KR20120118536A

KR20120118536A - 수정진동자 면역센서를 이용한 메탈로티오닌 검출 방법

Info

Publication number: KR20120118536A
Application number: KR1020110035949A
Authority: KR
Inventors: 김남수; 김종태; 조용진; 김철진
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2012-10-29
Also published as: KR101268366B1

Abstract

본 발명은 (S1) 수정진동자(quartz crystal microbalance, QCM) 칩의 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌과 시료를 메탈로티오닌에 대한 1차 항체에 대해 경합반응시키는 단계; (S2) 상기 고정화된 메탈로티오닌에 결합된 1차 항체에 HRP가 태깅된 2차 항체를 반응시키는 단계; (S3) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 반응완충용액을 가하여 정상상태에서의 진동수(F₁)를 얻는 단계; (S4) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 DAB/H₂O₂ 기질 용액을 반응시켜 정상상태에서의 진동수(F₂)를 얻는 단계; 및 (S5) 상기 (S3)단계에서 얻은 진동수(F₁)와 상기 (S4)단계에서 얻은 진동수(F₂)로부터 진동수 변화(ΔF = F₁ - F₂)를 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 시료 내 포함된 메탈로티오닌을 0.1 ng/ml 농도까지 고감도로 검출할 수 있다.

Description

수정진동자 면역센서를 이용한 메탈로티오닌 검출 방법{Detection method for metallothionein using quartz crystal microbalance immunosensor}

본 발명은 수정진동자(quartz crystal microbalance, QCM) 면역센서를 이용한 시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법에 관한 것이다.

최근 세계적으로 식용어류의 품질안정성과 관련된 중금속 오염 여부에 대한 심각성을 지각하고 이의 감시를 위한 제도를 정비하고 각종 검사를 시행하고 있다. 이러한 검사의 실효성을 확보하기 위해서는 개별 중금속에 대한 정밀분석법과 함께 현장간이검사를 위한 어류 체내 중금속 오염 여부의 총체적 지표로서 바이오마커(biomarker)에 대한 고감도 신속검출법 개발이 긴요하다.

따라서 품질안정성이 높은 어패류 섭취를 위해서는 중금속오염 가능성이 상대적으로 높은 광어, 우럭 등 연안양식업에 의하여 주로 공급되는 각종 식용어류의 중금속 오염 여부에 대한 모니터링이 필요하다. 이를 위하여 기기분석법에 의한 중금속이온 자체의 분석뿐만 아니라 중금속에 의하여 식용어류에서 발현되는 바이오마커(biomarker protein)에 대한 현장성 있는 첨단검출기술 확립이 필요하며 아울러 순간적인 계측이 가능하도록 관련 장치의 센서화가 이루어져야 한다. 내분비계장애물질에 노출된 잉어, 도미 등 대부분 어류에서 비텔로제닌(vitellogenin)이 정상어류보다 고농도로 분비되듯이 하천과 연안해수의 중금속 노출 시 메탈로티오닌(metallothionein)이 바이오마커로서 어류 체내에서 과량발현되므로 이를 측정하면 식용어류 자체의 중금속 오염 여부를 총체적으로 선행파악 할 수 있으며, 그 결과 메탈로티오닌 함량이 정상보다 높은 양성시료를 대상으로 중금속 정밀분석을 행할 수 있다.

메탈로티오닌 분석법으로는 Cd-hem 측정법, Hg 혹은 Ag 포화법, thiol기 측정법, Sephadex G-75/atomic absorption spectrometry(AAS)법, 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA)과 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 등의 면역학적 방법, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE) 및 HPLC 등이 보고되고 있다. 그러나 이들 중 Cd-hem 측정법이나 방사면역분석법의 경우 방사성 동위원소를 취급하여야 하며 AAS법과 모세관 전기영동법은 측정과정이 복잡하며 시약소모가 많고 효소면역분석법은 감응도가 높으나 색소물질에 의한 측정저해현상이 발생할 수 있는 실험실적 방법이다. 따라서 식용어류의 중금속에 대한 품질안정성 평가를 위한 지표단백질 검출에서와 같이 현장성과 실시간성이 요구되는 경우에는 적용하기 어려운 단점이 있으므로 미래품질지표로서의 메탈로티오닌 검사의 센서화 기술의 확보가 요구된다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 비표지 면역센서인 수정진동자 면역센서를 이용하여 신속하고 편리할 뿐만 아니라 고감도로 메탈로티오닌을 측정하는 방법을 제공하기 위한 것으로, 수정진동자 칩의 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌과 항원-항체 반응한 1차 항체에 결합된 2차 항체에 태깅된 HRP을 DAB/H₂O₂ 기질 용액과 반응시킴으로써 생성된 침전물에 의한 전극 표면의 질량증대에 따른 진동수 변화를 통하여, 시료 내 포함된 메탈로티오닌을 0.1 ng/ml 농도까지 고감도로 검출할 수 있도록 하기 위한 방법이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (S1) 수정진동자(quartz crystal microbalance, QCM) 칩의 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌과 시료를 메탈로티오닌에 대한 1차 항체에 대해 경합반응시키는 단계;

(S2) 상기 고정화된 메탈로티오닌에 결합된 1차 항체에, HRP가 태깅된 2차 항체를 반응시키는 단계;

(S3) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 반응완충용액을 가하여 정상상태에서의 진동수(F₁)를 얻는 단계;

(S4) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 DAB/H₂O₂ 기질 용액을 반응시켜 정상상태에서의 진동수(F₂)를 얻는 단계; 및

(S5) 상기 (S3)단계에서 얻은 진동수(F₁)와 상기 (S4)단계에서 얻은 진동수(F₂)로부터 진동수 변화(ΔF = F₁ - F₂)를 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법을 제공한다.

시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법에 있어서, 상기 메탈로티오닌의 고정화는 메탈로티오닌: 설포석신이미딜 6-[3-{2-피리딜디치오}프로피온아미도]헥사노에이트: 디티오트레이톨을 1 : 0.5-1.5 : 0.1-1.1의 부피비로 혼합한 용액을 상기 수정진동자 칩의 전극 표면에 반응시켜 얻어지는 것에 특징이 있다.

시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법에 있어서, 상기 반응완충용액은 0.0001-0.15 M의 pH 5.8-8 인산완충용액인 것에 특징이 있다.

시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법에 있어서, 상기 방법의 검출한계는 시료 내 메탈로티오닌의 농도가 0.1 ng/ml 인 것에 특징이 있다.

시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법에 있어서, 상기 고정화된 메탈로티오닌의 농도는 1 mg/ml 이상, 상기 1차 항체의 농도는 5 μg/ml 이상, 상기 2차 항체의 농도는 1 μg/ml 이상, 또는 상기 DAB/H₂O₂ 기질 용액의 농도는 0.1 mM 이상인 것에 특징이 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 진동수변화를 측정하는 비표지 면역센서는 간편하며 경제적으로 메탈로티오닌을 검출할 수 있고, 시료 중 착색물질에 의한 계측저해현상이 거의 없을 뿐만 아니라 시료 내 포함된 메탈로티오닌을 0.1 ng/ml 농도까지 고감도로 검출할 수 있어서, 식용 어패류, 갑각류, 및 포유동물의 중금속에 대한 품질안정성 확보에 크게 기여할 것으로 기대된다.

도 1은 수정진동자 면역센서(quartz crystal microbalance immunosensor) 작동 모드를 나타낸 것으로, 직접결합방식(A, Direct-binding mode) 및 간접경합방식(B, indirect-competitive mode)을 나타낸다.
도 2는 반응완충용액의 농도에 따른 바이오마커와 항체간의 면역반응을 비교한 것으로, (a)는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)이고 (b)는 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)이며, 화살표는 주입 시점을 나타낸다.
도 3은 배치형 QCM 시스템을 도식화한 것으로, a, QCM의 금 전극; b, well cell; c, oscillator circuit; d, quartz crystal analyzer; e, PC이다.
도 4는 표면침전에 의한 신호증폭의 이론을 나타낸 것이다.
도 5는 고정화에 사용된 1차 항체 농도를 결정하기 위하여 항-MT 항체 농도의 증가에 따른 센서 반응을 나타낸 것이다: 항체 농도(㎍/ml) : a, 0 (버퍼 투입); b, 0.5; c, 1.25; d, 2.5; e, 5.0; f, 10.
도 6은 MPA 및 코팅항원의 농도 변화와 함께 4-클로로-1-나프톨 투입에 따른 센서 반응을 나타낸 것이다: A, 코팅 항원(0.5 mg/ml) MPA (1 mM); B, 코팅 항원(0.5 mg/ml) MPA(10 mM); C, 코팅 항원(1 mg/ml) MPA(1 mM); D, 코팅 항원(1 mg/ml) MPA(10 mM). a, 2차 항체 1 ㎍/ml; b, 2차 항체 2 ㎍/ml; c, 2차 항체 10 ㎍/ml; d, 버퍼. 1 mM 4-클로로-1-나프톨 및 5 ㎍/ml 항-MT 항체를 연속해서 well cell에 첨가하였다.
도 7은 sulfo-LC-SPDP 이용하여 4-클로로-1-나프톨을 첨가함에 따른 센서 반응을 나타낸 것이다: 2차 항체(㎍/ml) : a, 1; b, 2; c, 10.
도 8은 sulfo-LC-SPDP 이용하여 DAB를 첨가함에 따른 2차 항체의 농도에 따른 센서 반응을 나타낸 것이다: 2차 항체(㎍/ml): a, 1; b, 2; c, 10.
도 9는 DAB의 농도에 따른 진동수 변화를 나타낸 것이다: DAB 농도(μM) a, 100; b, 250; c, 500; d, 1000; e, 2000.
도 10은 analyte 농도에 따른 시간-의존적인 반응 프로파일을 나타낸 것이다: a, 대조군; b, 0.005 ng/ml; c, 0.05 ng/ml; d, 0.1 ng/ml; e, 0.5 ng/ml; f, 1 ng/ml.
도 11은 analyte 농도에 따른 농도 의존성을 나타낸 것이다: normal (A), semi-logarithmic (B), double-logarithmic scale (C).

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명은 (S1) 수정진동자(quartz crystal microbalance, QCM) 칩의 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌과 시료를 메탈로티오닌에 대한 1차 항체에 대해 경합반응시키는 단계; (S2) 상기 고정화된 메탈로티오닌에 결합된 1차 항체에 HRP가 태깅된 2차 항체를 반응시키는 단계; (S3) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 반응완충용액을 가하여 정상상태에서의 진동수(F₁)를 얻는 단계; (S4) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 DAB/H₂O₂ 기질 용액을 반응시켜 정상상태에서의 진동수(F₂)를 얻는 단계; 및 (S5) 상기 (S3)단계에서 얻은 진동수(F₁)와 상기 (S4)단계에서 얻은 진동수(F₂)로부터 진동수 변화(ΔF = F₁ - F₂)를 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법을 제공한다.

(S1) 단계에서 수정진동자(quartz crystal microbalance, QCM) 칩의 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌에 1차 항체 및 시료를 경합반응시킨다.

시료 내 메탈로티오닌이 포함된 경우, 간접경합방식(competitive mode)에 따라 고정화된 메탈로티오닌과 시료 내 메탈로티오닌이 1차 항체에 대해 항원-항체 경합반응을 한다. 경합반응 결과, 일부 1차 항체는 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌에 결합하고, 일부는 시료 내 포함된 메탈로티오닌에 결합한다.

상기 전극 표면에 메탈로티오닌을 고정화시키기 위해, 바람직하게는 sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate) 고정화법을 이용할 수 있으며, 이 고정화법에 따르면 메탈로티오닌, 설포석신이미딜 6-[3-{2-피리딜디치오}프로피온아미도]헥사노에이트(sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), 및 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 동시에 또는 순차적으로 반응시켜 수득한 고정화 용액을 수정진동자 칩의 전극 표면에 반응시킴으로써 메탈로티오닌을 고정화시킬 수 있다. 이때 사용되는 메탈로티오닌: 설포석신이미딜 6-[3-{2-피리딜디치오}프로피온아미도]헥사노에이트 : 디티오트레이톨의 부피비는 이에 제한되지 않지만 1 : 0.5-1.5 : 0.1-1.1인 것이 바람직하다. 전극 표면에 고정된 메탈로티오닌의 농도는 1 mg/ml 이상인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 1 mg/ml 이다.

상기 시료는 메탈로티오닌 검출을 목적으로 하는 물질이면 제한되지 않고, 예컨대 메탈로티오닌 표준용액, 검체의 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 체액 또는 조직추출물이 포함될 수 있으며, 상기 검체에는 예컨대 잉어, 도미, 메기, 뱀장어, 등을 포함하는 어패류 및 게, 새우 등을 포함하는 갑각류 및 쥐(rat), 마우스(mouse), 토끼, 원숭이, 사람, 염소 등 포유동물이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 메탈로티오닌에 대한 1차 항체는 당업계 공지된 다양한 방법으로 제조하거나 상업적 루트를 통해 수득할 수 있고, 쥐(rat), 마우스(mouse), 토끼, 원숭이, 사람, 염소 등 포유동물 유래인 것을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 메탈로티오닌에 대한 1차 항체의 농도는 이에 제한되지 않지만 5 μg/ml 이상인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게 5-100 μg/ml 이다. 메탈로티오닌과 그 항체의 결합 시 농도의존성을 보이므로 메탈로티오닌에 대한 1차 항체의 농도가 5 μg/ml 미만인 경우, 결합성이 떨어진다.

상기 시료: 메탈로티오닌에 대한 1차 항체의 부피비는 1 : 0.5-1.5, 바람직하게 1 : 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

(S1) 단계를 수행하고 일정 시간 경과한 후, 잔존하는 용액을 모두 제거하는 단계를 포함하여, 고정화된 메탈로티오닌에 결합한 1차 항체만 남길 수 있다.

(S2) 단계에서 상기 결합된 1차 항체에 HRP(horseradish peroxidase)가 태깅된 2차 항체를 반응시킨다.

상기 2차 항체는 당업계 공지된 다양한 방법으로 제조하거나 상업적 루트를 통해 수득할 수 있고, 쥐(rat), 마우스(mouse), 토끼, 원숭이, 사람, 염소 등 포유동물 유래인 것을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 마우스(mouse) IgG 2차 항체를 사용할 수 있다. 2차 항체의 농도는 1 μg/ml 이상인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게 1-10μg/ml 이나, 이에 제한되지 않는다.

(S2) 단계를 수행하고 일정 시간 경과한 후, 1차 항체에 결합하지 않은 2차 항체는 모두 제거하는 단계를 포함하여, 1차 항체에 결합한 2차 항체만 남길 수 있다.

(S3) 단계에서 상기 HRP가 태깅된 2차 항체에 반응완충용액을 가하여 정상상태에서의 진동수(F₁)를 얻는다.

상기 2차 항체에 반응완충용액을 가하면 어떠한 반응도 일어나지 않는다. 정상상태가 되기 위한 일정시간 경과 후, 예컨대 5-20분 후에 정상상태에서의 진동수(F₁)를 측정한다.

상기 반응완충용액은 0.0001-0.15 M의 pH 5.8-8.0 인산완충용액인 것이 바람직하다. pH 5.8 미만 또는 pH 8.0 초과에서는 완충능력이 떨어지고, 본 발명자들은 0.1 M 이온강도의 경우 수정진동자 센서 칩의 센서반응이 높은 반면 0.2 M 이온강도에서는 센서반응이 아주 낮아 센서감도를 저해함을 확인하였는바, 반응완충용액의 농도는 0.0001-0.15 M인 것이 바람직하다.

(S4) 단계에서 상기 HRP가 태깅된 2차 항체에 DAB/H₂O₂ 기질 용액을 반응시켜 정상상태에서의 진동수(F₂)를 얻는다.

2차 항체에 태깅된 HRP과 DAB(3,3'-diaminobenzidine)/H₂O₂ 기질 용액 간에 효소-기질 반응이 일어나, 산화 및 중합과정을 거치면서 2개의 물 분자(2H₂O)가 떨어져 나가고 불용성 침전물이 생기게 되며 이 물질이 전극 표면에 침전된다. 상기 침전될 때 나타나는 질량축적(mass deposition)에 의해 신호증폭을 일으켜 전극 표면의 진동수가 변화한다. 진동수 변화 값은 하기 식에 따른다:

Δf = -2.3 × 10^-6f²Δm/A

여기에서, Δf, QCM의 공명진동수 변화; f, QCM의 공명진동수; A, QCM상의 고정화 면적; Δm, 질량축적

본 발명자들은 동일한 조건에서, DAB 대신에 HRP의 기질로 당업계에 공지된 CN(4-chloro-1-naphthol)을 사용하여 메탈로티오닌을 검출하는 실험을 수행하였으나, 진동수 변화가 거의 감지되지 않았다(도 6 및 7 참고). 이에 대해, 본 발명자들은 CN의 경우 그 자체의 분자량이 낮고 시간에 따른 안정성이 떨어지는 반면, DAB의 경우 HRP에 의하여 산화된 후 아민기(amine group)에서 유래한 -N=N- 결합에 의하여 다이머가 형성되어 분자량이 증가된 불용성 침전이 형성되고(도 4 참조), 이것이 신호증폭을 크게 증대시킨 것으로 예상하였다. 또한, DAB의 경우 특히 분자내 아민기가 네 개이기 때문에 산화반응이 추가로 일어나 산화된 다이머로부터 불용성의 테트라머 및 올리고머가 형성될 수 있고 이로 인해 신호증폭에 현저한 효과를 발휘할 수 있는 것으로 예상하였다.

DAB/H₂O₂ 기질 용액의 농도가 높아질수록 더욱 큰 진동수 변화를 나타내며 (도 9 참조), 바람직하게 0.1 mM이상, 더욱 바람직하게 0.1-20 mM일 수 있다.

충분한 효소-기질 반응을 거쳐 정상상태가 되기 위한 일정시간 경과 후, 예컨대 5-30분 후에 정상상태에서의 진동수(F₂)를 측정한다.

(S5) 단계에서 상기 (S3)단계에서 얻은 진동수(F₁)와 상기 (S4)단계에서 얻은 진동수(F₂)로부터 진동수 변화(ΔF = F₁ - F₂)를 측정한다.

진동수 변화를 측정함으로써 시료 내 메탈로티오닌의 존부를 알 수 있을 뿐만 아니라, 진동수 변화와 시료 내 메탈로티오닌의 농도는 반비례하는바 정량분석이 가능하다.

본 발명에 따르면, 검출한계(limit of detection, LOD) 0.1 ng/ml 까지 검출할 수 있어 고감도 검출 효과를 가진다(도 11 참조).

본 발명에 따른 방법은 일례로 도 3에 도시된 수정진동자 계측 시스템을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 이외에 dip cell을 이용하는, 반응 cell의 부피가 보다 큰 시스템과 연속형 시스템으로서 flow형 시스템을 이용하여 수행할 수도 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다.　 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 센서반응 측정을 위한 계측 format

수정진동자 센서반응을 위한 계측 format으로서 원리적 측면에서 직접결합방식(direct-binding mode, Fig. 1A)과 간접경합방식(competitive mode, Fig. 1B)을 생각할 수 있으나 경합방식의 계측 format을 채택하였다.

실시예 2. 반응완충용액의 결정

용액 상 수정진동자 계측 시의 측정조건 설정과 관련하여 가장 고려해야 할 점은 시료의 점도가 센서 칩의 진동특성에 미치는 영향을 배제하는 것이며 이를 위해서는 사용되는 반응완충용액의 몰 농도를 최적의 상태로 유지하여 주어야 한다. 반응완충용액과 관련해서는 인산완충용액이 높은 완충능력(buffering capacity)으로 인하여 중성근처 pH 대역에서 가장 높은 완충특성을 보여주며 수정진동자의 반응용매로서 적절하므로 본 연구에서는 pH 7.0의 인산완충용액을 반응완충용액으로 선정하였다. 그러나 반응완충용액의 이온강도(ionic strength)가 0.1 M 이하로 낮아지게 되면 시료첨가 시 센서반응에 크게 영향을 주었으므로 반응완충용액의 몰 농도를 0.1 M 이상의 이온강도로 유지하고자 하였다. 도 2에는 수정진동자 센서 칩이 장착된 batch형 반응 셀 내의 pH 7.0 인산완충용액의 이온강도를 0.1 및 0.2 M로 조절하고 메탈로티오닌과 항체의 면역반응 결과로써 나타나는 센서반응을 비교한 결과가 표시되어 있다. 그림에서처럼 동일농도의 시료(analyte)를 첨가하였을 때 0.1 M 이온강도의 경우 센서반응이 높은 반면, 0.2 M 이온강도에서는 센서반응이 아주 낮아 이온강도를 무작정 높이는 것은 오히려 센서감도를 저해함을 알 수 있었다. 이와 같은 사실은 센서반응의 안정성과 센서감도를 고려하여 사용되는 반응완충용액의 이온강도를 조절해야 함을 시사하며 이로부터 본 연구에서는 메탈로티오닌(metallothionein, MT) 측정을 위한 반응완충용액의 이온강도로서 0.1 M을 최종 선정하여 이 후의 실험에 적용하였다.

실시예 3. 수정진동자 계측 시스템

Batch형의 수정진동자 면역센서 측정장치를 도 3과 같이 구성하여 실험을 행하였다. 이때 면역반응은 well cell(도 3의 b)내에서 행하여졌으며 cell 용량은 600μL이었고 반응완충용액(reaction buffer)으로는 매트릭스 효과를 고려하여 0.1 M 인산나트륨 버퍼(pH 7.0)를 사용하였다. 일반적인 반응과정은 반응 cell에 반응완충용액 270 μL를 가한 후 baseline이 안정되면 공명진동수 (resonant frequency)를 측정하여 F₁으로 하고 이 후 DAB(10mM) 30 μL를 가하여 면역반응에 의한 진동수 profile의 변화를 확인한 후 baseline이 안정되면 공명진동수 F₂를 측정하였으며 센서반응은 ΔF = F₁ - F₂로서 나타내었다.

실시예 4. 표면침전에 의한 신호증폭현상을 활용한 메탈로티오닌 검출(도 4)

실시예 4-1. sulfo-LC-SPDP 기반 가교화법에 따른 메탈로티오닌 고정화 단계

수정진동자상의 금 전극에 메탈로티오닌을 고정화시키기 위하여 Sulfo-LC-SPDP 고정화법을 사용하였다. 보다 구체적으로, 금 전극 세척을 위하여, 금 전극을 1.2M NaOH(700μl)에 5분 침지하고 D.W로 헹군 후 1.2M HCl(700μl)에 5분 재침지한 후 다시 D.W로 헹궜다. 그 다음, 금 전극 한쪽 면에 20μl씩 conc. HCl를 로딩(loading)한 후 1분 반응시키고 D.W로 헹궜다. 그리고 킴와이프스 위에 금 전극을 놓고 실온건조하였다.

또한, 1mg/ml 농도의 MT 항원(Zn metallothionein) 6μl (0.1M PBS pH 7.0)을 준비하고, 이를 HPLC water에 sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate)를 녹여 제조한 20mM sulfo-LC-SPDP 6μl와 섞어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 0.1M 소듐 아세테이트 버퍼(pH 4.5)에 디티오트레이톨을 녹여 만든 15mg/ml 디티오트레이톨 4μl를 섞어 실온에서 30분 반응시켜, 고정화 용액을 제조하였다.

제조한 고정화 용액을 금 전극 위에 7μl씩 로딩한 후 1시간 반응시키고 D.W로 헹군 다음 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 다시 헹구고, 메탈로티오닌이 고정화된 금 전극 위에 1% BSA(Albumin from bovine serum, A7638. 시그마) 용액을 로딩하고 1시간 동안 반응시켜 메탈로티오닌이 고정화되지 않은 것은 1% BSA로 블로킹(blocking)하였다.

실시예 4-2. 시료 내 메탈로티오닌 검출 단계

(1) 1차 항체와 시료(analyte) 반응

1mg/ml MT 항원이 고정된 칩을 셀에 고정시키고, PBS pH 7.0 (0.1M Sodium phosphate buffer) 270μl를 넣은 다음, baseline과 상관없이 100μg/ml MT 항체(1차 항체, 1:10배 희석률) 18μl와 0.2ng/ml analyte 18μl를 섞은 뒤(pre-incubation: 5분) 이 중에서 30μl를 30분 동안 금 전극에 로딩하였다. (로딩 농도= MT 항체 : 50μg/ml(1:20), analyte : 1ng/ml) 용액을 모두 제거한 후, PBS pH 7.0 (0.1M Sodium phosphate buffer)로 3번 헹궜다.

(2) 2차 항체 반응

PBS pH 7.0 (0.1M Sodium phosphate buffer) 270μl를 넣은 다음, baseline과 상관없이 20배 희석한(100μg/ml) mouse igG secondary antibody (2차 항체) 30μl를 넣고 30분 동안 반응시켰다. 용액을 모두 제거한 후, PBS pH 7.0 (0.1M Sodium phosphate buffer)로 3번 헹궜다.

(3) 기질 DAB 반응

PBS pH 7.0 (0.1M Sodium phosphate buffer) 270μl를 넣고 baseline이 잡히면 진동수 F₁을 측정하고기질용액 DAB(10mM) 30μl를 넣고 반응시켜 면역반응에 의한 진동수 profile의 변화를 확인한 후 baseline이 안정되면 진동수 F₂을 측정하였다.

대조군으로는 1차 항체를 1:10배 희석(100μg/ml)한 18μl 및 버퍼 18μl을 혼합하고 이 중에서 30μl을 취하여 로딩시킨 후 2차 항체 반응과 기질 DAB 반응을 행하여 실험하였다.

실시예 5. 1차 항체 농도의 결정

수정진동자 면역센서 측정장치의 well cell에 1 mg/ml 메탈로티오닌 이 sulfo-LC-SPDP 기반 가교화법에 의하여 고정된 센서 chip을 장착하고 여기에 정제 메탈로티오닌 항체를 농도별로 결합시킨 결과(도 5, 표 1_항체 농도에 따른 진동수 값), 항체농도가 높아질수록 센서반응이 커지는 것을 알 수 있었다. 메탈로티오닌 항체 대신 반응완충용액을 가했을 때는 반응이 없었고 메탈로티오닌과 그 항체의 결합 시 농도의존성이 존재함을 알 수 있었으며 이때 경제성을 고려한 1차 항체의 최적농도로서 5 μg/ml를 선정하였다.

^a Mean±SD(n=7).

실시예 6. HRP에 대한 기질 선정

실시예 6-1. 4-클로로-1-나프톨 기반 표면침전에 의한 신호증폭 실험

1 mM 3-mercaptopropionic acid(MPA)에 24시간 침지시켜 SAM을 형성한 후 EDC/NHS를 이용하여 carboxyl group을 활성화시켜 0.5 mg/ml 메탈로티오닌 항원을 고정화한 센서 chip에 1차 항체는 5 μg/ml, 2차 항체는 농도별로 1,2,10 μg/ml를 가한 후 기질용액으로 1 mM 4-chloro-1-naphthol을 반응시켰으나 뚜렷한 변화가 없어 MPA 농도와 항원농도를 각각 10 mM, 1 mg/ml로 달리하여 실험했지만 변화가 없었다(표 2_MPA 농도와 MT 항원농도에 따른 진동수 변화, 도 6).

고정화방법을 바꾸어 sulfo-LC-SPDP 고정화법에 의하여 메탈로티오닌 항원을 고정시킨 칩에 1차 항체 및 2차 항체를 결합시키고 기질용액인 1 mM 4-클로로-1-나프톨을 반응시켰지만 센서감응의 큰 변화가 없는 것은 마찬가지였다(도 7).

^a HRP-labeld goat anti-mouse IgG.

^b Mean±SD(n=7).

실시예 6-2. 3,3'-DAB 기반 표면침전에 의한 신호증폭 실험

4-클로로-1-나프톨 대신 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB)을 기질로 바꾸어 실험했다. 1차 항체는 5 μg/ml, 기질용액은 DAB 0.34 mM로 실험조건을 유지하고 2차 항체는 1, 2, 10 μg/ml로 변화를 주어 실험하였을 때 2차 항체의 농도가 증가함에 따라 공명진동수가 떨어지는 것을 볼 수 있었다(도 8, 표 3_2차 항체 농도에 따른 진동수 변화).

^a HRP-labeld goat anti-mouse IgG.

^b Mean±SD(n=7).

기질용액 DAB의 반응을 확인한 뒤 1차 항체는 5 μg/ml, 2차 항체는 10 μg/ml로 일정한 농도로 결합한 후, 4가지 농도의 DAB를 반응시켰다. DAB의 농도가 높아질수록 더욱 큰 진동수 변화를 나타냈다(도 9, 표 4). 즉, 기질로써 4-클로로-1-나프톨을 사용한 경우는 반응을 보이지 않고, 기질로써 DAB를 사용한 경우는 2차 항체 농도와 DAB 농도가 변함에 따라 MT 항원과 반응하여 개연성 있는 결과를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이 후의 실험에서는 2차 항체의 농도는 10 μg/ml로 하였다.

DAB 농도에 따른 진동수 변화
DAB/H₂O₂ (μM)	Response (Hz)
100	-3.8 ± 10.8^a
250	311.3 ± 0.7
500	262.3 ± 1.4
1000	454.7 ± 1.5
2000	982.8 ± 4.4

^aMean ± SD(n=7).

실시예 7. 3,3'-DAB 기반 표면침전 간접경합법에 의한 메탈로티오닌 검 출

코팅항원으로서 메탈로티오닌을 1 mg/ml 농도로 sulfo-LC-SPDP법에 의하여 고정화한 후 1차 항체로써 메탈로티오닌에 대한 항체와 메탈로티오닌을 1 : 1(v/v)로 섞은 후 5분 후에 반응 cell에 가하여 경합반응시켰으며, 이때 cell 내의 1차 항체농도는 5 μg/ml로 조정하였다. 이 후 2차 항체를 10 μg/ml 농도로 가하여 반응시킨 후 반응 기질인 DAB를 1 mM 농도로 첨가하고 센서반응을 측정한 결과는 표 5와 같으며 메탈로티오닌 농도에 따른 반응 profile은 도 10과 같다. 아울러 메탈로티오닌 농도에 따른 센서반응을 보통척도와 단일로그 및 이중로그척도로 도시하여 도 11과 같은 결과를 얻었는데, 이로부터 센서의 검출한계(limit of detection, LOD)가 0.1 ng/ml 수준임을 알 수 있었다 (표 5_MT 농도에 따른 센서반응).

^a Mean±SD(n=7~35).

Claims

(S1) 수정진동자(quartz crystal microbalance, QCM) 칩의 전극 표면에 고정화된 메탈로티오닌과 시료를 메탈로티오닌에 대한 1차 항체에 대해 경합반응시키는 단계;
(S2) 상기 고정화된 메탈로티오닌에 결합된 1차 항체에, 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 태깅된 2차 항체를 반응시키는 단계;
(S3) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 반응완충용액을 가하여 정상상태에서의 진동수(F₁)를 얻는 단계;
(S4) 상기 1차 항체에 결합된, HRP가 태깅된 2차 항체에 3,3'-디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine, DAB)/H₂O₂ 기질 용액을 반응시켜 정상상태에서의 진동수(F₂)를 얻는 단계; 및
(S5) 상기 (S3)단계에서 얻은 진동수(F₁)와 상기 (S4)단계에서 얻은 진동수(F₂)로부터 진동수 변화(ΔF = F₁ - F₂)를 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 메탈로티오닌의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 고정화된 메탈로티오닌의 고정화는 메탈로티오닌: 설포석신이미딜 6-[3-{2-피리딜디치오}프로피온아미도]헥사노에이트: 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 1 : 0.5-1.5 : 0.1-1.1의 부피비로 혼합한 용액을 상기 수정진동자 칩의 전극 표면에 반응시켜 얻어지는 것에 특징이 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응완충용액은 0.0001-0.15 M의 pH 5.8-8 인산완충용액인 것에 특징이 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 검출한계는 시료 내 메탈로티오닌의 농도가 0.1 ng/ml 인 것에 특징이 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 고정화된 메탈로티오닌의 농도는 1 mg/ml 이상, 상기 1차 항체의 농도는 5 μg/ml 이상, 상기 2차 항체의 농도는 10 μg/ml 이상, 또는 상기 DAB/H₂O₂ 기질 용액의 농도는 0.1 mM 이상인 것에 특징이 있는, 방법.