KR20120113374A

KR20120113374A - Ｃａ／Ｐ 몰비율 조절을 통한 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR20120113374A
Application number: KR1020110031052A
Authority: KR
Inventors: 윤석영; 박홍채; 김태완; 김동현; 박영민
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-05
Filing date: 2011-04-05
Publication date: 2012-10-15

Abstract

출발물질로 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를 사용하여 공침물을 합성하는 단계; Ca/P 몰 비율을 맞추기 위해 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를정량하여 각각의 수용액으로 형성하는 단계; 탈이온 증류수(distilled water)에 Ca(NO₃)₂4H₂O 수용액을 첨가한 후 (NH₄)₂HPO₄ 수용액을 천천히 첨가하는 단계; 상기 첨가물을 교반시키며, 현탁액을 완전히 용해시킨 후 암모니아를 첨가하여 수용액의 pH를 9.9 내지 10.1로 조절하여 공침시키는 단계; 및 상기 수용액을 건조하고 800 내지 950℃에서 1 내지 3시간 동안 하소처리하는 단계;를 포함하는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말의 제조방법을 개시한다. 본 발명의 제조방법에 따르면, 동일한 하소처리 온도를 설정하여 다양한 조성의 이상인산칼슘 분말을 제조할 수 있고, 이러한 분말의 조성비를 찾아낼 수 있고, 출발물질로부터 화학양론적으로 예측이 가능하다.

Description

Ｃａ／Ｐ 몰비율 조절을 통한 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 조성물의 제조방법{The method of preparing Ca/P mole ratio control of bone graft bioactive biphasic calcium phosphate compositions}

본 발명은 Ca/P 비율 조절을 통한 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HAp의 안정성과 β-TCP의 높은 용해율을 적절히 혼합하여 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절한 이상인산칼슘(Biphasic Calcium Phosphate; BCP)이 골이식 재료로서 장점을 지닌 수산화인회석 (Hydrowyapatite; HAp)과 β-삼인산칼슘 (Tricalcium phosphate; β-TCP)이 혼재된 이상인산칼슘 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

뼈의 결함 및 손상을 복원하기 위해서 인산칼슘 계열의 세라믹 재료들 중 수산화인회석(Hydrowyapatite; HAp)과 β-삼인산칼슘 (Tricalcium phosphate; β-TCP)은 생체적합성과 인체 골조직과의 화학적, 물리적인 유사성으로 인하여 많은 연구가 이루어져 왔으나, 치밀한 HAp는 생체 내에서 용해율이 낮아 숙주 결합 조직 내에서 면역반응 없는 이물질로서 작용하여 신생골 형성을 위한 지지체로 기능을 하지 못하고, β-TCP는 체액과 여러 용액에서 쉽게 흡수되어 골성장을 위한 골격을 예견성 있게 제공할 수 없어, 순수한 HAp나 β-TCP의 사용은 임상적으로 한계가 있었다.

골 결손이 생겼을 때 가장 좋은 치료방법은 자가골(autograft bone)을 이용하는 것으로 특히 장골의 뼈를 일부 채취하여 수술하는 방식이다. 척추융합 수술 과정에서는 자가골을 이용하는 방법을 많이 사용하고 있으며 미국에서도 계속 증가하는 추세이다. 자가골은 골전도성과 골유도성을 모두 갖추었고 이에 골세포까지 포함되어 있어 치료 속도가 빠르며 면역반응이 전혀 없는 장점이 있는 반면 2차 수술의 감염 및 제한된 양을 채취해야 하는 단점이 있다. 자가골의 이러한 단점으로 인해 사람시체에서 얻은 동종골(allogeneic bone)이나 소나 돼지 또는 말의 뼈를 가공해서 제조한 이종골(xenogeneic bone)이 이용되고 있지만 여러 병원소 등을 조사하여 제거해야 하는 문제가 있다. 그래서 최근에는 칼슘과 인을 이용한 합성골(synthetic bone) 제품이 증가하는 추세이다.

생체 세라믹 재료는 결정상의 변화에 따라 흡수특성을 제어할 수 있고, 뼈와 치아의 무기질과 같은 조성을 만들 수 있어 구조적 안정성이 수반되며, 인체 내에서 인체의 구성 이온으로 흡수될 수 있다는 장점으로 그 어떤 재료보다 인체 친화력과 활성이 뛰어나다. 그러나 압축력은 강하지만 인장력에는 약한 세라믹스의 취성 때문에 문제가 되었다. 예를 들어, 인산칼슘의 경우, 혈액 및 세포 내에 존재하는 주요 이온성분인 칼슘 (calcium) 이온 및 포스페이트 (phosphate) 이온으로 용해되어 흡수되므로 체내 적합성이 우수하다고 할 수 있는 반면에, 고분자에 비해서는 외부자극에 대한 감응성 부여가 힘들다는 점과 부서지기 쉬운 특성으로 기계적 강도에 한계가 있는 것으로 알려져 있다. 생체 활성을 가지면서 굽힘 강도, 파괴인성, 피로수명 등이 뛰어난 결정화 유리 등이 개발되면서 인공척추체, 인공장골 등이 상품화되고 있다. 또한 이미 치과재료로도 상당 부분이 상품화되어 있는 실정이다.

임상적으로 주로 적용되는 합성세라믹은 calcium phosphate, hydroxyapatite, tricalcium phosphate(TCP) 등이 있고, 경우에 따라서 이들 물질들의 성분들을 서로 혼합한 물질들을 사용한다. 이러한 생물학적으로 분해되는 세라믹들은 골재생 중에 새로운 형태의 골로 치환된다. Tricalcium phosphate(TCP)의 경우 HAp보다 훨씬 더 용해력이 커서 비교적 빨리 재흡수되며 Calcium sulphate는 가장 오랜 기간 동안 임상적으로 활용된 골전도 물질로 주요결점은 화학반응이 발생할 때 매우 다양한 결정구조가 발생하여 결국 마지막 산물의 성질이 일정치 않다는 것과 주위 골조직이 재생되는 용량을 초과해서 매우 빠르게 흡수된다는 점이다.

HAp가 천천히 흡수되는 것은 많은 임상 상황에서 바람직하지 않기 때문에 HAp가 빨리 흡수가 되도록 하기 위해서 HAp를 변형시키려는 많은 시도가 행해지고 있다. 한 가지의 방법은 HAp와 calcium carbonate를 혼합하는 것이고 또 다른 방법으로는 HAp와 좀 더 잘 녹는 TCP의 혼합체의 경우인데 이물질이 이식되었을 때, TCP는 신속하게 분해되어, 구멍이 많은 다공성 HA 위에 새로운 골이 형성되게 된다.

인산칼슘계 세라믹 재료의 적용에 있어 HAp의 생체비분해성과 상대적으로 너무 빠른 β-TCP의 생체분해 거동에 의해 임플란트 소재로의 적용이 제한적이므로, 생체분해속도를 조절하기 위하여 HAp와 β-TCP로 구성된 2상 칼슘인산염(biphasic calcium phosphate, BCP) 세라믹스의 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.생체비분해성과 생체활성의 조절은 BCP의 구성 성분인 HAp/β-TCP(BCP;biphasic calcium phosphate)의 값에 의해 좌우될 수 있다.

일반적인 BCP 분말의 합성법으로는 HAp와 TCP분말의 단순 기계적 혼합법인 고상반응법은 BCP 분말의 제조를 위한 간단한 공정이나 높은 하소 온도로 인하여 비교적 큰 응집입자의 생성 및 생산비용 절감에 있어 문제점이 대두되었다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 칼슘결손 HAp의 하소(calcination) 처리법, 공침된 인산칼슘계 전구체의 일반적인 하소처리 및 인산칼슘계 수화물 혼합용액의 마이크로파 가열법 등이 연구되고 있다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은,

HAp의 안정성과 β-TCP의 높은 용해율을 적절히 혼합하여 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절한 이상인산칼슘(BCP)을 이용하여 공침물의 Ca/P 몰 비율 조절을 통하여 동일한 pH, 반응온도, 하소온도를 적용하여 다양한 조성으로 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 제조방법에 의하여 제조된 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

출발물질로 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를 사용하여 공침물을 합성하는 단계;

Ca/P 몰 비율을 맞추기 위해 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를정량하여 각각의 수용액으로 형성하는 단계;

탈이온 증류수(distilled water)에 Ca(NO₃)₂4H₂O 수용액을 첨가한 후 (NH₄)₂HPO₄수용액을 천천히 첨가하는 단계;

상기 첨가물을 교반시키며, 현탁액을 완전히 용해시킨 후 암모니아를 첨가하여 수용액의 pH를 9.9 내지 10.1로 조절하여 공침시키는 단계; 및

상기 수용액을 건조하고 800 내지 950℃에서 1 내지 3시간 동안 하소처리하는 단계;를 포함하는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말의 제조방법을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

상기 제조방법에 따라 형성된 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말과 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드를 혼합하여 슬러리를 형성하고, 상기 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 변화시켜 기공율을 조절한 다음 상기 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 하소하여 제거하고 소결함으로써 얻어지는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 따르면, 동일한 하소처리 온도를 설정하여 다양한 조성의 이상인산칼슘 분말을 제조할 수 있고, 이러한 분말의 조성비를 찾아낼 수 있고, 출발물질로부터 화학양론적으로도 예측이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 출발물질의 Ca/P 몰 비율 변화시켜 제조한 공침물의 건조 후 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 출발물질의 Ca/P 몰 비율 변화시켜 제조한 공침물의 건조 후 주사전자현미경(SEM)사진을 도시한다.
도 3은 900℃에서 2시간 동안 하소처리 하여 얻은 다양한 조성의 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한다.
도 4는 900℃에서 2시간 동안 하소처리 하여 얻은 다양한 조성의 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한다.
도 5는 900℃에서 2시간 동안 하소 처리하여 얻은 다양한 조성의 BCP 분말의 주사전자현미경(SEM)사진을 도시한다.
도 6은 HAp:β-TCP의 비율을 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 8에서 (a) 열처리전, (b) 600℃로 2시간, (c) 900℃로 2시간 하소처리하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다.
도 7은 HAp:β-TCP의 비율을 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 9에서 (a) 열처리전, (b) 600℃로 2시간, (c) 900℃로 2시간 하소처리하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다.
도 8은 HAp:β-TCP의 비율을 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 10에서 (a) 열처리전, (b) 600℃로 2시간, (c) 900℃로 2시간 하소처리하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다.
도 9는 HAp:β-TCP의 비율을 (a)0:100=β-TCP(1.5), (b)60:40(Ca/P = 1.602), (c)100:0=HAp(1.67)로 설정하고, pH 10에서 열처리전 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다.
도 10은 HAp:β-TCP의 비율을 (a)0:100=β-TCP(1.5), (b)60:40(Ca/P = 1.602), (c)100:0=HAp(1.67)로 설정하고, pH 10에서 2시간 동안 하소처리 하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다.
도 11은 HAp:β-TCP의 비율을 0:100=β-TCP(1.5), 100:0=HAp(1.67), 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 10에서 (a)600, (b)700, (c)800, (d)900, (e)1000℃에서 하소처리 하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 분말의 결정성, 결정상 및 결정화도를 도시한다((a)결정성, (b)결정상, (c)결정화도).
도 13은 BCP 조성물을 제조하기 위해 사용한 PMMA의 주사전자현미경(SEM)사진을 도시한다.
도 14는 PMMA 비드(30 vol%)와 BCP 분말(70 vol%) 함량을 조절하여 제조된 BCP 다공성 조성물의 주사전자현미경(SEM)사진을 도시한다.
도 15는 본 발명에 따른 BCP 다공성 조성물의 세포독성 실험 결과를 도시한다.
도 16은 본 발명에 따른 BCP 다공성 조성물의 Mouse Skull 이식 4주 후 Micro-CT 사진을 도시한다.
도 17은 본 발명에 따른 BCP 다공성 조성물의 Mouse Skull 이식 8주 후 Micro-CT 사진을 도시한다.
도 18은 본 발명에 따른 BCP 다공성 조성물의 Mouse Skull 이식 8주 후 H&E staining 후 조직의 사진을 도시한다.

이하 본 발명을 도면을 참고하여 상세히 설명한다.

본 발명은 출발물질로 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를 사용하여 공침물을 합성하는 단계; Ca/P 몰 비율을 맞추기 위해 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를정량하여 각각의 수용액으로 형성하는 단계; 탈이온 증류수(distilled water)에 Ca(NO₃)₂4H₂O 수용액을 첨가한 후 (NH₄)₂HPO₄ 수용액을 천천히 첨가하는 단계; 상기 첨가물을 교반시키며, 현탁액을 완전히 용해시킨 후 암모니아를 첨가하여 수용액의 pH를 9.9 내지 10.1로 조절하여 공침시키는 단계; 및 상기 수용액을 건조하고 800 내지 950℃에서 1 내지 3시간 동안 하소처리하는 단계;를 포함하는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말의 제조방법을 제공한다.

여기서, 수용액의 pH는 바람직하게는 9.99 내지 10.01, 가장 바람직하게는 pH 10이고, 하소처리 온도는 바람직하게는 890 내지 910℃, 가장 바람직하게는 900℃이다.

뼈는 혈관으로 차 있고 때로는 상처를 받아도 흔적을 남기지 않고 치유되는 아주 역동적인 조직으로서 새로운 뼈를 자라게 하는 세포, matrix, 세포 간의 신호전달, 세포-matrix간 상호작용, 성장을 조절하는 성장인자 그리고 뼈와 같은 다공성 구조를 지니는 조성물이 필요하기에 본 발명에서는 PMMA 고분자 bead를 이용하여 다공체를 제조하고 이를 분쇄하여 미세기공을 지니는 BCP 조성물을 제공한다.

현재 골이식 재료로서 가장 많이 사용하고 있는 HAp의 안정성과 β-TCP의 높은 용해율을 적절히 혼합하여 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절한 이상인산칼슘(Biphasic Calcium Phosphate; BCP)의 HAp/β-TCP의 비율이 60:40으로 제시되어 있어 본 발명에서는 조성물에 대한 골이식 재료로서의 임상적 가능성을 평가하고자 mouse skull에 이식하여 그 특성을 평가한다.

일반적으로 HAp는 생체 내에서 비분해성을, β-TCP는 분해성을 나타내는 것으로 알려져 있는 가운데 최근 이러한 상반된 분해거동을 동시에 가지는 BCP(biphasic calcium phosphate)에 관한 연구 및 응용연구에 초점이 맞추어 가고 있다. 예를 들어, 임플란트의 인산칼슘계 세라믹 재료의 적용에 있어 HAp의 생체비분해성과 상대적으로 너무 빠른 β-TCP의 생체분해 거동에 의해, 임플란트 소재 사용의 제한이 되므로, 생체분해속도를 적당히 조절하기 위하여 HAp와 β-TCP로 구성된 2상 칼슘인산염(biphasic calcium phosphate, BCP) 세라믹스의 개발에 관심을 갖게 되었다. 생체비분해성과 생체활성의 조절은 BCP의 구성 조직인 HAp/β-TCP의 값에 의해 좌우 될 수 있으며, 이러한 조절능에 따라 임플란트 소재 외, 기타 의료용 인체 경조직 재료로서 응용 가능성은 크다.

본 발명에 따르면, 상기 제조방법에 따라 형성된 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말과 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 혼합하여 슬러리를 형성하고, 상기 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 변화시켜 기공율을 조절한 다음 상기 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 하소하여 제거하고 소결함으로써 얻어지는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말을 제공한다.

또한 동일한 공정을 통하여 다양한 조성의 BCP 조성물을 제조함에 다라 제조 원가 절감을 통한 생체재료 개발에 좋은 결과물을 기대할 수 있게 되었다. 생체 세라믹스에서는 재료 개발, 재료 가공, 치의학, 임상의학, 정형외과학 등 다양한 분야와 유기적인 협력연구를 통해 새로운 생체 세라믹스의 개발 이 가능할 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 들어 설명하나, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 발명에서 이상인산칼슘(BCP)을 제조하기 위하여 시약급의 Ca(NO₃)₂4H₂O(Katayama chemical, Japan)과 (NH₄)₂HPO₄(Junsei chemical, Japan)을 사용하여 공침법(co-precipitation process)으로 합성하였다.

공침법의 실험조건은 목표한 Ca/P 몰 비율이 되기 위해 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를정량하여 각각 수용액으로 만들었다. 250ml의 탈이온 증류수(distilled water)에 Ca(NO₃)₂4H₂O 수용액을 첨가한 후 (NH₄)₂HPO₄ 수용액을 천천히 첨가하였다. 자기교반기(magnetic stirrer)를 이용하여 일정하게 교반시키며, 현탁액을 완전히 용해시킨 후 NH₃(Junsei chemical, Japan)를 첨가하여 수용액의 pH를 10으로 조절하여 공침시켰다. 제조된 수용액을 2시간 동안 교반한 후 상온에서 24시간동안 시효처리(aging)하였다. 반응생성물의 여과 및 미 반응물을 제거하기 위해 증류수로 5회 이상 반복적으로 수세하고 여분의 수분을 제거하기 위하여 80℃로 고정된 건조기를 이용하여 24시간 동안 충분히 건조시켰다. 이때 얻어진 분말의 결정상을 관찰한 결과 Ca/P 몰 비율 조절에 따른 결정상 내에 이상 조직은 관찰되지 않았고, 저결정성 HAp만 나타났다.

도1은 출발물질의 Ca/P 몰 비율 변화시켜 제조한 공침물의 건조 후 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한다(Ca/P ratio;(a)1.500, (b)1.534, (c)1.568, (d)1.585, (e)1.602, (f)1.619, (g)1.636, (h)1.670).

도 2는 출발물질의 Ca/P 몰 비율에 따라 공침반응 후 건조된 분말의 SEM 이미지 결과는 정성적으로 뚜렷한 차이점이 없었던 XRD 결과와 비슷한 형상변화를 나타낸다(Ca/P ratio;(a)1.500, (b)1.534, (c)1.568, (d)1.585, (e)1.602, (f)1.619, (g)1.636, (h)1.670). 도 2를 참고하면, 출발물질의 Ca/P 몰 비율이 1.500인 경우를 제외한 모든 시편은 어느 정도의 단/장축비를 가지는 침상 또는 과립형태의 입자형상을 나타낸다. 그러나 몰 비율이 1.500일 경우 작은 구형 입자들이 뭉쳐진 형상을 보였고, 입자크기는 평균 60nm 이하임을 알 수 있었다.

이렇게 얻은 분말을 충분히 분쇄하여, 전기로에 넣어 900℃에서 2시간 동안 하소처리 하여 BCP 분말을 얻었다. 하소 처리 후 얻어진 분말의 Ca/P 몰 비율을 다양하게 변화시킨 결과 아래의 실시예에 의한 조성의 분말을 얻을 수 있었다.

도 3은 제조된 BCP 분말을 XRD(D/max-IIA, Rigaku)를 사용하여 생성물의 상 분석을 행한 결과를 나타낸다(Ca/P ratio;(a)1.500, (b)1.534, (c)1.568, (d)1.585, (e)1.602, (f)1.619, (g)1.636, (h)1.670). 출발물질의 Ca/P 몰 비율을 1.500 ~ 1.670으로 조절한 결과, 얻어진 분말의 결정상은 각각 β-TCP, BCP 및 HAp 상이 뚜렷하게 관찰되었다.

실시예	Ca/P mole Ratio	HAp:β-TCP 조성 비
1	1.5	0:100
2	1.534	20:80
3	1.550	30:70
4	1.568	40:60
5	1.602	60:40
6	1.619	70:30
7	1.636	80:20
8	1.67	100:0

도 4는 900℃에서 2시간 동안 하소처리 하여 얻은 다양한 조성의 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다(Ca/P ratio;(a)1.500, (b)1.602, (c)1.670).

Ca/P 몰 비율 1.670인 경우 HAp 결정상인 (211), (112), (300) 및 (202) 피크가 잘 발달되어 있고, Ca/P 몰 비율 1.602인 경우 HAp 결정상인 (211) 및 (300)과 β-TCP 결정상인 (0210) 및 (220) 피크가 뚜렷하게 양분화되었다. Ca/P 몰 비율 1.500인 경우 β-TCP 결정상인 (0210) 및 (220) 피크가 뚜렷하게 보였다. 얻어진 분말의 결정화도는 β-TCP 및 BCP일 경우 HAp보다 낮은 양상을 보였고, 출발물질의 Ca/P 몰 비율이 1.500인 경우, HAp 피크라 판단되는 미약한 피크도 관찰되었다. 그러나 출발물질의 Ca/P 몰 비율을 1.500, 1.602 및 1.670으로 조절하여 하소시킨 분말의 결정상 결과는 이론상의 결정상(예; 이론적 Ca/P 몰 비율, β-TCP = 1.5, HAp = 1.67)과 일치한다.

도 5는 900℃에서 2시간 동안 하소 처리하여 얻은 다양한 조성의 BCP 분말의 주사전자현미경(SEM)사진을 도시한다(Ca/P ratio;(a)1.500, (b)1.534, (c)1.568, (d)1.585, (e)1.602, (f)1.619, (g)1.636, (h)1.670).

도 6은 HAp:β-TCP의 비율을 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 8에서 (a) 열처리전, (b) 600℃로 2시간, (c) 900℃로 2시간 하소처리하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다. 도 6을 참조하면, 열처리전 pH영향이 없이 모두 저결정 HAp, 600℃에서 열처리 후 저결정 HAp, 900℃에서 열처리 후 β-TCP 함량이 높은 것을 확인할 수 있다.

도 7은 HAp:β-TCP의 비율을 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 9에서 (a) 열처리전, (b) 600℃로 2시간, (c) 900℃로 2시간 하소처리하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다. 도 7을 참조하면, 열처리전 pH영향이 없이 모두 저결정 HAp, 600℃에서 열처리 후 저결정 HAp, 900℃에서 열처리 후 β-TCP 함량이 높은 것을 확인할 수 있다.

도 8은 HAp:β-TCP의 비율을 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 10에서 (a) 열처리전, (b) 600℃로 2시간, (c) 900℃로 2시간 하소처리하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다. 도 8을 참조하면, 열처리전 pH영향이 없이 모두 저결정 HAp, 600℃에서 열처리 후 저결정 HAp, 900℃에서 열처리 후 HAp:β-TCP 함량비가 60:40인 것을 확인할 수 있다.

도 9는 HAp:β-TCP의 비율을 (a)0:100=β-TCP(1.5), (b)60:40(Ca/P = 1.602), (c)100:0=HAp(1.67)로 설정하고, pH 10에서 열처리전 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다. 도 9를 참조하면, 열처리 이전은 공침몰의 Ca/p 비율에 관계없이 모두 저결정 HAp인 것을 확인할 수 있다.

도 10은 HAp:β-TCP의 비율을 (a)0:100=β-TCP(1.5), (b)60:40(Ca/P = 1.602), (c)100:0=HAp(1.67)로 설정하고, pH 10에서 2시간 동안 하소처리 하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다. 도 10을 참조하면, (a)는 HAp:β-TCP=0:100, (b)는 HAp:β-TCP=60:40, (c)는 HAp:β-TCP=100:0 이었다.

도 11은 HAp:β-TCP의 비율을 0:100=β-TCP(1.5), 100:0=HAp(1.67), 60:40(Ca/P = 1.602)로 설정하고, pH 10에서 (a)600, (b)700, (c)800, (d)900, (e)1000℃에서 하소처리 하여 얻은 BCP 분말의 결정상을 분석한 XRD 데이터를 도시한 것이다. 도 11을 참조하면, 하소처리 온도는 900℃인 것이 가장 바람직하다는 것을 확인할 수 있다.

출발물질의 Ca/P 몰 비율에 따라 공침반응 후 건조분말을 900℃에서 2시간 동안 하소(calcination)한 시편의 SEM 이미지에서 볼 수 있듯이, 합성된 β-TCP, BCP, 및 HAp 분말은 출발물질의 Ca/P 몰 비율과는 상관없이 전체적으로 비교적 구형에 가까운 입자형상을 나타내고 있으며, 입자들 간에 다소의 응집이 관찰되었다.

β-TCP 입자형상은 대체로 균일하고 매끄러운 표면형상을 보인 반면, BCP 및 HAp의 입자형상은 재결정화 또는 분말의 이차 결정성장을 암시하는 응집 및 넥(neck)이 형성됨을 보였다.

도 12는 출발물질의 Ca/P 몰 비율(1.534 ~ 1.636)에 따라 제조된 분말의 결정성, 결정상 및 결정화도를 나타낸다.

도 12(a)의 결과에 의하면, 출발물질의 Ca/P 몰 비율(1.534~1.636)과 주어진 pH조건 (pH = 10) 및 열처리 조건(900℃, 2시간)에 따라 BCP 상을 정확하게 얻을 수 있음을 확인할 수 있다. 도 12(b)는 도 12(a)의 X-선 회절 패턴을 확대하여 관찰한 결과로서, 출발물질의 Ca/P 몰 비율이 증가함에 따라 β-TCP 상의 주 피크 결정성장 방향은 (0210)으로 감소하였다. 이와 반대로 HAp 상의 주 피크 성장은 (211)쪽으로 상대적으로 증가하였다. 도 12(c)는 결정화도 측정한 경우로서 얻어진 β-TCP 및 HAp 분말의 결정화도가 이론치에 가깝다고 가정 한다면, BCP 분말의 이상 조직 (biphasic structure)의 부피 분율의 합은 정성적으로도 거의 일치함을 알 수 있다.

다공성 구조 조성물의 제조

도 13은 BCP 조성물을 제조하기 위해 사용한 PMMA의 주사전자현미경(SEM)사진을 도시한다. 골이식용 재료로서의 적용 가능성을 평가하기 위하여 뼈와 같은 다공성 구조를 지니는 조성물이 필요하기에 본 발명에서는 다공성 BCP 조성물을 제조하기 위해 비교적 낮은 온도(180℃)에서 연화되는 대표적인 생체 고분자 재료인 PMMA(Sunjin Chemical, SUNPMMA-S series, 50 ~ 100㎛)를 사용하였다. BCP 분말은 HAp의 안정성과 β-TCP의 높은 용해율을 적절히 혼합하여 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절한 이상인산칼슘(Biphasic Calcium Phosphate; BCP)의 HAp/β-TCP의 비율로 제시된 60:40의 분말을 사용하였다. 증류수 8.852g에 BCP 분말과 PMMA Beads를 첨가하여 슬러리를 제조하고 분산제(Darvan C) 0.451g 및 계면활성제(Dynol 604) 0.022g, 동결방지제(Glycerol) 2.72g, 결합제(Poly(vinyl alcohol), SIGMA-ALDRICH 99+%) 2.2528g을 첨가하고 균일한 혼합을 위해 24시간 동안 혼합하여 슬러리를 제작하였다.

BCP지지체 제조 시 기공률을 조절하기 위해 PMMA Beads를 30, 40. 50 vol%로 변화하였다. 슬러리에 잔류하는 공기를 빼내기 위해 진공데시케이터에서 3분간 탈포하였다. 탈포한 슬러리를 지름 25mm의 몰드에 담아 액체질소를 이용하여 급속하게 동결시켰다. 동결된 시편을 탈형시킨 후, 즉시 동결건조기에 넣고 3 Torr의 진공 하에서 용매를 승화 건조시켰다. 동결 건조된 시편을 super kanthal로(STD 1700, Lenton)을 사용하여 승온 속도 1℃/min로 180℃에서 2시간 동안 열처리하여 PMMA Beads를 제거하고, 승온 속도 1℃/min로 600℃에서 2시간 동안 하소함으로써 유기물을 제거한 후, 승온 속도 2℃/min로 1200℃에서 2시간 동안 소결하고 로에서 천천히 냉각하여 제조하였다.

도 14는 PMMA 비드(30 vol%)와 BCP 분말(70 vol%) 함량을 조절하여 제조된 슬러리를 동결건조 및 소결 처리한 다공체의 미세구조(SEM) 관찰 결과를 나타낸다. 골이식용 재료는 생체적합성인 화학적 조성뿐만 아니라 체액이 흐를 수 있는 다공성 구조를 필요로 하는데, 기공의 크기는 150 ~ 500μm 정도이어야 하며, 이 기공들은 연결되어 있어야 한다.

그러나 PMMA 비드를 적용한 경우 거대 기공들이 연결되지는 않았으나, 슬러리 건조과정 및 소결을 통해 미세기공은 비교적 잘 연결된 양상을 보였다. PMMA의 투입량에 따라 구형의 기공수는 달라지며 PMMA 비드의 투입량이 증가할수록 미세기공의 수는 낮아짐을 알 수 있었다. 거대기공의 크기는 PMMA bead에 의해 150 ~ 300 μm 정도였다.

in - vitro 실험

제조한 BCP 다공성 조성물의 세포 독성을 평가하기 위하여 세포는 MG63를 이용하고 배양조건은 37℃, 5(v/v)% CO₂ incubator를 배양액은 1% Penicillin-Streptomycin과 10% FBS를 첨가한 DMEM (Gibco BRL)를 사용하였다. 검액 제조를 위하여 매체는 10% FBS가 첨가되지 않은 DMEM/F12배지를 용출농도는 시료를 4g/20ml의 비율로 10% FBS가 첨가되지 않은 DMEM배지에 넣어 용출하였다. 용출온도 및 시간은 37℃, 24시간 시행하였다.

대조액 제조를 위하여 Media 대조액은 시험물질을 포함하지 않은 상태로 10% FBS가 첨가되지 않은 DMEM배지를 검액과 동일한 방법으로 제조하였다. 양성대조액은 양성대조물질인 ZDBC Polyurethane Film (Hatano Research Institute, Japan)을 6 ㎠/ml의 비율로 10% FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지에 넣고 검액과 동일한 방법으로 제조하였다. 음성대조액 : High Density Polyethylene Film (Hatano Research Institute, Japan)을 6㎠/ml의 비율로 10% FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지에 넣고 검액과 동일한 방법으로 제조하였다. 장비는 CO₂ incubator (SANYO Electric Biomedical CO.Ltd, Japan), Clean Bench ( DBB-922, 대일엔지니어링), 현미경 ( Nicon ECLIPSE TE300, Japan), ELISA reader ( E-MAX Molecular Devices)을 사용하였다. 검액과 대조액을 준비하고 시험개시 하루 전에 96 well plate에 세포현탁액 200ul(2x10⁴cells/well)씩 넣고 5% CO₂ incubator에서 단층 배양하였다. plate 바닥면적의 80%정도 세포가 증식하면 plate에서 배양액을 걷어내고 검액 및 대조액을 넣고 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 5mg/ml의 농도로 녹인 MTT 용액을 well당 50ul씩 넣은 다음, 37℃ incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, well에서 배지를 제거하고, 200ul의 DMSO를 넣어 보라색 침전물을 완전히 녹여낸 후 ELISA reader를 이용하여 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도 수치에서 평균을 구하고, 통계 처리한 결과를 도 15에 나타내었다.

세포의 생존율을 수치화한 결과 대조군의 비하여 약 10% 정도의 세포 생존율이 감소한 결과를 나타낸다. 이를 통하여 제조한 BCP 다공성 조성물이 생체 활성은 우수하지 못하나 세포 독성은 없는 것으로 판단된다.

in - vivo 실험

제조한 BCP 다공성 조성물의 in-vivo 실험을 위하여 무균의 쥐를 이용하였다. 실험동물은 케타민을 근육 주사하여 전신마취하였다. 이식 부위는 인체의 치아 조직과 유사한 뼈조직의 구성을 갖는 쥐의 두개골로 선정하여 쥐의 두개골 부위의 외피 조직을 절제하여 두개골 내에 골막을 박리하여 두개골을 노출시킨 후 외경 5mm의 트레핀버로 2개의 결손부를 형성하였다. 두 개의 결손부에 대조군으로 콜라겐을 왼쪽에 이식하고 BCP 무기계 골수복재를 오른쪽에 이식하여 4주, 8주 후 골 생성능을 Micro-CT 촬영을 통하여 분석하였다.

도 16은 BCP 다공성 조성물의 Mouse Skull 이식 4주 후 Micro-CT 사진을 도시한다. 도 16을 참조하면, 쥐의 두개골 결손 부위의 면적이 좁아 이식되는 수복재의 양이 적어 외과적 수술 시 과량의 수복재를 결손부에 이식하여 두개골의 4주 후 Micro-CT 촬영 사진에서 골 결손부에 과량의 수복재가 이식된 것을 확인할 수 있다.

도 17은 BCP 다공성 조성물의 Mouse Skull 이식 8주 후 Micro-CT 사진을 도시한다. 도 17을 참조하면, 8주 후에는 대조군인 콜라겐과 이식한 BCP 골수복재 모두에서 치밀한 골 생성을 확인할 수 있다. 두개골의 단면을 관찰한 결과 이식된 BCP 다공성 조성물이 골형성 능력이 있음을 알 수 있었다.

또한, 현미경을 이용하여 조직시편의 골 결손부위를 관찰하였다. 특히 신생골의 형성과 염증상태의 유무, 재료 주위의 뼈 조직 형성 정도를 관찰하였다.

H&E staining은 동물조직학에서 일반적으로 사용하는 염색법으로 잘 알려져 있다. H&E staining은 검푸른 색을 내는 헤마톡실린(hematoxylin)과 붉은 색을 내는 에오진(eosin)의 두 염료를 이용하는 방법은 생물 시료의 검사에 가장 유용한 염색법이다. 시행이 간편하고 신뢰도가 높으며 비용이 저렴하고 많은 정보를 얻을 수 있는 장점이 있다. 절편의 두께와 헤마톡실린 용액의 제조법에 따라 약간씩 다르지만 세포핵은 검푸르게 염색되며 대부분의 세포질 성분은 분홍색 또는 붉은색으로 염색된다.

이때 결합조직과 생성되는 뼈 조직은 조직형태학적 분석 및 염색의 밀도를 보고 판단하였다. 도 18는 BCP 다공성 조성물을 골 결손부에 이식한 후 8주째의 골 결손부위를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.

도 18를 참조하면, 가운데 부분이 결손된 부위이며 H&E staining 염색법으로 결손부위의 가장자리에 붉게 염색된 골 조직이 새로 생성된 부분(짙은 붉은색)과 새로 생기려는 부위(옅은 붉은색)로 구분된다. 도 18에서 왼쪽의 콜라겐 이식 부위와 대별되게 오른쪽의 BCP 다공성 조성물의 경우 신생골이 골 결손부위의 가장자리와 재료 주변에서부터 생성되는 것을 확인할 수 있었고, 모든 조직에서는 염증반응을 보이지 않았다. 또한 도 18에서 흰색으로 나타난 부위는 재료가 이동하여 빈 공간이 생긴 것이고 골 결손부 가장자리부터 골 형성이 시작되어 골 형성이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

Claims

출발물질로 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를 사용하여 공침물을 합성하는 단계;
Ca/P 몰 비율을 맞추기 위해 Ca(NO₃)₂4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를정량하여 각각의 수용액으로 형성하는 단계;
탈이온 증류수(distilled water)에 Ca(NO₃)₂4H₂O 수용액을 첨가한 후 (NH₄)₂HPO₄수용액을 천천히 첨가하는 단계;
상기 첨가물을 교반시키며, 현탁액을 완전히 용해시킨 후 암모니아를 첨가하여 수용액의 pH를 9.9 내지 10.1로 조절하여 공침시키는 단계; 및
상기 수용액을 건조하고 800 내지 950℃에서 1 내지 3시간 동안 하소처리하는 단계;를 포함하는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 수용액의 pH가 9.99 내지 10.01이고, 하소처리 온도가 890 내지 910℃인 것을 특징으로 하는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 따른 제조방법에 따라 형성된 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말과 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 혼합하여 슬러리를 형성하고, 상기 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 변화시켜 기공율을 조절한 다음 상기 폴리메틸메타크릴레이트 비드를 하소하여 제거하고 소결함으로써 얻어지는 골이식용 생체활성 이상인산칼슘 분말.