KR20120115348A - 혈관 내피 성장 인자 (ｖｅｇｆ) 수용체의 억제제 및 그의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체의 엑토도메인 (D7)의 최대 막-근접 Ig-유사 도메인에 결합하여 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 모이어티를 제공한다.
[대표도]
도 1a

Description

혈관 내피 성장 인자 (ＶＥＧＦ) 수용체의 억제제 및 그의 사용 방법 {INHIBITORS OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) RECEPTORS AND METHODS OF USE THEREOF}

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본 출원은 2009년 12월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 61/290,789 (그의 전체 내용이 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에 관한 것으로, 이를 우선권 주장한다.

<연방정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술>

본 발명은 미국 국립보건원에 의해 부여된 협정 R01-AR 051448, R01-AR 051886 및 P50 AR054086 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가질 수 있다.

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 VEGF-수용체 (VEGFR) 패밀리의 3가지 구성원에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 혈관 및 림프관 발생 및 조혈을 조절한다 (문헌 [Olsson et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 7(5):359-371 (2006)]). VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) 및 VEGFR3 (Flt4)은 7개의 Ig-유사 도메인 (D1-D7), 티로신 키나제 활성을 갖는 단일 막횡단 (TM) 헬릭스 및 세포질 영역 및 추가의 조절 서열로 구성된 큰 세포외 영역을 함유하는 패밀리인 유형-V RTK의 구성원이다. VEGFR 엑토도메인의 제2 및 제3 Ig-유사 도메인, 예를 들어 D2 및 D3은 시토카인의 VEGF 패밀리의 5개의 구성원 (즉, VEGF-A, B, C, D 및 태반 성장 인자 (PlGF))에 대한 결합 부위로 기능한다 (문헌 [Barleon et al., J. Biol. Chem., 272(16):10382-10388 (1997); 및 Shinkai et al., J. Biol. Chem., 273(47):31283-31288 (1998)]). 이들 성장 인자는 공유결합에 의해 연결된 동종이량체이다. 각각의 프로모터는 구조 지정된 시스테인-노트(knot) 성장 인자에서 역평행 방식으로 배열된 4 가닥 β-시트로 구성된다 (문헌 [Weismann et al., Cell, 91(5):695-704 (1997)]). 시토카인의 시스테인-노트 패밀리의 다른 구성원은 신경 성장 인자 (NGF) 및 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)를 포함한다. 그러나, RTK (유형-III)의 PDGFR 패밀리의 엑토도메인은 5개의 Ig-유사 반복부로 구성되고, 여기서 D1, D2 및 D3은 PDGFR 및 패밀리의 다른 구성원 (즉, KIT, CSF1R 및 Flt3)의 리간드 결합 영역으로 기능한다. 구조적 및 생화학적 실험은 세포외 영역에의 SCF 결합이 이웃하는 KIT 분자의 2개의 막 근접 Ig-유사 도메인 D4 및 D5 사이의 동형 접촉으로 이어지는 단계인 KIT 이량체화를 유도한다는 것을 보여주었다 (문헌 [Yuzawa et al., Cell, 130(2):323-334(2007)]). 야생형 및 종양원성 KIT 돌연변이체의 생화학적 연구는 동형 D4 및 D5 접촉이 KIT 이량체의 세포질 영역을 트랜스-자가인산화, 키나제 활성화 및 세포 신호전달을 용이하게 하는 거리 및 배향으로 배치하는데 결정적인 역할을 수행한다는 것을 보여주었다. 그러나, VEGF 수용체의 구조를 보다 잘 특성화할 필요가 존재한다. 이러한 특성화는 약물, 제약 또는 다른 생물제제로 표적화될 수 있는 영역의 유익한 확인으로 이어질 것이다.

<발명의 개요>

본 발명은 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체), 예를 들어 VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) 및 VEGFR3 (Flt4)의 엑토도메인에 결합하는 모이어티, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 소분자, 펩티드성 분자, 압타머 및 애드넥틴을 제공한다. 본 발명의 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킴으로써 VEGF 수용체의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 단량체 상태로 고정시킨다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인의 이량체화를 허용하지만, 2개의 단량체의 Ig-유사 도메인 (예를 들어, VEGF 수용체의 D7-D7 도메인) 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미침으로써 VEGF 수용체의 활성을 억제한다. 즉, 모이어티는 VEGF 수용체 엑토도메인의 리간드 유도된 이량체화를 허용할 수 있으나, 세포 표면 인터페이스 내의 2개의 엑토도메인의 배치에 영향을 미치거나 또는 VEGF 수용체의 입체형태적 변화를 변경 또는 방지함으로써 VEGF 수용체의 활성을 억제한다 (예를 들어, 수용체 내재화를 억제하고/거나 수용체의 티로신 자가인산화를 억제하고/거나 수용체가 하류 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 억제함). 본 발명은 적어도 부분적으로 VEGF2 수용체의 엑토도메인의 일부의 결정 구조의 판독에 기초한다. 이 결정 구조의 판독은 본 발명의 모이어티가 표적화할 수 있는 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프의 확인을 허용한다.

본 발명은 또한 적어도 부분적으로 이웃하는 수용체 사이의 동형 D7 상호작용이 수용체 이량체화에서 소정의 역할을 수행하기 보다는 티로신 키나제 활성화를 일으키는 이들의 세포질 도메인 사이의 상호작용을 가능하게 하는 거리 및 배향으로 2개의 수용체의 막 근접 영역을 정확하게 배치하는데 필요하다는 발견에 기초한다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체)의 엑토도메인에 결합하는 모이어티를 제공하고, 여기서 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킴으로써 VEGF 수용체의 활성을 길항한다. 한 실시양태에서, 모이어티는 인간 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인에 결합한다. 한 실시양태에서, Ig-유사 도메인은 리간드의 VEGF 수용체에의 결합에 관여하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, Ig-유사 도메인은 리간드의 VEGF 수용체에의 결합에 관여한다. 한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체 및 VEGF 수용체에 대한 리간드 사이의 상호작용을 차단하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체 및 VEGF 수용체에 대한 리간드 사이의 상호작용을 차단한다. 한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 이량체화를 방지하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 이량체화를 방지한다.

한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 각각의 프로모터로부터의 엑토도메인의 막 근접 영역 사이의 상호작용을 방지한다. 또 다른 실시양태에서, 상호작용은 동형이다. 또 다른 실시양태에서, 상호작용은 이형이다.

한 실시양태에서, 엑토도메인의 막 근접 영역은 VEGF 수용체의 제7 Ig-유사 도메인 (D7)이다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158), 여기서 L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고, X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, Φ는 발린이고; X₁은 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 각각의 프로모터로부터의 엑토도메인의 막 근접 영역을 약 16Å, 17Å, 18Å, 19Å 또는 20Å 초과의 거리로 분리시킨다. 한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킨다.

한 실시양태에서, VEGF 수용체는 VEGFR1 (Flt1)이다. 또 다른 실시양태에서, VEGF 수용체는 VEGFR2 (KDR/Flk1)이다. 또 다른 실시양태에서, VEGF 수용체는 VEGFR3 (Flt4)이다.

또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR2의 아미노산 잔기 Asp731에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726 및 Asp731에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR2의 아미노산 잔기 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732 및 733으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 모이어티는 상기 아미노산 잔기 중 어느 하나의 1Å, 2Å, 3Å, 4Å 또는 5Å 내에서 결합할 수 있다.

한 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR1의 아미노산 잔기 Asp725에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720 및 Asp725에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR1의 아미노산 잔기 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726 및 727로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 모이어티는 상기 아미노산 잔기 중 어느 하나의 1Å, 2Å, 3Å, 4Å 또는 5Å 내에서 결합할 수 있다.

한 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR3의 아미노산 잔기 Asp742에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGFR3의 아미노산 잔기 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743 및 744로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 모이어티는 상기 아미노산 잔기 중 어느 하나의 1Å, 2Å, 3Å, 4Å 또는 5Å 내에서 결합할 수 있다.

한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 아미노산 잔기 Arg726 및 Asp731; Arg 720 및 Asp 725; 또는 Arg737 및 Asp742를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 모이어티는 상기 입체형태적 에피토프의 1Å, 2Å, 3Å, 4Å 또는 5Å 내에서 결합할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의 ⁷²⁵RRVRKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 상기 에피토프 중 어느 하나의 1Å, 2Å, 3Å, 4Å 또는 5Å 내에서 결합할 수 있다.

한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 리간드 유도된 티로신 자가인산화를 차단한다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 리간드 유도된 내재화를 차단한다.

한 실시양태에서, VEGF 수용체의 엑토도메인에 결합하는 모이어티는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 키메라 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 쇄 Fv 단편, SMIP, 아피바디, 아비머, 나노바디 및 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인에 1 x 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-9 M 이하로 이루어진 군으로부터 선택된 KD로 결합한다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 VEGF 수용체의 엑토도메인에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 생성하는 하이브리도마를 제공한다.

한 실시양태에서, VEGF 수용체의 엑토도메인에 결합하는 모이어티는 소분자이다. 또 다른 실시양태에서, 소분자는 VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726 또는 Asp731 중 적어도 하나에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 소분자는 VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720 또는 Asp725 중 적어도 하나에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 소분자는 VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737 또는 Asp742 중 적어도 하나에 결합한다.

또 다른 실시양태에서, VEGF 수용체의 엑토도메인에 결합하는 모이어티는 펩티드성 분자이다. 한 실시양태에서, 펩티드성 분자는 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인을 기반으로 하여 설계된다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드성 분자는 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인을 기반으로 하여 설계된다. 한 실시양태에서, 펩티드성 분자는 구조: L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158)를 포함하고, 여기서 L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고, X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, Φ는 발린이고; X₁은 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 펩티드성 분자는 인간 VEGFR2의 아미노산 잔기 724-733, 678-683, 684-690, 691-697, 706-712, 713-716, 717-719, 720-724 또는 725-734와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 구조를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드성 분자는 인간 VEGFR1의 아미노산 잔기 718-727, 672-677, 678-684, 685-691, 700-706, 707-710, 711-713, 714-718 또는 719-728과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 구조를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드성 분자는 인간 VEGFR3의 아미노산 잔기 735-744, 689-694, 695-701, 702-708, 717-723, 724-727, 728-730, 731-735 또는 736-745와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 구조를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 펩티드성 분자는 적어도 하나의 D-아미노산 잔기를 포함한다.

한 실시양태에서, VEGF 수용체의 엑토도메인에 결합하는 모이어티는 애드넥틴이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 모이어티를 제공하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 VEGFR2의 잔기 Arg726 및 Asp731; VEGFR1의 잔기 Arg720 및 Asp725; 또는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726 및 Asp731; VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720 및 Asp725; 또는 VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 모이어티를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 VEGF 수용체의 엑토도메인에 결합하는 모이어티 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 발명의 모이어티를 투여하여 VEGF 수용체 관련 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 대상체에서 VEGF 수용체 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, VEGF 수용체 티로신 키나제 관련 질환은 암, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 당뇨병성 망막병증, 림프계의 질환 및 통증 관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 암은 GIST, AML, SCLC, 신암, 결장암, 유방암, 림프암 및 그의 성장이 기질에 의해 지지되는 다른 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 측면에서, 본 발명은 VEGF 수용체를 후보 모이어티와 접촉시키는 것; VEGF 수용체를 VEGF 수용체에 대한 리간드와 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 것; 및 모이어티가 리간드 유도된 이량체 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미치는지 여부를 결정하여 VEGF 수용체의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인에 결합하는 모이어티를 확인하는 것을 포함하는, VEGF 수용체의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인에 결합하는 모이어티를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킨다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 제7 Ig-유사 도메인 (D7)에 결합한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 VEGFR2의 잔기 Arg726 및 Asp731을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 VEGFR1의 잔기 Arg720 및 Asp725를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 VEGFR2의 아미노산 잔기 724-733에 결합하여 VEGFR2의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 VEGFR1의 아미노산 잔기 718-727에 결합하여 VEGFR1의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 VEGFR3의 아미노산 잔기 735-744에 결합하여 VEGFR3의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 인간 VEGFR2의 Arg726 및 Asp731로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하여 인간 VEGFR2의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VEGFR1의 Arg720 및 Asp725로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하여 인간 VEGFR1의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 VEGFR3의 Arg737 및 Asp742로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하여 인간 VEGFR3의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역에 결합하는 모이어티를 제공하고, 여기서 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킴으로써 수용체 티로신 키나제의 활성을 길항한다. 한 실시양태에서, Ig-유사 도메인은 리간드의 수용체 티로신 키나제에의 결합에 관여할 수 있거나 또는 관여하지 않을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 모이어티는 수용체 티로신 키나제 및 수용체 티로신 키나제에 대한 리간드 사이의 상호작용을 차단할 수 있거나 또는 차단하지 않을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 이량체화를 방지할 수 있거나 또는 방지하지 않을 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 리간드 유도된 수용체 이량체화를 방지하지 않을 수 있으나, 수용체 티로신 키나제 활성화에 요구되는 막 근접 영역 사이의 동형 또는 이형 상호작용을 방지할 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 각각의 프로모터로부터의 엑토도메인의 막 근접 영역 사이의 동형 또는 이형 상호작용을 방지한다. 예를 들어, 본 발명의 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 각각의 프로모터로부터의 엑토도메인의 말단 (원형질 막과 가장 가까운 엑토도메인의 말단)을 약 15Å, 약 20Å, 약 25Å, 약 30Å, 약 35Å 또는 약 40Å 초과의 거리로 분리시킬 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제는 유형 III 수용체 티로신 키나제, 예를 들어 Kit, PDGFRα, PDGFRβ, CSF1R, Fms, Flt3 또는 Flk2이다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티에 의해 결합된 Ig-유사 도메인은 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4 도메인이다. 한 구체적인 실시양태에서, 모이어티는 D4 상호작용 부위에 대해 하기 컨센서스 서열에 결합한다: LX₁RX₂X₃X₄X₅X₆X₇G, 여기서 L은 류신이고, R은 아르기닌이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇은 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 트레오닌, 이소류신, 발린, 프롤린, 아스파라긴, 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 류신, 발린, 알라닌 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 히스티딘, 아스파라긴 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글리신, 발린, 알라닌, 글루탐산, 프롤린 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 트레오닌, 세린, 글루탐산, 알라닌, 글루타민 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₆은 글루탐산, 아스파르트산 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₇은 글리신, 세린, 알라닌, 리신, 아르기닌, 글루타민 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티에 의해 결합된 Ig-유사 도메인은 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D5 도메인, 예를 들어 인간 Kit의 아미노산 잔기 309-413 또는 410-519이다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 D5 상호작용 부위로부터의 보존된 아미노산의 컨센서스 서열에 결합할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 유형 III 수용체 티로신 키나제 D4 또는 D5 도메인의 돌연변이체 또는 유형 V 수용체 티로신 키나제 D7 도메인의 돌연변이체에 결합한다. 구체적인 실시양태에서, 모이어티는 인간 Kit의 돌연변이체 D5 도메인 내의 점 돌연변이에 결합하고, 여기서 돌연변이는 Thr417, Tyr418, Asp419, Leu421, Arg420, Tyr503 및 Ala502로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 유형 III 수용체 티로신 키나제는 인간 Kit이고, 본 발명의 모이어티는 하기 표 4에 나타낸 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 또는 18개 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 모이어티는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, I371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431 또는 G432. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371 및 Y373으로 이루어진 군으로부터 선택된 Kit 수용체 내의 아미노산 잔기 중 적어도 하나 또는 Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390으로 이루어진 군으로부터 선택된 Kit 수용체 내의 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합한다. 본 발명의 모이어티는 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 모두에 결합할 수 있거나 또는 이들은 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 당업자는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티가 다른 유형 III RTK에서 상기 열거된 것에 상응하는 잔기, 예를 들어 유사한 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 또는 구조 정렬 또는 서열 정렬에 의해 동일한 위치에 있는 것에 용이하게 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 인간 Kit의 아미노산 잔기 ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 인간 Kit의 아미노산 잔기 ⁴¹⁸Tyr 및/또는 ⁵⁰⁵Asn에 결합한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 PDGFRα 또는 PDGFRβ 수용체에 결합한다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 인간 PDGFRβ의 아미노산 잔기 ³⁸⁵Arg 및/또는 ³⁹⁰Glu, 또는 PDGFRα에서 상응하는 잔기에 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 유형 III RTK 상의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 구체적인 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 유형 III RTK, 예를 들어 인간 Kit 수용체 또는 PDGF 수용체로부터의 D3, D4 또는 D5 도메인 또는 힌지 영역으로부터의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 추가의 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 표 4에 열거된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 잔기, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 또는 18개 이상의 아미노산 잔기로 구성된 인간 Kit 수용체 내의 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206. V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합한다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 하기 아미노산 군 중 하나로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다: P206, F208, V238, 및 S239; K127, A207, F208, 및 T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, 및 I371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, 및 D398; K218, A219, S220, N367, E368, 및 S369; K218, A220, E368, 및 S369; G384, T385, T411, K412, E414, 및 K471; Y408, F433, G470, K471, 및 L472; F324, V325, N326, 및 N410;D327, N410, T411, K412, 및 V497; G384, G387, V409, 및 K471; L382, G387, V407, 및 V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269; P206, F208, V238, 및 S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, 및 K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, 및 K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, 및 T390; Y350, R353, 및 F355. 상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 모이어티는 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티를 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나 또는 이들은 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 표 5에 열거된 펩티드로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 구체적인 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 제1 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 제2 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 표 5에 열거된 펩티드의 군으로부터 선택된다. 이에 따라, 본 발명의 모이어티는 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 제1 및 제2 펩티드 군은 다음과 같다: Ala219-Leu222 및 Thr304-Val308; Asp309-Gly311 및 Arg224-Gly226; Thr303-Glu306 및 Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 및 Ser217-Tyr221; Ala339-Pro343 및 Asn396-Val399; Ala339-Pro343 및 Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 및 Val374-His378; Asp357-Glu360 및 Leu377-Thr380; Met351-Glu360 및 His378-Thr389; His378-Thr389 및 Val323-Asp332; Val409-Ile415 및 Ala493-Thr500; Val409-Ile415 및 Ala431-Thr437; Val409-Ile415 및 Phe469-Val473; Val409-Ile415 및 Val325-Asn330; Val409-Ile415 및 Arg381-Gly387; Gly466-Leu472 및 Gly384-Gly388; Val325-Glu329 및 Tyr494-Lys499; Thr411-leu416 및 Val497-Ala502; Ile415-Leu421 및 Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 및 Lys484-Thr488; 및 Ala502-Ala507 및 Gly445-Cys450. 본 발명의 모이어티는 상기 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 VEGF 수용체 패밀리 (유형 V 수용체 티로신 키나제)의 구성원, 예를 들어 VEGFR-1 (Flt1), VEGFR-2 (Flk1) 및 VEGFR-3 (Flt4)인 수용체 티로신 키나제에 결합한다. 본 발명의 모이어티에 의해 결합된 Ig-유사 도메인은, 일부 실시양태에서, VEGF 수용체 패밀리의 구성원의 D7 도메인일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체 패밀리의 구성원의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: IX₁RVX₂X₃EDX₄G, 여기서 I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, E는 글루탐산이고, D는 아스파르트산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 글루탐산, 아르기닌 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 글루탐산 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다 (서열 1).

일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다. 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 IgG1이다. 추가로, 본 발명의 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 부분일 수 있고, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 쇄 Fv 단편, SMIP, 아피바디, 아비머, 나노바디 및 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인에 1 x 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-9 M 이하의 K_D 로 결합한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 Kit의 아미노산 잔기 309-413 및/또는 410-519에 결합하여 인간 Kit의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키고, 인간 Kit의 활성을 길항한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 생성하는 하이브리도마를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 소분자이다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 표 4에 나타낸 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 소분자는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, I371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, 또는 G432. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371 및 Y373으로 이루어진 군으로부터 선택된 Kit 수용체 내의 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합한다. 관련 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390으로 이루어진 군으로부터 선택된 Kit 수용체 내의 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합한다. 당업자는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 소분자가 다른 유형 III RTK에서 상기 열거된 것에 상응하는 잔기, 예를 들어 유사한 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 또는 구조 정렬 또는 서열 정렬에 의해 동일한 위치에 있는 것에 용이하게 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 펩티드성 분자이다. 일부 실시양태에서, 펩티드성 분자는 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인을 기반으로 하여 설계된다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 Kit의 D4 도메인을 기반으로 하여 설계된다. 본 발명의 펩티드성 분자는 보존된 D4 상호작용 부위, 예를 들어 상기 기재된 D4 컨센서스 서열 (LX₁RX₂X₃X₄X₅X₆X₇G), 또는 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4 도메인의 정렬 또는 비교에 의해 생성된 다른 것을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 인간 Kit의 아미노산 잔기 309-413과 적어도 80% 동일한 구조 또는 인간 Kit의 아미노산 잔기 410-519와 적어도 80% 동일한 구조를 포함한다. 펩티드성 모이어티는 또한 Kit의 D5 도메인을 기반으로 하여 설계될 수 있고, 추가의 바람직한 실시양태에서 이는 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D5 도메인의 정렬 또는 비교에 의해 생성된 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 펩티드성 분자는 돌연변이체 D5 도메인의 서열 또는 컨센서스 서열을 기반으로 하여 설계될 수 있다.

본 발명의 펩티드성 모이어티는 본원에서 확인된 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 1-89, 92, 93 및 105-157) 중 어느 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어진 펩티드일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 적어도 하나의 D-아미노산 잔기를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 애드넥틴이다.

또한, 일부 실시양태에서, 본 발명의 소분자 및 펩티드성 분자는 표적 RTK 내의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 소분자 및 펩티드성 분자는 표적 RTK 내의 입체형태적 에피토프가 아닌 에피토프에 결합한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 모이어티 중 어느 하나 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 대상체에서 수용체 티로신 키나제 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 유효량의 본 발명의 모이어티 (예를 들어, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4 또는 D5 도메인, 또는 유형 V 수용체 티로신 키나제의 D7 도메인에 결합하는 모이어티)를 투여하여 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제 관련 질환은 림프 질환 또는 암, 예를 들어 GIST, AML, SCLC, 흑색종, 신암, 결장암, 유방암, 림프암 및 다른 암이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 인간 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D3-D4 및/또는 D4-D5 힌지 영역에 결합하는 모이어티를 유효량으로 투여하여 수용체 티로신 키나제 관련 질환을 치료 또는 예방함으로써, 대상체에서 수용체 티로신 키나제 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제 관련 질환은 암, 예를 들어 GIST, AML, SCLC, 흑색종, 신암, 결장암, 유방암, 림프암 또는 다른 암이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인에 결합하여 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키는 모이어티를 확인하는 방법을 제공한다. 방법은 수용체 티로신 키나제를 후보 모이어티와 접촉시키는 것; 수용체 티로신 키나제를 수용체 티로신 키나제에 대한 리간드와 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 것; 및 모이어티가 리간드 유도된 이량체 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미치는지 여부를 결정하여, 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인에 결합하고, 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키는 모이어티를 확인하는 것을 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 유형 III 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키는 모이어티를 확인하는 방법을 제공한다. 방법은 유형 III 수용체 티로신 키나제를 후보 모이어티와 접촉시키는 것; 수용체 티로신 키나제를 수용체 티로신 키나제에 대한 리간드와 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 것; 및 모이어티가 리간드 유도된 이량체 수용체 티로신 키나제의 D4-D4 또는 D5-D5 도메인 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미치는지 여부를 결정하여, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키는 모이어티를 확인하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.

본 특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 유색 도면을 함유하고 있다. 유색 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 요금의 청구 및 납부시에 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1a-e는 Kit 엑토도메인의 결정 구조를 도시한다. 도 1a는 Kit 엑토도메인 단량체의 리본 다이어그램 (왼쪽) 및 표면 표현 (오른쪽)을 보여준다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널에 나타낸 도면의 수직 축을 따라 90° 회전한 도면을 보여준다. D1은 청색으로, D2는 녹색으로, D3은 황색으로, D4는 주황색으로, D5는 분홍색으로 채색되고, N 및 C 말단을 라벨링한다. D1 및 D5 내의 디술피드 결합은 황 원자가 오렌지색으로 채색된 볼-앤드-스틱 렌더링으로 나타낸다. 아스파라긴-연결된 탄수화물은 막대 모델로 나타낸다. 도 1b-e는 D1-D2 (B), D2-D3 (C), D3-D4 (D) 및 D4-D5 (E) 인터페이스의 상세도를 제공한다. 색 코딩은 도 1a에서와 동일하다. 도메인-도메인 상호작용에 참여하는 아미노산을 라벨링하고, 수소 결합은 황색 점선으로 도시한다. 2차 구조 요소는 IgSF 명명법에 따라 지정된다.
도 2a-b는 SCF-Kit 엑토도메인 2:2 복합체의 결정 구조를 도시한다. 도 2a는 SCF-Kit 2:2 복합체의 리본 다이어그램을 보여준다. D1 내지 D5의 색 코딩은 도 1에서와 동일하고, SCF는 마젠타색으로 채색된다. Kit 및 SCF의 N 및 C 말단을 라벨링한다. D1 및 D5 내의 디술피드 결합은 황 원자가 오렌지색으로 채색된 볼-앤드-스틱 렌더링으로 나타낸다. 아스파라긴-연결된 탄수화물은 막대 모델로 나타낸다. 화살표는 SCF-Kit 2:2 복합체 내의 큰 캐비티를 표시한다. 도 2b는 SCF-Kit 엑토도메인 2:2 복합체의 표면 표현을 나타낸다. 이 도면은 상부도 (상부), 전면도 (가운데 왼쪽), 측면도 (가운데 오른쪽) 및 하부도 (하부)를 보여준다. 색 코딩은 A에서와 동일하다. 이들 도면은 SCF 이량체가 2개의 상응하는 Kit 엑토도메인의 D1, D2 및 D3과 대칭적으로 상호작용한다는 것을 보여준다. 또한, Kit 엑토도메인은 2개의 이웃하는 수용체의 D4 (오렌지색) 사이 및 D5 (분홍색) 사이의 측면 접촉을 통한 동형 상호작용을 형성한다.
도 3a-e는 Kit에 의한 SCF 인식을 도시한다. 도 3a는 SCF-Kit 인터페이스의 도면을 보여준다. SCF 및 Kit 엑토도메인에서 매립된 표면 내의 아미노산은 2개의 분자를 떨어뜨려 끌어당김으로써 시각화하였다. 도면은 Kit D1-D2-D3 (왼쪽) 및 SCF (오른쪽)의 분자 표면을 보여준다. 산성 아미노산은 적색으로, 염기성 아미노산은 청색으로, 극성 아미노산은 주황색으로, 소수성 아미노산은 황색으로 나타낸다. Kit 상의 SCF 결합 부위-I, 부위-II 및 부위-III는 원으로 표시한다. 도 3b는 리간드-수용체 인터페이스에서의 정전기 전위의 상보성을 도시한다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널에 제시된 정전기적 표면의 수직 축을 따라 180° 회전시킨 도면을 보여준다. D1-D2-D3의 정전기적 표면 전위를 녹색으로 채색된 결합된 SCF의 카툰 다이어그램의 임프린트를 갖는 분자 표면 상에 중첩시켰다. 오른쪽 패널은 청색 (양성) 및 적색 (음성)으로 채색된 SCF-결합된 Kit의 정전기적 표면 전위를 도시한다. Kit는 시안색으로 채색된 리본 다이어그램의 형태로 나타낸다. 도 3c-e는 SCF-Kit 인터페이스의 부위-I (C), 부위-II (D) 및 부위-III (E)의 확대도를 보여준다. SCF는 녹색으로, Kit는 시안색으로 채색된다. 상호작용 아미노산을 라벨링하고, 수소 결합을 황색 점선으로 도시하고, 2차 구조 요소를 리본 및 가닥 상에 표시한다.
도 4a-c는 Kit에의 결합시 SCF의 입체형태적 변화를 도시한다. 도 4a는 2개의 SCF 프로모터 사이의 각이 Kit 결합시에 변경된다는 것을 보여준다. 도면은 유리 SCF (녹색) 및 Kit에 결합된 SCF (마젠타색)의 카툰 다이어그램을 보여준다. 한 SCF 프로모터의 중첩 (왼쪽)은 헬릭스 αC에 대해 측정된 바와 같이 제2 프로모터 (오른쪽)의 대략 5°의 각도 이동을 나타낸다. 헬릭스를 라벨링하고, 원통형으로 나타낸다. 도 4b는 Kit 결합시에 SCF의 N-말단의 입체형태적 변화를 도시한다. Kit의 부위-III는 분자 표면 (회색)으로 나타내고, 유리 SCF의 N-말단은 녹색으로 나타내고, Kit에 결합된 SCF는 마젠타색으로 나타낸다. Cys4' 및 Cys89' 사이의 디술피드 결합은 황색 구체로 나타낸다. 중요 아미노산을 라벨링하고, 막대 모델로 나타낸다. 도 4c는 Kit의 부위-I에의 결합시에 SCF의 αC-β2 루프의 입체형태적 변화를 도시한다. 색 코딩은 B에서와 동일하다.
도 5a-b는 SCF 결합시 Kit D4 및 D5의 재구성을 도시한다. 도 5a는 SCF-Kit 복합체에서 D4 및 D5의 재구성을 도시한다. Kit 단량체로부터의 D3과 SCF에 결합된 Kit의 D3 (둘 다 청색으로 채색됨)의 중첩은 결합된 형태의 D4 (적색)가 유리 형태의 D4 (녹색)의 위치에 대해 22° 이동한다는 것을 보여준다. 이들 2가지 형태의 D4 (둘 다 청색임)의 중첩 (오른쪽 패널)은 SCF-결합된 형태의 D5 (적색)가 유리 형태의 D5 (녹색)의 위치에 대해 27° 이동한다는 것을 보여준다. 2개의 바닥 패널은 단량체 (녹색) 및 동종이량체 수용체(적색) 형태의 D3-D4 및 D4-D5 인터페이스의 힌지 영역의 근접도를 보여준다. 도 5b는 도 2에서와 동일한 배향으로 도시한 SCF 점유 Kit의 D4 및 D5의 표면 표현 (상부 패널)을 보여준다. 흑색 외곽선은 리간드 결합 영역에 대한 SCF 결합에 의해 가교된 Kit 엑토도메인 단량체의 D4 및 D5의 위치를 보여준다. D4 및 D5의 재구성은 2개의 이웃하는 엑토도메인의 C-말단을 서로 75Å으로부터 15Å으로 이동시킨다. 하부 패널은 SCF-Kit 복합체의 세포 막으로부터 도면 (하부 도면)을 보여준다. x-축을 따른 90° 회전을 주목한다. D1 내지 D5의 색 코딩은 도 1에서와 동일하다.
도 6a-d는 D4-D4 및 D5-D5 인터페이스의 도면을 도시한다. 도 6a (상부 패널)는 D4-D4 인터페이스의 도면을 보여주는, 1.1σ 수준에서 윤곽이 그려진 2Fo-Fc 전자 밀도 맵을 보여준다. Kit 프로모터의 백본은 각각 분홍색 및 황색 튜브로 표현된다. 2개의 이웃하는 엑토도메인의 D4-D4 인터페이스의 근접도 (하부 패널). 2개의 인접한 D4의 Arg381 및 Glu386 사이에 형성된 쇄간 수소 결합은 황색으로 채색된다. 중요 아미노산을 라벨링하고, 막대 모델로 나타낸다. 2차 구조 요소를 IgSF 명명법에 따라 라벨링한다. 도 6b는 유형-III 및 유형-V RTK 패밀리의 구성원에 걸친 D4-D4 이량체화 모티프의 보존을 도시한다. 인간 Kit의 잔기 370-398 (AAC50969.1) (서열 94)을 마우스 (AAH75716.1) (서열 95), 닭 (NP_989692.1) (서열 96), 크세노푸스 라에비스(xenopus laevis) (AAH61947) (서열 97), 샐러맨더(salamander) (AAS91161.l) (서열 98) 및 제브라피시(zebrafish) 유형 A (서열 99) 및 B (서열 100) (NP_571128, XP_691901) 상동체의 서열과 정렬한다. 또한, 인간 (P07333) (서열 101), 마우스 (P09581) (서열 102) 및 복어 유형 A (서열 103) 및 B (서열 104) (P79750, Q8UVR8)로부터의 CSF1R의 아미노산 서열, 및 인간 (각각 서열 105 및 107) (P16234, P09619) 및 마우스 (각각 서열 106 및 108) (NP_035188, P05622)로부터의 PDGFRα 및 PDGFRβ로부터의 서열을 나타낸다. 인간 VEGFR 유형 1-3의 유형-V RTK의 아미노산 서열 (나타나는 순서대로 각각 서열 109-111) (제7 Ig-유사 도메인) (P17948, P35968 및 P35916)이 또한 제시된다. Kit 상의 2차 구조 요소를 서열 정렬의 상부 위에 라벨링한다. Arg381 및 Lys383, Leu382 및 Leu379, Glu386 및 Gly388의 보존된 잔기를 각각 청색, 황색, 적색 및 녹색으로 채색된다. 도 6c는 D5-D5 인터페이스의 리본 다이어그램을 도시한다. 2개의 인접한 Kit 프로모터의 가닥 A 및 G는 D5-D5 인터페이스의 형성에 참여한다. D5-D5 인터페이스는 2개의 이웃하는 수용체의 Tyr418 및 Asn505 사이의 아마도 이온(들) 또는 물 분자(들)을 통한 측면 상호작용에 의해 유지된다. 도 6d는 Kit의 D4 및 D5의 정전기 전위 표면을 도시한다. 이 도면은 D4-D4 상호작용 표면의 전면도 (오른쪽) 및 수직 축을 따라 90° 회전한 도면 (왼쪽)을 보여준다. 산성 패치 및 D4-D4 인터페이스의 위치를 원으로 표시하고, 상호작용 잔기 Arg381 및 Glu386을 라벨링한다.
도 7a-c는 암 및 다른 질환에 관련된 Kit 엑토도메인 돌연변이 및 Kit 및 다른 RTK 활성화의 메커니즘을 도시한다. 도 7a는 왼쪽 패널에 나타낸 흑백 얼룩 특징을 담당하는 기능 손실 돌연변이를 도시한다. D1 (청색), D2 (녹색) 및 D3 (황색)의 리본 다이어그램 및 SCF의 표면 표현 (회색). 돌연변이된 아미노산은 적색으로 채색된다. GIST, SCLC 및 AML을 담당하는 기능 획득 돌연변이를 오른쪽 패널에 나타낸다. 동종이량체 형태의 D4 및 D5의 표면 표현은 회색으로 채색된다. GIST에서 복제된 Ala502 및 Tyr503을 청색으로 나타내고, Asp419에 근접한 결실 및 삽입 돌연변이 (AML 및 NCLL)를 녹색으로 나타낸다. 활성화 Kit 돌연변이는 D5-D5 인터페이스에 한정된다는 것에 주목한다. 도 7b는 Kit 활성화가 D4-D4 인터페이스에서 점 돌연변이체에 의해 절충된다는 것을 보여준다. D4 내의 야생형 Kit (WT), R381A 또는 E386A 점 돌연변이를 일시적으로 발현하는 HEK293 세포를 지시된 바와 같이 10ng/ml SCF로 6분 동안 37℃에서 자극시켰다 (상부 왼쪽 패널). 자극되지 않은 또는 SCF 자극된 세포의 용해물을 항-Kit 항체로 면역침전 (IP)시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-Kit 또는 항 포스포티로신 (p-Tyr) 항체로의 이뮤노블롯팅 (IB)을 수행하였다. 항-p-Tyr 이뮤노블롯으로부터의 Kit의 티로신 자가인산화의 밀도측정 정량 (상부 오른쪽 패널). 야생형 Kit (WT) 또는 R381A 돌연변이체를 안정하게 발현하는 3T3 세포를 상이한 농도의 SCF로 처리하였다. 자극되지 않은 또는 SCF 자극된 세포의 용해물을 항-Kit 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-Kit 또는 항-p-Tyr 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다 (하부 왼쪽 패널). 천연 SCF를 사용한 세포 결합된 125I-SCF의 변위 검정. WT (■), R381A (▼), R381A/E386A (◆), 또는 키나제 음성 Kit (▲)를 발현하는 3T3 세포를 증가하는 농도의 천연 SCF의 존재하에 125I-SCF로 처리하였다. WT Kit (1.1 nM)를 향한 SCF의 EC50 (c-Kit에 결합된 ¹²⁵I-SCF의 50%를 변위시키는 리간드 농도)은 R381A (1.0 nM), R381A/E386A (0.8 nM) 또는 키나제 음성 Kit 돌연변이체 (1.4 nM)를 향한 SCF의 EC50과 대등하다. 도 7c는 이웃하는 세포의 세포 표면 상에서 발현된 가용성 (왼쪽 패널) 또는 막 앵커링된 (오른쪽 패널) SCF 분자에 의해 구동된 Kit 및 다른 RTK 활성화에 대한 모델을 보여준다. D1-D2-D3 리간드 결합 모듈에의 SCF 결합은 2개의 결합된 Kit 엑토도메인 단량체의 C-말단을 서로 75Å 이내로 가져온다. D3-D4 및 D4-D5 힌지의 가요성은 2개의 이웃하는 엑토도메인의 C-말단을 서로 15Å 이내로 가져오는 측면 D4-D4 및 D5-D5 상호작용을 가능하게 한다. 결과적으로, Kit 세포질 도메인의 증가된 근접성 및 국부 농도는 PTK 활성화를 일으키는 키나제 도메인 내의 조절 티로신 잔기의 자가인산화를 유도한다. (PTK 활성화는 모델에서 도시되지 않음에 주목한다.) 세포 신호전달 분자의 보체의 동원 및 활성화는 세포질 도메인 내의 중요 티로신의 인산화를 따라 진행될 것이다. 모델은 유리 SCF 구조, 리간드-비함유 Kit, SCF-Kit 복합체 및 Kit PTK 구조 (PDB 엔트리 1QZJ, 1R01 및 1T45)에 기초한다. 그의 구조가 결정되지 않은 영역을 2차 구조 예측 (녹색 헬릭스 및 흑색 루프)을 사용하여 모델링하였다. SCF는 마젠타색으로, Kit 엑토도메인은 청색으로, kit PTK는 밝은 청색으로 채색된다.
도 8은 Kit 엑토도메인 구조를 기초로 한, 유형-III RTK의 구조 기반 서열 정렬, 및 유형-III 패킬리 RTK에 대한 리간드의 구조 기반 정렬을 도시한다. 각각의 열은 개별 Ig-유사 도메인의 정렬을 보여준다. 아미노산 서열은 문헌 [Harpaz et al. (1994) J Mol Biol 238: 528-539]에 의해 결정된 바와 같은 IgSF 폴드 특성에 기초하여, 제이프레드(Jpred) (문헌 [Cuff et al. (1998) Bioinformatics 14: 892-893])에 의해 계산된 바와 같은 패밀리 구성원의 2차 구조 예측과 일치하는 범위 내로 수동적으로 정렬하였다. 적색으로 표시된 아미노산은 IgSF 폴드 결정 아미노산을 나타낸다. β 가닥은 화살표에 의해 라벨링되고, α-헬릭스는 서열 위의 스프링에 의해 라벨링되며, 인간 Kit 및 인간 SCF에 대해 넘버링되어 있다. 리간드 결합시에 감소된 용매 접근성을 나타내는 리간드 결합 부위의 잔기는 별표에 의해 표시된다. 부위-I는 흑색으로, 부위-II는 적색으로, 부위-III는 녹색으로 채색된다. SCF에서 상호작용하는 아미노산 잔기를 라벨링하는데 동일한 색 코드를 사용한다. D4-D4 상호작용을 담당하는 D4 EF 루프는 시안색으로 박스 안에 표시한다. 정렬에 사용되는 서열은 다음과 같다: Kit 인간 (AAC50969), Kit 마우스 (AAH75716), CSFR1 인간 (P07333), PDGFRα 인간 (P16234), PDGFRβ 인간 (P09619) 및 Flt3 인간 (P36888). 리간드 구조 정렬의 경우, SCF (1EXZ), CSF (1HMC), Flt3L (1ETE)의 PDB 엔트리를 Lsqman (문헌 [Kleywegt and Jones, 1995])을 사용하여 중첩시킨 한편, SCF 마우스의 서열 (NP_038626)은 ClustalW를 사용하여 인간 SCF에 정렬시켰다. 도면은 나타나는 순서대로 각각 서열 112-147을 개시한다.
도 9는 2:2 SCF-Kit 복합체의 전체적인 구조의 입체도를 제공한다. 2:2 SCF-Kit 복합체의 리본 모델은 입체 표현으로 나타낸다. 관점 및 색 코드는 도 2a에서와 같다.
도 10A-B는 SCF-Kit 복합체의 표면 내의 아미노산 보존을 도시한다. 도 10A는 SCF-Kit 결정 구조 복합체의 색-코딩된 보존 패턴을 보여준다. 시안색으로부터 고동색을 보존된 아미노산에 대한 변수로부터의 라벨링에 사용하였다. 도 10B는 2개의 분자가 서로 떨어지도록 하는 끌어당김에 의한 SCF 및 Kit의 시각화를 보여준다. 부위 I, 부위 II 및 부위 III 및 D4-D4 상호작용 영역 (D4-D4 인터페이스)은 원으로 표시한다.
도 11a-b는 SCF-Kit 인터페이스의 전자 밀도를 도시한다. 도 11a는 2:2 SCF-Kit 복합체의 부위-II의 부분도를 Kit 주위에서 2 σ 수준으로 도시된 2Fo-Fc 전자-밀도 맵으로 보여준다. Kit 주쇄는 라벨링된 측쇄를 제외하고 황색 튜브로 도시한다. 도 11b는 SCF-Kit 인터페이스의 전자 밀도를 도시하고, 이는 유리 Kit의 부분도를 Kit 주위에서 1.5 σ 수준으로 도시된 실험적 맵으로 보여준다. 배향 및 색 코드는 도 12a에서와 동일하다.
도 12a-d는 유리 및 SCF 결합된 Kit로부터의 Ig-유사 도메인의 중첩된 쌍의 도면을 도시한다. 유리 및 SCF 결합된 Kit로부터의 개별 D1, D2, D3 및 D4를 중첩시킨다. Ig-유사 도메인 (a) D1 및 D2, (b) D2 및 D3, (c) D3 및 D4 및 (d) D4 및 D5의 쌍의 구조를 나타내고, 여기서 각각의 쌍에서 중첩된 Ig-유사 도메인은 청색으로 채색되고, 제2 (중첩되지 않음) Ig-유사 도메인은 유리 엑토도메인의 경우 녹색으로 및 SCF 결합된 엑토도메인의 경우 적색으로 채색된다. 이들 도면은 SCF 결합시에 5개의 개별 Kit Ig-유사 도메인 각각의 구조에서 실질적으로 변화가 일어나지 않고, 리간드 결합 유닛으로서의 D1-D2-D3 기능이 SCF 결합을 향해 평형화되었다는 것을 보여준다. 대조적으로, 큰 재배열이 SCF 결합된 Kit에서 D3-D4 및 D4-D5 인터페이스에서 일어난다.
도 13A-B는 SCF-Kit 복합체 구조의 정전기적 표면 전위를 도시한다. 도 13A는 특히 SCF-Kit 2:2 복합체를 보여준다. 도 13B는 SCF-Kit 복합체 구조의 정전기적 표면 전위를 도시하고, 특히 SCF를 SCF-Kit 2:2 복합체로부터 떨어지도록 끌어당긴 후에 Kit의 정전기적 표면 전위의 시각화를 도시한다. 양으로 및 음으로 대전된 표면은 각각 청색 및 적색으로 채색된다. SCF 결합 영역 및 D4-D4 인터페이스는 원으로 표시한다.
도 14는 항 Kit-D5 항체에 의한 SCF-유도된 Kit 활성화의 억제를 도시한다. Kit를 발현하는 3T3 세포를 증가하는 농도의 항-Kit D5 (Kit의 제5 Ig-유사 도메인에 대해 지시됨) 또는 대조군으로서 항-SCF (SCF 리간드에 대해 지시됨), 또는 항-Kit 엑토도메인 (전체 Kit 엑토도메인에 대해 지시됨)과 인큐베이션하였다.
도 15는 재조합 Kit D4를 사용한 SCF 유도된 Kit 활성화의 억제를 도시한다. Kit를 발현하는 3T3 세포를 증가하는 농도의 재조합 Kit-D4와 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 10분 SCF 자극을 수행하였다.
도 16a는 PDGF-유도된 PDGFR 활성화가 D4 내의 점 돌연변이에 의해 방지된다는 것을 입증한다. WT PDGFR 또는 D4 돌연변이체 (R385A 및 E390A)를 발현하는 PDGFR-/- MEF를 밤새 혈청 고갈시키고, 지시된 농도의 PDGF BB로 5분 동안 자극시켰다. 세포 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시킨 후에, SDS-PAGE 및 항-포스포티로신 항체 4G10로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 막을 벗겨내고, 항-플래그 태그 항체로 재블롯팅하여 총 PDGFR 수준을 결정하였다.
도 16b는 PDGFR을 통한 신호전달이 D4 내의 점 돌연변이에 의해 방지된다는 것을 입증한다. WT PDGFR 및 D4 돌연변이체 (R385A 및 E390A)를 발현하는 PDGFR-/- MEF를 밤새 혈청 고갈시키고, 지시된 농도의 PDGF BB로 5분 동안 23 ℃에서 자극시켰다. 동일한 양의 전체 세포 용해물 (TCL)에 대해 SDS-PAGE를 수행하고, 각각 항-포스포-MAPK, MAPK, 포스포-Akt 및 Akt로의 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. 이 실험은 MAPK 반응 및 Akt 활성화가 둘 다 D4 내의 점 돌연변이에 의해 방지된다는 것을 보여준다.
도 16c는 PDGFR 활성화를 방지하는 D4 내의 점 돌연변이가 PDGF-유도된 PDGFR 이량체화를 방해하지 않는다는 것을 입증한다. WT 또는 E390A 돌연변이체를 발현하는 PDGFR-/- MEF를 밤새 혈청 고갈시킨 후에, 지시된 양의 PDGF와 DMEM/50mM Hepes 완충제 (pH7.4) 중에서 90분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 리간드를 제거한 후에, 세포를 0.5mM 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS)와 PBS 중에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 자극되지 않은 또는 자극된 세포의 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 분석 및 항-플래그 항체 (왼쪽 패널) 또는 항-pTyr 항체 (오른쪽 패널)로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다.
도 17은 D3-D4 힌지 영역 내의 캐비티를 보여준다. 여러 개의 캐비티가 엑토도메인 단량체 구조에서 D3-D4 인터페이스 상에 산재되어 있다. 캐비티를 규정하는데 관여하는 아미노산은 표 4 (하기)에 요약된다. 2개의 Kit 수용체 사이의 동형 상호작용의 형성시에, D3-D4 힌지 영역이 변경되어 하기 잔기에 의해 생성된 얕은 캐비티가 형성된다: D3으로부터의 K218, S220, Y221, L222 및 D4로부터의 F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, Y373. 도 17은 비점유 단량체 (a) 및 SCF-결합된 이량체 수용체 (b)의 D3-D4 힌지 영역의 리본 다이어그램 및 D3-D4 포켓의 메쉬 표현을 보여준다.
도 18은 D4-D5 힌지 영역 내의 캐비티를 보여준다. Kit 단량체의 D4의 AB 루프 및 EF 루프, D4-D5 연결 링커 및 D5의 DE 루프 및 FG 루프의 일부에 의해 작은 캐비티가 형성된다. 캐비티를 규정하는 잔기는 표 4 (하기)에 요약된다. 캐비티의 형태 및 크기는 Kit 엑토도메인 이량체 구조에서 변화한다. D4의 EF 루프 및 가닥 G, D4-D5 링커 및 D5의 가닥 B 및 DE 루프에 의해 형성된 주요 캐비티는 D4 동형 인터페이스의 형성에 결정적인 영역인 D4의 EF 루프 아래 위치한다. 캐비티에 가까이 위치한 D5의 DE 루프가 결합되지 않은 및 점유 Kit 구조 둘 다로부터의 전자 밀도의 낮은 품질에 의해 밝혀진 바와 같이 보다 높은 가요성을 가질 수 있다는 것에 주목한다. 도 18은 비점유 단량체 (a) 및 SCF-이량체 수용체 (b)의 리본 다이어그램 및 D4-D5 힌지 영역 주위의 얕은 캐비티의 메쉬 표현을 보여준다.
도 19는 D4 동형 상호작용을 매개하는 영역 내의 캐비티를 보여준다. Kit D4의 CD 루프 및 EF 루프에 의해 형성된 오목한 표면은 D4 동형 인터페이스의 오른쪽 위에 위치한다. D4로부터의 잔기 Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390은 엑토도메인 이량체 구조에서 오목한 표면에 대해 대략 130 A²의 표면적을 제공한다. D4 동형 인터페이스에서 중요한 역할을 수행하는 Glu386의 측쇄는 표면의 중심을 향해 돌출된다. 오목한 표면의 특징적인 특성은 대전된 잔기 (Glu386 및 Lys358)로 둘러싸인 작은 소수성 패치이다. 표면의 크기 미치 접근성은 동형 D4:D4 상호작용시에 변경되며, 함께 도메인의 상부에 대해 위를 향해 폴딩되도록 CD 루프의 형태가 변화한다. 오목한 표면의 형성에 관여하는 잔기는 표 4 (하기)에 요약된다. 아래 도면에서의 패널 A는 리간드-점유 (녹색) 및 비점유 엑토도메인 구조 (적색) 사이의 CD 및 EF 루프의 상이한 입체형태를 갖는 리간드-점유 Kit D4 (나타내지 않음) 상에 오버레이된 Kit의 비점유 D4 도메인 (금색)의 리본 다이어그램을 보여준다. D4:D4 상호작용에 결정적인 잔기는 막대 모델 포맷으로 나타낸다. 패널 B 및 C는 비점유 Kit (도 19b) 및 SCF-점유 Kit 구조 (도 19c)의 리본 다이어그램 및 D4 동형 인터페이스 위의 얕은 캐비티의 메쉬 표현을 보여준다.
도 20은 리간드-결합 D2 및 D3 영역 내의 오목한 표면을 보여준다. 얕은 오목한 표면은 D2 및 D3의 리간드-결합 표면의 일부 상에 위치한다. 작은 포켓에 관여하는 잔기는 D2로부터의 Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 및 F208 및 D3으로부터의 V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269이다. 포켓은 친수성 잔기로 둘러싸인 작은 소수성 패치에 의해 생성된다. 전체적인 매립된 표면적은 대략 500 A²으로, 비점유 및 SCF-점유 Kit 구조 사이에 주요 변경은 존재하지 않는다. 도 a 및 b는 비점유 Kit (a) 및 SCF-결합된 Kit (b)의 리본 다이어그램 및 D2-D3 포켓의 메쉬 표현을 보여준다.
도 21은 PDGF 수용체의 구조-기반 서열 분석 및 막 근접 영역의 상동성 모델링을 보여준다. 도 21a는 PDGFRα, PDGFRβ 및 Kit의 D4의 아미노산 서열 (나타나는 순서대로 각각 서열 148-157)의 정렬을 도시한다. 인간 Kit 구조의 D4의 IgSF 폴드의 중요 잔기의 아미노산 및 Ig-폴드의 코어 잔기는 상응하게 적색 및 녹색으로 채색된다. D4 동형 상호작용을 담당하는 2개의 중요 염기성 및 산성 잔기는 각각 청색 및 적색으로 박스 안에 표시한다. Ig-유사 도메인 (B5 및 F5) 상의 보존된 디술피드 결합-형성 시스테인 잔기에 상응하는 위치를 별표로 표시한다. β-가닥은 Kit 서열 아래 화살표로 라벨링한다. 2차 구조 요소는 IgSF 명명법에 따라 표시한다. 도 21b는 PDGFR의 세포외 도메인의 막 근접 영역의 모델을 도시한다. PDGFRβ 엑토도메인의 막 근접 영역은 백색으로 채색되고, 투명한 분자 표면을 갖는 리본으로 나타낸다 (D4는 주황색으로 채색되고, D5는 분홍색으로 채색됨; 왼쪽 패널). 2개의 이웃하는 PDGFRβ 분자의 D4-D4 인터페이스의 보다 근접한 도면 (오른쪽 패널)은 D4 사이의 상호작용이 2개의 인접한 EF 루프로부터 돌출된 잔기 Arg385 및 Glu390에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 중요 아미노산을 라벨링하고, 막대 모델로 나타낸다.
도 22는 PDGF-유도된 PDGFR 활성화가 D4 내의 돌연변이에 의해 절충된다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한다. 도 22a는 PDGFRβ의 PDGF-유도된 티로신 자가인산화가 PDGFRβ의 E390A, R385A, RE/AA 및 RKE/AAA 돌연변이체를 발현하는 세포에서 강하게 절충된다는 것을 입증하는 실험의 결과를 보여준다. 도 22b는 야생형 및 돌연변이체 PDGFRβ의 변위 곡선을 보여주는 그래프이다. IC50 값은 Prism4로의 곡선 핏팅에 의해 결정하였다. 도 22c는 R385A, E390A 또는 RE/AA 돌연변이가 PDGFR의 내인성 티로신 키나제 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 이뮤노블롯팅으로부터의 결과를 도시한다.
도 23은 D4 도메인에서 돌연변이된 PDGF-자극된 PDGFRβ가 세포 표면 상에서 불활성 이량체의 형태로 발현된다는 것을 입증하는 면역침전 실험으로부터의 결과를 도시한다. 세포 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시키고, 이뮤노펠릿을 SDS-PAGE 및 각각 항-플래그 항체 (왼쪽 패널) 및 항포스포티로신 항체 (오른쪽 패널)로의 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다.
도 24는 PDGF-유도된 세포 반응이 PDGFRβ D4 돌연변이체 내의 돌연변이에 의해 절충된다는 것을 입증하는 면역침전 실험으로부터의 결과를 도시한다.
도 25는 액틴 고리 형성의 PDGF 자극이 PDGFR D4 돌연변이체를 발현하는 MEF에서 절충된다는 것을 입증하는 실험으로부터의 결과를 도시한다. WT PDGFR를 발현하는 MEF의 대략 83%가 50ng/ml의 PDGF로의 2분 자극 후에 원형 액틴 고리 형성을 나타내는 한편, PDGFR D4 돌연변이체 세포는 5%만이 유사한 원형 액틴 고리 형성을 보여주었다. 또한, 2-5분의 PDGF 자극 후에 WT PDGFR를 발현하는 MEF에서 최고가 되는 일시적인 원형 액틴 고리 형성이 R385A, E390A 또는 RE/AA PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포에서 약하게 검출되었다.
도 26은 PDGFR 내재화 및 유비퀴틴-매개된 PDGFR 분해가 PDGFR의 D4 내의 돌연변이에 의해 절충된다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한다. 도 26a는 WT PDGFR를 발현하는 MEF에 결합된 ¹²⁵I 표지된 PDGF의 내재화의 동역학이 E390A, R385A 또는 RE/AA PDGFR을 발현하는 세포에 결합된 ¹²⁵I 표지된 PDGF의 내재화의 동역학보다 훨씬 더 빠르다는 것을 입증하는 그래프이다. 도 26b는 R385A, E390A 또는 RE/AA PDGFR 돌연변이체의 분해의 동역학이 강하게 감쇄되는 한편; WT PDGFR의 절반이 1.5시간의 PDGF 자극 내에 분해되고, PDGFR D4 돌연변이체에 대한 반감기가 대략 4 내지 6시간으로 연장된다는 것을 보여준다. 도 26c는 E390A PDGFR의 유비퀴틴화의 PDGF 유도된 자극이 또한 유사한 조건하에 WT PDGFR에 비해 강하게 감소되었다는 것을 보여주는 실험을 도시한다.
도 27은 D4 인터페이스의 분열이 KIT에서 종양원성 돌연변이를 차단한다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한다. 야생형 KIT의 SCF 자극은 KIT의 향상된 티로신 자가인산화에 의해 밝혀진 KIT 활성화의 향상으로 이어진다. 실험은 또한 KIT의 종양원성 D5-반복부 돌연변이체가 구성적으로 티로신 자가인산화된다는 것을 보여준다. 대조적으로, D5-반복부/E386A 돌연변이체는 종양원성 D5-반복부 돌연변이에 의해 매개되는 KIT의 구성적인 티로신 자가인산화를 차단한다.
도 28은 KIT-D4의 동형 상호작용 모티프에 상응하는 펩티드에 대해 지시된 항체가 전장 KIT 수용체를 인식한다는 것을 입증하는 이뮤노블롯팅 실험의 결과를 도시한다.
도 29A는 상이한 종으로부터의 VEGFR1 및 VEGFR2의 D7의 예측된 EF-루프 영역의 구조-기반 다중 서열 정렬을 도시한다. I-세트 Ig 프레임 내의 중요 아미노산은 녹색으로 강조되고, EF 루프에서 보존된 Arg/Asp 쌍은 적색으로 강조된다. 도 29B는 VEGFR로부터의 D4 및 KIT, CSF1R 및 PDGFR (유형-III RTK)의 D4의 예측된 EF-루프 영역의 비교를 도시한다. I-세트 Ig 프레임 내의 중요 아미노산은 녹색으로 강조되고, EF 루프에서 보존된 Arg/Asp 또는 Glu 쌍은 적색으로 강조된다. EF-루프에서 반대 전하를 갖는 비보존된 아미노산은 청색으로 강조된다. 보존된 Y-코너 모티프는 *로 표시한다.
도 30은 VEGFR2의 리간드 유도된 활성화가 D7의 EF 루프 영역 내의 돌연변이에 의해 절충되지만 D4의 EF 루프 영역 내의 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다. 도 30A는 야생형 VEGFR2, R726A 또는 E731A VEGFR2 돌연변이체를 일시적으로 발현하는 HEK293 세포가 지시된 양의 VEGF로 5분 동안 37℃에서 자극되었음을 나타낸다. 자극되지 않은 또는 VEGF 자극된 세포로부터의 용해물을 항-VEGFR2 항체로 면역침전시킨 후에 항-pTyr, 또는 항-VEGFR2 항체로의 이뮤노블롯팅 (IB)을 수행하였다. 동일한 실험으로부터의 전체 세포 용해물을 SDS-PAGE에 이어 항-포스포MAPK (pMAPK) 또는 항-MAPK 항체로의 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. 도 30B는 WT VEGFR2-PDGFR 키메라 수용체 또는 D7 영역 내의 돌연변이 (R726A, D731A 또는 R726/D731 이중 돌연변이체 RD/2A)를 보유하는 키메라 수용체를 안정하게 발현하는 혈청 고갈된 3T3 세포가 VEGF로 5분 동안 37℃에서 자극되었음을 나타낸다. 자극되지 않은 또는 VEGF 자극된 세포로부터의 용해물을 키메라 수용체의 세포질 영역에 대한 항체로 면역침전시킨 후에 각각 항-pTyr 또는 항-태그 (플래그) 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 도 30C는 WT VEGFR1-PDGFR 키메라 수용체 또는 D7 영역 내의 돌연변이 (R721A, D725A 또는 R721D725/2A 이중 돌연변이)를 보유하는 키메라 수용체를 안정하게 발현하는 혈청 고갈된 3T3 세포가 VEGF로 5분 동안 37℃에서 자극되었음을 나타낸다. 자극되지 않은 또는 VEGF 자극된 세포로부터의 용해물을 키메라 수용체의 세포질 영역에 대해 지시된 항체로 면역침전시킨 후에 각각 항-pTyr 또는 항-태그 (플래그) 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 도 30D는 WT VEGFR2-PDGFR 키메라 수용체 또는 D4 영역 내의 돌연변이 (D392A 또는 D387/R391A 이중 돌연변이)를 보유하는 키메라 수용체를 발현하는 3T3 세포가 도 30A에 기재된 바와 같이 분석되었음을 나타낸다.
도 31은 VEGFR2 엑토도메인 D7 이량체의 구조를 도시한다. 도 31A는 D7 동종이량체 구조의 리본 다이어그램 및 투명한 분자 표면을 도시한다 (측면도). Asp731 및 Arg726은 막대 모델로 나타낸다. 도 31B는 2개의 이웃하는 분자 (분홍색 및 녹색)의 동형 D7 인터페이스의 근접도를 도시한다. Asp731 및 Arg726에 의해 형성된 염 브릿지는 점선으로 나타낸다. 도 31C는 D7 동종이량체의 전하 분포 (측면도)를 표면 전위 모델 (왼쪽 패널)로 도시한다. 동형 접촉을 매개하는 D7 표면의 도면 (오른쪽 패널). 도 31D는 D7-D7 인터페이스의 도면을 보여주는 1.1σ 수준에서 윤곽을 그린 2Fo-Fc 전자 밀도 맵을 도시한다. VEGFR D7 프로모터의 백본은 각각 분홍색 및 황색 튜브로 표현한다.
도 32는 VEGFR2의 D7의 구조와 이량체 KIT-SCF 복합체의 D4의 구조의 중첩을 도시한다. VEGFR D7 구조 (PDB ID 코드: 3KVQ) 및 SCF와 복합체를 형성한 KIT 이량체 (PDB ID 코드: 2E9W)의 오버레이 (왼쪽 패널). 중첩된 D7 및 D4 영역의 보다 근접한 도면은 도메인 배열 및 동형 접촉에서 높은 유사성을 나타낸다 (오른쪽 패널). VEGFR D7은 녹색으로, EF 루프는 황색으로 나타낸다. KIT의 D4는 회색으로, 그의 EF 루프는 주황색으로 나타낸다.
도 33은 VEGFR1 및 VEGFR2이 계통발생 분석을 도시한다. 도 33A는 다양한 종으로부터의 유형-III 및 유형-V RTK에서 보존된 EF-루프의 위치를 도시한다. 보존된 EF-루프 모티프를 함유하는 Ig-유사 도메인은청색으로 표시한다. 도 33B는 VEGFR2 D7 영역의 색-코딩된 보존 패턴을 도시한다. 인간 VEGFR의 아미노산 서열을 PSI-BLAST를 사용하여 상동성 서열에 대한 비-중복성 데이터베이스 (nr)를 검색하기 위한 검색어로 사용하였다 (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Boiol., 215(3):403-410 (1990)]). D7의 서열 정렬을 20개의 중요 잔기에 대한 IgSF 폴드 제지에 기초하여 수동적으로 조정된 ClustalW2 (문헌 [Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22(22):4673-4680 (1994)])를 사용하여 수행하였다. 아미노산 서열의 정렬을 Consurf 3.0 서버 (문헌 [Landau et al., Nucleic Acids Res., 33 (Web Server issue):W299-302 (2005)])에 입력하여 각각의 위치에 대한 최대-가능성 정규화된 진화율을 생성하였다. 시안색으로부터 고동색을 보존된 아미노산에 대한 변수로부터의 라벨링에 사용하였다. 도 33C는 Clustal W2의 사용에 기초한 이웃-연결 방법에 의해 생성된 VEGFR1 및 VEGFR2의 계통발생 관계도를 도시한다. 분석에 사용된 아미노산은 다음을 포함한다: VEGFR2_HUMAN (gi:11321597), VEGFR2_DOG (gi:114158632), VEGFR2_HORSE (gi:194209154), VEGFR2_CATTLE (gi:158508551), VEGFR2_RAT (gi:56269800), VEGFR2_MOUSE (gi:27777648), VEGFR2_CHICK (gi:52138639), VEGFR2_QUAIL (gi:1718188), VEGFR2_ZEBRARISH (gi:46401444), VEGFR1_HUMAN (gi:143811474), VEGFR1_MOUSE (gi:148673892), VEFGR1_RAT (gi:149034835), VEFGR1_HORSE (gi:149730119), VEGFR1_CHICK (gi:82105132), VEGFR1_ZEBRAFISH (gi:72535148), VEGFR_SEAURCHIN (gi:144226988), VER1_C_ELEGANS (gi:6003694), VER3_C_ELEGANS (gi:3877967), VER4_C_ELEGANS (gi:3877968), PVR_DROSOPHILA (gi:45552252), VEGFR_SEASQUIRT (gi:198434052).

본 발명은 인간 수용체 티로신 키나제, 예를 들어 VEGF 수용체, 예컨대 인간 VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) 및 VEGFR3 (Flt4)의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 또는 Ig-유사 도메인 사이의 힌지에 결합하는 모이어티, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 부분, 소분자, 펩티드성 분자, 압타머 및 애드넥틴을 제공한다. 본 발명의 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킴으로써 VEGF 수용체의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인을 단량체 상태로 고정시킨다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 모이어티는 VEGF 수용체의 엑토도메인의 이량체화를 허용하지만, 2개의 단량체의 Ig-유사 도메인 (예를 들어, VEGF 수용체의 D7-D7 도메인) 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미침으로써 VEGF 수용체의 활성을 억제한다. 즉, 모이어티는 VEGF 수용체 엑토도메인은 리간드 유도된 이량체화를 허용할 수 있으나, 세포 표면 인터페이스에서 2개의 엑토도메인의 배치에 영향을 미치거나 또는 VEGF 수용체의 입체형태적 변화를 변경 또는 방지함으로써 VEGF 수용체의 활성을 억제한다 (예를 들어, 수용체 내재화를 억제하고/거나 수용체의 티로신 자가인산화를 억제하고/거나 수용체가 하류 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 억제함). 본 발명은 적어도 부분적으로 VEGF 수용체 VEGFR2의 전체 엑토도메인의 결정 구조의 판독에 기초한다. 이 결정 구조의 판독은 본 발명의 모이어티가 표적화할 수 있는 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프의 확인을 허용한다.

본원에 사용된 용어 "모이어티"는 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인에 결합하는 임의의 모이어티를 포함하고, 여기서 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태, 예를 들어 단량체 상태로 고정시킴으로써 수용체 티로신 키나제의 활성을 길항한다. 모이어티는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분; 소분자; 펩티드성 분자 (예를 들어, 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인의 구조를 기반으로 하여 설계된 펩티드성 분자); 압타머 또는 애드넥틴일 수 있다. 일부 측면에서, 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인을 연결하는 힌지 영역 (예를 들어, 유형 III RTK의 D3-D4 또는 D4-D5 힌지 영역)에 결합한다.

일부 실시양태에서, 모이어티는 인간 VEGF 수용체의 특정 서열, 예를 들어 VEGFR1의 잔기 718-727, VEGFR1의 Arg720 및 Asp725, VEGFR2의 잔기 724-733, VEGFR2의 Arg726 및 Asp731, VEGFR3의 잔기 735-744, 또는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합할 것이다. 모이어티는 대안적으로 인간 Kit 수용체의 특정 서열, 예를 들어 인간 Kit의 잔기 309-413, 잔기 410-519, ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu, 또는 ⁴¹⁸Tyr 및 ⁵⁰⁵Asn에 결합할 것이다. 잔기 309-413은 인간 Kit의 D4 도메인을 포함하고, 잔기 410-519는 인간 Kit의 D5 도메인을 포함하고, 이들은 본원에서 Kit 수용체 이량체화에 중요한 것으로 밝혀졌다. 잔기 ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu는 Kit의 D4 도메인 내의 잔기로, 이들은 본원에서 D4 도메인의 비-공유결합 회합에 중요하며, 이에 따라 수용체의 이량체화에 중요한 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 잔기 ⁴¹⁸Tyr 및 ⁵⁰⁵Asn은 Kit의 D5 도메인 내의 잔기로, 이들은 본원에서 수용체의 이량체화에 중요한 것으로 밝혀졌다. 당업자는 상기 언급된 잔기에 특이적으로 결합하는 모이어티가 예를 들어 2개의 단량체 Kit 또는 VEGF 수용체 분자의 이량체화를 방지함으로써 수용체의 활성을 길항할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

추가의 실시양태에서, 모이어티는 인간 VEGF 수용체는 돌연변이된 아미노산 잔기에 결합하고, 여기서 아미노산 잔기는 VEGFR1의 Arg720 또는 Asp 725, VEGFR2의 Arg726 또는 Asp731, 또는 VEGFR3의 Arg737 또는 Asp742 중 적어도 하나이다. 추가의 실시양태에서, 모이어티는 인간 Kit에서 돌연변이된 아미노산 잔기에 결합하고, 여기서 아미노산 잔기는 ⁴¹⁷Thr, ⁴¹⁸Tyr, ⁴¹⁹Asp, ⁴²¹Leu, ⁴²⁰Arg, ⁵⁰³Tyr, 또는 ⁵⁰²Ala 중 적어도 하나이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 표 4 (하기)에 기재된 작은 캐비티 또는 포켓을 구성하는 Kit 수용체 내의 하나 이상의 잔기에 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 모이어티는 Kit 수용체의 D3-D4 힌지 영역 내의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: D3 도메인으로부터의 K218, S220, Y221, L222 및 D4 도메인으로부터의 F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, Y373. 본 발명의 모이어티는 또한 Kit 수용체의 D4 도메인에서 오목한 표면을 구성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 Kit 수용체의 D2-D3 힌지 영역에서 포켓을 형성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합한다: D2 도메인으로부터의 Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 및 F208 및 D3 도메인으로부터의 V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 인접한 또는 비-인접한 아미노산 잔기에 결합할 수 있고, 티로신 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로 RTK의 막 근접 영역을 배치하는데 요구되는 움직임을 방지하는 분자 웨지로 기능할 수 있다. 본 발명의 모이어티는 또한 동형 또는 이형 D4 또는 D5 수용체 상호작용을 방지하거나 또는 리간드-수용체 상호작용 부위를 불안정화시키는 작용을 할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 Kit 수용체 상의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합한다: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, I371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, 또는 G432. 당업자는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티가 다른 유형 III RTK에서 상응하는 잔기, 예를 들어 유사한 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 또는 구조 정렬 또는 서열 정렬에 의해 동일한 위치에 있는 것에 용이하게 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 유형 III RTK 상의 입체형태적 에피토프 또는 불연속적 에피토프에 결합한다. 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 유형 III RTK, 예를 들어 인간 Kit 수용체 또는 PDGF 수용체로부터의 D3, D4, 및/또는 D5 도메인 또는 D4-D5 또는 D3-D4 힌지 영역으로부터의 2개 이상의 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들어, 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 표 4에 열거된 잔기 중 2개 이상으로 구성될 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206, V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합한다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 하기 아미노산 군 중 하나로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다: P206, F208, V238, 및 S239; K127, A207, F208, 및 T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, 및 I371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, 및 D398; K218, A219, S220, N367, E368, 및 S369; K218, A220, E368, 및 S369; G384, T385, T411, K412, E414, 및 K471; Y408, F433, G470, K471, 및 L472; F324, V325, N326, 및 N410;D327, N410, T411, K412, 및 V497; G384, G387, V409, 및 K471; L382, G387, V407, 및 V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269; P206, F208, V238, 및 S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, 및 K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, 및 K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, 및 T390; Y350, R353, 및 F355. 상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 모이어티는 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티를 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나 또는 이들은 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 모이어티가 언급되는 경우, 목적은 모이어티가 에피토프를 구성하는 특정 잔기 (예를 들어, 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티)에만 결합하고, 수용체의 선형 아미노산 서열 내의 다른 잔기에 결합하지 않도록 하는 것으로 이해되어야 한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 에피토프는 표 5에 열거된 펩티드로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 구체적인 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 제1 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 제2 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 표 5에 열거된 펩티드의 군으로부터 선택된다. 이에 따라, 본 발명의 모이어티는 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 표 5로부터의 상기 제1 및 제2 펩티드 군은 다음과 같다: Ala219-Leu222 및 Thr304-Val308; Asp309-Gly311 및 Arg224-Gly226; Thr303 -Glu306 및 Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 및 Ser217-Tyr221; Ala339-Pro343 및 Asn396-Val399; Ala339-Pro343 및 Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 및 Val374-His378; Asp357-Glu360 및 Leu377-Thr380; Met351-Glu360 및 His378-Thr389; His378-Thr389 및 Val323-Asp332; Val409-Ile415 및 Ala493-Thr500; Val409-Ile415 및 Ala431-Thr437; Val409-Ile415 및 Phe469-Val473; Val409-Ile415 및 Val325-Asn330; Val409-Ile415 및 Arg381-Gly387; Gly466-Leu472 및 Gly384-Gly388; Val325-Glu329 및 Tyr494-Lys499; Thr411-leu416 및 Val497-Ala502; Ile415-Leu421 및 Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 및 Lys484-Thr488; 및 Ala502-Ala507 및 Gly445-Cys450. 본 발명의 모이어티는 상기 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 모이어티가 언급되는 경우, 목적은 모이어티가 에피토프를 구성하는 특정 잔기 (예를 들어, 표 5에 확인된 특정 펩티드)에만 결합하고, 수용체의 선형 아미노산 서열 내의 다른 잔기에 결합하지 않도록 하는 것으로 이해되어야 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370 및 G466으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 또는 불연속적 에피토프에 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의⁷²⁵RRVRKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 인간 PDGFRβ의 아미노산 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu, 또는 PDGFRα에서 상응하는 잔기에 결합한다. 인간 PDGFRβ의 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu는 Kit 수용체의 잔기 ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu와 유사하고, PDGFRβ의 동형 D4-D4 상호작용을 매개한다. 본 발명의 모이어티는 티로신 키나제 활성화에 필수적인 거리 및 배향으로 세포질 도메인을 배치하는데 필수적인 유형-III RTK의 막 근접 영역 사이의 결정적인 동형 상호작용 (예컨대, 인간 PDGFRβ의 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu 사이에 형성된 염 브릿지)을 방지함으로써 수용체 활성화에 대한 그의 억제 효과를 나타낼 수 있다. 본원에서 논의되는 실험은 동형 D4-D4 상호작용이 PDGFRβ 이량체화에 불필요하고, PDGFRβ 이량체화가 수용체 활성화에 필요하지만 충분하지는 않다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 모이어티는 활성화를 방지하면서 PDGFRβ의 이량체화를 허용할 수 있다. 구조 기반 서열 정렬은 EF 루프의 크기, 및 D4-D4 인터페이스를 포함하는 결정적인 아미노산이 Kit, PDGFRα, PDGFRβ 및 CSF1R에서 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 유형 III RTK의 D4 또는 D5 도메인의 보존된 영역을 표적화할 수 있다. 또한, 당업자는 본 발명의 모이어티가 RTK의 글리코실화된 형태 상에서 나타날 수 있는 당 잔기에 결합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 모이어티가 아미노산 잔기 및 당 잔기 둘 다로 구성된 에피토프에 결합할 것이 가능하다.

용어 "수용체 티로신 키나제" 및 "RTK"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 티로신 잔기를 인산화하는 막 수용체의 주지된 패밀리를 지칭한다. 다수가 발생 및 세포 분열에서 중요한 역할을 수행한다. 수용체 티로신 키나제는 세포외 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 촉매성 도메인을 보유한다. 세포외 도메인은 시토카인, 성장 인자 또는 다른 리간드에 결합하고, 일반적으로 하나 이상의 동일화가능한 구조적 모티프, 예를 들어 시스테인-풍부 영역, 피브로넥틴 III-유사 도메인, 이뮤노글로불린-유사 도메인, EGF-유사 도메인, 카드헤린-유사 도메인, 크린글-유사 도메인, 인자 VIII-유사 도메인, 글리신-풍부 영역, 류신-풍부 영역, 산성 영역 및 디스코이딘-유사 도메인으로 구성된다. 세포내 키나제 도메인의 활성화는 수용체의 이량체화를 유도하는 세포외 도메인에의 리간드 결합에 의해 달성된다. 이러한 방식으로 활성화된 수용체는 촉매성 도메인 외부에서 티로신 잔기를 자가인산화시켜, 활성 수용체 형태의 안정화를 용이하게 할 수 있다. 인산화된 잔기는 또한 단백질에 대한 결합 부위로 작용하고, 이는 이어서 세포 내에서 신호를 전달할 것이다. RTK의 예는 Kit 수용체 (또한, 줄기 세포 인자 수용체 또는 SCF 수용체로 공지됨), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체, 간세포 성장 인자 (HGF) 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 수용체, 신경 성장 인자 (NGF) 수용체, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체, PDGF-수용체-α, PDGF-수용체-β, CSF-1-수용체 (또한, M-CSF-수용체 또는 Fms로 공지됨), 및 Flt3-수용체 (또한, Flk2로 공지됨)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, RTK는 유형 III RTK이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, RTK는 유형 V RTK, 즉 VEGF 수용체 패밀리의 구성원이다.

본원에 사용된 용어 "수용체 티로신 키나제의 유형 III 패밀리" 또는 "유형 III RTK"는 그의 엑토도메인에 전형적으로 5개의 이뮤노글로불린 유사 도메인, 또는 Ig-유사 도메인을 함유하는 수용체 티로신 키나제를 포함한다. 유형 III RTK의 예는 PDGF 수용체, M-CSF 수용체, FGF 수용체, Flt3-수용체 (또한, Flk2로 공지됨) 및 Kit 수용체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유형 III RTK는 Kit (또한, 당업계에 SCF 수용체로 공지됨)이다. Kit는 다른 유형 III RTK와 같이 단일 막횡단 (TM) 도메인에 의해 세포질 영역에 연결된 글리코실화된 세포외 리간드 결합 도메인 (엑토도메인)으로 구성된다 (문헌 [Schlessinger (2000) Cell 103: 211-225]에서 검토됨). 유형 III RTK, 예를 들어 Kit 또는 PDGFR의 다른 특징은 큰 키나제-삽입체 영역을 갖는 세포질 단백질 티로신 키나제 (PTK) 도메인이다. Kit 수용체의 적어도 2개의 스플라이스 이소형이 존재하는 것으로 공지되어 있고, 보다 짧은 것이 인-프레임 스플라이스 부위를 사용한다. Kit 및 다른 상기 기재된 RTK의 모든 이소형이 본 발명에 포함된다.

본원에 사용된 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 "Ig-유사 도메인"이 RTK의 엑토도메인에 존재하는 것으로 당업계에 주지된 도메인을 포함한다. 유형 III 수용체 티로신 키나제 (유형 III RTK)의 패밀리, 예를 들어 Kit의 엑토도메인에, D1, D2, D3, D4 및 D5로 공지된 이러한 5개의 도메인이 존재한다. 유형 III RTK의 D1, D2 및 D3 도메인은 RTK의 리간드에 결합하는 것을 담당한다 (문헌 [Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212]에서 검토됨). 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 용어 "Ig-유사 도메인"은 리간드 결합을 담당하는 RTK의 도메인을 포함하지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, Ig-유사 도메인은 유형 III RTK의 D4 및/또는 D5 도메인이다. VEGF 수용체의 엑토도메인 패밀리에, D1, D2, D3, D4, D5, D6 및 D7로 공지된 7개의 Ig-유사 도메인이 존재한다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, Ig-유사 도메인은 VEGF 수용체 패밀리의 D7 도메인이다.

본원에 사용된 용어 "혈관 내피 성장 인자 수용체", "VEGF 수용체", 또는 "VEGF 수용체 패밀리" (또한 유형 V RTK로 공지됨)는 혈관 내피 성장 인자에 대한 RTK 수용체를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 RTK는 이들의 엑토도메인에 7개의 Ig-유사 도메인을 갖는다. VEGF 패밀리 수용체의 예는 VEGFR1 (또한, Flt-1로 공지됨), VEGFR2 (또한, KDR 또는 Flk-1로 공지됨), 및 VEGFR3 (또한, Flt-4로 공지됨)이다.

용어 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 "엑토도메인"은 당업계에 주지되어 있고, RTK의 세포외 일부, 즉 원형질 막의 외부에 있는 RTK의 일부를 지칭한다.

용어 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인의 "막 근접 영역"은 원형질 막과 근접하고, 바람직하게는 리간드의 RTK에의 결합을 직접 담당하지 않는 RTK의 세포외 부분을 지칭한다. 막 근접 영역의 예는 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4 도메인, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D5 도메인, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D3-D4 힌지 영역, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4-D5 힌지 영역, 및 유형 V 수용체 티로신 키나제의 D7 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "동형 상호작용"은 2개의 단량체 수용체로부터의 2개의 동일한 막 근접 영역 사이의 상호작용을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "이형 상호작용"은 2개의 단량체 수용체로부터의 2개의 상이한 막 근접 영역 사이의 상호작용을 지칭한다. 이형 상호작용은 2개의 상이한 유형의 단량체 수용체의 이량체화의 결과 또는 동일한 단량체 수용체의 야생형 및 돌연변이체 형태의 이량체화의 결과일 수 있다. 예를 들어, 암 환자가 특정 수용체에 대한 야생형 대립유전자 및 돌연변이체 대립유전자를 보유할 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다.

본원에 사용된 용어 "단량체 상태"는 RTK 분자가 동일한 또는 상이한 유형의 제2 RTK 폴리펩티드와 관련되지 않은 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된 RTK의 상태를 지칭한다. RTK 이량체화는 자가인산화 및 수용체 활성화로 이어진다. 따라서, 단량체 상태의 RTK는 불활성 상태이다. 단량체 상태는 또한 단일 RTK의 D4, D5, 또는 D7 도메인이 각각 제2 RTK의 D4, D5, 또는 D7 도메인과 관련되지 않은 상태이다.

본원에 사용된 "프로모터"는 올리고머 단백질, 예컨대 RTK의 구조 유닛이다. 프로모터는 규정된 화학량론으로 어셈블리되어 올리고머를 형성할 수 있는 단백질 서브유닛이다. 수용체 티로신 키나제의 VEGFR 패밀리는 공유결합에 의해 연결된 동종이량체이고, 각각의 VEGFR 프로모터는 "시스테인-노트 성장 인자"로 지정된 구조에서 역평행 방식으로 배열된 4 가닥 β-시트로 구성된다.

어구 "수용체 티로신 키나제의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시킨다"는 본 발명의 모이어티가 수용체 티로신 키나제의 활성을 억제하는 능력을 지칭한다. 즉, 이 어구는 본 발명의 모이어티가 평형상태를 불활성 또는 억제된 수용체 입체형태의 형성을 향해 이동시키는 능력을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 모이어티는 수용체 티로신 키나제의 활성을 모이어티의 부재하의 수용체의 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 억제할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "불활성 상태"는 RTK 분자가 하류 신호전달을 활성화시킬 수 없는 RTK의 상태를 지칭한다. 불활성 상태는 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인이 이량체화에 허용되지만, 2개의 단량체의 Ig-유사 도메인 (예를 들어, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4-D4 또는 D5-D5 도메인 또는 유형 V 수용체 티로신 키나제의 D7-D7 도메인) 사이의 배치, 배향, 입체형태 및/또는 거리가 수용체 티로신 키나제의 활성이 억제되도록 (예를 들어, 수용체 내재화가 억제되고/거나 수용체의 티로신 자가인산화가 억제되고/거나 수용체가 하류 신호전달 경로를 활성화시키는 능력이 억제되도록) 변경된 상태일 수 있다. 불활성 상태는 또한 상기 기재된 바와 같은 단량체 상태를 포함한다. 불활성 상태는 또한 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인이 수용체 리간드에 결합되고, 이량체화되지만, 수용체의 활성화를 허용하는 입체형태적 변화가 아직 일어나지 않은 상태일 수 있다. 실시예 22-25는 또한 RTK 활성화에 결정적이지만 (예를 들어, D4 또는 D5 동형 상호작용의 매개에 의함) 수용체 이량체화에 불필요한 특정 보존된 아미노산 잔기가 존재한다는 것을 보여주는 실험을 논의한다. 용어 "불활성 상태"는 본 발명의 모이어티가 수용체 티로신 키나제의 활성을 모이어티의 부재하의 수용체의 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 감소시키거나 또는 억제할 수 있는 상태를 포함한다. 임의의 본원에 기재된 기능 검정을 이용하여 본 발명의 모이어티가 수용체 티로신 키나제의 활성을 억제하는 능력을 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 예를 들어 대부분의 또는 모든 표적 RTK가 불활성화되었을 때 광범위한 효과를 나타낼 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 예를 들어 표적 RTK의 부분이 불활성화되었을 때 보다 좁은 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 실시양태에서, 수용체의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 상기 모이어티의 부재하의 수용체에 비해 불활성 상태로 고정된다.

본원에 사용된 용어 "입체형태적 에피토프" 또는 "비-선형 에피토프" 또는 "불연속적 에피토프"는 교환가능하게 사용되고, 단일 단백질 쇄에서 보존되지 않은 아미노산인 적어도 2개의 아미노산으로 구성된 에피토프를 지칭한다. 예를 들어, 입체형태적 에피토프는 개재 아미노산의 스트레치에 의해 분리되어 있으나, 단일 에피토프로서 본 발명의 모이어티에 의해 인식되기에 충분히 가까운 2개 이상의 아미노산으로 구성된다. 추가의 예로서, 단일 단백질 쇄 상의 개재 아미노산에 의해 분리된 아미노산, 또는 별개의 단백질 쇄 상에 존재하는 아미노산은 단백질 구조 또는 복합체의 입체형태적 형태로 인해 근접해져 본 발명의 모이어티에 의해 결합될 수 있는 입체형태적 에피토프가 될 수 있다. 특정한 불연속적 및 입체형태 에피토프가 본원에 기재된다 (예를 들어, 표 4 및 5 참조).

당업자는 일반적으로 본 발명의 모이어티에 의해 결합된 선형 에피토프가 RTK의 2차, 3차 또는 4차 구조에 의존할 수 있거나 또는 의존하지 않을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 이들이 본래 3차원 단백질 구조로 폴딩되는지 여부에 관계없이 아미노산의 군에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 에피토프를 구성하는 개별 아미노산 잔기를 인식하지 못할 수 있고, 에피토프를 인식하여 이에 결합하기 위해 특정한 형태 (벤드, 트위스트, 턴 또는 폴드)를 요구할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "인접한 에피토프" 또는 "연속적 에피토프"는 교환가능하게 사용되고 단일 단백질 쇄에서 보존된 아미노산인 적어도 2개의 아미노산으로 구성된 에피토프를 지칭한다. 특정한 인접한 에피토프는 본원에 기재되어 있다 (예를 들어, 표 8 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 모이어티는 VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의 ⁷²⁵RRVRKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프이다.

본원에 사용된 어구 "소수성 아미노산"은 소수성 특성을 포함하는 아미노산, 예를 들어 알라닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 아르기닌, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신, 세린, 프롤린 및 본원에 열거된 다른 것을 지칭한다.

본 발명의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 더욱 상세히 기재된다:

I. 인간 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인에 결합하는 항체

본 발명의 한 측면에서, 인간 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역에 결합하는 모이어티는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본원에 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. "항체"는 디술피드 결합에 의하여 상호 연결되어 있는 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원-결합 부분을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 V_H라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 C_H1, C_H2 및 C_H3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 V_L이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 C_L로 이루어진다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, Kit의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는, (i) Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) Fab' 단편, 힌지 영역의 일부를 갖는 본질적으로 Fab (문헌 [FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993)] 참조); (iv) V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) V_H 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 나노바디, 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 V_L 및 V_H 는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 이루어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체 역시 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 이 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭하는 것이다 (예를 들어, RTK의 Ig-유사 도메인에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 RTK의 Ig-유사 도메인을 제외한 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않음). 또한, 단리된 항체에는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 그러나, "단리된 항체"는 모두 예를 들어 RTK의 Ig-유사 도메인에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본원에 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유할 경우, 이러한 불변 영역도 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용되는 용어 "인간 항체"가 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하지 않는다.

용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는, 재조합 수단으로 제조, 발현, 생성 또는 단리한 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉이거나 또는 트랜스크로모솜성인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리한 항체 또는 그로부터 제조한 하이브리도마 (이하에 추가로 기재됨), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리한 항체, (c) 재조합 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리한 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단으로 제조, 발현, 생성 또는 단리한 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)을 행할 수 있기 때문에, 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만, 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에 사용되는 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.

어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 교환가능하게 사용된다.

용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어 항체와 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.

용어 "인간화 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 지칭한다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 만들어질 수 있다. 당업자는 서열이 특정한 종으로부터 "유래"된 경우, 예컨대 가변 영역 아미노산이 뮤린 항체로부터 수득된 경우 상기 서열이 단백질 서열일 수 있거나 또는 예컨대 핵산을 코딩하는 가변 영역이 뮤린 DNA로부터 수득된 경우 상기 서열이 DNA 서열일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 인간화 항체는 또한 인간 및 비-인간 (예를 들어, 뮤린 또는 토끼) 항체의 공지된 서열을 기반으로 하여 설계될 수 있다. 잠재적으로 인간 및 비-인간 잔기가 둘 다 혼입되도록 설계된 항체가 화학적으로 합성될 수 있다. 서열은 또한 DNA 수준에서 합성되고, 시험관내 또는 생체내에서 발현되어 인간화 항체를 생성할 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종에서 유래되고 불변 영역 서열은 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.

용어 "항체 모방체"는 항원에 결합하는 항체의 능력을 모방할 수 있지만 천연 항체 구조로 제한되지 않는 분자를 지칭한다. 이러한 항체 모방체의 예는 애드넥틴 (즉, 피브로넥틴 기반 결합 분자), 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머 및 베르사바디를 포함하나 이에 제한되지 않는 한편, 이들은 모두 종래의 항체 결합을 모방하고, 특징적인 메카니즘으로부터 생성되어 이를 통해 기능하는 결합 구조를 사용한다. 본 발명의 실시양태는 이들이 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이므로 또한 상기 기재된 항체 모방체에 적용될 수 있다.

본원에 사용된 RTK의 Ig-유사 도메인에 "특이적으로 결합하는" 항체는 RTK의 Ig-유사 도메인에 1 x 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-9 M 이하의 K_D로 결합하는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는"은 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나, 고친화도로 결합하는 것이 아닌 것, 즉 단백질 또는 세포에 1 x 10^-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10^-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10^-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10^-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1 x 10^-2 M 이상의 K_D로 결합하는 것을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "K_assoc" 또는 "K_a"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것인 반면, 본원에 사용된 용어 "K_dis" 또는 "K_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것이다. 본원에 사용된 용어 "K_D"는 K_d 대 K_a의 비 (즉, K_d/K_a)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하고, 몰 농도 (M)로서 표시한다. 항체에 대한 K_D 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 K_D를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)^® 시스템을 사용하는 것이다.

본원에 사용된 IgG 유형 항체를 지칭하는 용어 "고친화도"는 RTK의 Ig-유사 도메인에 대한 K_D가 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10^-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10^-10 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 대해 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 K_D가 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 10^-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10^-9 M 이하인 항체를 지칭한다.

항체

본 발명의 항체는 RTK, 예를 들어 수용체 티로신 키나제의 인간 유형 III 패밀리의 구성원의 Ig-유사 도메인에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 RTK 단량체의 Ig-유사 도메인에의 결합은 엑토도메인을 불활성 상태, 예를 들어 단량체 상태로 고정시킴으로써 RTK가 이량체화되고 하류 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 길항한다. 예를 들어, 항체는 수용체 티로신 키나제의 리간드 유도된 티로신 자가인산화 및/또는 수용체 내재화를 차단할 수 있다.

본 발명의 항체는 RTK의 특정 Ig-유사 도메인, 예를 들어 인간 Kit의 D4 도메인 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 결합하도록 선택 또는 설계된다. 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 RTK, 예를 들어 Kit 수용체 또는 VEGF 수용체의 도메인에 대한 상동성을 공유하는 단백질에 결합하도록 선택 또는 설계된다. 예를 들어, 항체는 도메인, 예를 들어 Kit 수용체의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인과 적어도 50% 동일하거나, 적어도 60% 동일하거나, 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 도메인에 결합하도록 선택 또는 설계될 수 있다. 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 아마도 Kit, VEGF 수용체, 및 Kit의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인과 기능적으로 유사한 다른 RTK에서 단백질에 결합할 수 있을 것이다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또한 RTK, 예를 들어 인간 유형 III RTK의 Ig-유사 도메인으로부터 유래된 특정한 모티프 또는 컨센서스 서열에 결합하도록 선택 또는 설계되어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 RTK의 인간 유형 III 패밀리의 구성원 사이 및 유형 III RTK 및 다른 RTK, 예를 들어 유형 V RTK 사이에 공유된 에피토프 또는 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 허용할 수 있다. 이러한 선형 컨센서스 서열은, 예를 들어 서열 정렬 알고리즘을 사용함으로써 발견되어 다양한 RTK의 도메인, 예를 들어 RTK 유형 또는 종에 걸친 D4 도메인의 도메인을 정렬할 수 있다 (도 6b 참조). 당업자는 예를 들어 다양한 종 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트)으로부터의 Kit D4 도메인의 단백질 서열을 정렬하여 단백질 잔기가 정렬된 서열의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%에서 보존되는지 결정할 수 있다. 이어서, 이러한 컨센서스 서열을 사용하여 컨센서스 서열에 특이적으로 결합하고, 이에 따라 Kit RTK의 가장 보존된 잔기에 결합하게 될 항체 또는 다른 모이어티를 생성할 수 있다. 유사하게는, 또한 유형 V RTK의 D7 도메인의 단백질의 서열을 정렬하여 (도 6 참조) 본 발명의 모이어티가 생성될 수 있는 컨센서스 서열을 수득할 수 있다. 당업자는 가장 고도로 보존된 잔기가 진화를 통해 보존된 것이고, 단백질 기능에 중요할 가능성이 가장 크다는 것을 이해하여야 한다. 대안적으로, 정렬이 다양한 클래스의 RTK에 걸쳐 이루어진 경우, 이러한 컨센서스 서열을 향해 생성된 항체는 항체가 여러 RTK 유형에서 유사한 Ig-유사 도메인에 결합하도록 허용할 것이다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분)는 D4 상호작용 부위에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: LX₁RX₂X₃X₄X₅X₆X₇G, 여기서 L은 류신이고, R은 아르기닌이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇은 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 트레오닌, 이소류신, 발린, 프롤린, 아스파라긴, 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 류신, 발린, 알라닌 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 히스티딘, 아스파라긴 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글리신, 발린, 알라닌, 글루탐산, 프롤린 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 트레오닌, 세린, 글루탐산, 알라닌, 글루타민 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₆은 글루탐산, 아스파르트산 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₇은 글리신, 세린, 알라닌, 리신, 아르기닌, 글루타민 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분)는 VEGF 수용체 패밀리의 구성원의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: IX₁RVX₂X₃EDX₄G, 여기서 I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, E는 글루탐산이고, D는 아스파르트산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 글루탐산, 아르기닌 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 글루탐산 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다 (서열 1).

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분)는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158), 여기서 L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, Φ는 발린이고; X₁은 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 항체는 RTK의 리간드 결합 부위, 예를 들어 Kit 수용체의 SCF 결합 부위에 결합하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 항체는 수용체가 그의 표적 리간드에 결합하는 능력을 길항하지 않는다.

일부 실시양태에서 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 Kit 수용체의 특정 서열, 예를 들어 인간 Kit 수용체의 잔기 309-413, 잔기 410-519, ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu, 또는 ⁴¹⁸Tyr 및 ⁵⁰⁵Asn에 결합한다.

다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 단백질에서 3차원 구조를 나타내는 단백질 모티프 또는 컨센서스 서열에 결합한다. 이러한 모티프 또는 컨센서스 서열은 아미노산의 근접한 스트링이 아니라, RTK의 3차원 폴딩으로부터 나타난 비-인접한 아미노산 배열 (즉, "구조적 모티프" 또는 "비-선형 에피토프")을 나타낼 것이다. 이러한 모티프의 예는 Kit 수용체의 D4-D4 또는 D5-D5 결합 인터페이스 또는 VEGF 수용체의 D7-D7 결합 인터페이스일 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 D4-D4, D5-D5 또는 D7-D7 인터페이스에서 비-선형 에피토프에 결합하여 RTK의 활성화를 방지한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 표 4 (하기)에 기재된 작은 캐비티 또는 포켓을 구성하는 Kit 수용체 내의 하나 이상의 잔기에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Kit 수용체의 D3-D4 힌지 영역 내의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: D3 도메인으로부터의 K218, S220, Y221, L222 및 D4 도메인으로부터의 F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, Y373. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또한 Kit 수용체의 D4 도메인에서 오목한 표면을 구성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Kit 수용체의 D2-D3 힌지 영역에서 포켓을 형성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: D2 도메인으로부터의 Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 및 F208 및 D3 도메인으로부터의 V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 근접한 또는 비-인접한 아미노산 잔기에 결합할 수 있고, 티로신 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로 RTK의 막 근접 영역을 배치하는데 요구되는 움직임을 방지하는 분자 웨지로 기능할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또한 동형 D4 또는 D5 수용체 상호작용을 방지하거나 또는 리간드-수용체 상호작용 부위를 불안정화시키는 작용을 할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Kit 수용체 상의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, I371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, 또는 G432.

당업자는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체가 다른 유형 III RTK에서 상응하는 잔기, 예를 들어 유사한 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 또는 구조 정렬 또는 서열 정렬에 의해 동일한 위치에 있는 것에 용이하게 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 유형 III RTK 상의 입체형태적 에피토프 또는 불연속적 에피토프에 결합한다. 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 유형 III RTK, 예를 들어 인간 Kit 수용체 또는 PDGF 수용체로부터의 D3, D4, 또는 D5 도메인 또는 D4-D5 또는 D3-D4 힌지 영역으로부터의 2개 이상의 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들어, 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 하기 표 4에 열거된 잔기 중 2개 이상으로 구성될 수 있다.

특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206. V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합한다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 하기 아미노산 군 중 하나로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다: P206, F208, V238, 및 S239; K127, A207, F208, 및 T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, 및 I371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, 및 D398; K218, A219, S220, N367, E368, 및 S369; K218, A220, E368, 및 S369; G384, T385, T411, K412, E414, 및 K471; Y408, F433, G470, K471, 및 L472; F324, V325, N326, 및 N410;D327, N410, T411, K412, 및 V497; G384, G387, V409, 및 K471; L382, G387, V407, 및 V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269; P206, F208, V238, 및 S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, 및 K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, 및 K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, 및 T390; Y350, R353, 및 F355. 상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티를 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나 또는 이들은 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 항체가 언급되는 경우, 목적은 항체가 에피토프를 구성하는 특정 잔기 (예를 들어, 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티)에만 결합하고, 수용체의 선형 아미노산 서열 내의 다른 잔기에 결합하지 않도록 하는 것으로 이해되어야 한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 표 5에 열거된 펩티드로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 구체적인 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 제1 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 제2 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 표 5에 열거된 펩티드의 군으로부터 선택된다. 이에 따라, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 펩티드 군은 다음과 같다: Ala219-Leu222 및 Thr304-Val308; Asp309-Gly311 및 Arg224-Gly226; Thr303-Glu306 및 Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 및 Ser217-Tyr221; Ala339-Pro343 및 Asn396-Val399; Ala339-Pro343 및 Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 및 Val374-His378; Asp357-Glu360 및 Leu377-Thr380; Met351-Glu360 및 His378-Thr389; His378-Thr389 및 Val323-Asp332; Val409-Ile415 및 Ala493-Thr500; Val409-Ile415 및 Ala431-Thr437; Val409-Ile415 및 Phe469-Val473; Val409-Ile415 및 Val325-Asn330; Val409-Ile415 및 Arg381-Gly387; Gly466-Leu472 및 Gly384-Gly388; Val325-Glu329 및 Tyr494-Lys499; Thr411-leu416 및 Val497-Ala502; Ile415-Leu421 및 Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 및 Lys484-Thr488; 및 Ala502-Ala507 및 Gly445-Cys450.

본 발명의 항체는 상기 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 항체가 언급되는 경우, 목적은 항체가 에피토프를 구성하는 특정 잔기 (예를 들어, 표 5에 확인된 특정 펩티드)에만 결합하고, 수용체의 선형 아미노산 서열 내의 다른 잔기에 결합하지 않도록 하는 것으로 이해되어야 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370 및 G466으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 또는 불연속적 에피토프에 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 PDGFRβ의 아미노산 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu, 또는 PDGFRα에서 상응하는 잔기에 결합한다. 인간 PDGFRβ의 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu는 Kit 수용체의 잔기 ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu와 유사하고, PDGFRβ의 동형 D4-D4 상호작용을 매개한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 티로신 키나제 활성화에 필수적인 거리 및 배향으로 세포질 도메인을 배치하는데 필수적인 유형-III RTK의 막 근접 영역 사이의 결정적인 동형 상호작용 (예컨대, 인간 PDGFRβ의 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu 사이에 형성된 염 브릿지)을 방지함으로써 수용체 활성화에 대한 그의 억제 효과를 나타낼 수 있다. 본원에서 논의되는 실험은 동형 D4-D4 상호작용이 PDGFRβ 이량체화에 불필요하고, PDGFRβ 이량체화가 수용체 활성화에 필요하지만 충분하지는 않다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 활성화를 방지하면서 PDGFRβ의 이량체화를 허용할 수 있다. 구조 기반 서열 정렬은 EF 루프의 크기, 및 D4-D4 인터페이스를 포함하는 결정적인 아미노산이 Kit, PDGFRα, PDGFRβ 및 CSF1R에서 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 유형 III RTK의 D4 또는 D5 도메인의 보존된 영역에 표적화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 VEGF 수용체의 특정 서열, 예를 들어 VEGFR1의 잔기 718-727, VEGFR1의 Arg720 및 Asp725, VEGFR2의 잔기 724-733, VEGFR2의 Arg726 및 Asp731, VEGFR3의 잔기 735-744, 또는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의 ⁷²⁵RRVRKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 돌연변이체 RTK에 특이적으로 결합하도록 선택 또는 설계된다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 RTK는 종양형성 또는 종양원성 돌연변이체이다. 한 구체적인 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 종양원성 Kit 수용체 돌연변이체에 결합하도록 선택 또는 설계된다. 본 발명의 항체에 의해 표적화될 수 있는 여러 Kit 수용체 돌연변이체는 하기 아미노산 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는 Kit 수용체이다: Thr417, Tyr418, Asp419, Leu421, Arg420, Tyr503 또는 Ala502. 당업자는 본 발명의 방법이 Kit 내의 다른 돌연변이 또는 다른 RTK 내의 돌연변이에 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이체 RTK의 표적화의 한 가지 이점은 치료 항체가 돌연변이를 함유하는 세포 상의 RTK에만 결합할 수 있고, 건강한 세포는 크게 또는 전적으로 영향을 받지 않도록 한다는 것이다. 따라서, 돌연변이가 종양형성인 경우에, 오직 종양 세포만이 치료를 위해 표적화되어 잠재적으로 부작용 및 투여량 요구를 감소시킬 것이다.

바람직하게는, 항체는 인간 RTK의 Ig-유사 도메인에 5 x 10^-8 M 이하의 K_D, 1 x 10^-8 M 이하의 K_D, 5 x 10^-9 M 이하의 K_D, 또는 1 x 10^-8 M 내지 1 x 10^-10 M 또는 그 미만의 K_D로 결합한다. RTK, 예를 들어 Kit 또는 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인을 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정 (예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA 포함)이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화도)는 또한 ELISA, 스캐차드 및 비아코어 분석과 같은 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.

조작 및 변형된 항체

항체의 V_H 및/또는 V_L 서열은 본 발명의 방법에 따라 제조되고, 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로 사용될 있으며, 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 본래 가변 영역 (즉, V_H 및/또는 V_L), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시켜 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 조작의 유형 중 하나는 CDR 이식이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이로한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개개의 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 이식된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).

항체의 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공용 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고 문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 상에서 mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836] (이들 각각의 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 예에서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 진뱅크 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.

항체 단백질 서열은 당업자에게 주지되어 있는 Gapped BLAST (문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402])라 불리는 서열 유사성 검색 방법 중의 하나를 사용하여 컴파일링된 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교한다. BLAST는 항체 서열과 데이터베이스 서열 간의 통계상 유의한 정렬이 정렬된 단어의 높은-스코어링 절편 쌍 (HSP)을 함유하는 것으로 예상된다는 점에서 발견적 알고리즘이다. 스코어가 연장 또는 트리밍에 의해 개선될 수 없는 절편 쌍이 히트 (hit)로 지칭된다. 간략하게, VBASE 기원의 뉴클레오티드 서열 (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)을 번역하고, FR1 내지 FR3 프레임워크 영역을 포함한 이들 간의 영역을 유지시킨다. 데이터베이스 서열은 평균 길이가 98개 잔기이다. 단백질 전체 길이에 걸쳐 정확히 매치되는 중복 서열을 제거하였다. BLAST는 디폴트, 작동 중지되는 저 복잡성 필터를 제외한 표준 파라미터, 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스, 서열 매치를 산출시키는 상위 5개 히트에 대한 필터를 갖는 프로그램 blastp을 이용하여 단백질을 검색한다. 뉴클레오티드 서열을 6개 프레임 모두에서 번역하고, 데이터베이스 서열의 매치 절편 내의 중지 코돈을 전혀 갖지 않는 프레임을 잠재적 히트로 간주한다. 이는 결국 BLSAT 프로그램 tblastx을 이용하여 확인하는데, 이 프로그램은 항체 서열을 6개 모든 프레임에서 번역하고, 이러한 번역물을, 6개 모든 프레임에서 극적으로 번역된 VBASE 뉴클레오티드 서열과 비교한다. 다른 인간 생식계열 서열 데이터베이스, 예를 들어 IMGT (http://imgt.cines.fr)로부터 이용가능한 데이터베이스를 상기한 VBASE와 유사하게 검색할 수 있다.

동일하다는 것은 서열 전체 길이에 걸쳐 항체 서열과 단백질 데이터베이스 간에 아미노산이 정확히 매치된다는 것이다. 양성 (동일성 + 치환 매치)이 동일한 것은 아니지만 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 유도된 아미노산 치환이다. 항체 서열이 동일한 동일성으로 데이터베이스 서열 중의 2개와 매치되는 경우, 가장 양성인 히트가 매치 서열 히트로 결정될 것이다.

확인된 V_H CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 V_K CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 그로부터 프레임워크 서열이 유도되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 이식될 수 있거나, CDR 서열은 배선 서열에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프레임워크 영역 상에 이식될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 향상시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).

또 다른 유형의 가변 영역 변형은 V_H 및/또는 V_K CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과, 또는 관심있는 다른 기능적인 특성은 당업계에 공지된 시험관내 및 생체내 검정에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 돌연변이화되어 라이브러리를 생성할 수 있고, 이는 이어서 RTK의 Ig-유사 도메인, 예를 들어 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인에의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 바람직하게는, (상기 논의되어 있는 바와 같은) 보존적 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 추가로, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반하였다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로 지칭되고, 미국 특허 공보 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수도 있고 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 잔기를 항체에 부착시킬 수 있음), 이것의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수도 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 지수의 넘버링이다.

한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 더욱 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역 내로 도입하여 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터의 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 변경시킬 수 있다. 이러한 전략은 항체의 RTK의 Ig-유사 도메인에의 결합이 절충되지 않는 한 효과적일 것이다.

또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대한 친화도는 변경되지만 모 항체의 항원 결합 능력은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 예에서, 항체가 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/거나 항체의 Fcγ 수용체에 대한 친화도를 증가시키기 위해 하기 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 Fc 영역을 변형시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 또한, 인간 IgG1 상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되어 있고, 결합이 개선된 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339 내의 특정 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 하기 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 C-말단 단부는 미국 가출원 번호 60/957,271 (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 시스테인 잔기의 도입에 의해 변형된다. 이러한 변형에는 전장 중쇄 서열의 C-말단에 있거나 그 근처에 있는 기존의 아미노산 잔기를 대체시키는 것 뿐만 아니라 시스테인 함유 연장물을 전장 중쇄 서열의 C-말단에 도입하는 것이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 양태에서, 시스테인 함유 연장물은 서열 알라닌-알라닌-시스테인 (N-말단에서부터 C-말단까지)을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 이러한 C-말단 시스테인 변형의 존재는 파트너 분자, 예를 들어 치료제 또는 마커 분자의 접합을 위한 위치를 제공한다. 특히, C-말단 시스테인 변형에 의한 반응성 티올기는 아래에서 상세히 설명되는 디술피드 링커를 사용하여 파트너 분자를 접합하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방식으로 항체를 파트너 분자에 접합하면, 특정 부착 부위에 대한 조절력이 증가할 수 있다. 또한, C-말단에 또는 그 근처에 부착 부위를 도입함으로써, 항체의 기능적 특성의 방해를 감소시키거나 제거하고 접합체 제조에 대한 간단한 분석 및 품질 제어가 가능하도록 접합을 최적화할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화 항체가 생성될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 하나 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 글리코실화 변경을 위한 추가의 접근법은 미국 특허 7,214,775 (Hanai et al.), 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta), 미국 공보 번호 20070020260 (Presta), PCT 공보 번호 WO/2007/084926 (Dickey et al.), PCT 공보 번호 WO/2006/089294 (Zhu et al.) 및 PCT 공보 번호 WO/2007/055916 (Ravetch et al.) (각각 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 그의 탄수화물 상에 푸코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8^-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성되었다 (미국 특허 공보 번호 20040110704 (Yamane et al.) 및 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22] 참조). 또 다른 예로서, EP 1,176,195 (Hanai et al.)에는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있고, 이에 따라 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. 하나이(Hanai) 등은 또한, 항체의 Fc 영역과 결합하거나 또는 효소 활성을 갖지 않은 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기재하였다. PCT 공보 WO 03/035835 (Presta)에는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체가 저푸코실화된 것인 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기재되어 있다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공보 WO 99/54342 (Umana et al.)에는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 세포주를 조작하여, 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 이분화 GlcNac 구조가 나타내도록 하고, 이에 의해 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것이 기재되어 있다 (또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단 제거할 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거하였다 (문헌 [Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23]).

추가로 또는 대안적으로, 글리코실화 유형이 변경된 항체를 제조할 수 있고, 이 변경은 항체의 시알릴화 수준에 관련된다. 이러한 변경은 PCT 공보 번호 WO/2007/084926 (Dickey et al.) 및 PCT 공보 번호 WO/2007/055916 (Ravetch et al.) (둘 다 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 예를 들어, 시알리다제, 예를 들어 아르트로박터 우레아파센스 (Arthrobacter ureafacens) 시알리다제와의 효소 반응을 이용할 수 있다. 이러한 반응의 조건은 일반적으로 미국 특허 번호 5,831,077 (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 적합한 효소의 다른 비제한적인 예는 문헌 [Schloemer et al., J. Virology, 15(4), 882-893 (1975) 및 Leibiger et al., Biochem J., 338, 529-538 (1999)]에 각각 기재된 바와 같은 뉴라미니다제 및 N-글리코시다제 F이다. 탈알릴화 항체는 친화성 크로마토그래피를 이용함으로써 추가로 정제할 수 있다. 또 다른 한편으로, 예를 들어 시알릴트랜스퍼라제 효소를 이용하여 시알릴화도를 증가시키는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 반응 조건은 일반적으로 문헌 [Basset et al., Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311 (2000)]에 기재되어 있다.

본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 다른 변형으로서는 PEG화가 있다. 항체는 PEG화되어, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 수행한다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함한다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 글리코실화되지 않은 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다. 이에 따라, 여기에 기재된 PEG화의 방법은 또한 하기 기재된 본 발명의 펩티드성 분자에 적용한다.

항체 단편 및 항체 모방체

본 발명은 종래의 항체로 제한되지 않고, 항체 단편 및 항체 모방체를 이용하는 것을 통해 실행될 수 있다. 이하에서 상술하는 바와 같이, 매우 다양한 항체 단편 및 항체 모방체 기술이 현재 개발되어 있고, 당업계에 주지되어 있다. 다수의 이러한 기술, 예컨대 도메인 항체, 나노바디 및 유니바디가 종래의 항체 구조의 단편 또는 그에 대한 다른 변형을 이용한 것이지만, 애드넥틴, 아피바디, DARPin, 안티칼린스, 아비머 및 베르사바디와 같은 대안적 기술도 또한 존재하며, 이는 종래의 항체 결합을 모방하는 것이기는 하지만, 별개의 메카니즘으로부터 생성되어 그를 통해 기능하는 결합 구조를 이용한다. 이들 대안적인 구조의 일부는 문헌 [Gill and Damle (2006) 17: 653-658]에서 검토된다.

도메인 항체 (dAb)는 항체의 가장 작은 기능적 결합 단위로, 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 중 어느 하나의 가변 영역에 상응한다. 도메인 항체는 대략 13 kDa의 분자량을 갖는다. 도만티스(Domantis)는 일련의 크고 고도로 기능적인 완전 인간 VH 및 VL dAb 라이브러리 (각각의 라이브러리에 100억 초과의 상이한 서열)를 개발하였고, 이들 라이브러리는 치료 표적에 대해 특이적인 dAb를 선택하는데 사용된다. 많은 종래의 항체와 대조적으로, 도메인 항체는 박테리아, 효모 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 그의 생성 방법에 대한 추가의 상세내용은 미국 특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 미국 번호 2004/0110941; 유럽 특허 출원 번호 1433846 및 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609 (각각 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조하여 수득할 수 있다.

나노바디는 자연 발생 중쇄 항체의 특징적인 구조와 기능적 특성을 갖는 항체 유래의 치료 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인 (VHH) 및 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 함유한다. 중요하게는, 클로닝 및 단리된 VHH 도메인은 본래의 중쇄 항체의 완전한 항원-결합 능력을 보유하는 완벽하게 안정한 폴리펩티드이다. 나노바디는 인간 항체의 VH 도메인과 높은 상동성을 갖고, 어떤 활성 손실도 없이 추가로 인간화될 수 있다. 중요하게는, 나노바디는 낮은 면역원성 잠재력을 가지며, 이는 나노바디 리드 화합물을 이용한 영장류 연구에서 확인되었다.

나노바디는 종래의 항체의 이점과 소분자 약물의 중요한 특성을 조합한다. 종래의 항체와 마찬가지로, 나노바디는 높은 표적 특이성, 그의 표적에 대한 고친화도, 및 낮은 고유 독성을 나타낸다. 그러나, 소분자 약물처럼 이는 효소를 억제할 수 있고, 수용체 틈에 쉽게 접근할 수 있다. 추가로, 나노바디는 극히 안정하며, 주사 이외의 수단에 의해 투여될 수 있고 (예를 들어, 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO 04/041867 참조), 제조가 용이하다. 나노바디의 다른 이점으로는, 그의 크기가 작기 때문에 흔하지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식한다는 것, 단백질 표적의 캐비티 또는 활성 부위에 고친화도로 결합한다는 것, 그의 특징적인 3 차원적, 약물 포맷 가요성으로 인한 선택성, 반감기 조정 및 약물 발견의 용이성 및 신속성이 있다.

나노바디는 단일 유전자에 의해 코딩되고, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) (예를 들어, 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 U.S. 6,765,087 참조), 곰팡이 (예를 들어, 아스페르길루스 (Aspergillus) 또는 트리코더마 (Trichoderma)) 및 효모 (예를 들어, 사카로미세스 (Saccharomyces), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 한세눌라 (Hansenula) 또는 피키아 (Pichia)) (예를 들어, 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 U.S. 6,838,254 참조)에서 효율적으로 생성된다. 생산 방법은 확장가능하며, 수 킬로그램 양의 나노바디가 생산된다. 나노바디가 종래의 항체에 비해 우수한 안정성을 나타내기 때문에, 이는 긴 반감기의 즉시 사용가능한 용액으로서 제제화될 수 있다.

나노클론 방법 (예를 들어, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO 06/079372 참조)은 B 세포의 자동화된 고-처리량 선택을 기초로 원하는 표적에 대한 나노바디를 생성하기 위한 독점적인 방법으로, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.

유니바디는 또 다른 항체 단편 기술이지만, 이는 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거를 기초로 하는 것이다. 힌지 영역의 제거는 크기가 종래의 IgG4 항체 크기의 본질적으로 절반인 분자를 야기하고, IgG4 항체의 2가 결합 영역이 아닌 1가 결합 영역을 갖게 한다. 또한 IgG4 항체가 불활성이며, 따라서 면역계와 상호작용하지 않아 면역 반응이 바람직하지 않은 질환을 치료하는데 있어서 유익할 수 있으며, 이러한 이점은 유니바디에 해당한다는 사실이 주지되어 있다. 예를 들어, 유니바디는 그것이 결합하는 세포를 저해하거나 침묵시키지만, 사멸시키지는 않도록 기능할 수 있다. 또한, 종양 세포에 결합하는 유니바디는 세포가 증식하도록 자극하지 않는다. 또한, 유니바디는 크기가 종래의 IgG4 항체의 약 절반이기 때문에, 이는 잠재적으로 유익한 효능으로 보다 큰 고형 종양 상에서 더 나은 분포를 나타낼 수 있다. 유니바디는 전체 IgG4 항체와 유사한 속도로 신체에서 제거되며, 전체 항체와 유사한 친화도로 항원에 결합할 수 있다. 유니바디에 대한 추가의 상세내용은 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 특허 출원 WO2007/059782를 참조하여 수득할 수 있다.

애드넥틴 분자는 피브로넥틴 단백질의 하나 이상의 도메인으로부터 유래된 조작된 결합 단백질이다. 피브로넥틴은 자연적으로 인체에 존재한다. 이는 세포외 매트릭스에 불용성 당단백질 이량체로 존재하고, 또한 링커 단백질로서 작용한다. 이는 또한 디술피드 연결된 이량체로서 혈장에서 가용성 형태로 존재한다. 피브로넥틴의 혈장 형태는 간 세포 (간세포)에 의해 합성되고, ECM 형태는 연골세포, 대식세포, 내피 세포, 섬유모세포, 및 상피의 일부 세포에 의해 만들어진다 (Ward M., and Marcey, D., callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/fibro/fibro.htm 참조). 이전에 언급된 바와 같이, 피브로넥틴은 자연적으로 세포 부착 분자로 기능할 수 있거나, 또는 이는 세포외 매트릭스에서 접촉을 만들어 세포의 상호작용을 매개할 수 있다. 전형적으로, 피브로넥틴은 3개의 상이한 단백질 모듈, 유형 I, 유형 II 및 유형 III 모듈로 만들어진다. 피브로넥틴의 기능의 구조의 검토를 위해, 문헌 [Pankov and Yamada (2002) J Cell Sci.,115(Pt 20):3861-3, Hohenester and Engel (2002) 21:115-128, 및 Lucena et al. (2007) Invest Clin.48:249-262]을 참조한다.

바람직한 실시양태에서, 애드넥틴 분자는 피브로넥틴 유형 III 도메인으로부터의 2개의 베타 시트 사이에 분포된 다중 베타 가닥으로 구성된 천연 단백질을 변경함으로써 유래된다. 기원 조직에 따라, 피브로넥틴은 예를 들어 ¹Fn3, ²Fn3, ³Fn3 등으로 나타낼 수 있는 다중 유형 III 도메인을 함유할 수 있다. ¹⁰Fn3 도메인은 인테그린 결합 모티프를 함유하고, 베타 가닥을 연결하는 3개의 루프를 더 함유한다. 이들 루프는 IgG 중쇄의 항원 결합 루프에 상응하는 것으로 생각될 수 있고, 이들은 하기 논의되는 방법에 의해 관심있는 표적, 예를 들어 RTK의 Ig-유사 도메인, 예컨대 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 특이적으로 결합하도록 변경될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 목적에 유용한 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질 데이터 뱅크 (PDB, rcsb.org/pdb/home/home.do)로부터 접근 코드: 1ttg로 접근할 수 있는 피브로넥틴 유형 III 분자의 구조를 코딩하는 서열에 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 나타내는 서열이다. 애드넥틴 분자는 또한 단순한 단량체 ¹⁰Fn3 구조 보다는 ¹⁰Fn3 관련 분자의 중합체로부터 유래될 수 있다.

천연 ¹⁰Fn3 도메인은 전형적으로 인테그린에 결합하지만, 애드넥틴 분자가 되기에 적합한 ¹⁰Fn3 단백질은 관심있는 항원, 예를 들어 RTK의 Ig-유사 도메인, 예컨대 인간 Kit의 D4 또는 D5 도메인에 결합하도록 변경된다. 한 실시양태에서, ¹⁰Fn3 분자에 대한 변경은 베타 가닥에 대한 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, ¹⁰Fn3 분자의 베타 가닥을 연결시키는 루프 영역은 인간 수용체 티로신 키나제, 예를 들어 VEGF 수용체 또는 유형 III 수용체 티로신 키나제, 예컨대 인간 Kit의 Ig-유사 도메인에 결합하도록 변경된다.

¹⁰Fn3에서의 변경은 오류 유발 PCR, 부위-지정 돌연변이유발, DNA 셔플링, 또는 본원에서 참조한 다른 유형의 재조합 돌연변이유발을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 한 예에서, ¹⁰Fn3 서열을 코딩하는 DNA의 변이체는 시험관내에서 직접 합성될 수 있고, 이후에 시험관내 또는 생체내에서 전사 및 번역될 수 있다. 대안적으로, 천연 ¹⁰Fn3 서열은 표준 방법을 이용하여 게놈으로부터 단리 또는 클로닝될 수 있고 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 20070082365에서 수행된 바와 같음), 이어서 당업계에 공지된 돌연변이유발 방법을 이용하여 돌연변이화될 수 있다.

한 실시양태에서, 표적 단백질, 예를 들어 RTK의 Ig-유사 도메인, 예컨대 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인은 고체 지지체, 예컨대 칼럼 수지 상에 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 고정될 수 있다. 이어서, 표적을 잠재적인 결합 단백질의 라이브러리와 접촉시킨다. 라이브러리는 야생형 ¹⁰Fn3로부터 ¹⁰Fn3 서열의 돌연변이유발/무작위화 또는 ¹⁰Fn3 루프 영역 (베타 가닥이 아님)의 돌연변이유발/무작위화에 의해 유래된 ¹⁰Fn3 클론 또는 애드넥틴 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 라이브러리는 미국 번호 09/007,005 및 09/247,190 (Szostak et al.); WO989/31700 (Szostak et al.); 및 문헌 [Roberts & Szostak (1997) 94:12297-12302]에 기재된 기술에 의해 생성된 RNA-단백질 융합 라이브러리일 수 있다. 라이브러리는 또한 DNA-단백질 라이브러리일 수 있다 (예를 들어, 미국 번호 60/110,549, 미국 번호 09/459,190, 및 WO 00/32823 (Lohse)에 기재됨). 이어서, 융합 라이브러리를 고정된 표적 (예를 들어, 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인)과 인큐베이션하고, 고체 지지체를 세척하여 비-특이적 결합 모이어티를 제거한다. 이어서, 단단한 결합제를 엄격한 조건하에 용리하고, PCR을 이용하여 유전자 정보를 증폭시키거나 또는 (추가의 돌연변이유발의 존재 또는 부재하에) 과정을 반복하기 위한 결합 분자의 새로운 라이브러리를 생성한다. 선택/돌연변이유발 과정은 표적에 충분한 친화도를 갖는 결합제를 수득할 때까지 반복할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 애드넥틴 분자는 애드넥서스(Adnexus) (브리스톤-마이어스 스큅 캄파니 (Briston-Myers Squibb company))에 의해 이용되는 PROfusion^TM 기술을 이용하여 조작될 수 있다. PROfusion 기술은 상기 참조 기술에 기초하여 생성되었다 (예를 들어, 문헌 [Roberts & Szostak (1997) 94:12297-12302]). 변경된 ¹⁰Fn3 도메인의 라이브러리의 생성 및 본 발명과 사용될 수 있는 적절한 결합제의 선택 방법은 하기 미국 특허 및 특허 출원 문서에 상세하게 기재되어 있고, 이들은 본원에 참고로 포함된다: 미국 특허 번호 7,115,396; 6,818,418; 6,537,749; 6,660,473; 7,195,880; 6,416,950; 6,214,553; 6623926; 6,312,927; 6,602,685; 6,518,018; 6,207,446; 6,258,558; 6,436,665; 6,281,344; 7,270,950; 6,951,725; 6,846,655; 7,078,197; 6,429,300; 7,125,669; 6,537,749; 6,660,473; 및 미국 특허 출원 번호 20070082365; 20050255548; 20050038229; 20030143616; 20020182597; 20020177158; 20040086980; 20040253612; 20030022236; 20030013160; 20030027194; 20030013110; 20040259155; 20020182687; 20060270604; 20060246059; 20030100004; 20030143616; 및 20020182597. 피브로넥틴 유형 III 도메인, 예컨대 ¹⁰Fn3에서의 다양성의 생성에 이어 선택 단계는 당업계에 공지된 다른 방법, 예컨대 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이를 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lipovsek et al. (2007) Journal of Molecular Biology 368: 1024-1041; Sergeeva et al. (2006) Adv Drug Deliv Rev. 58:1622-1654; Petty et al. (2007) Trends Biotechnol. 25: 7-15; Rothe et al. (2006) Expert Opin Biol Ther. 6:177-187; 및 Hoogenboom (2005) Nat Biotechnol. 23:1105-1116]).

당업자는 상기 인용된 참조 방법이 바람직한 ¹⁰Fn3 도메인이 아닌 단백질로부터의 항체 모방체의 유래에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 상기 참조 방법을 통해 항체 모방체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가의 분자는 인간 피브로넥틴 모듈 ¹Fn3-⁹Fn3 및 ¹¹Fn3-¹⁷Fn3 뿐만 아니라 비-인간 동물 및 원핵생물로부터의 관련 Fn3 모듈을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 테나신 및 운둘린과 같은 ¹⁰Fn3과 서열 상동성을 갖는 다른 단백질로부터의 Fn3 모듈을 또한 사용할 수 있다. 이뮤노글로불린-유사 폴드를 갖는 (하지만, V_H 도메인에 관련되지 않은 서열을 가짐) 다른 예시적 단백질은 N-카드헤린, ICAM-2, 티틴, GCSF 수용체, 시토카인 수용체, 글리코시다제 억제제, E-카드헤린, 및 항생제 색소단백질을 포함한다. 관련된 구조를 갖는 추가의 도메인은 미엘린 막 부착 분자 P0, CD8, CD4, CD2, 클래스 I MHC, T-세포 항원 수용체, CD1, C2 및 VCAM-1의 I-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 I-세트 이뮤노글로불린 폴드, 미오신-결합 단백질 H의 I-세트 이뮤노글로불린 폴드, 텔로킨의 I-세트 이뮤노글로불린-폴드, 텔리킨, NCAM, 트위트친, 뉴로글리안, 성장 호르몬 수용체, 에리트로포이에틴 수용체, 프로락틴 수용체, GC-SF 수용체, 인터페론-감마 수용체, 베타-갈락토시다제/글루쿠로니다제, 베타-글루쿠로니다제, 및 트랜스글루타미나제로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 이뮤노글로불린-유사 폴드를 포함하는 임의의 다른 단백질을 사용하여 애드넥틴 유사 결합 모이어티를 생성할 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 프로그램 SCOP를 사용하여 확인할 수 있다 (문헌 [Murzin et al., J. Mol. Biol. 247:536 (1995); Lo Conte et al., Nucleic Acids Res. 25:257 (2000)]).

압타머는 본 발명에 포함되는 다른 유형의 항체-모방체이다. 압타머는 전형적으로 특정 표적 분자에 결합하는 작은 뉴클레오티드 중합체이다. DNA 기재 압타머는 가장 전형적으로 이중 가닥이지만, 압타머는 단일 또는 이중 가닥 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)일 수 있다. 압타머 핵산에 대한 길이가 규정되어 있지 않지만, 압타머 분자는 가장 전형적으로 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다.

압타머는 종종 표적 분자에 대한 그의 친화도를 결합하는 복잡한 3차원 구조를 형성한다. 압타머는 이들이 주로 시험관내에서 거의 전적으로 조작 및 증폭될 수 있기 때문에 단순한 항체보다 다수의 이점을 제공할 수 있다. 또한, 압타머는 종종 면역 반응을 거의 또는 전혀 유도하지 않는다.

압타머는 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있으나, 본래 시험관내 선택 (문헌 [Ellington and Szostak. (1990) Nature. 346(6287):818-22]) 및 SELEX 방법 (지수적 풍부화에 의한 리간드의 계통적 진화) (문헌 [Schneider et al. 1992. J Mol Biol. 228(3):862-9]) (그의 내용이 본원에 참고로 포함됨)을 사용하여 개발되었다. 압타머의 제조 및 사용을 위한 다른 방법은 하기 문헌을 포함하는 문헌에 공개되어 있다: 문헌 [Klussmann. The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications. ISBN: 978-3-527-31059-3; Ulrich et al. 2006. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32; Cerchia and de Franciscis. 2007. Methods Mol Biol. 361:187-200; Ireson and Kelland. 2006. Mol Cancer Ther. 2006 5(12):2957-62]; 미국 특허 번호 5582981; 5840867; 5756291; 6261783; 6458559; 5792613; 6111095; 및 미국 특허 출원 번호 11/482,671; 11/102,428; 11/291,610; 및 10/627,543 (모두 본원에 참고로 포함됨).

SELEX 방법은 명백하게 가장 대중적이며, 3가지 기본적인 단계로 수행된다. 첫째, 후보 핵산 분자의 라이브러리가 특정 분자 표적에의 결합에 대해 선택된다. 둘째, 표적에 대해 충분한 친화도를 갖는 핵산을 비-결합제로부터 분리한다. 셋째, 결합된 핵산을 증폭시키고, 제2 라이브러리를 형성하고, 과정을 반복한다. 각각의 반복에서, 표적 분자에 대해 보다 높은 친화도를 갖는 압타머를 선택한다. SELEX 방법은 하기 간행물 (본원에 참고로 포함됨)에서 보다 자세하게 기재된다: 문헌 [Bugaut et al. 2006. 4(22):4082-8; Stoltenburg et al. 2007 Biomol Eng. 2007 24(4):381-403; 및 Gopinath. 2007. Anal Bioanal Chem. 2007. 387(1):171-82].

본 발명의 "압타머"는 또한 뉴클레오티드 대신에 펩티드로부터 만들어진 압타머 분자를 포함한다. 펩티드 압타머는 뉴클레오티드 압타머와 다수의 특성을 공유하고 (예를 들어, 작은 크기 및 표적 분자에 고친화도로 결합하는 능력), 이들은 뉴클레오티드 압타머를 생성하기 위해 사용되는 것과 유사한 원리를 갖는 선택 방법에 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Baines and Colas. 2006. Drug Discov Today. 11(7-8):334-41; 및 Bickle et al. 2006. Nat Protoc. 1(3):1066-91], 본원에 참고로 포함됨).

아피바디 분자는 스타필로코쿠스 단백질 A의 IgG 결합 도메인 중 하나로부터 유래된 58개의 아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 친화도 단백질의 새로운 클래스를 대표한다. 이의 3개의 헬릭스 다발 도메인은 조합 파지미드 라이브러리의 구축을 위한 스캐폴드로서 이용되며, 이로부터 파지 디스플레이 기술을 이용하여 원하는 분자를 표적화하는 아피바디 변이체를 선택할 수 있다 (문헌 [Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55]). 저분자량 (6 kDa)을 가지면서 단순한, 탄탄한 구조의 아피바디 분자는 이를 매우 다양한 적용분야에 적합하게 하며, 예를 들어 검출 시약 (문헌 [Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al., Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211])으로서, 및 수용체 상호작용을 억제하는데 (문헌 [Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7]) 적합하다. 아피바디 및 그의 생성 방법에 대한 추가의 상세내용은 미국 특허 번호 5,831,012 (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조하여 수득할 수 있다.

DARPin (설계된 안키린 반복 단백질)은 비-항체 폴리펩티드의 결합 능력을 활용하기 위해 개발된 항체 모방체 DRP (설계된 반복 단백질) 기술의 한 예이다. 안키린 또는 류신 풍부 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 항체와 달리 세포내 및 세포외에서 일어나는 편재성 결합 분자이다. 이들의 고유한 모듈 구조는 가변적 및 모듈화된 표적 결합 표면을 디스플레이하는 신장된 반복 도메인을 형성하기 위해 겹겹이 쌓여 있는 반복 구조 단위 (반복부)를 특징으로 한다. 이러한 모듈성에 기초하여, 고도로 다양해진 결합 특이성을 지닌 폴리펩티드의 조합 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이러한 전략에는 반복 도메인 내로의 그의 무작위 어셈블리 및 가변 표면 잔기를 디스플레이하는 자가-상용성 반복부의 컨센서스 설계가 포함된다.

DARPin은 박테리아 발현 시스템에서 매우 높은 수율로 생산될 수 있으며, 공지된 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 시토카인, 키나제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 비롯한 넓은 범위의 표적 단백질에 대한 매우 특이적인 고친화도 DARPin이 선택되었다. 한 자릿수의 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화도를 갖는 DARPin을 수득할 수 있다.

DARPin은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유동 세포측정 분석 (FACS), 면역조직화학 (IHC), 칩 분야, 친화도 정제 또는 웨스턴 블롯팅을 비롯한 다양한 범위의 분야에서 사용되어 왔다. DARPin은 또한 세포내 구획에서, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 매우 활성이 있는 것으로 입증되었다. DARPin은 추가로 pM 범위의 IC50으로 바이러스 진입을 억제하는 데에도 사용되었다. DARPin은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는데 뿐만 아니라, 효소를 억제하는 데에도 이상적이다. 가장 빈번하게는 알로스테릭 억제 모드로 프로테아제, 키나제 및 수송체가 성공적으로 억제되었다. 종양에서의 매우 신속하고 특이적인 강화 및 매우 바람직한 종양 대 혈액 비는 DARPin을 생체내 진단 또는 치료적 접근법에 매우 적합하게 만든다.

DARPin 및 다른 DRP 기술에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 2004/0132028 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO 02/20565 (둘 다 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

안티칼린은 추가의 항체 모방체 기술이지만, 이 경우 결합 특이성은 천연적으로 인간 조직 및 체액에서 풍부하게 발현되는 저분자량 단백질 패밀리인 리포칼린으로부터 유래된다. 리포칼린은 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리적 수송 및 저장과 관련된 일정 범위의 생체내 기능을 수행하도록 진화되어 왔다. 리포칼린은 해당 단백질의 1개 말단에 4개의 루프를 지지시켜 주는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 강건한 고유 구조를 지니고 있다. 이들 루프는 결합 포켓에 대한 입구를 형성하고, 이러한 분자 일부에서의 입체 형태적 차이는 개별 리포칼린 간의 결합 특이성 상의 변동을 설명하고 있다.

보존된 β-시트 프레임워크에 의해 지지된 초가변 루프의 전반적인 구조가 이뮤노글로불린을 연상시키긴 하지만, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산의 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되는, 크기 측면에서 항체와 상당히 상이하다 (이는 단일 이뮤노글로불린 도메인 보다 아주 조금 더 큼).

리포칼린은 클로닝되며, 그의 루프를 조작하여 안티칼린를 제작할 수 있다. 구조적으로 다양한 안티칼린의 라이브러리가 생성되었고, 안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선택 및 스크리닝에 이어 원핵 또는 진핵 시스템에서의 추가 분석을 위한 가용성 단백질의 발현 및 생성을 가능하게 한다. 연구 결과, 실질적으로 임의의 인간 표적 단백질에 특이적인 안티칼린을 개발 및 단리할 수 있고, 나노몰 이상의 범위의 결합 친화도를 수득할 수 있는 것으로 성공적으로 입증되었다.

안티칼린은 또한 이중 표적화 단백질, 소위 듀오칼린으로 포맷될 수 있다. 듀오칼린은 그의 2개의 결합 도메인의 구조적 배향에 관계없이 표적 특이성 및 친화도를 보유하면서 누구든 표준 제조 방법을 이용하여 쉽게 생산하는 단량체 단백질 내의 2개의 별개의 치료 표적에 결합한다.

단일 분자를 통한 다중 표적의 조절은 하나를 초과한 원인 인자가 관련된 공지병에 있어서 특히 유익하다. 또한, 듀오칼린과 같은 2가 또는 다가 결합 포맷은 질환에서 세포 표면 분자를 표적화하거나, 신호 전달 경로에 대해 효능작용 효과를 매개하거나, 또는 세포 표면 수용체의 결합 및 클러스터링을 통한 증가된 내재화 효과를 유도하는데 있어서 상당한 잠재력을 갖는다. 또한, 듀오칼린의 높은 고유의 안정성은 단량체 안티칼린과 유사하여, 듀오칼린에 대해 탄력적 제제 및 전달 잠재력을 부여한다.

안티칼린에 관한 추가의 정보는 미국 특허 번호 7,250,297 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO 99/16873 (둘 다 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

본 발명과 관련하여 유용한 또 다른 항체 모방체 기술은 아비머이다. 아비머는 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인 거대 패밀리로부터 진화되는데, 이로써 결합성과 억제성을 지닌 멀티도메인 단백질이 생성된다. 다수의 독립적인 결합 도메인을 연결시키는 것이 결합력을 창출시키고, 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질과 비교해서 친화도 및 특이성을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 잠재적 이점으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 내에서 다중 표적-특이적 분자가 단순하고도 효율적으로 생성되고, 열안정성이 개선되며 프로테아제에 대한 내성이 있다는 것이다. 각종 표적에 대하여 친화도가 나노몰 이하인 아비머가 수득하였다.

아비머에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756 (모두 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

베르사바디는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 또 다른 항체 모방체 기술이다. 베르사바디는 전형적인 단백질이 갖고 있는 소수성 코어를 대체하는 높은 디술피드 밀도 스캐폴드를 형성하는, 시스테인 함량이 15％ 초과인 3-5 kDa의 작은 단백질이다. 소수성 코어를 포함하는 다수의 소수성 아미노산을 소수의 디술피드로 대체하는 것에 의해, 보다 작고, 보다 친수성이며 (덜 응집되고, 비-특이적 결합임), 프로테아제 및 열에 대한 내성이 더 크고, 보다 저 밀도의 T-세포 에피토프를 갖는 단백질이 생성되는데, 이는 MHC 제시에 가장 기여하는 잔기가 소수성이기 때문이다. 모든 4 가지의 이들 특성은 면역원성에 영향을 미치는 것으로 주지되어 있고, 이들 특성은 함께 면역원성에 있어서 상당한 저하를 유발시킬 것으로 예상된다.

베르사바디에 대한 영감은 뜻밖의 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 알려져 있는 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이 및 아네모네에 의해 생산되는 천연의 주사가능한 생물제약으로부터 유래되었다. 선택된 천연 단백질 패밀리로부터 시작하여, 설계하고 크기, 소수성, 단백질분해 항원 프로세싱, 및 에피토프 밀도를 스크리닝하는 것에 의해, 천연의 주사가능한 단백질의 평균보다 훨씬 낮은 수준으로 최소화시켰다.

베르사바디의 구조가 주어지면, 이들 항체 모방체는 다가, 다특이성, 반감기 메카니즘의 다양성, 조직 표적화 모듈 및 항체 Fc 영역의 부재를 포함하는 다양한 포맷을 제공한다. 또한, 베르사바디는 이. 콜라이에서 고 수율로 제조되고, 친수성이고 크기가 작기 때문에, 베르사바디는 고도로 가용성이며, 고 농도로 제제화될 수 있다. 베르사바디는 유난히 열 안정적이고 (비등이 가능함) 연장된 저장 수명을 제공한다.

베르사바디에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공보 번호 2007/0191272 (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.

SMIP^TM (스몰 모듈러 이뮤노파마슈티칼스(Small Modular ImmunoPharmaceuticals)-트루비온 파마슈티칼스(Trubion Pharmaceuticals))는 표적 결합, 이펙터 기능, 생체내 반감기, 및 발현 수준이 유지 및 최적되하도록 조작된다. SMIPS는 3개의 특징적인 모듈 도메인으로 이루어진다. 첫째, 이들은 특이성을 부여하는 임의의 단백질 (예를 들어, 세포 표면 수용체, 단일 쇄 항체, 가용성 단백질 등)로 이루어질 수 있는 결합 도메인을 함유한다. 둘째, 이들은 결합 도메인 및 이펙터 도메인 사이의 가요성 링커로서 작용하는 힌지 도메인을 함유하고, 또한 SMIP 약물의 다량체화의 제어를 돕는다. 마지막으로, SMIPS는 Fc 도메인 또는 특별히 지정된 다른 단백질을 포함하는 다양한 분자로부터 유래될 수 있는 이펙터 도메인을 함유한다. 다양한 상이한 결합을 갖는 SMIP, 힌지, 및 이펙터 도메인의 간단한 구축을 허용하는 설계의 모듈성은 신속하고 주문제작가능한 약물 설계를 제공한다.

이들을 설계하는 방법의 예를 포함하는 SMIP에 대한 보다 많은 정보는 문헌 [Zhao et al. (2007) Blood 110:2569-77] 및 하기 미국 특허 출원 번호 20050238646; 20050202534; 20050202028; 20050202023; 20050202012; 20050186216; 20050180970; 및 20050175614에서 찾아볼 수 있다.

상기에서 제공한 항체 단편 및 항체 모방체 기술의 상세한 설명은 본 명세서에서 사용될 수 있는 모든 기술을 종합한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 또한 제한없이, 대안적인 폴리펩티드-기반 기술, 예컨대 문헌 [Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)] (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개략된 바와 같은 상보성 결정 영역의 융합, 뿐만 아니라 핵산-기반 기술, 예컨대 미국 특허 번호 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774 및 6,387,620 (이들은 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 RNA 압타머 기술을 비롯한 다양한 추가의 기술을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다.

항체 물리적 특성

RTK의 Ig-유사 도메인에 결합하는 본 발명의 항체는 다양한 물리적 특성에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 다양한 검정을 이용하여 이들 물리적 특성에 기초한 항체의 상이한 클래스의 항체를 검출 및/또는 구별할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 부위의 존재는 변경된 항원 결합으로 인하여, 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 일으킬 수 있다 (문헌 [Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al. (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706]). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 항체를 절단시켜 Fab를 생성시킨 다음, 이를 대상으로 하여 퍼아이오데이트 산화와 쉬프 염기 형성을 측정하는 검정을 이용하여 글리코실화에 관하여 시험하는 글리코블롯 검정을 이용하여 가변 영역 글리코실화를 시험할 수 있다. 대안적으로, Fab로부터 사카라이드를 절단시켜 모노사카라이드를 수득하고, 개별적 사카라이드 함량을 분석하는 디오넥스(Dionex) 광 크로마토그래피 (Dionex-LC)를 이용하여 가변 영역 글리코실화를 시험할 수 있다. 일부 경우에, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역 내에서 글리코실화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택함으로써, 또는 당업계에 주지된 표준 기술을 이용하여 글리코실화 모티프 내에서 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

각각의 항체는 고유의 등전점 (pI)을 가지긴 하지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5의 pH 범위에 들어간다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위에 해당하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 해당한다. 항체는 이러한 범위를 벗어나는 pI를 가질 수도 있다. 이들 효과가 전반적으로 알려져 있진 않지만, 정상 범위를 벗어나는 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에서 상당한 언폴딩과 불안정성을 가질 것으로 추측된다. 등전점은 모세관 등전점 포커싱 검정을 이용하여 시험될 수 있는데, 이는 pH 구배를 발생시키고, 증가된 정확도를 위하여 레이저 포커싱을 이용할 수도 있다 (문헌 [Janini et al. (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al. (1998) J Chromatogr A 800:355-67]). 일부 경우에, 정상 범위에 들어가는 pI 값을 함유하는 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위에서 pI를 갖는 항체를 선택함으로써, 또는 당업계에 주지된 표준 기술을 이용하여 하전 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

각각의 항체는 열 안정성을 나타내는 용융 온도를 가진다 (문헌 [Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71]). 보다 높은 열 안정성은 생체내에서 보다 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 융점은 기술, 예컨대 시차 주사 열량법을 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett 68:47-52]). T_M1은 항체의 초기 언폴딩의 온도를 나타낸다. T_M2는 항체의 완전한 언폴딩의 온도를 나탄내다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 T_M1은 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 보다 더 바람직하게는 70℃를 초과한다. 대안적으로, 항체의 열 안정성은 원편광 이색성을 이용하여 측정할 수도 있다 (문헌 [Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9]).

바람직한 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체가 바람직할 수 있다. 항체의 단편화는 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32]).

또 다른 바람직한 실시양태에서, 최소 응집 효과를 갖는 항체가 선택된다. 응집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약동학 특성의 촉발로 이어질 수 있다. 일반적으로, 응집이 25％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 더 바람직하게는 15％ 이하, 보다 더 바람직하게는 10％ 이하, 보다 더 바람직하게는 5％ 이하인 항체가 허용된다. 응집은 크기-배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 확인하기 위한 광 산란을 비롯한, 당업계에 주지된 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 폴리클로날 항체의 생성

본 발명의 폴리클로날 항체는 당업계에 주지된 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 폴리클로날 항체는 상이한 B-세포주로부터 유래하고, 이에 따라 동일한 항원 상에서 다중 에피토프를 인식할 수 있다. 폴리클로날 항체는 전형적으로 적합한 포유동물의 관심 항원, 예를 들어 RTK의 Ig-유사 도메인, 예컨대 인간 Kit의 D4 또는 D5 도메인 또는 인간 VEGF의 D7 도메인으로의 면역화에 의해 생성된다. 폴리클로날 항체의 생성에 종종 사용되는 동물은 닭, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 마우스, 래트, 양, 및 가장 통상적으로 토끼이다. 하기 실시예 14에서, 토끼를 Kit의 제4 (D4) 또는 제5 (D5) Ig-유사 도메인 또는 Kit의 전체 엑토도메인으로 면역화시켜 폴리클로날 항-Kit 항체를 생성하였다. 폴리클로날 항체를 생성하기 위한 표준 방법은 당업계에 주지되어 있고, 본 발명의 방법과 조합될 수 있다 (예를 들어, research.cm.utexas.edu/bkitto/Kittolabpage/Protocols/Immunology/PAb.html; 미국 특허 번호 4,719,290, 6,335,163, 5,789,208, 2,520,076, 2,543,215 및 3,597,409, 이들의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨).

본 발명의 모노클로날 항체의 생성

본 발명의 모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 이론적으로 체세포 혼성화 절차가 바람직하나, 모노클로날 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질감염이 이용될 수 있다. 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날) 또는 그의 항원-결합 부분이 RTK의 Ig-유사 도메인, 보다 바람직하게는 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인 상의 임의의 에피토프, 본원에서 논의된 컨센서스 서열, 또는 본원에 기재된 임의의 입체형태적, 불연속적, 또는 선형 에피토프에 대해 생성될 수 있다는 것에 주목하여야 한다.

당업계에 공지된 여러 방법이 관심있는 불연속적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 선택하는데 유용하다. 예를 들어, 미국 공보 번호 2005/0169925 (그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 기술은 단백질 서열 내에서 2개의 상이한 펩티드에 결합하는 항체의 선택을 허용한다. 이러한 방법을 본 발명에 따라 이용하여 본원에 개시된 입체형태적 및 불연속적 에피토프를 특이적으로 표적화할 수 있다. 입체형태적 에피토프가 단백질 2차 구조인 경우, 이러한 구조는 종종 보다 작은 펩티드 (예를 들어, <50개 아미노산)에서 용이하게 형성된다. 따라서, 동물을 보다 작은 펩티드로 면역화시켜 일부 입체형태적 에피토프를 포획할 수 있었다. 대안적으로, 입체형태적 에피토프 (예를 들어, 표 5에 확인된 펩티드)를 포함하는 2개의 작은 펩티드를 가요성 링커 (예를 들어, 폴리글리콜, 또는 극성, 비대전된 아미노산의 스트레치)를 통해 연결시킬 수 있다. 링커는 펩티드가 다양한 상호작용 배향을 조사하도록 할 것이다. 이러한 구축물로의 면역화에 이어 적절한 스크리닝은 입체형태적 에피토프에 대해 지시된 항체의 확인을 허용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 동물을 RTK의 특정한 도메인 (예를 들어, Kit 엑토도메인의 도메인 4 또는 도메인 5 또는 VEGF 수용체의 D7)으로 면역화시켜 입체형태적 또는 선형 에피토프에 특이적인 펩티드를 생성하고, 이후에 관심있는 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 한 실시양태에서, 냉동전자 현미경검사 (문헌 [Jiang et al. (2008) Nature 451, 1130-1134; Joachim (2006) Oxford University Press_ISBN:0195182189])를 이용하여 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 결합된 에피토프를 확인할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RTK 또는 그의 도메인은 결합된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 결정화되고, X선 결정학에 의해 분석되어 결합된 정확한 에피토프를 결정할 수 있다. 또한, 에피토프는 RTK 서열의 부분을 마우스 또는 다른 종으로부터의 상응하는 서열로 대체하여 맵핑될 수 있다. 관심있는 에피토프에 대해 지시된 항체는 인간 서열 영역에 선택적으로 결합할 것이고, 이에 따라 표적 에피토프를 순차적으로 맵핑할 수 있다. 키메라 기반 에피토프 맵핑의 이 기술을 이용하여 다양한 설정에서 에피토프를 성공적으로 확인하였다 (문헌 [Henriksson and Pettersson (1997) Journal of Autoimmunity. 10(6):559-568; Netzer et al. (1999) J Biol Chem. 1999 Apr 16;274(16):11267-74; Hsia et al. (1996) Mol. Microbiol. 19, 53-63] 참조, 이들의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨).

표적 RTK (예를 들어, Kit RTK 또는 VEGF 수용체)에서 관심있는 에피토프가 글리코실화되지 않은 것으로 여겨진다. 그러나, 관심있는 RTK가 글리코실화되는 경우, 항체 또는 그의 항원-결합 부분 (및 다른 본 발명의 모이어티)은 이들이 관련 아미노산 및/또는 당 잔기에 결합하도록 생성될 수 있다. 예를 들어, Kit 단백질이 잠재적인 N-연결된 글리코실화를 위한 적어도 10개의 부위를 갖는다는 것이 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Morstyn, Foote, Lieschke (2004) Hematopoietic Growth Factors in Oncology: Basic Science and Clinical Therapeutics. Humana Press. ISBN:1588293025]). 또한, Kit가 O-연결된 글리코실화 뿐만 아니라 시알산 잔기에의 부착을 나타낼 수 있을 것으로 생각된다 (문헌 [Wypych J, et al.(1995) Blood, 85(1):66-73]). 따라서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분 (및 본 발명의 다른 모이어티)은 이들이 또한 본원에 확인된 임의의 에피토프에 부착될 수 있는 당 잔기에 결합하도록 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 이 목적을 위해, 관심있는 항원성 펩티드를 동물 세포에서 이것이 적절하게 글리코실화되고, 이어서 글리코실화된 항원성 펩티드가 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있도록 생성할 수 있다. 글리코실화된 펩티드를 생성하기에 적합한 세포 및 기술이 당업계에 공지되어 있고, 아래 추가로 기재된다 (예를 들어, 글리코파이, 인크.(GlycoFi, Inc.) (뉴햄프셔주 레버넌) 및 바이오와(BioWa) (뉴저지주 프린스톤)로부터 입수가능한 기술). 펩티드의 적절한 글리코실화는 글리칸을 확인하기 위한 임의의 표준 방법, 예컨대 등전위 포커싱 (IEF), 산 가수분해 (모노사카라이드 조성물을 결정함), 화학적 또는 효소적 절단 및 질량 분광측정법 (MS)을 이용하여 시험할 수 있다. 글리칸 분석을 가속화시키기 위해 렉틴-기반 어레이를 사용하는 프로코그니아(Procognia) (procognia.com)에서 제공한 기술이 또한 사용될 수 있다. O-글리코실화는 특히 환원성 알칼리 절단 또는 "베타 제거 ", 펩티드 맵핑, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석법 또는 이들 기술의 임의의 조합과 같은 기술을 이용하여 검출될 수 있다.

하이브리도마를 제조하는데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심있는 뮤린 하이브리도마로부터 수득하여, 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해서, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조). 대안적으로, 인간화 항체는 DNA 또는 단백질 수준에 설계되어, 인간 및 비-인간 서열의 지식을 제공할 수 있다. 이러한 항체는 화학적으로 직접적으로 합성될 수 있거나, 또는 DNA는 시험관내 또는 생체내에서 합성 및 발현되어 인간화 항체를 생성할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. RTK의 Ig-유사 도메인, 예를 들어 Kit의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모솜 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모솜 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스^TM로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로서 총칭한다.

HuMAb 마우스^® (메다렉스, 인크. (Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ쇄 로커스를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니로커스를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진이 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (문헌 [Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌]; 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조 및 용도, 및 이러한 마우스가 보유하는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] (이들 모두의 내용은 그 전체가 특히 본원에 참고로 포함됨)에 추가로 기재되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; (모두 Lonberg and Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공보 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg and Kay); 및 PCT 공보 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)을 참조한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 "KM 마우스^TM"로도 지칭되는 이러한 마우스는 PCT 공보 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세히 기재되어 있다.

또한 추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (Xenomouse) (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있으며; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.

또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모솜 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 둘 다 보유하는 마우스 ("TC 마우스"로 지칭됨)를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 당업계에 기재되어 있고 (문헌 [Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어: 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 문헌 [Marks, J.D., et al. ((1991). J. Mol. Biol. 222, 581), Nissim, A., et al. ((1994). EMBO J. 13, 692)] 및 미국 특허 번호 6,794,132; 6562341; 6057098; 5821047; 및 6512097에 기재된 바와 같은 주지된 파지 디스플레이 기술을 이용하여 생성될 수 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,423,538; 6,300,065; 6,696,251; 6,699,658에 기재된 바와 같은 효모 세포 표면 디스플레이 기술을 시용하여 발견할 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성

본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 대안적으로, 면역화한 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 시토펄스(CytoPulse) 대형 챔버 세포 융합 전기천공기 (시토펄스 사이언시즈, 인크.(CytoPulse Sciences, Inc.), 메릴랜드주 그렌 버니)를 사용하여, 전기장에 의거한 전기융합 방법을 이용하여 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 2 x 10⁵개 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마 (Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가함)를 함유하는 선택 배지 내에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 대체로 10-14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 특성화를 위한 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.

인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 l의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화도 크로마토그래피 처리할 수 있다. 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD₂₈₀에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에서 저장할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성

본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 주지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마 (하이브리도마의 유형)에서 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).

예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용가능한 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로 유전자 둘 다가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, V_H 절편이 벡터 내에서 C_H 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 V_K 절편이 벡터 내에서 C_L 절편에 작동가능하게 연결되도록 이들을 이미 원하는 이소형의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자를 벡터 내로 클로닝하여 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인-프레임 연결되도록 할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에서 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존적일 수 있음을 인식할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한 추가로, SV40초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SR 프로모터 시스템과 같은 상이한 공급원으로부터의 서열로 구성된 조절 요소를 사용할 수 있다 (문헌 [Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).

항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위한 것)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하긴 하지만, 항체를 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비하는데 있어서 원핵 세포보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵생물 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13]).

본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재되어 있는 dhfr-CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입할 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기 위해, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포를 성장시키는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기 위해 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산한다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

RTK의 Ig-유사 도메인에의 항체 결합의 특성화

본 발명의 항체는 예를 들어 표준 ELISA에 의해, RTK의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 (또는 임의의 선택된 영역, 예컨대 본원에서 논의된 컨센서스 서열)에의 결합에 대해 시험될 수 있다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중 0.25 μg /ml의 정제된 Ig-유사 도메인 (또는 바람직한 수용체 도메인)으로 코팅한 후에, PBS 중 5% 소 혈청 알부민으로 차단한다. 항체의 희석액 (예를 들어, 면역화된 마우스, 예를 들어 인간 Kit의 D4 또는 D5 도메인으로 면역화된 마우스로부터의 혈장의 희석액)을 각각의 웰에 첨가하고, 1-2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 다음, 알칼리성 포스파타제와 접합된 2차 시약 (예를 들어, 인간 항체의 경우에는 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 mg/ml)로 발색시키고, OD 405-650에서 분석한다. 바람직하게는, 가장 높은 역가를 나타내는 마우스를 융합에 사용할 것이다.

상기 기재한 바와 같은 ELISA 검정을 이용하여 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 RTK의 Ig-유사 도메인에 높은 결합력으로 결합하는 하이브리도마가 서브클로닝되고, 추가로 특성화된다. -140℃에 저장된 5-10개 바이알 세포 은행을 만들고 항체를 정제하기 위해, 모 세포의 반응성을 보유하는 (ELISA에 의함) 각각의 하이브리도마로부터 1개의 클론을 선택할 수 있다.

항-RTK 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 l의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD₂₈₀에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에 저장할 수 있다.

선택된 모노클로날 항체가 특징적인 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 시판되는 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 이용하는 경쟁 연구는 상기 기재된 바와 같이 RTK의 Ig-유사 도메인 (예를 들어, Kit-D4 도메인, Kit-D5 도메인, 또는 VEGF 수용체 D7 도메인)으로 코팅된 RTK 코딩 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화 mAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.

정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 특정 이소형의 항체에 특이적인 시약을 이용하여 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 이소형을 결정하기 위하여, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 밤새 1 ㎍/㎖의 항-인간 이뮤노글로불린으로 코팅시킬 수 있다. 1％ BSA로 차단시킨 후, 플레이트를 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 1 ㎍/ml 이하의 시험 모노클로날 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기에서 기재한 바와 같이 발색시키고 분석한다.

항-RTK 인간 IgG는 RTK의 Ig-유사 도메인 또는 본원에 제시된 컨센서스 서열과의 반응성에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, RTK의 Ig-유사 도메인, 예컨대 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인을 제조하고, 이에 대해 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10% 태아 소 혈청으로 차단하고, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙할 수 있다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 이용하여 검출하고, BCIP/NBT 기질 태블릿 (시그마 켐. 코포레이션(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)으로 발색시킬 수 있다.

에피토프 맵핑을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 결합 부위를 결정할 수 있다. 입체형태적 에피토프의 맵핑을 추가로 허용하는 여러 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Timmerman et al. (Mol Divers. 2004;8(2):61-77)]에 개시된 방법이 사용될 수 있다. 티머만(Timmerman) 등은 2가지 신규 기술, 도메인 스캔 및 매트릭스 스캔을 이용하여 불연속적/입체형태적 에피토프를 성공적으로 맵핑할 수 있었다. 문헌 [Ansong et al. (J Thromb Haemost. 2006. 4(4):842-7)]에 개시된 기술이 또한 사용될 수 있다. 앤송(Ansong) 등은 친화도 지시된 질량 분광측정법을 이용하여 항체 R8B12에 의해 인식되는 불연속적 에피토프를 맵핑하였다. 또한, 영상화 기술, 예컨대 단백질 단층촬영을 이용하여 표적 RTK에의 항체 또는 펩티드 결합을 시각화할 수 있다. 단백질 단층촬영은 이전에 분자 상호작용에 대한 견해를 얻기 위해 이용되었고, 이를 이용하여 억제 항체가 EGFR의 도메인 III에 결합함으로써 작용하여 EGFR를 비가요성 및 불활성 입체형태로 고정시킨다는 것을 보여주었다 (문헌 [Lammerts et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008.105(16):6109-14]). 보다 종래의 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발을 또한 불연속적 에피토프의 맵핑에 적용할 수 있다. 불연속적 에피토프에 참여할 것으로 생각되는 아미노산 영역은 선택적으로 돌연변이화되고, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에의 결합에 대해 검정할 수 있다. 어느 한 영역이 돌연변이화되었을 때 항체가 결합하지 못하는 것은 결합이 두 아미노산 절편에 의존한다는 것을 나타낼 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 선형 에피토프는 본 발명의 모이어티에 결합하기 위해 존재하여야 하는 특정한 3차원 구조에 의해 특성화된다. 이러한 에피토프는 RTK가 그의 천연 또는 폴딩된 상태일 때 및 다시 RTK가 변성되었을 때 항체 (또는 다른 모이어티)의 결합을 검정하여 발견할 수 있다. 결합이 폴딩된 상태에서만 일어난다는 관찰은 에피토프가 폴딩된 단백질에만 존재하는 특정한 폴딩된 구조 또는 불연속적 에피토프에 의해 특성화된 선형 에피토프임을 나타낼 것이다.

본원에 기재된 활성 검정 뿐만 아니라, 단백질 단층촬영을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 수용체 티로신 키나제에 결합하여 이를 비활성화시킬 수 있는지 결정할 수 있다. 결합 상호작용의 시각화는 항체의 결합이 세포 표면 인터페이스에서 2개의 엑토도메인의 배치에 영향을 미치거나 또는 수용체 티로신 키나제의 입체형태적 변화를 변경 또는 방지할 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.

II. 인간 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역에 결합하는 소분자

본 발명의 또 다른 측면에서, 인간 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역에 결합하는 모이어티는 소분자이다.

본 발명의 소분자는 특정한 기능적 특징 또는 특성에 의해 특성화된다. 예를 들어, 소분자는 RTK의 Ig-유사 도메인, 예를 들어 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인, 또는 RTK의 힌지 영역, 예를 들어 Kit RTK의 D3-D4 또는 D4-D5 힌지 영역에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 소분자 억제제의 D3-D4 또는 D4-D5 힌지 영역에의 결합은 막 근접 D4 및 D5 도메인이 티로신 키나제 도메인의 트랜스-자가인산화 및 활성화에 이어 하류 신호전달 경로의 동원 및 활성화를 허용하는 거리 및 배향 (위치)에 있도록 할 수 있는 움직임을 방지할 것이다. 소분자 결합은, 일부 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인의 이량체화를 허용하지만 2개의 단량체의 Ig-유사 도메인 (예를 들어, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4-D4 또는 D5-D5 도메인 또는 유형 V 수용체 티로신 키나제의 D7-D7 도메인) 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미침으로써 수용체 티로신 키나제의 활성을 억제할 수 있다. 즉, 모이어티 또는 소분자는 수용체 티로신 키나제 엑토도메인의 리간드 유도된 이량체화를 허용하지만, 세포 표면 인터페이스 내의 2개의 엑토도메인의 배치에 영향을 미침으로써 수용체 티로신 키나제의 활성을 억제할 수 있다 (예를 들어, 수용체 내재화를 억제하고/거나 수용체의 티로신 자가인산화를 억제하고/거나 수용체가 하류 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 억제함).

용어 "소분자 화합물", "소분자 약물", "소분자", 또는 "소분자 억제제"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, RTK에 대한 효과 및 RTK, 예를 들어 Kit RTK 또는 VEGF 수용체의 이량체화 또는 활성을 억제하는 이들의 능력에 대해 스크리닝된 본 발명의 화합물을 지칭한다. 이들 화합물은 PubChem 데이터베이스 (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), 몰레큘라 라이브러리즈 스크리닝 센터 네트워크(Molecular Libraries Screening Center Network) (MLSCN) 데이터베이스의 화합물, 관련 데이터베이스의 화합물, 또는 그의 유도체 및/또는 기능성 유사체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "유사체" 또는 "기능적 유사체"는 모 화합물과 구조적으로 유사하지만 조성이 약간 상이한 (예를 들어, 하나 이상의 원자 또는 관능기가 부가, 제거 또는 변형된) 화학적 화합물 또는 소분자 억제제를 지칭한다. 유사체는 본래 화합물보다 상이한 화학적 또는 물리적 특징을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있고, 개선된 생물학적 및/또는 화학적 활성을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 유사체는 보다 소수성일 수 있거나 또는 이는 모 화합물에 비해 변경된 활성 (증가된, 감소된, 또는 모 화합물과 동일한 활성)을 가질 수 있다. 유사체는 본래 화합물의 자연 또는 비-자연 발생 (예를 들어, 재조합) 변이체일 수 있다. 다른 유형의 유사체는 이성질체 (거울상이성질체, 부분입체이성질체 등) 및 화합물의 다른 유형의 키랄 변이체 뿐만 아니라 구조적 이성질체를 포함한다. 유사체는 선형 화합물의 분지형 또는 시클릭 변이체일 수 있다. 예를 들어, 선형 화합물은 특정 바람직한 특성 (예를 들어, 친수성 또는 생체이용률의 개선)을 부여하기 위해 분지된 또는 다르게는 치환된 유사체를 가질 수 있다.

본원에 사용된 "유도체"는 모 화합물과 구조적으로 유사하고 모 화합물로부터 (실제로 또는 이론적으로) 유도가능한 화학적 화합물 또는 소분자 억제제의 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된 버전을 지칭한다. 모 화합물이 "유도체"를 생성하기 위한 출발 물질일 수 있는 반면, 모 화합물이 "유사체" 또는 "기능적 유사체"를 생성하기 위한 출발 물질로 반드시 사용되지 않을 수 있다는 점에서 "유도체"는 "유사체" 또는 "기능적 유사체"와 상이하다. 유도체는 모 화합물의 상이한 화학적 또는 물리적 특성을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 유도체는 모 화합물에 비해 보다 친수성일 수 있거나 또는 이는 모 화합물에 비해 변경된 반응성을 가질 수 있다. 유도체화 (즉, 화학적 또는 다른 수단에 의한 변형)는 분자 내의 하나 이상의 모이어티의 치환 (예를 들어, 관능기의 변화)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수소가 할로겐, 예컨대 플루오린 또는 염소로 치환될 수 있거나, 또는 히드록실 기 (--OH)가 카르복실산 모이어티 (--COOH)로 대체될 수 있다. 용어 "유도체"는 또한 모 화합물의 접합체, 및 전구약물 (즉, 생리적 조건하에 본래 화합물로 전환될 수 있는 화학적으로 변형된 유도체)을 포함한다. 예를 들어, 전구약물은 활성제의 불활성 형태일 수 있다. 생리적 조건하에, 전구약물은 화합물의 활성 형태로 전환될 수 있다. 전구약물은, 예를 들어 질소 원자 상의 1개 또는 2개의 수소 원자를 아실 기 (아실 전구약물) 또는 카르바메이트 기 (카르바메이트 전구약물)에 의해 대체함으로써 형성될 수 있다. 전구약물에 관한 보다 상세한 정보는, 예를 들어 문헌 [Fleisher et al., Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115; Design of Prodrugs, H. Bundgaard (ed.), Elsevier, 1985; 및 H. Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443]에서 발견된다. 용어 "유도체"는 또한 모든 용매화물, 예를 들어 수화물 또는 부가물 (예를 들어, 알코올을 갖는 부가물), 활성 대사물, 및 모 화합물의 염을 기재하는데 사용된다. 제조될 수 있는 염의 유형은 화합물 내의 모이어티의 특성에 따라 좌우된다. 예를 들어, 산성 기, 예컨대 카르복실산 기는 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염 (예를 들어, 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 칼슘 염, 및 생리학상 허용가능한 4급 암모늄 이온과의 염 및 암모니아 및 생리학상 허용가능한 유기 아민, 예컨대 트리에틸아민, 에탄올아민 또는 트리스-(2-히드록시에틸)아민과의 산 부가 염)을 형성할 수 있다. 염기성 기는, 예를 들어 무기 산, 예컨대 염산 ("HCl"), 황산 또는 인산, 또는 유기 카르복실산 및 술폰산, 예컨대 아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 메탄술폰산, 또는 p-톨루엔술폰산과의 산 부가 염을 형성할 수 있다. 염기성 질소 원자에 더하여 염기성 기 및 산성 기, 예컨대 카르복실 기를 동시에 함유하는 화합물은 쯔비터이온으로 존재할 수 있다. 염은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 화합물을 용매 또는 희석제 중에서 무기 또는 유기 산 또는 염기와 합하여 수득하거나 또는 다른 염으로부터 양이온 교환 또는 음이온 교환에 의해 수득할 수 있다.

소분자는 1200 이하, 1000 이하, 900 이하, 800 이하, 700 이하, 600 이하, 500 이하, 400 이하, 300 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 25 이하, 또는 10 이하의 분자량을 갖는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 소분자 억제제는 RTK의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역에 결합하도록 선택 또는 설계된다. 일부 실시양태에서, 소분자 억제제는 인간 Kit, 인간 VEGF 수용체 또는 PDGFR의 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역, 예를 들어 인간 Kit 수용체의 D4 또는 D5 도메인, 또는 D3-D4 및/또는 D4-D5 힌지 영역에 결합하여 수용체가 이량체화되고 활성이 되는 능력, 예를 들어 세포내 신호 전달 경로를 자가인산화시키고 활성화시키는 능력을 길항하도록 선택 또는 설계된다. 다른 실시양태에서, 소분자 억제제는 Kit 수용체 또는 VEGF 수용체의 도메인에 대한 상동성을 공유하는 도메인에 결합하도록 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 소분자는 RTK의 Ig-유사 도메인, 예를 들어 Kit의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인; 또는 RTK의 힌지 영역, 예를 들어 Kit 또는 PDGFR 수용체의 D3-D4 또는 D4-D5 힌지 영역과 적어도 50% 동일하거나, 적어도 60% 동일하거나, 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95% 또는 99% 동일한 도메인을 향해 지시될 수 있다. 이러한 소분자는 아마도 Kit, VEGF 수용체, 및 예를 들어 Kit 또는 PDGF 수용체의 D4, D5 또는 D7 도메인 또는 D3-D4 및/또는 D4-D5 힌지 영역과 기능적으로 유사한 다른 RTK에서 단백질 도메인에 결합할 수 있을 것이다.

본 발명의 소분자 억제제는 또한 RTK, 예를 들어 인간 VEGF 수용체 또는 인간 유형 III RTK의 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역으로부터 유래된 특정한 모티프 또는 컨센서스 서열에 결합하여 소분자 억제제를 RTK 패밀리의 구성원, 예를 들어 RTK의 인간 유형 III 패밀리의 구성원 사이에 공유된 도메인에 특이적으로 결합시킬 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 D4 상호작용 부위에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: LX₁RX₂X₃X₄X₅X₆X₇G, 여기서 L은 류신이고, R은 아르기닌이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇은 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 트레오닌, 이소류신, 발린, 프롤린, 아스파라긴, 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 류신, 발린, 알라닌, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글리신, 발린, 알라닌, 글루탐산, 프롤린, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 트레오닌, 세린, 글루탐산, 알라닌, 글루타민, 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₆은 글루탐산, 아스파르트산, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₇은 글리신, 세린, 알라닌, 리신, 아르기닌, 글루타민, 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서 본 발명의 소분자는 VEGF 수용체 패밀리의 구성원의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: IX₁RVX₂X₃EDX₄G, 여기서 I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, E는 글루탐산이고, D는 아스파르트산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 글루탐산, 아르기닌, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 글루탐산 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다 (서열 1).

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 모이어티 (예를 들어, 소분자)는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158), 여기서 L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, Φ는 발린이고; X₁은 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 소분자 억제제는 단백질의 3차원 구조를 나타내는 단백질 모티프 또는 컨센서스 서열에 결합한다. 이러한 모티프 또는 컨센서스 서열은 아미노산의 근접한 스트링이 아니라, RTK의 3차원 폴딩으로부터 나타난 비-선형 아미노산 (즉, 구조적 모티프)을 나타낼 것이다. 이러한 모티프의 예는 Kit 수용체의 D3-D4 및/또는 D4-D5 힌지 영역을 기반으로 하여 설계된 모티프일 것이다. 이러한 모티프 및 컨센서스 서열은 항체에 대해 섹션 I에서 논의된 방법에 따라 설계될 수 있다.

중요하게는, 본 발명의 소분자 억제제는 RTK의 리간드 결합 부위, 예를 들어 Kit 수용체의 SCF 결합 부위에 결합하지 않는다. 즉, 소분자 억제제는 리간드 결합을 담당하는 RTK의 Ig-유사 도메인에 결합하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 소분자 억제제는 VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의 ⁷²⁵RRVRKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 소분자 억제제는 RTK의 돌연변이체 엑토도메인, 예를 들어 돌연변이체 Ig-유사 도메인 또는 돌연변이체 힌지 영역에 특이적으로 결합하도록 선택 또는 설계된다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 RTK는 종양형성 또는 종양원성 돌연변이체이다. 한 구체적인 실시양태에서, 소분자 억제제는 종양원성 Kit 수용체 돌연변이체에 결합하도록 선택 또는 설계된다. 본 발명의 소분자에 의해 표적화될 수 있는 Kit 수용체 돌연변이체는 하기 아미노산 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는 Kit 수용체이다: Thr417, Tyr418, Asp419, Leu421, Arg420, Tyr503, 또는 Ala502. 당업자는 본 발명의 방법이 Kit 내의 다른 돌연변이 또는 다른 RTK 내의 돌연변이에 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이체 RTK의 표적화의 한 가지 이점은 치료 소분자가 돌연변이를 함유하는 세포 상의 RTK에만 결합할 수 있고, 건강한 세포는 크게 또는 전적으로 영향을 받지 않도록 한다는 것이다. 따라서, 돌연변이가 종양형성인 경우에, 오직 종양 세포만이 치료를 위해 표적화되어 잠재적으로 부작용 및 투여량 요구를 감소시킬 것이다.

일부 실시양태에서, 소분자는 인간 Kit 수용체의 특정 서열, 예를 들어 인간 Kit 수용체의 잔기 309-413, 잔기 410-519, ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu, 또는 ⁴¹⁸Tyr 및 ⁵⁰⁵Asn에 결합한다. 일부 실시양태에서, 소분자는 인간 VEGF 수용체의 특정 서열, 예를 들어 VEGFR1의 잔기 718-727, VEGFR1의 Arg720 및 Asp725, VEGFR2의 잔기 724-733, VEGFR2의 Arg726 및 Asp731, VEGFR3의 잔기 735-744, 또는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 표 4 (하기)에 기재된 작은 캐비티 또는 포켓을 구성하는 Kit 수용체에서의 하나 이상의 잔기에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 소분자는 Kit 수용체의 D3-D4 힌지 영역에서의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: D3 도메인으로부터의 K218, S220, Y221, L222 및 D4 도메인으로부터의 F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, Y373. 본 발명의 소분자는 또한 Kit 수용체의 D4 도메인에서 오목한 표면을 구성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 Kit 수용체의 D2-D3 힌지 영역에서 포켓을 형성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: D2 도메인으로부터의 Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 및 F208 및 D3 도메인으로부터의 V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 소분자 근접한 또는 비-인접한 아미노산 잔기에 결합하고, 티로신 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로 RTK의 막 근접 영역을 배치하는데 요구되는 움직임을 방지하는 분자 웨지로 기능할 수 있다. 본 발명의 소분자는 또한 동형 D4 또는 D5 수용체 상호작용을 방지하거나 또는 리간드-수용체 상호작용 부위를 불안정화시키는 작용을 할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 Kit 수용체 상의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다: Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, I371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, 또는 G432. 당업자는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 소분자가 다른 유형 III RTK에서 상응하는 잔기, 예를 들어 유사한 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 또는 구조 정렬 또는 서열 정렬에 의해 동일한 위치에 있는 것에 용이하게 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 유형 III RTK 또는 유형 V RTK 상의 입체형태적 에피토프 또는 불연속적 에피토프에 결합한다. 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 유형 III RTK, 예를 들어 인간 Kit 수용체 또는 PDGF 수용체로부터의 D3, D4, 또는 D5 도메인 또는 D4-D5 또는 D3-D4 힌지 영역으로부터의 2개 이상의 잔기, 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인으로부터의 2개 이상의 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들어, 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 하기 표 4에 열거된 잔기 중 2개 이상으로 구성될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206. V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합한다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 하기 아미노산 군 중 하나로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다: P206, F208, V238, 및 S239; K127, A207, F208, 및 T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, 및 I371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, 및 D398; K218, A219, S220, N367, E368, 및 S369; K218, A220, E368, 및 S369; G384, T385, T411, K412, E414, 및 K471; Y408, F433, G470, K471, 및 L472; F324, V325, N326, 및 N410;D327, N410, T411, K412, 및 V497; G384, G387, V409, 및 K471; L382, G387, V407, 및 V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269; P206, F208, V238, 및 S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, 및 K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, 및 K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, 및 T390; Y350, R353, 및 F355. 상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 소분자는 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티를 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나 또는 이들은 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 소분자가 언급되는 경우, 목적은 소분자가 에피토프를 구성하는 특정 잔기 (예를 들어, 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티)에만 결합하고, 수용체의 선형 아미노산 서열에서의 다른 잔기에 결합하지 않도록 하는 것으로 이해되어야 한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 표 5에 열거된 펩티드로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 구체적인 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 제1 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 제2 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 표 5에 열거된 펩티드의 군으로부터 선택된다. 이에 따라, 본 발명의 소분자는 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 펩티드 군은 다음과 같다: Ala219-Leu222 및 Thr304-Val308; Asp309-Gly311 및 Arg224-Gly226; Thr303-Glu306 및 Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 및 Ser217-Tyr221; Ala339-Pro343 및 Asn396-Val399; Ala339-Pro343 및 Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 및 Val374-His378; Asp357-Glu360 및 Leu377-Thr380; Met351-Glu360 및 His378-Thr389; His378-Thr389 및 Val323-Asp332; Val409-Ile415 및 Ala493-Thr500; Val409-Ile415 및 Ala431-Thr437; Val409-Ile415 및 Phe469-Val473; Val409-Ile415 및 Val325-Asn330; Val409-Ile415 및 Arg381-Gly387; Gly466-Leu472 및 Gly384-Gly388; Val325-Glu329 및 Tyr494-Lys499; Thr411-leu416 및 Val497-Ala502; Ile415-Leu421 및 Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 및 Lys484-Thr488; 및 Ala502-Ala507 및 Gly445-Cys450. 본 발명의 소분자는 상기 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프, 예를 들어 입체형태적 에피토프에 결합하는 본 발명의 소분자가 언급되는 경우, 목적은 소분자가가 에피토프를 구성하는 특정 잔기 (예를 들어, 표 5에 확인된 특정 펩티드)에만 결합하고, 수용체의 선형 아미노산 서열에서의 다른 잔기에 결합하지 않도록 하는 것으로 이해되어야 한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370, 및 G466으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 또는 불연속적 에피토프에 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 인간 PDGFRβ의 아미노산 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu, 또는 PDGFRα에서 상응하는 잔기에 결합한다. 인간 PDGFRβ의 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu는 Kit 수용체의 잔기 ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu와 유사하고, PDGFRβ의 동형 D4-D4 상호작용을 매개한다. 본 발명의 소분자는 티로신 키나제 활성화에 필수적인 거리 및 배향으로 세포질 도메인을 배치하는데 필수적인 유형-III RTK의 막 근접 영역 사이의 결정적인 동형 상호작용 (예컨대, 인간 PDGFRβ의 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu 사이에 형성된 염 브릿지)을 방지함으로써 수용체 활성화에 대한 그의 억제 효과를 나타낼 수 있다. 본원에서 논의되는 실험은 동형 D4-D4 상호작용이 PDGFRβ 이량체화에 불필요하고, PDGFRβ 이량체화가 수용체 활성화에 필요하지만 충분하지는 않다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 소분자는 활성화를 방지하면서 PDGFRβ의 이량체화를 허용할 수 있다. 구조 기반 서열 정렬은 EF 루프의 크기, 및 D4-D4 인터페이스를 포함하는 결정적인 아미노산이 Kit, PDGFRα, PDGFRβ, 및 CSF1R에서 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 유형 III RTK의 D4 또는 D5 도메인의 보존된 영역에 표적화될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 소분자는 Kit의 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역 (예를 들어, Kit 수용체의 D3-D4 및/또는 D4-D5 힌지 영역 또는 D4-D4 및/또는 D5-D5 인터페이스 결합 부위)에 고친화도로, 예를 들어 1 x 10^-7 M 이하의 K_D, 5 x 10^-8 M 이하의 K_D, 1 x 10^-8 M 이하의 K_D, 5 x 10^-9 M 이하의 K_D, 또는 1 x 10^-8 M 내지 1 x 10^-10 M 또는 그 미만의 K_D의 친화도로 결합한다.

본 발명의 소분자 억제제는 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 제조 또는 선택될 수 있다. 스크리닝 절차를 이용하여, 라이브러리로부터 RTK의 바람직한 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역, 예를 들어 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인에 결합하는 소분자를 확인할 수 있다. 한 가지 방법, 케메틱스(Chemetics)^® (뉴볼루션(Nuevolutions))는 선택을 용이하게 하기 위해 라이브러리의 각각의 분자에 대한 DNA 태그를 사용한다. 케메틱스^® 시스템은 표적 결합에 대해 수백만개의 화합물의 스크리닝을 허용한다. 소분자 라이브러리 및 태그 기반 스크리닝에 관련된 특허는 미국 특허 출원 번호 20070026397; 20060292603; 20060269920; 20060246450; 20060234231; 20060099592; 20040049008; 20030143561 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨).

라이브러리로부터 RTK의 바람직한 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역, 예를 들어 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 결합하는 소분자를 확인하는데 이용될 수 있는 다른 주지된 방법은, 라이브러리 구성원이 확인 표지로 태그 부착된, 즉 라이브러리에 존재하는 각각의 표지가 라이브러리에 존재하는 특징적인 화합물 구조와 관련되어, 표지의 확인이 태그 부착된 분자의 구조를 말해주는 것인 라이브러리를 사용하는 방법을 포함한다. 태그 부착된 라이브러리에 대한 한 가지 접근법은, 예를 들어 PCT 공보 번호 WO 2005/058479 A2 (다이렉트 셀렉트(Direct Select)^TM 기술) 및 미국 특허 번호 5,573,905; 5,708,153; 5,723,598, 6,060,596 공개된 PCT 출원 WO 93/06121; WO 93/20242; WO 94/13623; WO 00/23458; WO 02/074929 및 WO 02/103008, 및 문헌 [Brenner and Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5381-5383 (1992); Nielsen and Janda (Methods: A Companion to Methods in Enzymology 6, 361-371 (1994); 및 Nielsen, Brenner and Janda (J. Am. Chem. Soc. 115, 9812-9813 (1993))) (각각의 전체 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 태그를 사용하는 것이다. 이러한 태그는 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 증폭시켜, 다수의 카피의 태그를 생성하고 태그를 서열분석에 의해 확인할 수 있다. 이어서, 태그의 서열은 결합 분자의 구조를 확인하고; 이는 순수한 형태로 합성되고 활성에 대해 표적화될 수 있다.

조합 화학적 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 주지되어 있다. 본 발명의 모이어티를 확인하기 위해 사용될 수 있는 이러한 조합 화학적 라이브러리는 펩티드 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,010,175, 문헌 [Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487 493 (1991) 및 Houghton et al., Nature 354:84 88 (1991)])을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화학적 다양성 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학이 당업계에 주지되어 있고, 사용될 수 있다. 이러한 화학은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 펩토이드 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO 91/19735), 코딩된 펩티드 (예를 들어, PCT 공보 WO 93/20242), 랜덤 바이오-올리고머 (예를 들어, PCT 공보 번호 WO 92/00091), 벤조디아제핀 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,288,514), 다이버소머, 예컨대 히드안토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드 (문헌 [Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909 6913 (1993)]), 비닐 위치 폴리펩티드 (문헌 [Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)]), 글루코스 스캐폴딩을 갖는 비펩티드 펩티드모방체 (문헌 [Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217 9218 (1992)]), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성 (문헌 [Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)]), 올리고카르바메이트 (문헌 [Cho et al., Science 261:1303 (1993)]), 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (문헌 [Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)]), 핵산 라이브러리 (문헌 [Ausubel, Berger and Russell & Sambrook, 모두 상기 문헌] 참조), 펩티드 핵산 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,539,083 참조), 탄수화물 라이브러리 (예를 들어, 문헌 [Liang et al., Science, 274:1520 1522 (1996)] 및 미국 특허 번호 5,593,853 참조), 유기 소분자 라이브러리 (예를 들어, 벤조디아제핀, 문헌 [Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993)]; 이소프레노이드, 미국 특허 번호 5,569,588; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 번호 5,549,974; 피롤리딘, 미국 특허 번호 5,525,735 및 5,519,134; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 번호 5,506,337; 벤조디아제핀, 5,288,514, 등). 각각의 상기 공보는 본원에 참고로 포함된다. 공용 데이터베이스가 또한 이용가능하고, 통상적으로 소분자 스크리닝, 예를 들어 PubChem (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov), Zinc (문헌 [Irwin and Shoichet (2005) J. Chem. Inf. Model. 45(1):177-82]), 및 ChemBank (문헌 [Seiler et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D351-D359])에 사용된다.

조합 라이브러리의 제조를 위한 장치는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, 어드밴스드 켐 테크(Advanced Chem Tech) (켄터키주 루이스빌), 심포니(Symphony), 라이닌(Rainin) (매사추세츠주 우번), 433A 어플라이드 바이오시스템즈 (433A Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티), 9050 플러스(9050 Plus), 밀리포어(Millipore) (매사추세츠주, 베드포드) 참조). 또한 다수의 조합 라이브러리는 그 자체로 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 콤게넥스(ComGenex) (뉴욕주 프린스톤), 트리포스 인크.(Tripos, Inc.) (미주리주 세인트 루이스), 3D 파마슈티칼스(3D Pharmaceuticals) (펜실베니아주 엑스턴), 마르텍 바이오사이언시즈(Martek Biosciences) (매릴랜드주 컬럼비아) 등 참조)이다. 또한, 스크리닝 방법론이 아주 잘 규정되어 있기 때문에, 관심 표적 (예를 들어, 바이오포커스 디피아이(BioFocus DPI) (biofocus.com), 및 콴텀 리드(Quantum Lead) (q-lead.com))에 대한 특정한 화합물을 확인하기 위해 전문 회사와 계약하는 것이 통상적이다.

당업계에 주지되어 있고 본 발명의 방법에 적용할 수 있는 소분자를 선택하는 다른 방법은 문헌 [Huang and Stuart L. Schreiber (1997) Proc Natl Acad Sci U S A. 94(25): 13396-13401; Hung et al. (2005) Science 310:670-674; Zhang et al. (2007) Proc Natl Acad Sci 104: 4606-4611]에 있거나; 또는 문헌 [Gordon (2007) ACS Chem. Biol. 2:9-16] (이들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 검토된 임의의 방법이다.

실험적 스크리닝 방법 뿐만 아니라, 본 발명의 소분자는 가상 스크리닝 방법을 이용하여 선택될 수 있다. 가상 스크리닝 기술은 라이브러리로부터의 소분자가 통계적 분석 및 단백질 도킹 모의실험을 이용하여 단백질 또는 그 안의 특정 에피토프에 결합할 것으로 예상한다. 가장 일반적으로, 가상 스크리닝 방법은 라이브러리에서 단백질의 3차원 구조를 소분자의 것과 비교한다. 수소 결합, 정전기력 및 반 데르 발스 상호작용을 포함하는, 원자 사이에 결합 에너지를 모의실험한 알고리즘을 이용하는 것이 통상적일지라도, 단백질-분자 상호작용을 모델링하기 위한 다양한 전략이 이용된다. 전형적으로, 가상 스크리닝 방법은 백만개가 넘는 화합물의 라이브러리를 스캐닝하고, 강한 결합제일 가능성이 있는 소분자의 짧은 목록을 되돌릴 수 있다. 가상 스크리닝 방법의 여러 검토가 이용가능하고, 여기에 본 발명의 소분자를 확인하는데 사용될 수 있는 기술이 상세히 기재되어 있다 (문헌 [Engel et al. (2008) J. Am. Chem. Soc., 130 (15), 5115-5123;McInnes. (2007). Curr Opin Chem Biol. Oct;11(5):494-502; Reddy et al. (2007) Curr Protein Pept Sci. Aug;8(4):329-51; Muegge and Oloff. (2006) Drug Discovery Today. 3(4): 405-411; Kitchen et al. (2004) Nature Reviews Drug Discovery 3, 935-949]). 소분자 스크리닝의 추가의 예는 본원에 참고로 포함되는 U.S. 2005/0124678에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 소분자는 아래 표에 도시된 스캐폴드 구조중 하나를 함유할 수 있다. 표에 인용된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 기 R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 단지 이들이 지시된 반응을 방해하거나 또는 유의하게 억제하지 않도록 제한되고, 수소, 알킬, 치환된 알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로겐, 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 치환된 아미노 및 당업계에 공지된 다른 것을 포함할 수 있다. 적합한 치환기는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 니트로, 히드록실, 술프히드릴, 아릴옥시, 아릴-S-, 할로겐, 카르복시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 시아노, 시아네이트, 니트릴, 이소시아네이트, 티오시아네이트, 카르바밀 및 치환된 카르바밀을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

III. 인간 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인에 결합하는 펩티드성 분자

본 발명의 또 다른 측면에서, 인간 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인, 예를 들어 Ig-유사 도메인 또는 힌지 영역에 결합하는 모이어티는 펩티드성 분자이다.

펩티드성 분자는 RTK의 Ig-유사 도메인 또는 이러한 도메인으로부터 유래된 컨센서스 서열을 기반으로 하여 설계될 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 펩티드성 분자는 D4 상호작용 부위에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: LX₁RX₂X₃X₄X₅X₆X₇G, 여기서 L은 류신이고, R은 아르기닌이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇은 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 트레오닌, 이소류신, 발린, 프롤린, 아스파라긴, 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 류신, 발린, 알라닌, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글리신, 발린, 알라닌, 글루탐산, 프롤린, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 트레오닌, 세린, 글루탐산, 알라닌, 글루타민, 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₆은 글루탐산, 아스파르트산, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₇은 글리신, 세린, 알라닌, 리신, 아르기닌, 글루타민, 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이에 따라, 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 상기 언급된 컨센서스 서열 (LX₁RX₂X₃X₄X₅X₆X₇G)에 매치된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서 L은 류신이고, R은 아르기닌이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇은 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 트레오닌, 이소류신, 발린, 프롤린, 아스파라긴, 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 류신, 발린, 알라닌, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글리신, 발린, 알라닌, 글루탐산, 프롤린, 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 트레오닌, 세린, 글루탐산, 알라닌, 글루타민, 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₆은 글루탐산, 아스파르트산, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₇은 글리신, 세린, 알라닌, 리신, 아르기닌, 글루타민, 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 대한 컨센서스 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다: L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158), 여기서 L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, Φ는 발린이고; X₁은 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅는 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 펩티드성 분자는 VEGF 수용체 패밀리의 구성원의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열에 결합한다: IX₁RVX₂X₃EDX₄G, 여기서 I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, E는 글루탐산이고, D는 아스파르트산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃ 및 X₄ 는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁는 글루탐산, 아르기닌, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 글루탐산 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다 (서열 1).

이에 따라, 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 컨센서스 서열 IX₁RVX₂X₃EDX₄G에 매치된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 여기서 I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, E는 글루탐산이고, D는 아스파르트산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 임의의 아미노산이다. 구체적인 실시양태에서, X₁은 글루탐산, 아르기닌, 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂는 아르기닌 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃은 글루탐산 및 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄는 글루탐산 및 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다 (서열 1).

한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 인간 Kit의 전체 단백질 도메인, 예를 들어 D4 또는 D5 도메인, 예컨대 D4 도메인 (잔기 309-413) 또는 D5 도메인 (잔기 410-519)을 포함할 수 있다. 추가의 예로서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 유형 V RTK의 D7 도메인 (또는 그의 단편), 예컨대 VEGFR의 D7 도메인 (VEGFR1의 잔기 718-727, VEGFR2의 잔기 724-733 또는 VEGFR3의 잔기 735-744)을 포함할 수 있다. 이러한 펩티드성 분자는 RTK에 결합하고, RTK의 활성화를 방지함으로써 길항제로 작용한다 (하기 실시예 16 참조). 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 RTK, 예컨대 유형 III RTK의 도메인과 적어도 50% 동일성을 가질 수 있고, 예를 들어 본 발명의 펩티드성 모이어티는 RTK의 D4, D5 또는 D7 도메인과 적어도 50% 동일하거나, 적어도 60% 동일하거나, 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 인간 Kit RTK의 아미노산 잔기 309-413, VEGFR1의 아미노산 잔기 718-727, VEGFR2의 아미노산 잔기 724-733, 또는 VEGFR3의 아미노산 잔기 735-744와 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 인간 Kit RTK의 아미노산 잔기 410-519, VEGFR1의 아미노산 잔기 718-727, VEGFR2의 아미노산 잔기 724-733, 또는 VEGFR3의 아미노산 잔기 735-744와 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 또는 98% 동일하다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 인간 Kit 수용체의 특정 서열, 예를 들어 인간 Kit 수용체의 잔기 309-413, 잔기 410-519, ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu, 또는 ⁴¹⁸Tyr 및 ⁵⁰⁵Asn에 결합하거나 또는 이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 VEGF 수용체의 특정 서열, 예를 들어 VEGFR1의 잔기 718-727, VEGFR1의 Arg720 및 Asp725, VEGFR2의 잔기 724-733, VEGFR2의 Arg726 및 Asp731, VEGFR3의 잔기 735-744, 또는 VEGFR3의 Arg737 및 Asp742에 결합하거나 또는 이를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 표 4 (하기)에 기재된 작은 캐비티 또는 포켓을 구성하는 Kit 수용체에서의 하나 이상의 잔기에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음). 예를 들어, 본 발명의 펩티드성 분자는 Kit 수용체의 D3-D4 힌지 영역에서의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음): D3 도메인으로부터의 K218, S220, Y221, L222 및 D4 도메인으로부터의 F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, Y373. 본 발명의 펩티드성 분자는 또한 Kit 수용체의 D4 도메인에서 오목한 표면을 구성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음): Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 Kit 수용체의 D2-D3 힌지 영역에서 포켓을 형성하는 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음): D2 도메인으로부터의 Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 및 F208 및 D3 도메인으로부터의 V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269.

본 발명의 펩티드성 모이어티는 근접한 또는 비-인접한 아미노산 잔기에 결합하고, 티로신 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로 RTK의 막 근접 영역을 배치하는데 요구되는 움직임을 방지하는 분자 웨지로 기능할 수 있다. 본 발명의 펩티드성 분자는 또한 동형 D4, D5 또는 D7 수용체 상호작용을 방지하거나 또는 리간드-수용체 상호작용 부위를 불안정화시키는 작용을 할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 Kit 수용체 상의 하기 잔기 중 하나 이상에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음): Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, P206, F208, K127, A207, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, Y269, T295, L222, L222, L223, E306, V308, R224, V308, K310, K218, A219, S220, K218, A220, Y221, A339, D327, D398, E338, E368, E386, F312, F324, F340, F355, G311, G384, G387, G388, I371, K342, K358, L382, L379, N326, N367, N370, N410, P341, S369, T385, V325, V407, V409, Y373, Y350, Y408, T380, T390, R381, R353, T411, K412, E414, K471, F433, G470, L472, V497, F469, A431, 또는 G432. 본 발명의 펩티드성 모이어티는 표 4에 확인된 포켓 또는 캐비티를 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있거나) 또는 이들은 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음). 당업자는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자가 다른 유형 III RTK에서 상응하는 잔기, 예를 들어 유사한 포켓 또는 캐비티를 형성하는 잔기 또는 구조 정렬 또는 서열 정렬에 의해 동일한 위치에 있는 것에 용이하게 표적화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 유형 III RTK 또는 유형 V RTK 상의 입체형태적 에피토프 또는 불연속적 에피토프에 결합한다. 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 유형 III RTK, 예를 들어 인간 Kit 수용체 또는 PDGF 수용체 또는 유형 V RTK, 예를 들어 인간 VEGF 수용체로부터의 D3, D4, D5 또는 D7 도메인 또는 D4-D5 또는 D3-D4 힌지 영역으로부터의 2개 이상의 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들어, 입체형태적 또는 불연속적 에피토프는 하기 표 4에 열거된 잔기 중 2개 이상으로 구성될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 Y125, H180, R181, K203, V204, R205, P206, V238, S239, S240, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합한다. 유사한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 하기 아미노산 군 중 하나로부터 선택된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다: P206, F208, V238, 및 S239; K127, A207, F208, 및 T295; L222, A339, F340, K342, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; L222, L223, E306, V308, F312, E338, F340, 및 I371; R224, V308, K310, G311, F340, P341, 및 D398; K218, A219, S220, N367, E368, 및 S369; K218, A220, E368, 및 S369; G384, T385, T411, K412, E414, 및 K471; Y408, F433, G470, K471, 및 L472; F324, V325, N326, 및 N410;D327, N410, T411, K412, 및 V497; G384, G387, V409, 및 K471; L382, G387, V407, 및 V409; Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206, F208, V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268, 및 Y269; P206, F208, V238, 및 S239; K218, S220, Y221, L222, F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, 및 Y373; G384, G387, G388, Y408, V409, T411, F433, F469, G470, 및 K471; D327, T411, K412, E414, A431, G432, 및 K471; Y350, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386, 및 T390; Y350, R353, 및 F355.

추가의 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 입체형태적 에피토프는 표 5에 열거된 펩티드로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성된다. 구체적인 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 제1 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 제2 펩티드로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 표 5에 열거된 펩티드의 군으로부터 선택된다. 이에 따라, 본 발명의 펩티드성 분자는 입체형태적 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 펩티드 군은 다음과 같다: Ala219-Leu222 및 Thr304-Val308; Asp309-Gly311 및 Arg224-Gly226; Thr303-Glu306 및 Ala219-Leu222; Asn367-Asn370 및 Ser217-Tyr221; Ala339-Pro343 및 Asn396-Val399; Ala339-Pro343 및 Glu368-Arg372; Lys358-Tyr362 및 Val374-His378; Asp357-Glu360 및 Leu377-Thr380; Met351-Glu360 및 His378-Thr389; His378-Thr389 및 Val323-Asp332; Val409-Ile415 및 Ala493-Thr500; Val409-Ile415 및 Ala431-Thr437; Val409-Ile415 및 Phe469-Val473; Val409-Ile415 및 Val325-Asn330; Val409-Ile415 및 Arg381-Gly387; Gly466-Leu472 및 Gly384-Gly388; Val325-Glu329 및 Tyr494-Lys499; Thr411-leu416 및 Val497-Ala502; Ile415-Leu421 및 Ala502-Ala507; Ala502-Ala507 및 Lys484-Thr488; 및 Ala502-Ala507 및 Gly445-Cys450. 본 발명의 펩티드성 모이어티는 상기 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 아미노산 잔기 모두에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 제1 및 제2 펩티드 군을 형성하는 잔기의 하위세트에 결합할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 E33, P34, D72, E76, N77, K78, Q79, K158, D159, N250, S251, Q252, T253, K254, L255, N260, W262, H264, G265, E344, N352, R353, F355, T356, D357, Y362, S365, E366, N367, N370, 및 G466으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산에 결합할 수 있다 (또는 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있음).

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 인접한 에피토프는 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의 ⁷²⁵RRVRKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 인간 PDGFRβ의 아미노산 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu, 또는 PDGFRα에서 상응하는 잔기에 결합하거나 또는 이를 포함한다. 인간 PDGFRβ의 잔기 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu는 Kit 수용체의 잔기 ³⁸¹Arg 및 ³⁸⁶Glu와 유사하고, PDGFRβ의 동형 D4-D4 상호작용을 매개한다. 본 발명의 펩티드성 분자는 티로신 키나제 활성화에 필수적인 거리 및 배향으로 세포질 도메인을 배치하는데 필수적인 유형-III RTK의 막 근접 영역 사이의 결정적인 동형 상호작용 (예컨대, 인간 PDGFRβ의 ³⁸⁵Arg 및 ³⁹⁰Glu 사이에 형성된 염 브릿지)을 방지함으로써 수용체 활성화에 대한 이들의 억제 효과를 나타낼 수 있다. 본원에서 논의되는 실험은 동형 D4-D4 상호작용이 PDGFRβ 이량체화에 불필요하고, PDGFRβ 이량체화가 수용체 활성화에 필요하지만 충분하지는 않다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 펩티드성 분자는 활성화를 방지하면서 PDGFRβ의 이량체화를 허용할 수 있다. 구조 기반 서열 정렬은 EF 루프의 크기, 및 D4-D4 인터페이스를 포함하는 결정적인 아미노산이 Kit, PDGFRα, PDGFRβ, 및 CSF1R에서 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드성 분자는 유형 III RTK의 D4 또는 D5 도메인의 보존된 영역에 표적화될 수 있다.

본 발명의 펩티드성 모이어티는 본원에서 확인된 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 1-89, 92, 93, 및 105-157) 중 어느 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어진 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드성 모이어티는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어진 펩티드일 수 있다:

본 발명의 펩티드 분자는 그의 안정성, 생체이용률 또는 용해도를 증가시키기 위해 추가도 변형될 수 있다. 예를 들어, 펩티드성 분자 내의 하나 이상의 L-아미노산 잔기는 D-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 본 발명의 펩티드성 분자에 적용된 용어 "모방체"는 D-펩티드성 구조의 화학적 구조를 모방하고, D-펩티드 구조의 기능적 특성을 유지하는 분자를 포함한다. 용어 "모방체"는 또한 하기 기재된 바와 같은 펩티드의 "유사체" 및/또는 "유도체"를 포함한다. 펩티드 유사체, 유도체 및 모방체를 설계하기 위한 접근법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Farmer, P.S. in Drug Design (E.J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. 10, pp. 119-143; Ball. J.B. and Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3:55; Morgan, B.A. and Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243; 및 Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10:270]을 참조한다. 또한, 문헌 [Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M.D. and Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Chapter 17; Smith, A.B. 3rd, et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11113-11123; Smith, A.B. 3rd, et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:9947-9962; 및 Hirschman, R., et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:12550-12568]을 참조한다.

본원에 사용된 본 발명의 펩티드성 분자의 "유도체"는 분자 상의 하나 이상의 반응 기가 치환기 군으로 유도체화된 펩티드성 분자의 형태를 지칭한다. 펩티드 유도체의 예는 아미노산 측쇄, 펩티드 백본, 또는 아미노- 또는 카르복시-말단이 유도체화된 펩티드 (예를 들어, 메틸화된 아미드 연결을 갖는 펩티드성 화합물)를 포함한다. 본원에 사용된 본 발명의 펩티드성 분자의 "유사체"는 분자의 기능적 활성에 필수적인 분자의 화학적 구조를 보유하나 또한 분자와 상이한 특정 화학적 구조를 함유하는 펩티드성 분자를 지칭한다. 자연 발생 펩티드의 유사체의 예는 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 본원에 사용된 본 발명의 펩티드성 분자의 "모방체"는 분자의 기능적 활성에 필수적인 분자의 화학적 구조가 분자의 입체형태를 모방하는 다른 화학적 구조로 대체된 펩티드성 분자를 지칭한다. 펩티드모방체의 예는 펩티드 백본이 하나 이상의 벤조이다제핀 분자로 치환된 펩티드성 화합물을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [James, G.L. et al. (1993) Science 260:1937-1942] 참조).

본 발명의 펩티드성 분자의 유사체는 펩티드 구조의 하나 이상의 L- 또는 D-아미노산이 분자의 특성이 유지되도록 상동성 아미노산으로 치환된 분자를 포함한다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 아미노산 잔기에서 만들어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리, 예를 들어 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 당업계에 규정되어 있다. 본 발명의 펩티드성 분자의 구조에서 만들어질 수 있는 상동성 치환의 비-제한적 예는 D-페닐알라닌의 D-티로신, D-피리딜알라닌 또는 D-호모페닐알라닌으로의 치환, D-류신의 D-발린 또는 지방족 측쇄를 갖는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산으로의 치환 및/또는 D-발린의 D-류신 또는 지방족 측쇄를 갖는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산으로의 치환을 포함한다.

용어 모방체, 특히 펩티드모방체는 동배체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "동배체"는 제1 구조의 입체 형태가 제2 구조에 특이적인 결합 구조에 맞기 때문에 제2 화학적 구조에 대해 치환될 수 있는 화학적 구조를 포함한다. 용어 특이적으로는 당업자에게 주지된 펩티드 백본 변형 (즉, 아미드 결합 모방체)을 포함한다. 이러한 변형은 아미드 질소, α-탄소, 아미드 카르보닐의 변형, 아미드 결합의 완전한 대체, 연장, 결실 또는 백본 가교를 포함한다. 여러 펩티드 백본 변형, 예를 들어 ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CSNH₂], ψ[NHCO], ψ[COCH₂], 및 ψ[(E) 또는 (Z) CH=CH]이 공지되어 있다. 상기 이용된 명명법에서, ψ은 아미드 결합의 부재를 나타낸다. 아미드 기를 대체하는 구조는 괄호 내에 설명된다.

다른 가능한 변형은 N-알킬 (또는 아릴) 치환 (ψ[CONR]), 또는 락탐 또는 다른 시클릭 구조의 구축을 위한 백본 가교를 포함한다. 본 발명의 조절제 화합물의 다른 유도체는 C-말단 히드록시메틸 유도체, O-변형된 유도체 (예를 들어, C-말단 히드록시메틸 벤질 에테르), N-말단 변형된 유도체, 예를 들어 치환된 아미드, 예컨대 알킬아미드 및 히드라지드를 포함한다.

본 발명의 펩티드성 분자는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 만들어질 수 있다. 펩티드성 분자, 예를 들어 인간 Kit RTK의 D4 도메인 또는 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인은 표준 기술을 이용하여 인간 세포로부터 클로닝되고, 재조합 벡터에 삽입되고, 시험관내 세포 시스템에서 (예를 들어, 벡터의 효모 세포로의 형질감염에 의해) 발현될 수 있다. 대안적으로, 펩티드성 분자는 문헌 [Atherton et al. (1989) Oxford, England: IRL Press. ISBN 0199630674; Stewart et al. (1984). 2nd edition, Rockford: Pierce Chemical Company, 91. ISBN 0935940030; Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154]과 같은 공지된 합성 방법을 통해 새롭게 설계 및 합성될 수 있다.

이어서, 펩티드성 분자는 본원에 기재된 임의의 검정, 예를 들어 하기 실시예 섹션에 기재된 것을 이용하여 기능적 활성에 대해 시험할 수 있다.

IV. 본 발명의 모이어티를 확인하기 위한 스크리닝 검정

본 발명의 모이어티는 임의의 본원에 기재된 검정을 이용하여 RTK 억제 활성에 대해 스크리닝될 수 있고, 이들 검정은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 수용체 내재화, 수용체 자가인산화, 및/또는 키나제 신호전달을 결정할 수 있는 검정을 이용하여 표적 RTK, 예를 들어 Kit 수용체 또는 인간 VEGF 수용체의 활성화를 방지하는 모이어티를 확인할 수 있다. 새로운 억제제 모이어티에 대한 스크리닝을 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어 포스포ELISA^TM 절차 (인비트로젠에서 입수가능함)를 이용하여 수행함으로서 RTK 또는 하류 분자의 인산화 상태를 결정할 수 있다. 수용체, 예를 들어 Kit 수용체 또는 VEGF 수용체의 인산화 상태는 시판되는 키트, 예컨대 예를 들어, C-Kit [pY823] ELISA KIT, HU (바이오소스(BioSource)^TM; 카달로그 번호 - KHO0401); c-KIT [TOTAL] ELISA KIT, HU (바이오소스^TM; 카달로그 번호 - KHO0391)를 사용하여 결정할 수 있다. 항체, 소분자, 및 다른 본 발명의 모이어티를 이러한 키트를 이용하여 스크리닝함으로써 그의 RTK 억제 활성을 결정할 수 있다. 예를 들어, 적절한 리간드 및 본 발명의 모이어티로 처리한 후에, 포스포ELISA^TM을 수행하여 인산화 상태를 결정하고, 이에 따라 관심있는 RTK의 활성화 상태를 결정할 수 있다. 본 발명의 모이어티는 RTK 활성화를 방지하는 것으로 확인될 수 있다. 하기 실시예 15 및 16은 항-포스포티로신 항체를 사용하는 RTK 활성화의 검출을 포함하는 검정을 기재하고 있다. 하기 실시예 20은 포스포ELISA^TM 시스템을 이용하여 수용체 활성화를 검출하기 위한 한 가능한 검정을 기재하고 있다. 실시예 22-25 (이와 관련된 방법 및 도입부 포함)는 RTK의 활성화 상태를 결정하기 위해 본원에서 사용되는 방법을 추가로 기재한다.

수용체 활성화는 세포내이입 및 수용체 내재화로 이어질 수 있으므로, 이는 일부 실시양태에서 본 발명의 모이어티가 표적 RTK를 억제하는 능력을 이들이 수용체 내재화를 방지하는 능력을 측정함으로써 결정하는데 유용하다. 하기 실시예 25 (및 이와 관련된 방법)는 PDGF 수용체 돌연변이체의 내재화 및 분해의 측정을 기재한다. 수용체 내재화 검정은 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Fukunaga et al. (2006) Life Sciences. 80(1). p. 17-23; Bernhagen et al. (2007) Nature Medicine 13, 587-596] (natureprotocols.com/2007/04/18/receptor_internalization_assay.php) (각각의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 수용체 내재화를 결정하기 위한 한 가지 주지된 방법은 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 다른 적합한 표지제로 리간드에 태그를 부착하는 것이다. 리간드가 수용체에 결합하면, 형광 현미경검사를 이용하여 수용체 내재화를 시각화할 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 모이어티에 표지제로 태그를 부착하고, 형광 현미경 검사를 이용하여 수용체 내재화를 시각화할 수 있다. 모이어티는 수용체의 활성을 억제하여, 적절한 대조군에 비해 리간드의 존재하에 형광의 내재화를 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 형광이 모이어티가 엔도솜 또는 소포에서 보다 수용체에 결합하는 세포의 주변부에서만 관찰될 수 있음).

상기 언급된 것 뿐만 아니라, 다양한 다른 수용체 활성화 검정이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 어느 하나를 이용하여 본 발명의 모이어티의 기능을 평가할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 추가의 수용체 활성화 검정이 미국 특허 번호 6,287,784; 6,025,145; 5,599,681; 5,766,863; 5,891,650; 5,914,237; 7,056,685; 및 문헌 [Amir-Zaltsman et al. (2000) Luminescence 15(6):377-80; Nakayama and Parandoosh (1999) Journal of Immunological Methods. 225(1-2), 27, 67-74; Pike et al. (1987) Methods of Enzymology 146: 353-362; Atienza et al. (2005) Journal of Biomolecular Screening. 11(6): 634-643; Hunter et al. (1982). Journal of Biological Chemistry 257(9): 4843-4848; White and Backer (1991) Methods in Enzymology 201: 65-67; Madden et al. (1991) Anal Biochem 199: 210-215; Cleaveland et al. (1990) Analytical Biochemistry 190: 249-253; Lazaro et al. (1991) Analytical Biochemistry 192: 257-261; Hunter and Cooper (1985) Ann Rev Biochem 54: 897-930; Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212; Knutson and Buck (1991) Archives of Biochemistry and Biophysics 285(2): 197-204); King et al. (1993) Life Sciences 53: 1465-1472; Wang. (1985) Molecular and Cellular Biology 5(12): 3640-3643; Glenney et al. (1988) Journal of Immunological Methods 109: 277-285; Kamps (1991) Methods in Enzymology 201: 101-110; Kozma et al. (1991) Methods in Enzymology 201: 28-43; Holmes et al. (1992) Science 256: 1205-10; 및 Corfas et al. (1993) PNAS, USA 90: 1624-1628] (이에 제한되지 않음)을 비롯한 다수의 과학 간행물에 기재되어 있다.

리간드 결합에 의한 수용체 활성화는 전형적으로 이후의 세포내 사건을 개시시키고, 예를 들어 2차 메신저, 예컨대 IP₃을 증가시키고, 다시 칼슘 이온의 세포내 저장소를 방출시킨다. 따라서, 수용체 활성을 2차 메신저, 예컨대 IP_3, 시클릭 뉴클레오티드, 세포내 칼슘, 또는 인산화된 신호전달 분자, 예컨대 STAT, PI3K, Grb2, 또는 당업계에 공지된 다른 가능한 표적의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다. 미국 특허 번호 7,056,685는 수용체 활성을 검출하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 여러 방법을 기재 및 참고하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.

상기 기재된 다수의 검정, 예컨대 수용체 내재화 검정 또는 수용체 활성화 검정은 면역학적 결합 검정을 이용하는 표적 RTK의 검출 또는 정량 (예를 들어, 수용체 내재화 검정 동안 세포 표면 상의 RTK의 양을 검출하기 위해 방사성표지된 항체를 사용하는 경우)을 포함한다. 면역학적 결합 검정은 당업계에 널리 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; 및 4,837,168 참조). 일반적인 면역 검정의 검토를 위해, 또한 문헌 [Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991)]을 참조한다.

수용체 내재화 연구, 수용체 활성화 연구, 또는 수용체 검출 검정에 이용될 수 있는 것과 같은 면역검정은 종종 검출 항체 및 RTK에 의해 형성된 복합체에 특이적으로 결합시키고 이를 표지하기 위해 표지제를 사용한다 (본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 7,056,685 참조). 표지제는 그 자체로 수용체를 검출하기 위해 사용되는 항체일 수 있다 (여기서 항체는 본 발명의 모이어티일 수 있거나 또는 본 발명의 모이어티가 아닐 수 있음). 대안적으로, 표지제는 제3 작용제, 예컨대 2차 또는 3차 항체 (예를 들어, 표적 RTK에 특이적인 마우스 모노클로날 항체에 결합하는 항-마우스 항체)일 수 있다. 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질은 또한 면역학적 결합 검정에서 표지제로 사용될 수 있다. 이들 단백질은 다양한 종으로부터의 이뮤노글로불린 불변 영역과의 강력한 비-면역원성 반응성을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Kronval et al. (1973), J. Immunol. 111:1401-1406; Akerstrom et al. (1985), J. Immunol. 135:2589 2542] 참조). 표지제는 또한 스트렙타비딘과 같은 또 다른 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 검출가능한 작용제, 예컨대 비오틴으로 변형될 수 있다. 다양한 검출가능한 모이어티는 당업자에게 주지되어 있다.

일반적으로 사용되는 검정은 비경쟁적 검정, 예를 들어 샌드위치 검정 및 경쟁적 검정을 포함한다. 일반적으로 사용되는 검정 포맷은 샘플 내의 단백질의 존재를 검출 및 정량하기 위해 사용되는 웨스턴 블롯 (이뮤노블롯팅)을 포함한다. 검정에 사용되는 특정한 표지 및 검출가능한 기는 이것이 RTK 또는 RTK에 결합하여 이를 불활성화시키도록 설계된 본 발명의 모이어티를 검출하기 위해 사용된 이뮤노글로불린의 특정 결합을 유의하게 방해하지 않는 한 본 발명의 결정적인 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 면역검정의 분야에서 잘 개발되어 있고, 일반적으로, 이러한 방법에서 유용한 대부분의 임의의 표지가 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지는 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사성표지 (예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³²P), 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 효소), 및 비색 표지, 예를 들어 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 비드 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 라텍스)를 포함한다.

표지는 당업계에 주지된 방법에 따라 적절한 분석 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 표지는 또한 예를 들어, 효소 또는 형광단과의 접합에 의해 신호 생성 화합물에 직접 접합될 수 있다. 표지로서 관심있는 효소는 주로 히드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도타제, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 다양한 표지화 또는 신호 생성 시스템의 검토를 위해 미국 특허 번호 4,391,904를 참조한다.

표지의 검출 수단은 당업자에게 주지되어 있다. 따라서, 예를 들어 표지가 방사성 표지인 경우에, 검출 수단은 섬광 계수기 또는 오토라디오그래피에서와 같은 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우, 이는 적절한 파장의 광으로 형광색소를 여기시키고 생성된 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 전자 검출기, 예컨대, 전하 결합 소자 (CCD) 또는 포토멀티플라이어 등을 사용하여 사진 필름에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소성 표지는 효소에 적합한 기질을 제공하고 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 최종적으로 단순한 비색 표지는 표지에 관련된 색을 관찰함으로써 간단히 검출될 수 있다. 따라서, 다양한 딥스틱 검정에서, 접합된 금은 종종 분홍색으로 나타나는 한편, 다양한 접합된 비드는 비드의 색상을 나타낸다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 모이어티는 표적 RTK 상의 에피토프에 결합할 수 있고, 여전히 수용체 티로신 키나제의 엑토도메인의 이량체화를 허용한다. 이 실시양태에서, 모이어티의 결합은 2개의 단량체의 Ig-유사 도메인 (예를 들어, 유형 III 수용체 티로신 키나제의 D4-D4 또는 D5-D5 도메인 또는 유형 V 수용체 티로신 키나제의 D7-D7 도메인) 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미침으로써 수용체 티로신 키나제의 활성을 억제할 수 있다. 즉, 모이어티는 수용체 티로신 키나제 엑토도메인의 리간드 유도된 이량체화를 허용할 수 있으나, 세포 표면 인터페이스에서 2개의 엑토도메인의 배치에 영향을 미치거나 또는 수용체 티로신 키나제의 입체형태적 변화를 변경 또는 방지함으로써 수용체 티로신 키나제의 활성을 억제할 수 있다 (예를 들어, 수용체 내재화를 억제하고/거나 수용체의 티로신 자가인산화를 억제하고/거나 수용체가 하류 신호전달 경로를 활성화시키는 능력을 억제함).

따라서, 일부 실시양태에서, 수용체 이량체화를 허용하나 아직 수용체는 불활성이도록 하는 모이어티를 확인할 수 있는 검정을 이용하는 것이 유용하다. 이러한 검정은 하기 기재되어 있다. 예를 들어, 실시예 18은 PDGF 수용체를 사용하여 수행된 실험을 기재하고 있고, 여기서 수용체 이량체화는 가교를 이용하여 검출하고, 수용체 활성화는 포스포티로신 특이적 항체를 사용하여 결정한다. 또한, 실시예 23은 PDGFR의 돌연변이체가 리간드-유도된 수용체 이량체화의 결여에 의해 유발되지 않는 리간드-유도된 티로신 자가인산화의 손상을 갖는다는 것을 보여준다 (또한, 실시예 22-25의 방법 및 도입부 참조).

RTK의 입체형태적 상태는 또한 형광 공면 에너지 전달 (FRET) 분석에 의해 결정될 수 있다. 단백질 입체형태 및 상호작용을 결정하기 위한 형광 방법론의 포괄적 검토는 문헌 [Johnson (2005) Traffic. 2005 Dec;6(12):1078-92] (본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. FRET 검정에서, 관심있는 RTK를 적절한 FRET 형광단으로 표지한다. RTK를 표지한 후에, 표지된 RTK를 발현하는 세포를 본 발명의 시험 모이어티 및 RTK의 리간드 (예를 들어, Kit RTK에 대한 SCF)와 인큐베이션한다. FRET 분석은 리간드 결합, RTK 이량체화, 및/또는 수용체 활성화와 관련된 RTK의 입체형태적 변화의 관찰을 허용할 것이다. 이 방법에 의해 당업자는 하류 활성화가 일어나지 않은 RTK 이량체화를 나타내는 단백질 입체형태적 변화를 직접 평가할 수 있다. FRET 분석을 수행하기 위해 이용가능한 다수의 방법이 존재하며, 상이한 형광단의 사용 또는 이들 형광단을 관심있는 단백질로 도입하기 위한 상이한 기술로부터 큰 부분의 변화가 생겼다. FRET 형광단 및 분석 방법은 당업계에 주지되어 있고, FRET 기술의 개략적 검토는 문헌 [Heyduk. (2002) Current Opinion in Biotechnology. 13(4). 292-296] 및 그의 참조 문헌에서 가능하다. 하기 간행물이 FRET 방법을 설명하고 있으며, 본원에 참고로 포함된다: 문헌 [Kajihara et al. (2006) Nat Methods. 3(11):923-9; Biener-Ramanujan et al. (2006) Growth Horm IGF Res.16(4):247-57; Taniguchi et al. (2007) Biochemistry. 46(18):5349-57]; 미국 특허 번호 6,689,574; 5,891,646; 및 WIPO 공보 번호 WO/2002/033102. FRET 형광단을 RTK의 임의의 도메인 또는 힌지 영역 (예를 들어, 유형 III RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 유형 V RTK의 D7 도메인)에 도입하여 입체형태적 변화를 검출할 수 있고, 단 형광단은 RTK의 기능 또는 본 발명의 모이어티가 RTK에 결합하는 능력을 방해하지 않는다.

FRET에 유용한 형광단은 종종 하기 논의되는 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET)에 유용한 것과 동일하다. 가장 대중적인 FRET 방법은 반응성 시스테인 잔기를 관심있는 단백질로 조작하는 것이다. 이어서, 형광단을 선택된 시스테인 잔기와 용이하게 반응시킬 수 있다. 종종 융합 단백질이 구축되고, 이에 의해 관심있는 단백질이 녹색 형광 단백질에 융합된다 (문헌 [Neininger et al. (2001) EMBO Reports. 2(8):703-708] 참조). 추가의 방법 및 FRET에 유용한 형광단은 문헌 [Huebsch and Mooney (2007) Biomaterials. 28(15):2424-37; Schmid and Birbach (2007) Thromb Haemost. 97(3):378-84; Jares-Erijman AND Jovin (2006) Curr Opin Chem Biol. 10(5):409-16; Johansson (2006) Methods Mol Biol. 335:17-29; Wallrabe and Periasamy (2005) Curr Opin Biotechnol. 16(1):19-27; 및 Clegg RM (1995) Curr Opin Biotechnol. 6(1):103-10] (본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.

다른 실시양태에서, 어떤 RTK 형태가 특히 활성화가 일어나지 않는 이량체화를 나타내는지 (수용체에 따라) 결정하는 것은 알려져 있지 않거나 또는 어려울 수 있다. 이러한 경우에, 당업자는 수용체 이량체화를 결정하는 검정을 수용체 활성화를 결정하는 검정과 조합할 수 있다. 예를 들어, RTK 이량체화를 검출하기 위한 종래의 가교 연구 (문헌 [Rodriguez et al. (1990) Molecular Endocrinology, 4(12), 1782-1790]에 예시됨)를 임의의 상기 논의된 수용체 활성화 검정과 함께 이용할 수 있다. FRET 및 유사한 시스템이 또한 수용체 활성화 또는 이량체화를 직접 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 FRET 형광단을 RTK의 세포질 도메인 및 인산화 표적 단백질 (즉, 하류 신호전달 분자)에 도입시킴으로써, FRET는 하류 신호전달 분자가 RTK에 동원되는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 성공적인 모이어티는 가교 또는 FRET에 의해 측정된 바와 같이 수용체 이량체화를 허용하지만, FRET 또는 BRET 검정 또는 다른 수용체 활성화 검정 (예를 들어, 항-포스포티로신 항체 및 웨스턴 블롯을 이용하여 자가인산화 검정)에 의해 형광의 결핍으로 검출되는 바와 같이 수용체 활성화를 방지하는 것이다. 따라서, 본원에 기재된 기술을 이용하여, 당업자는 모이어티 (예를 들어, 소분자, 펩티드, 또는 항체)를 이들이 RTK 활성을 억제하고, 수용체 이량체화를 허용하지 여부를 결정하기 위해 용이하게 시험할 수 있다.

특히, 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET) 분석을 이용하여 RTK의 활성을 억제하는 모이어티를 확인할 수 있다. 미국 특허 공보 번호 20060199226, WIPO 공보 번호 WO/2006/094073, 및 문헌 [Tan et al. (2007. Molecular Pharmacology. 72:1440-1446)]은 RTK를 활성화시키는 리간드를 확인하는 방법을 구체적으로 기재하고 있고, 이에 따라 이들은 본원에 참고로 포함된다. 이들 기술을 시험관내 및 생체내에서 단백질 상호작용을 결정하는데 사용된다 (문헌 [Pfleger et al. (2006) Nature Protocols 1 337-345; Kroeger et al. (2001), J. Biol. Chem., 276(16):12736-43; 및 Harikumar, et al. (2004) Mol Pharmacol 65:28-35]; 모두 본원에 참고로 포함됨).

BRET은 RTK 활성화를 방지하는 모이어티에 대한 스크리닝에 의해 시험 화합물로부터본 발명의 모이어티를 확인하는데 유용하다.

미국 특허 공보 번호 2006/0199226 (본원에 참고로 포함됨)에 논의된 바와 같이, BRET 기반 검정을 이용하여 생물발광 공여자 분자 (DM)를 갖는 단백질과 형광 수용자 모이어티 (AM)를 갖는 단백질의 상호작용을 모니터링할 수 있다. 간략하게, RTK-DM 융합체를 발현하는 세포는 기질의 화학적 에너지를 광으로 전환시킬 것이다. RTK-DM 융합체에 밀접하게 근접한 AM (예를 들어, 신호전달 단백질-AM 융합체)이 존재한다면, 세포는 특정 파장에서 광을 방출할 것이다. 예를 들어, BRET 기반 검정을 이용하여 RTK-루시페라제 융합체 및 GFP-신호전달 단백질 융합체 사이의 상호작용을 평가할 수 있다. 이는 공여자 분자가 화학적 에너지 전환에 의해서 보다는 특정 파장의 광에 의해 여기될 수 있는 점에서 FRET 분석과 약간 상이하다. BRET 분석에 사용될 수 있는 루시페라제 활성을 갖는 생물발광 단백질의 예는 미국 특허 번호 5,229,285, 5,219,737, 5,843,746, 5,196,524, 5,670,356에서 찾아볼 수 있다. 대안적인 DM은 발광 신호를 생성하기에 적합한 기질에 작용할 수 있는 효소를 포함한다. 이러한 효소의 구체적인 예는 베타-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-글루쿠로니다제 및 베타-글루코시다제이다. 이들 효소에 대한 합성 발광 기질은 당업계에 주지되어 있고, 트로픽스 인크. (Tropix Inc.) (미국 매사추세츠주 베드포드)와 같은 회사로부터 시판된다. DM은 또한 곤충으로부터 단리 또는 설계된다 (미국 특허 번호 5,670,356).

기질에 따라, DM은 상이한 파장의 광을 방출한다. DM에 대한 기질의 비-제한적 예는 코엘렌테라진, 벤조티아졸, 루시페린, 에놀 포르메이트, 테르펜 및 알데히드 등을 포함한다. DM 모이어티는 RTK 단백질의 아미노 말단 또는 카르복실 말단 부분에 융합될 수 있다. 바람직하게는, RTK-DM 융합체 내의 BDM 도메인의 배치는 천연 단백질의 활성 또는 본 발명의 모이어티의 결합을 변경시키지 않는다. RTK-DM 융합 단백질은 이것이 천연 단백질의 생화학적 특성, 예컨대 리간드 결합 및 하류 신호전달 분자와 상호작용하는 능력을 유지하는지 확인하기 위해 시험될 수 있다.

BRET 분석에서 AM은 형광으로서 전달된 에너지를 다시 방출할 수 있다. AM의 예는 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 그의 이소형 및 유도체, 예컨대 YFP, EGFP, EYFP 등을 포함한다 (문헌 [R. Y. Tsien, (1998) Ann. Rev. Biochem. 63:509-544]). 바람직하게는, AM-단백질 융합체 내의 AM 도메인의 배치는 천연 단백질의 활성을 변경시키지 않는다. AM-제2 단백질 융합 단백질은 이것이 동족 천연 단백질의 생화학적 특성, 예컨대 RTK와의 상호작용을 유지하는지 확인하기 위해 시험할 수 있다. 예를 들어, 인산화되거나 또는 표적 RTK에 결합할 수 있는 임의의 기질에 대한 GFP 단백질의 아미노 말단 융합이 이용될 수 있다.

V. 본 발명의 모이어티를 함유하는 제약 조성물

또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 하나의 본 발명의 모이어티 (예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들), 항체 모방체, 소분자, 또는 펩티드성 분자) 또는 그의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 하나의 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체, 소분자, 또는 펩티드성 분자 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 RTK 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보적 활성을 갖는 항체 및 소분자, 예를 들어 유형 III RTK의 D3-D4 힌지 영역에 결합하는 소분자의 조합을 유형 III RTK의 D4 도메인에 결합하는 모노클로날 항체와 함께 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제에 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 항암제와 조합된 본 발명의 항-RTK 항체 (또는 소분자 또는 펩티드성 분자)를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예는 아래 보다 상세하게 기재된다.

본원에 사용된, "제약상 허용되는 담체"는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 본 발명의 모이어티는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연적인 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

본 발명의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고, 임의의 원치않는 독성 효과는 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리성 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.

본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입도의 유지, 및 계면활성 작용제의 사용으로 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기한 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 추가로, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 제약 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.

제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이들을 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입도의 유지, 및 계면활성 작용제의 사용으로 유지될 수 있다. 많은 경우에서 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물을 장기간 흡수시키는 것은 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 수행할 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 미세여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 (동결건조)인데, 이로써 앞서 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터 부가의 목적 성분이 활성 성분에 부가된 분말이 생성된다.

담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100％를 기준으로, 그 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 약 0.01％ 내지 약 99％ 활성 성분, 바람직하게 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게 약 1％ 내지 약 30％ 활성 성분의 범위일 것이다.

투여 처방은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 투여량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 또는 투여량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된, 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특별한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에 존재하는 제한 사항에 의해 지시되고 이에 직접적으로 좌우된다.

항체, 소분자, 또는 펩티드성 분자의 투여에 경우, 투여량은 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100 ㎎/kg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 ㎎/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수도 있고, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위 이내일 수도 있다. 예시적인 치료법은 1주 당 1회 투여, 2주 당 1회 투여, 3주 당 1회 투여, 4주 당 1회 투여, 1개월 당 1회 투여, 3개월 당 1회 투여, 또는 3개월 내지 6개월 당 1회 투여를 포함한다. 본 발명의 모이어티에 대한 바람직한 투여 처방은 정맥내 투여를 통해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체는 다음 투여 스케줄 중 하나를 이용하여 제공된다: (i) 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg 체중.

대안적으로, 보다 적은 횟수로 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체, 소분자, 또는 펩티드성 분자를 지속 방출 제형으로 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 투여된 물질의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방을 위해 적용하는 경우에는 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서는, 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 치료제를 투여할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분 및 소분자의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변화시킬 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 의학 분야에 주지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 달라될 것이다.

본 발명의 항-RTK 모이어티의 "치료 유효 투여량"은 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속 기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 무능력을 방지한다. 예를 들어, 종양의 치료의 경우, "치료 유효 투여량"은 세포 성장 또는 종양 성장을 치료되지 않은 대상체에 비해 바람직하게는 적어도 약 20％, 보다 바람직하게는 적어도 약 40％, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60％, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80％ 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력을 인간 종양에서의 효능을 예보하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 상기 특성은 숙련된 당업자에게 공지된 분석에 의해 시험관 내에서 상기 억제를 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가할 수 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 대상체에게서 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 항-RTK 모이어티는 RTK를 길항하는데 효과적인지 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 항-RTK 모이어티를 시험하는 한 가지 방법은 상호작용이 항-RTK 모이어티 및 RTK 사이에서 일어난다는 것을 확인하는 것이다. 예를 들어, 당업자는 본 발명의 항체, 소분자, 또는 펩티드성 분자가 인간 Kit RTK의 D4 또는 D5 도메인 또는 VEGF 수용체의 D7 도메인에 결합하는 여부를 시험할 수 있다. 이러한 결합에 대한 시험은 당업계에 주지되어 있고, 항-RTK 모이어티의 표지화(예를 들어, 방사성표지화), 결합이 일어날 수 있는 조건 하에서의 항-RTK 모이어티와 RTK의 인큐베이션, 이어서 겔 또는 인광 스크린 상에서의 복합체의 단리/시각화를 포함할 수 있다. 유사하게는, ELISA 기술을 이용하여 결합을 결정할 수 있다.

본 발명의 모이어티가 RTK를 길항하는지 여부를 결정하기 위한 또 다른 방법은 RTK의 세포질 도메인의 인산화 상태를 시험하는 것이다. 구체적인 실시양태에서, 효과적인 길항제는 RTK의 활성화 및 자가인산화를 방지할 것이다. RTK의 인산화는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여, 예를 들어 RTK의 인산화된 잔기에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 시험할 수 있다. 인산화 사건을 검출하는 다른 방법은 미국 특허 번호 6548266; 또는 문헌 [Goshe et al. (2006) Brief Funct Genomic Proteomic. 4:363-76; de Graauw et al. (2006) Electrophoresis. 27:2676-86; Schmidt et al. (2007) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 849:154-62]에 기재된 것; 또는 퍼킨엘머(PerkinElmer)에 의한 [감마-33P]ATP를 사용하는 키나제 인산화 검정에 대한 플래쉬플레이츠(FlashPlates) (SMP200) 프로토콜을 사용하는 것을 포함한다. 당업자는 이들 방법, 및 실시예에서 입증된 것이 또한 RTK에 의해 인산화되고, 세포 내에서 신호 전달자인 단백질의 인산화 상태를 결정하기 위해 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 단백질의 인산화 상태의 검출은 또한 RTK가 본 발명의 모이어티에 의해 효과적으로 길항되는지 여부를 나타낼 것이다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중에서 한 가지 이상을 이용하여 한 가지 이상의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경으로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 결합 모이어티에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입 경로를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 대체로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 항-RTK 결합 모이어티는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여될 수 있다.

활성 화합물은 예를 들어 제어 방출 제제, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.

치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 기기를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 바늘 없는 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 주지된 이식물 및 모듈의 예는 미국 특허 번호 4,487,603에 개시된, 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식가능 마이크로-주입 펌프; 미국 특허 번호 4,486,194에 개시된, 피부를 통하여 의약을 투여하기 위한 치료 장치; 미국 특허 번호 4,447,233에 개시된, 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프; 미국 특허 번호 4,447,224에 개시된, 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 기구; 미국 특허 번호 4,439,196에 개시된, 멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템; 및 미국 특허 번호 4,475,196에 개시된, 삼투성 약물 전달 시스템을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참고로 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.

V. 본 발명의 모이어티의 사용 방법

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 모이어티를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 RTK 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항-RTK 모이어티, 예를 들어 항체, 소분자, 또는 펩티드성 분자는 수용체 티로신 키나제 관련 질환의 진단 및 치료를 포함하는 다수의 시험곤내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 본 발명의 결합 모이어티는 배양물, 시험관내 또는 생체외에서 세포에 투여하거나 또는 인간 대상체에게 예를 들어 생체내에서 투여하여, 수용체 티로신 키나제 관련 질환을 치료, 예방 및 진단할 수 있다.

본원에 사용된 "수용체 티로신 키나제 관련 질환"은 RTK 활성에 의해 매개되거나 또는 비정상적인 RTK 발현 또는 활성화와 관련된 질환 또는 상태이다. 수용체 티로신 키나제 관련 질환의 예는, 예를 들어 FGF 수용체, HGF 수용체, 인슐린 수용체, IGF-1 수용체, NGF 수용체, VEGF 수용체, PDGF-수용체-α, PDGF-수용체-β, CSF-1-수용체, 및 Flt3-수용체와 관련된 질환 또는 상태, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 당뇨병성 망막병증 또는 통증 관련 질환을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 관련 질환의 구체적인 예는 위장 기질 종양 (GIST), 급성 골수성 백혈병 (AML), 소세포 폐암 (SCLC), 유방암, 골 전이성 유방암, 림프 질환 및 건활막 거대 세포 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용체 티로신 키나제 관련 질환의 추가의 예는 결장암 (소장암 포함), 폐암, 유방암, 췌장암, 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 급성 골수성 백혈병, 신장암, 방광암, 난소암 및 전립선암을 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예는 신암 (예를 들어, 신세포 암종), 교모세포종, 뇌 종양, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 림프구성 림프종, 원발성 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역모세포성 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 중심모세포/중심세포 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통 미만성 거대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프절병증 (AILD)-유사 T 세포 림프종 및 HIV 관련 체강계 림프종), 배아 암종, 미분화성 비인두 암종 (예를 들어, 슈민케 종양), 캐슬만병, 카포시 육종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 다른 B-세포 림프종, 비인두 암종, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS) 신생물, 종양 혈관신생, 척수 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 표피양암, 편평세포암, 석면에 의해 유발된 것을 포함하여 환경적으로 유발된 암, 예를 들어 중피종 및 상기 암의 조합을 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 림프 질환, 또는 "림프계의 질환"은 무섬유소혈증, 빈혈, 재생불량성 빈혈, 용혈성 빈혈, 선천성 비구상적혈구 빈혈, 거대적혈모구성 빈혈, 악성 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, 신성 빈혈, 호산구증가증을 동반한 혈관림프구 증식증, 항트롬빈 III 결핍, 버나드-술리에 증후군, 혈액 응고 장애, 혈소판 장애, 청색 고무 수포 모반 증후군, 체디악-히가시 증후군, 한랭글로불린혈증, 파종성 혈관내 응고, 호산구증가증, 에르트하임-체스터 질환, 적모구증, 태아, 에반스 증후군, 인자 V 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XI 결핍, 인자 XII 결핍, 판코니 빈혈, 거대 림프절 증식증, 혈액 질환, 혈색소병증, 혈색소뇨증, 발작, a형 혈우병, b형 혈우병, 신생아 출혈성 질환, 조직구증, 조직구증, 랑게르한스-세포, 조직구증, 비-랑게르한스-세포, 작업 증후군, 백혈구감소증, 림프절염, 림프관평활근종증, 림프부종, 메트헤모글로빈혈증, 골수이형성 증후군, 골수섬유증, 골수 화생, 골수증식성 장애, 호중구감소증, 파라단백혈증, 혈소판 저장 풀 결핍, 진성 적혈구증가증, 단백질 c 결핍, 단백질 s 결핍, 자반증, 혈소판감소성, 자반증, 혈전성 혈소판감소성, RH-동종면역, 사르코이드증, 사르코이드증, 구상적혈구증, 비장 파열, 지중해빈혈, 혈소판무력증, 혈소판감소증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 폰 빌레브란트 질환을 포함한다.

또한, 다양한 종양 세포 상에서 유형 III 또는 유형 V RTK를 발현하는 경우, 본 발명의 결합 모이어티, 조성물 및 방법은 종양형성 장애, 예를 들어 Kit를 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 장애 (예를 들어, 위장 기질 종양, 비만 세포 질환 및 급성 골수성 백혈병 포함)를 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 종양형성 장애를 갖는 다른 대상체의 예는 신암 (예를 들어, 신세포 암종), 교모세포종, 뇌 종양, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 림프구성 림프종, 원발성 CNS 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할-세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역모세포성 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 중심모세포/중심세포 (cb/cc) 여포성 림프종 암, B 계통 미만성 거대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프절병증 (AILD)-유사 T 세포 림프종 및 HIV 관련 체강계 림프종), 배아 암종, 미분화성 비인두 암종 (예를 들어, 슈민케 종양), 캐슬만병, 카포시 육종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 다른 B-세포 림프종, 비인두 암종, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS) 신생물, 종양 혈관신생, 척수 축 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 표피양암, 편평세포암, 석면에 의해 유발된 것을 포함하여 환경적으로 유발된 암, 예를 들어 중피종 및 상기 암의 조합을 갖는 대상체를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 대상체는 수용체 티로신 키나제 관련 질환을 갖는 인간 대상체를 포함한다.

본 발명의 모이어티 (예를 들어, 항체, 그의 항원-결합 부분, 소분자, 펩티드성 분자, 항체 모방체, 및 조성물)는 RTK 관련 질환의 치료 및 진단에서 추가의 유용성을 갖는다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 소분자, 또는 펩티드성 분자를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 하기 생물학적 활성 중 하나 이상을 도출할 수 있다: RTK (예를 들어, Kit, VEGF 수용체 또는 PDGFR)를 발현하는 세포의 성장을 억제하고/거나 이를 사멸시키는 활성; 인간 이펙터 세포의 존재하에 RTK (예를 들어, Kit, VEGF 수용체 또는 PDGFR)를 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 매개하는 활성; 또는 RTK, 예를 들어 RTK의 유형 III 또는 유형 V 패밀리의 구성원의 엑토도메인을 불활성 상태 및/또는 단량체 상태로 고정시킴으로써 수용체의 활성을 길항하는 활성.

생체내 및 시험관내에서 본 발명의 항-RTK 모이어티를 투여하는 적합한 경로는 당업계에 주지되어 있고, 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 항-RTK 모이어티는 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 결합 모이어티 조성물의 농도 및/또는 제제화에 따라 달라질 것이다.

이전에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항-RTK 모이어티는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 공동 투여될 수 있다. 모이어티는 작용제에 연결될 수 있거나 또는 작용제와 분리하여 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별도 투여), 결합 모이어티는 작용제 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여될 수 있거나 또는 다른 공지의 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선조사와 공동 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 특히 항신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스파미드 히드록시우레아를 포함하고, 이들은 그 자체로 환자에게 독성 또는 아독성인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주 마다 1회 100 mg/ 용량으로 정맥내 투여되고, 아드리아마이신은 21일 마다 1회 60-75 mg/ml 용량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 항-RTK 결합 모이어티와 화학요법제의 공동 투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 나타내는 다양한 메카니즘을 통해 작동하는 두 가지 항암 작용제를 제공한다. 이러한 공동 투여는 결합 모이어티에 비반응성이 되도록 할 약물에 대한 내성의 발생 또는 종양 세포의 항원성의 변화로 인한 문제를 해결할 수 있다.

비정상적인 세포 증식에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-RTK 모이어티 파트너 분자 접합체를 투여할 때, 약 0.001 μM 내지 20 μM 또는 약 0.01 μM 내지 5 μM의 투여되는 화합물의 순환 농도를 사용할 수 있다.

본원에 기재된 화합물의 경구 투여를 위한 환자 용량은 전형적으로 약 1 mg/일 내지 약 10,000 mg/일, 보다 전형적으로 약 10 mg/일 내지 약 1,000 mg/일, 가장 전형적으로 약 50 mg/일 내지 약 500 mg/일의 범위이다. 환자 체중 측면에서 언급하면, 전형적인 용량은 약 0.01 내지 약 150 mg/kg/일, 보다 전형적으로 약 0.1 내지 약 15 mg/kg/일, 가장 전형적으로 약 1 내지 약 10 mg/kg/일의 범위, 예를 들어 5 mg/kg/일 또는 3 mg/kg/일이다.

적어도 일부 실시양태에서, 종양 성장을 지연시키거나 또는 억제하는 환자 용량은 1 μmol/kg/일 이하일 수 있다. 예를 들어, 환자 용량은 0.9, 0.6, 0.5, 0.45, 0.3, 0.2, 0.15, 또는 0.1 μmol/kg/일 또는 그 미만일 수 있다 (약물의 몰을 참조함). 바람직하게는, 항-RTK 모이어티 약물 접합체는 적어도 5일의 기간에 걸쳐 일일 투여량으로 투여된 경우 종양의 성장을 지연시킨다.

한 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 화합물 (예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항-RTK 결합 모이어티에 연결시킴으로써 이러한 화합물을 RTK 세포 표면 수용체를 갖는 세포에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-RTK 모이어티는 그의 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 6,281,354 및 6,548,530, 미국 특허 공보 번호 20030050331, 20030064984, 20030073852 및 20040087497에 기재되거나 또는 WO 03/022806에 공개된 임의의 독소 화합물에 접합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 RTK를 발현하는 세포를 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자로) 생체외 또는 생체내에서 국소화하는 방법을 제공한다.

표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 그의 항원-결합 부분, 소분자, 또는 펩티드성 분자)에 연결된 이펙터 세포가 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포는 호산구, 천연 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포를 포함한다. 원하는 경우에, 이펙터 세포는 치료하려는 대상으로부터 수득할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학상 허용되는 용액 중의 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 10⁸-10⁹개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 양은 표적 세포, 예를 들어 RTK를 발현하는 종양 세포에서의 국소화를 수득하고, 세포 사멸 (예를 들어, 포식작용에 의함)에 영향을 미치기에 충분할 것이다. 투여 경로는 또한 달라질 수 있다.

표적-특이적 이펙터 세포를 사용하는 요법은 표적화된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 모이어티 및/또는 이들 조성물로 보강된 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 요법은 화학요법과 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 샘플, 및 대조군 샘플을 인간 RTK에 특이적으로 결합하는 RTK 결합 모이어티, 예를 들어 인간 모노클로날 항체 또는 다른 결합 모이어티와 항체 또는 다른 모이어티 및 인간 RTK, 예컨대 Kit 또는 인간 VEGF 수용체 사이의 복합체의 형성을 허용하는 조건하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 인간 RTK 항원의 존재를 검출하거나, 또는 인간 RTK 항원 (예를 들어, 인간 Kit RTK, 인간 VEGF 수용체 또는 PDGFR의 Ig-유사 도메인)의 양을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이어서, 복합체의 형성을 검출하고, 여기서 대조군 샘플에 비해 샘플 사이에서의 복합체 형성의 차이는 샘플에 RTK, 예를 들어 인간 Kit RTK, 인간 VEGF 수용체 또는 PDGFR RTK가 존재한다는 것을 나타낸다.

또한, 항-RTK 결합 모이어티 (예를 들어, 항체, 그의 항원-결합 부분, 소분자, 또는 펩티드성 분자) 및 사용 지침서를 포함하는 키트가 본 발명의 범주 내에 있다. 키트는 하나 초과의 추가의 시약, 예컨대 면역저해 시약, 세포독성제 또는 방사성독성제 또는 하나 이상의 추가의 본 발명의 항-RTK 모이어티 (예를 들어, 제1 항-RTK 모이어티와 구별되는 RTK 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 갖는 항-RTK 결합 모이어티)를 추가로 함유할 수 있다. 전형적으로, 키트는 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트상에 또는 키트와 함께 제공되는 임의의 기입물 또는 기록물 또는 다른 방식으로 키트에 수반되는 물질을 포함한다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 추가로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원 공개의 내용 뿐만 아니라 도면은 그 전체가 명백하게 본원에 참고로 포함된다.

실시예

실시예 1-19로의 도입

줄기 세포 인자 (SCF)는 수용체 티로신 키나제 Kit (또한, SCF-수용체로 공지됨)에의 결합 및 이의 활성화에 의해 그의 다양한 세포 반응을 매개하는 시토카인이다. Kit는 처음에 활성화 및 말단절단된 형태의 표면 수용체를 포획한 고양이과 레트로바이러스에서 종양유전자로 발견되었다 (문헌 [Besmer et al. (1986) J Virol 60: 194-203]). SCF는 뮤린 스틸 (SI) 로커스에 의해 코딩되는 한편, Kit는 마우스에서 우성 백색 스폿팅 (W) 로커스에 의해 코딩된다 (문헌 [Copeland et al. (1990) Cell 63: 175-183; Huang et al. (1990) Cell 63: 225-233; Flanagan and Leder (1990) Cell 63: 185-194.; Tan et al. (1990) Science 247: 209-212; Bernstein et al. (1990) Ciba Found Symp 148: 158-166; discussion 166-172]). SCF는 비-공유 동종이량체로서 기능하고, 대안적인 RNA 스플라이싱 및 단백질분해 처리에 의해 생성된 막-앵커링된 및 가용성 형태의 SCF가 둘 다 기재되어 있다 (문헌 [Ashman (1999) Int J Biochem Cell Biol 31:1037-1051]에서 검토됨). Kit는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 유형-III 패밀리의 구성원이고, 또한 PDGF-수용체-α, 및 β, CSF-1-수용체 (또한 M-CSF-수용체 또는 Fms로 공지됨), 및 Flt3-수용체 (또한 Flk2로 공지됨) (문헌 [Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212; Blume-Jensen et al. (2001) Nature 411: 355-365]에서 검토됨)를 포함한다. Kit는 단일 막횡단 (TM) 도메인에 의해 세포질 영역에 연결된 글리코실화된 세포외 리간드 결합 도메인 (엑토도메인)으로 구성된다 (문헌 [Schlessinger (2000) Cell 103: 211-225]에서 검토됨). Kit 및 유형-III RTK의 다른 구성원의 엑토도메인은 모두 5개의 Ig-유사 도메인을 함유하고, 여기서 제2 및 제3 막 말단 도메인은 리간드 인식에서 소정의 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Ullrich and Schlessinger (1990) Cell 61: 203-212]에서 검토됨). 그의 세포외 리간드 결합 도메인이 오직 여러 개의 Ig-유사 반복부로 구성된 다른 RTK는 VEGF-수용체 패밀리 (7개 Ig-유사), CCK4-수용체 (7개 Ig-유사) 및 FGF-수용체 (3개 Ig-유사)의 구성원을 포함한다. Kit의 세포질 영역은 큰 키나제-삽입체 영역 (유형-III RTK의 또 다른 특징)을 갖는 단백질 티로신 키나제 (PTK) 도메인을 함유한다. SCF의 Kit에의 결합은 수용체 이량체화, 분자간 자가인산화 및 PTK 활성화를 유도한다. Kit의 제4 Ig-유사 도메인이 1가 또는 2가 SCF 결합에 반응하는 Kit 이량체화를 담당한다고 제안되었다 (문헌 [Lev et al. (1992b) J Biol Chem 267: 15970-15977; Blechman et al. (1995) Cell 80: 103-113]). 그러나, 다른 연구는 Kit의 리간드 유도된 이량체화가 SCF의 2가 결합에 의해 구동되었음을 입증하였다 (문헌 [Philo et al. (1996) J Biol Chem 271: 6895-6902; Lemmon et al. (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317]).

SCF 또는 Kit 로커스에서 돌연변이화된 마우스의 특성화는 SCF 및 Kit가 조혈 세포, 멜라닌세포, 배세포 및 장 페이스메이커 세포의 발생에 필요하다는 것을 밝혀냈다 (문헌 [Ashman (1999) Int J Biochem Cell Biol 31:1037-1051]에서 검토됨). 인간에서, Kit 내의 돌연변이 기능의 손실은 복측 흉부 및 복부의 색소탈색, 모발의 백색 페어플록, 난청 및 변비를 특징으로 하는 흑백 얼룩 특성의 원인이 된다 (문헌 [Fleischman et al. (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88: 10885-10889]). Kit에서의 다양한 기능 획득 돌연변이는 상이한 유형의 인간 암에서 발견되었다. Kit 돌연변이의 활성화는 다른 암 중에서 위장-기질 종양 (GIST), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 비만 세포 백혈병 (MCL)에서 발견되었다. 돌연변이는 막 근접 Ig-유사 도메인 (D5) (엑손 8 및 9), 막근접 (JM) 도메인 (엑손 11), 및 티로신 키나제 (PTK) 도메인 (엑손 17)에서 확인되었다 (문헌 [Forbes et al. (2006) COSMIC 2005. BR J. CANCER, 94: 318-22]. Somatic mutation database: Catalogue of Somatic Mutations in Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). JM 및 PTK 도메인 내의 기능 획득 돌연변이가 자가억제 제약을 완화시킴으로써 Kit의 구성적 활성화를 유발한다는 우수한 증거가 존재하는 한편 (문헌 [Mol et al. (2004) J Biol Chem. 279: 31655-31663]), 엑토도메인의 D5에서의 기능 획득 돌연변이의 기초가 되는 분자 메커니즘은 이해되지 않는다. RTK, 예컨대 Kit 및 PDGFR 뿐만 아니라 SCF, PDGFα/β, 및 결합된 Kit/SCF 복합체의 구조를 보다 양호하게 특성화할 필요가 있다. 이러한 특성화는 약물, 제약 또는 다른 생물제제로 표적화될 수 있는 영역의 유익한 확인으로 이어질 것이다.

줄기 세포 인자 (SCF)는 티로신 키나제 활성화를 유발하는 Kit의 엑토도메인에의 결합에 의해 그의 다중 세포 반응을 시작한다. 아래 실시예 중 일부에 SCF 자극 전에 및 후에 Kit의 전체 엑토도메인의 결정 구조가 기재된다. 구조는 Kit 이량체화가 그의 유일한 역할이 2개의 Kit 분자를 함께 가져오는 것인 SCF 결합에 의해 구동된다는 것을 보여준다. 수용체 이량체화는 2개의 Kit 분자의 막 근접 Ig-유사 도메인 D4 및 D5 사이의 측면 상호작용을 가능하게 하는 입체형태적 변화에 따른다. 배양된 세포를 사용한 실험은 Kit 활성화가 D4-D4 상호작용에 중요 아미노산 내의 점 돌연변이에 의해 절충된다는 것을 보여준다. 또한, 다양한 종양원성 돌연변이가 D5-D5 인터페이스에 맵핑되었다. Kit 구조의 중요한 특징, 리간드-유도된 수용체 이량체화 및 D4-D4 인터페이스 내의 결정적인 잔기가 다른 수용체에서 보존되므로, 이 보고서에서 밝혀진 Kit 자극의 메커니즘은 다른 수용체 활성화에 대해 적용할 수 있다. 이는 이들 인터페이스에 표적화된 약물 또는 생물제제가 치료제로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

본원에 기재된 SCF 자극 전에 및 후에 Kit의 전체 엑토도메인의 X선 결정 구조의 설명은 SCF-유도된 Kit 이량체화 및 활성화의 메커니즘과 관련된 유용한 통찰을 제공한다. 구조는 D1, D2 및 D3으로 지정된 Kit의 처음 3개의 Ig-유사 도메인이 SCF 결합을 담당한다는 것을 보여준다. SCF 결합의 주요 역할은 2개의 Kit 분자를 가교시켜 세포 막 상의 Kit의 국부 농도를 증가시키는 것이다. 이는 이웃하는 Kit 분자의 D4 또는 D5 사이의 동형 상호작용을 유발하는 Kit의 막-근접 영역에서의 큰 입체형태적 변화를 용이하게 한다. 2개의 이웃하는 Kit 분자의 D4 사이의 측면 상호작용은 각각의 D4 프로모터의 EF 루프로부터의 염 브릿지 2쌍을 통한 직접적인 접촉을 통해 일어난다. 막 근접 D5 도메인은 이웃하는 Kit 분자 사이의 추가의 간접적인 상호작용을 제공하여, 세포질 티로신 키나제의 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향에서 엑토도메인의 막 근접 부분을 추가로 안정화시키고 배치한다.

하기 실시예 중 몇몇 실시예에 단량체 형태 및 SCF-유도된 동종이량체 (SCF-Kit 2:2 복합체) 형태 둘 다의 Kit의 전체 엑토도메인의 결정 구조가 기재된다. 3.0Å 해상도에서의 비점유 단량체 형태 및 3.5Å 해상도에서의 SCF-유도된 동종이량체 형태의 상세도는 Kit 및 다른 RTK의 활성화 메커니즘과 관련된 새로운 통찰을 제공한다. 당업자는 하기 기재된 실험을 다른 RTK로 수행할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있는 RTK 서열의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: Kit mRNA NM_000222.2에 대한 진뱅크 참조 서열 (단백질 NP_000213.1을 코딩함;

또는 Kit mRNA NM_001093772.1의 변이체 2에 대한 진뱅크 참조 서열 (단백질 NP_001087241.1을 코딩함;

여기서, 단백질은 표준 1-문자 아미노산 코드로 지정됨.

실시예 1: SCF 및 Kit의 발현, 정제 및 결정화

D1, D2, D3, D4 및 D5로 지정된 5개의 Ig-유사 도메인으로 구성된 Kit의 전체 엑토도메인은 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포에서 발현시켰다. 정제된 Kit 엑토도메인 단량체 또는 SCF-유도된 Kit 엑토도메인 동종이량체 (SCF-Kit 2:2 복합체)를 각각 결정 성장 및 최적화를 위해 광범위하게 스크리닝한 후에 이들의 결정 구조를 결정하였다.

단백질 발현 및 정제

C-말단에 폴리-히스티딘 태그를 함유하는 가용성 Kit 엑토도메인 (아미노산 1-519)을 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포 (Sf9)에서 발현시켰다. Kit 엑토도메인을 Ni-킬레이트에 이어 크기-배제 크로마토그래피 (슈퍼덱스(Superdex) 200, 지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 정제하였다. 엔도-글리코시다제 F1을 사용하는 부분적인 탈글리코실화 후에, 엑토도메인을 음이온 교환 크로마토그래피 (모노 큐(Mono Q), 지이 헬스케어)에 의해 추가로 정제하였다. SCF (1-141)를 이전에 기재된 바와 같이 발현시키고, 재폴딩시키고, 정제하였다 (문헌 [Langley et al. (1994) Arch Biochem Biophys 311: 55-61; Zhang et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 7732-7737]).

세포주 및 발현 벡터

HEK 및 NIH3T3 세포를 각각 10% FCS 및 10% CS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. SCF 자극 이전에, 세포를 이전에 기재된 바와 같이 혈청 비함유 배지에서 밤새 고갈시켰다 (문헌 [Kouhara et al. (1997) Cell 30: 693-702]). 제조사의 지시에 따라 리포펙틴 (인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 전장 Kit의 cDNA를 일시적인 형질감염을 위해 RK5 발현 벡터로 서브클로닝하고, 안정한 발현을 위해 pBABE/puro 벡터로 서브클로닝하였다 (문헌 [Kouhara et al. (1997) Cell 30: 693-702]). 토끼를 재조합 Kit 엑토도메인으로 면역화시켜 항-Kit 항체를 생성하였다. 모노클로날 항-Kit 항체 (산타 크루즈(Santa Cruz))를 이뮤노블롯팅에 사용하였다. 항-포스포티로신 (항-pTyr) 항체는 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology)로부터 구입하였다.

결정화 및 데이터 수집

Kit 엑토도메인 단독 또는 SCF와 복합체를 형성한 Kit 엑토도메인의 샘플을 결정 성장 및 최적화를 위해 광범위하게 스크리닝하였다. 대략 0.12x0.1x0.05 mm의 치수를 갖는 탈글리코실화된 엑토도메인의 결정을 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 포함하는 포스페이트 완충제 (0.1 M Na-Pi 완충제 (pH 6.0), 0.2 M KCl, 12% PEG 400) 중에서 4℃에서 침전물로 수득하였다. 모든 결정을 5-18% 글리세롤이 보충된 저장 용액에 몇 초 동안 침지시키고; 급속 냉각시키고, 데이터 수집 동안 100° K에서 질소 기체의 스트림 중에 유지시켰다. 결정은 비대칭 유닛 당 하나의 분자를 갖는 6 각형 격자 셋팅에서 단위 셀 치수가 a = 162.4Å, 및 c = 67.1Å인 정사방형 공간군 R3에 속하였다. Kit의 백금, 브로민 및 아이오딘 유도체는 결정을 중원자 시약을 함유하는 저장 용액에 0.1 mM 내지 50 mM의 농도 범위로 몇 초 내지 10일 동안 277K에서 침지시켜 제조하였다.

SCF-Kit 복합체의 결정을 침전제로서 폴리에틸렌글리콜 (PEG) (0.2 M 황산암모늄, 8-12% PEG 8000, 5-8% 에틸렌 글리콜 (pH 7.0-8.5))과 4℃에서 성장시키고, 회절 데이터를 NSLS, 부룩하벤 내셔널 래보러토리(Brookhaven National Laboratory)의 X25 빔라인에서 ADSD 양자-210 CCD 검출기를 사용하여 3.5Å의 해상도로 수집하였다. 결정은 단위 셀 치수가 a = 269.5Å, b = 52.1Å, c = 189.8Å, β = 108.2°인 단사정 공간군 C2에 속하고, 이는 비대칭 유닛에서 SCF 및 Kit 분자의 2개의 세트로 구성된다. 모든 데이터 세트를 DENZO 및 SCALEPACK 및 HKL2000 프로그램 패키지를 사용하여 처리 및 스케일링하였다 (문헌 [Otwinowski et al. (1997) Methods Enzymol. 276: 307-326]). 데이터 수집 통계치는 표 1A에 요약된다.

실시예 2: 구조 결정

실험적 위상은 비정상 산란을 갖는 다중 이질동상 대체법 (MIRAS)을 사용하고, 3.0Å 해상도로의 다중-파장 불규칙적 회절 (MAD)에 의해 계산하였다 (표 1A). 생성된 전자-밀도 맵은 β 샌드위치 구조의 연속적인 전자 밀도, 및 명백한 용매-단백질 경계를 보여주었다. 단량체 Kit 엑토도메인의 분자 모델을 실험적 전자 밀도 맵으로 수동적으로 구축하였다. 구조를 25.4%의 결정학적 R-인자 및 29.6%의 자유 R-인자로의 원시 데이터 세트를 이용하여 3.0Å 해상도로 정교화하였다 (표 1B). SCF-Kit 2:2 복합체의 구조는 검색 모델로서 이 보고서에 기재된 단량체 형태의 구조 및 SCF의 구조를 사용하여 분자 대체법에 의해 풀었다 (문헌 [Zhang et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 7732-7737]; 단백질 데이터 뱅크로부터 코드: 1EXZ로 조회할 수 있음). 구조를 24.9%의 결정학적 R-인자 및 29.5%의 자유 R-인자로의 원시 데이터 세트를 이용하여 3.5Å 해상도로 정교화하였다 (표 1A 및 1B). Pymol (pymol.sourceforge.net) 및 CCP4MG (문헌 [Potterton et al. (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2288-2294]) 소프트웨어를 사용하여 분자 영상을 생성하였다. Kit 단량체 및 SCF-Kit 복합체의 원자 좌표 및 구조 인자는 각각 승인 코드 2EC8 및 2E9W로 단백질 데이터 뱅크 (rcsb.org/pdb)에 기탁되어 있다.

[표 1A]

[표 1B]

실시예 3: Kit 엑토도메인의 구조의 분석

엑토도메인 구조의 일반적인 분석

Kit 엑토도메인은 대략적인 치수가 170 x 60 x 50Å인 연장된 세르펜틴 형상을 보여준다 (도 1a). Kit의 D1, D2, D3, D4 및 D5 도메인은 2개의 역평행 β 시트로 이루어진 β 샌드위치로 조립된 ABCC'DEFG로 지정된 8개의 β 가닥으로 구성된 전형적인 이뮤노글로불린 슈퍼 패밀리 (IgSF) 폴드를 나타낸다 (도 1a). D1, D2, D3 및 D5는 각각 2개의 β 시트를 가교시켜 Ig-유사 폴드의 소수성 코어의 중심을 형성하는 위치인 B5 및 F5 (각각 가닥 B 및 F의 제5 아미노산)에서 시스테인 잔기를 연결하는 보존된 디술피드 결합을 함유한다 (문헌 [Harpaz and Chothia (1994) J Mol Biol 238: 528-539]). D2 및 D5는 2개의 디술피드 결합을 함유하고, D4는 어떠한 시스테인 잔기도 함유하지 않으나, 그럼에도 불구하고 D4의 Ig-유사 폴드의 강도는 B5 및 F5에서 보존된 시스테인 잔기가 각각 발린 및 페닐알라닌 잔기로 대체되더라도 유지된다.

2개의 도메인의 축을 따른 D1 및 D2 사이의 각은 76°로 (도 1a, b), 인터류킨-1β 수용체의 제1 및 제2 Ig-유사 도메인 사이의 배향과 닮았다 (문헌 [Vigers et al. (1997) Nature, 386: 190-194]). 대조적으로, D2 및 D3 사이의 각은 150°이고, D3 및 D4 사이의 각은 119°이고, D4 및 D5 사이의 각은 162°이다. 상이한 Ig-유사 도메인에 대한 ABED 및 A'GFC β-시트 사이의 배향은 D1-D2의 경우 약 180°, D2-D3의 경우 약 180°, D3-D4의 경우 약 90°, D4-D5의 경우 약 180°이다 (도 1).

Ig-폴드에 대한 표준으로 사용된 텔로킨 (문헌 [Holden et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 840-851])과 Kit 엑토도메인의 모든 5개의 Ig-유사 도메인의 중첩은 동등한 Cα 원자에 대해 1.5-2.9Å의 근평균 제곱 (r.m.s.) 편차를 나타낸다. D2는 텔로킨과 중첩시 그의 보다 높은 r.m.s.d. 값에 의해 나타난 바와 같이 5개의 Kit Ig-유사 도메인 중에서 가장 다르다 (도 8). Ig-유사 도메인에서 중요 아미노산의 구조적 보존 및 이들의 2차적인 구조적 위상 (문헌 [Harpaz et al. (1994) J Mol Biol 238: 528-539; Halaby et al. (1999) Protein Eng 12: 563-571])에 기초하여, D1, D2, D3 및 D4는 I-하위세트에 속하고, D5는 IgSF의 C2 및 IgCAM 하위세트와 관련된다. 또한, IgSF의 구조적으로 보존된 20개의 핑거-프린트 잔기 (문헌 [Harpaz et al. (1994) J Mol Biol 238: 528-539]) 중에서, 10-14개의 잔기가 Kit의 5개의 Ig-유사 도메인에서 보존된다 (표 2).

Kit Ig-유사 도메인의 구조의 상세한 분석

Kit D1. D1 폴드는 2개의 β 시트로 구성된 β 샌드위치이다. 1개의 시트는 3-가닥, A, B 및 E에 의해 형성되고, 제2 시트는 5-가닥, A', G, F, C 및 C'로 구성된다 (ABE/A'GFCC'). Pro41에서 시스-입체형태에 의해 개재된 제1 가닥은 A 및 A'의 2개의 보다 짧은 가닥으로 나누어지고, 이들은 각각 가닥 B 및 G와 쌍을 이룬다. B5의 Cys58을 F5의 Cys97과 연결시키는 디술피드 결합은 2개의 β 시트를 가교시킨다. 가닥 C와 상호작용하는 매우 긴 가닥 C'는 가닥 E에 직접 연결된 D1의 상부 측면을 향한 폴리펩티드 쇄의 C-말단을 향한다. Ig-유사 도메인 명명법에 기초하여, D1은 IgSF의 I2-하위세트에 속한다 (문헌 [Casasnovas et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 4134-4139]).

Kit D2. D2는 가닥 B, E, 및 D에 의해 형성된 작은 β-시트 및 가닥 A', G, F 및 C로 구성된 제2 β-시트 (BED/A'GFC) 뿐만 아니라 가닥 E 및 F 사이의 교차점 (잔기 177-179)에서의 추가의 헬릭스로 이루어진다. IgSF의 I-세트의 20개의 특징적인 잔기 중 11개가 D2 상에서 확인되었으나, 이 Ig-유사 도메인은 다수의 방식으로 IgSF의 표준 I1-세트와 상이하다. D2는 C4 위치에 Leu 잔기를 갖는 한편, IgSF의 다른 I1-세트는 보존된 Trp를 갖는다. 가닥 B에서의 수소 결합의 패턴은 가닥 B 및 B'로 지칭되는 2개의 짧은 β 가닥의 형성으로 인해 변경된다. 추가의 B' 가닥은 가닥 A에 정렬되어, AB' 위상을 갖는 짧은 β 시트를 형성한다. G 가닥은 가닥 A'와 β 시트를 형성하는 아미노산 197-199에서의 삽입물 때문에 2개의 짧은 가닥, G (바닥 측면) 및 G' (상부 측면)로 나누어진다. 잔기 197-199에서 G 가닥의 "킹크"에 의해 유발된 수소 결합 패턴의 분열은 Ser197의 측쇄 및 Cys186의 주쇄 아미드 사이의 수소 결합에 의해 보상된다. 주목할만하게, Ser197은 상이한 종으로부터의 Kit 및 다른 유형-III RTK에서 Ser 또는 Thr 잔기로 보존된다. D2는 Cys151 및 Cys183 사이의 추가의 디술피드 결합을 함유하며, 이는 CD 루프를 F 가닥의 말단과 가교시켜 가닥 C 및 CD 루프에 대한 추가의 안정성을 제공한다. 추가의 디술피드 브릿지는 가닥 C 및 F 사이에 수소 결합의 환원된 네트워크를 보상할 수 있다. 이들 2개의 Cys는 제브라피시로부터 인간에까지 Kit에서 고도로 보존된다.

Kit D3. D3은 IgSF의 I1-하위세트에 속하는 2개의 세트의 β 시트로 구성된다 (ABED/A'GFC). 2개의 β 시트는 가닥 B 상의 Cys233 및 가닥 F 상의 Cys290 사이의 디술피드 결합에 의해 가교된다. 텔로킨 (PDB 코드: 1TLK) 및 D3 구조의 비교는 D3의 98개 정렬된 Cα 잔기에 대해 10.4의 Z스코어 및 2.0Å의 r.m.s. 편차를 보여준다.

Kit D4. D4가 B5 및 F5에서의 시스테인 사이에 특징적인 디술피드 결합이 결여되어 있더라도, D4는 IgSF 위상을 유지한다. 또한, I-세트 IgSF의 20개의 핑거-프린트 잔기 중 13개가 D4에 보존되어 있다. D4의 구조적 완전성은 도메인의 소수성 코어의 일부를 구성하는 각각 B5 및 F5에 존재하는 매립된 지방족 (Val335) 및 방향족 (Phe392) 잔기 사이의 상호작용에 의해 보존된다. DALI를 사용한 구조 비교는 Kit Ig-유사 도메인 중에서 D4가 텔로킨과 가장 유사하며 (단백질 데이터 뱅크 코드: 1TLK로 조회함), 89개 정렬된 Cα 잔기에 대한 그의 Z-스코어는 11.9이고, r.m.s.d.는 1.5Å이다. Val335 및 Phe392의 Cα-Cα 사이의 8.6Å의 거리는 B5 및 F5를 연결하는 디술피드 결합이 결여된 IgSF 도메인에서 유사한 위치 사이에서 관찰되는 거리 범위 내에 있다. 예를 들어, 티틴 Ig-유사 도메인 M5 (단백질 데이터 뱅크 코드: 1TNM) (또한, 디술피드 결합이 결여되어 있음)는 D4와 2Å의 r.m.s.d로 중첩되고, B5 및 F5 위치 사이의 거리가 8.9Å이다. D4는 ABED/A'GFC의 배열로 각각 4개의 가닥을 함유하는 2개의 β 시트로 구성된다. A' 가닥의 제1 잔기 Thr321은 고도로 보존된 Phe405의 방향족 고리와 반 데르 발스 접촉을 형성한다. 주목할만하게, 도메인의 상부 측면의 위를 향하도록 폴딩된 CD 루프는 3가지 주요 상호작용에 의해 안정화된다. Thr354의 측쇄는 Gln347의 측쇄 및 Trp348의 주쇄 카르보닐과 수소 결합을 형성한다. 소수성 코어의 변부에 위치한 소수성 잔기 (Trp348, Tyr350, Trp359 Val377, Leu379 및 Tyr390)는 Phe355에 소수성 환경을 제공한다. CD 루프가 주목할만한 서열 보존을 나타내지 않더라도, 이 루프는 모든 유형-III 패밀리 RTK에서 8개의 아미노산을 함유한다.

Kit D5. D5는 IgSF의 C2 및 IgCAM 하위세트에 속하고, 20개의 핑거프린트 잔기 중 10개가 이 모듈에서 보존된다. D5는 ABED/CFG 위상, 2개의 β 시트를 가교시키는 B5의 Cys428 및 F5의 Cys491 사이의 디술피드 결합, 및 C 가닥 및 CD 루프를 가교시키는 제2 디술피드 결합을 나타낸다. 2개의 디술피드 결합은 모든 Kit 및 유형-III RTK에서 보존된다. 주목할만하게, 상위 절반의 D5는 뉴런 세포 부착 분자의 제3 Ig를 닮는다.

액소닌-1/TAG-1 (단백질 데이터 뱅크 코드 1CS6). 텔로킨 (단백질 데이터 뱅크 코드 1FHG), FGFR (단백질 데이터 뱅크 코드 1CVS) 및 RTK Musk (단백질 데이터 뱅크 코드 2IEP)에서 보다는 적은 정도이지만 여러 특징을 확인할 수 있다. 이들은 B5를 F5와 연결하는 디술피드 결합에 가까이 2개의 Ala 잔기 (Ala430 및 Ala493)를 포함하고; 이 영역 내의 작은 측쇄의 존재는 도메인의 상부에서 밀접한 패킹을 가능하게 한다. 두번째 특징은 각각 A, B, C 및 G 가닥 내의 Pro 및 Gly 잔기 Pro413, Gly432, Pro436 및 Gly498의 고리 배열이다. 세번째 특징은 각각 FG 및 BC 루프의 Val497 및 Pro434의 주쇄와 수소 결합을 형성하는 F9 (Asn495) 내의 Asn 잔기의 존재이다. 함께, D5의 상부에서의 이들 3가지 특징은 세포 부착 단백질의 Ig-유사 도메인의 형태와 유사한 단단하게 패킹된 형태를 만든다.

실시예 4: Kit 단량체 형태에서의 Ig-유사 도메인간 상호작용

Kit의 5개의 Ig-유사 도메인 사이의 도메인간 상호작용은 Kit 엑토도메인 단량체의 전체적인 위상을 유지하는 것을 담당한다 (도 1). D2에 상대적인 D1의 배향은 2개의 Ig-유사 도메인 사이의 다수의 상호작용에 의해 나타난 광범위하게 매립된 표면적에 의해 결정된다 (도 1b). D1-D2 인터페이스에서 1240Ų의 매립된 표면적은 500 내지 800Ų 범위의 Kit 엑토도메인 내의 3개의 다른 인터 Ig-유사 인터페이스를 포함하는 막대-유사 다중-도메인 IgSF 구조의 최대 Ig-유사 도메인간 인터페이스의 매립된 표면적보다 훨씬 더 크다 (문헌 [Su et al. (1998) Science 281: 991-995]). 이 인터페이스는 주로 D1의 가닥 A' 및 G, 루프 EF 및 CC'와 D2의 가닥 A의 N-말단 영역, 가닥 B의 C-말단, 루프 BC 및 DE 사이의 소수성 및 정전기적 상호작용에 의해 형성된다 (도 1b). 또한, D1의 가닥 G, D1 및 D2를 연결하는 링커 영역 및 D2의 BC 루프로부터의 아미노산을 포함하는 D1-D2 인터페이스 내의 다수의 잔기는 상이한 종으로부터의 Kit에서 보존된다 (도 1b).

D2-D3 인터페이스의 매립된 표면적은 대략 780Ų이다. D2-D3 인터페이스는 2개의 정전기적 상호작용에 의해 둘러싸여 있는 작은 소수성 패치로 구성된다. 이 인터페이스는 D2의 EF 루프 및 D3의 DE 루프 사이의 상호작용 및 D2-D3 링커 영역과 D3의 FG 및 BC 루프 사이의 상호작용에 의해 형성된다 (도 1c). D3-D4 인터페이스의 매립된 표면적은 대략 570 A²이다. D3 및 D4는 주로 D3의 가닥 A' 및 G를 통해 D4의 BC 및 DE 루프와 상호작용한다 (도 1d). D3-D4 인터페이스의 길이는 대략 20Å으로, 이는 2개의 Ig-유사 도메인의 장축에 따라 119°의 각을 갖는 D3에 상대적인 D4의 각도 배열 때문이다. D4-D5 인터페이스는 760Ų의 매립된 표면적을 형성하고, 주로 소수성 상호작용에 의해 매개된다 (도 1e). 인터페이스는 D4의 가닥 A, G 및 F와 D5의 BC 및 DE 루프 뿐만 아니라 D4-D5 링커 영역 사이의 상호작용에 의해 형성된다 (도 1e).

Kit 단량체에서의 Ig-유사 도메인간 상호작용에 대한 상세한 도메인-바이-도메인 정보

D1-D2 인터페이스. D1의 잔기 Ile47, Ile70, Leu71, Ala89, Tyr108 및 Phe110 및 D2의 Leu119, Pro137, Leu138, Pro141, Pro166 및 Lys167의 측쇄 사이의 소수성 상호작용은 도메인간 상호작용을 안정화시킨다 (도 1b). D1의 Arg112 및 D2의 Asp140 사이의 상호작용 및 D1의 Asp72 및 D2의 Arg135 사이의 상호작용을 포함하는 소수성 패치를 둘러싸고 있는 영역 내에 2가지 주요 정전기적 상호작용이 존재한다 (도 1b).

D2-D3 인터페이스. 소수성 패치는 Arg177의 지방족 부분 및 Pro206, Phe208, Val238 및 Phe267의 측쇄로 구성된다. 정전기적 상호작용은 D2의 Glu128 및 Asp129의 측쇄와 D3의 Lys209 사이의 수소 결합을 포함한다 (도 1c). Arg177의 측쇄 및 Glu128의 측쇄 사이의 염 브릿지는 D2에서 Arg177의 측쇄 및 Pro206의 측쇄 및 D3에서 Phe267의 위치를 안정화시켜 D2에서 Arg177의 측쇄의 지방족 부분에 소수성 환경을 생성시킨다 (도 1c). 제2 정전기적 상호작용은 D2에서 Arg181의 측쇄와 D3의 Asp266의 측쇄에 의해 매개된다.

D3-D4 인터페이스. D3-D4 인터페이스에서의 소수성 상호작용은 D3으로부터의 Val308 및 Leu222 및 D4로부터의 Phe312, Phe340, 및 Ile371 사이의 상호작용을 포함한다. D3-D4 인터페이스는 다른 Ig-유사 도메인간 인터페이스보다 더 적은 매립된 영역을 포함한다 (도 1d).

D4-D5 인터페이스. D4-D5 인터페이스 상의 소수성 패치는 각각 D4의 A 및 G 가닥으로부터의 Phe324 및 Tyr408 및 D5의 BC 루프로부터의 Phe433을 포함한다. 또한, 반 데르 발스 접촉은 소수성 패치를 둘러싸고 있는 인터페이스의 안정화에 기여하고; D4의 Phe324, Gly384, Thr389, Tyr408, Asn410, Thr411 및 Met351은 D5의 Val497, Phe433, Gly470, Phe649 및 Lys471과 상호작용한다 (도 1e).

실시예 5: 결합된 SCF-Kit 복합체의 전반적인 구조의 분석

SCF-Kit 복합체의 구조는 2:2 화학량론을 보여주고, 여기서 비대칭 유닛의 1:1 복합체의 2개의 세트는 비-결정학적 2배 대칭에 의해 관련된다 (도 2). 결정 격자에서 관찰된 SCF-Kit 2:2 복합체는 Kit 이량체화가 이량체성 SCF 리간드에 의해 구동된다는 것을 입증한 실험과 일치한다 (문헌 [Philo et al. (1996) J Biol Chem 271: 6895-6902; Lemmon et al. (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317]). Kit 엑토도메인 및 SCF 분자의 2개의 세트는 대략적인 치수가 170 x 130 x 70Å인 거꾸로 된 "A" 문자와 닮았다 (도 2a 및 도 9).

Kit에 결합된 SCF의 전반적인 구조는 이전에 기재된 유리 SCF의 구조와 유사하다 (문헌 [Zhang et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 7732-7737; Jiang et al. (2000) Embo J 19: 3192-3203]). SCF-Kit 2:2 복합체의 구조는 개별 SCF 프로모터가 개별 Kit 프로모터의 D1, D2 및 D3에 직접 결합한다는 것을 보여준다 (도 2b). 결과적으로, 단일 수용체 프로모터는 SCF 프로모터 상에 유사한 2배 관련 표면을 갖는 대칭적 복합체를 형성한다. Kit의 이량체화는 또한 Kit의 2개의 막 근접 Ig-유사 도메인 사이의 동형 상호작용, 즉 D4-D4 및 D5-D5 상호작용에 의해 매개된다 (도 2b). 이는 서로의 15Å 내에 있는 C-말단을 이들이 막횡단 도메인에 연결되는 위치에 가까이 가져오는 분자의 나머지 부분에 대해 상당히 변경된 형태의 D4 및 D5를 만든다 (도 2b 및 도 9). 구조는 또한 치수가 약 50x50x15Å인 복합체의 중심에 있는 큰 캐비티의 존재를 특징으로 한다 (도 2b). 결정 구조는 SCF의 각각의 프로모터가 오직 단일 Kit 분자에 결합하고, 수용체 이량체화는 추가의 수용체-수용체 상호작용을 용이하게 하는 SCF 이량체에 의해 구동된다는 것을 입증한다.

실시예 6: Kit의 SCF 결합 영역의 분석

SCF는 SCF의 4개의 헬릭스 다발이 D1, D2 및 D3의 장축에 수직으로 배향되고, SCF 및 Kit의 C-말단이 반대 방향으로 마주보는 형태로 Kit의 D1, D2 및 D3에 의해 형성된 오목한 표면에 결합된다 (도 2, 3 및 도 9). Kit 및 각각의 SCF 프로모터 사이의 인터페이스에서 매립된 용매-접근가능한 표면적은 대략 2060Ų이고; 매립된 표면적은 공지된 리간드 수용체 인터페이스의 범위 내에 있다. SCF-Kit 인터페이스를 3개의 결합 부위로 나누는 것이 가능하다 (도 3a, b, 표 2, 및 표 3). 부위-I는 D1 상에 위치하고, 부위-II는 D2 및 D2-D3 링커 영역에 위치하고, 부위-III는 D3에 위치한다. 부위 I, II 및 III의 매립된 표면적은 각각 대략 280, 770 및 1010Ų이다.

부위-I

SCF의 αC-β2 루프는 도 3c에 제시된 바와 같이 D1의 가닥 C'에 수직으로 정렬된다. D1의 Asp72, Glu73 및 Thr74 및 SCF의 Lys99', Ser101' 및 Phe102'는 6-8Å의 Cα 거리로 가까이 위치하고, 이는 이들 잔기가 D1 및 SCF 사이의 상호작용에 참여할 수 있다는 것을 나타낸다. αC-β2 루프의 부족한 전자 밀도 때문에, 특이적 상호작용을 규정할 수 없었다.

부위-II

SCF 결합은 대부분의 경우 Kit 상의 대전된 표면의 상보성 정전기적 상호작용에 의해 매개된다 (도 3a, b, d). 염 브릿지는 Kit의 염기성 아미노산 Arg122, Arg181, Lys203 및 Arg205와 SCF 상의 산성 아미노산 Asp54', Asp77', Asp84' 및 Glu88' 사이에서 형성된다. Arg122의 입체형태는 Kit의 Glu198 및 SCF의 Asp54' 사이의 염 브릿지에 의해 안정화된다. 도 3d는 D2 상의 주요 상호작용 잔기 Tyr125, Arg181 및 Lys203 중 3개가 동일한 평면 상에 정렬되어, SCF의 αB 및 αC의 Asp77', Asn81', Asp84', Ser53' 및 Thr57'와 수소 결합을 형성한다는 것을 보여준다. D2의 Ser123 및 Ile201 및 SCF의 Val50' 및 Thr57' 사이의 반 데르 발스 접촉은 또한 리간드-수용체 복합체의 형성에 기여한다. 그러나, 다른 종으로부터의 Kit 및 SCF에서 부위-II의 잔기에 주목할만한 차이가 있다 (도 3, 도 8 및 도 10). Arg181 및 Lys203은 포유동물에서 염기성 아미노산으로 불변하지만, Tyr125는 마우스 및 래트에서 페닐알라닌으로 치환되고, 이에 아마도 대부분 수소 결합이 손실될 것이다. Kit의 Arg205는 고도로 보존된 아미노산인 한편, Glu88'는 각각 마우스 및 래트에서 류신 및 알라닌 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간에서 Kit의 Arg122 및 SCF의 Asp54'는 각각 마우스 및 래트에서 류신 또는 발린에 의해 치환된다. 이들 치환은 설치류 SCF의 인간 Kit에 대한 감소된 친화도를 설명할 수 있다 (문헌 [Lev et al. (1992b) J Biol Chem 267: 15970-15977]).

부위-III

SCF의 N-말단 절편은 D3의 가닥 D와 상호작용한다 (도 3a, e). 수소 결합은 SCF의 Asn10'의 측쇄와 Ser261의 주쇄 아미드 및 카르보닐 기 사이에서 뿐만 아니라 D3 상의 Asp260 및 Trp262의 측쇄와의 사이에서 형성된다. 또한, SCF의 Thr9' 및 Asn11'는 각각 Kit의 Ser261 및 His263의 측쇄 및 주쇄 아미드에 결합한다. SCF의 돌연변이 분석은 Asn10'의 알라닌 또는 글루탐산 잔기로의 치환이 SCF의 Kit에 대한 결합 친화도를 대략 10배 감소시키고, Asn10' (또는 다른 종에서의 Asp)가 생물학적 활성에 필요하다는 것을 보여주었다 (문헌 [Hsu et al. (1998) Biochemistry 37: 2251-2262]). 상이한 종으로부터의 SCF에서의 수용체 결합 인터페이스의 비교는 Asn10' (또는 Asp)가 고도로 보존된 잔기라는 것을 보여준다 (도 8). 추가의 중요한 상호작용은 Kit의 D3 상의 Tyr259, Thr269, Ser240, Val242, Ser241, Ser244와의 반 데르 발스 접촉을 통해 SCF의 Asn6' 및 Arg7'에 의해 매개된다.

실시예 7: Kit/SCF 구조 및 결합과 관련된 입체형태적 변화의 분석

Kit의 리간드 결합 도메인을 SCF 결합을 위해 준비하였다.

Kit 단량체 형태의 개별 D1, D2, 및 D3의 구조와 SCF-유도된 동종이량체 형태의 상응하는 구조의 중첩은 각각 D1, D2, 및 D3에서 82, 92, 및 100개의 정렬된 Cα 잔기에 대해 0.5, 0.8, 및 1.1Å의 r.m.s.d. 값을 나타내었다. 유사하게, Kit 단량체의 전체 D1-D2-D3 영역의 구조와 SCF-Kit 2:2 복합체에서 상응하는 구조의 중첩은 D1-D2-D3 영역의 274개의 정렬된 Cα 잔기에 대해 1.1Å의 r.m.s.d.를 나타내었다. 주목할 만하게, Kit의 SCF 결합 포켓의 구조에서 유의한 백본 변화는 없었다 (도 3 및 도 11). 그러나, SCF 결합시에 SCF 결합 클레프트에서 몇몇 부수적인 구조 변화가 검출되었다. 구조 변화는 SCF 결합 후에 D2의 가닥 G, F, 및 C의 상부 절반 (아미노산 167-187 및 143-166)에서 나타났다 (도 1a, 2a). 이들 가닥은 SCF 결합 인터페이스와 반대의 측면에 위치하고, SCF와의 어떠한 직접적인 접촉의 매개에도 관여하지 않는다. 전체적으로, Kit 단량체의 구조와 SCF-점유 Kit 이량체의 구조의 비교는 Kit의 D1-D2-D3 영역이 SCF 결합에 이어 이량체성 SCF 분자에 의해 구동된 Kit 이량체화를 위해 준비된 기능성 유닛으로 조명될 수 있다는 것을 보여준다.

Kit에 결합된 SCF 분자의 입체형태적 변화

Kit에 결합된 SCF의 전체적인 구조는 유리 SCF의 구조와 유사하지만, 연결 루프의 입체형태 및 분자의 가요성 N 말단의 구조에서 2개의 프로모터 사이의 각은 주목할만한 차이가 있다 (도 4). SCF 이량체 (단백질 데이터 뱅크에서 승인 코드 1EXZ 및 1SCF)의 공개된 구조의 비교는 유리 SCF 동종이량체의 2개의 프로모터 사이의 각 (αC 헬릭스 사이의 각)이 상이한 구조에서 2° 내지 6° 달라질 수 있다는 것을 보여주고, 이는 특정 정도의 가요성이 SCF 이량체에 존재함을 시사한다. Kit 결합된 SCF 프로모터 사이의 각의 유리 SCF의 각에 대한 차이 범위가 3-9° 증가하였다. 도 4는 SCF 프로모터 사이의 각이 5° 증가한 Kit 결합된 SCF 구조를 보여준다.

도 4b는 Cys4'부터 Asn11'까지의 유리 SCF의 N-말단이 랜덤-코일 형태를 갖는다는 것을 보여준다 (문헌 [Zhang et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 7732-7737]). 또한, 처음 4개의 아미노산의 결실이 SCF의 Kit에 대한 결합 친화도를 대략 25% 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 Cys4' 및 Cys89' 사이의 디술피드 브릿지가 SCF의 기능적 완전성을 유지하는데 소정의 역할을 수행함을 시사한다 (문헌 [Langley et al. (1994) Arch Biochem Biophys 311: 55-61]). 도 4b는 또한 Kit에 결합된 SCF의 N-말단 영역의 Thr9' 및 Asn10'는 이들의 Cα 위치가 수용체 결합시에 3 내지 5Å 이동하도록 입체형태적으로 변화한다는 것을 보여준다 (도 4b). N-말단에서의 Cys4' 및 αC 헬릭스에서의 Cys89' 사이의 디술피드 브릿지는 SCF의 N-말단에서 일어나는 입체형태적 변화를 매개하는데 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 유리 SCF에서 Cys24'의 위치는 Cα 위치의 1.2Å의 근평균 제곱 편차 (r.m.s.d.)에 의해 나타난 바와 같이 수용체 점유시에 변경되지 않았다. 최종적으로, 유리 SCF의 αC-β2는 무질서해지거나 또는 Kit에 결합된 SCF에서 αC-β2 루프의 구조와 상이한 구조를 갖는다. 도 4c는 SCF의 αC-β2 루프가 수용체 결합시에 입체형태적으로 크게 변화한다는 것을 보여주고, 이 변화는 SCF-Kit 인터페이스의 부위-I의 확립에 결정적이다.

SCF 결합된 Kit에서 D4 및 D5 배향의 큰 재배열

Kit 단량체 형태의 개별 D1, D2, D3, D4, 및 D5와 SCF-유도된 동종이량체 형태에서 상응하는 Ig-유사 도메인의 구조의 중첩은 SCF 결합 후에 Kit Ig-유사 도메인의 구조에서 부수적인 변화를 나타내었다. 대조적으로, Kit 단량체 형태의 D3-D4-D5 영역과 동종이량체 형태에서 상응하는 영역의 중첩은 서로에 대한 및 Kit의 리간드 결합 영역에 대한 D4 및 D5의 배향에서 큰 구조적 변화를 나타내었다 (도 5a 및 도 12). 단량체 Kit의 각각의 도메인 D3, D4, 및 D5는 SCF-점유 Kit에서 이들의 대응물과 각각 D3, D4, 및 D5의 98, 101, 및 85 Ca 원자에 대해 0.9, 0.9 및 1.9Å의 r.m.s.d. 값으로 중첩될 수 있다. 그러나, Kit 단량체의 D3 구조와 리간드-점유 동종이량체 형태에서 D3 구조의 중첩은 SCF 결합된 Kit에서 D4 및 D5의 배향의 현저한 이동을 나타내었다 (도 5a). 리간드 결합 영역에 대한 D4 및 D5의 재배향은 각각 D3-D4 및 D4-D5 인터페이스를 통해 진행되는 D3을 D4에 연결하는 링커에서의 축을 따른 회전 및 D4를 D5에 연결하는 링커에서의 축을 따른 회전에 의해 일어난다 (도 5a). 유리 및 리간드-결합된 Kit의 비교는 리간드 점유 Kit의 D4가 D3에 대해 22° 회전하고, 리간드 점유 Kit의 D5가 D4에 대해 27° 회전한다는 것을 보여준다 (도 5a). SCF 점유 Kit에서 D4 및 D5의 재배열은 2개의 이웃하는 Kit 분자의 D4-D4 및 D5-D5 상호작용에 의해 매개되는 수용체-수용체 상호작용을 일으킨다 (도 5b). D5의 DE 루프의 입체형태는 SCF 점유 엑토도메인에서 변경된다. 수용체 이량체화에 의해 구동된 D4 및 D5의 재배향은 D5의 DE 루프에 새로운 형태를 부여한다 (도 5a).

Kit 동종이량체에서의 D4:D4 상호작용

2개의 이웃하는 Kit 분자의 D4 사이의 동형 상호작용은 SCF-Kit 2:2 복합체에서 D4-D4 인터페이스에 의해 매개된다. D4-D4 인터페이스가 각각의 Kit 프로모터의 D4의 ABED 가닥에 의해 형성된 2개의 β 시트에 의해 매개되어 각각의 프로모터의 Arg381이 서로를 향하는 거의 평면인 배열을 형성함으로써 360A²의 매립된 표면적이 생겼다. 도 6a는 Arg381 및 Glu386이 Kit 이량체의 2-폴드 축을 가로질러 염 브릿지 및 반 데르 발스 접촉을 형성한다는 것을 보여준다. 또한, 각각의 프로모터의 Arg381의 측쇄는 이웃하는 Kit 분자의 상응하는 잔기의 주쇄 카르보닐과 수소 결합을 형성한다.

구조 기반 서열 분석은 D4-D4 인터페이스가 CSF1R, PDGFRα 및 PDGFRβ를 포함하는 대부분의 유형-III RTK에서 보존된다는 것을 보여주었다 (도 6b 및 도 8). PDGFRα에서, Glu386은 아스파르트산에 의해 대체되고; 이 잔기는 또한 염 브릿지 파트너로 기능할 수 있다. 한 쌍의 염기성 (Arg381) 및 산성 (Glu386) 잔기는 상이한 종의 유형-III RTK에서 엄밀하게 보존된다. D4-D4 인터페이스에서 발견된 서열 모티프는 또한 VEGFR-1 (Flt1), VEGFR-2 (Flk1) 및 VEGFR-3 (Flt4)을 포함하는 유형-V RTK (VEGFR 패밀리)의 모든 구성원의 막 근접 제7 Ig-유사 도메인 (D7)에서 보존된다. VEGFR에서, 염기성 (Arg) 및 산성 (Asp) 잔기는 EF 루프에 위치한다. 유형-III RTK D4-D4 인터페이스를 담당하는 코어 서열 모티프가 VEGFR의 상이한 Ig-유사 도메인에 위치하더라도 (즉, 유형 III의 D7 대 D4), Kit의 D4-D4 인터페이스에서 보여진 것과 유사한 수용체-수용체 상호작용이 또한 RTK의 VEGFR 패밀리의 모든 구성원에서 유사한 D7-D7 인터페이스를 통해 일어날 것이 가능하다 (도 6a) (문헌 [Ruch et al. (2007) Nature. Struct. Mol. Biol. 14: 249-250]).

Kit 동종이량체에서의 D5-D5 상호작용

도 2b 및 도 5b, 6C는 SCF-Kit 2:2 복합체에서 이웃하는 D5 프로모터가 평행하고, 서로 밀접하게 가까이 있을 뿐만 아니라 세포 막에 수직일 가능성이 있는 배향으로 있다는 것을 보여준다. D5의 β-시트 위상은 가닥 A가 가닥 A 및 A'로 나누어지는 대부분의 I-세트 IgSF와 상이한 비전형적인 배열에 따른다. D5의 가닥-A는 가닥 B와 쌍을 이루어 ABED/CFG의 β 시트 위상을 형성한다. 결과적으로, 2개의 β 시트 (ABED/CFG)의 변부에 위치한 가닥 A 및 G는 서로 Cα에서 6.5-11.5Å의 거리로 거의 평행하다. 또한, 한 프로모터의 가닥 A 및 G는 2-폴드 대칭에서 이웃하는 D5의 가닥 A 및 G와 마주본다. 2개의 이웃하는 Kit 프로모터의 Asn505의 측쇄는 서로 대략 4.2Å이지만, 2개의 아스파라긴 사이의 간접적인 상호작용을 매개할 수 있는 물 또는 금속 이온은 약한 전자 밀도의 이 영역에서 검출할 수 없었다. 추가의 D5-D5 상호작용은 2개의 이웃하는 Kit 분자의 Tyr418에 의해 매개된다 (도 6c). 이웃하는 Tyr418 측쇄의 히드록실 기 사이의 상호작용은 물 분자에 의해 매개될 수 있다. 이는 또한 이웃하는 D5 도메인의 상대적인 위치가 이웃하는 프로모터의 Tyr418 및 Asn505에 의해 형성된 간접적인 상호작용에 의해 매개될 수 있음을 시사한다. D5의 G-가닥은 짧은 링커를 통해 Kit의 막횡단 도메인에 연결된다.

실시예 8: 수용체 활성화의 메커니즘

Kit 엑토도메인 단량체 및 SCF 유도된 이량체의 구조는 Kit 및 이들의 세포외 도메인에 5 또는 7개의 Ig-유사 도메인을 함유하는 다른 RTK의 리간드-유도된 활성화의 메커니즘에 대한 새로운 견해를 제공한다. Kit 엑토도메인 단량체의 D1, D2 및 D3과 SCF-유도된 엑토도메인 이량체에서의 상응하는 영역의 구조의 비교는 SCF 결합 후에 SCF-결합 포켓 및 D1, D2 및 D3의 다른 부분에 구조적 변경이 매우 적다는 것을 보여준다. 이들의 특징적인 생화학적 기능에 기초하여, 본 발명자들은 Kit의 엑토도메인을 3개의 독립적인 기능적 유닛으로 나누었다. 제1 유닛은 D1, D2, 및 D3의 3개의 막 말단 Ig-유사 도메인으로 구성된다. D1-D2-D3 영역은 특이적인 SCF 결합 유닛으로 기능하는 별개의 모듈로 작용한다. SCF-결합 유닛은 가요성 연결부 (D3-D4 인터페이스)에 의해 D4에 연결되고; 추가의 가요성 연결부 (D4-D5 인터페이스)에 의해 D5에 연결된 제2 독립적인 유닛은 제3 독립적인 유닛으로 규정된다. D4 및 D5의 기능은 각각 2개의 이웃하는 Kit 엑토도메인의 막 근접 영역 사이의 상호작용을 함께 가져오고 안정화시키는 측면 D4-D4 및 D5-D5 상호작용을 매개하는 것이다.

이 견해에 따라, Kit의 이량체화는 그의 유일한 기능이 SCF에 결합하고, 2개의 Kit 분자를 함께 가져오는 것인 2가 SCF 결합에 의해 구동된다. SCF-유도된 Kit 이량체화에 이어 D1-D2-D3 SCF-결합 유닛의 위치에 대해 D4 및 D5 배향이 크게 변화한다. 본원에 제시된 데이터는 D3-D4 및 D4-D5 인터페이스에서의 가요성 연결부가 수용체 이량체화시에 큰 입체형태적 변화를 일으키는 측면 상호작용을 가능하게 한다는 것을 입증한다. 이량체화는 Kit에서 입체형태적 변화를 유도하기 보다는 유연하게 연결된 단량체로부터 단단한 이량체로의 전이에서 특정 입체형태를 선택할 수 있다. 이로 인해 Kit의 2개의 이웃하는 D4 및 2개의 이웃하는 D5 사이에 복합체가 형성되어, D5의 C-말단을 2개의 이웃하는 Kit 분자의 막횡단 도메인이 서로의 15Å 내에 있는 세포 막의 지점으로 가져온다. 실제로, Kit의 SCF-유도된 티로신 자가인산화 (도 7b) 및 하류 신호전달 경로의 자극은 Kit의 D4 내의 Arg381 또는 Glu386 내의 점 돌연변이에 의해 강하게 절충된다. PDGF-수용체 활성화 및 하류 신호전달 경로의 자극은 또한 PDGFR의 D4에서의 유사한 점 돌연변이에 의해 절충된다. 본원에 제시된 데이터는 Kit의 막 근접 영역 사이의 동형 상호작용이 주로 D4-D4 인터페이스에 의해 매개되고, D5-D5 인터페이스가 세포 표면 인터페이스 내의 2개의 Kit 엑토도메인의 정확한 배치를 용이하게 함으로써 협력적인 부차적 역할을 수행한다는 것을 입증한다.

SCF-Kit 복합체는 하기 특성을 갖는 정전기장의 강한 분극을 나타낸다: (i) 전체적인 음으로 대전된 표면; (ii) SCF (음성), 및 리간드 결합 D1-D2-D3 유닛 (양성) 사이의 상보성; 및 (iii) D4-D4 인터페이스의 오른쪽 위 및 주변의 강하게 음으로 분극된 표면 (도 6d, 3b 및 도 13). 이 데이터는 SCF의 Kit에의 결합이 적어도 2개의 단계로 일어난다는 것을 입증한다: 우선, SCF 및 D1-D2-D3 사이의 정전기적 인력은 SCF를 Kit 상의 대향 리간드 결합 영역에 따라 정렬할 것이다. 정전기적 인력은 또한 스티어링 효과로 인해 SCF의 보다 빠른 연합 속도를 유도할 수 있다 (문헌 [Muellera et al. (2002) Biochina and Biophysica Acta. 1592: 237-250]). 이후에, SCF-Kit 복합체 형성은 결합된 SCF 분자에서 입체형태적 변화에 의해 매개되는 것을 포함하는 추가의 상호작용에 의해 안정화될 것이다. D4 상에서 강하게 분극된 정전기적 표면은 또한 이웃하는 Kit 수용체의 D4 도메인 사이의 반발을 유도함으로써 Kit를 불활성 단량체 형태로 유지시키는데 있어 소정의 역할을 수행할 수 있다 (도 6d). 이웃하는 수용체의 D4를 향한 D4의 결합 친화도 및 D5를 향한 D5의 결합 친화도는 아마도 세포 표면 상의 국부 수용체 농도가 SCF-구동된 수용체 이량체화 및 차원수의 효과에 의해 증가되기 전에 Kit 엑토도메인 이량체화를 용이하게 하기에는 너무 낮을 것이다. 이러한 국부 농도의 역치에 도달하면, 이웃하는 D4 사이의 인력이 2개의 이웃하는 D4 유닛이 서로 결합할 수 있게 될 정도로 정전기적 반발을 극복할 것이다. 흥미롭게는, D4-D4 인터페이스, 즉 이웃하는 Kit 분자에서 Arg381 및 Glu386 사이의 이중 염 브릿지를 유지하는 주요 상호작용이 또한 정전기적 상호작용에 의해 매개된다.

Kit 및 C-카드헤린의 엑토도메인 (문헌 [Boggon et al. (2002) Science 296: 1308-1313])은 각각 5개의 탠덤 Ig-유사 도메인으로 구성되고, 둘 다 유사한 신장된 위상을 나타낸다; Kit의 경우 170Å 및 C-카드헤린의 경우 185Å. 또한, 박테리아 부착 분자 인베이신은 주목할만하게 유사한 신장된 구조 및 Ig-유사 도메인간 위상을 나타낸다 (문헌 [Hamburger et al. (1999) Science 286: 291-295]). Kit 엑토도메인은 세포-세포 상호작용을 매개하는 단백질을 코딩하는 공통적인 조상 유전자로부터 진화되었을 수 있다. 종래의-카드헤린은 세포-세포 상호작용을 매개하는 동형 접합을 위해 이들의 대부분의 막 말단 Ig-유사 도메인을 사용하지만, Kit의 엑토도메인은 수용체 이량체화 및 활성화를 유도하기 위해 막 앵커링된 또는 가용성 SCF 이소형에 결합하는 세포 신호전달 수용체로서 기능하도록 진화되었다 (도 7c).

Kit 구조, 리간드 결합 및 수용체 이량체화의 특징이 다른 수용체에서 보존되므로, Kit 활성화에 대해 여기서 기재된 메커니즘은 다수의 수용체의 활성화에 대한 일반적인 메커니즘일 수 있다 (도 7c). 또한, 여기서 기재된 구조적 정보는 암 및 활성화된 수용체에 의해 유발된 다른 질환의 치료를 위한 새로운 치료적 개입을 설계하기 위해 적용될 수 있다.

실시예 9: 인간 질환에서 Kit 돌연변이의 분석

다양한 인간 질환이 Kit 유전자 내의 돌연변이에 의해 유발된다. 인간에서, Kit의 엑토도메인 내의 기능 손실 돌연변이는 흑백 얼룩 특성을 유발한다 (문헌 [Fleischman et al. (1996) J Invest Dermatol 107: 703-706; Murakami et al. (2005) J Invest Dermatol. 124: 670-672]). Kit 로커스에서의 이들 엑손-2 및 엑손-3 점 돌연변이는 아르기닌 잔기에 의해 대체되는 Cys136 및 트레오닌 잔기에 의해 치환되는 Ala178을 생성한다. 돌연변이는 둘 다 Kit 상의 SCF 결합 부위의 결정적인 성분인 D2에서 일어난다 (도 7a). 흑백 얼룩 Cys136Arg 돌연변이는 D2의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는데 결정적인 역할을 수행하는 중요한 디술피드 결합이 손실될 것이며, 이에 따라 그의 SCF를 인식하는 능력이 손실될 것이다. Ala178은 D2-D3 인터페이스에 밀접하게 근접한 D2의 EF 루프에 위치한다 (도 7a). 흑백 얼룩 Ala178Thr 돌연변이는 D2-D3 인터페이스의 완전성을 유지하는데 필수적인 상호작용 및 SCF에의 D2 및/또는 D3 결합에 필요한 상호작용을 파괴할 수 있다 (도 7a).

Kit 로커스에서의 다양한 기능 획득 돌연변이는 GIST, AML 및 SCLC을 포함하는 여러 암에서 발견되었다 (문헌 [Forbes et al. (2006) COSMIC 2005. BR J. CANCER, 94: 318-22]. Somatic mutation database: Catalogue of Somatic Mutations in Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ 참조). 다수의 종양원성 돌연변이가 Kit의 JM 및 PTK 도메인에서 확인되었다. 또한 집합적으로 Kit의 활성화된 형태를 형성하는 인-프레임 결실, 점 돌연변이, 인-프레임 복제 및 삽입을 포함하는 다양한 종양원성 돌연변이가 Kit 엑토도메인에서 발견되었다 (도 7a). Asp419의 손실 또는 치환을 포함하는 엑손-8에서의 인-프레임 결실 및 삽입 돌연변이가 AML 환자에서 기재되는 한편, Ala502-Tyr503 및 Ala502-Phe506 서열의 복제가 GIST에서 확인되었다 (도 7a). Asp419는 D5의 가닥 A 및 AB 루프를 연결하는 영역에 위치하고, Ala502-Tyr503은 Kit의 D5의 가닥 G 상에 위치한다. 흥미롭게는, 실질적으로 Kit 엑토도메인에서 발견된 모든 활성화 종양원성 돌연변이를 D5-D5 인터페이스에 맵핑하였다 (도 7a). 종양원성 D5 돌연변이의 작용 방식의 가장 타당한 해석은 이들 돌연변이가 온-레이트를 증가시키거나, 오프-레이트를 감소시키거나, 또는 향상된 D5-D5 상호작용을 용이하게 하는 방식으로 두 과정의 속도를 변경시킴으로써 이웃하는 D5 도메인 사이의 결합 친화도 및 동형 상호작용을 향상시킨다는 것이다.

상기 분석은 D4 및 D5 영역이 표적 치료에 대해 우수한 후보라는 것을 입증한다. 약물, 제약, 또는 생물제제는 Kit 이량체화/활성화를 증진시키거나 또는 보다 바람직하게는 이량체화/활성화를 방지하기 위해 Kit에 결합시키는데 사용될 수 있다.

실시예 10: Kit 엑토도메인의 발현, 정제 및 부분적인 탈글리코실화

추가의 5개의 히스티딘 잔기를 C 말단에 함유하는 인간 Kit의 아미노산 1-519를 코딩하는 DNA 구축물 (문헌 [Lemmon et al. (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317])을 pFastBac1 (인비트로젠, 인크.)에 라이게이션시켰다. 엑토도메인 Kit 단백질을 발현하는 바큘로바이러스를 Bac-대-Bac 설명서 매뉴얼 (인비트로젠)에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 곤충 Sf9 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지의 15L 배양물 중에서 웨이브 생물반응기(Wave Bioreactor) (웨이브 바이오테크, 엘엘씨, 시스템(Wave Biotech, LLC, System) 20/50)로 2 내지 3 x 10⁶개 세포/ml까지 성장시킨 후에, Kit 엑토도메인 유전자를 보유하는 재조합 바큘로바이러스로 감염시켰다. 엑토도메인 Kit가 인간 Kit로부터의 신호 서열을 함유하더라도, 단백질은 곤충 세포 밖으로 분비되기 보다는 그 안에 축적되었다. 72시간 후에, 세포를 수확하고, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% NDP-40 및 2 mM PMSF를 함유하는 50 mM의 인산칼륨 완충제 (pH 8) 1.4 리터에 20분 동안 얼음 상에서 용해시켰다. 원심분리 및 여과 후에, Kit의 엑토도메인을 Ni-NTA 비드로의 친화성 크로마토그래피를 사용한 후에 슈퍼덱스 200을 사용하는 겔 여과에 의해 정제하였다. 25 mM NaCl 및 1% 글리세롤을 함유하는 25 mM 트리스 완충제 (pH8.5) 중 정제된 Kit 엑토도메인을 12시간 동안 4℃에서 10:1 w/w의 최종 비율로 Kit 용액에 첨가된 재조합 엔도글리코실라제 F1로 처리하였다. 이어서, Kit의 엔도뉴클레아제 F1 처리된 엑토도메인을 미리 평형화된 16/10 모노 큐 칼럼 상에 로딩하고, 400 mM NaCl 및 1% 글리세롤을 함유하는 얕은 구배의 트리스 완충제 (pH 8.5)로 용리하였다. 탈글리코실화된 Kit 엑토도메인의 분획을 모으고, 회전 농축기를 사용하여 35mg/ml로 농축시켰다. 정제되고, 부분적으로 탈글리코실화된 Kit 엑토도메인 제제를 분취액으로 나누고, 액체 N2에 급속 냉동시켰다. 이 접근법을 사용하여, 약 10 mg의 부분적으로 탈글리코실화된 Kit 엑토도메인을 15 리터의 배양된 세포로부터 정제하였다. SCF (1-141)를 이전에 기재된 바와 같이 발현시키고, 재폴딩시키고, 정제하였다 (문헌 [Zhang et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97: 7732-7737]). Kit의 엑토도메인 (아미노산 1-514)을 또한 이전에 기재된 바와 같이 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 Sf9 곤충 세포에서 분비된 형태로 발현시키고, 정제하였다 (문헌 [Lemmon et al. (1997) J Biol Chem 272: 6311-6317]).

실시예 11: 구조 결정 및 정교화

실험적 상을 Kit 엑토도메인 단량체의 결정의 다중-파장 불규칙적 회절 (MAD) 및 불규칙적 산란을 이용하는 다중 이질동상 대체법 (MIRAS)의 조합을 이용하여 결정하였다. 중원자 검색 및 위상조정을 CNS (문헌 [Brunger et al. (1998) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54: 905-921]) 및 SHARP (문헌 [Bricogne et al. (2003) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59: 2023-2030]) 프로그램 슈트를 사용하여 수행하였다. 하나의 주요 부위 및 2개의 소수 부위를 백금 유도체 (K2Pt(NO2)4)에 대해 검출하고, 하나의 주요 부위 및 5개의 소수 부위를 아이오딘 침지된 결정에 대해 검출하였다. MAD 상을 CNS를 사용하여 3가지 파장에서 백금 유도체에 대해 3.3Å 해상도까지 계산하였다. MIRAS 상을 CNS 및 SHARP를 사용하여 백금 및 아이오딘 유도체에 대해 3.0Å 해상도까지 계산하였다. 용매 플리핑 밀도 변형은 연속적인 전자 밀도 및 매우 명확한 용매-단백질 경계를 갖는 해석가능한 품질의 전자 밀도 맵을 생성하였다. D2에서의 가닥 F, G 및 C의 상부 절반 뿐만 아니라 CD 루프 및 D5에서의 CD 루프, 가닥 D, DE 루프 및 EF 루프 및 가닥 F의 하부 절반을 포함하는, 전자 밀도 품질이 낮은 영역을 MIRAS 및 MAD 위상조정에 의해 계산된 전자 밀도 맵을 비교하여 확인하였다. 데이터 수집 및 위상조정 통계치는 표 1A 및 1B에 요약된다. Kit의 분자 모델을 COOT (문헌 [Emsley, and Cowtan (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2126-2132])를 사용하여 수동적으로 실험적 전자 밀도 맵으로 구축하였다. 자유 R-인자의 계산을 위해, 데이터의 5%가 정교화 동안 생략되었다. CNS를 사용하여 본래 데이터에 대해 3.0Å 해상도로 정교화를 수행하였다. 정교화의 최종 단계에서, 번역/자유화/스크류 (TLS) 정교화를 TLSMD 웹 서버 (문헌 [Painter et al. (2006) J Appl Cryst 39: 109-111])를 사용하여 생성된 3개의 TLS 군을 갖는 CCP4 프로그램 슈트에서 Refmac5 (문헌 [Murshudov et al. (1997) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53: 240-255])에 의해 수행하였다.

SCF-Kit 복합체의 구조는 PHASER를 사용하는 분자 대체법에 의해 풀었다 (문헌 [McCoy et al. (2005) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61: 458-464]). Kit 엑토도메인의 D1D2D3D4 및 SCF에 대해 명확한 분자 대체 용액은 PHASER를 사용하여 각각 본래 데이터 세트에 대한 검색 모델로서 Kit의 D1D2D3 및 D4 및 SCF를 사용하여 발견하였다. Kit (D1D2D3D4)-SCF 복합체 구조에 대해 20으로부터 4Å까지의 강체 정교화를 수행하여, 43.8%의 Rcryst를 얻었다. 모델 구축 및 정교화를 각각 31.6% 및 34.0%의 Rcryst 및 Rfree 값까지 CNS를 사용하여 수행하였다. D5의 영역에서의 연속적인 전자 밀도를 2 σ 2Fo-Fc 및 3 σ Fo-Fc 맵에서 발견하였다. D5에 대한 가닥을 COOT를 사용하여 수동적으로 맵으로 추적한 다음, 각각의 단계 후에 정교화를 적용하였다. 초기 정교화 전반에 걸쳐, 비-결정학적 대칭 (NCS) 제약이 잔기 상에 부가되었다. 추가의 정교화를 본래 X선 회절 데이터에 대해 3.5Å 해상도까지 수행하였다. 전체 SCF-Kit 복합체 분자를 거의 구축한 후에, NCS 제약이 풀려 R 및 Rfree의 값이 감소하고, 전자 밀도가 개선되었다. 정교화의 최종 단계에서, NCS 제약이 완전하게 풀렸다. 모델의 입체화학을 PROCHECK로 분석하였다 (문헌 [Laskowski et al. (1993) J Appl Cryst 26: 283-291]). 정교화 통계치의 요약은 표 1B에 제시된다.

실시예 12: SCF의 방사성표지 및 리간드 변위 검정

인간 SCF (10 μg)를 아이오도겐 아이오딘화 튜브 (피어스)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 1mCi의 ¹²⁵I (퍼킨엘머)로 표지하였다. 변위 결합 검정을 위해, WT Kit 또는 Kit 돌연변이체를 발현하는 3T3 세포를 10% FCS를 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. 세포를 10mM HEPES (PH7.4) 및 0.1% BSA (DMEM-BSA)를 함유하는 DMEM으로 3회 세척한 후에, 증가하는 농도의 천연 SCF의 존재하에 1시간 동안 실온에서 2ng의 ¹²⁵I-표지된-SCF와 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 차가운 DMEM-BSA로 3회 세척하고, 0.5 ml의 0.5M NaOH에서 1시간 동안 실온에서 용해시키고, 100 μl의 세포 용해물을 10ml의 옵티-플루오르(Opti-Fluor) 섬광 용액 (퍼킨엘머)에 적용하여, LS6500 섬광 계수기 (베크만 코울터(Beckman Coulter))를 사용하여 세포 관련 방사능을 측정하였다.

실시예 13: 보존 분석

인간 SCF 및 Kit의 아미노산 서열을 PSI-BLAST를 사용하여 상동성 서열에 대한 비-중복성 데이터베이스 (nr)를 검색하기 위한 검색어로 사용하였다 (문헌 [Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-410]). 서열 정렬을 SCF 서열 또는 Kit 서열 상에서 ClustalW (문헌 [Higgins (1994) Methods Mol Biol 25: 307-318])를 사용하여 수행한 후에, Kit Ig-유사 도메인에서 20개의 중요 잔기에 대한 IgSF 폴드 제지에 기초하여 수동적으로 조정하였다. SCF-Kit 복합체 결정 구조에 의해 밝혀진 아미노산 서열의 정렬을 Consurf 3.0 서버 (문헌 [Landau et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: W299-302])에 입력하여 낮은 비율의 디버전스가 높은 서열 보존에 상응하는 각각의 정렬의 위치에 대한 최대-가능성 정규화된 진화율을 생성하였다. Consurf 출력에서와 같이, 연속적인 보존 스코어를 시각화를 위해 빈 9가 최대 보존된 (고동색) 위치를 함유하고 빈 1이 최대 가변 (시안색) 위치를 함유하도록 9개 빈의 별도의 스케일로 분할하였다.

실시예 14: 항체의 단백질 발현, 정제 및 생성

인간 Kit의 제4 Ig-유사 도메인 (잔기 309-413; Kit D4)을 코딩하는 DNA를 PCR 반응을 이용하여 전장 인간 Kit의 cDNA로부터 증폭시켰다. BL21 (DE3) 이. 콜라이 코돈 플러스 세포를 Kit D4의 합성을 지시하는 박테리아 발현 벡터 (pET-NusA 히스티딘 태그 부착됨)로 형질전환시킨 후에 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다. Kit D4-NusA 융합 단백질을 BL21 용해물로부터 금속 킬레이팅 친화성 칼럼 (Ni-NTA; 퀴아젠(QIAGEN))을 사용하여 정제한 후에 음이온-교환 크로마토그래피 (소스 큐(Source Q) 칼럼; 지이 헬스케어)를 사용하여 추가로 정제하였다. 이어서, D4로부터 NusA 및 히스티딘 태그를 절단하기 위해 Kit D4-NusA를 밤새 4℃에서 TEV 프로테아제와 인큐베이션하였다. Kit D4의 추가의 정제 단계를 겔 여과 크로마토그래피 (슈퍼덱스 200 칼럼; 지이 헬스케어)를 사용하여 수행하였다.

인간 Kit의 제5 Ig-유사 도메인 (잔기 410-519; Kit D5)을 이. 콜라이 균주 BL21 (DE3) 세포에서 발현시키고, 6.0 M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 10 mM 트리스 완충제 (pH 8.0)를 사용하는 재폴딩 단계를 이용하여 박테리아 봉입체로부터 정제하였다. 재폴딩된 Kit D5를 음이온-교환 크로마토그래피 (Q 세파로스 칼럼; 지이 헬스케어)를 사용한데 이어 겔 여과 크로마토그래피 (슈퍼덱스 200 칼럼; 지이 헬스케어)를 이용하는 정제 및 음이온-교환 크로마토그래피 (소스 큐 칼럼; 지이 헬스케어)를 이용하는 추가의 정제 단계에 의해 정제하였다.

단리된 D4, D5, 또는 전체 Kit 엑토도메인 (아미노산 1-519; Kit EC) 또는 인간 Kit의 C-말단 영역으로부터의 단편을 함유하는 GST-융합 단백질 (잔기 876-976)에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 실시예 1에 언급된 방법과 같은 당업계에 주지된 기술을 이용하여 생성하였다. 예를 들어, Kit 엑토도메인에 대한 폴리클로날 항체는 토끼를 정제된 Kit 엑토도메인으로 면역화시키고, 표준 방법에 의해 생성된 항체를 수집함으로써 생성될 수 있다. 실시예 15 및 도 14에서와 같은 Kit 활성화에 대한 항체의 효과를 시험하는 실험을 단백질-A 친화도 크로마토그래피로 정제하는 항체 제제를 사용하여 수행하였다.

실시예 15: Kit의 D5 도메인에 대한 항체를 사용하는 SCF-유도된 Kit 활성화의 억제

인간 Kit를 발현하는 3T3 세포를 증가하는 농도의 폴리클로날 토끼 항체 (Kit의 단리된 재조합 D5에 대해 생성됨)를 함유하는 완충제 용액과 인큐베이션하였다 (도 14). 대조군으로서, 세포를 SCF에 대한 토끼 폴리클로날 항체 또는 전체 Kit 엑토도메인에 대해 지시된 토끼 폴리클로날 항체 (바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포에서 생성됨)로 처리하였다. 세포 용해물을 항-Kit 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-Kit 또는 항-pTyr 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다 (도 14).

이 실험은 항-D5 항체가 Kit의 SCF-유도된 티로신 자가인산화를 차단한다는 것을 보여준다.

실시예 16: 단리된 재조합 Kit D4 도메인에 의한 SCF-유도된 Kit 활성화의 억제

Kit를 발현하는 3T3 세포를 10분 동안 23℃에서 증가하는 농도의 정제된 재조합 D4 (이. 콜라이에서 발현됨)와 인큐베이션한 후에 SCF 인큐베이션하였다. 자극되지 않은 또는 자극된 세포의 용해물을 항-Kit 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-Kit 또는 항-pTyr 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다 (도 15).

이 실험은 단리된 D4의 존재가 Kit의 SCF-유도된 티로신 자가인산화를 방해한다는 것을 보여준다.

실시예 17: SCF-유도된 Kit 자극 실험

인간 Kit를 발현하는 3T3 세포를 10% 송아지 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. SCF 자극 전에, 세포를 문헌 [Yuzawa et al. (2007) Cell, 130: 323]에 기재된 바와 같이 혈청 비함유 배지에서 밤새 고갈시켰다. 고갈된 세포를 10 mM HEPES (pH 7.4) 및 0.1% BSA를 함유하는 차가운 DMEM으로 3회 세척한 후에, 도 14 또는 도 15에 나타낸 바와 같이 증가하는 농도의 항체 또는 Kit-D4와 10분 동안 23 ℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 100 ng/mL SCF로 10분 동안 23 ℃에서 자극하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 자극되지 않은 또는 SCF-자극된 세포의 용해물을 항-Kit 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-Kit 또는 항-p-Tyr 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다.

실시예 18: PDGF-수용체 β의 PDGF-유도된 활성화 및 PDGFRβ를 통한 신호전달은 PDGFRβ의 D4에서 결정적인 아미노산 내의 점 돌연변이에 의해 방지된다.

WT PDGFRβ 또는 D4에서 결정적인 아미노산 (Kit 엑토도메인 x선 결정 구조에서의 D4-D4 인터페이스와의 서열 유사성에 기초함)에서의 점 돌연변이체를 발현하는 PDGFR-/- 마우스로부터 유래된 마우스 배아 섬유모세포 (MEF)를 사용하여 R385 또는 E390의 돌연변이가 PDGF-유도된 수용체 활성화 (도 16a), 또는 PDGF-유도된 MAP 키나제 반응 및 Akt 자극 (도 16b)을 방지한다는 것을 입증하였다. 또한, 공유결합 가교제로의 가교 실험을 이용하여 본 발명자들은 E390A 점 돌연변이가 PDGF-유도된 수용체 이량체화를 방해하지 않는다는 것을 입증하였다. 그러나, 세포 표면 상에 활성화된 상태로 존재하는 WT PDGFRβ 공유결합 가교된 이량체와 달리, E390A 돌연변이체의 공유결합 가교된 이량체는 불활성이다 (도 16c). 이 실험은 D4에서 결정적인 E390 잔기의 돌연변이가 PDGFR 활성화에 필수적인 D4-D4 상호작용을 방지한다는 것을 보여준다. 그러나, PDGFR의 PDGF-유도된 이량체화는 수용체 활성화를 방지하는 D4 내의 점 돌연변이에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 D4-D4가 PDGFR의 티로신 키나제 도메인의 활성화를 가능하게 하는 엑토도메인의 막 근접 영역의 배치를 매개하는데 중요한 역할을 수행한다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태는 PDGFR에서 잔기 R385 또는 E390에 결합하거나 또는 이를 표적화하는 모이어티를 포함한다. 모이어티는 수용체 이량체화를 보존하면서 수용체를 불활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 실시예는 또한 Kit 엑토도메인 결정 구조의 경우에 한 RTK의 결정 구조에 기초한 정보가 다른 RTK로 용이하게 전달될 수 있다는 것을 입증한다. 여기서, Kit D4 도메인의 지식은 PDGF 수용체의 활성화를 위해 중요 아미노산을 확인하는데 정확하였다. PDGFR이 관여하는 실험의 보다 상세한 세트는 실시예 22-25에 기재된다.

실시예 19: Kit 엑토도메인의 분자 표면 분석

본원에 기재된 SCF 결합 전에 및 후에 Kit의 전체 엑토도메인의 결정 구조의 결정은 SCF-유도된 수용체 이량체화가 2개의 이웃하는 Kit 분자의 막 근접 Ig-유사 도메인 D4 및 D5 사이의 동형 측면 상호작용으로 이어진다는 것을 입증하였다. 동형 D4 및 D5 상호작용은 2개의 이웃하는 수용체의 세포질 티로신 키나제 도메인을 티로신 자가인산화 및 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로 배치시킨다. 또한, 본원에서 D4 동형 상호작용에 결정적인 단일 아미노산 잔기의 돌연변이가 SCF-유도된 Kit 활성화 및 PDGF-유도된 PDGF-수용체 활성화를 절충한다는 것이 입증되었다 (실시예 22-25 참조).

본원에 기재된 구조 분석은 RTK의 엑토도메인에 의해 형성된 캐비티의 얕은 영역 (예를 들어, D3, D4, 또는 D5 영역)에서 입체형태적 또는 비-인접한 에피토프에 결합하는 억제성 모이어티, 예컨대 모노클로날 항체 또는 Kit 및 다른 유형-III RTK의 엑토도메인의 D3-D4 및 D4-D5 힌지 영역에 결합하는 소분자 억제제를 설계하는 방법에 대한 새로운 견해를 제공한다. 엑토도메인 내의 4개의 영역을 처음에 표적화하였다: (A) D3-D4 힌지 영역에 결합하고, 티로신 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로의 막 근접 영역의 배치를 위해 필요한 움직임을 방지하는 분자 웨지로서 기능하는 모이어티를 생성할 수 있다 (도 17 참조); (B) D4-D5 힌지 영역에 결합하고, 티로신 키나제 활성화를 가능하게 하는 거리 및 배향으로의 막 근접 영역의 배치를 위해 필요한 움직임을 방지하는 분자 웨지로서 기능하는 모이어티를 생성할 수 있다 (도 18 참조); (C) D4:D4 인터페이스에 결합하여 동형 D4 수용체 상호작용을 방지하는 모이어티를 생성할 수 있다 (도 19 참조), (D) D2-D3 힌지 영역 내의 오목한 표면에 결합하여 리간드-수용체 상호작용을 불안정하게 하는 모이어티를 생성할 수 있다 (도 20 참조); 및 (E) Kit의 표면 상에 다양한 근접한 및 비-인접한 에피토프를 형성하는 펩티드 영역에 결합하는 모이어터를 생성할 수 있다 (표 5).

Kit 및 SCF-Kit 복합체 (PDB 코드: 2EC8 및 2E9W)의 엑토도메인의 분자 표면을 단백질의 표면 토포그래피의 컴퓨터 지도 (CASTp) 서버를 사용하여 분석함으로써 단백질의 3차원 구조 상의 오목한 표면 영역의 위치에 관한 정보를 제공하고, 묘사 및 측정이 가능해졌다 (문헌 [Dundas et al., (2006) Nucl Acids Res., 34: W116-W118]). 확인된 캐비티를 Pymol을 사용하여 시각화 및 조사하였다 (문헌 [DeLano. (2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA]).

(A) D3-D4 힌지 영역 내의 캐비티 (도 17)

여러 캐비티는 엑토도메인 단량체 구조에서 D3-D4 인터페이스 상에 산재되어 있다. 캐비티를 규정하는데 관여하는 아미노산은 표 4에 요약된다. 2개의 Kit 수용체 사이의 동형 상호작용의 형성시에, D3-D4 힌지 영역은 하기 잔기에 의해 생성된 얕은 캐비티가 형성되도록 변경된다: D3으로부터의 K218, S220, Y221, L222 및 D4로부터의 F340, P341, K342, N367, E368, S369, N370, I371, Y373. 도 17은 비점유 단량체 (도 17a) 및 SCF-결합된 이량체 (도 17b)의 D3-D4 힌지 영역의 리본 다이어그램 및 D3-D4 포켓의 메쉬 표현을 보여준다.

(B) D4-D5 힌지 영역 내의 캐비티 (도 18)

작은 캐비티가 Kit 단량체에서 D4의 AB 루프 및 EF 루프, D4-D5 연결 링커 및 D5의 DE 루프 및 FG 루프의 일부에 의해 형성된다. 상기 캐비티를 규정하는 잔기는 표 4에 요약된다. 캐비티의 형태 및 크기는 Kit 엑토도메인 이량체 구조에서 변화한다. D4의 EF 루프 및 가닥 G, D4-D5 링커 및 D5의 가닥 B 및 DE 루프에 의해 형성된 주요 캐비티는 D4 동형 인터페이스의 형성에 결정적인 영역인 D4의 EF 루프 아래 위치한다. 캐비티에 가깝게 위치한 D5의 DE 루프가 비결합 및 점유 Kit 구조 둘 다로부터의 전자 밀도의 보다 낮은 품질에 의해 밝혀진 바와 같이 보다 높은 가요성을 가질 수 있음에 주목한다. 도 18은 비점유 단량체 (도 18a) 및 SCF-이량체 (도 18b)의 리본 다이어그램 및 D4-D5 힌지 영역 주위의 얕은 캐비티의 메쉬 표현을 보여준다.

(C) D4 동형 상호작용을 매개하는 영역 내의 캐비티

Kit D4의 CD 루프 및 EF 루프에 의해 형성된 오목한 표면은 D4 동형 인터페이스 오른쪽 위에 위치한다. D4로부터의 잔기 Y350, R353, F355, K358, L379, T380, R381, L382, E386 및 T390은 엑토도메인 이량체 구조에서 오목한 표면에 대해 대략 130 A²의 표면적을 제공한다. Glu386의 측쇄는 표면의 중심을 향한 D4 동형 인터페이스 프로젝트에서 중요한 역할을 수행한다. 오목한 표면의 특징적인 특성은 대전된 잔기 (Glu386 및 Lys358)로 둘러싸인 작은 소수성 패치이다. 표면의 크기 및 접근가능성은 동형 D4:D4 상호작용시에 변경되는데, 도메인의 상부에 대해 위를 향하여 폴딩된 CD 루프의 입체형태에서 일어나는 변화가 나타난다. 오목한 표면의 형성에 관여하는 잔기는 표 4에 요약된다. 도 19a는 리간드-점유 (녹색) 및 비점유 엑토도메인 구조 (적색) 사이의 CD 및 EF 루프의 상이한 입체형태를 갖는 리간드-점유 Kit D4 (나타내지 않음) 상에 오버레이된 Kit의 비점유 D4 도메인 (금색)의 리본 다이어그램을 도시한다. D4:D4 상호작용에 결정적인 잔기를 막대 모델 형태로 나타낸다. 도 19b 및 19c는 비점유 Kit (도 19b) 및 SCF-점유 Kit 구조 (도 19c)의 리본 다이어그램 및 D4 동형 인터페이스 위의 얕은 캐비티의 메쉬 표현을 보여준다.

(D) 리간드-결합 D2 및 D3 영역 내의 오목한 표면

얕은 오목한 표면은 D2 및 D3 도메인의 리간드-결합 표면의 일부 상에 위치한다. 작은 포켓에 관련된 잔기는 Kit의 D2 도메인으로부터의 Y125, G126, H180, R181, K203, V204, R205, P206 및 F208 및 Kit의 D3 도메인으로부터의 V238, S239, S240, S241, H263, G265, D266, F267, N268 및 Y269이다. 포켓은 친수성 잔기로 둘러싸인 작은 소수성 패치에 의해 생성된다. 전체적인 매립된 표면적은 대략 500 A²으로 비점유 및 SCF-점유 Kit 구조 사이에 주요한 변경은 없었다. 도 20a 및 20b는 비점유 Kit (A) 및 SCF-결합된 Kit (B)의 리본 다이어그램 및 D2-D3 포켓의 메쉬 표현을 보여준다.

(E) KIT 티로신 키나제의 구조 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 분석은 본 발명의 모이어티에 대한 표적일 수 있는 연속적 및 불연속적 에피토프를 둘 다 밝혀내었다. 표 5에서, 에피토프 1, 4, 5, 6, 8, 12-16, 19, 22-23, 및 31-39는 연속적 에피토프이다. 이들 에피토프는 KIT 단백질에서 순차적인 아미노산으로 구성된다. 표 5에서의 에피토프 2, 3, 7, 9-11, 17, 18, 20, 21, 24-30, 및 40-43은 KIT 단백질의 폴딩에 의해 근접해진 KIT 단백질의 적어도 2개의 펩티드로 구성된 불연속적 입체형태적 에피토프이다.

실시예 20: RTK 활성 검정

관심있는 RTK를 함유하는 세포를 본 발명의 수용체 및 모이어티에 대한 활성화 리간드에 노출시켰다. 관심있는 RTK는 표준 분자 생물학 방법 (예를 들어, 항체 정제)에 의해 단리할 수 있다. 정제 후에, RTK (본 발명의 모이어티가 아니고 단순하게 정제에 사용되는 바와 같은 구조적 결합제임)에 결합하는 항체를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 상에 미리 코팅하였다. 이어서, RTK 및 눈금을 매긴 표준을 RTK 단백질이 포획된 별개의 웰에 첨가하였다. 다음에, 검출 항체를 첨가하였고, 이는 포스포-부위 특이적일 수 있다 (예를 들어, 활성화시에 인산화되는 Kit의 c-Kit pY823 또는 다른 잔기; 포스포ELISA^TM 시스템은 토끼 항체를 사용함). 항체-Kit 복합체는 비색 기질에 따라 표지 또는 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제가 포스포ELISA^TM 시스템에 사용됨)에 접합된 2차 항체 (예를 들어, 토끼 유래의 1차 항체를 검출하기 위한 항-토끼 Ab)를 사용하여 검출하였다. 이어서, 정지 용액을 첨가하고, 플레이트를 판독하였다 (예를 들어, 450nm 광원 및 검출기 사용). 포스포ELISA^TM에 대한 상세한 프로토콜은 인비트로젠으로부터 입수가능하다 (invitrogen.com/content.cfm?pageid=11655; invitrogen.com/downloads/F1027_BN_pELISA1006.pdf; invitrogen.com/downloads/F1028_BN_pELISA1006.pdf C-KIT [pY823] ELISA KIT, HU (BioSource^TM) Catalog number - KHO0401; c-KIT [TOTAL] ELISA KIT, HU (BioSource^TM) Catalog number - KHO0391).

실시예 21: 수용체 내재화 검정

관심있는 RTK를 발현하는 세포를 우선 적절한 리간드와 인큐베이션하여 (예를 들어, Kit 발현 세포를 SCF와 인큐베이션함) 수용체 내재화를 유도하였다. 수용체 내재화의 과정을 세포를 차가운 PBS 중에서 세척하여 중지시켰다. 이어서, 남아있는 표면 결합된 리간드를 세포를 리간드의 해리에 충분한 염 농도 및/또는 pH 수준을 갖는 용액 중에서 세척하여 제거하였다. 이어서, 세포를 적절한 완충제에 재현탁시켰다. 이 지점에서의 세포가 내재화된 수용체를 함유할 것이며, 이에 따라 세포 표면 상에 남아있는 수용체의 양이 감소된다.

세포를 적절한 리간드 및 본 발명의 시험 모이어티에 노출시키는 유사한 실험의 또 다른 세트를 진행하였다. 시험 모이어티가 표적 RTK의 활성화를 방지한다면, 수용체 내재화는 억제될 것이다. 상기 실험에 기재된 세포 (수용체 활성화가 일어남)와 비교하였을 때, 이들 세포는 세포 표면 상에서 감소된 내재화 및 보다 많은 양의 수용체를 보여주었다. 세포를 오직 완충제 또는 에탄올 용액 (약물의 가용화를 위한 공통적인 비히클)으로 처리하는 대조군을 또한 설정하였다.

상기 실험에서 세포 표면 상의 수용체의 양의 결정은 세포를 수용체에 특이적인 마우스 항체와 인큐베이션한 후에 형광단, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)에 접합된 항-마우스 항체와 인큐베이션하여 달성할 수 있다. 이어서, 형광 현미경검사 기술을 이용하여 세포 표면 상의 수용체의 양을 시각화 및 정량할 수 있다.

세포 표면 수용체의 정량 또는 시각화를 위한 대안적인 기술은 당업계에 주지되어 있고, 다양한 형광 및 방사성 기술을 포함한다. 예를 들어, 한 방법은 세포를 방사성표지된 항-수용체 항체와 인큐베이션하는 것을 포함한다. 대안적으로, 수용체의 천연 리간드는 형광 분자 또는 방사성-표지에 접합될 수 있고, 세포와 인큐베이션할 수 있다. 추가의 수용체 내재화 검정은 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Jimenez et al. (1999) Biochemical Pharmacology. 57(10):1125-1131; Bernhagen et al. (2007) Nature Medicine. 13(5):587-596; 및 Conway et al. (2001) J. Cell Physiol. 189(3):341-55] (각각의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된다.

실시예 22-25로의 도입

수용체 티로신 키나제 (RTK) 활성화의 일반적으로 허용되는 메커니즘은 리간드-유도된 수용체 이량체화가 티로신 키나제 활성화에 필수적인 단계인 촉매 코어의 활성화 루프에서의 결정적인 조절 티로신 잔기의 트랜스-자가인산화를 용이하게 하는 것이다. 이는 동원 및/또는 티로신 인산화시에 조절된 방식으로 다양한 세포내 구획에 신호를 전달하는 다양한 신호전달 단백질의 SH2 (Src 상동성 2) 또는 PTB (포스포티로신 결합) 도메인에 대한 결합 부위로서의 역할을 하는 세포질 도메인 내의 다중 티로신 잔기의 자가인산화로 이어진다 (문헌 [Schlessinger, J. (2000) Cell 103, 211-225; Pawson, T. & Nash, P. (2003) Science 300, 445-452; 및 Hunter, T. (2000) Cell 100, 113-127]).

모든 RTK가 이량체화에 의해 활성화되는 한편, 상이한 RTK 패밀리가 리간드-유도된 수용체 이량체화 및 활성화를 위해 상이한 분자 전략을 사용하도록 진화되었다 (문헌 [Burgess, A. W., et al. (2003) Mol Cell 12, 541-552; Schlessinger, J., et al. (2000) Molecular Cell 6, 743-750]). PDGF, SCF, CSF 및 Flt3L을 포함하는 유형-III RTK의 모든 리간드는 2개의 이웃하는 수용체 분자의 동일한 부위에의 2가 결합에 의해 이들의 동족 수용체를 가교시킬 수 있는 이량체성 분자이다. PDGF 프로모터는 분자의 한 말단에 특징적인 시스테인-노트를 갖는 중심 4-가닥 β-시트로 구성된다. 2개의 PDGF 프로모터는 역평행 방식으로 배열되고, 2개의 쇄간 디술피드 브릿지에 의해 서로에 연결된다 (문헌 [Oefner, C., et al. (1992) EMBO J. 11, 3921-3926]). 대조적으로, 각각의 SCF, CSF 또는 Flt3L 프로모터는 짧은 헬릭스 폴드로 구성되고, 비-공유결합 상호작용에 의해 서로에 연결된다 (문헌 [Jiang, X., et al. (2000) Embo J 19, 3192-3203; Zhang, Z., et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 7732-7737; Pandit, J., et al. (1992) Science 258, 1358-62; 및 Savvides, S. N., et al. (2000) Nat Struct Mol Biol 7, 486-491]). 이들의 다양한 폴드에도 불구하고, 2개의 성장 인자 하위유형은 실질적으로 동일한 방식으로 이들의 동족 RTK에 결합하여 이를 활성화시킴으로써 활성화된 리간드/RTK 2:2 복합체를 형성한다 (문헌 [Savvides, S. N., et al. (2000) Nat Struct Mol Biol 7, 486-491]). 모든 유형-III RTK는 5개의 탠덤 Ig-유사 도메인에 이어 단일 막횡단 헬릭스 및 세포질 티로신 키나제 도메인 (이종 단백질 키나제에 의해 자가인산화 및 인산화되는 조절 영역에 의해 말단절단된 큰 키나제-삽입체 영역을 가짐)을 함유하는 세포외 리간드 결합 영역으로 구성된다 (문헌 [Hubbard, S. R. (1999) Prog Biophys Mol Biol 71, 343-358]).

PDGF-수용체 β (PDGFRβ) 활성화의 메커니즘은 관련 수용체 티로신 키나제 Kit의 세포외 영역의 결정 구조에 기초하여 설계된 돌연변이체 수용체의 특성을 분석함으로써 조사하였다. 이들 실험에 기초하여 D4 (세포외 영역의 제4 Ig-유사 도메인) 내의 Arg385 또는 Glu390이 돌연변이된 PDGFRβ의 PDGF-유도된 활성화가 다양한 PDGF-유도된 세포 반응의 손상을 일으키면서 절충되었다는 것을 입증하였다. 이들 실험은 또한 Arg385 및 Glu390 사이의 염 브릿지에 의해 매개될 가능성이 있는 동형 D4 상호작용이 PDGFRβ 및 모든 유형-III RTK의 활성화에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 입증한다. 또한 화학적 가교제를 사용하여 PDGF-자극된 세포를 공유결합에 의해 가교시킴으로써 PDGFRβ의 Glu390Ala 돌연변이체가 전형적인 PDGF-유도된 수용체 이량체화를 경험한다는 것을 입증하였다. 그러나, 리간드-자극된 세포의 표면 상에서 활성 상태로 발현되는 WT PDGFR 과 다르게, PDGF-유도된 Glu390Ala 이량체는 불활성이다. D4 동형 상호작용을 매개하는데 요구되는 보존된 아미노산은 PDGFRβ 활성화 (및 유형-III RTK에서의 유사한 상호작용)에 중요한 반면, 이들 상호작용은 PDGFRβ 이량체화에 불필요하다. 또한, PDGFRβ 이량체화는 티로신 키나제 활성화에 필수적이지만 충분하지 않다.

Kit의 D4 도메인과 유사하게, PDGFRα 및 PDGFRβ의 D4 도메인은 Ig-유사 도메인에서 B5 및 F5에 위치한 시스테인 잔기를 가교시키는 특징적인 디술피드 결합이 결여되어 있다. 도 21에 제시된 아미노산 서열 정렬은 I세트 IgSF 폴드의 20개의 핑거-프린트 잔기 중 13개가 PDGFR의 D4 도메인에 보존되고, 핑거-프린트 잔기에 상응하는 가닥의 수 및 길이가 Kit, PDGFRα, PDGFRβ 및 CSF1R의 D4 도메인에 고도로 보존된다는 것을 보여준다. 이는 본 발명의 억제제가 모든 유형 III RTK를 포함하는 다양한 수용체 분자를 억제하기 위해 설계될 수 있다는 것을 나타낸다.

Kit의 D4 도메인은 2개의 β 시트로 구성되고, 이는 각각 4개의 가닥을 배열 ABED/A'GFC로 함유하고, 동형 D4 접촉은 2개의 이웃하는 Kit 분자로부터 돌출된 D4의 EF 루프에 의해 매개된다. 본원에 개시된 Kit 구조는 EF 루프에서의 Arg381 및 Glu386이 Kit 이량체의 2-폴드 축을 가로질러 염 브릿지 및 반 데르 발스 접촉을 형성한다는 것을 입증한다. 또한, 각각의 프로모터의 Arg381의 측쇄는 이웃하는 Kit 분자의 상응하는 잔기의 주쇄 카르보닐과 수소 결합을 형성한다. 구조 기반 서열 정렬은 EF 루프의 크기, 및 D4-D4 인터페이스를 포함하는 결정적인 아미노산이 Kit, PDGFRα, PDGFRβ, 및 CSF1R에서 보존된다는 것을 보여주었다. PDGFRα에서, Glu386은 아스파르트산에 의해 대체되고, 이 잔기는 또한 염 브릿지 파트너로 기능할 수 있다. 또한, 한 쌍의 염기성 및 산성 (Glu/Asp) 잔기가 타키푸구 루브리페스(Takifugu rubripes)로부터 호모 사피엔(Homo sapien)에 이르는 범위의 상이한 종의 PDGFRα 및 PDGFRβ에서 엄격하고 보존되고 (도 21), 이는 이 영역의 기능적 중요성에 대한 추가의 지지를 제공한다. 이와 같이, 상이한 아미노산 서열을 갖는 RTK, 예를 들어 유형 III RTK 또는 본원에 기재된 것과 유사한 기능의 변이체 도메인에 표적화된 본 발명의 모이어티가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.

실시예 22-25에 관련된 방법

서열 정렬 및 상동성 모델링

아미노산 서열 정렬을 CONSEQ 서버 (문헌 [Berezin, C., et al. (2004) Bioinformatics 20, 1322-1324])를 사용할 뿐만 아니라 IgSF 폴드 특성 (문헌 [Harpaz, Y. & Chothia, C. (1994) Journal of Molecular Biology 238, 528-539]) 및 인간 Kit 구조의 D4의 Ig-폴드의 코어 잔기 (문헌 [Yuzawa, S., et al. (2007) Cell 130, 323-334])에 따라 수행하였다. 각각의 서열의 승인 코드는 다음과 같다: PDGFRα 인간 (P16234), 마우스 (P26618), 닭 (Q9PUF6), 개구리 (P26619) 및 복어 (Q8AXC7); PDGFRβ 인간 (P09619), 개 (Q6QNF3), 마우스 (P05622), 복어 (P79749) 및 Kit 인간 (Q96RW7). PDGFRβ의 D4의 상동성 모델은 WHAT IF 서버를 사용하여 D4 Kit 구조 (PDB 코드: 2E9W)에 기초하여 생성하였다 (문헌 [Rodriguez, R., et al. (1998) Bioinformatics 14, 523-528]). PyMOL (Delano, W.L.; pymol.org)을 사용하여 도면을 생성하였다.

시약 및 항체

L-히스티디놀 및 항-플래그 항체를 시그마로부터 구입하였다. MAPK, 포스포-MAPK, Akt, 포스포-Akt, 및 포스포리파제 Cγ에 대한 항체를 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 구입하였다. 항-포스포티로신 (4G10) 항체는 업스테이트 테크놀로지(Upstate Technology)로부터의 것이다. 항유비퀴틴 항체 (P4D1)는 산타 크루즈로부터의 것이다. PDGFRβ에 대한 항체를 PDGFRβ의 세포질 도메인으로부터의 합성 펩티드로 토끼를 면역화시켜 생성하였다. PDGF BB cDNA를 스튜어트 아론손(Stuart Aaronson)으로부터 구입하였다. PDGF BB를 인비트로젠으로부터 구입하고, 이전에 기재된 바와 같이 박테리아에서 생성하였다 (문헌 [Hoppe, J., et al. (1990) European Journal of Biochemistry 187, 207-214]). ¹²⁵I 방사성핵종을 퍼킨엘머로부터 구입하였다. 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 시약 및 아이오도-겐(IODO-GEN) 사전-코팅된 아이오딘화 튜브는 피어스로부터의 것이다. FITC-팔로이딘을 인비트로젠으로부터 구입하였다.

세포주 및 레트로바이러스 감염

PDGFRα 및 PDGFRβ가 둘 다 (PDGFRα/β) 결여되어 있는 마우스 배아로부터 유래된 섬유모세포는 필립 사리아노(Philip Sariano) 및 안드리우스 카즐라우스카스(Andrius Kazlauskas)가 제공하였다. PDGFRβ cDNA는 다니엘 데마이오(Daniel DeMaio)가 제공하였다. PDGFRβ cDNA를 pLXSHD 레트로바이러스 벡터로 서브클로닝하고, 플래그-태그를 수용체의 C 말단에 부가하였다. D4에서의 모든 돌연변이체를 제조사의 지시 (스트라타진(Stratagen))에 따른 부위-지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다. WT 및 돌연변이체 PDGFRβ를 코딩하는 레트로바이러스를 293GPG 세포에서 생성하였다 (문헌 [Ory, D. S., et al. (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. 93, 11400-11406]). 감염 후에, 세포를 L-히스티디놀로 선택하고, 선택된 세포의 풀을 실험에 사용하였다.

면역침전 및 이뮤노블롯팅

자극되지 않은 또는 PDGF-자극된 세포를 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% 트리톤X-100, 25mM 나트륨 플루오라이드, 1mM 오르토바나데이트, 1mM 페닐-메틸술포닐 플루오라이드, 5 μg의 아프로티닌 및 류펩틴 (pH 7.5)을 함유하는 완충제 용액 중에서 용해시켰다. 동등한 양의 세포 용해물을 지시된 항체로 면역침전시키고, 이뮤노펠릿을 SDS-PAGE에 의해 분할하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 상이한 항체로 이뮤노블롯팅하였다. 필름을 덴시토미터 (아머샴(Amersham))를 사용하여 스캐닝하고, 이미지콴트(Imagequant) 소프트웨어 (몰레큘라 다이나믹스(Molecular dynamics))로 정량하였다.

PDGFR에 대한 시험관내 인산화 검정

세포를 16시간 동안 혈청-고갈시키고, 150 mM NaCl, 50 mM Hepes (pH 7.4), 1 mM EDTA, 25 mM NaF, 0.1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 5 μg/ml 류펩틴 및 아프로티닌, 1mM PMSF 및 1% NP40을 함유하는 용해 완충제 중에서 가용화시켰다. 용해물을 항-PDGFRβ 항체로 면역침전시키고, 이뮤노펠릿을 50mM Hepes (pH7.4), 1mM ATP 및 10mM MgCl₂를 함유하는 반응 완충제 중에서 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 펠릿을 SDS-PAGE에 이어 항포스포티로신 항체로의 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. 막을 벗겨내고, 총 PDGFRβ 수준의 결정을 위해 항-플래그 태그 항체로 재블롯팅하였다.

수용체 이량체의 화학적 가교

세포를 150mm 플레이트에서 80% 전면성장률에 도달할 때까지 성장시키고, 16시간 동안 혈청-고갈시킨 후에 50mM Hepes (pH 7)를 함유하는 DMEM 중에서 4℃에서 지시된 농도의 PDGF와 인큐베이션하였다. 90분 후에, 세포를 PBS (pH 7.4)로 광범위하게 세척하였다. 플레이트를 실온으로 옮기고, 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS)를 0.5mM의 최종 농도로 첨가하였다. 가교 반응은 30분 후에 10mM 트리스 완충제와 15분 동안 인큐베이션한 후에 PBS로 광범위하게 세척함으로써 켄칭하였다. 50mM Hepes, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 25mM 나트륨 플루오라이드, 1mM 나트륨 오르토바나데이트, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 5 μg/ml 아프로티닌 및 5 μg/ml 류펩틴 (pH 7.4) 중의 세포 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시키고, SDS-PAGE에 의해 분할하였다. 니트로셀룰로스 막을 플래그-태그에 대한 항체 또는 항포스포티로신 (4G10) 항체로 이뮤노블롯팅하여 각각 총 수용체 및 인산화된 수용체 수준을 검출하였다.

PDGF-유도된 액틴 세포골격 재조직화

MEF를 24시간 동안 유리 커버슬립 상에 아융합되도록 플레이팅한 후에 밤새 혈청 고갈시켰다. 세포를 50 ng/ml PDGF로 2, 5, 10, 또는 30분 동안 처리하거나 또는 처리하지 않고 두었다. 세포를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, PBS 중 0.1% 트리톤으로 투과시키고, 1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 30분 동안 FITC-팔로이딘 (시그마)으로 염색하였다. 커버슬립을 프롤롱 안티페이드(Prolong Antifade) 마운팅 배지 (인비트로젠)로 마운팅하고, 니콘(Nikon) 형광 현미경으로 영상을 수득하였다. 각각의 커버슬립 상에서 약 400개의 세포를 분석하고, 액틴 고리 형성을 보이는 세포의 백분율을 계산하고, 선형으로 제시하였다.

PDGF 결합 및 내재화 실험

PDGF를 볼튼-헌터 시약 (피어스)를 사용하여 표지한 후에 아이오도-겐 아이오딘화 튜브 (피어스)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 아이오딘화시켰다. 세포를 24-웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 중에서 80% 전면성장률까지 성장시켰다. 세포를 20mM Hepes (pH7.4) 및 0.1% BSA를 함유하는 차가운 DMEM에서 2회 세척하였다. 3중 웰을 증가하는 양의 천연 PDGF의 존재하에 5ng/ml의 ¹²⁵I-PDGF와 인큐베이션하였다. 결합은 25℃에서 1시간 동안 진행시켰다. 이어서, 세포를 차가운 PBS에서 세척하고, 0.5 M NaOH 중에서 가용화시켰다. 샘플의 방사능 함량을 LS6500 섬광 계수기 (베크만 코울터)를 사용하여 결정하고, 데이터를 PRISM 소프트웨어 (그래프패드(GraphPad))를 이용하여 분석하였다.

내재화 실험을 위해, 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하여, 80% 전면성장률까지 성장시키고, 밤새 고갈시켰다. 세포를 DMEM/0.1% BSA/50mM Hepes (pH7.4) 중에서 5 ng/ml ¹²⁵I-PDGF와 90분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 리간드는 빙냉 PBS (pH 7.4)로 세척하여 제거하였다. 미리 가온된 DMEM/0.1% BSA/50mM Hepes를 세포에 첨가하고, 지시된 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 표면-관련 리간드를 PBS (pH 3) 및 0.1% BSA를 함유하는 빙냉 산성 완충제로 10분 동안 수집하였다. 내재화된 리간드를 0.5 M NaOH로의 가용화에 의해 수집하였다. 분해된 ¹²⁵I-PDGF의 양은 인큐베이션 배지를 10% 트리클로로아세트산 (TCA)으로 침전시키고, 상층액을 TCA 가용성 분획에 대해 계수하여 결정하였다. 세포-표면-관련 내재화 및 방출 방사능을 액체 섬광 계수기에 의해 결정하였다. 표면 결합된, 세포내 및 분해된 PDGF의 양을 얼음 상에서 90분 인큐베이션한 후에 (t=0 분) 총 세포 관련 방사능의 백분율로 표현하였다. 각각의 시점을 3중으로 수행하고, 결과를 평균±SE로 표현하였다.

실시예 22: PDGF-유도된 PDGF-수용체 활성화는 D4 도메인 내의 돌연변이에 의해 절충된다.

도 21a에 제시된 아미노산 서열 정렬은 PDGFR의 EF 루프에서의 Arg385 및 Glu390이 이웃하는 Kit 수용체 사이의 동형 D4 상호작용의 매개를 담당하는 Kit의 Arg381 및 Glu386 사이에 형성된 염 브릿지와 유사한 동형 D4 상호작용을 매개할 수 있다는 것을 입증한다. 유사한 메커니즘이 PDGFRβ, Arg385 및 Glu390에 의해 이용되는지 여부를 조사하기 위해, 각각을 단독으로 (R385A, E390A) 또는 조합하여 (R385E390/AA) 알라닌 잔기로 치환하였다. 루프 영역에서의 추가의 보존된 Lys387 잔기를 또한 PDGF-유도된 PDGFRβ 활성화의 제어에서 그의 잠재적인 역할을 조사하기 위해 알라닌 (R385K387E390/AAA) 잔기로 치환하였다. 야생형 및 돌연변이체 PDGFRβ를 PDGFRα 및 PDGFRβ가 둘 다 결핍된 마우스 배아 (MEF)로부터 유래된 섬유모세포에서 안정하게 발현시켰다 (문헌 [Soriano, P. (1994) Genes Dev. 8, 1888-1896; Soriano, P. (1997) Development 124, 2691-2700; 및 Andrews, A., et al. (1999) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2683-2689]). 발현 수준에 매치된 야생형 또는 돌연변이체 PDGFRβ를 발현하는 MEF를 아래 기재된 실험에 사용하였다. 자극되지 않은 또는 PDGF-자극된 세포로부터의 세포 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시킨 후에, 항-포스포티로신 항체로 이뮤노블롯팅하였다.

이후에, 막을 벗겨내고, PDGFR 발현의 정량을 위해 항-PDGFR 항체로 재블롯팅하였다. 도 22a에 제시된 실험은 PDGFRβ의 PDGF-유도된 티로신 자가인산화가 PDGFRβ의 E390A, R385A, (R385E390/AA), 및 (R385K387E390/AAA) 돌연변이체를 발현하는 세포에서 강하게 절충되고; 티로신 자가인산화의 정도 및 동역학이 둘 다 각각 감소 및 감쇄된다는 것을 보여준다. 이들 실험은 D4의 EF 루프에서의 Arg385 및 Glu390이 PDGFRβ의 PDGF-유도된 자극에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 입증하고, 이는 Kit 구조에서 확인된 것과 유사한 한 쌍의 염 브릿지가 활성화된 PDGFR 및 다른 유형 III RTK에 존재한다는 것을 입증한다. 리간드-수용체 복합체 내의 이웃하는 수용체의 D4 도메인 사이의 직접적인 상호작용은 유형-III RTK의 리간드 유도된 활성화에 사용되는 공통적인 메커니즘을 대표할 수 있다. PDGF-유도된 수용체 자가인산화가 R385A, (R385E390/AA) 또는 (R385K387E390/AAA) 돌연변이체를 발현하는 세포와 비교하여 E390A를 발현하는 세포에서 더 강하게 절충된다는 것이 일관되고 재현가능하게 관찰되었다. 이들 돌연변이체 사이의 차이를 담당하는 정확한 메커니즘이 명확하지 않으나, D4 인터페이스에서의 국부 표면 양전하가 정전기적 반발을 일으켜 리간드 자극 전에 이웃하는 수용체의 D4를 떨어져 있는 상태로 유지시킬 수 있음이 가능하다. Arg385의 알라닌 잔기에 의한 치환이 염 브릿지 형성을 방지할 것인 반면, 이러한 변화는 또한 D4-D4 인터페이스에서의 순 양전하를 감소시켜 PDGFR 활성화의 보다 약한 억제를 일으킬 수 있다.

다음에, PDGFR의 D4 도메인 내의 돌연변이가 돌연변이체 PDGFRβ의 세포 막 발현 및 리간드 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있는지 가능성을 조사하기 위해, 야생형 또는 돌연변이체 PDGFRβ를 발현하는 세포에 대한 정량적 PDGF 결합 실험을 수행하였다. 야생형, R385A, E390A 또는 (R385E390/AA) PDGFRβ 돌연변이체를 발현하는 세포를 ¹²⁵I-PDGF를 함유하는 완충제 용액과 90분 동안 4℃에서 증가하는 농도의 천연 PDGF의 존재하에 인큐베이션하였다. 세포 결합된 방사능을 섬광 계수기를 사용하여 측정하였다. 야생형 및 돌연변이체 PDGFRβ의 변위 곡선의 EC50 값을 프리즘4로의 곡선 핏팅에 의해 분석하였다 (도 22b). 형질감염된 MEF에서 발현되는 야생형 및 돌연변이체 PDGFRβ의 양을 또한 전체 세포 용해물을 PDGFR에 대한 항체 또는 항-태그 항체로 이뮤노블롯팅하여 비교하였다 (도 22a 및 c). 이들 실험은 함께 유사한 양의 야생형 또는 돌연변이체 PDGFRβ가 형질감염된 세포의 세포 표면 상에서 발현된다는 것을 입증한다. 또한, 유사한 IC50 값 (50%의 ¹²⁵I-PDGF 결합을 변위시키는 PDGF 농도)을 야생형 (3.7nM), R385A (6.0nM), E390A (2.8nM) 또는 RE/AA (3.0nM) 돌연변이체를 발현하는 세포에 대해 수득하였다. 야생형 및 돌연변이체 수용체의 시험관내 티로신 키나제 활성을 비교함으로써 돌연변이체 PDGFRβ의 내인성 티로신 키나제 활성이 불리한 영향을 받을지 여부의 가능성을 또한 조사하였다. 이 실험에서, 혈청-고갈된 세포로부터의 세포 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시키고, 고정된 PDGFR에 대해 1mM ATP 및 10mM 염화마그네슘의 존재하에 시험관내 키나제 검정을 수행하였다. 인큐베이션 후에, 샘플을 항-포스포티로신 항체로의 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다. 도 22c에 제시된 실험은 R385A, E390A 또는 RE/AA 돌연변이가 PDGFR의 내인성 티로신 키나제 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다. 함께, 이들 실험은 PDGFRβ의 PDGF-유도된 자극에 영향을 미치는 D4 내의 돌연변이가 세포 표면 상에서의 PDFGRβ의 발현을 변경시키지 않고, PDFGRβ의 리간드 결합 친화도에 영향을 미치지 않고, 돌연변이체 PDGFRβ의 내인성 티로신 키나제를 변경시키지 않는다는 것을 입증한다.

실시예 23: PDGF 수용체 D4 점 돌연변이체는 PDGF-자극된 세포의 표면 상에서 불활성 이량체의 형태로 발현된다

수용체 이량체화가 수용체 티로신 키나제 활성화를 기반으로 한 결정적인 메커니즘으로 확립되었기 때문에, 본 발명자들은 PDGF 자극에 반응한 돌연변이체 PDGFRβ의 감소된 티로신 자가인산화가 수용체 이량체화의 결핍에 의해 유발되는지 여부를 조사하였다. 화학적 가교제는 이전에 살아있는 세포의 세포 표면 상에서 야생형 및 다양한 EGF 수용체 돌연변이체를 포함하는 여러 세포 막 수용체의 리간드-유도된 이량체화를 모니터링하고 이를 따르기 위해 사용되었다 (문헌 [Cochet, C., et al. (1988) J Biol Chem 263, 3290-3295). 이 실험에서, 야생형 PDGFRβ 또는 E390A 돌연변이체를 발현하는 세포를 밤새 혈청 고갈시킨 후에, 90분 동안 4℃에서 PDGF와 인큐베이션하였다. 여러 번 세척을 사용하여 결합되지 않은 PDGF를 제거하고, 세포를 PBS 중에서 30분 동안 25℃에서 0.5mM 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS)와 인큐베이션하였다. 자극되지 않은 또는 PDGF-자극된 세포로부터의 세포 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시킨 후에, SDS-PAGE 및 PDGFR 이량체화의 상태를 모니터링하기 위한 항-플래그 항체로의 이뮤노블롯팅 및 PDGFR 활성화의 상태를 모니터링하기 위한 항포스포티로신 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다 (도 23).

도 23에 도시된 실험은 자극되지 않은 세포의 용해물에서 PDGFR 단량체에 상응하는 180 kDa의 겉보기 분자량으로 SDS 겔 상에서 이동하는 밴드가 야생형 PDGFRβ 또는 E390A 돌연변이체를 발현하는 세포로부터의 용해물에서 검출되었다는 것을 입증한다. PDGF 자극시에, 추가의 PDGFR 이량체에 상응하는 360 kDa의 겉보기 분자량으로 SDS 겔 상에서 이동하는 추가의 밴드가 야생형 PDGFRβ 및 E390A 돌연변이체를 둘 다 발현하는 세포에서 검출되었다. 그러나, 샘플을 항-포스포티로신 항체로 이뮤노블롯팅하여, 야생형 PDGFR의 이량체에 상응하는 밴드가 강하게 티로신 인산화되는 한편, E390A 돌연변이체의 이량체에 상응하는 밴드의 매우 약한 티로신 인산화가 검출된다는 것을 입증하였다 (도 23).

이 실험은 E390A 돌연변이체의 손상된 리간드-유도된 티로신 자가인산화가 리간드-유도된 수용체 이량체화의 결핍에 의해 유발되지 않는다는 것을 보여준다. 이 실험은 또한 공유결합에 의해 가교된 야생형 PDGFRβ가 PDGF-자극된 세포의 세포 표면 상에 활성 이량체의 형태로 디스플레이되는 한편 E390A 돌연변이체는 PDGF-자극된 세포의 표면 상에 불활성 이량체의 형태로 디스플레이된다는 것을 입증한다. 상기 데이터는 PDGFR에서의 D4 동형 상호작용이 수용체 이량체화에 불필요하고, PDGF-유도된 수용체 이량체화가 티로신 키나제 활성화에 필수적이지만 충분하지 않다는 것을 입증한다.

실시예 24: D4 PDGF-수용체 돌연변이체를 발현하는 세포에서의 세포 신호전달의 손상된 자극

PDGF 자극에 반응한 세포 신호전달에 대한 PDGFR D4 돌연변이의 영향을 조사하였다. WT 또는 PDGFR D4 돌연변이체를 발현하는 자극되지 않은 또는 PDGF-자극된 세포로부터의 용해물을 항-포스포리파제 Cγ (항-PLCγ) 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-PLCγ 또는 항pTyr 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 도 24a에 제시된 실험은 PLCγ의 티로신 인산화가 R385A, E390A, RE/AA 또는 RKE/AAA PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포에서 심하게 절충된다는 것을 보여준다. 추가의 PDGF 유도된 세포 반응의 손상된 자극이 PDGFR D4 돌연변이체를 발현하는 세포에서 관찰된다. 도 24b에 제시된 실험은 MAP-키나제 반응 및 Akt 자극이 WT PDGFR을 발현하는 MEF에서 PDGF에 의해 유도된 유사한 반응과 비교하여 R385A, E390A, R385E390/AA 또는 R385K387E390/AAA PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포에서 강하게 절충되었다는 것을 보여준다. 전체적으로, 대략 10-배 더 높은 농도의 PDGF가 E390A, R385E390/AA (즉, RE/AA) 또는 R385K387E390/AAA (즉, RKE/AAA) PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포에서의 유사한 수준의 MAP 키나제 반응 및 Akt 자극을 위해 요구된다.

배양된 섬유모세포의 PDGF 자극의 특징 중 하나는 PDGF-자극된 세포의 배측 표면 상에서의 막 러플 및 원형 액틴 고리 구조의 전형적인 형성이다. 도 25에 제시된 실험은 액틴 고리 형성의 PDGF 자극이 PDGFR D4 돌연변이체를 발현하는 MEF에서 절충된다는 것을 보여준다. WT PDGFR을 발현하는 MEF의 대략 83%가 원형 액틴 고리 형성을 나타내는 한편, PDGFR D4 돌연변이체 세포의 5%만이 50ng/ml의 PDGF로의 2분 자극 후에 유사한 원형 액틴 고리 형성을 보여주었다. 또한, 2-5 분의 PDGF 자극 후에 WT PDGFR을 발현하는 MEF에서 최고가 되는 일시적인 원형 액틴 고리 형성은 R385A, E390A 또는 RE/AA PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포에서 약하게 검출되었다.

실시예 25: D4 PDGF 수용체 돌연변이체의 감소된 내재화 및 분해

PDGF 내재화, PDGFR 분해 및 PDGFR 유비퀴틴화에 대한 PDGFR D4 돌연변이의 효과를 또한 조사하였다. WT PDGFR 또는 PDGFR D4 돌연변이체를 발현하는 MEF를 4℃에서 90분 동안 5ng/ml의 ¹²⁵I 표지된 PDGF로 처리한 후에 PBS (pH7.4)로 간단하게 세척하여 배지 중의 잉여량의 리간드를 제거하였다. 미리-표지된 세포를 37℃로 가온시켜 4시간까지 다양한 시간 간격 동안 리간드-수용체 복합체의 세포내이입을 시작하였다. 배지 중의 세포 표면-결합된, 세포내 및 분해된 ¹²⁵I-PDGF를 수집하고, 섬광 계수기를 사용하여 정량하고, 4℃에서 90분 인큐베이션 후에 (t=0) 총 세포-관련 ¹²⁵IPDGF 방사능의 백분율로 제시하였다 (평균±SD). 도 26a에 제시된 실험은 WT PDGFR을 발현하는 MEF에 결합된 ¹²⁵I 표지된 PDGF의 내재화의 동역학이 E390A, R385A 또는 R385E390/AA PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포에 결합된¹²⁵I 표지된 PDGF의 내재화의 동역학보다 훨씬 더 빠르다는 것을 보여준다. 30분 후에, 약 75-80%의 ¹²⁵I-PDGF를 세포 표면으로부터 제거하고, 돌연변이체 수용체를 발현하는 세포에서 50% 미만에 비해 WT 수용체를 발현하는 세포 내에 축적시켰다.

¹²⁵I-PDGF의 저분자량 분해 생성물이 30분 후에 검출가능하게 되었다. 분해된 ¹²⁵I-PDGF의 방출은 WT 세포에서 보다 E390A 돌연변이체 세포에서 훨씬 더 느렸다 (도 26a). 감소된 PDGF 내재화 및 분해는 PDGFR D4 돌연변이체의 감소된 분해에서 반영된다. WT 또는 R385A, E390A 또는 R385E390/AA PDGFR 돌연변이체를 발현하는 세포를 우선 분해 실험 동안 새로운 PDGFR 분자의 생합성을 방지하기 위해 시클로헥시미드와 30분 동안 인큐베이션하였다. 자극되지 않은 또는 PDGF 자극된 세포의 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 WT 또는 PDGFR D4 돌연변이체의 C-말단에 부착된 태그에 대해 지시된 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 도 26b에 제시된 실험은 R385A, E390A 또는 R385E390/AA PDGFR 돌연변이체의 분해의 동역학이 강하게 감쇄되는 한편; WT PDGFR의 절반이 1.5시간의 PDGF 자극 내에 분해되고, PDGFR D4 돌연변이체에 대한 반감기가 대략 4 내지 6시간으로 연장된다는 것을 보여준다. 도 26c에 제시된 실험은 E390A PDGFR의 유비퀴틴의 PDGF 유도된 자극이 또한 유사한 조건하에 WT PDGFR에 비해 강하게 감소된다는 것을 보여준다. 이들 실험은 함께 PDGFR 내재화 및 유비퀴틴-매개된 PDGFR 분해가 PDGFR의 D4에서 돌연변이에 의해 절충된다는 것을 입증한다.

실시예 22-25의 논의

PDGFRα, PDGFRβ, CSF1R, Flt3 및 Kit를 포함하는 유형-III RTK의 모든 구성원의 세포외 도메인은 5개의 Ig-유사 도메인으로 구성되고, 이들 중 처음 3개는 결합시에 수용체 이량체화 및 활성화를 자극하는 이량체성 리간드 분자를 위한 결합 부위로 기능한다. 유형-III RTK의 분자 구조, 리간드 결합 특성 및 수용체 이량체화의 메커니즘이 고도로 보존되므로, SCF 자극 이전 및 이후에 Kit의 완전한 세포외 도메인의 결정 구조에 의해 밝혀진 SCF 유도된 Kit 활성화의 메커니즘은 모든 유형-III RTK의 활성화의 일반적인 메커니즘을 대표한다. 또한, 이들의 세포외 도메인에서 Ig-유사 도메인을 함유하는 RTK의 계통발생 분석은 VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR) 및 VEGFR3 (Flt4)을 포함하는 패밀리인 유형-III 및 유형-IV RTK에 대한 공통적인 진화 기원을 나타낸다. 또한, VEGF 및 PDGF는 둘 다 유사한 위상, 크기 및 수용체 결합 전략을 공유하는 동종이량체 성장 인자인 동일한 시스테인-노트 패밀리에 속한다. 따라서, 그의 세포외 도메인의 x선 구조 분석에 의해 밝혀진 Kit 활성화의 현저한 특징 (본원에서 처음으로 개시됨)은 또한 유형-V RTK의 리간드-유도된 활성화에 적용할 수 있다.

Kit의 구조 분석은 2개의 이웃하는 D4 도메인의 Glu386 및 Arg381 사이에 형성된 한 쌍의 염 브릿지가 SCF-유도된 Kit 활성화에 필수적인 동형 D4 상호작용의 매개를 담당한다는 것을 보여주었다. 유형-III RTK의 아미노산 서열의 비교는 동일한 서열 모티프가 PDGFRα, PDGFRβ 및 CSF1R의 D4의 EF 루프 영역에 존재한다는 것을 입증하고 (도 21), 이는 유사한 염 브릿지가 또한 유형-III RTK의 D4 사이에 형성된다는 증거를 제공한다. 실제로, PDGFRβ의 D4 도메인 내의 Arg385 또는 Asp390의 알라닌에 의한 치환은 WT PDGFRβ를 발현하는 세포에서 PDGF에 의해 자극된 다양한 세포 반응의 손상을 일으키는 PDGFRβ 활성화의 PDGF 자극을 절충하였다. Kit 구조의 분석에 의해 밝혀진 리간드 유도된 Kit 활성화의 메커니즘을 모든 유형-III RTK의 활성화에 적용한다. D4 동형 상호작용을 담당하는 서열 모티프에 동일한 서열 모티프는 또한 RTK의 VEGFR 패밀리 (유형-IV)의 모든 3개의 구성원의 막 근접 제7 Ig-유사 도메인 (D7)의 EF 루프에서 확인되었다. Kit 및 다른 유형-III RTK에서 동형 D4 상호작용을 매개하는 것을 담당하는 보존된 서열 모티프가 유형-IV RTK의 D7 도메인에 위치하더라도, VEGFR의 D7은 유형-IV RTK의 막 근접 영역 사이의 동형 상호작용을 매개하는데 있어 D4와 유사한 소정의 역할을 수행할 가능성이 있다. 실제로, VEGFR2의 세포외 도메인의 구조의 전자 현미경 분석은 VEGF-결합된 VEGFR2 이량체에서 D7 사이의 직접적인 접촉을 밝혀내었다 (문헌 [Ruch, C., et al. (2007) Nat Struct Mol Biol 14, 249-250]). 막 근접 Ig-유사 도메인 사이의 직접적인 접촉은 유형-III 및 유형-IV RTK 둘 다에 의해 이용되는 일반적인 메커니즘을 대표한다.

다양한 수용체 돌연변이체를 연구하거나 또는 Kit (문헌 [Blechman, et al. (1995) Cell 80, 103-113]), PDGF-수용체 (문헌 [Miyazawa, K., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 25495-25502]) 및 다른 유형-III RTK의 개별 Ig-유사 도메인에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 사용하는 연구는 Kit가 1가의 SCF 리간드에 의해 자극되는 경우일지라도 D4가 수용체 이량체화를 매개하는데 소정의 역할을 수행한다는 것을 제안하였다 (문헌 [Lev, S., et al. (1992) J Biol Chem 267, 15970-15977]). 그러나, 처음 3개의 Ig-유사 도메인 (D1-D3) 또는 모든 5개의 Ig-유사 도메인 (D1-D5)으로 구성된 Kit의 정제된 세포외 도메인을 향한 SCF 결합의 미세열량측정법 및 SCF 화학량론을 사용하는 정량적 분석은 D4 및 D5가 Kit 이량체화의 SCF 자극에 불필요하다는 것을 보여주었다. 즉, 이러한 보고는 Kit 이량체화가 주로 Kit에 대한 SCF 결합의 이량체 특성에 의해 구동된다는 것을 보여주었다 (문헌 [Lemmon, M. A., et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6311-6317]).

그러나, 본원에 제시된 작업은이웃하는 수용체 사이의 동형 D4 (및 또한 동형 D5) 상호작용이 수용체 이량체화에서 소정의 역할을 수행하는 것 보다는 티로신 키나제 활성화를 일으키는 이들의 세포질 도메인 사이의 상호작용을 가능하게 하는 거리 및 배향으로 2개의 수용체의 막 근접 영역을 정확하게 배치하는데 필요하다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 모이어티, 예를 들어 모노클로날 항체는 수용체 이량체화를 방해하기 보다는 티로신 키나제 활성화를 위해 필수적인 거리 및 배향으로 세포질 도메인을 배치하는데 필수적인 유형-III RTK의 막 근접 영역 사이의 결정적인 동형 상호작용을 방지함으로써 이들의 수용체 활성화에 대한 억제 효과를 나타낸다.

본원에 제시된 실험은 PDGFRβ, Kit 및 다른 유형-III RTK의 이량체화가 전적으로 리간드 결합에 의해 구동되고, 리간드 결합의 유일한 역할이 세포 막에서의 그의 국부 농도를 증가시키기 위해 2개의 수용체 분자를 가교시키는 것임을 입증한다. 동형 D4 상호작용의 매개를 담당하는 2개의 염 브릿지 (360Ų의 매립된 표면적의 인터페이스를 가짐)는 Kit가 각각의 SCF 프로모터에 대해 2060Ų의 총 매립된 표면적을 갖는 여러 강한 상호작용에 의해 매개되는 경우에 리간드 매개된 수용체 이량체화의 지지없이 수용체 상호작용을 지지하기에는 너무 약하다. 세포 당 20,000개의 수용체를 발현하는 자극되지 않은 세포의 세포 막에서의 수용체의 겉보기 농도는 대략 1-3 μM으로 추정되었다 (문헌 [Klein, P., et al. (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101, 929-934; Chandrasekhar, S. (1943) Reviews of Modern Physics 15, 1]). 이량체성 리간드, 예컨대 SCF의 결합시에, 2개의 점유 수용체는 75Å의 거리에서 함께 유지된다. 이러한 조건하에, 가장 가까운 이웃 접근법에 대한 평균 거리를 사용하여 계산된 세포 막에서의 겉보기 수용체 농도는 2배수의 크기로 4 - 6 x 10^-4M 초과로 증가한다. 이 계산은 2개의 염 브릿지에 의해 매개되는 것과 같은 10^-4 - 10^-5M 범위의 해리 상수를 갖는 약한 상호작용일지라도 2개의 이웃하는 수용체의 막 근접 영역 사이의 연합 및 직접적인 접촉을 매개할 수 있다는 것을 보여준다. D4 및 D5를 수용체 분자의 나머지 부분에 연결시키는 연결부의 가요성과 함께 세포 막에서의 높은 국부 농도는 동형 D4의 이동 및 형성 뿐만 아니라 이웃하는 세포질 도메인 사이의 상호작용, 티로신 자가인산화, 및 티로신 키나제 활성의 자극을 가능하게 하는 정확한 배향 및 거리 (Kit의 경우 15Å)로 수용체의 막 근접 영역을 위치시키는 동형 D5 접촉을 가능하게 한다.

최종적으로, 화학적 가교제를 적용하여 자극되지 않은 또는 PDGF-자극된 세포 상에 WT 또는 돌연변이체 수용체를 공유결합에 의해 가교시킴으로써 E390A PDGFRβ 돌연변이체가 WT 수용체의 PDGF-유도된 이량체화와 유사하게 PDGF-유도된 이량체화된다는 것을 본원에서 입증하였다. 그러나, PDGF-자극된 세포의 세포 표면 상에서 활성화된 이량체의 형태로 발현되는 WT PDGFRβ와 대조적으로, E390A 돌연변이체는 PDGF-자극된 세포의 표면 상에서 불활성 이량체의 형태로 발현된다. 이 실험은 동형 D4-D4 상호작용이 PDGFRβ 이량체화에 불필요하고, PDGFRβ 이량체화가 수용체 활성화에 필요하지만 충분하지 않다는 것을 입증한다.

실시예 26: D4-D4 인터페이스의 분열은 종양원성 KIT 활성화를 극복한다

야생형 (WT) KIT, D5의 Ala502 및 Tyr503이 복제된 종양원성 KIT 돌연변이체 (D5-반복부 돌연변이체), 또는 D5의 Ala502 및 Tyr503 (D5-반복부)이 D4의 Glu386이 Ala 잔기에 의해 치환된 추가의 점 돌연변이와 함께 복제된 KIT 돌연변이체 (D5-반복부/E386A 돌연변이체)를 안정하게 발현하는 뮤린 3T3 세포를 37℃에서 5분 동안 1, 5 또는 10 ng/ml의 SCF로 자극하였다.

자극되지 않은 또는 SCF 자극된 세포의 용해물을 항-KIT 항체로 면역침전시킨 후에 SDS-PAGE 및 항-KIT 또는 항-포스포티로신 (항-pY) 항체로의 이뮤노블롯팅을 수행하였다.

도 27에 제시된 실험은 야생형 KIT의 SCF 자극이 SCF 자극에 반응한 KIT의 향상된 티로신 자가인산화에 의해 밝혀진 KIT 활성화의 향상으로 이어진다는 것을 입증한다. 실험은 또한 KIT의 종양원성 D5-반복부 돌연변이체가 구성적으로 티로신 자가인산화된다는 것을 보여준다 (즉, 이는 SCF 자극의 부재하에 활성화됨). 대조적으로, D4에서 추가의 점 돌연변이를 보유하는 D5-반복부/E386A 돌연변이체 (정상 수용체 단백질의 백그라운드에서 KIT의 SCF 활성화를 손상시키는 것으로 밝혀짐)는 종양원성 D5-반복부 돌연변이에 의해 매개되는 KIT의 구성적인 티로신 자가인산화를 매개한다.

이 실험은 D5에서는 종양원성 돌연변이에 의해 및 아마도 KIT 분자의 상이한 부분에서는 다른 종양원성 돌연변이에 의해 KIT 활성화를 매개하는데 있어 D4-D4 동형 상호작용의 중요성에 대한 유전자 확인을 제공한다. 또한, 이 실험은 본 발명의 모이어티, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 소분자 또는 펩티드성 분자에 의한 약리학적 개입에 의한 D4-D4 인터페이스의 분열이 D5에서의 종양원성 돌연변이, KIT 분자의 다른 부분에서의 종양원성 돌연변이 및 종양원성 유형-III 및 유형-IV RTK에서의 활성을 차단할 것이라는 생각의 추가의 확인을 제공한다.

실시예 27: D4 동형 상호작용을 매개하는데 관여하는, KIT의 시그너쳐 모티프에 상응하는 합성 펩티드에 대해 지시된 항체는 무손상 KIT 단백질을 인식한다

본 실시예에서, 토끼 폴리클로날 항체는 3개의 상이한 KIT 항원에 대해 생성되었다:

1. 인간 KIT의 전장 세포외 도메인 (아미노산 1-510).

2. 아미노산 308- 411로 구성된 KIT Ig-유사 도메인 4 (D4) (KIT-D4)

3. KLH에 접합된 KIT D4의 시그너쳐 모티프를 포함하는 아미노산 375-391에 상응하는 17-머 펩티드 (SELHLTRLKGTEGGTYT).

토끼를 2주 간격으로 각각의 3개의 항원으로 면역화시키고, 시험 혈액을 분석하였다. 제시된 결과는 제3 면역화 후에 수집된 혈청 샘플로부터의 것이다.

야생형 인간 KIT를 발현하는 3T3 세포의 용해물을 하기 항체 중 하나를 함유하는 30 ㎕의 혈청과 인큐베이션하였다: 1. 항-KIT, 전장 KIT 세포외 도메인에 대해 지시됨. 2. 항-D4, KIT-D4에 대해 지시됨. 3. 항-펩티드, KIT D4의 아미노산 375-391에 상응하는 펩티드에 대해 지시됨. 각각의 항체가 포함된, 야생형 KIT를 발현하는 3T3 세포의 용해물을 단백질 A 세파로스와 함께 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션한 후에, 20mM Hepes, 150mM NaCl, 0.1% 트리톤X-100 및 5% 글리세롤을 함유하는 세척 완충제로 3회 세척하였다. 면역침전물을 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 니트로셀룰로스로 옮기고, 도 28에 기재된 바와 같은 각각의 항체로 이뮤노블롯팅하였다. 도 28에 제시된 데이터는 그의 활성화된 형태에서 KIT 이량체를 배치하는데 필수적인 D4의 동형 상호작용 영역에 대해 지시된 항-펩티드 항체를 포함하는 각각의 항체가 실험의 면역침전 및 이뮤노블롯팅 단계에서 무손상 천연 KIT를 인식한다는 것을 보여준다.

주목할 만하게, 이 실험은 항-펩티드 항체가 KIT의 무손상 세포외 또는 D4 영역에 대해 지시된 항체만큼 효율적으로 야생형 KIT를 인식한다는 것을 보여준다.

실시예 28: 세포외 막 근접 도메인 사이의 직접적인 접촉이 VEGF-수용체 활성화 및 세포 신호전달에 필요하다

SCF와의 복합체에서 KIT의 세포외 영역의 구조적 분석은 동형 수용체 접촉의 형성 및 리간드 유도된 KIT 활성화 및 세포 신호전달을 담당하는 제4 Ig-유사 도메인 (D4)의 EF-루프에서 서열 모티프를 밝혀냈다. 동일한 모티프는 VEGFR1, 2 및 3의 최대 막 근접 제7 Ig-유사 도메인 (D7)에서 확인되었다. 본 실시예는 D7 내의 중요 잔기 (Arg726 또는 Asp731)에 돌연변이를 보유하는 VEGFR1 또는 VEGFR2를 통한 리간드 유도된 티로신 자가인산화 및 세포 신호전달이 강하게 손상된다는 것을 입증한다. VEGFR2의 D7의 결정 구조는 또한 2.7Å의 해상도로 기재하였다. 구조는 동형 D7 접촉이 한 프로모터의 Arg726 및 다른 프로모터의 Asp731 사이에 형성된 염 브릿지 및 반 데르 발스 접촉에 의해 매개된다는 것을 보여준다. D7 이량체의 구조는 SCF와의 복합체에서의 KIT 세포외 영역의 결정 구조에서 보여진 D4 이량체의 구조와 매우 유사하다. 2개의 구조에서 EF 루프 및 염 브릿지의 위치는 거의 동일하고, 이들의 C-말단 사이의 거리는 두 구조에서 대략 15Å이다. 구조 및 기능 둘 다에서 VEGFR D7 및 KIT D4 사이의 높은 유사성은 유형 III 및 유형 V RTK의 공통적인 조상 기원에 대한 추가의 증거를 제공한다. 이는 또한 RTK 활성화에 대한 보존된 메커니즘 및 병적으로 활성화된 RTK의 약리학적 개입을 위한 신규한 표적을 밝혀낸다.

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 VEGF-수용체 (VEGFR) 패밀리의 3개의 구성원에의 결합 및 활성화에 의해 혈관 및 림프관 발생 및 조혈작용을 조절한다 (문헌 [Olsson et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 7(5):359-371 (2006)]). VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR/Flk1) 및 VEGFR3 (Flt4)은 7개의 Ig-유사 도메인 (D1-D7)으로 구성된 큰 세포외 영역 (티로신 키나제 활성 및 추가의 조절 서열을 갖는 단일 막횡단 (TM) 헬릭스 및 세포질 영역)을 함유하는 패밀리인 유형-V RTK의 구성원이다. VEGFR 엑토도메인의 제2 및 제3 Ig-유사 도메인, D2 및 D3은 시토카인의 VEGF 패밀리의 5개 구성원 (즉, VEGF-A, B, C, D 및 태반 성장 인자 (PlGF))에 대한 결합 부위로 기능한다 (문헌 [Barleon et al., J. Biol. Chem., 272(16):10382-10388 (1997); 및 Shinkai et al., J. Biol. Chem., 273(47):31283-31288 (1998)]). 이들 성장 인자는 공유 결합에 의해 연결된 동종이량체이다. 각각의 프로모터는 시스테인-노트 성장 인자로 지정된 구조에서 역평행 방식으로 배열된 4 가닥 β-시트로 구성된다 (문헌 [Weismann et al., Cell, 91(5):695-704 (1997)]). 시토카인의 시스테인-노트 패밀리의 다른 구성원은 신경 성장 인자 (NGF) 및 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)를 포함한다. 그러나, RTK (유형-III)의 PDGFR 패밀리의 엑토도메인은 D1, D2, 및 D3이 PDGFR 및 패밀리의 다른 구성원 (즉, KIT, CSF1R, 및 Flt3)의 리간드 결합 영역으로 기능하는 5개 Ig-유사 반복부로 구성된다. 구조적 및 생화학적 실험은 세포외 영역에의 SCF 결합이 KIT 이량체화를 유도하고, 이 단계에 이어 이웃하는 KIT 분자의 2개의 막 근접 Ig-유사 도메인 D4 및 D5 사이의 동형 접합을 유도한다는 것을 보여주었다 (문헌 [Yuzawa et al., Cell, 130(2):323-334(2007)]). 야생형 및 종양원성 KIT 돌연변이체의 생화학적 연구는 동형 D4 및 D5 접촉이 KIT 이량체의 세포질 영역을 트랜스-자가인산화, 키나제 활성화 및 세포 신호전달을 용이하게 하는 거리 및 배향으로 배치하는데 중요한 역할을 수행한다는 것을 보여주었다.

본 실시예에서, 구조적 및 생화학적 증거는 VEGF-수용체의 엑토도메인 (D7)의 최대 막-근접 Ig-유사 도메인 사이의 동형 접촉이 VEGF-수용체를 통한 VEGF 유도된 활성화 및 세포 신호전달에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 입증한다.

VEGFR2 D4 및 D7의 서열 분석

Ig-유사 도메인 사이의 동형 접합을 매개하는 것을 담당하는 진화적으로 보존된 서열 모티프 (L/IxRΦxxxD/ExG)를 KIT의 D4의 구조 기반 서열 정렬에 의해 확인하였다 (문헌 [Yuzawa et al., Cell, 130(2):323-334(2007)]). 유사한 모티프가 PDGFRα, PDGFRβ, 및 CSF1R의 D4 뿐만 아니라 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3의 최대 막 근접 Ig-유사 도메인 (D7)에서 발견되었다 (도 29). L/IxRΦxxxD/ExG 모티프는 D7의 βE 및 βF 가닥을 연결하는 루프 영역; 동형 D4 KIT 접촉에 필요한 염 브릿지를 매개하는 것을 담당할 것으로 밝혀진 영역에 위치한다. Arg 및 Asp는 VEGFR1 및 VEGFR2 둘 다에서 성게로부터 인간에까지 진화적으로 보존되고 (도 29), 이는 VEGFR 활성에서 이들 잔기의 기능적 중요성을 나타낸다. 그러나, KIT 및 PDGFR의 D4와 대조적으로, VEGFR1 및 VEGFR2의 D7은 β 가닥 사이에 디술피드 결합을 형성하는 위치 B5 및 F5에서 2개의 보존된 시스테인 잔기를 함유하고, 상호작용은 I-세트 Ig-유사 도메인의 소수성 코어에 기여한다 (문헌 [Harpaz and Chothia, J. Mol. Biol., 238(4):528-539(1994)]).

PDGFR 및 KIT의 D4와 유사하게, VEGFR2의 D4는 위치 B5 및 F5에서 β 가닥 사이의 디술피드 결합 형성을 담당하는 보존된 시스테인이 결여되어 있다. VEGFR2의 D4에서, βC를 βE와 연결하는 영역은 다른 전형적인 I-세트 Ig 도메인에 비해 더 짧은데, 이는 아마도 이 영역이 β-가닥 중 하나가 결여되어 있기 때문일 것이다. 아미노산 서열 분석은 VEGFR2 D4가 미오메신 도메인 D13 (2R15) 및 텔로킨 (1TLK)에 각각 30% 및 33%의 서열 동일성으로 상동성이라는 것을 보여주었다. 매뉴얼 서열 정렬은 VEGFR2의 D4 및 PDGFRα의 D4 사이에 20% 서열 동일성을 나타내었다. KIT의 D4 및 PDGFR의 D4는 둘 다 D/E-x-G/A/D-x-Y-x-C 모티프를 이루는 βF에서 "Y-코너 모티프" 주위에 보존된 "D/E-x-G" 아미노산을 함유한다 (문헌 [Hemmingsen et al., Protein Sci., 3(11):1927-1937 (1994)]) (D4에서 Cys 잔기는 소수성 아미노산에 의해 대체됨). D4에서, 염 브릿지는 제2 KIT 분자의 -5 위치에서 한 분자 상의 Glu 잔기와 Arg 잔기 사이에 형성된다 (도 29B). Asp 잔기는 VEGFR2의 D4에서 발견되지만, -5 위치에서 Arg 대신에 이 Ig-유사 도메인은 Asp 잔기와 관련하여 -2 및 -6 위치에서 반대 전하를 갖는 한 쌍의 아미노산을 함유한다 (도 29B). D4 사이의 직접적인 접촉이 VEGFR2의 엑토도메인의 VEGF-A 유도된 이량체의 전자 현미경검사 (EM) 영상에서 관찰되었으나 (문헌 [Ruch et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 14(3):249-250 (2007)]), VEGFR2 D4의 기능은 확실하지 않은 상태로 남아있다. 따라서, D7은 EF 루프 영역에서의 VEGFR2의 D4보다 KIT 및 PDGFR의 D4에서의 상응하는 서열에 더 유사하다.

동형 D7 접촉은 리간드 유도된 VEGFR2 활성화에 필수적이다

이 서열 분석 및 KIT와의 비교는 VEGFR2의 잔기 R726 및 D731이 수용체간 염 브릿지 형성을 매개할 수 있고, 리간드에 대한 반응을 변경시킬 수 있다고 제안한다. 리간드 유도된 VEGFR2 활성화 및 신호 전달에서 D7 영역에 보존된 잔기의 역할을 조사하기 위해, Arg726, Asp731 또는 두 아미노산이 Ala 잔기에 의해 대체된 (R726A, D731A 및 RD2A) VEGFR2 돌연변이체를 생성하였다. HEK293 세포를 WT VEGFR2 또는 D7 돌연변이를 보유하는 VEGFR2의 발현을 지시하는 pCDNA3 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 동안 인큐베이션한 후에, 형질감염된 세포를 VEGF-A 자극 전에 밤새 고갈시켰다. VEGFR2의 티로신 자가인산화 및 자극되지 않거나 또는 VEGF-A 자극된 또는 자극되지 않은 세포의 MAPK 반응을 각각 항-포스포티로신 항체 (항-pTyr) 또는 항-포스포-MAPK 항체를 사용하여 분석하였다. 도 30A는 수용체간 염 브릿지 형성을 매개하는데 관여할 것으로 예상되는 Arg 또는 Glu 잔기의 돌연변이가 VEGF-A 유도된 VEGFR2 자가인산화 및 MAPK 자극을 주목할만하게 감소시켰다는 것을 보여준다.

VEGFR2의 상대적으로 약한 키나제 활성을 극복하기 위해, 키메라 수용체 접근법을 사용하였다 (문헌 [Fambrough et al., Cell, 97(6):727-741 (1999) 및 Meyer et al., J. Biol. Chem., 281(2):867-875 (2006)]). PDGFR의 막횡단 및 세포질 영역 (아미노산 528-1106)에 연결된 VEGFR2의 엑토도메인 (아미노산 1-761)으로 구성된 키메라 수용체를 제조하고, VEGF-A 유도된 VEGFR2 활성화에서 D7에 의해 수행되는 역할을 추가로 조사하기 위해 사용하였다. 키메라 VEGFR2/PDGFR 또는 D7 돌연변이를 보유하는 키메라 VEGFR2/PDGFR을 안정하게 발현하는 VEGF-A 자극된 또는 자극되지 않은 NIH-3T3 세포로부터의 용해물을 항-PDGFR 항체로 면역침전시킨 후에 항-pTyr 항체로 이뮤노블롯팅하였다. 도 30B는 VEGF-A 자극에 반응한 키메라 VEGFR2/PDGFR의 강건한 티로신 자가인산화를 입증한다 (도 30B, WT). 대조적으로, D7 돌연변이 (R726A, D731A, RD2A)를 보유하는 키메라 수용체의 VEGF-A 유도된 티로신 자가인산화는 강하게 절충되었다 (도 30B). PDGFR의 TM 및 세포내 영역에 융합된 VEGFR1의 세포외 영역으로 구성된 키메라 수용체를 또한 생성하였다. 야생형 키메라 수용체를 안정하게 발현하는 3T3 세포는 리간드 자극에 반응하여 자가인산화를 보였다 (도 30C, WT). 대조적으로, 키나제 활성의 리간드 유도된 자극은 각각 Arg720, Asp725 또는 두 아미노산 내의 돌연변이, R720A, D725A 및 RD2A를 보유하는, 키메라 수용체를 발현하는 3T3 세포에서 강하게 절충되었다 (도 30C). 이전 데이터는 유형-III 및 유형-V RTK의 막 근접 Ig-유사 도메인 사이의 동형 접촉이 리간드 유도된 수용체 활성화 및 세포 신호전달에 필수적이라는 것을 입증한다.

공유 교차 연결제를 사용하여 리간드 자극된 세포의 교차 연결에 이어 리간드 자극된 또는 자극되지 않은 세포로부터의 용해물의 SDS-PAGE 분석에 의해 리간드 유도된 수용체 이량체화에 대한 D7 돌연변이의 효과를 조사하였다 (예를 들어, 문헌 [Cochet et al., J. Biol. Chem., 263(7):3290-3295 (1988)] 참조). 이 실험은 키메라 수용체의 VEGF-A 유도된 이량체화가 D7 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증한다 (데이터는 나타내지 않음). PDGFR 및 KIT에 대한 이전의 보고와 유사하게 (문헌 [Yuzawa et al., Cell, 130(2):323-334 (2007) 및 Yang et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 105(220:7681-7686 (2008)]), D7 매개된 동형 접촉은 수용체 활성화에 필요하지만 수용체 이량체화에는 불필요하다. 또한, 리간드 유도된 수용체 이량체화는 티로신 자가인산화 및 수용체 활성화에 필요하지만 충분하지는 않다. 대조적으로, D392A 돌연변이 또는 두 Asp387 및 Arg391이 Ala 잔기에 의해 치환된 (DR2A) 돌연변이를 포함하는 VEGFR2의 D4 내의 돌연변이를 보유하는 키메라 수용체의 VEGF-A 유도된 티로신 자가인산화는 변화하지 않고 남아있었으며 (도 30D), 상이한 인터페이스가 VEGF-A 유도된 VEGFR2 엑토도메인 이량체의 EM 영상에서 보여진 D4 상호작용을 매개하는데 관여할 수 있다는 것을 입증한다 (문헌 [Ruch et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 14(3):249-250 (2007)]).

분석적 원심분리를 이용하여 단리된 D7 영역의 이량체화에 대한 해리 상수를 결정하였다. 4x10^-5, 8x10^-5 및 1.6x10^-4 M 단백질 농도를 사용하여 수행한 분석적 원심분리 실험은 단리된 D7이 10^-4 M만큼 높은 농도에서 용액 중에 단량체로 남아있다는 것을 보여주었으며, 이는 D7 이량체화의 해리 상수가 10^-4 M을 초과한다는 것을 나타낸다. 유사한 높은 해리 상수가 KIT 또는 PDGFR의 단리된 D4 또는 D5의 이량체화에서 발견되었다. SCF 또는 PDGF 유도된 이량체화 후에, 세포 막에서 2개의 이웃하는 KIT 또는 PDGFR 프로모터의 국부 농도가 4-6 x10^-4 M 범위라는 것은 이전에 밝혀졌다. 이는 감소된 차원수와 함께 세포 막에서 서로에 낮은 친화도로 결합하는 Ig-유사 도메인의 쌍들 사이의 효율적인 측면 상호작용 및 안정한 동형 접촉의 형성을 가능하게 한다. 또한, 유형-III 및 유형-V RTK에서 막 근접 Ig-유사 도메인 사이의 동형 접촉은 이웃하는 수용체의 TM 및 세포질 영역 사이에서 협력적인 방식으로 일어나는 추가의 측면 상호작용에 의해 지지된다.

VEGFR 세포외 도메인 D7의 구조

리간드 유도된 VEGFR2 활성화에서 D7에 의해 수행되는 역할을 기반으로 분자 기초를 결정하기 위해 이 Ig-유사 도메인의 결정 구조를 결정하였다. 결정은 28개 물 분자와 함께 비대칭 유닛 당 단일 D7 분자를 갖는 공간군 I2₁2₁2₁에서 수득하였다. D7 구조는 VEGFR2의 아미노산 667 내지 756으로 이루어지고, X선을 2.7Å 해상도로 회절시켰다. 구조는 텔로킨 (PDB 코드: 1TLK) (문헌 [Holden et al., J. Mol. Biol., 227(3):840-851 (1992)])의 구조에 기초한 모델을 사용하는 분자 대체법에 의해 결정하였다. 복합체에서 D7의 2개의 카피는 0.1Å의 r.m.s. 편차로 서로 매우 유사하다. D7은 하나는 가닥 A, B, D 및 E를 포함하고, 두번째는 가닥 A', G, F 및 C를 포함하는 2개의 4-가닥 시트에 의해 형성된 β-샌드위치로 이루어진 전형적인 IgSF 폴드인 것으로 추정된다. A 가닥의 첫번째 절반은 B 가닥과 수소 결합을 형성하고, A' 가닥은 G 가닥과 수소 결합을 형성하는데, 이는 수용체 티로신 키나제 MuSK에서의 세포외 영역으로부터의 Ig-유사 도메인 Ig1 및 Ig2의 구조와 유사하다 (문헌 [Stiegler et al., J. Mol. Biol., 364(3):424-433 (2006)]). 가닥 βE 및 βF 사이의 교차 연결은 잔기 729-731에서 단일 나선형 회전을 포함한다. VEGFR2의 D7은 βB의 Cys688 및 βF의 Cys737 사이의 보존된 디술피드 결합, 및 소수성 코어를 형성하기 위해 디술피드 결합에 대해 패킹된 시그너쳐 트립토판 잔기를 포함하는 IgSF 폴드의 여러 특성을 나타낸다. DALI (문헌 [Holm et al., Curr. Protoc. Bioinformatics, Chapter 5, Unit 5 5 (2006)])를 사용한 분자 비교는 VEGFR2의 Ig-유사 도메인 중에서, D7이 89개의 정렬된 Cβ 잔기에 대해 13.4의 Z-스코어 및 1.5Å의 r.m.s.d.로 텔로킨 (PDB 코드: 1TLK) (문헌 [Holden et al., J. Mol. Biol., 227(3):840-851 (1992)])과 가장 유사하다는 것을 보여준다. D7은 I-세트를 규정하는 V-프레임 프로파일에서 20개의 주요 위치 중 16개를 함유한다 (문헌 [Harpaz and Chothia, J. Mol. Biol., 238(4):528-539(1994)]). 추가의 노출된 교차-가닥 디술피드 결합은 βF (Cys740) 및 βG (Cys745)에 위치한 한 쌍의 Cys에 의해 형성된다. 이 특징은 VEGFR2 및 VEGFR3에서 고도로 보존되나, VEGFR1에서는 보존되지 않는다.

결정 구조는 동형 D7 접촉이 하나의 프로모터의 Arg726이 다른 것의 Asp731을 향하여 대략 360 A²의 매립된 표면적을 생성하는 각각의 프로모터의 D7의 ABED 가닥에 의해 형성되는 2개의 β 시트에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 도 31B는 Arg726 및 Asp731이 염 브릿지 및 반 데르 발스 접촉을 형성한다는 것을 보여준다. D7 이량체의 구조는 KIT 세포외 이량체 구조에서 보여진 동형 D4 접촉 (PDB 코드: 2E9W) (문헌 [Yuzawa et al., Cell, 130(2):323-334 (2007)])과 매우 유사하다. 또한, VEGFR2의 D7은 D7-D7 인터페이스를 따라 계속 양으로 대전된 중심 스트립을 제외하고는 전체적으로 음으로 대전된 표면을 갖는 정전기장의 강한 분극을 나타낸다 (도 31C). 강하게 대전된 인터페이스는 리간드 자극 전에 단량체 수용체 분자의 비정상적인 연합을 방지할 수 있다.

DALI (문헌 [Holm et al., Curr. Protoc. Bioinformatics, Chapter 5, Unit 5 5 (2006)])를 사용한 KIT의 D4의 구조와 VEGFR2의 D7의 구조의 비교는 83개의 정렬된 Cα 잔기에 대해 10.4의 Z-스코어 및 1.8Å의 r.m.s.d.로 주목할만한 유사성을 보였다. 2개의 구조에서 EF 루프의 위치는 거의 동일하고, C-말단 사이의 거리는 D4 및 D7 이량체 구조 둘 다의 경우 대략 15Å이다 (도 33). 구조 및 기능 둘 다에서 VEGFR D7 및 KIT D4 사이의 높은 유사성은 RTK 활성화에 대한 잘 보존된 메커니즘을 제안하고, 유형 III 및 유형 V RTK의 공통적인 조상 기원에 대한 추가의 증거를 제공한다. 흥미롭게는, 드로소필라(Drosophila) (문헌 [Cho et al., Cell, 108(6):865-876 (2002)]), 씨. 엘레간스(C. elegans) (문헌 [Plowman et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 96(24):13603-13610 (1999)]), 멍게 (문헌 [Satou et al., Dev. Genes Evol., 213(5-6):254-263 (2003)]) 및 성게 (문헌 [Duloquin et al., Development, 134(12):2293-2302 (2007)]) 게놈은 그의 세포외 영역에 7개의 Ig-유사 도메인을 함유하는 VEGFR/PDGFR 유사 RTK의 단일 패밀리를 함유한다. 유형-III 및 유형-V RTK 유전자는 척추동물에서 기능적으로 구분되지만, 염색체 상에서 서로 인접하여 위치한다 (문헌 [Shibuya, Biol. Chem., 383(10):1573-1579 (2002) 및 Grassot et al., Mol. Biol. Evol., 23(6):1232-1241 (2006)]). 인간에서, 클래스 III 및 클래스 V RTK에 대한 유전자는 염색체 4q12 (KIT, PDGFRα 및 VEGFR2), 5q33 (FMS, PDGFRβ 및 VEGFR3) 및 13q12 (FLT3 및 VEGFR1) 상의 3개의 클러스터에서 발견되었다. 클래스 III 및 클래스 V RTK의 계통발생은 이들 8개의 RTK가 2 라운드의 시스 복제 및 2 라운드의 트랜스 복제에 의해 생성된다고 제안한다 (문헌 [Grassot et al., Mol. Biol. Evol., 23(6):1232-1241 (2006)]). EF-루프 영역에서 고도로 보존된 모티프는 또한 씨. 엘레간스의 2개의 VEGFR/PDGFR 유사 수용체 유전자인 VER3 및 VER4의 D7에서 확인된다. 유사한 모티프가 성게의 VEGFR/PDGFR 유사 수용체의 D7에서 발견되었으나, 드로소필라의 VEGFR/PDGFR 유사 수용체에서 발견되지 않았다. 흥미롭게도, 멍게의 VEGFR/PDGFR 유사 수용체의 10개의 Ig-유사 도메인 중 3개는 전형적인 EF-루프 모티프를 함유한다. VEGFR/PDGFR 유사 멍게 수용체의 D3, D6 및 D9 사이의 동형 접촉은 그의 세포외 영역에 10개의 Ig-유사 도메인을 함유하는 RTK의 리간드 유도된 활성화에 필요할 수 있다.

본 실시예에 제시된 실험은 유형-III 및 유형-V RTK가 막 근접 Ig-유사 도메인에 의해 매개되는 동형 접촉이 2개의 수용체 단량체의 TM 및 세포질 영역이 효율적인 트랜스-자가인산화, 키나제 활성화 및 세포 신호전달을 가능하게 하는 밀접한 접근성 및 정확한 배향을 갖도록 하는 통상적인 메커니즘에 의해 활성화된다는 것을 입증한다. 막 근접 Ig-유사 도메인 사이의 여러 저친화도 동형 연합과 함께 리간드 유도된 수용체 이량체화의 접합은 리간드 유도된 막횡단 신호전달을 위한 간단하지만 효율적인 메커니즘을 제공한다. 또한, 서로를 향한 개별 Ig-유사 도메인의 낮은 결합 친화도는 리간드 부착 전에 수용체 단량체의 부수적인 수용체 활성화를 방지한다. 동형 접촉 영역은 병적 RTK 활성화 및 세포 신호전달의 약리학적 개입을 위한 이상적인 표적을 제공한다.

VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3의 D7 영역의 인접한 에피토프

구조-기반 서열 정렬을 수행하였다. 이 정렬은 본 발명의 모이어티에 의해 인식될 수 있는 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3 D7 영역 상의 잠재적인 인접한 에피토프를 나타내었다 (표 8). 에피토프는 가닥 B, D, E, A'B 루프, CD 루프, DE 루프 및 EF 루프에 위치한다. 이들 에피토프는 동형 D7 접촉을 매개하는 인터페이스에 위치한다.

실시예 28을 위한 물질 및 방법

1. 단백질 발현, 정제 및 결정화

N-말단 6xHis-태그를 함유하는 VEGFR2의 D7 (아미노산 657-765)을 PET28a 벡터를 사용하여 이. 콜라이에서 발현시켰다. 봉입체를 수집하고, 6M 구아니딘 히드로클로라이드 (pH8.0)에서 가용화시켰다. 10mM 트리스 (pH8.0), 2mM 환원된 글루타티온 및 0.2mM 산화된 글루타티온을 함유하는 재폴딩 완충제에 단백질을 80-100μg/ml의 최종 단백질 농도로 적가 희석하여 D7을 재폴딩시켰다. 재폴딩을 교반하면서 48시간 동안 4℃에서 수행하였다. 재폴딩 용액을 0.45μm 여과 장치를 사용하는 여과에 의해 정화하고, FastQ 세파로스 칼럼에 이어 크기 배제 (S200, 지이 헬스케어) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (모노 큐, 지이 헬스케어)에 의해 정제하였다. N-말단 6xHis 태그를 트롬빈 소화에 의해 제거하였다. D7 단백질을 25mM 트리스 (pH 8.0) 및 200mM NaCl을 함유하는 완충제에서 15mg/ml로 농축하고, 결정화 및 최적화를 위해 광범위하게 스크리닝하였다 (햄턴 리서치(Hampton research), 결정 스크리닝). 대략적인 치수가 300 x 75 x 20 μM인 엑토도메인 D7의 결정을 0.2M 숙신산 및 16% PEG3350 중에서 4℃에서 성장시켰다. 모든 결정을 5-18% 글리세롤이 보충된 저장 용액에 몇 초 동안 침지시키고, 급속 냉각시키고, 데이터 수집 동안 100K에서 질소 기체의 스트림 중에 유지시켰다. 결정은 비대칭 유닛 당 하나의 분자를 갖는 단위 셀 치수가 a=39.476Å, b=76.991Å, 및 c=102.034Å인 I2₁2₁2₁ 공간군에 속한다. 회절 데이터는 NSLS, 부룩하벤 내셔널 래보러토리의 X29A 빔라인에서 ADSD 양자-210 CCD 검출기를 사용하여 2.7Å의 해상도로 수집하였다. 모든 데이터 세트는 HKL2000 프로그램 패키지를 사용하여 처리 및 스케일링하였다 (문헌 [Otwinowski and Minor, Methods in Enzymology, 276(part A):307-326 (1997)]). 데이터 수집 통계치는 표 7에 요약된다. 구조는 검색 모델로서 MUSK로부터의 Ig 도메인 (2IEP) (문헌 [Stiegler et al., J. Mol. Biol., 364(3):424-433 (2006)]), 텔로킨 (1TLK) (문헌 [Holden et al., J. Mol. Biol., 227(3):840-851 (1992)]) 및 KIT의 D4 (2E9W) (문헌 [Yuzawa et al., Cell, 130(2):323-344 (2007)])의 구조에 기초한 모델을 사용하는 Phaser로의 분자 대체법에 의해 풀었다. 구조를 22.7%의 결정학적 R-인자 및 27.7%의 자유 R-인자를 사용하여 2.7Å 해상도로 정교화하였다 (표 7). VEGFR2 D7의 원자 좌표는 단백질 데이터 뱅크에 승인 코드 XXX로 기탁하였다. 분자 영상은 Pymol 및 CCP4MG 소프트웨어를 사용하여 생성하였다 (문헌 [Potterton et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 60 (Pt. 12 Pt. 1):2288-2294 (2004)]).

2. 아미노산 서열 정렬

D7의 아미노산 서열 정렬을 ClustalW (문헌 [Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22(220:4673-4680 (1994)))를 사용하여 수행한 후에, 20개의 중요 잔기에 대한 I-세트 IgSF 폴드 제지에 기초하여 수동적으로 조정하였다. 인간 VEGFR의 아미노산 서열을 PSI-BLAST를 사용하여 상동성 서열에 대한 비-중복성 데이타베이스 (nr)를 검색하기 위한 검색어로 사용하였다 (문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215(3):403-410 (1990)]). 아미노산 서열의 정렬 뿐만 아니라 D7 PDB 파일을 Consurf 3.0 서버 (문헌 [Landau et al., Nucleic Acids Res., 33 (Web Server Issue), W299-302 (2005)])에 입력하여 낮은 비율의 디버전스가 높은 서열 보존에 상응하는 각각의 정렬의 위치에 대한 최대-가능성 정규화된 진화율을 생성하였다. Consurf 출력에서와 같이, 연속적인 9개 보존 스코어를 시각화를 위해 빈 9가 최대 보존된 (고동색) 위치를 함유하고 빈 1이 최대 가변 (시안색) 위치를 함유하도록 9개 빈의 별도의 스케일로 분할하였다.

3. VEGFR 발현 벡터 및 키메라 수용체의 생성

인간 VEGFR1 및 VEGFR2의 cDNA는 친절하게 마사부미 시부야(Masabumi Shibuya) 박사에게 제공받았다 (문헌 [Sawano et al., Blood, 97(3):785-791 (2001)]). VEGFR2 cDNA를 PCR에 의해 pcDAN3 발현 벡터로 서브클로닝하고, XhoI/XbaI 부위로 삽입하였다. VEGFR1 또는 VEGFR2의 세포외 영역으로 구성된 키메라 수용체를 PDGFR-β의 막횡단 및 세포질 영역에 융합시켰다. 플래그-태그를 C-말단에 부가하고, 키메라 수용체를 pLXSHD 레트로바이러스 발현 벡터의 EcoRI/ XhoI 부위로 클로닝하였다.

4. 세포주 및 발현 벡터

VEGFR1/2-PDGFR 키메라 수용체를 안정하게 발현하는 3T3 세포주를 이전에 기재된 바와 같이 레트로바이러스 감염에 의해 생성하였다 (문헌 [Yuzawa et al., 2007 및 Cochet et al., 1988]). 세포를 L-히스티디놀로 선택하고, 유사한 발현 수준에 매치된 풀을 실험에 사용하였다.

HEK293 세포를 1 μg의 DNA로 일시적으로 형질감염시키고, VEGF 자극 전에 밤새 혈청 고갈시켰다. 세포를 200 ng/ml VEGF로 처리하고, 세포 용해물을 VEGFR1 또는 VEGFR2에 대한 항체로 면역침전시킨 후에 항-pTyr 항체 (PY20, 산타 크루즈)로 이뮤노블롯팅하였다. 전체 세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 각각 항-포스포MAPK, 및 항-MAPK 항체 (셀 시그널링)로 이뮤노블롯팅하였다.

VEGF를 이전에 기재된 바와 같이 바큘로바이러스 발현 벡터 pFastBac1을 사용하여 sf9 세포에서 생성하였다 (문헌 [Cohen et al., Growth Factors, 7(2):131-138 (1992)]). VEGF를 쿠마시 블루 염색된 SDS PAGE 실험에 의해 헤파린 세파로스 비드를 사용하여 >80% 순도로 정제하였다.

5. 분석적 초원심분리

침강 속도 실험은 거대분자 어셈블리의 분석적 초원심분리를 위한 센터 (텍사스 대학 보건 과학 센터, 생화학 부서, 텍사스주 산 안토니오)에서 베크만 옵티마(Beckman Optima) XL-I로 수행하였다. 25 mM 트리스 (pH 8) 및 100 mM NaCl을 함유하는 완충제 중 4x10^-5 M, 8x10^-5 M, 및 1.6x10^-4 M 농도의 D7 단백질을 20℃에서 50,000 rpm으로 원심분리하였다. 속도 데이터를 몬테 카를로(Monte Carlo) 분석과 함께 2차원 스펙트럼 분석으로 분석하였다.

등가물

당업자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 또는 더 이상의 통상적인 실험을 이용하지 않고 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Yale University <120> INHIBITORS OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTORS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 117950-00620 <140> New Application <141> 2010-12-20 <150> US 61/290789 <151> 2009-12-29 <160> 159 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of ArtificialSequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Glu, Arg or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Arg or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Glu or Ala <400> 1 Ile Xaa Arg Val Xaa Xaa Glu Asp Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Glu Val Val Asp Lys Gly Phe Ile Asn 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ala Ser Tyr Leu 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Synthetic peptide <400> 16 Ala Phe Pro Lys Pro 1 5 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Asn Ser Asp Val 1 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Ala Phe Pro Lys Pro Asn Ser Asp Val 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Glu Ser Asn Ile Arg 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ala Phe Pro Lys Pro Glu Ser Asn Ile Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Asp Lys Trp Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Glu 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Ile 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Leu Leu Glu Val Phe Glu Phe Ile 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Arg Val Lys Gly Phe Pro Asp 1 5 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Lys Ala Ser Asn Glu Ser 1 5 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Lys Ala Glu Ser 1 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Gly Thr Thr Lys Glu Lys 1 5 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Tyr Phe Gly Lys Leu 1 5 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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musculus <400> 113 Pro Ser Pro Pro Ser Ile His Pro Ala Gln Ser Glu Leu Ile Val Glu 1 5 10 15 Ala Gly Asp Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Asp Pro Asp Phe Val Arg 20 25 30 Trp Thr Phe Lys Thr Tyr Phe Asn Glu Met Val Glu Asn Lys Lys Asn 35 40 45 Glu Trp Ile Gln Glu Lys Ala Glu Ala Thr Arg Thr Gly Thr Tyr Thr 50 55 60 Cys Ser Asn Ser Asn Gly Leu Thr Ser Ser Ile Tyr Val Phe Val Arg 65 70 75 80 <210> 114 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys 1 5 10 15 Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu 20 25 30 Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser 35 40 45 Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr 50 55 60 Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 His Leu Tyr Val Lys 85 <210> 115 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu 1 5 10 15 Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg 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Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile 50 55 60 Ser Glu Gly Leu Ser Asn 65 70 <210> 141 <211> 70 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141 Ile Cys Gly Asn Pro Val Thr Asp Asn Val Lys Asp Ile Thr Lys Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Leu Pro Asn Asp Tyr Met Ile Thr Leu Asn Tyr Val Ala 20 25 30 Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Leu Arg Asp Met Val Ile 35 40 45 Gln Leu Ser Leu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile 50 55 60 Ser Glu Gly Leu Ser Asn 65 70 <210> 142 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu Gln Ser Leu Gln Arg 1 5 10 15 Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln Ile Thr Phe Glu Phe 20 25 30 Val Asp Gln Glu Gln Leu Ala Asp Pro Val Cys Tyr Leu Lys Lys Ala 35 40 45 Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr Met Arg Phe Arg Asp 50 55 60 Asn Thr Pro Asn 65 <210> 143 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp 20 25 30 Asp Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp 35 40 45 Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met 50 55 60 <210> 144 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu 1 5 10 15 Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser 20 25 30 Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Cys Val Val Ser 65 <210> 145 <211> 69 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 145 Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Gly Lys Ile Val Asp Asp Leu Val Leu 1 5 10 15 Cys Met Glu Glu Asn Ala Pro Lys Asn Ile Lys Glu Ser Pro Lys Arg 20 25 30 Pro Glu Thr Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Ser Ile Phe Asn 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Met Val Ala Ser Asp Thr Ser 50 55 60 Asp Cys Val Leu Ser 65 <210> 146 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser 1 5 10 15 Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Ala Ala Cys Val Arg Thr 20 25 30 Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe 35 40 45 Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Ala Asn Ile Phe Ser Lys 50 55 60 Asn Cys Asn Asn Ser 65 <210> 147 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys 1 5 10 15 Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn 20 25 30 Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys 35 40 45 Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys 50 55 60 Gln 65 <210> 148 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val 1 5 10 15 Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro 20 25 30 Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu Lys Ile Gln Glu Thr Arg Tyr 50 55 60 Gln Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly His 65 70 75 80 Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe 85 90 95 Glu Leu Leu Thr Gln 100 <210> 149 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 149 Lys Gly Phe Val Glu Ile Glu Pro Thr Phe Gly Gln Leu Glu Ala Val 1 5 10 15 Asn Leu His Glu Val Arg Glu Phe Val Val Glu Val Gln Ala Tyr Pro 20 25 30 Thr Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asp Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Gln Lys Ser Gln Glu Thr Arg Tyr 50 55 60 Gln Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly His 65 70 75 80 Tyr Thr Ile Ile Val Gln Asn Glu Asp Asp Val Lys Ser Tyr Thr Phe 85 90 95 Glu Leu Ser Thr Leu 100 <210> 150 <211> 101 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 150 His Gly Phe Ile His Leu Glu Pro Gln Phe Ser Pro Leu Glu Ala Val 1 5 10 15 Asn Leu His Glu Val Lys Asn Phe Val Val Asp Val Gln Ala Tyr Pro 20 25 30 Ala Pro Lys Met Tyr Trp Leu Lys Asp Asn Val Thr Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Leu Thr Glu Ile Val Thr Ser Ser Asn Arg Val Gln Glu Thr Arg Phe 50 55 60 Gln Ser Val Leu Lys Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly Thr 65 70 75 80 Ile Leu Trp Leu Leu Lys Asn Glu Asp Glu Ile Lys Arg Tyr Thr Phe 85 90 95 Ser Leu Leu Ile Gln 100 <210> 151 <211> 101 <212> PRT <213> Rana sp. <400> 151 Lys Gly Phe Ile Asp Leu Glu Pro Met Phe Gly Ser Glu Glu Phe Ala 1 5 10 15 Asn Leu His Glu Val Lys Ser Phe Ile Val Asn Leu His Ala Tyr Pro 20 25 30 Thr Pro Gly Leu Phe Trp Leu Lys Asp Asn Arg Thr Leu Ser Glu Asn 35 40 45 Leu Thr Glu Ile Thr Thr Ser Ile Val Thr Thr Lys Glu Thr Arg Phe 50 55 60 Gln Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Thr Leu Val Ala Gln Asn Asp Arg Glu Thr Lys Ser Tyr Ser Phe 85 90 95 Ile Leu Gln Ile Lys 100 <210> 152 <211> 101 <212> PRT <213> Takifugu rubripes <400> 152 Ser Glu Phe Met Ser Ile Gln Pro Lys Phe Gly Glu Tyr Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Leu Asp Glu Val Cys Glu Phe Arg Ala Glu Ile Thr Ser Phe Pro 20 25 30 Thr Ala Ser Val Thr Trp Phe Lys Asp Ser Val Pro Leu Ser Asn Val 35 40 45 Thr Ala Glu Ile Ser Thr Ser Leu Gln Lys Leu Ser Glu Thr Ser Tyr 50 55 60 Met Ser Val Leu Thr Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Asp Ser Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Met Arg Val Lys Asn Gly Asp Gln Ser Arg Thr Val Ser Leu 85 90 95 Ile Leu Glu Val Lys 100 <210> 153 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala 1 5 10 15 Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro 20 25 30 Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser 35 40 45 Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg 50 55 60 Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly 65 70 75 80 His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His Glu Asp Ala Glu Val Gln Leu Ser 85 90 95 Phe Gln Leu Gln Ile Asn 100 <210> 154 <211> 102 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 154 Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly Glu Leu Asp Ala Val Gln Phe Ala 1 5 10 15 Glu Leu His Arg Ser Arg Ala Leu Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro 20 25 30 Pro Pro Thr Val Val Trp Phe Lys Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser 35 40 45 Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg 50 55 60 Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Thr Met Arg Ala Phe His Glu Asp Ala Glu Ala Gln Leu Ser 85 90 95 Phe Gln Leu Gln Val Asn 100 <210> 155 <211> 102 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 155 Asn Gly Tyr Val Arg Leu Leu Glu Thr Leu Gly Asp Val Glu Ile Ala 1 5 10 15 Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu Arg Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro 20 25 30 Met Pro Ser Val Leu Trp Leu Lys Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Glu Leu Val Leu Ser Thr Arg Asn Met Ser Glu Thr Arg 50 55 60 Tyr Val Ser Glu Leu Ile Leu Val Arg Val Lys Val Ser Glu Ala Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Thr Met Arg Ala Phe His Glu Asp Asp Glu Val Gln Leu Ser 85 90 95 Phe Lys Leu Gln Val Asn 100 <210> 156 <211> 98 <212> PRT <213> Takifugu rubripes <400> 156 Arg Gly Phe Val Ala Val Lys Ser Thr Arg Lys Gln Asn Ile Thr Ala 1 5 10 15 Glu Leu Gln Glu Asn Val Glu Leu Arg Val Glu Ile Glu Ala Tyr Pro 20 25 30 Pro Pro Gln Ile Arg Trp Lys Lys Asp Gly Ala Pro Val Arg Gly Asp 35 40 45 Lys Thr Ile Ile Ile Arg Gln Glu His Glu Ile Arg Tyr Val Thr Ile 50 55 60 Leu Thr Leu Val Arg Val Arg Thr Glu Gln Lys Gly Leu Tyr Thr Ala 65 70 75 80 Leu Ile Thr Asn Glu Asp Asp Val Lys Glu Val Thr Phe Ala Leu Glu 85 90 95 Val Gln <210> 157 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Lys Gly Phe Ile Asn Ile Phe Pro Met Ile Asn Thr Thr Val Phe Val 1 5 10 15 Asn Asp Gly Glu Asn Val Asp Leu Ile Val Glu Tyr Glu Ala Phe Pro 20 25 30 Lys Pro Glu His Gln Gln Trp Ile Tyr Met Asn Arg Thr Phe Thr Asp 35 40 45 Lys Trp Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Asn Glu Ser Asn Ile Arg Tyr 50 55 60 Val Ser Glu Leu His Leu Thr Arg Leu Lys Gly Thr Glu Gly Gly Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Phe Leu Val Ser Asn Ser Asp Val Asn Ala Ala Ile Ala Phe 85 90 95 Asn Val Tyr Val Asn 100 <210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any Amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Any Amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Any amino acid <400> 158 Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Arg, Gln, Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Arg, Lys or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Lys, Glu, Gln or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Glu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Glu, Gly, Ser or Gln <400> 159 Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10

Claims (74)

1. 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGF 수용체)의 엑토도메인에 결합하여 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 모이어티.
2. 제1항에 있어서, 인간 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인에 결합하는 모이어티.
3. 제2항에 있어서, 상기 Ig-유사 도메인이 리간드의 VEGF 수용체에의 결합에 관여하지 않는 것인 모이어티.
4. 제2항에 있어서, 상기 Ig-유사 도메인이 리간드의 VEGF 수용체에의 결합에 관여하는 것인 모이어티.
5. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 및 VEGF 수용체에 대한 리간드 사이의 상호작용을 차단하지 않는 모이어티.
6. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 및 VEGF 수용체에 대한 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 모이어티.
7. 제1항에 있어서, VEGF 수용체의 이량체화를 방지하지 않는 모이어티.
8. 제1항에 있어서, VEGF 수용체의 이량체화를 방지하는 모이어티.
9. 제1항에 있어서, VEGF 수용체의 각각의 프로모터로부터의 엑토도메인의 막 근접 영역 사이의 상호작용을 방지하는 모이어티.
10. 제9항에 있어서, 상기 상호작용이 동형인 모이어티.
11. 제9항에 있어서, 상기 상호작용이 이형인 모이어티.
12. 제9항에 있어서, 상기 엑토도메인의 막 근접 영역이 VEGF 수용체의 제7 Ig-유사 도메인 (D7)인 모이어티.
13. 제12항에 있어서, VEGF 수용체의 D7 도메인에 대한 하기 컨센서스 서열:
    L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158) (여기서, L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산임)
    에 결합하는 모이어티.
14. 제13항에 있어서, Φ가 발린이고; X₁이 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂가 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃이 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄가 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅가 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 (서열 159)인 모이어티.
15. 제9항에 있어서, VEGF 수용체의 각각의 프로모터로부터의 엑토도메인의 막 근접 영역을 16Å 초과의 거리로 분리시키는 모이어티.
16. 제1항에 있어서, 상기 VEGF 수용체가 VEGFR1인 모이어티.
17. 제1항에 있어서, 상기 VEGF 수용체가 VEGFR2인 모이어티.
18. 제1항에 있어서, 상기 VEGF 수용체가 VEGFR3인 모이어티.
19. 제1항에 있어서, VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키는 모이어티.
20. 제1항에 있어서, VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726에 결합하는 모이어티.
21. 제1항에 있어서, VEGFR2의 아미노산 잔기 Asp731에 결합하는 모이어티.
22. 제1항에 있어서, VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726 및 Asp731에 결합하는 모이어티.
23. 제1항에 있어서, VEGFR2의 아미노산 잔기 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732 및 733으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는 모이어티.
24. 제1항에 있어서, VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720에 결합하는 모이어티.
25. 제1항에 있어서, VEGFR1의 아미노산 잔기 Asp725에 결합하는 모이어티.
26. 제1항에 있어서, VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720 및 Asp725에 결합하는 모이어티.
27. 제1항에 있어서, VEGFR1의 아미노산 잔기 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726 및 727로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는 모이어티.
28. 제1항에 있어서, VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737에 결합하는 모이어티.
29. 제1항에 있어서, VEGFR3의 아미노산 잔기 Asp742에 결합하는 모이어티.
30. 제1항에 있어서, VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합하는 모이어티.
31. 제1항에 있어서, VEGFR3의 아미노산 잔기 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743 및 744로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는 모이어티.
32. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 상의 입체형태적 에피토프에 결합하는 모이어티.
33. 제32항에 있어서, 상기 입체형태적 에피토프가 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된 것인 모이어티.
34. 제32항에 있어서, 상기 입체형태적 에피토프가 아미노산 잔기 Arg726 및 Asp731; Arg 720 및 Asp 725; 또는 Arg737 및 Asp742를 포함하는 것인 모이어티.
35. 제1항에 있어서, VEGF 수용체의 리간드 유도된 티로신 자가인산화를 차단하는 모이어티.
36. 제1항에 있어서, VEGF 수용체의 리간드 유도된 내재화를 차단하는 모이어티.
37. 제1항에 있어서, VEGF 수용체 상의 인접한 에피토프에 결합하는 모이어티.
38. 제37항에 있어서, 상기 인접한 에피토프가 VEGF 수용체의 D7 도메인 내의 2개 이상의 잔기로 구성된 것인 모이어티.
39. 제38항에 있어서, 상기 인접한 에피토프가 VEGFR1의 ⁶⁷²VAISSS⁶⁷⁷, VEGFR1의 ⁶⁷⁸TTLDCHA⁶⁸⁴, VEGFR1의 ⁶⁸⁵NGVPEPQ⁶⁹¹, VEGFR1의 ⁷⁰⁰KIQQEPG⁷⁰⁶, VEGFR1의 ⁷⁰⁷IILG⁷¹⁰, VEGFR1의 ⁷¹¹PGS⁷¹³, VEGFR1의 ⁷¹⁴STLFI⁷¹⁸, VEGFR1의 ⁷¹⁹ERVTEEDEGV⁷²⁸, VEGFR3의 ⁶⁸⁹VNVSDS⁶⁹⁴, VEGFR3의 ⁶⁹⁵LEMQCLV⁷⁰¹, VEGFR3의 ⁷⁰²AGAHAPS⁷⁰⁸, VEGFR3의 ⁷¹⁷LLEEKSG⁷²³, VEGFR3의 ⁷²⁴VDLA⁷²⁷, VEGFR3의 ⁷²⁸DSN⁷³⁰, VEGFR3의 ⁷³¹QKLSI⁷³⁵, 및 VEGFR3의 ⁷³⁶QRVREEDAGR⁷⁴⁵, VEGFR2의 ⁶⁷⁸TSIGES⁶⁸³, VEGFR2의 ⁶⁸⁴IEVSCTA⁶⁹⁰, VEGFR2의 ⁶⁹¹SGNPPPQ⁶⁹⁷, VEGFR2의 ⁷⁰⁶TLVEDSG⁷¹², VEGFR2의 ⁷¹³IVLK⁷¹⁶, VEGFR2의 ⁷¹⁷DGN⁷¹⁹, VEGFR2의 ⁷²⁰RNLTI⁷²⁴ 및 VEGFR2의 ⁷²⁵RRVKEDEGL⁷³⁴로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프인 모이어티.
40. 제1항에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분인 모이어티.
41. 제40항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 키메라 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 모이어티.
42. 제41항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 모이어티.
43. 제42항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 IgG1인 모이어티.
44. 제40항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 쇄 Fv 단편, SMIP, 아피바디, 아비머, 나노바디 및 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 모이어티.
45. 제40항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 수용체 티로신 키나제의 Ig-유사 도메인에 1 x 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10^-9 M 이하로 이루어진 군으로부터 선택된 KD로 결합하는 것인 모이어티.
46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 생성하는 하이브리도마.
47. 제1항에 있어서, 소분자인 모이어티.
48. 제47항에 있어서, VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726, VEGFR2의 Asp731, VEGFR1의 Arg720, VEGFR1의 Asp725, VEGFR3의 Arg737 및 VEGFR3의 Asp742로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하는 모이어티.
49. 제1항에 있어서, 펩티드성 분자인 모이어티.
50. 제49항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인을 기반으로 하여 설계된 것인 모이어티.
51. 제50항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 인간 VEGF 수용체의 D7 도메인을 기반으로 하여 설계된 것인 모이어티.
52. 제51항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 하기 구조:
    L/I X₁ R Φ X₂ X₃ X₄ D/E X₅ G (서열 158) (여기서, L은 류신이고, I는 이소류신이고, R은 아르기닌이고, Φ는 소수성 아미노산이고, D는 아스파르트산이고, E는 글루탐산이고, G는 글리신이고; X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 임의의 아미노산임)
    를 포함하는 것인 모이어티.
53. 제52항에 있어서, Φ가 발린이고; X₁이 아르기닌, 글루타민, 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₂가 아르기닌, 리신 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃이 리신, 글루탐산, 글루타민 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₄가 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₅가 글루탐산, 글리신, 세린 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 (서열 159)인 모이어티.
54. 제50항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 인간 VEGFR2의 아미노산 잔기 724-733과 적어도 80% 동일한 구조를 포함하는 것인 모이어티.
55. 제50항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 인간 VEGFR1의 아미노산 잔기 718-727과 적어도 80% 동일한 구조를 포함하는 것인 모이어티.
56. 제50항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 인간 VEGFR3의 아미노산 잔기 735-744와 적어도 80% 동일한 구조를 포함하는 것인 모이어티.
57. 제50항에 있어서, 상기 펩티드성 분자가 적어도 하나의 D-아미노산 잔기를 포함하는 것인 모이어티.
58. 제1항에 있어서, 애드넥틴인 모이어티.
59. 인간 VEGF 수용체의 제7 Ig-유사 도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 VEGFR2의 잔기 Arg726 및 Asp731; VEGFR1의 잔기 Arg720 및 Asp725; 또는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742를 포함하는 것인 모이어티.
60. VEGFR2의 아미노산 잔기 Arg726 및 Asp731; VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720 및 Asp725; 또는 VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 모이어티.
61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 모이어티 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
62. 대상체에서 VEGF 수용체 티로신 키나제 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 유효량의 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 모이어티의 용도.
63. 제62항에 있어서, 상기 VEGF 수용체 티로신 키나제 관련 질환이 암, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 당뇨병성 망막병증, 림프 질환 및 통증 관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
64. 제63항에 있어서, 암이 GIST, AML, SCLC, 신암, 결장암, 림프암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
65. VEGF 수용체를 후보 모이어티와 접촉시키는 것;
    상기 VEGF 수용체를 VEGF 수용체에 대한 리간드와 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 것; 및
    상기 모이어티가 리간드 유도된 이량체 VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인 사이의 배치, 배향 및/또는 거리에 영향을 미치는지 여부를 결정하여, VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인에 결합하는 모이어티를 확인하는 것
    을 포함하는, VEGF 수용체의 Ig-유사 도메인에 결합하는 모이어티를 확인하는 방법.
66. 제65항에 있어서, 모이어티가 VEGF 수용체의 엑토도메인을 불활성 상태로 고정시키는 것인 방법.
67. 제65항에 있어서, 모이어티가 VEGF 수용체의 제7 Ig-유사 도메인 (D7)에 결합하는 것인 방법.
68. 인간 VEGF 수용체의 제7 Ig-유사 도메인 상의 입체형태적 에피토프에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 VEGFR2의 잔기 Arg726 및 Asp731; VEGFR1의 잔기 Arg720 및 Asp725; 또는 VEGFR3의 잔기 Arg737 및 Asp742를 포함하는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
69. VEGFR2의 아미노산 잔기 724-733에 결합하여 VEGFR2의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
70. VEGFR1의 아미노산 잔기 Arg720 및 Asp725에 결합하여 VEGFR1의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
71. VEGFR3의 아미노산 잔기 Arg737 및 Asp742에 결합하여 VEGFR3의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
72. 인간 VEGF 수용체의 Arg726 및 Asp731로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
73. 인간 VEGF 수용체의 Arg720 및 Asp725로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
74. 인간 VEGF 수용체의 Arg737 및 Asp742로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 중 적어도 하나에 결합하여 인간 VEGF 수용체의 활성을 길항하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.

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