40℃之间任一温度。
可以使用传统的分离和提纯技术从发酵培养基中回收经遗传修饰的微生物产生的所需PUFA和/或其他生物活性分子。例如，可以过滤或离心发酵培养基以除去微生物，细胞碎片及其他颗粒物质，且可以通过常规方法从无细胞悬液回收产品，所述常规方法例如离子交换，色谱法，萃取，溶剂萃取，相位分离，膜分离，电渗析，反渗透，蒸馏，化学衍生和结晶。另外，可以不必从产品中除去微生物而使用产生PUFA的微生物，或其提取物及各种级分。
优选地，本发明遗传修饰的Thraustochytrid微生物产生一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20：5，ω-3)，DHA(C22：6，ω-3)，DPA(C22：5，ω-6)，ARA(C20：4，ω-6)，GLA(C18：3，n-6)和SDA(C184，n-3))。一个优选实施方案中，根据本发明对野生型形式的Schizochytrium进行遗传修饰，以产生高水平的EPA。所述野生型Schizochytrium产生高水平DHA和DPA。正如以上的讨论，使用遗传修饰的Thraustochytrid微生物生产PUFA的一个优点是：PUFA被直接掺入磷脂(PL)和三酰甘油酯(TAG)。
优选地，PUFA以大于约5％微生物干重的量产生，一方面，以大于6％的量，另一方面，以大于7％的量，另一方面，以大于8％的量，另一方面，以大于9％的量，另一方面，以大于10％的量，诸如此类以全部整数百分数，直至大于90％微生物干重(如15％，20％，30％，40％，50％，和任何中间的百分数)。
本发明生产所需生物活性化合物的方法中，在发酵培养基培养中或在合适的介质例如土壤中培养经遗传修饰的植物。上面已经详细讨论了合适的或有效的发酵培养基。适合高等植物的生长培养基包括任何用于植物的生长培养基，包括但不限于土壤，沙子，任何其他支持根部生长的颗粒性介质(如蛭石(vermiculite)，珍珠岩等(perlite)等)或溶液培养基，以及适当的光照，水分和优化高等植物生长的饮食补充剂。改造本发明经遗传修饰的植物，通过根据本发明遗传修饰的PKS系统的活性，来产生显著量的所需产品。可以通过从植物提取化合物的纯化过程来回收化合物。在一个优选实施例中，通过收获植物来回收化合物。在该实施例中，植物可以以自然状态被食用或进一步加工成可食用的产品。
本发明的公开以及本文已经讨论的各种其它修饰，许多用于产生生物活性分子的遗传修饰对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明涉及了任何与本文所述导致产生所需生物活性分子的PUFA PKS系统相关的遗传修饰。
本发明的生物活性分子包括具有生物活性，而且可以由包括至少一个氨基酸序列的PKS系统产生的任何分子(化合物，产品等等)，所述氨基酸序列具有本文所述非细菌PUFA PKS系统至少一个功能域的生物活性。上述生物活性分子包括，但不限于：多不饱和脂肪酸(PUFA)，抗炎配制品，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松症药物，抗抑郁剂，抗惊厥剂，抗幽门螺杆菌药物，治疗神经变性疾病的药物，治疗肝脏变性疾病的药物，抗生素，降低胆固醇的成分。本发明非细菌PUFA PKS系统的一个优点是：上述系统在顺式构型引入碳-碳双键的能力以及分子的每第3个碳含有一个双键。可以利用该能力产生各种化合物。
优选地，所需生物活性化合物由经遗传修饰的微生物产生，以微生物干重计其产量为大于约0.05％，且优选大于约0.1％，且更优选大于约0.25％，且更优选大于约0.5％，且更优选大于约0.75％，且更优选大于约1％，且更优选大于约2.5％，且更优选大于约0.25％，且更优选大于约5％，且更优选大于约10％，且更优选大于约15％，且更优选大于约20％。优选地，对于脂质化合物，上述化合物以大于约5％微生物干重的量产生。对于其他生物活性化合物，例如以较小量合成的抗生素或化合物，具有以微生物干重量表示的化合物的菌株被鉴定为可以预见地包含上述类型的新PKS系统。在某些实施方案中，特定的生物活性分子(化合物)是由微生物分泌的，而不是积累的。因此，通常从培养基中回收上述生物活性分子，且产生的分子的浓度根据微生物以及培养物的大小而不同。
本发明的一个实施方案涉及修饰包含至少一种脂肪酸的最终产物的方法，包括向最终产物中添加由表达至少一种重组核酸分子的重组宿主细胞产生的油，所述重组核酸分子包括编码PUFA PKS系统的至少一个生物学活性结构域的核酸序列。PUFA PKS系统包括本文所述任何合适的细菌或非细菌PUFA PKS系统，包括来自破囊壶菌属和Schizochytrium的PUFA PKS系统，或来自通常(如在正常的或自然条件)可以在大于22℃的温度生长并产生PUFA的细菌的任何PUFA PKS系统，诸如Shewanella olleyana或Shewanellajaponica。
优选地，最终产品选自食品，饮食补充剂，药物配制品，人源化动物乳汁和婴儿代乳品。合适的药物配制品包括，但不限于，抗炎配制品，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松症药物，抗抑郁剂，抗惊厥剂，抗幽门螺杆菌药物，治疗神经变性疾病的药物，治疗肝脏变性疾病的药物，抗生素和降低胆固醇配制品。在一个实施方案中，最终产品用于治疗选自下述疾病组成的组的病症：慢性炎症，急性炎症，胃肠疾病，癌症，恶病质，心脏再狭窄，神经变性疾病，肝脏的变性疾病，血脂紊乱，骨质疏松症，骨关节炎，自身免疫疾病，先兆子痫，早产，年老性黄斑病变，肺部疾病，和过氧化物酶体疾病。
合适的食品包括，但不限于，精细面包商品，面包卷(bread and rolls)，早餐谷类食品，加工的和未加工的乳酪，调味品(番茄酱，蛋黄酱等)，乳制品(奶，酸乳酪)，布丁和胶质甜点，碳酸饮料，茶，粉末状饮料混合物，加工的鱼产物，基于水果的饮料，口香糖，硬甜食，冷冻乳制品，加工的肉类产物，坚果和坚果饼(nut-based spreads)，意大利面，加工的家禽产物，肉汁和酱，马铃薯片和其它片状食品或松脆食品，巧克力和其它甜食，汤和汤混合物，大豆类产物(奶，饮料，乳酪，增白剂(whiteners))，基于植物油的饼(spreads)，和基于蔬菜的饮料。
本发明的另一实施方案涉及生产人源化动物乳汁的方法。该方法包括用至少一种重组核酸分子来遗传修饰产奶动物的产奶细胞的步骤，所述重组核酸分子含有编码本文所述PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的核酸序列。
遗传修饰宿主细胞的方法和生产遗传修饰的非人源产奶动物的方法是本领域已知的。进行修饰的宿主动物的例子包括牛，绵羊，猪，山羊，牦牛等，它们易于进行遗传操作和克隆用于迅速扩大表达转基因的群体。对于动物，通过修饰基因调控区可使PKS-样转基因适应于在靶器官，组织和体液中表达。具体感兴趣的是在宿主动物乳汁中产生PUFA。
提供下述实施例以进行说明，而非用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1
以下实施例，来自U.S.专利申请号10/124,800，描述了使用本发明的筛选方法鉴定含有本发明PUFA PKS系统的其他非细菌生物体。
如本文所述培养Thraustochytrium 23B(ATCC 20892)。
使用Thraustochytrium 23B(ATCC 20892)的冷冻小瓶接种含有50mLRCA培养基的250mL摇瓶。25℃在摇床上振摇(200rpm)培养物72小时。RCA培养基含有如下成份：
RCA培养基
去离子水                   1000mL
Reef 海盐          40g/L
葡萄糖                     20g/L
谷氨酸钠(MSG)              20g/L
酵母提取物                 1g/L
PII金属*                   5mL/L
维生素混合物*              1mL/L
pH                         7.0
*PII金属混合物和维生素混合物与US 5,130,742所述相同，并入此处作为参考。
然后使用25mL72小时的旧培养物接种含有50mL低氮RCA培养基(10g/L MSG代替20g/L)的另一250mL摇瓶，且使用另一25mL的培养物接种含有175mL低氮RCA培养基的250mL摇瓶。然后将两个摇瓶置于摇床(200rpm)上，25℃振摇72小时。然后通过离心收获细胞并冷冻干燥。使用标准气相色谱法分析干燥细胞的脂肪含量和脂肪酸图谱与含量。
相对于高氧条件的低氧条件下，Thraustochytrium 23B的筛选结果如下：
以％FAME表示的DHA是否增加？               是(38->44％)
C14:0+C16:0+C16:1是否高于约40％TFA？      是(44％)
是否无C18:3(n-3)或C18:3(n-6)？            是(0％)
脂肪含量是否增加？                        是(增加2倍)
DHA(或其它HUFA含量)是否增加？             是(增加2.3倍)
该结果，特别是在低氧条件下DHA含量(表示为％FAME)显著增加有力地表明在该破囊壶菌属菌株中存在产生PUFA的PKS系统。
为了提供证实存在PUFA PKS系统的其它数据，使用来自Schizochytrium菌株20888的PKS探针对Thraustochytrium 23B进行southern印迹，其中已经确定菌株20888含有产生PUFA的PKS系统(即上述SEQ ID Nos：1-32)。使用Southern印迹技术检测与来自PKS PUFA合成基因的杂交探针同源的Thraustochytrium 23B基因组DNA的片段。用ClaI或KpnI限制性核酸内切酶消化Thraustochytrium 23B基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离(0.7％琼脂糖，在标准Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液中)，并通过毛细管转移印迹到Schleicher&Schuell Nytran Supercharge膜上。使用两个异羟洋地黄毒苷元(digoxigenin)标记的杂交探针，一个对Schizochytrium PKS OrfB的烯酰-ACP还原酶(ER)区域(OrfB的5012-5511核苷酸；SEQ ID NO：3)具有特异性，另一个对在Schizochytrium PKS OrfC起始处的保守区(OrfC的76-549核苷酸；SEQ ID NO：5)具有特异性。
OrfB-ER探针在Thraustochytrium 23B基因组DNA中检测到约13kb的ClaI片段和约3.6kb的KpnI片段。OrfC探针在Thraustochytrium 23B基因组DNA中检测到约7.5kb的ClaI片段和约4.6kb的KpnI片段。
最后，使用异羟洋地黄毒苷元标记的相应于Schizochytrium 20888PUFA-PKS基因的下列片段的探针筛选重组基因组文库：OrfA的7385-7879核苷酸(SEQ ID NO：1)，OrfB的5012-5511核苷酸(SEQ ID NO：3)，和OrfC的76-549核苷酸(SEQ ID NO：5)，所述重组基因组文库由插入载体λFIX II(Stratagene)的来自Thraustochytrium 23B基因组DNA的DNA片段组成。这些探针分别检测到来自Thraustochytrium 23B文库的阳性噬斑，表明Schizochytrium PUFA-PKS基因与Thraustochytrium 23B基因之间具有广泛同源性。
这些结果证实Thraustochytrium 23B基因组DNA含有与来自Schizochytrium 20888的PKS基因同源的序列。
实施例2
以下实施例证明Schizochytrium OrfsA，B和C通过在大肠杆菌中的功能性表达编码具有功能的DHA/DPA合成酶。
制备大肠杆菌转化体的一般过程
编码在Schizochytrium中产生DHA和DPA的Schizochytrium PUFA PKS系统的三个基因(OrfsA，B&C；分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5)被克隆入单一大肠杆菌表达载体(来自pET21c(Novagen))。该基因以单一信息转录(通过T7RNA聚合酶)，且每一基因前的核糖体结合位点启动翻译。需要修饰OrfB编码序列以在大肠杆菌中产生全长OrfB蛋白质(见下文)。编码PPTase(见下文)的辅助基因被克隆入第二质粒(来自ACYC184，NewEngland Biolabs)。
OrfB
Orf B基因被预测编码～224 kDa的蛋白质。最初试图在大肠杆菌中表达该基因，导致表观分子量～165 kDa的蛋白质的积累(根据与SDS-PAGE期间已知的蛋白质比较进行判断)。测验Orf B核苷酸序列显示含有15个连续丝氨酸密码子的区域-其全部是TCT密码子。该遗传密码包含6个不同的丝氨酸密码子，且其中3个在大肠杆菌中经常使用。本发明人使用4个重叠寡聚核苷酸以及聚合酶链式反应方案以再合成Orf B基因的一小部分(195个碱基对，BspHI至SacII限制性内切酶片段)，其含有丝氨酸密码子重复区域。合成Orf B片段的过程中，大肠杆菌通常使用3个丝氨酸密码子的随机混合物，并且改变其它可能有问题的密码子(即其它大肠杆菌很少使用的密码子)。原始OrfB中的BspHI至SacII片段被再合成的片段替换(以产生OrfB*)，并且该修饰的基因被克隆入相关表达载体。该修饰的OrfB*仍然编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。大肠杆菌中修饰的OrfB*克隆的表达导致产生224kDa的蛋白质，表明产生了OrfB的全长产物。SEQ ID NO：80显示了再合成的OrfB* BspHI至SacII片段。SEQ ID NO：80显示了再合成的OrfB BspHI至SacII区域的核苷酸序列。鉴定了BspHI限制性位点和SacII限制性位点。BspHI位点起始于OrfBCDS的4415核苷酸处(SEQ ID NO：3)(注意：OrfB CDS中总共有3个BspHI位点，而SacII位点是唯一的)。GenBank登录号AF378328和SEQ ID NO：3中给出了未修饰的OrfB CDS的序列。
PPTase
OrfA蛋白质(Schizochytrium中的SEQ ID NO：2)的ACP结构域，必须通过添加磷酸泛酰巯基乙胺基团得以激活化，从而发挥功能。催化上述一般类型的反应的酶被称为磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTases)。大肠杆菌含有两种内源性PPTases，但是预期其不会识别来自Schizochytrium的OrfA ACP结构域。通过在没有其它PPTase的情况下，在大肠杆菌中表达Orfs A，B*(参见上面)和C证实上述观点。在上述转化体中，没有检测到DHA的产生。本发明人在大肠杆菌PUFA PKS表达系统中检测了两种异源PPTases：(1)sfp(来自枯草芽孢杆菌)和(2)Het I(来自藻青菌念珠藻属菌株7120)。
sfp PPTase已被充分鉴定且由于其识别大量底物的能力而被广泛应用。基于公开的序列信息(Nakana，et al.，1992，Molecular and General Genetics232：313-321)，通过将编码区与确定的上游和下游侧翼DNA序列一起克隆入pACYC-184克隆载体来构建sfp的表达载体。寡聚核苷酸：
CGGGGTACCCGGGAGCCGCCTTGGCTTTGT(正向；SEQ ID NO：73)；和
AAACTGCAGCCCGGGTCCAGCTGGCAGGCACCCTG(反向；SEQ IDNO：74)，
用于从枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增所需区域。寡聚核苷酸内包括适当的限制性内切酶位点以促进中间体型高拷贝数载体中的克隆，并最终进入pACYC184的EcoRV位点以形成质粒：pBR301。测验用该质粒转化的大肠杆菌的提取物显示：存在一种具有sfp的流动性的新的蛋白质。在一定条件下，表达OrfA，B*，C蛋白质的细胞中sfp构建体的共表达导致产生DHA。实验证明sfp能够活化Schizochytrium Orf A ACP结构域。此外，与sfp基因相关的调控元件用于构建可以插入其它基因的表达盒。具体地，pBR301的sfp编码区(与ATG最上游的3个核苷酸一起)被DNA的53个碱基对部分替换，以至其含有若干特有的(对上述构建体而言)限制性内切酶位点。该区域内的起始限制性内切酶位点是NdeI(CATATG；SEQ ID NO：79)。嵌入该位点的ATG序列被用作所引入基因的起始甲硫氨酸密码子。还包括其它限制性内切位点(BgILL，NotI，SmaI，PmelI，HindIH，SpeI和XhoI)以促进克隆过程。通过使用PCR产生在5′末端具有NdeI位点并在3′末端具有XhoI位点的sfp来检测该表达载体的功能。该片段被克隆入表达盒并与Orf A，B*和C表达载体一起转移入大肠杆菌。在合适的条件下，上述细胞积累DHA，证明产生了功能性sfp。
以本发明人的知识，以前没有在异源性情况下检测Het I。Het I存在于已知负责合成长链羟基-脂肪酸的念珠藻属基因簇中，所述长链羟基-脂肪酸即生物体异形细胞(heterocyst)中存在的糖原脂质(glyco-lipid)层的成分。不受理论的约束，本发明人相信Het I活化那些簇中存在的蛋白质HglE的ACP结构域。Hgl E的两个ACP结构域与Schizochytrium Orf A中发现的ACP结构域具有高度序列同源性。没有鉴定HetI内源性起始密码子(推定的蛋白质中不存在甲硫氨酸)。开放阅读框的5′末端存在数个潜在的可选起始密码子(例如，TTG和ATT)。SEQ ID NO：81显示了编码HetI基因的念珠藻属DNA区域的序列。SEQ ID NO：82代表SEQ ID NO：81编码的氨基酸序列。关于SEQ IDNO：81，限于在SEQ ID NO：811-3位的框内无义三联体(inframe nonsensetriplet)(TAA)指示的上游编码区，且终止于SEQ ID NO：81的715-717位置的终止密码子(TGA)。该序列中不存在甲硫氨酸密码子(ATG)。潜在的可选起始密码子是：3个TTG密码子(SEQ ID NO：81的4-6，7-9和49-51位置)，ATT(SEQID NO：81的76-78位置)和GTG(SEQ ID NO：81的235-237位置)。Het I表达构建体通过PCR来制备，以用甲硫氨酸密码子(ATG，如上述NdeI限制性内切酶识别部位的一部分)替换潜在的可选起始密码子的5′最远端，并在该编码序列3′末端引入XhoI位点。该修饰的HetI编码序列然后被插入含有sfp调控元件的pACYC 184载体构建体的NdeI和XhoI位点。大肠杆菌中该Het I构建体的表达导致产生可以根据序列信息预期其大小的新蛋白质。某些条件下，大肠杆菌中Het I和Schizochytrium OrfsA，B*，C的共表达导致上述细胞中DHA和DPA的积累。在所有比较sfp和Het I的实验中，含有Het I构建体的细胞比含有sfp构建体的细胞积累更多DHA和DPA。
大肠杆菌转化体中的DHA和DPA产生
编码：(1)Schizochytrium PUFAPKS基因(OrfsA，B*和C)和(2)PPTase(来自sfp或来自HetI)的两种质粒被转化入含有可诱导的T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌菌株BL21。通过向培养基中添加IPTG诱导Schizochytrium蛋白质的合成，而PPTase表达受单独调控元件的控制(参见上面)。细胞在各种确定的条件下生长并且使用两种异源PPTase基因中的任何一个。收获细胞，且脂肪酸被转化为甲基-酯(FAME)，并且使用气液色谱法分析。
在若干条件下，在表达Schizochytrium PUFA PKS基因和两种异源PPTases中任何一种的大肠杆菌中检测到DHA和DPA。由对照细胞(即用缺少一种Orfs的质粒转化的细胞)制备的FAMEs中没有检测到DHA或DPA。大肠杆菌中观察到的DHA与DPA的比例约等于Schizochytrium中观察到的内源性DHA与DPA的比例。32℃在补充有10％(重量计)甘油的765培养基(配方得自美国典型培养物保藏所)中生长的细胞中，发现代表总FAME的～17％的PUFA(DHA加DPA)最高水平。应注意，在20℃，补充有5或10％甘油的Luria肉汤中生长的细胞中也观察到PUFA积累。通过在生长期间加入合适的抗生素来维持对各个质粒存在的选择，且IPTG(最终浓度为0.5mM)用来诱导OrfsA，B*和C的表达。
附图4显示对FAMEs的气液层析分析的示例性层析图，其中所述FAME来自对照细胞以及来自表达Schizochytrium PUFA PKS基因加PPTase(在HetI的情况下)的细胞。使用质谱法确定标记FAMEs的特性。
实施例3
以下实施例证明编码Schizochytrium PUFA PKS酶复合物的基因可以被选择性灭活(敲除)，而且其是致死性表型，除非培养基补充有多不饱和脂肪酸。
已经在Schizochytrium中证明了同源重组(参见未决U.S.专利申请序列号10/124,807，并入此处作为参考)。通过在含有OrfA编码序列的克隆的SmaI位点插入ZeocinTM抗性标记制备设计成能灭活Schizochytrium OrfA(SEQ IDNO：1)的质粒。ZeocinTM抗性标记得自质粒pMON50000-ZeocinTM抗性基因的表达由得自Schizoclaytrium的微管蛋白启动子元件驱动(参见U.S.专利申请序列号10/124,807，如上)。敲除构建体由此包括：5′Schizochytrium OrfA编码序列，微管-ZeocinTM抗性元件和3′Schizochytrium OrfA编码序列，全部克隆入pBluescript II SK(+)载体(Stratagene)。
通过粒子轰击将质粒引入Schizochytrium细胞，且在含有ZeocinTM并补充有多不饱和脂肪酸(PUFA)的平板上选择转化体(参见实施例4)。检测在ZeocinTM和PUFA平板上生长的菌落在不补充PUFA的平板上生长的能力，且发现其中一些需要PUFA。上述PUFA营养缺陷型被推定为Orf A体敲除。从这些变异体中的数种提取的RNA的Northern印迹分析证实了该变异体中不产生全长Orf A信息。
上述实验证明了可以通过同源重组灭活Schizochytrium基因(例如OrfA)，Orf A的灭活产生致死性表型，而且可以通过向培养基中补充PUFA挽救上述变异体。
灭活Schizochytrium OrfB(SEQ ID NO：3)和Orf C(SEQ ID NO：5)的类似实验产生相似结果。也就是说，可以通过同源重组分别灭活Orf B和Orf C，且上述细胞需要补充PUFA才能生长。
实施例4
以下实施例显示PUFA营养缺陷型可以在补充有EPA的培养基上生长，证明Schizochytrium中EPA可以替代DHA。
如实施例3所示，PUFA PKS复合物已被灭活的Schizochytrium细胞需要补充PUFA才能存活。除证明Schizochytrium的生长有赖于该系统的产物外，该实验系统允许测试各种脂肪酸挽救变异体的能力。人们发现突变细胞(其中3个基因中任何一个已被灭活)在补充有EPA的培养基和补充有DHA的培养基上生长得同样好。该结果表明，如果产生DHA的内源性PUFA PKS复合物被产物为EPA的PUFA PKS复合物替换，细胞仍可存活。此外，可以通过补充ARA或者GLA挽救所述突变细胞，证明了制备产生上述产物的经遗传修饰的Schizochytrium的可行性。有人指出补充PUFA的优选方法涉及在向培养基添加PUFA之前，将游离脂肪酸与部分甲基化β-环糊精混合。
实施例5
以下实施例显示灭活的PUFA基因可以在相同位点被该基因的活性形式替换以重建PUFA合成。
已经证明Schizochytrium中存在乙酰乳酸合酶基因位点的双重同源重组(参见U.S.专利申请序列号10/124,807，出处同上)。本发明人检测了通过用全长Schizochytrium Orf A基因组克隆转化Schizochytrium Orf A敲除菌株(实施例2描述)，替换Schizochytrium PUFA PKS基因的构思。通过转化体在不补充PUFA的培养基上的生长能力筛选转化体。然后测试PUFA原养型对ZeocinTM的抗性，且发现其中一些对抗生素敏感。该结果指出，引入的Schizochytrium Orf A通过双重同源重组替换了敲除菌株中的ZeocinTM抗性基因。该实验显示了PUFA PKS基因内的基因替换构思的证据。对Schizochytrium OrfB和OrfC敲除的类似实验得出相同的结果。
实施例6
该实施例显示全部或部分Thraustochytrium 23B PUFA PKS基因可以在Schizochytrium中发挥功能。
如U.S专利申请序列号10/124,800(出处同上)所述，产生DHA的原生生物Thraustochytrium 23B(Th.23B)已被证实含有orfA，orfB，和orfC同源物。上述3个Th.23B基因的完整基因组克隆用于转化含有同源(cognate)orf“敲除”的Schizochytrium菌株。在没有PUFA补充的情况下进行互补转化体的直接选择。通过该方法，可以表明Th.23B orfA和orfC基因可以将Schizochytrium orfA和orfC敲除菌株分别互补为PUFA原养型。已发现互补转化体或者保持或者丢失ZeocinTM抗性(插入Schizochytrium基因的标记由此定义上述敲除)。通过将上述完整的破囊壶菌属基因单交换整合入相应orf区域外的Schizochytrium基因组，可能产生ZeocinTM抗性互补转化体。该结果显示完整的破囊壶菌属基因在Schizochytrium中发挥功能。ZeocinTM敏感的互补转化体可能通过双交换事件产生，所述双交换事件中部分(或可能全部)Thraustochytrium基因功能性地替换含有破裂(disruptive)ZeocinTM抗性标记的Schizochytrium基因的同源区域。该结果显示一部分破囊壶菌属基因在SchiZochytrium中发挥功能。
实施例7
以下实施例显示特定的产EPA细菌含有显示为适于修饰Schizochytrium的PUFA PKS-样基因。
已经显示2株希瓦氏属的产EPA海洋细菌菌株在常规Schizochytrium发酵温度生长，且具有PUFA PKS-样基因。Shewanella olleyafza(AustralianCollection of Antarctic Microorganisms(ACAM)菌株号644；Skerratt et al.，Int.J.Syst.Evol.Microbiol 52，2101(2002))产生EPA，并在高至30℃生长。Shewanellajaponica(美国典型培养物保藏中心(ATCC)菌株号BAA-316；Ivanova et al.，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51，1027(2001))产生EPA且在高至35℃生长。
从上述细菌菌株鉴定和分离PUFA-PKS基因，基于希瓦氏SCRC-2738，Shewanella oneidensis MR-1；Shewanella sp.GA-22；Photobacter profundum和Moritella marina的公开的基因序列，设计用于细菌orf5/pfaA基因的KS-MAT区域和细菌orf7/pfaC的DH-DH区域的简并PCR引物对(参见上述讨论)。具体地，如下设计引物和PCR条件：
KS/AT区域的引物；基于以下公开的序列：Shewanella sp.SCRC-2738；Shewanella oneidensis MR-1；Photobacter profundum；Moritella marina：
prRZ23 GGYATGMTGRTTGGTGAAGG(正向；SEQ ID NO：69)
prRZ24 TRTTSASRTAYTGYGAACCTTG(反向；SEQ ID NO：70)
DH区域的引物；基于以下公开的序列：Shewanella sp.GA-22；Shewanella sp.SCRC-2738；Photobacter profundum；Moritella marina：
prRZ28 ATGKCNGAAGGTTGTGGCCA(正向；SEQ ID NO：71)
prRZ29CCWGARATRAAGCCRTTDGGTTG(反向；SEQ ID NO：72)
PCR条件(使用细菌染色体DNA作为模板)如下：
反应混合物：
0.2μM dNTPs
0.1μM各种引物
8％ DMSO
250 ng染色体DNA
2.5U 
Figure A200480014646D01191
DNA聚合酶(Stratagene)
1X 
Figure A200480014646D01192
缓冲液
总体积50μL
PCR方案：(1)98℃ 3分钟；(2)98℃ 40秒；(3)56℃ 30秒；(4)72℃ 90秒；(5)重复29个步骤2-4的循环；(6)72℃ 10分钟；(7)保持在6℃。
对于两个引物对，使用来自Shewanella olleyana或Shewanella japonica的染色体DNA模板，PCR产生预期大小的不同产物。将4个相应的PCR产物克隆入pCR-BLUNT II-TOPO(Invitrogen)，且使用M13正反向引物确定插入序列。在所有情况下，如此获得的DNA序列与已知的细菌PUFA PKS基因区域具有高度同源性。
将得自细菌PCR产物的DNA序列与已知序列和来自标准Blastx搜索中Schizochytrium ATCC20888的PUFA PKS基因比较(BLAST参数：LowComplexity filter：On；Matrix：BLOSUM62；Word Size：3；Gap Costs：Existancell，Extension1(Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“Gapped BLAST andPSI-BLAST:a new generation of protein database search programs”NucleicAcids Res.25：3389-3402描述的BLAST，全部并入此处作为参考))。
在氨基酸水平，与SEQ ID NO：78编码的、Shewanella olleyana ACAM644酮脂酰合酶/转酰酶(KS-AT)的公知氨基酸序列具有最大同源性的序列是：Photobacter profundum pfaA(相同性＝70％；阳性＝81％)；Shewanella oneidensisMR-1“多结构域β-酮脂酰合酶”(相同性＝66％；阳性＝77％)；和Moritellamarina ORF8(相同性＝56％；阳性＝71％)。Schizochytrium sp.ATCC20888orfA与SEQ ID NO：76编码的公知氨基酸序列具有41％相同性和56％阳性。
在氨基酸水平，与SEQ ID NO：78编码的、Shewanella japonica ATCCBAA-316酮脂酰合酶/转酰酶(KS-AT)的公知氨基酸序列具有最大同源性的序列是：Shewanella oneidensis MR-1“多结构域β-酮脂酰合酶”(相同性＝67％；阳性＝79％)；Shewanella sp.SCRC-2738 orf5(相同性＝69％；阳性＝77％)；和Moritella marina ORF8(相同性＝56％；阳性＝70％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfA与由SEQ ID NO：78编码的公知氨基酸序列具有41％相同性和55％阳性。
在氨基酸水平，与SEQ ID NO：75编码的、Shewanella olleyana ACAM644脱氢酶(DH)的公知氨基酸序列具有最大同源性的序列是：Shewanella sp.SCRC-2738 orf7(相同性＝77％；阳性＝86％)；Photobacter profundurn pfaC(相同性＝72％；阳性＝81％)；和Shewanella oneidensis MR-1“多结构域β-酮脂酰合酶”(相同性＝75％；阳性＝83％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfC与由SEQ ID NO：75编码的公知氨基酸序列具有26％相同性和42％阳性。
在氨基酸水平，与SEQ ID NO：77编码的、Shewanella japonica ATCCBAA-316脱氢酶(DH)的公知氨基酸序列具有最大同源性的序列是：Shewanella sp.SCRC-2738orf7(相同性＝77％；阳性＝86％)；Photobacterrofundurn pfaC(相同性＝73％；阳性＝83％)；和Shewanella oneidensis R-1“多结构域β-酮脂酰合酶”(相同性＝74％；阳性＝81％)。Schizochytrium sp.ATCC20888 orfC与由SEQ ID NO：77编码的公知氨基酸序列具有27％相同性和42％阳性。
预期来自上述2株希瓦氏菌株的PUFA PKS基因组可以为修饰Schizochytrium的PUFA生产提供全部基因或个别结构域的有益来源。来自任一Shewanella olleyana或Shewanella japonica的PUFA PKS基因及其编码的蛋白质和结构域明确地落入本发明范围之内。
实施例8
该实施例显示：实施例7描述的细菌PUFA PKS基因片段如何用于修饰Schizochytrium中的PUFA生产。
所有目前已知的来自细菌的PUFA PKS基因的实例以4个紧密相连的基因存在，其中含有与3基因Schizochytrium基因组相同的结构域。可以预料来自Shewanella olleyana和Shewanella japonica的PUFA PKS基因同样被发现是紧密相连排列。实施例7鉴定的同源区域用于从Sh.olleyana和Sh.japonicaDNAs克隆库中分离PUFA PKS基因簇。可以在噬菌体λ载体，粘粒载体，细菌人工染色体(“BAC”)载体中构建克隆库，或通过本领域已知的其他方法构建克隆库。可以使用探针通过菌落或噬斑杂交(实施例1描述)鉴定含有细菌PUFA PKS基因的所需克隆，所述探针是利用为这些序列设计的引物，对实施例7中部分基因序列的PCR而产生的。然后，上述新细菌PUFA PKS基因组的完整DNA序列用于设计载体，所述载体用于转化内源性PUFA PKS基因缺陷的Schizochytrium菌株(如参见实施例3，5和6)。全细菌基因(编码序列)可用于替换全Schizochytrium基因(编码序列)，如此利用Schizochytrium基因表达区域，且上述第四细菌基因可能被靶向该基因组内的不同位点。此外，通过类似的同源重组技术，单独细菌PUFA PKS功能域可能被类似的Schizochytrium结构域“替换(swap)”或交换。应该理解，细菌PUFA PKS基因或结构域的序列必需被修饰以适应Schizochytrium密码子使用的详细情况，但是应在本领域技术人员的能力范围之内。
本文引用或讨论的每篇出版物都全部并入此处作为参考。
本申请以参考文献的方式包含下列申请：US专利申请序列号60/457，979，2003-03-26提交；U.S.专利申请序列号10/124,800，2002-04-16提交；U.S.临时申请序列号60/284，2001-04-16提交；U.S.临时申请序列号60/298,796，2001-06-15提交；和U.S.临时申请序列号60/323,269，2001-09-18提交；U.S.申请序列号09/231,899，1999-01-14提交；当前US6,566,583和U.S.申请序列号09/090,793，1998-06-04提交；当前US6,140,486。
已经详述了本发明的各种实施方案，很明显，本领域技术人员可以想到对上述实施例进行修改和改进。然而应了解，上述修改和改进落在本发明范围内，正如下列权利要求所述。
序列表
<110>马泰克生物科学公司
     Metz，James
     Weaver，Craig
     Barclay，William
     Flatt，James
<120>PUFA聚酮化合物合酶系统及其用途
<130>2997-49-pct
<150>10/124,800
<151>2002-04-16
<150>60/457,979
<151>2003-03-26
<160>82
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>8730
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
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<400>1
Figure A200480014646Q01231
Figure A200480014646Q01241
Figure A200480014646Q01251
Figure A200480014646Q01261
Figure A200480014646Q01271
Figure A200480014646Q01281
Figure A200480014646Q01291
Figure A200480014646Q01311
Figure A200480014646Q01321
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<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>2
Figure A200480014646Q01322
Figure A200480014646Q01331
Figure A200480014646Q01341
Figure A200480014646Q01351
Figure A200480014646Q01361
Figure A200480014646Q01381
Figure A200480014646Q01391
Figure A200480014646Q01401
Figure A200480014646Q01411
<210>3
<211>6177
<212>DNA
<213>Schizochvtrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(6177)
<400>3
Figure A200480014646Q01431
Figure A200480014646Q01441
Figure A200480014646Q01461
Figure A200480014646Q01471
Figure A200480014646Q01481
<210>4
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<212>PRT
<213>SchizochytriuTm sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(370)..(370)
<223>第370位的’Xaa’代表Leu.
<220>
<221>misc_feature
<222>(371)..(371)
<223>第371位的’Xaa’代表Ala，或Val
<400>4
Figure A200480014646Q01492
Figure A200480014646Q01511
Figure A200480014646Q01521
Figure A200480014646Q01531
Figure A200480014646Q01541
Figure A200480014646Q01551
Figure A200480014646Q01561
<210>5
<211>4509
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(4509)
<400>5
Figure A200480014646Q01562
Figure A200480014646Q01581
Figure A200480014646Q01601
Figure A200480014646Q01611
<210>6
<211>1503
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>6
Figure A200480014646Q01612
Figure A200480014646Q01621
Figure A200480014646Q01641
Figure A200480014646Q01661
<210>7
<211>600
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(600)
<400>7
Figure A200480014646Q01671
<210>8
<211>200
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>8
Figure A200480014646Q01672
Figure A200480014646Q01681
<210>9
<211>1278
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1278)
<400>9
Figure A200480014646Q01682
Figure A200480014646Q01691
Figure A200480014646Q01701
<210>10
<211>426
<212>PRT
<213>Schizochvtrium sp.
<400>10
Figure A200480014646Q01702
Figure A200480014646Q01711
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Xaa＝任意的氨基酸
<400>11
<210>12
<211>258
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(258)
<400>12
Figure A200480014646Q01713
Figure A200480014646Q01721
<210>13
<211>86
<212>PRT
<213>Schizochvtrium sp.
<400>13
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>14
Figure A200480014646Q01723
<210>15
<211>21
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>15
Figure A200480014646Q01724
Figure A200480014646Q01731
<210>16
<211>3006
<212>DNA
<213>Schizochvtrium sp.
<400>16
Figure A200480014646Q01732
Figure A200480014646Q01741
<210>17
<211>2133
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2133)
<400>17
Figure A200480014646Q01742
Figure A200480014646Q01751
Figure A200480014646Q01761
<210>18
<211>711
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>18
Figure A200480014646Q01781
<210>19
<211>1350
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1350)
<400>19
Figure A200480014646Q01792
Figure A200480014646Q01801
Figure A200480014646Q01811
<210>20
<211>450
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(370)..(370)
<223>第370位的’Xaa’代表Leu.
<220>
<221>misc_feature
<222>(371)..(371)
<223>第371位的’Xaa’代表Ala，或Val
<400>20
Figure A200480014646Q01812
Figure A200480014646Q01821
<210>21
<211>1323
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1323)
<400>21
Figure A200480014646Q01831
Figure A200480014646Q01841
<210>22
<211>441
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>22
Figure A200480014646Q01842
Figure A200480014646Q01861
<210>23
<211>1500
<212>DNA
<213>Schizochvtrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>23
Figure A200480014646Q01871
<210>24
<211>500
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>24
Figure A200480014646Q01872
Figure A200480014646Q01881
<210>25
<211>1530
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1530)
<400>25
Figure A200480014646Q01892
Figure A200480014646Q01901
Figure A200480014646Q01911
<210>26
<211>510
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>26
Figure A200480014646Q01912
Figure A200480014646Q01921
<210>27
<211>4512
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(4512)
<400>27
Figure A200480014646Q01932
Figure A200480014646Q01951
Figure A200480014646Q01961
Figure A200480014646Q01971
Figure A200480014646Q01981
<210>28
<211>1503
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>28
Figure A200480014646Q01991
Figure A200480014646Q02001
Figure A200480014646Q02011
Figure A200480014646Q02021
<210>29
<211>1500
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>29
Figure A200480014646Q02032
Figure A200480014646Q02041
Figure A200480014646Q02051
<210>30
<211>500
<212>PRT
<213>Schizochytrium sp.
<400>30
Figure A200480014646Q02061
Figure A200480014646Q02071
<210>31
<211>1512
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1512)
<400>31
Figure A200480014646Q02072
Figure A200480014646Q02081
Figure A200480014646Q02091
<210>32
<211>504
<212>PRT
<213>Schizochvtrium sp.
<400>32
Figure A200480014646Q02092
Figure A200480014646Q02101
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>motif
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(3)
<223>Xaa＝任意的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Ala或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(8)
<223>Xaa＝任意的氨基酸
<400>33
Figure A200480014646Q02111
<210>34
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>motif
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(6)
<223>Xaa＝Ile或Leu或Val
<400>34
<210>35
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>motif
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Xaa＝Ile或Leu或Val
<400>35
Figure A200480014646Q02113
<210>36
<211>4244
<212>DNA
<213>Schizochvtrium sp.
<400>36
Figure A200480014646Q02114
Figure A200480014646Q02121
Figure A200480014646Q02131
<210>37
<211>3886
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3886)
<223>n＝a，c，g，或t
<400>37
Figure A200480014646Q02132
Figure A200480014646Q02141
<210>38
<211>8436
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(8433)
<400>38
Figure A200480014646Q02152
Figure A200480014646Q02161
Figure A200480014646Q02171
Figure A200480014646Q02181
Figure A200480014646Q02191
Figure A200480014646Q02201
Figure A200480014646Q02211
Figure A200480014646Q02231
Figure A200480014646Q02241
Figure A200480014646Q02251
<210>39
<211>2811
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>39
Figure A200480014646Q02252
Figure A200480014646Q02261
Figure A200480014646Q02271
Figure A200480014646Q02291
Figure A200480014646Q02311
Figure A200480014646Q02321
Figure A200480014646Q02341
<210>40
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>40
Figure A200480014646Q02351
Figure A200480014646Q02361
<210>41
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>41
Figure A200480014646Q02362
Figure A200480014646Q02371
<210>42
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>42
Figure A200480014646Q02382
Figure A200480014646Q02391
Figure A200480014646Q02401
<210>43
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>43
Figure A200480014646Q02411
Figure A200480014646Q02421
<210>44
<211>351
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(351)
<400>44
<210>45
<211>117
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>45
Figure A200480014646Q02423
Figure A200480014646Q02431
<210>46
<211>5
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Xaa＝任意的氨基酸
<400>46
<210>47
<211>2790
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2790)
<400>47
Figure A200480014646Q02441
Figure A200480014646Q02451
<210>48
<211>930
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>48
Figure A200480014646Q02471
Figure A200480014646Q02481
Figure A200480014646Q02491
<210>49
<211>2433
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2433)
<400>49
Figure A200480014646Q02501
Figure A200480014646Q02521
<210>50
<211>811
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>50
Figure A200480014646Q02522
Figure A200480014646Q02531
Figure A200480014646Q02551
<210>51
<211>5808
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(5805)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(5808)
<223>n＝a c t或g
<400>51
Figure A200480014646Q02552
Figure A200480014646Q02571
Figure A200480014646Q02581
Figure A200480014646Q02611
Figure A200480014646Q02621
<210>52
<211>1935
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(248)..(248)
<223>第248位的’Xaa’代表Asp，Gly，Ala，或Val
<400>52
Figure A200480014646Q02622
Figure A200480014646Q02631
Figure A200480014646Q02641
Figure A200480014646Q02651
Figure A200480014646Q02661
Figure A200480014646Q02671
Figure A200480014646Q02681
<210>53
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1500)
<223>n＝a c t或g
<400>53
Figure A200480014646Q02701
<210>54
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(248)..(248)
<223>第248位的’Xaa’代表Asp，Gly，Ala，或Val.
<400>54
Figure A200480014646Q02702
Figure A200480014646Q02711
Figure A200480014646Q02721
<210>55
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>55
Figure A200480014646Q02722
Figure A200480014646Q02731
Figure A200480014646Q02741
<210>56
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>56
Figure A200480014646Q02742
Figure A200480014646Q02751
Figure A200480014646Q02761
<210>57
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>57
<210>58
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>58
Figure A200480014646Q02791
<210>59
<211>1305
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1305)
<400>59
Figure A200480014646Q02801
Figure A200480014646Q02811
<210>60
<211>435
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>60
Figure A200480014646Q02812
Figure A200480014646Q02821
<210>61
<211>4410
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(4410)
<400>61
Figure A200480014646Q02831
Figure A200480014646Q02841
Figure A200480014646Q02851
Figure A200480014646Q02861
<210>62
<211>1470
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>62
Figure A200480014646Q02881
Figure A200480014646Q02891
Figure A200480014646Q02901
Figure A200480014646Q02911
Figure A200480014646Q02921
<210>63
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>63
Figure A200480014646Q02931
Figure A200480014646Q02941
<210>64
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>64
Figure A200480014646Q02942
Figure A200480014646Q02951
Figure A200480014646Q02961
<210>65
<211>1500
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<400>65
Figure A200480014646Q02962
Figure A200480014646Q02971
Figure A200480014646Q02981
<210>66
<211>500
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>66
Figure A200480014646Q03001
<210>67
<211>1410
<212>DNA
<213>Thraustochytrium sp.
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1410)
<400>67
Figure A200480014646Q03002
Figure A200480014646Q03011
<210>68
<211>470
<212>PRT
<213>Thraustochytrium sp.
<400>68
Figure A200480014646Q03021
Figure A200480014646Q03031
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>69
<210>70
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
Figure A200480014646Q03033
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>n＝a c g或t
<400>71
Figure A200480014646Q03034
<210>72
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
Figure A200480014646Q03041
<210>73
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
<210>74
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
<210>75
<211>798
<212>DNA
<213>Shewanella olleyana
<400>75
<210>76
<211>1042
<212>DNA
<213>Shewanella olleyans
<400>76
Figure A200480014646Q03045
<210>77
<211>806
<212>DNA
<213>Shewanella japonica
<400>77
Figure A200480014646Q03052
<210>78
<211>1042
<212>DNA
<213>Shewanella japonica
<400>78
Figure A200480014646Q03053
Figure A200480014646Q03061
<210>79
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>限制性酶位点
<400>79
Figure A200480014646Q03062
<210>80
<211>192
<212>DNA
<213>Schizochytrium sp.
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>BspHI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(188)..(192)
<223>SacII限制性位点
<400>80
Figure A200480014646Q03063
<210>81
<211>717
<212>DNA
<213>念珠藻属(Nostoc sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(4)..(714)
<400>81
Figure A200480014646Q03071
<210>82
<211>237
<212>PRT
<213>念珠藻属(Nostoc sp.)
<400>82
Figure A200480014646Q03072
Figure A200480014646Q03081

Claims (114)

1.一种分离的核酸分子，其含有选自以下序列组成的组的核酸序列：
a)核酸序列，其编码选自以下序列及其生物学活性片段组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；
b)核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)核酸序列，其编码与SEQ ID NO：54具有至少约65％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
e)核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
f)与(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的核酸序列完全互补的核酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自以下序列组成的组：
a)核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
b)核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS))统的至少一个结构域的生物学活性。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自以下序列组成的组：核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，和SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自下序列组成的组：核酸序列，其编码与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，和SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约90％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
5.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列编码选自以下序列组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：64，SEQ ID NO：66，和SEQ ID NO：68及其生物活性片段。
6.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自下序列组成的组：SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ IDNO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67。
7.重组核酸分子，其包含与至少一个转录调控序列可操作地相连的权利要求1的核酸分子。
8.用权利要求7的重组核酸分子转染的重组细胞。
9.经遗传修饰的微生物，其中所述微生物表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物学活性结构域的PKS系统，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56，和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：54具有至少约65％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
e)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
其中所述微生物被遗传修饰以影响所述PKS系统的活性。
10.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ IDNO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
11.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
12.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约90％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
13.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ IDNO：68及其生物活性片段。
14.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中通过转染对所述微生物进行遗传修饰，所述转染使用编码多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的重组核酸分子进行。
15.权利要求14的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是Thraustochytrid。
16.权利要求14的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是Schizochytrium。
17.权利要求14的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物进一步被遗传修饰以重组表达编码PKS系统的至少一个生物学活性结构域的至少一种核酸分子，所述PKS系统选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFAPKS系统组成的组。
18.权利要求17的经遗传修饰的微生物，其中所述非细菌PUFA PKS系统是Thraustochytrid PUFA PKS系统。
19.权利要求18的经遗传修饰的微生物，其中所述Thraustochytrid PUFAPKS系统是Schizochytrium PUFA PKS系统。
20.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个结构域的PKS系统，且其中所述遗传修饰位于编码所述PUFA PKS系统的至少一个结构域的核酸序列中。
21.权利要求20的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物进一步被遗传修饰以重组表达编码PKS系统的至少一个生物学活性结构域的至少一种核酸分子，所述PKS系统选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFAPKS系统组成的组。
22.权利要求21的经遗传修饰的微生物，其中所述非细菌PUFA PKS系统是Thraustochytrid PUFA PKS系统。
23.权利要求22的经遗传修饰的微生物，其中所述Thraustochytrid PUFAPKS系统是Schizochytrium PUFA PKS系统。
24.权利要求9的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个生物学活性结构域的PUFA PKS系统，且其中所述遗传修饰包含重组核酸分子的表达，所述重组核酸分子选自编码来自第二PKS系统的至少一个生物学活性结构域的重组核酸分子和编码影响内源性PUFA PKS系统活性的蛋白质的重组核酸分子组成的组。
25.权利要求24的经遗传修饰的微生物，其中来自第二PKS系统的生物学活性结构域选自：
a)结构域，其来自Thraustochytrid微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统；
b)结构域，其来自由下述方法鉴定的微生物的PUFA PKS系统：
i)选择产生至少一种PUFA的微生物；和，
ii)鉴定具有以下能力的(i)的微生物，其：与发酵培养基中在大于约5％饱和度的溶氧条件下所述微生物的PUFA生成相比，所述微生物在发酵培养基中不足约5％饱和度的溶氧条件下具有产生增加的PUFA的能力；
c)结构域，其含有选自以下序列及其生物活性片段组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32；和
d)结构域，其含有与(c)的氨基酸序列具有至少约60％相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
26.权利要求24的经遗传修饰的微生物，其中所述重组核酸分子编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶。
27.权利要求24的经遗传修饰的微生物，其中第二PKS系统选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFAPKS系统组成的组。
28.权利要求27的经遗传修饰的微生物，其中所述非细菌PUFA PKS系统是真核PUFA PKS系统。
29.权利要求28的经遗传修饰的微生物，其中所述真核PUFAPKS系统是Thraustochytrid PUFA PKS系统。
30.权利要求29的经遗传修饰的微生物，其中所述Thraustochytrid PUFAPKS系统是Schizochytrium PUFA PKS系统。
31.一种经遗传修饰的植物，其中所述植物被遗传修饰以重组表达含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物学活性结构域的PKS系统，其中所述结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，或SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约65％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
e)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
32.权利要求31的经遗传修饰的植物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，或SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
33.权利要求31的经遗传修饰的植物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自以下序列组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
34.权利要求31的经遗传修饰的植物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自以下序列组成的组的氨基酸序列具有至少约90％相同性：SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
35.权利要求31的经遗传修饰的植物，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39，SEQID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68及其生物活性片段。
36.权利要求31的经遗传修饰的植物，其中所述植物进一步被遗传修饰以重组表达编码PKS系统的至少一个生物学活性结构域的至少一种核酸分子，所述PKS系统选自细菌PUFA PKS系统，I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFA PKS系统组成的组。
37.权利要求36的经遗传修饰的植物，其中所述非细菌PUFAPKS系统是Thraustochytrid PUFA PKS系统。
38.权利要求37的经遗传修饰的植物，其中所述Thraustochytrid PUFAPKS系统是Schizochytrium PUFA PKS系统。
39.一种制备通过聚酮化合物合酶系统产生的生物活性分子的方法，包括在有效产生所述生物活性分子的条件下培养表达PKS系统的经遗传修饰的生物体，所述PKS系统含有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个生物学活性结构域，其中所述PUFA PKS系统的所述至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约65％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
e)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
40.权利要求39的方法，其中所述生物体内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个结构域的PKS系统，且其中所述遗传修饰在编码所述PUFAPKS系统的至少一个结构域的核酸序列中。
41.权利要求40的方法，其中与PUFA PKS系统没有经过遗传修饰的生物体相比，所述遗传修饰改变内源性PKS系统产生的至少一种产物。
42.权利要求39的方法，其中所述生物体内源性表达含有PUFA PKS系统的至少一个生物学活性结构域的PKS系统，且其中所述遗传修饰包括使用重组核酸分子转染该生物体，所述重组核酸分子选自编码来自第二PKS系统的至少一个生物学活性结构域的重组核酸分子和编码影响所述PUFA PKS系统活性的蛋白质的重组核酸分子组成的组。
43.权利要求42的方法，其中与没有经遗传修饰以影响PUFA产生的生物体相比，所述遗传修饰改变内源性PKS系统产生的至少一种产物。
44.权利要求39的方法，其中所述生物体通过使用编码所述多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的重组核酸分子来转染而被遗传修饰。
45.权利要求39的方法，其中所述生物体产生与无遗传修饰的天然存在的生物体不同的多不饱和脂肪酸(PUFA)图谱。
46.权利要求39的方法，其中所述生物体内源性表达非细菌PUFA PKS系统，且其中所述遗传修饰包括用来自不同PKS系统的结构域对编码所述非细菌PUFA PKS系统的至少一个结构域的核酸序列的取代。
47.权利要求39的方法，其中所述生物体内源性表达非细菌PUFA PKS系统，该系统通过用重组核酸分子转染所述生物体而被修饰，该重组核酸分子编码对所述PUFA PKS系统产生的脂肪酸的链长进行调节的蛋白质。
48.权利要求39的方法，其中所述生物活性分子选自以下物质组成的组：抗炎配制品，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松症药物，抗抑郁剂，抗惊厥剂，抗幽门螺杆菌药物，治疗神经变性疾病的药物，治疗肝脏变性疾病的药物，抗生素和降胆固醇配制品。
49.权利要求39的方法，其中所述生物活性分子是抗生素。
50.权利要求39的方法，其中所述生物活性分子是多不饱和脂肪酸(PUFA)。
51.权利要求39的方法，其中所述生物活性分子是包括顺式构型碳-碳双键的分子。
52.权利要求39的方法，其中所述生物活性分子是在每第3个碳含有双键的分子。
53.权利要求39的方法，其中所述生物体是微生物。
54.权利要求39的方法，其中所述生物体是植物。
55.制备具有不同于天然植物的多不饱和脂肪酸(PUFA)图谱的植物的方法，包括对所述植物的细胞进行遗传修饰，以表达含有至少一种重组核酸分子的PKS系统，该重组核酸分子含有编码PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的核酸序列，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有一种氨基酸序列，所述氨基酸序列选自以下序列组成的组：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约65％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
e)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
56.修饰含有至少一种脂肪酸的最终产物的方法，包括向所述最终产物中添加由重组宿主细胞产生的油，该重组宿主细胞表达至少一种重组核酸分子，所述重组核酸分子含有编码PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的核酸序列，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQSEQ IDNO：50，或SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约65％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQSEQ IDNO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
e)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
57.权利要求56的方法，其中所述最终产物选自以下物质组成的组：饮食补充剂，食品，药物配制品，人源化动物乳汁和婴儿代乳品。
58.权利要求57的方法，其中所述药物配制品选自以下物质组成的组：抗炎配制品，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松症药物，抗抑郁剂，抗惊厥剂，抗幽门螺杆菌药物，治疗神经变性疾病的药物，治疗肝脏变性疾病的药物，抗生素和降低胆固醇配制品。
59.权利要求56的方法，其中所述最终产物用于治疗选自下述疾病组成的组的疾病：慢性炎症，急性炎症，胃肠疾病，癌症，恶病质，心脏再狭窄，神经变性疾病，肝脏变性疾病，血脂紊乱，骨质疏松症，骨关节炎，自身免疫疾病，先兆子痫，早产，年老性黄斑病变，肺部疾病和过氧化物酶体疾病。
60.一种生产人源化动物乳汁的方法，包括用至少一种重组核酸分子对产奶动物的产奶细胞进行遗传修饰，所述重组核酸分子含有编码PUFA PKS系统的至少一个生物活性结构域的核酸序列，其中所述PUFA PKS系统的至少一个结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，和SEQ ID NO：68；
b)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58组成的组的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
c)氨基酸序列，其与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少约65％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；
d)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：64组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性；和
e)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性，其中所述氨基酸序列具有多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统的至少一个结构域的生物学活性。
61.经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述微生物具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，且与无所述遗传修饰的Thraustochytrid微生物相比，所述内源性PUFA PKS系统已被遗传修饰以改变Thraustochytrid微生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)表达图谱。
62.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述内源性PUFA PKS系统已经通过诱变编码所述内源性PUFA PKS系统的至少一个结构域的核酸序列而得以修饰。
63.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述内源性PUFA PKS系统已经通过以下方法而得以修饰：缺失编码所述内源性PUFAPKS系统的至少一个结构域的至少一种核酸序列，并由此插入编码所述内源性结构域同源物的核酸序列以改变所述Thraustochytrid微生物的PUFA产生图谱，其中所述同源物具有PKS系统的至少一个结构域的生物活性。
64.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述内源性PUFA PKS系统已经通过以下方式得以修饰：缺失编码所述内源性PUFAPKS系统的至少一个结构域的至少一种核酸序列，并插入编码来自不同微生物的PKS系统的至少一个结构域的核酸序列。
65.权利要求62-64任一项的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中内源性PUFA PKS系统的结构域是具有下列蛋白质中至少一种的生物学活性的结构域：丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮还原酶(KR)，酰基转移酶(AT)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，链长因子(CLF)，酰基载体蛋白(ACP)，烯酰ACP-还原酶(ER)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶和催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮基-酰基-ACP的酶。
66.权利要求62-64任一项的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中内源性PUFA PKS系统的结构域含有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68；和
b)氨基酸序列，其与(a)的氨基酸序列具有至少约60％相同性，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系统的至少一个结构域的生物学活性。
67.权利要求62-64任一项的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中内源性PUFA PKS系统的结构域含有这样的氨基酸序列，其与选自以下序列组成的组的氨基酸序列具有至少约70％相同性：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68。
68.权利要求62-64任一项的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中内源性PUFA PKS系统的结构域含有这样的氨基酸序列，其与选自以下序列组成的组的氨基酸序列具有至少约80％相同性：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68。
69.权利要求62-64任一项的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中内源性PUFA PKS系统的结构域含有这样的氨基酸序列，其与选自以下序列组成的组的氨基酸序列具有至少约90％相同性：与SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：39，SEQID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ IDNO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68。
70.权利要求62-64任一项的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中内源性PUFA PKS系统的结构域含有这样的氨基酸序列，其选自以下序列及其生物活性片段组成的组：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68。
71.权利要求62的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述修饰通过定向的诱变产生。
72.权利要求62的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述修饰通过传统诱变和筛选产生。
73.权利要求63的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中与内源性结构域相比，所述内源性结构域的同源物含有修饰，所述修饰选自导致所述微生物的PUFA生成图谱发生改变的至少一种缺失，插入或取代组成的组。
74.权利要求63的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述同源物的氨基酸序列与所述内源性结构域的氨基酸序列具有至少约60％相同性。
75.权利要求63的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述同源物的氨基酸序列与所述内源性结构域的氨基酸序列具有至少约70％相同性。
76.权利要求63的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述同源物的氨基酸序列与所述内源性结构域的氨基酸序列具有至少约80％相同性。
77.权利要求63的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述同源物的氨基酸序列与所述内源性结构域的氨基酸序列具有至少约90％相同性。
78.权利要求63的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述内源性结构域的同源物是来自另一种Thraustochytrid微生物的PUFA PKS系统的结构域。
79.权利要求64的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中编码来自不同微生物的PKS系统的至少一个结构域的核酸序列来自于细菌PUFA PKS系统。
80.权利要求79的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述不同的微生物是具有在大约25℃或更高温度天然产生PUFA的PUFA PKS系统的海洋细菌。
81.权利要求80的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述海洋细菌选自Shewanella olleyana和Shewanella japonica组成的组。
82.权利要求64的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中来自不同微生物的PKS系统的结构域来自于选自I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和来自不同Thraustochytrid微生物的PUFA PKS系统组成的组的PKS系统。
83.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中改变PUFA生成图谱以启动，增加或减少该微生物的二十碳五烯酸(EPA)的生成。
84.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中改变PUFA生成图谱以启动，增加或减少该微生物的二十二碳六烯酸(DHA)的生成。
85.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中改变PUFA生成图谱以启动，增加或减少该微生物的二十二碳五烯酸(DPA)的一或两种异构体的生成。
86.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中改变PUFA生成图谱以启动，增加或减少该微生物的花生四烯酸(ARA)的生成。
87.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述Thraustochytrid来自于选自Schizochytrium，破囊壶菌和Japonochytrium组成的组的属。
88.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述Thraustochytrid来自于Schizochytrium属。
89.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述Thraustochytrid来自于选自Schizochytrium aggregatum，Schizochytriumlimacinum和Schizochytrium minutum组成的组的Schizochytrium种。
90.权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述Thraustochytrid来自于破囊壶菌属。
91.产生二十碳五烯酸(EPA)的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，该系统在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码导致Schizochytrium产生EPA的内源性PUFA PKS系统的至少一个结构域。
92.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码至少一个结构域，所述结构域具有下列蛋白质中至少一种蛋白质的生物活性：丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(MAT)，β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮还原酶(KR)，酰基转移酶(AT)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，链长因子(CLF)，酰基载体蛋白(ACP)，烯酰ACP-还原酶(ER)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶以及催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮基-酰基-ACP的酶。
93.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码开放阅读框的至少一个结构域，所述开放阅读框编码内源性PUFA PKS系统的SEQ ID NO：2。
94.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码开放阅读框的至少一个结构域，所述开放阅读框编码内源性PUFA PKS系统的SEQ ID NO：4。
95.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码开放阅读框的至少一个结构域，所述开放阅读框编码内源性PUFA PKS系统的SEQ ID NO：6。
96.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码至少一个结构域，所述结构域具有下列蛋白质中至少一种蛋白质的生物活性：β-酮脂酰-ACP合酶(KS)，FabA-样β-羟酰-ACP脱水酶(DH)，链长因子(CLF)，催化反式-2-酰基-ACP合成的酶，催化反式-2-酰基-ACP向顺式-3-酰基-ACP的可逆异构化的酶和催化顺式-3-酰基-ACP延长成顺式-5-β-酮基-酰基-ACP的酶。
97.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码选自内源性PUFA PKS系统的SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30组成的组的氨基酸序列。
98.权利要求91的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium通过以下方式得以修饰：缺失编码内源性PUFA PKS系统的至少一个结构域的至少一种核酸序列，插入编码来自非Schizochytrium微生物的PKS系统的至少一个结构域的核酸序列。
99.权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述非Schizochytrium微生物在至少约15℃的温度生长并产生PUFA。
100.权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述非Schizochytrium微生物在至少约20℃的温度生长并产生PUFA。
权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述非Schizochytrium微生物在至少约25℃的温度生长并产生PUFA。
权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述非Schizochytrium微生物在至少约30℃的温度生长并产生PUFA。
权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述非Schizochytrium微生物在约20℃至约40℃之间的温度生长并产生PUFA。
权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述编码来自非Schizochytrium微生物的PKS系统的至少一个结构域的核酸序列来自于细菌PUFA PKS系统。
权利要求104的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述细菌PUFAPKS系统来自于选自Shewanella olleyana和Shewanella japonica组成的组的细菌。
权利要求98的经遗传修饰的Schizochytrium，其中编码PKS系统的至少一个结构域的核酸序列选自I型PKS系统，II型PKS系统，模块PKS系统和非细菌PUFA PKS系统组成的组。
权利要求106的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述非细菌PUFA PKS系统是真核PUFA PKS系统。
权利要求107的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述真核PUFAPKS系统是Thraustochytrid PUFA PKS系统。
一种经遗传修饰的Schizochytrium，其与非遗传修饰的Schizochytrium相比，产生的二十二碳六烯酸(DHA)量增加，其中所述Schizochytrium具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，该系统在至少一种核酸序列中含有遗传修饰，所述核酸序列编码导致Schizochytrium的DHA产量增加的内源性PUFA PKS系统的至少一个结构域。
110.权利要求109的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述内源性PUFA PKS系统的至少一个结构域已通过来自破囊壶菌属PUFA PKS系统的至少一个结构域取代而得以修饰。
111.权利要求109的经遗传修饰的Schizochytrium，其中所述Schizochytrium产生的DHA与DPA的比例与无遗传修饰的Schizochytrium相比增加。
112.一种生产脂质的方法，所述脂质富含至少一种选定的多不饱和脂肪酸(PUFA)，所述方法包括在可有效产生所述脂质的条件下培养权利要求61的经遗传修饰的Thraustochytrid微生物或者权利要求91或权利要求109的经遗传修饰的Schizochytrium。
113.权利要求112的方法，其中所述选定的PUFA是二十碳五烯酸(EPA)。
114.一种生产二十碳五烯酸(EPA)富集型脂质的方法，包括在有效产生EPA富集型脂质的条件下培养遗传修饰的Thraustochytrid微生物，其中所述微生物具有内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系统，且其中所述内源性PUFA PKS系统在至少一个结构域中被遗传修饰，与缺乏所述遗传修饰相比，所述修饰可启动或增加所述微生物脂质中EPA的产生。
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