KR20120112189A - Ｐｄｚｋ１ 억제제를 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PDZK1 발현억제제 또는 활성 억제제는 색소과다침착부위에서 멜라닌 생성에 가장 중요한 효소인 티로시나아제의 발현을 억제하고, 각질형성세포로의 칼슘이온의 유입을 억제하여 경피수분손실을 감소시킴으로써 기미 증상을 예방 또는 개선시키는 효과가 있다.

Description

ＰＤＺＫ１ 억제제를 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물{Cosmetics composition containing PDZK1 inhibitor for preventing and improving melasma}

본 발명은 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

인류의 역사와 더불어 아름다운 피부를 갖고 싶어하는 것은 모든 사람들의 공통의 관심사라 할 것인 바, 피부는 몸과 마음의 건강 상태를 반영하며 깨끗한 피부는 상대방으로부터 쉽게 호감을 살 수 있도록 하기 때문에 오랜 시간 여성은 물론이고 남성들도 피부 미용 및 피부관리에 많은 관심을 보여왔다. 피부는 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 수행하며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다.

한편, 표피 중에서도 가장 바깥쪽에 존재하는 각질층(Stratum corneum, horney layer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다. 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 "표피 세포의 분화" 또는 "각화(keratinization)"라고 부른다.

또한, 각화과정 중에 각질형성세포는 천연보습인자(natural moisturizing factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부 장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다. 이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목욕 등의 생활 습관적 요소, 건조한 대기 오염 물질 등의 환경적인 요인, 그리고 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제로 현대에 들어서 더욱 늘어난 다양한 요인들로 인해 최근에는 건조피부증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 부분들이 점점 증가하고 있는 추세이다.

따라서, 적절한 피부 수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분 손실을 방지하기 위한 연구가 다양하게 진행되어 왔으며, 실제로 수분 보유 능력이 있는 다양한 보습제(moisturizer) 가 개발되어 있다. 피부 보습제로는 세라마이드 등의 지질성분과 필수지방산 및 지질복합체 등 각질층에서의 수분보유를 증가시킬 수 있는 물질을 사용하는 것이 일반적이다.

한편, 사람의 신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선에 의한 피부손상 저해에 중요한 역할을 담당한다. 그러나 멜라닌의 과잉 합성 및 축적은 피부에 기미, 주근깨 및 노인성 흑자 등 심각한 미적 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 피부노화를 촉진하며 피부암을 유발하기도 한다. 특히, 가장 흔히 발생하는 질환인 기미는 주로 뺨, 이마, 코, 턱 등 얼굴의 중심부위에 연한 갈색이나 암갈색 심지어는 검은색의 과색소성 병변이 발생하는 질환으로써, 주로 여성에게 발생하나 드물게 남성에게 생기는 경우도 있다. 기미는 매우 흔한 질환이지만 아직까지는 정확한 원인이 알려져 있지 않다. 대개는 태양광선의 과잉 노출, 유전적 소인, 임신 등이 원인이며, 피임약의 복용과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 기미는 일반적으로는 좌우 대칭 형태로 나타나는 특징을 갖고, 햇볕을 비교적 덜 받는 눈두덩이나 턱밑 같은 곳에는 거의 생기지 않는다. 따라서 햇볕이 강한 여름에 한층 더 증세가 심해지는 반면 겨울에는 옅어지고, 성별이나 인종, 나이에 큰 영향을 받지는 않지만 주로 동양인이나 라틴계 여성에게서 많이 발견되고 있다. 이렇듯 현대 사회의 피부미용 및 관리에 있어서 많은 비중을 차지하고 있는 기미 치료에 많은 관심이 집중되고 있는 바, 국내외 많은 연구기관 등에서 이를 위한 연구를 활발히 진행하고 있는 실정이다.

기미에서 특이적으로 과다 발현되는 마커를 발굴하고 이를 억제할 수 있다면 피부의 색소과다침착을 개선할 수 있는 장점이 있으므로 기미 병변부의 특이적인 마커의 발굴 및 이를 이용한 기미 예방 또는 개선용 물질에 대한 연구가 필요하다.

본 발명자들은 기미에서 특이적으로 과다 발현되는 마커를 연구하던 중, PDZK1(PDZ domain containing 1)이 기미 병변부인 색소과다침착 부위에서 과다 발현되고 이를 억제하면 티로시나아제의 발현을 억제할 수 있으며, 각질형성세포에서 칼슘 이온의 유입을 감소시켜 경피수분손실을 감소시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른, PDZK1 발현억제제 또는 활성 억제제는 색소과다침착 부위에서 멜라닌 생성에 가장 중요한 효소인 티로시나아제의 발현을 억제하고 각질형성세포로의 칼슘이온의 유입을 억제하여 경피수분손실을 감소시킴으로써, 기미 증상을 예방 또는 개선시키는 효과가 있다.

도 1은 색소과다침착 부위에서의 PDZK1의 발현을 실시간 PCR(a), 면역조직화학염색(b)으로 확인하고, 배양된 정상 멜라닌세포 및 각질형성세포에서 PDZK1 발현을 실시간 PCR(c)로 확인한 결과를 나타낸 도이다(KC: 각질형성세포 단독 배양, MC: 멜라닌 세포 단독배양)
도 2는 멜라닌 세포와 각질형성세포에서 PDZK1을 과발현시킨 후, PDZK1과 티로시나아제(tyrosinase), ERK, CREB 및 PKC의 발현 및 인산화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(KC+MC: 각질형성세포-멜라닌세포 공동배양, KC(PDZK1)+MC: 멜라닌 세포와 PDZK1 과발현된 각질형성세포의 공동배양, KC+MC(PDZK1): 각질형성 세포와 PDZK1 과발현된 멜라닌 세포의 공동배양, c: 대조 벡터 pcDNA3.1-MYC로만 형질도입된 세포)
도 3은 멜라닌세포 단독 배양 또는 멜라닌세포-각질형성세포의 공동 배양에 10 또는 100nM의 에스트로겐(ES)을 처리하거나(a), PDZK1의 발현 변화 유도 후 에스트로겐을 처리한 경우 티로시나아제 발현양의 변화(b)를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 PDZK1의 과발현(a) 또는 PDZK1 넉다운(knock down)(b)이 유도된 멜라닌세포-각질형성세포 공동배양에 에스트로겐을 처리한 후, 에스트로겐 수용체 ER-α 및 ER-β의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하고, 색소과다침착부위에서 ER-α 및 ER-β의 발현을 실시간 PCR(c) 및 이중염색(d)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 PDZK1 과발현에 의한 이온전달체의 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 확인하고(a, b), 면역조직염색을 통하여 PDZK1과 이온전달체의 결합을 확인한 결과를 나타낸 도이다(c).
도 6은 에스트로겐 처리에 의한 이온전달체(NHE3, CFTR 및 SLC26A3) 및 티로시나아제 단백질의 발현 유도를 웨스턴 블랏으로 확인(a)하고, 이온전달체 특이적 억제제(EIPA, CFTR Inhibitor-172)에 의한 에스트로겐 유도된 티로시나아제 단백질의 발현 변화를 확인(b, c)한 결과를 나타낸 도이다(EIPA: 5-ethylisopropyl amiloride, CF: CFTR inhibitor-172, ER: 에스트로겐 수용체).
도 7은 에스트로겐 수용체 ER-α 및 ER-β과 이온전달체(NHE3, CFTR 및 SLC26A3)의 결합(a) 및 에스트로겐 수용체 서브타입(ER-α, ER-β)과 NHE3 또는 에스트로겐 수용체 서브타입, CFTR 발현의 관계를 실시간 PCR로 확인한 결과(b)를 나타낸 도이다(PPT: propylpyrazoletriol, DPN: diarylpropionitrile).
도 8은 PDZK1 과발현에 의한 각질형성세포 내 칼슘 이온 유입을 FACS 분석을 이용하여 확인(a)하고 칼슘 킬레이터인 EDTA를 처리한 한 후의 PDZK1과 이온전달체(NHE3, CFTR 및 SLC26A3)의 발현량의 변화를 측정한 결과(b)를 나타낸 도이다. 또한, 항-Tyrp1-항체 및 항-K14 이중 염색을 통하여 PDZK1에 의한 멜라노좀의 전달 증가(c)와 이러한 전달이 RAC 및 ERM의 인산화를 통해 이루어짐을 확인한 결과(d)를 나타낸 도이다.
도 9는 각질형성세포에 0, 10, 100nM의 에스트로겐을 처리한 후, PDZK1과 티로시나아제의 발현 및 PDZK1의 과발현 후, 각질형성세포의 총 세포용해물에서 ER-α 및 ER-β 의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과(a) 및 PDZK1의 과발현의 유무에 따른 각질형성세포에서의 세포내 칼슘의 농도 변화를 FACS 로 확인한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 10은 각질형성세포에서 PDZK1에의한 칼슘 유입의 상항조절에 따른 각질형성세포의 분화를 분화마커 단백질을 이용한 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 PDZK1 발현 억제제는 PDZK1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 PDZK1(PDZ domain containing 1) 활성 억제제는 PDZK1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(mimetics), 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제는 각질형성세포 내 칼슘 이온의 유입을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제는 각질형성세포 내 칼슘 이온의 유입 억제를 통해 색소과다침착부위의 경피수분손실을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

상기 기미는 주로 뺨, 이마, 코, 턱 등 얼굴의 중심부위에 연한 갈색이나 암갈색 심지어는 검은색의 색소과다침착 병변이 발생하는 것을 말한다.

상기 각질형성세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식하는 기저세포가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포를 의미한다.

상기 경피수분손실(TEWL)은 피부표면에서 증발되는 수분량을 의미한다. 또한 이는 피부장벽 기능의 이상을 나타내는 지표가 될 수 있으며, 과도한 수분의 손실은 피부건조 증상을 나타낼 수 있다.

상기 보습제는 적절한 피부 수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분 손실을 방지하기 위한 제제를 말한다. 보습제로는 세라마이드 등의 지질성분과 필수지방산 및 지질복합체 등 각질층에서의 수분보유를 증가시킬 수 있는 물질을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 솔비톨, 헥실렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 디글리세린, 판테놀, 베타인; 및 하이드롤라이즈드밀단백질로 구성된 군으로부터 선택된 1종이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 PDZK 발현 억제제 또는 활성 억제제 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 본 발명에 따른 PDZK1 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하며, 스킨, 로션, 에센스, 영양 크림, 맛사지 크림 및 클렌징 크림과 같은 각종 크림, 클렌징 폼, 비누, 자외선 차단제 및 팩 등의 기초 화장료 및 파우더, 파운데이션 및 메이크업 베이스를 비롯한 색조 화장료 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 PDZK1 발현 억제제 또는 활성 억제제 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다 이때 조성물의 분포를 용이하게 하기 위하여, 조성 내 활성성분에 대한 희석제, 분산제 또는 운반체로서 작용하는, 화장료 조성물에 허용되는 각종 부형제를 포함할 수도 있다. 수분 이외의 부형제 또는 수분을 포함하는 부형제로는 액체 또는 고체 형태의 피부연화제, 용매, 습윤제, 유지성분, 에몰리언트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH 조정제, 향료, 증점제 또는 분말 등을 포함할 수도 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에서 PDZK1 발현 억제제 또는 활성 억제제는 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.01~5중량%로 함유되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 색소과다침착 부위에서의 PDZK1 의 과발현 확인

15명의 기미환자로부터 색소과다침착부위(hyperpigmented, L) 및 정상 피부(N) 생검 시료를 얻고 PDZK1 프라이머를 사용한 실시간 PCR을 수행하고, 항-PDZK1 항체 및 항-c-키트 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 실시하였다. 항체들은 각각 녹색과 적색의 형광을 나타내었다. 핵은 Hoechst 33258로 청색 형광을 내도록 대조 염색하였다. 또한, 배양된 정상 멜라닌세포 및 각질형성세포에서 PDZK1 발현을 실시간 PCR로 확인하였다. PDZK1 과발현 유도 전, PDZK1의 발현을 3개의 배양된 정상 멜라닌 세포 및 3개의 각질형성세포 실험군에서 측정하였다.

결과를 도 1에 나타내었다.

도 1 에 나타낸 바와 같이, PDZK1 mRNA의 발현은 정상 피부보다 색소과다침착 부위에서 더 높게 나타났으며(a), 정상 피부보다 색소과다침착 부위에서 PDZK1의 강한 활성을 확인할 수 있었다. 표피의 각질형성세포(keratinocyte)뿐만 아니라 멜라닌세포(melanocyte)에서도 PDZK1 양성을 확인하였다(b). 또한, 배양된 각질형성세포의 경우 PDZK1의 발현이 3개의 실험군에서 모두 비슷한 수준으로 높게 나타난 반면, 멜라닌세포는 PDZK1의 발현이 낮은 편이였으나, 각 세포들 사이에서 다양한 발현 수준을 나타내었다(c).

실시예 2. PDZK1 과발현 유도가 티로시나아제의 발현 및 ERK , CREB , PKC 의 인산화에 미치는 영향

멜라닌 세포와 각질형성세포에서 PDZK1을 과발현 시키고 24시간 후, PDZK1과 티로시나아제(tyrosinase), ERK, CREB 및 PKC의 발현을 각질형성세포 또는 멜라닌세포 단독 배양 또는 각질형성세포와 멜라닌세포 공동배양 실험군에서 웨스턴 블랏으로 측정하였다.

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 멜라닌세포에서 PDZK1의 과발현 유도는 티로시나아제의 발현을 뚜렷하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며(a), 단독 또는 공동 배양한 모든 실험군에서 ERK, CREB 및 PKC의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다(b).

실시예 3. 에스트로겐에 의한 PDZK1 및 티로시나아제 발현 유도

멜라닌세포 단독 배양 또는 멜라닌세포-각질형성세포의 공동 배양에 10 또는 100nM의 에스트로겐을 처리한 후, PDZK1과 티로시나아제의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한, PDZK1의 발현 변화를 유도한 경우 에스트로겐 처리 농도에 따른 티로시나아제의 발현양 변화를 확인하기 위하여 PDZK1의 과발현 또는 PDZK1 넉다운(knock down)이 유도된 멜라닌세포와 각질형성세포의 공동배양에서 에스트로겐의 농도에 따른 티로시나아제의 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 에스트로겐을 처리한 결과 멜라닌세포 단독 배양 및 멜라닌세포-각질형성세포의 공동 배양 모두 에스트로겐 처리에 의하여 PDZK1의 상향조절 되고, 티로시나아제의 발현이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다(a). 또한, PDZK1의 과발현은 에스트로겐-자극 티로시나아제의 발현을 촉진시켰으나 PDZK1의 발현을 siRNA를 통해 넉다운시킨 실험군에서는 티로시나아제의 발현이 대조군에 비하여 감소되는 것을 확인하였다(b).

실시예 4. PDZK1 에 의한 에스트로겐 수용체 발현 증가

에스트로겐이 생물학적인 활성을 갖고 있으며, 이는 에스트로겐 수용체의 서브타입인 ER-α 및 ER-β에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으므로, 에스트로겐 수용체에 PDZK1이 미치는 효과를 분석하였다. PDZK1의 과발현 또는 PDZK1 넉다운(knock down)이 유도된 멜라닌세포-각질형성세포 공동배양에 에스트로겐을 처리하고 24시간 후, 총 세포 용해물에서 ER-α 및 ER-β의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한, PDZK1 상향 조절된 12명의 기미 환자들의 정상 피부와 색소과다침착부위에서 ER-α 및 ER-β의 발현을 확인하기 위하여, mRNA의 발현량을 실시간 PCR로 비교하고 PDZK1 과발현을 유도하거나 또는 유도하지 않은 배양 세포들에서 항-PDZK1, ER-α 및 ER-β의 항체를 이용하여 이중염색을 하였다.

결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, PDZK1의 과발현은 뚜렷하게 ER-α 및 ER-β의 발현을 증가시켰다(a). 반면, PDZK1를 siRNA를 통해 넉다운시키자 에스트로겐-유도된 ER-α 및 ER-β의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(b). 또한, 적어도 하나의 에스트로겐 수용체 서브타입은 뚜렷하게 색소과다침착부위에서 과발현되어 있는 것을 확인하였으며(c), PDZK1과 ER-α 또는 PDZK1과 ER-β를 함께 염색한 결과 비록 항-PDZK1 및 항-에스트로겐 항체들의 염색부위는 상이하나, PDZK1의 과발현이 각각의 에스트로겐 수용체들의 염색강도를 멜라닌세포와 각질형성세포에서 모두에서 증가시킨다는 확인하였다.

실시예 5. PDZK1 과발현에 의한 이온전달체 단백질의 발현 유도

PDZK1이 NDE, CFTR 및 SLC26과 같은 이온 전달체로 알려진 4개의 단백질-단백질 상호작용 PDZ 도메인을 포함하기 때문에, 멜라닌세포의 단독 및 멜라닌 각질형성세포의 공동 배양에서 PDZK1의 과발현 유도 이후 NDE, CFTR 및 SLC26의 발현의 변화를 확인하였다. NDE, CFTR 및 SLC26의 발현의 변화는 PDZK1으로 멜라닌 세포를 형질감염 시키고 24시간 후, 멜라닌세포 단독배양 또는 멜라닌세포 각질형성세포 공동배양 실험군에서 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한, 항 PDZK1 항체를 사용하여 PDZK1의 과발현을 유도하거나 또는 유도하지 않은 각질형성세포 및 멜라닌세포의 총 세포 용해물에서 면역침전을 수행하였으며, 항-PDZK1 항체 및 항 CFTR 항체를 이용하여, PDZK1의 과발현을 유도하거나 또는 유도하지 않은 세포에서 면역조직 염색을 수행하였다. 각각의 항체들은 적색과 녹색 형광을 나타냈으며, 핵은 Hoechst 33258를 이용하여 청색을 나타내도록 대조 염색을 하였다.

결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, NHE의 경우, NHE1 및 NHE3의 발현을 각질형성세포와 멜라닌세포의 배양에서 확인하였다. PDZK1의 과발현은 유의적으로 대조군에 비하여 NHE1 및 NHE3의 발현을 단독 또는 공동배양에서 모두 증가시켰다(a). PDZK1 과발현에 의하여, PDZK1과 NDE, CFTR 및 SLC26A3와 같은 이온 전달체들 사이의 결합이 각질형성세포와 멜라닌 세포에서 모두에서 증가되는 것을 확인하였다(b). 또한, 면역조직 염색결과 PDZK1의 과발현 유도가 멜라닌 세포와 각질형성세포 모두에서 이온 전달체(CFTR)의 염색 강도를 증가시키는 것을 확인하였다(c).

실시예 6. 에스트로겐 처리에 의한 이온결합 단백질 및 티로시나아제 단백질의 발현 유도

0, 10, 100 nM의 에스트로겐을 각각 멜라닌 세포에 처리한 후 멜라닌 세포를 단독배양 하거나 멜라닌 세포와 각질형성세포를 공동배양하고 NHE3, CFTR 및 SLC26A3의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한 에스트로겐 유도된 티로시나아제 단백질의 발현이 이온결합 단백질의 억제로 인하여 변화되는지 확인하기 위하여 PDZK1 과발현 실험군 또는 PDZK1이 과발현되지 않은 대조군에 NHE 특이적 억제제인 EIPA(5-ethylisopropyl amiloride)와 CFTR 특이적 억제제인 CFTR Inhibitor-172(3-[(3-Trifluoromethyl)phenyl]-5-[(4-carboxyphenyl)methylene]-2-thioxo-4-thiazolidinone)을 각각 5 μΜ씩 에스트로겐-유도된 티로시나아제 단백질의 과발현 상태에 처리한 후 에스트로겐 유도된 티로시나아제 단백질의 발현 변화를 확인하였다.

결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, PDZk1은 NHE3, CFTR 및 SLC26A3의 발현은 멜라닌 세포 단독 배양 및 멜라닌 세포와 각질형성세포의 공동배양 모두에서 에스트로겐의 농도에 따라 발현이 증가됨을 확인하였다(a). 또한, EIPA와 CFTR Inhibitor-172는 에스트로겐 유도된 티로시나아제의 과발현을 PDZK1의 존재여부와 상관없이 뚜렷하게 억제하였다(p< 0.05)(b, c).

실시예 7. 에스트로겐 수용체와 이온전달체의 결합

ER-α 특이적 길항제인 PPT(propyl pyrazole triol) 10, 100nM과 ER-β 특이적 길항제인 DPN(diarylpropionitrile) 100, 1000nM을 각각 처리한 후, NHE3, CFTR 및 SLC26A3 단백질의 발현을 멜라닌세포 및 각질형성세포 공동 배양에서 관찰하여 에스트로겐 수용체 서브타입과 이온 전달체들의 결합을 확인하였다. 또한, 에스트로겐 수용체 서브타입(ER-α, ER-β)과 NHE3 또는 에스트로겐 수용체 서브타입, CFTR 발현의 관계를 PDZK1 과발현을 나타내는 기미환자 12명으로부터 얻은 피부 샘플을 이용하여 실시간 PCR 분석을 통해 확인하였다.

결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, PPT의 처리는 ER-β 및 CFTR의 발현에는 영향을 주지 않았으며, ER-α에 따른 NHE3의 발현을 뚜렷하게 증가시켰다(p<0.05). 반면에 DPN의 처리는 NHE3의 발현의 변화를 유도하지 않았으나 CFTR의 발현을 뚜렷하게 증가시켰다(a). NHE3 와 ER-α 사이의 유사한 발현의 증가 및 감소가 12명의 환자들 중 2번 및 5번 환자에서 확인되었다. 11명의 환자에서 CFTR을측정하였으며, 7번, 3번 환자들에서 각각 ER-β와 유사한 증가 및 감소양상을 보였다(b).

실시예 8. PDZK1 의 과발현에 의한 세포 내 칼슘 이온 유입 유도 및 멜라노좀의 전달 촉진

멜라닌 생성의 조절에서, 세포내 pH와 세포 내로의 칼슘이온의 유입의 관계 및 칼륨 의존적 나트륨-칼슘 교환 패밀리의 하나인 NCKX5(SLC24A5)의 관계가 언급되고 있다. 이와 함께 에스트로겐 수용체를 통한 세포내에서의 칼슘 이온의 증가는 PDZK1 유도 멜라닌생성에 칼슘 이온의 유입이 참여한다는 것을 암시한다. 따라서, PDZK1의 과발현 유도에 의한 칼슘 이온의 유입 여부를 확인하였다.

PDZK1의 과발현 유도를 하거나 또는 유도하지 않은 배양된 멜라닌세포를 칼슘 표지를 위한 Fluo-3를 이용하여 염색한 후, 각질형성세포 내 칼슘이온의 농도를 FACS 분석을 이용하여 측정하였다. 칼슘 킬레이터로써 EGTA를 사용하였다. 또한, PDZK1의 과발현 유도에 의한 멜라노좀의 전달 촉진을 확인하기 위하여, PDZK1 과발현 유도를 하거나 또는 유도하지 않은 멜라닌 세포-각질형성세포 공동배양에서 항-TYRP-1 및 항-K14 항체를 사용하여 FACs 분석을 수행하였다. 칼슘 킬레이터로써 EGTA의 처리가 ERM과 Rac1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)의 인산화에 어떠한 영향을 미치는지 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다.

결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, PDZK1 과발현 유도 멜라닌 세포는 Myc-형질감염된 대조세포와 비교하여 상대적으로 증가된 형광을 방출하였으며 이를 통해 PDZK1의 과발현은 칼슘 이온의 세포내 유입을 유도하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05)(a) 또한, PDZK1의 과발현에 의하여 과발현이 유도된 이온전달체 NHE, CFTR 및 SLC26A3은 칼슘이온 킬레이터인 EGTA를 이용하여 칼슘이온을 제거하자 발현양이 감소하는 것을 확인하였으며(p<0.05), 이를 통해 멜라닌 생성에서의 칼슘이온의 필수적인 역할을 확인할 수 있었다(b). 또한, PDZK1의 과발현은 뚜렷하게 TYRP-1 및 K14 동시 양성 세포의 비율을 증가시키는 것(p<0.02)을 FACs 분석을 통해 확인함으로써 PDZK1 과발현은 색소 증가에 참여하는 멜라노좀의 전달을 촉진시키는 것을 확인하였다(c). PDZK1 과발현에 의해 증가된 인산화된 Rac1 및 ERM이 칼슘 킬레이터 EDTA에 의하여 억제(p<0.05)되는 것을 통해 칼슘에 PDZK1에 의해 유도된 멜라노좀의 전달에서의 칼슘 이온의 역할은 Rac1 및 ERM을 통해 이루어지는 것을 확인하였다(d).

실시예 9. 각질형성세포에서 PDZK1 의 과발현에 의한 칼슘이온유입 및 표피 결합

PDZK1의 과발현의 효과를 각질형성세포에서 확인하였다. 각질형성세포에 0, 10, 100nM의 에스트로겐을 처리한 후, PDZK1과 티로시나아제의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한, PDZK1의 과발현 24 시간 후, 각질형성세포의 총 세포용해물에서 ER-α 및 ER-β 의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하고 PDZK1의 과발현의 유무에 따른 각질형성세포에서의 세포내 칼슘의 농도 변화를 FACS 를 이용하여 측정하였다.

결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 에스트로겐 처리에 의하여 각질형성세포에서 PDZK1의 발현이 증가되었으며, 과발현된 PDZK1은 뚜렷하게 ER-α 및 ER-β 의 발현을 증가시켰다(p< 0.05). 이는 멜라닌 세포 단독 배양 및 멜라닌 세포-각질형성세포 공동배양에서의 결과와 동일한 결과였다(a). PDZK1 과발현에 의한 세포 내 칼슘 농도의 전위 변화는 또한 Myc-형질감염 대조 세포에 비하여 각질형성세포에서 상대적인 형광 방출 강도를 뚜렷하게 증가시켰다(p<0.05)(b).

세포내 칼슘이온의 증가는 각질형성세포의 분화를 유도하므로, PDZK1 발현이 상향 조절된 각질형성세포에서 칼슘이온 유입의 증가에 의한 각질형성세포의 분화가 촉진될 것으로 예측하였다. 따라서, 각질형성세포 분화마커 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 각질형성세포 배양 또는 각질형성세포와 멜라닌세포 공동배양의 총 세포 용해물에서 K14 및 K10, 인볼루크린(involucrin)의 발현을 PDZK1의 과발현 또는 이오노포어(ionophore) 처리 24시간 후 웨스턴 블랏으로 확인하였다.

결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, PDZK1의 발현이 상향 조절된 각질형성세포에서 인볼루크린의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(a). 칼슘 이오노포어를 처리한 후의 인볼루크린과 K10, K14 발현의 변화를 확인한 결과 각질형성세포의 초기 분화 마커인 K10의 발현은 감소하여 PDZK1의 과발현에 의한 결과와 유사하게 나타났다. 그러나, K14 발현 변화는 PDZK1 과발현 세포와 칼슘 이오노포어를 처리한 세포에서 다르게 나타났다(b).

실시예 10. 색소과다침착부위에서의 경피수분손실량 측정

10.1 정상부와 기미 병변부에서 경피수분손실량의 측정

칼슘의 양은 피부 표피막의 유지 및 표피 손상의 회복에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 기미 병변 부위인 색소과다침착 부위에서의 경피수분손실량(transepidermal water loss; TEWL)을 정상부의 피부와 비교하기 위하여, 18명의 여자 피험자(나이: 32-58세)를 대상으로 경피수분손실량을 확인하였다. 비교는 온도를 20-25도, 습도를 40-60%로 맞춘 별도의 방에서 수행하였다. 5명은 온도와 습도 등의 조건만을 맞추고 세안은 프로토콜대로 시행하지 않았으며, 다른 13명은 온도 습도 조건 및 세안을 모두 프로토콜대로 시행하였다. 기미가 나타나는 색소과다침착 부위와 정상부에서 피부의 수분을 3회 반복 측정하여 평균값을 구하였다. 구체적인 피실험군의 조건 및 결과를 표 1에 나타내었다.

번호	이름	성별	나이	MASI	병변부 TEWL	정상부 TEWL	TEWL 조건
1	이x미	F	44	4.5	16.4	7.8	온, 습도 조건맞춤
2	강x옥	F	41	10.5	9.4	9.7	온, 습도 조건맞춤
3	이x수	F	35	6	9.1	7.1	온, 습도 조건맞춤
4	조x휘	F	48	7	8.5	12	온, 습도 조건맞춤
5	최x옥	F	51	9.5	10.4	17.4	온, 습도 조건맞춤
6	박x희	F	46	15.5	9	6.9	온, 습도, 세안, 3회 측정
7	이x희	F	43	6.5	10.5	10.2	온, 습도, 세안, 3회 측정
8	박x희	F	34	2.4	15.5	11.8	온, 습도, 세안, 3회 측정
9	권x현	F	32	8.4	8.2	9.3	온, 습도, 세안, 3회 측정,
10	김x옥	F	58	25.2	10.7	8.1	온, 습도, 세안, 3회 측정
11	전x옥	F	54	13.5	10	8.7	온, 습도, 세안, 3회 측정
12	조x자	F	32	12.5	13.5	9.3	온, 습도, 세안, 3회 측정
13	진x경	F	38	4.8	7.9	5.1	온, 습도, 세안, 3회 측정
14	황x리	F	56	1.8	8.2	6.5	온, 습도, 세안, 3회 측정
15	송x희	F	47	18.5	6.6	7.3	온, 습도, 세안, 3회 측정
16	KxxA	F	51	15	12.8	10.3	온, 습도, 세안, 3회 측정
17	송x숙	F	48	7.2	9.1	7.9	온, 습도, 세안, 3회 측정
18	송x원	F	49	16.5	10.5	9.1	온, 습도, 세안, 3회 측정

표 1에 나타낸 바와 같이, 세안을 프로토콜대로 시행하지 않은 5명의 경우 2명은 색소과다침착부위에서 경피수분손실량이 높았으나 3명은 정상부에서 높게 나타났다. 반면 프로토콜대로 시행한 세안을 수행한 13명에서는 경피수분손실량이 정상부에서 2명, 색소과다침착부위에서 11명이 높게 나타나 통계적으로 색소과다침착부위에서 정상부에 비하여 경피수분손실량의 유의한 증가를 나타내었다(p=0.005). 이러한 결과는 Kendall's Tau_b와 Spearman's rho 방법을 이용한 둘 간의 상관관계 조사에서도 유의성있는 결과임을 확인하였으며(p=0.002, 0.003), 전체 실험군 분석 결과 실험군인 18명 모두 색소과다침착부위에서 유의한 증가와 (p=0.045) 상관관계 (p=0.044)를 보였다. 따라서, 기미 병변부에 적절한 보습을 함으로써 기미 증상을 호전할 수 있음을 확인하였다.

10.2 PDZK1 발현 억제제 또는 활성억제제를 포함하는 화장료 제형(영양화장수) 처리에 의한 병변부의 경피수분손실량의 변화

상기 10.1의 피험자의 색소과다침착 부위의 피부에 본 발명의 제제예 2의 방법으로 제조된 PDZK1 발현 억제제 또는 활성억제제를 포함하는 영양화장수를 처리한 후, 기미 병변부인 색소과다침착부위의 수분을 측정하여 경피수분손실이 개선되는지 확인하였다.

결과를 표 2에 나타내었다.

번호	이름	성별	나이	MASI	병변부 TEWL	정상부 TEWL	제제예2의 영양화장수 도포 후 병변부의 TEWL
1	이x미	F	44	4.5	16.4	7.8	8.3
2	강x옥	F	41	10.5	9.4	9.7	9.4
3	이x수	F	35	6	9.1	7.1	8.4
4	조x휘	F	48	7	8.5	12	8.6
5	최x옥	F	51	9.5	10.4	17.4	10.4
6	박x희	F	46	15.5	9	6.9	7.3
7	이x희	F	43	6.5	10.5	10.2	10.2
8	박x희	F	34	2.4	15.5	11.8	12.1
9	권x현	F	32	8.4	8.2	9.3	8.0
10	김x옥	F	58	25.2	10.7	8.1	9.5
11	전x옥	F	54	13.5	10	8.7	8.9
12	조x자	F	32	12.5	13.5	9.3	10.2
13	진x경	F	38	4.8	7.9	5.1	5.5
14	황x리	F	56	1.8	8.2	6.5	7.3
15	송x희	F	47	18.5	6.6	7.3	6.4
16	KxxA	F	51	15	12.8	10.3	10.4
17	송x숙	F	48	7.2	9.1	7.9	8.1
18	송x원	F	49	16.5	10.5	9.1	10.4

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 제제예 2의 방법으로 제조된 본 발명의 영양화장수를 피험자의 기미 병변부에 도포한 결과 병변부인 색소과다침착 부위의 경피수분손실량이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

제제예1 . 유연화장수(스킨로션) (단위: 중량%)

PDZK1 발현 억제제 또는 활성 억제제 0.1~0.2

부틸렌글리콜 2.0

프로필렌글리콜 2.0

카르복시비닐폴리머 0.1

피이지-12 노닐페닐에테르 0.2

폴리솔베이트 80 0.4

에탄올 10.0

트리에탄올아민 0.1

방부제, 색소, 향료 적량

제제예 2. 영양화장수( 밀크로션 ) (단위: 중량%)

PDZK1 발현 억제제 또는 활성 억제제 0.1~0.2

밀납 4.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 1.5

유동파라핀 0.5

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0

글리세린 3.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

카르복시비닐폴리머 0.1

트리에탄올아민 0.2

방부제, 색소, 향료 적량

Claims (6)

1. PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 PDZK1 발현 억제제는 PDZK1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 PDZK1(PDZ domain containing 1) 활성 억제제는 PDZK1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(mimetics), 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제는 각질형성세포 내 칼슘 이온의 유입을 억제하는 것을 특징으로 하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 PDZK1(PDZ domain containing 1) 발현 억제제 또는 활성 억제제는 각질형성세포 내 칼슘 이온의 유입 억제를 통해 색소과다침착부위의 경피수분손실을 감소시키는 것을 특징으로 하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 PDZK1 발현억제제 또는 활성 억제제의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.01~5중량%인 것을 특징으로 하는, 기미예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
   

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