KR20120119571A - Jak2 v617f mutation detection kit using methods and kits for the mutant detection using pna mediated real-time pcr clamping - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A jak2 v 617f mutant detecting method and a kit using PNA base real-time PCR clamping is provided to rapidly and accurately check polycythemia, idiopathic myelofibrosis, and essential thrombocythemia in early stage. CONSTITUTION: A jak2 v 617f mutant detecting method is processed real-time polymerase chain reaction for the JAK2 genes under the presence of a JAK 2 gene clamping primer set and a PNA(peptide nucleic acid) clamping probe which completely unites with the base sequence including the Exxon 14 codon 617th nucleotide of the wild type JAK2 gene. The jak2 v 617f mutant detecting method measures the Ct(cycle threshold) value of the real time PCR and determines the existence or the concentration of the mutations of the JAK2 gene. The JAK2 gene clamping primer set amplifies the base sequence including the Exxon 14 codon 617th nucleotide of the JAK2 gene. The primer set includes primers described in the sequence number 25, 29, 31, 32, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55 or 57 as the sequence number forward primer. The PNA clamping probe is selected from the sequence number of 1-24. [Reference numerals] (AA, BB) Number of mutant hexane copies; (CC) Wild type; (DD) Mutant type

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ 돌연변이 검출 방법 및 키트{JAK2 V617F Mutation Detection Kit using Methods and kits for the mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping}JAK2 V617F Mutation Detection Kit using Methods and kits for the mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping}

본 발명은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하 ‘PNA’라 함) 프로브를 이용한 JAK2 (Janus Activated Kinase 2) V617F 유전자 돌연변이 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, JAK2 유전자 코돈 617의 돌연변이 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 증폭시켜 소량의 돌연변이 유전자도 소량의 돌연변이형만을 높은 민감도로 검출할 수 있는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.The present invention relates to the detection of JAK2 (Janus Activated Kinase 2) V617F gene mutation using a peptide nucleic acid (Peptide Nucleic Acid) probe, and more particularly, to detect a wild type for mutation detection of JAK2 gene codon 617. The present invention relates to a method for amplifying only a mutation by inhibiting amplification of a wild type, and a kit for use in the method.

골수증식질환 (MPD: Myeloproliferative Disease)에는 여러 이상 혈액 세포 질병들이 포함되며 혈액 세포의 이상 증식을 그 특징으로 한다. 여기에는 진성적혈구증가증(PV: Polycythemia Vera), 본태성 혈소판증가증 (ET: Essential Thrombocythaemia), 그리고 특발성 골수섬유증(IMF: Idiopathic Myelofibrosis)이 대표적이라 할 수 있다. 골수증식질환은 Tyrosine Kinase의 이상 활동이 주된 원인일 것이라 추정되고 있으나 정확한 분자생물학적 기전은 아직 밝혀지지 않은 상태이다 (H. Quentmeier et al., Leukemia 20:471-476, 2006). Myeloproliferative Diseases (MPDs) include several abnormal blood cell diseases and are characterized by abnormal cell proliferation. These include Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythaemia (ET), and Idiopathic Myelofibrosis (IMF). Myeloproliferative diseases are thought to be a major cause of aberrant activity of tyrosine kinase, but the exact molecular biological mechanisms are still unknown (H. Quentmeier et al., Leukemia 20: 471-476, 2006).

초기의 골수증식질환은 임상학적과 생물학적 특징을 이용하여 분류되었으나 필라델피아 염색체의 변이 발견과 JAK2 V617F의 변이 발견이 이루어짐으로써 이러한 분자유전학적 표지자(Molecular marker)를 이용한 분류 방법이 행해지고 WHO의 2008년 개정된 분류에 포함되어 이들의 유전적 변형을 통한 질병의 발생과 치료 방법에 대한 연구가 활발히 행해지고 있다(A. Tefferi et al., Blood 110: 1092-1097, 2007) 이 중 대표적인 Molecular marker인 JAK2 V617F의 변이는 Tyrosine Kinase의 지속적인 활성상태를 초래하며 STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription)와 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) 그리고 PI3K (Phosphotidylinositol 3-kinase) 신호에 영향을 끼쳐 이들 신호의 지속적인 활성화라는 결과를 초래한다. Early myeloproliferative diseases were classified using clinical and biological characteristics, but the mutations of the Philadelphia chromosome and the mutations of JAK2 V617F were discovered, and the classification method using these molecular markers was performed and the WHO revised in 2008. Investigation into the development and treatment of diseases through their genetic modifications has been actively conducted (A. Tefferi et al., Blood 110: 1092-1097, 2007). Among them, JAK2 V617F, a representative Molecular marker Variation of Tyrosine Kinase results in the continuous activation of Tyrosine Kinase and affects the Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT), Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) and Phosphhotidylinositol 3-kinase (PI3K) signals, resulting in the continuous activation of these signals. Cause.

JAK2 V617F의 변이는 다양한 질병에서 나타나며, 주로 필라델피아 염섹체 변이와는 독립적으로 나타난다는 것이 현 학계의 입장이다. JAK2 V617F의 변이의 경우 진성적혈구증가증에서 주로 나타나며 본태성 혈소판증가증과 특발성 골수섬유증에서도 많이 관찰되어지는데, 후자들의 경우 변이의 정도가 진성적혈구증가증보다 적은 경우가 많아 현재 주로 사용되는 염기서열분석 방법의 검출 한계로서는 정확한 진단이 어려워 실제 후자의 질병들에서의 JAK2 V617F의 변이는 더 많을 것으로 생각되어지며 민감도가 우수한 새로운 방법에 대한 요구가 높아지고 있다(W. Vainchenker et al., Hematology 2005:195-200, 2005). JAK2 V617F의 변이는 환자마다 유전자의 변형 정도와 같은 질병 그룹 안에 있다고 하더라도 JAK2 V617F의 변이가 없는 경우가 있기에 정확한 진단이 환자의 선택과 질병 치료의 방향성 및 예후결과를 예측하는 대에 매우 중요하다고 할 수 있다.It is the current academic view that the mutation of JAK2 V617F occurs in a variety of diseases, mainly independent of the Philadelphia salt sector mutation. Mutations of JAK2 V617F occur mainly in intrinsic erythrocytosis and are also observed in essential thrombocytopenia and idiopathic myeloid fibrosis. In the latter cases, the degree of variation is less than that of intrinsic erythrocytosis. As the detection limit is difficult to accurately diagnose, it is considered that the variation of JAK2 V617F in the latter diseases is more likely, and there is an increasing demand for a new method with high sensitivity (W. Vainchenker et al., Hematology 2005: 195-200, 2005). Although the mutation of JAK2 V617F is in the same disease group as the degree of genetic variation in each patient, there is no variation of JAK2 V617F. Therefore, accurate diagnosis is very important for predicting the patient's choice and the direction and prognosis of disease treatment. Can be.

JAK2 V617F의 변이에 따른 질병을 치료할 수 있는 JAK 억제자(JAK inhibitors)의 경우 여러 임상 실험을 통해서 그 유효성과 안정성이 평가되고 있으며 Ruxolitinib(Incyte Corporation-Licensed by Novartis, USA)과 같은 경우는 임상3상 시험에 돌입하여 우수한 효능과 안정성을 인정받고 있다 (Quintas-Cardama et al., Nature Reviews Drug Discovery 10:127-140, 2011). JAK2의 정밀한 진단이 가능할 경우 이러한 치료 방법에 대한 적용 유무를 임상학적으로 판단할 수 있을 것이며 개인맞춤형 임상 시술이 가능할 것으로 기대된다. JAK inhibitors that can treat diseases caused by mutations of JAK2 V617F have been evaluated for efficacy and safety through several clinical trials, and in the case of Ruxolitinib (Incyte Corporation-Licensed by Novartis, USA) It has entered the phase trial and is recognized for its excellent efficacy and stability (Quintas-Cardama et al., Nature Reviews Drug Discovery 10: 127-140, 2011). If the accurate diagnosis of JAK2 is possible, it can be clinically judged whether the treatment method is applied and personalized clinical procedure is expected.

상기한 치료의 방향성 및 예후예측과 관련된 JAK2 유전자의 변이는 주로 엑손 14의 코돈617번째(1849번째)에 위치한 점 돌연변이이다. Mutations in the JAK2 gene associated with the above-mentioned directionality and prognosis of the treatment are mainly point mutations located at codon 617th (1849th) of exon 14.

이러한 JAK2 돌연변이의 검출 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석 혹은 융해곡선을 통한 변이 검출 방법, 야생형을 인식해 절단하는 제한효소(BsaXI)를 사용하여 절단된 야생형과 절단되지 않은 돌연변이형 증폭산물의 크기를 통해 검출하는 방법(D. Shammaa et al., Genetic Testing and Molecular Biomarkers 14(1): 13-15, 2010)과 직접염기서열분석법의 낮은 민감도를 개선할 수 있는 돌연변이 발생 부위를 실시간으로 증폭하면서 염기서열을 분석해나가는 파이로시퀀싱(pyrosequencing)방법을 이용하여 정량적으로 검출하는 방법과 돌연변이 부위를 증폭시키고, 증폭 후 HPLC와 용융을 통한 시간차에 따라 돌연변이와 야생형을 구분하는 방법 등이 사용되어왔다. 그러나 상기 방법들은 PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동 과정, 염기서열분석 등의 여러가지 단계를 거쳐 돌연변이를 검출하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요되는 것이 단점으로 지적된다. 또한 임상 시료는 돌연변이가 야생형에 비해 아주 극소량 존재하는 경우가 많고 환자별로 차이가 나는 경우가 많아서, 소량의 돌연변이를 검출하는 것이 매우 중요함에도 불구하고, 상기의 방법은 낮은 검출 민감도를 가지므로 극소량의 돌연변이의 검출이 어렵다. As a detection method of the JAK2 mutation, a sequencing method using a sequencing or fusion curve after polymerase chain reaction (PCR), a wild type cleaved using a restriction enzyme ( Bsa XI) that recognizes and cleaves a wild type And low sequencing of the uncut mutant amplification product (D. Shammaa et al., Genetic Testing and Molecular Biomarkers 14 (1): 13-15, 2010) and direct sequencing. Quantitative detection using a pyrosequencing method that analyzes the nucleotide sequence while amplifying possible mutagenesis in real time and amplifies the mutation site, and then amplifies the mutation and wild type according to time difference through HPLC and melting after amplification. How to distinguish between has been used. However, the above method is pointed out that the reaction time is long, cumbersome and expensive because it detects mutations through various steps such as cleavage with restriction enzymes after PCR, electrophoresis and sequencing. . In addition, clinical samples have very few mutations compared to wild type and often differ from patient to patient, and although detection of a small number of mutations is very important, the above method has low detection sensitivity and therefore a very small amount of mutation. Detection of mutations is difficult

상기 방법들의 낮은 민감도를 극복하기 위해 실시간 중합연쇄효소반응 (Real-time PCR)을 이용한 진단 방법들이 개발되었으며 (M. Cankovic et al., Am J Clin Pathol 132:713-721, 2009) 이러한 기술은 짧은 시간 안에 민감하고 정확하게 유전자의 변이 유무를 확인할 수 있으므로 환자의 생명이 좌우되는 임상현장에 더욱 알맞은 방법이라고 할 수 있다. 실시간 중합연쇄효소반응의 대표적인 기술은 TaqMan 프로브를 이용하여 단염기 다양성(SNP: Single Nucleotide Polymorphism)을 구별해내는 방법이며 두 개의 다른 형광 신호로 각각 야생형과 돌연변이를 구분한다 있다(Rhodes et al., Diagn mol pathol 1997 6(1):49-57; Zuo et al., Modern Pathol 22:1023-1031, 2009). In order to overcome the low sensitivity of the methods, diagnostic methods using real-time PCR have been developed (M. Cankovic et al.,Am J Clin Pathol 132: 713-721, 2009) This technique is more suitable for the clinical site where the patient's life is influenced because it can detect the mutation of genes in a short time and sensitively. A typical technique for real-time polymerase chain reaction is to distinguish single nucleotide polymorphism (SNP) using a TaqMan probe and distinguish between wild type and mutation by two different fluorescent signals (Rhodes et al., Diagn mol pathol 1997 6 (1): 49-57; Zuo et al., Modern Pathol22: 1023-1031, 2009).

그러나 실시간중합효소연쇄반응의 우수성을 이용하는 방법은 돌연변이를 검출하기 위하여 돌연변이가 발생하는 부위에 각각 프로브나 프라이머를 모두 사용해야하기 때문에 각각의 프로브와 프라이머를 일일이 디자인하고 제작한 뒤에 최적화 시키는 것에 소요되는 비용과 시간이 크며, 상기와 같은 이유로 제작단가가 높아 사용자들에게 최신 기술의 혜택을 주지 못하는 경우가 생길 수 있다. However, the method using the excellence of real-time polymerase chain reaction requires the use of both probes and primers at the sites where mutations occur in order to detect mutations. The time and cost is too high, the production cost is high for the above reasons, users may not be able to benefit from the latest technology.

최근에는 돌연변이형을 선택적으로 검출하는 기술로 상기한 방법과는 달리 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로, 같은 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용한 진단법에 비해 프로브와 프라이머 제작이 용이하고 제품 구성 또한 간단하여 제작단가가 상대적으로 낮은, 돌연변이를 선택적으로 검출하는 우수한 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. Recently, a technique for selectively detecting a mutant type is a method of inhibiting amplification of a large amount of wild type by using a PNA probe that specifically binds to a wild type, unlike the above method, using the same real-time polymerase chain reaction method. Compared to diagnostic methods, superior PNA clamping technology has been developed to selectively detect mutations, which are easier to manufacture probes and primers, and also have a simpler product structure.

상기 PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다(Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, “Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide”, Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500). PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. The PNA was first reported in 1991 as analogous DNA linked to a peptide bond rather than a phosphate bond (Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, “Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-”). substituted polyamide ”, Science 1991, Vol. 254: pp 1497-1500). PNA is synthesized chemically and is not found in nature.

PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우, PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥 보다 PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥 보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고, 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산 보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 상기와 같은 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다. PNAs hybridize with native nucleic acids of complementary base sequences to form double strands. When the number of nucleic acid bases is the same, the PNA / DNA strand is more stable than the DNA / DNA strand and the PNA / RNA strand is more stable than the DNA / RNA strand. As the basic skeleton of PNA, N- (2-aminoethyl) glycine is most commonly used by amide bonds. In this case, the backbone of peptide nucleic acid is different from that of negatively charged natural nucleic acid. It is electrically neutral. The four nucleic acid bases present in the PNA occupy a similar space as the nucleic acid bases of DNA, and the distances between the nucleic acid bases are almost the same as those of natural nucleic acids. PNA is not only chemically more stable than natural nucleic acids but also biologically stable because it is not degraded by nucleases or proteases. Since PNA is also electrically neutral, the stability of PNA / DNA, PNA / RNA double strands is not affected by salt concentration. Because of these properties, PNA can recognize complementary nucleic acid sequences better than natural nucleic acids and are therefore used for diagnostic or other biological and medical purposes.

PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다.The PNA clamping technique uses the advantages of the above-described PNA, so that when the PNA probe is completely bound, the amplification reaction does not occur because the enzyme is not recognized, and in the case of a point mutation, the amplification reaction cannot be perfectly bound. As a method using the principle that occurs, it is widely used because it can quickly and accurately detect a very small amount of mutations compared to wild type.

이에 본 발명자들은 종래의 16mer 에서 20mer 길이의 PNA 클램핑 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 변이형을 검출함으로써, 용융곡선의 차이를 이용한 변이형 검출 기술보다 간편할 뿐만 아니라, 다량의 야생형의 증폭을 완벽하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속 정확하게 검출할 수 있는, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 JAK2 V617F 돌연변이 검출 기술을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors detect the mutant using only the amplification cycle difference with the wild type by using the conventional 16mer to 20mer long PNA clamping probe, thereby being simpler than the mutant detection technique using the difference of the melting curve, Complete the present invention by developing JAK2 V617F mutation detection technology using PNA-based real-time PCR clamping, which can quickly and accurately detect very small amounts of mixed mutations by completely inhibiting amplification and improving the detection sensitivity of the mutant. It was.

본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 JAK2 V617F 돌연변이 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide a JAK2 V617F mutation detection method using PNA-based real-time PCR clamping.

본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 JAK2 V617F 돌연변이를 검출하는 방법에 사용하기 위한 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a detection kit for use in a method for detecting JAK2 V617F mutation using PNA-based real-time PCR clamping.

본 발명의 제1면은The first aspect of the present invention

JAK2(Janus Kinase 2) 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 야생형 JAK2 유전자의 엑손 14 코돈 617번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, JAK2 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;Real-time PCR for the JAK2 gene in the presence of a Peptide Nucleic Acid (PNA) clamping probe that completely binds to a set of Janus Kinase 2 (JAK2) gene clamping primers and a nucleotide sequence comprising exon 14 codon 617 nucleotide of the wild-type JAK2 gene perform (real-time Polymerase Chain Reaction);

상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 JAK2 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:Gene amplification by the real-time PCR is analyzed to determine the presence or absence of the mutation of the JAK2 gene:

단계를 포함하는, JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.It relates to a method for detecting mutations of the JAK2 gene, comprising the step.

본 발명의 제2면은The second aspect of the present invention

서열번호 1 내지 24로부터 선택되는 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 본 발명에 따른 JAK2 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a kit for use in a method for detecting mutation of a JAK2 gene according to the present invention, comprising any one PNA clamping probe selected from SEQ ID NOs: 1 to 24.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 검출하는 방법이 매우 간단하며, 질병의 발생 및 예후에 관여하는 JAK2 V617F 유전자의 돌연변이를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 극소량 포함되어 있는 돌연변이까지 검출할 수 있다. The PNA probe according to the present invention is very stable to biological enzymes and physical elements and is very simple to detect, and contains a very small amount of mutations of the JAK2 V617F gene involved in disease development and prognosis in a short time with excellent sensitivity and specificity. Mutations can be detected.

또한 본 발명에 따른 JAK2 유전자의 돌연변이 검출방법은 진성적혈구증가증(PV: Polycythemia Vera), 본태성 혈소판증가증(ET: Essential Thrombocythaemia), 및 특발성 골수섬유증(IMF: Idiopathic Myelofibrosis) 등의 질환을 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있어, 조기 진단으로 인한 효율적인 치료를 가능하게 할 것이다. In addition, the method of detecting mutations of the JAK2 gene according to the present invention can rapidly diagnose diseases such as polycythemia vera (PV), essential thrombocytosis (ET), and idiopathic myelofibrosis (IMF). And accurate inspections will enable efficient treatment due to early diagnosis.

도 1은 PNA 기반의 PCR 클램핑 원리를 나타내는 모식도이고;
도 2는 JAK2 V617F 세포주를 대상으로, 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 돌연변이 세포주의 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이며;
도 3은 JAK2 V617F의 클론을 대상으로, 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용하여 돌연변이 클론의 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 4는 JAK2 V617F 세포주를 대상으로, 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR에서의 돌연변이 세포주의 농도에 따른 검출 민감도(ΔCt 및 증폭사이클 수)를 나타낸 그래프이며;
(A: ΔCt, B:, 검출 사이클 수)
도 5는 JAK2 V617F 클론을 대상으로, 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR에서의 돌연변이 클론의 농도에 따른 검출 민감도(ΔCt 및 증폭사이클 수)를 나타낸 그래프이다.
(A: ΔCt, B:, 검출 사이클 수)1 is a schematic diagram showing the PNA-based PCR clamping principle;
2 is a real-time PCR curve image showing the detection sensitivity results of the concentration of the mutant cell line using the PNA probe according to the present invention, JAK2 V617F cell line;
3 is a real-time PCR curve image showing the detection sensitivity results of the concentration of the mutant clone using the PNA probe according to the present invention, clones of JAK2 V617F;
4 is a detection sensitivity (ΔC t) of JAK2 V617F cell line according to the concentration of the mutant cell line in real-time PCR using the PNA probe according to the present invention. And number of amplification cycles);
(A: ΔC t , B :, Number of detection cycles)
5 is a detection sensitivity (ΔC t) of JAK2 V617F clones according to the concentration of mutant clones in real-time PCR using a PNA probe according to the present invention. And number of amplification cycles).
(A: ΔC t , B :, Number of detection cycles)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 JAK2 유전자의 돌연변이를 검출하는 것이다. The present invention is to detect mutations of the JAK2 gene using PNA-based real-time PCR clamping.

1.PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작 1. PNA Clamping Probe Design and Fabrication

본 발명의 PNA 프로브는 JAK2 유전자의 코돈 617의 야생형 유전자의 서열에 완벽하게 결합할 수 있는(perfectly matched) 것으로서 16개 이상, 바람직하게는 18 내지 25개, 보다 바람직하게는 19 내지 23개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.The PNA probe of the present invention is perfectly matched to the sequence of the wild type gene of codon 617 of the JAK2 gene, and has 16 or more, preferably 18 to 25, more preferably 19 to 23 base sequences. Characterized in that consists of.

본 발명의 PNA 프로브는 JAK2 엑손 14의 코돈 617의 야생형 유전자 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 24 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인바, 16mer 이상의 길이를 갖는 PNA 프로브로서, 본 발명에 따른 PNA 클램핑 실시간 PCR을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 JAK2 엑손 14 코돈 617의 돌연변이를 효과적으로 검출해낼 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.  The PNA probe of the present invention is preferably designed such that the wild type gene region of codon 617 of JAK2 exon 14 is located in the center of the probe. For example, the PNA probe of the present invention may be composed of the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NO: 1 to 24. PNA probe sequence within the range that can be easily modified by those skilled in the art from the base sequence using a common knowledge should be considered to be within the scope of the present invention, PNA probe having a length of 16mer or more, according to the present invention As long as it is possible to effectively detect mutations of JAK2 exon 14 codon 617 using only amplification cycle differences using PNA clamping real-time PCR, it is within the scope of the present invention.

구체적으로는, 서열번호 3 내지 8은 JAK2 코돈 617번의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생의 증폭을 저해하고 돌연변이만을 검출하기 위한 프로브로서 JAK2 엑손 14의 코돈 617번 주변 염기와 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. Specifically, SEQ ID Nos. 3 to 8 are designed to hybridize specifically with the wild type of JAK2 codon 617 to inhibit wild amplification and to detect only mutations, and to specifically hybridize with the base around codon 617 of JAK2 exon 14 .

Figure pat00001
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상기 프로브들 중 대표적으로 서열번호 1번부터 24번까지 프로브를 적용하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 야생형의 증폭을 억제하는 대에 우수한 효과를 나타낸다. Representative of the probes from SEQ ID NO: 1 to 24 representatively of the probes to confirm the effect of inhibiting the amplification of wild-type amplification and detecting mutations, showing an excellent effect for suppressing the amplification of wild-type.

본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예로서 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 친수성 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다[J Chem Technol Biotechnol 81: 892-899, 2006; Tetrahedron Lett 39:7255-7258, 1998; Proc Natl Acad Sci USA 99:5953-5958, 2002; Anal Chem 69:5200-5202, 1997]. 구체적인 예로서, N-말단에 라이신(lysine)이 1개 부착된 PNA 프로브를 사용하였다.The PNA probe of the present invention may include a hydrophilic functional group at the N-terminus or C-terminus to increase the reaction efficiency and solubility. For example, a hydrophilic linker or a hydrophilic amino acid, or an amine group at the N-terminus or C-terminus may be used. Dogs or several, may be included [ J Chem Technol Biotechnol 81: 892-899, 2006; Tetrahedron Lett 39: 7255-7258, 1998; Proc natl Acad Sci USA 99: 5953-5958, 2002; Anal Chem 69: 5200-5202, 1997. As a specific example, a PNA probe having one lysine attached to the N-terminus was used.

본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(Dueholm et al., J Org chem . 59(19): 5767-5773, 1994; Christensen J peptide Sci 1(3): 175-183, 1995; Thomson et al., Tetrahedron 51(22): 6179-6194, 1995).
The PNA oligomer used in the present invention is a PNA monomer protected with Bts (Benzothiazolesulfonyl) group, or a PNA monomer protected with known Fmoc (9-flourenylmethloxycarbonyl) or t-Boc (t-butoxycarbonyl) according to the method of Korean Patent No. 464,261. Can be synthesized using (Dueholm et al., J Org). chem . 59 (19): 5767-5773, 1994; Christensen J peptide Sci 1 (3): 175-183, 1995; Thomson et al., Tetrahedron 51 (22): 6179-6194, 1995).

2 .2 . JAK2JAK2 V617FV617F 유전자  gene 클램핑Clamping 프라이머의Primer 설계 및 제작 Design and production

본 발명에서 “JAK2 V617F 유전자 클램핑 프라이머”라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 야생형 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 미스매치가 존재하는) 돌연변이 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다. In the present invention, the "JAK2 V617F gene clamping primer" refers to amplification of a mutant gene that inhibits amplification of wild-type genes that are perfectly bound to PNA probes and that is not perfectly bound to PNA probes (ie, mismatches exist). The PCR primers are indicated.

본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 진단 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 돌연변이가 일어나는 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 구체적인 예에 따르면, 서열번호 1과 서열번호 3의 PNA 프로브의 3’ 부위의 5 내지 6개의 염기서열이 포함되도록 24mer 내지 27mer의 클램핑 프라이머를 설계하였다.The clamping primer of the present invention is not particularly limited, but in order to detect mutations with higher sensitivity and specificity, a portion of the clamping primer overlaps with the PNA probe in one direction and the other direction is to be detected based on the PNA clamping probe. Including the site, it is preferable to devise in consideration of the size of the PCR amplification product. In addition, considering the T m with the PNA probe, the length is between 17mer and 30mer, it is preferable to design lower than the T m of the PNA probe. In order to maximize the diagnostic sensitivity and specificity, it is desirable to design to include the part immediately before the base of the mutation in the PNA clamping probe sequence that binds complementarily with the wild type. According to a specific example, clamping primers of 24mer to 27mer were designed to include 5 to 6 base sequences of the 3 'region of the PNA probes of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.

본 발명에서 예시된 서열번호 30의 역방향 프라이머는 JAK2 유전자 엑손 14의 코돈 617의 하류 부분 1850 내지 1877번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 47의 역방향 프라이머와 조합되는 서열번호 46의 정방향 프라이머 JAK2 유전자 인트론 13부위에 걸쳐 엑손 14 부위의 1776 내지 1794번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며, 프라이머의 길이는 28mer로 서열번호 30과 조합되어 증폭산물의 크기가 107 bp가 되도록 고안되었다. The reverse primer of SEQ ID NO: 30 exemplified herein is designed to specifically recognize the 1850-1877 base downstream of codon 617 of JAK2 gene exon 14. It was designed to specifically recognize the 1776-1794 base of the exon 14 site over 13 sites of the forward primer JAK2 gene intron in combination with the reverse primer of SEQ ID NO: 47 exemplified in the present invention, and the length of the primer was 28mer. In combination with SEQ ID NO: 30, the amplification product was designed to be 107 bp.

한편, JAK2 유전자의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여, 본 발명에서 제공되는 서열번호 57번의 정방향 프라이머는 JAK2 유전자 인트론 13 부위의 929 내지 949 번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 프라이머의 길이는 17mer에서 30mer 사이로 고안되었으며, 서별번호 58번의 역방향 프라이머와 조합되어 증폭산물의 크기가 322 bp가 되도록 고안되었다. 각각의 프라이머의 특성은 하기 표 2에 나타내었다. On the other hand, in order to identify the gene by sequencing the JAK2 gene, the forward primer of SEQ ID NO: 57 provided in the present invention is designed to specifically recognize the 929 to 949th base of the 13 region of the JAK2 gene intron, the length of the primer Was designed between 17mer and 30mer, and was designed to be 322 bp in size with the amplification product in combination with reverse primer No. 58. The properties of each primer are shown in Table 2 below.

Figure pat00002
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Figure pat00003
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1.PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 JAK2 돌연변이 검출 1. PNA- based Real-Time PCR Detection of JAK2 Mutations Using Clamping

본 발명에 따른 JAK2 유전자 돌연변이 검출방법은JAK2 gene mutation detection method according to the invention

JAK2(Janus Kinase 2) 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 야생형 JAK2 유전자의 엑손 14 코돈 617번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, JAK2 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;Real-time PCR for the JAK2 gene in the presence of a Peptide Nucleic Acid (PNA) clamping probe that completely binds to a set of Janus Kinase 2 (JAK2) gene clamping primers and a nucleotide sequence comprising exon 14 codon 617 nucleotide of the wild-type JAK2 gene perform (real-time Polymerase Chain Reaction);

상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 JAK2 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는: 단계를 포함한다.Analyzing the gene amplification by the real-time PCR to determine the presence or absence of the mutation of the JAK2 gene: a step.

본 발명의 JAK2 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비한다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액 또는 종양 표본으로부터 DNA를 추출하여 준비한다.JAK2 gene of the present invention is prepared by extracting from a subject sample. In the present invention, there is no particular limitation on nucleic acid extraction, and any nucleic acid extraction method generally used may be used, and DNA may be extracted and prepared from blood or tumor samples of patients using commercially available nucleic acid extraction kits.

본 발명의 실시간 PCR 클램핑 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라 함)로 나타내므로, 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 상기 방법은 전기영동 후 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭 정도를 자동화 및 수치화시켜 신속?간편하게 진단할 수 있는 방법이다In the real-time PCR clamping method of the present invention, the amount of initial sample in which exponential amplification takes place is represented by the number of cycles at which an exponential increase in fluorescent material is detected (Cycle threshold, hereinafter referred to as 'C t '). Analysis is possible and the reaction can be analyzed in real time. This method eliminates the step of measuring the intensity with an image analyzer after electrophoresis and can quickly and easily diagnose by automating and quantifying the amplification degree of the amplified product.

본 발명에 있어서, PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브는 16mer 이상 길이의 염기서열로 이루어지며, 바람직하게는 18 내지 25mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.In the present invention, PNA (Peptide Nucleic Acid) clamping probe is composed of a base sequence of 16mer or more length, preferably consisting of a base sequence of 18 to 25mer length.

본 발명에서 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000 nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다. In the present invention, it is preferable that the PNA clamping probe in the reaction of the real-time PCR clamping has a final concentration of 1 to 1000 nM.

본 발명에서는 인터컬레이터(intercalator) 방법을 이용하여 형광을 검출하는데, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 결합해 형광을 발하게 되는데 이때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다.In the present invention, the fluorescence is detected by using an intercalator method. In this method, the fluorescent label binds to the amplified double-stranded DNA and emits fluorescence. do.

본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 사이버 그린 (SYBR Green) I 외에도 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX Orange 등을 사용할 수 있다(Gudnason et al., Nucleic Acids Res. 35(19):e127, 2007; Bengtsson et al., Nucleic Acids Res . 31(8):e45; Wittwer et al., Clinical Chemistry 49(6):853-860, 2003).In the present invention, a DNA-binding fluorophore used in a real-time gene detection method is used as a fluorescent material for identifying gene amplification products, and there is no particular limitation on the type thereof. For example, in addition to SYBR Green I, Evergreen, Etdium Bromide (EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC Green, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX Orange, etc. can be used (Gudnason et al., Nucleic Acids Res . 35 (19): e 127, 2007; Bengtsson et al ., Nucleic Acids Res . 31 (8): e 45; Wittwer et al., Clinical Chemistry 49 (6): 853-860, 2003).

본 발명에서는 실시간 PCR 클램핑에 의한 유전자 증폭을 분석하여, JAK2 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 바, 증폭된 Ct값을 비교하여 JAK2 유전자의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 JAK2 야생형 유전자에 혼성화되어 증폭을 저해하게 되면 증폭이 저해되어 높은 Ct값이 나타나게 된다. In the present invention, by analyzing the gene amplification by real-time PCR clamping, to determine the presence or absence of a mutation or concentration of JAK2 gene, it is possible to confirm the presence or absence of mutation of the JAK2 gene by comparing the amplified C t value. When a PNA probe designed to hybridize with a wild type gene hybridizes to a JAK2 wild type gene and inhibits amplification, the amplification is inhibited, resulting in high C t value.

돌연변이 유무 및 그 농도는 하기 식 1에 의해 얻어지는 △Ct값으로부터 확인한다.The presence or absence of a mutation and its concentration are confirmed from the ΔC t value obtained by the following formula (1).

Figure pat00004
Figure pat00004

돌연변이형 유전자가 다량 포함되어 있을수록 Ct 값이 낮게 나타나므로, △Ct 값은 큰 값을 나타내게 된다. Since the larger the mutant gene is included, the lower the C t value, the higher the ΔC t value is.

본 발명은 Real-Time PCR 및 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 진성적혈구증가증(PV: Polycythemia Vera), 본태성 혈소판증가증(ET: Essential Thrombocythaemia), 그리고 특발성 골수섬유증(IMF: Idiopathic Myelofibrosis)을 대표적으로 진단할 뿐 아니라 JAK2 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 개체군-기초 연구와 같이 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.
The present invention is representative of polycythemia vera (PV), essential thrombocytosis (ET), and idiopathic myelofibrosis (IMF) using real-time PCR and PNA-based real-time PCR clamping. In addition to diagnostics, it can be very useful for studying the mechanisms involved in JAK2 signaling. It can also be effectively applied to studies that require large sample analysis, such as population-based studies.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, which are intended to aid the understanding of the present invention but are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

실시예Example 1:  One: JAK2JAK2 코돈 617의 야생형의 증폭을 억제하기 위한  To suppress amplification of wild type of codon 617 PNAPNA 프로브Probe 합성 synthesis

JAK2 유전자 엑손 14 코돈 617의 야생형과 완벽하게 결합하는 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 코돈의 야생형과 완벽하게 결합하는 프로브는 돌연변이와의 효과적인 분리를 위하여 돌연변이가 일어나는 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다(Lee et al., Org Lett, 9:3291-3293, 2007).
PNA probes that perfectly bind to the wild type of JAK2 gene exon 14 codon 617 were constructed as shown in Table 1 above. Probes that perfectly bind to the wild type of each codon are designed so that the mutant sequence is located in the middle of the probe for effective isolation from the mutation. According to the method described in Korean Patent No. 446461, a PNA probe was synthesized (Lee et al., Org Lett , 9: 3291-3293, 2007).

실시예 2: JAK2 V617F 야생형 및 돌연변이 세포주( cell line )로부터의 핵산 추출 Example 2: JAK2 V617F mutant and wild-type cell line (cell extracting nucleic acid from the line)

JAK2 V617F의 야생형 및 돌연변이의 표적핵산을 확보하기 위하여, 한국세포주은행으로부터 JAK2 V617F의 야생형 세포주인 K562(genomic DNA) 만성골수백혈병 세포주[KCLB10243, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국]를 분양 받았으며, 돌연변이 세포주로는 하기 표 3에 나타난 세포주들을 JCRB(Japanese Collection of Research Biosource, Osaka, Japan)로부터 분양 받았다. In order to secure the target nucleic acid of wild type and mutant of JAK2 V617F, K562 (genomic DNA) chronic myelogenous leukemia cell line [KCLB10243, Korea Cell Line Bank (KCLB), Seoul, Korea], which is a wild type cell line of JAK2 V617F, was obtained from Korea Cell Line Bank. As a mutant cell line, the cell lines shown in Table 3 were distributed from JCRB (Japanese Collection of Research Biosource, Osaka, Japan).

Figure pat00005
Figure pat00005

상기 분양받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1X 페니실린-스트렙토마이신(Welgene, Korea)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 Highpure PCR Template Preparation Kit(Roche, Germany)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20℃에 보관하여 사용하였다. The cultured cell line was a medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA) and 1X penicillin-streptomycin (Welgene, Korea) in RPMI1640 (Hyclone, Thermo scientific, USA). Culture at 37 ° C., maintained at 5% carbon dioxide (CO 2 ). The cultured cell line was extracted with DNA using the Highpure PCR Template Preparation Kit (Roche, Germany) to obtain target nucleic acids. The obtained nucleic acid was quantified using a nanodrop spectrophotometer (ND 2000C, Thermo Scientific, USA) and stored at -20 ° C.

상기 분양받은 JAK2 유전자의 돌연변이 집중 코돈 부위인 V617F의 야생형 및 돌연변이형 인간 세포주로부터 각각 분리한 전체 DNA를 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 57 및 58의 프라이머 조합을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 LabopassTM PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 후 염기서열을 분석하여 유전자형을 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형 및 변이형 세포주는 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법의 검체로 사용하였다.
Total DNA isolated from wild-type and mutated human cell lines of V617F, the mutant intensive codon site of the above distributed JAK2 gene, were amplified using the primer combinations SEQ ID NOs: 57 and 58 described in Table 2 above. The amplified PCR product was purified using a Labopass ™ PCR purification kit (Cosmogenetech, Korea) and analyzed for sequencing to confirm genotype. Genotype-identified wild-type and variant cell lines were used as samples of real-time PCR method using the PNA probe of the present invention.

실시예Example 3:  3: JAK2JAK2 V617FV617F 야생형 및 돌연변이 클론( Wild-type and mutant clones ( cloneclone )으로부터의 핵산 추출Nucleic acid extraction from

JAK2 V617F의 야생형 및 돌연변이의 표적핵산을 확보하기 위하여, 한국세포주은행으로부터 JAK2 V617F의 야생형 세포주로 K562(genomic DNA) 만성골수백혈병 세포주[KCLB10243, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국]를 분양 받았으며, 돌연변이 세포주로는 상기 표 3에 나타난 세포주들을 JCRB (Japanese Collection of Research Biosource, Osaka, Japan) 으로부터 분양 받았다. 분양 받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1X 페니실린-스트렙토마이신(Welgene, Korea)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 Highpure PCR Template Preparation Kit (Roche, Germany)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20℃에 보관하여 사용하였다. JAK2 유전자의 돌연변이 집중 코돈 부위인 V617F의 야생형 및 돌연변이형 인간 세포주로부터 각각 분리한 전체 DNA를 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 40 및 41의 프라이머 조합을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 LabopassTM PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 후 yT&A Cloning Vector Kit(Yeastern Biotech Co., Ltd, Taiwan)를 이용하여 벡터에 증폭산물을 접합시켰다. 접합된 벡터는 JM109 competent cell(Promega, USA)에 transformation이 되었으며 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 클론들은 LabopassTM Plasmid Mini(코스모진텍, 한국)로 핵산이 추출되었으며, 이 중 일부는 유전자형 확인을 위해 염기서열분석을 하였다. 확인된 야생형 및 변이형 클론은 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법의 검체로 사용하였다.
In order to secure the target nucleic acid of wild type and mutant of JAK2 V617F, K562 (genomic DNA) chronic myelogenous leukemia cell line [KCLB10243, Korea Cell Line Bank (KCLB), Seoul, Korea] was distributed from the Korea Cell Line Bank as a wild type cell line of JAK2 V617F. As a mutant cell line, the cell lines shown in Table 3 above were distributed from JCRB (Japanese Collection of Research Biosource, Osaka, Japan). Cell lines received were cultured using RPMI1640 (Hyclone, Thermo scientific, USA) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA) and 1X penicillin-streptomycin (Welgene, Korea). And incubated in an incubator at 37 ° C., 5% carbon dioxide (CO 2 ). The cultured cell line was extracted with DNA using the Highpure PCR Template Preparation Kit (Roche, Germany) to obtain target nucleic acids. The obtained nucleic acid was quantified using a nanodrop spectrophotometer (ND 2000C, Thermo Scientific, USA) and stored at -20 ° C. Total DNA isolated from wild type and mutant human cell lines of V617F, the mutant concentration codon site of JAK2 gene, respectively, was amplified using the primer combinations SEQ ID NOs: 40 and 41 described in Table 2 above. The amplified PCR product was purified using a Labopass ™ PCR purification kit (Cosmogenetech, Korea) and then amplified products were conjugated to the vector using the yT & A Cloning Vector Kit (Yeastern Biotech Co., Ltd, Taiwan). The conjugated vector was transformed into JM109 competent cells (Promega, USA) and cultured in an incubator maintained at 37 ° C and 5% carbon dioxide (CO 2 ). Cultured clones were extracted with Labopass TM Plasmid Mini (Cosmogenetech, Korea), and some of them were sequenced for genotyping. The identified wild-type and variant clones were used as samples of the real-time PCR method using the PNA probe of the present invention.

실시예Example 4:  4: JAK2JAK2 V617FV617F 의 표적핵산을 증폭하기 위한 To amplify target nucleic acids 프라이머primer 합성 synthesis

JAK2 코돈 617의 표적핵산의 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 JAK2 유전자의 엑손 14 부위를 분석하여 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 40 및 41로 이루어진 프라이머 한 세트와 서열번호 30의 JAK2 코돈 617 역방향 클램핑 프라이머를 합성하였으며, 코돈 617 클램핑에 사용된 정방향 프라이머는 서열번호 29의 것을 사용하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
Primers were prepared by analyzing the exon 14 region of the JAK2 gene for amplification and clamping PCR of JAK2 codon 617. Primer was synthesized a set of primers consisting of SEQ ID NO: 40 and 41 to identify wild type and mutant genes and JAK2 codon 617 reverse clamping primer of SEQ ID NO: 30, the forward primer used for clamping codon 617 using SEQ ID NO: 29 It was. The sequence of the used primer is as Table 2 above. Primer was synthesized by BIONIA (Korea).

실시예 5: JAK2 코돈 617의 야생형에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립 Example 5 PNA for Wild Type of JAK2 Codon 617 Real-Time PCR with Probes Establish clamping method

상기 실시예 2에서 세포주로부터 추출된 DNA를 이용하여 하기 조건으로 RT-PCR 클램핑을 수행하여 JAK2 유전자의 야생형의 증폭을 효과적으로 억제하는 최적의 PNA 프로브를 찾고자 하였다. 주형 DNA 용액(10 ng/㎕ 혹은 해당 핵산 copy수) 1 ㎕, 상기 표 2에 나타난 1개의 클램핑 센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 상기 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100 nM) 1 ㎕, 2X IQ Sybr 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초 그리고 PNA가 혼성화될 수 있는 70℃에서 20초 반응을 추가하고, 63℃ 30초, 72℃ 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.
In Example 2, RT-PCR clamping was performed using the DNA extracted from the cell line to find an optimal PNA probe that effectively inhibits amplification of the wild type of JAK2 gene. 1 μl template DNA solution (10 ng / μl or corresponding nucleic acid copy number), 1 μl of one clamping sense primer (10 pmole / μl) shown in Table 2 above, 1 μl of antisense primer (10 pmole / μl), Table 1 above 1 μl of one of the clamping probes (100 nM), 10 μl of 2X IQ Sybr Green Supermix (Bio-Rad, USA), 6 μl of distilled water was added, and a real-time PCR machine (CFX96TM Real-Time) was added. PCR System, manufactured by Bio-RAD Co., Ltd.) for 3 minutes at 95 ° C, followed by 95 ° C 30 seconds and 20 seconds at 70 ° C where PNA can hybridize, 63 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 The initial reaction process was repeated 40 times. Fluorescence was measured at 72 ° C. polymerization step.

실시예 6: JAK2 코돈 617의 야생형에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법을 통한 JAK2 유전자의 돌연변이 검색 Example 6: PNA for wild type of JAK2 codon 617 Real-Time PCR with Probes Mutation Detection of JAK2 Gene by Clamping Method

상기 실시예 4에서 확립된 실시간 PCR을 이용한 방법을 사용하여 세포주의 경우 야생형 유전자 50 ng에 돌연변이 유전자를 각각 100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0%가 포함하도록 제작하고, 클론의 경우 1x107부터 1x101까지의 돌연변이 copy 수에 따른 Ct값 및 ΔCt 값을 분석하여, 돌연변이형의 검출한계를 확인하였다.Using the method using the real-time PCR established in Example 4, the cell line was prepared to include 100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0% of the mutant gene in 50 ng of the wild type gene, respectively, In the case of clones, the limit of detection of the mutant type was confirmed by analyzing the Ct value and ΔC t value according to the number of mutant copies from 1x10 7 to 1x10 1 .

그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다. 도 2 내지 도 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 용액 내 상대적인 돌연변이 유전자의 농도가 높을수록 형광이 역치값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 Ct값이 일정하게 감소하여 용액 내 돌연변이 유전자의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.The results are shown in FIGS. 2 to 5. As can be seen from Figures 2 to 5, as the concentration of the relative mutant gene in the solution is higher, the Ct value indicating the number of reactions that the fluorescence reaches the threshold value is constantly reduced, so that the amount of the mutant gene in the solution and the Ct value Correlation was confirmed.

<110> Panagene Inc. <120> JAK2 V617F Mutation Detection Kit using PNA mediated Real-time PCR clamping <160> 58 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-1 <400> 1 ggagtatgtg tctgtgga 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-2 <400> 2 gagtatgtgt ctgtgga 17 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-3 <400> 3 agtatgtgtc tgtgg 15 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-4 <400> 4 gagtatgtgt ctgtgga 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-5 <400> 5 tggagtatgt gtctgtgga 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-6 <400> 6 ggagtatgtg tctgtggag 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-7 <400> 7 atggagtatg tgtctgtgga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-8 <400> 8 tggagtatgt gtctgtggag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-9 <400> 9 tatggagtat gtgtctgtgg a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-10 <400> 10 atggagtatg tgtctgtgga g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-11 <400> 11 tatggagtat gtgtctgtgg aga 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-12 <400> 12 atggagtatg tgtctgtgga gac 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-13 <400> 13 tatggagtat gtgtctgtgg agac 24 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-1 <400> 14 tccacagaca catactcca 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-2 <400> 15 ctccacagac acatactcc 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-3 <400> 16 tctccacaga cacatactcc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-4 <400> 17 tccacagaca catactcca 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-5 <400> 18 ctccacagac acatactcca 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-6 <400> 19 tctccacaga cacatactcc a 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-7 <400> 20 tctccacaga cacatactcc at 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-8 <400> 21 gtctccacag acacatactc ca 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-9 <400> 22 tctccacaga cacatactcc at 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-10 <400> 23 tctccacaga cacatactcc ata 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-11 <400> 24 gtctccacag acacatactc cata 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP1-FC <400> 25 ttggttttaa attatggagt atgt 24 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP1-R <400> 26 tgctctgaga 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Sequence <220> <223> JAK2-RC-3-F <400> 44 agcagcaagt atgatgagca ag 22 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-3 <400> 45 agttttactt actctcgtct ccacaga 27 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-4-F <400> 46 ccttagtctt tctttgaagc agca 24 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-4 <400> 47 tagttttact tactctcgtc tccacaga 28 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-5-F <400> 48 cctagtcttt ctttgaagca gca 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP1-F <400> 49 tgctgaaagt aggagaaagt gc 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP1-R <400> 50 agctgtgatc ctgaaactga a 21 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP2-F <400> 51 ttgatggcag ttgcaggt 18 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP2-R <400> 52 gatgctctga gaaaggcatt ag 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP3-F <400> 53 tcatgctgaa agtaggagaa 20 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP3-R <400> 54 tttcaaaaat acttaactcc tgt 23 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP4-F <400> 55 ataaagggac caaagcacat t 21 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP4-R <400> 56 aaggcattag aaagcctgta gtt 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP5-F <400> 57 agggaccaaa gcacattgta t 21 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP5-R <400> 58 acacctagct gtgatcctga aa 22 <110> Panagene Inc. <120> JAK2 V617F Mutation Detection Kit using PNA mediated Real-time          PCR clamping <160> 58 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-1 <400> 1 ggagtatgtg tctgtgga 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-2 <400> 2 gagtatgtgt ctgtgga 17 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-3 <400> 3 agtatgtgtc tgtgg 15 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-4 <400> 4 gagtatgtgt ctgtgga 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-5 <400> 5 tggagtatgt gtctgtgga 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-6 <400> 6 ggagtatgtg tctgtggag 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-7 <400> 7 atggagtatg tgtctgtgga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-8 <400> 8 tggagtatgt gtctgtggag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-9 <400> 9 tatggagtat gtgtctgtgg a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-10 <400> 10 atggagtatg tgtctgtgga g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-11 <400> 11 tatggagtat gtgtctgtgg aga 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-12 <400> 12 atggagtatg tgtctgtgga gac 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-SP-13 <400> 13 tatggagtat gtgtctgtgg agac 24 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-1 <400> 14 tccacagaca catactcca 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-2 <400> 15 ctccacagac acatactcc 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-3 <400> 16 tctccacaga cacatactcc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-4 <400> 17 tccacagaca catactcca 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-5 <400> 18 ctccacagac acatactcca 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-6 <400> 19 tctccacaga cacatactcc a 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-7 <400> 20 tctccacaga cacatactcc at 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-8 <400> 21 gtctccacag acacatactc ca 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-9 <400> 22 tctccacaga cacatactcc at 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-10 <400> 23 tctccacaga cacatactcc ata 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-ASP-11 <400> 24 gtctccacag acacatactc cata 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP1-FC <400> 25 ttggttttaa attatggagt atgt 24 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP1-R <400> 26 tgctctgaga aaggcattag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2-R <400> 27 agctgtgatc ctgaaactga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP3-R <400> 28 tgacacctag ctgtgatcct 20 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP4-F <400> 29 cttagtcttt ctttgaagca gca 23 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP4-RC <400> 30 tttacttact ctcgtctcca caga 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP5-F <400> 31 caagctttct cacaagcatt 20 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-1 <400> 32 tttggtttta aattatggag tatgt 25 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-1-R <400> 33 ctagctgtga tcctgaaact g 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-2-R <400> 34 cactgacacc tagctgtgat c 21 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-3 <400> 35 catttggttt taaattatgg agtatgt 27 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-3-R <400> 36 tagctgtgat cctgaaactg aat 23 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-4 <400> 37 catgtggttt taaattatgg agtatgt 27 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-4-R <400> 38 tgacacctag ctgtgatcct g 21 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-5 <400> 39 gcatttggtt ttaaattatg gagtatgt 28 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-FC-5-R <400> 40 ctgtgatcct gaaactgaat tttctat 27 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-1-F <400> 41 gcagcaagta tgatgagcaa g 21 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-1 <400> 42 ttttacttac tctcgtctcc acaga 25 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-2-F <400> 43 agcagcaagt atgatgagca a 21 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-3-F <400> 44 agcagcaagt atgatgagca ag 22 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-3 <400> 45 agttttactt actctcgtct ccacaga 27 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-4-F <400> 46 ccttagtctt tctttgaagc agca 24 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-4 <400> 47 tagttttact tactctcgtc tccacaga 28 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2-RC-5-F <400> 48 cctagtcttt ctttgaagca gca 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP1-F <400> 49 tgctgaaagt aggagaaagt gc 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP1-R <400> 50 agctgtgatc ctgaaactga a 21 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP2-F <400> 51 ttgatggcag ttgcaggt 18 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP2-R <400> 52 gatgctctga gaaaggcatt ag 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP3-F <400> 53 tcatgctgaa agtaggagaa 20 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP3-R <400> 54 tttcaaaaat acttaactcc tgt 23 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP4-F <400> 55 ataaagggac caaagcacat t 21 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP4-R <400> 56 aaggcattag aaagcctgta gtt 23 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP5-F <400> 57 agggaccaaa gcacattgta t 21 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSP5-R <400> 58 acacctagct gtgatcctga aa 22

Claims (10)

JAK2(Janus Kinase 2) 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 야생형 JAK2 유전자의 엑손 14 코돈 617번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, JAK2 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 JAK2 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
단계를 포함하는, JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.Real-time PCR for the JAK2 gene in the presence of a Peptide Nucleic Acid (PNA) clamping probe that completely binds to a set of Janus Kinase 2 (JAK2) gene clamping primers and a nucleotide sequence comprising exon 14 codon 617 nucleotide of the wild-type JAK2 gene perform (real-time Polymerase Chain Reaction);
Gene amplification by the real-time PCR is analyzed to determine the presence or absence of the mutation of the JAK2 gene:
Method of detecting a mutation of the JAK2 gene, comprising the step. 제 1항에 있어서,
상기 JAK2 유전자의 돌연변이 검출은 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 JAK2 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.The method of claim 1,
The mutation detection of the JAK2 gene is a mutation detection method of the JAK2 gene, characterized in that the determination of the presence or concentration of the mutation of the JAK2 gene by measuring the Ct (cycle threshold) value of real-time PCR. 제 1항에 또는 제 2항에 있어서,
상기 JAK2 유전자 클램핑 프라이머 세트는 JAK2 유전자의 엑손 14 코돈 617번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.The method according to claim 1 or 2,
The JAK2 gene clamping primer set is a mutation detection method of JAK2 gene, characterized in that for amplifying a nucleotide sequence comprising the nucleotide exon 14 codon 617 of the JAK2 gene. 제 3항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 정방향 프라이머로서 서열번호 25, 29, 31, 32, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, 및 57로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.The method of claim 3, wherein
The primer set is any one selected from SEQ ID NOs: 25, 29, 31, 32, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 49, 51, 53, 55, and 57 as SEQ ID NO. Mutation detection method of JAK2 gene comprising the above primer. 제 3항에 있어서,
상기 EGFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 역방향 프라이머로서 서열번호 26 내지 28, 30, 33, 34, 36, 38, 40, 42, 45, 47, 50, 52, 54, 56 및 58로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.The method of claim 3, wherein
The EGFR gene clamping primer set is any one or more primers selected from SEQ ID NOs: 26 to 28, 30, 33, 34, 36, 38, 40, 42, 45, 47, 50, 52, 54, 56 and 58 as reverse primers. Mutation detection method of JAK2 gene comprising a. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 단계의 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브는 서열번호 1 내지 24로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
PNA (Peptide Nucleic Acid) clamping probe of the step is a mutation detection method of the JAK2 gene, characterized in that any one or more selected from SEQ ID NO: 1 to 24. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 JAK2 유전자의 돌연변이 검출은 DNA 삽입(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
The mutation detection of the JAK2 gene is a mutation detection method of JAK2 gene, characterized in that for analyzing the gene amplification using a DNA intercalating fluorescent material. 제 7항에 있어서,
상기 DNA 삽입(intercalating) 형광물질은 사이버 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.8. The method of claim 7,
The DNA intercalating fluorescent material is Cyber Green I, Evergreen, Ethidium Bromide (EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC Green, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16 , SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 and SYTOX orange mutation method of detecting a mutation of the JAK2 gene, characterized in that at least one selected from the group consisting of. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 JAK2 유전자의 돌연변이 검출은 진성적혈구증가증(PV: Polycythemia Vera), 본태성 혈소판증가증(ET: Essential Thrombocythaemia), 및 특발성 골수섬유증(IMF: Idiopathic Myelofibrosis)으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 진단하는데 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 JAK2 유전자의 돌연변이 검출 방법.3. The method according to claim 1 or 2,
Detection of mutations in the JAK2 gene can be used to diagnose one or more diseases selected from polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythaemia (ET), and Idiopathic Myelofibrosis (IMF). Mutation detection method of JAK2 gene, characterized in that for. 서열번호 1 내지 24로부터 선택되는 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 제 1항 또는 제 2항에 따른 JAK2 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트.A kit for use in a mutation detection method of a JAK2 gene according to claim 1, comprising any one PNA clamping probe selected from SEQ ID NOs: 1 to 24.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170055400A (en) * 2015-11-11 2017-05-19 가톨릭대학교 산학협력단 Peptide nucleic acid probe for multiplex-detecting BCR/ABL negative MPN related gene mutations, composition for multiplex-detecting gene mutation there of, gene mutation detecting multiplex kit and gene mutation detecting multiplex methods
CN110951850A (en) * 2020-02-22 2020-04-03 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and detection method thereof
CN111004841A (en) * 2020-02-22 2020-04-14 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and method based on double-stranded DNA peptide ligase
CN111004842A (en) * 2020-02-22 2020-04-14 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and method based on single-stranded RNA peptide ligase
WO2020145762A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 주식회사 진캐스트 Dna polymerase for jak2 mutation detection, and kit comprising same
CN114350767A (en) * 2022-01-17 2022-04-15 武汉海希生物科技有限公司 Primer and probe for detecting JAK2 gene V617F mutation, application thereof and kit

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170055400A (en) * 2015-11-11 2017-05-19 가톨릭대학교 산학협력단 Peptide nucleic acid probe for multiplex-detecting BCR/ABL negative MPN related gene mutations, composition for multiplex-detecting gene mutation there of, gene mutation detecting multiplex kit and gene mutation detecting multiplex methods
WO2020145762A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 주식회사 진캐스트 Dna polymerase for jak2 mutation detection, and kit comprising same
CN110951850A (en) * 2020-02-22 2020-04-03 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and detection method thereof
CN111004841A (en) * 2020-02-22 2020-04-14 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and method based on double-stranded DNA peptide ligase
CN111004842A (en) * 2020-02-22 2020-04-14 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and method based on single-stranded RNA peptide ligase
CN110951850B (en) * 2020-02-22 2022-08-16 福建晨欣科生物科技有限公司 JAK2 gene specific mutation detection kit and detection method thereof
CN111004842B (en) * 2020-02-22 2022-08-16 黄志清 JAK2 gene specific mutation detection kit and method based on single-stranded RNA peptide ligase
CN111004841B (en) * 2020-02-22 2022-08-16 黄志清 JAK2 gene specific mutation detection kit and method based on double-stranded DNA peptide ligase
CN114350767A (en) * 2022-01-17 2022-04-15 武汉海希生物科技有限公司 Primer and probe for detecting JAK2 gene V617F mutation, application thereof and kit

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