KR20120111221A

KR20120111221A - 블랙베리 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20120111221A
Application number: KR1020110029608A
Authority: KR
Inventors: 정일윤; 진창현; 서권일; 강시용; 김동섭
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2012-10-10

Abstract

본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 블랙베리 추출물이 CCl₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에서 항산화 효소의 활성을 증가시켜, 산화 스트레스에 대하여 보호 작용을 나타내며, 간 손상을 회복시키는 효과를 확인함으로써, 블랙베리 추출물이 간 기능 보호용 약학적 조성물, 특히 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다는 것을 밝혔다.

Description

블랙베리 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition comprising blackberry extract for protecting liver}

본 발명은 블랙베리 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물, 및 간 기능 개선용 건강식품에 관한 것이다.

슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 과산화수소 및 하이드록실라디칼(hydroxyl radical)과 같은 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 제노바이오틱스(xenobiotics), 약물, 중금속, 자외선(UV), 및 이온화방사선(ionizing radiation)과 같은 다양한 인자에 의해서 유도된다. 비록, ROS가 정상 생리학적 상태에서 중요한 역할을 담당하지만, 높은 수준의 ROS는 단백질, 지질 및 DNA와 같은 다양한 세포의 생물분자에 손상을 유발시키며(Kaspar, J.W., et al., Free Radical Biology and Medicine , 2009), 노화, 암, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 당뇨 및 퇴행성 뇌질환과 연관되어 왔다(Wiseman, H., et al., Biochemical Journal, 1996). 살아있는 유기체는 ROS 형성을 방지하거나 또는 ROS를 무독화시키기 위한 다양한 기작을 발달시켜왔다. 이러한 기작은 과산화물제거효소(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(CAT, catalase) 및 글루타티온 페옥사이드(glutathione peroxidase, GPx)와 같은 항산화 효소 및 글루타티온(glutathione, GSH), 요산(uric acid), 및 비타민 C 및 E와 같은 비효소 항산화물질이 관련된다(Issa, A.Y., et al., Journal of Food Composition and Analysis, 2006; Mohammadi, M. et al., Food and Chemical Toxicology, 2009).

블랙베리(blackberry)(Rubus fruticosus L.)는 우수한 천연 항산화제로서, 다양한 치료 목적으로 사용되어 왔다. 근래의 연구에서 블랙베리는 암 및 심혈관 질환의 위험을 감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Cuevas-Rodriguez et al., 2010a). 블랙베리는 안토시아닌(anthocyanin)과 플라보놀(flavonol), 페놀산(phenolic acid), 엘라그산(ellagic acid), 비타민 C 및 E와 같은 다른 항산화물질을 다량 포함하고 있다고 알려졌다(Bowen-Forbes, C.S., et al., Journal of Food Composition and Analysis, 2010). 블랙베리의 주요 폴리페놀(polyphenolic) 화합물인 안토시아닌(anthocyanin)은 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 과산화수소 및 하이드록실라디칼(hydroxyl radical)과 같은 다양한 ROS의 스캐빈저(scavenger)이다(Cuevas-Rodriguez et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 9542-9548, 2010). 다양한 연구에서 항산화 물질 및/또는 항염증제로서의 잠재적인 생물학적 이점에 대해서 보고된바 있다(Hassimotto, N.M.A., et al., Journal of the Science of Food and Agriculture , 2010). 그러나, 블랙 베리 추출물의 산화 스트레스에 대한 기능적 역할에 대해서 알려진 바가 매우 적다.

CCl₄(carbon tetrachloride)는 대표적인 급성 간 독성 유발 물질로 현재까지 CCl₄의 정확한 작용기전은 알려져 있지 않으나 체내로 흡수된 CCl₄가 간장 내 약물대사 효소계에 의해 ?CCl₃ (trichloromethyl radical)로 대사되어 세포막의 지질과산화를 초래하여 막의 구조와 기능을 파괴함으로써 간 세포 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 세포막의 구조와 기능이 파괴되게 되면 간 세포질 내에 널리 존재하는 효소인 알라닌 아미노전이효소(Alanine Aminotransferase, ALT) 및 아스파진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST)가 혈액으로 유출되므로 혈액 내 ALT 및 AST수치는 간손상의 지표로 빈번히 사용되고 있다.

또한, CCl₄에 의한 간 손상의 주된 기전이 CCl₃에 의한 산화적 손상과 밀접히 관련되어 있으므로 지질과산화와 간장 내 GSH 함량을 측정하여 세포의 산화적 손상과의 연관성을 알아볼 수 있다. 지질과산화는 세포막의 투과성을 항진시킬 뿐 아니라 전반적인 세포 독성을 초래하여 세포 기능 저하 및 괴사에 관여하여 이에 따른 여러 가지 질환의 병리 현상을 유발하므로 병적 현상이나 조직의 손상 정도를 나타내는 지표로 이용되며, 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)가 지질과산화의 최종 산물이다.

이에, 본 발명자들은 간 손상을 유발시킬 수 있는 CCl₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에 본 발명에 따른 블랙베리 추출물을 처리하였을 때, 항산화 효소의 활성을 증가시켜, 산화 스트레스에 대하여 보호 작용을 나타내며, 간 손상을 회복시키는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물, 및 간 기능 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 블랙베리 추출물은 간 독성을 유발한다고 알려진 CCl₄ 처리에 의해서 유도된 급성 간 독성 모델에서 산화 스트레스에 대한 보호효과 및 간 손상을 회복시키는 효과를 보이므로, 본 발명의 블랙베리 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 간 기능 보호용 약학적 조성물 또는 상기 목적의 건강식품의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 산화 스트레스 억제 효과를 나타낸 그래프이다:
#: 대조군에 대하여, p<0.01;
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05; 및
**: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.01.
도 2는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 항산화 효소 활성 증가 효과를 나타낸 그래프이다:
도 2의 A는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 SOD(Superoxide dismutase)의 활성을 나타낸 그래프이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.05;
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05;
도 2의 B는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 CAT(Catalase)의 활성을 나타낸 그래프이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.05;
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05;
도 2의 C는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 GPx 활성을 나타낸 그래프이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.05;
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05;
도 2의 D는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 GR 활성을 나타낸 그래프이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.05; 및
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05.
도 3은 블랙베리 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 간 보호효과 측정한 그래프이다:
도 3의 A는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 처리에 의하여 유도된 간 손상의 회복을 혈청내 아르파라진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST) 수준을 통하여 확인한 그래프이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.001;
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05;
도 3의 B는 블랙베리 추출물의 CCl₄ 처리에 의하여 유도된 간 손상의 회복을 혈청내 알라닌 아미노전이효소(Alanine Aminotransferase, ALT) 수준을 통하여 확인한 그래프이다;
#: 대조군에 대하여, p<0.001;
*: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.05; 및
**: CCl₄ 처리군에 대하여, p<0.01.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 보호용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분인 블랙베리 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 블랙베리를 분쇄하는 단계;

2) 단계 1)의 분쇄한 블랙베리를 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출하는 단계; 및

3) 단계 2)의 추출물을 여과 및 건조하는 단계;

본 발명의 제조방법에 있어서, 단계 1)의 블랙베리는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 단계 2)의 알코올은 C₁ 내지 C₃의 저급 알코올 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 용매는 에탄올과 염산을 혼합하여 사용하는 것이 가장 바람직하며, 에탄올과 염산은 99:1(v/v) 내지 95:5(v/v)의 비율로 혼합한 혼합물을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 용매의 양은 생약 중량의 2 내지 10 배로, 바람직하게는 3 ~ 4배로 하는 것이 바람직하며, 3배로 하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 용매를 가한 후 상온에서 침지시켜 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 추출시 용매의 온도는 20℃ ~ 30℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 추출시간은 30분 ~ 18시간이 바람직하며, 1 ~ 12시간이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러 추출 횟수는 1 내지 3회인 것이 바람직하며, 1회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법에 의하여 블랙베리를 추출, 여과시켜 블랙베리 추출물을 수득하였다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 단계 3)의 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 있어서, 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 블랙베리 추출물을 투여한 후 간 독성을 유발하는 CCl₄를 투여하였을 때, CCl₄ 투여에 의해서 증가된 간의 지질과산화가 감소하는 것을 확인하였으며, 이러한 지질과산화 억제 효과는 투여한 블랙베리 추출물의 농도가 증가할수록, 이에 비례하여 억제효과가 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 블랙베리 추출물의 산화 스트레스에 대한 보호효과를 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 블랙베리 추출물을 투여한 후, 간 독성을 유발하는 CCl₄를 투여하였을 때, 항산화 효소인 SOD, CAT, GPx, 및 GR의 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2 참조). 따라서, 블랙베리 추출물의 산화 스트레스에 대한 보호작용이 항산화 효소의 활성을 증가시킴으로써 일어나는 것임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 블랙베리 추출물의 간 보호효과를 확인하기 위하여, 블랙베리 추출물을 투여한 후, 간 독성을 유발하는 CCl₄를 투여하였을 때, 간 손상 지수인 ALT와 AST가 유의하게 감소함으로써, 블랙베리 추출물이 간 보호효과가 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 블랙베리 추출물은 CCl₄ 투여에 의해서 유발되는 산화 스트레스에 대하여, 항산화 효소의 활성을 증가시키며, 간 손상을 완화시키는 효과를 보이므로, 본 발명에 따른 블랙베리 추출물을 간 기능 보호용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있으며, 특히 간독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다.

비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 조성물은 투여를 위해서 블랙베리 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별 및 비만의 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 간 기능 개선용 약학적 조성물은 블랙베리 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 블랙베리 추출물은 산화 스트레스에 대하여 보호효과를 보이며, 간 손상을 완화시키는 효과를 나타내므로, 이러한 블랙베리 추출물을 간 기능 개선용 건강식품으로 유용하게 사용할 수 있으며, 또한 본 발명에 따른 블랙베리 추출물을 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품에 있어서, 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 블랙베리 추출물은 식품학적으로 허용된 담체와 혼합하여 식품 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명의 블랙베리 추출물을 식품 또는 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 블랙베리 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 블랙베리 추출물의 혼합양은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우, 상기 블랙베리 추출물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 장기간 복용이 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

음료수로 제형화할 경우에 블랙베리 추출물 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이제 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제[타우마린, 스테비아 추출물(예, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(예, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 블랙베리 추출물의 제조

동결건조기를 이용하여 잘 말리고 잘게 부순 블랙베리 0.5 Kg에 에탄올(Et-OH)/염산(HCl)(99:1, v/v) 1.5ℓ를 넣고 -20℃에서 3일간 추출하였다. 0.45 uM 사이즈의 포어(pore)를 갖는 여과지로 여과한 다음, 25℃에서 감압하에 농축하여 붉은색 추출물을 얻었다. 추출물을 동결건조기로 건조시켜 유효성분을 함유하는 블랙베리 추출(21.3g)을 얻었다. 여과액은 증발시켜, 하기 실험예에 사용하였다.

< 실시예 2> 실험동물의 사육

6 주령의 수컷 Sprague-Dawley 래트(150 ± 10 g)(오리엔트바이오, 한국)은 표준 환경 조건에서 1주일간 순응시키며, 표준식이와 물을 자유식이로 섭취하게 하였다. 상기 랫트는 12/12시간의 명-암 주기로 에어컨디션 방에서 유지되었다. 본 발명에서 사용한 모든 실험 프로토콜은 한국 원자력 연구원의 동물 실험윤리위원회(KAERI-IACUC)에서 인증된 실험 동물 관리 및 이용 가이드라인에 따라 수행하였다.

< 실시예 3> CCl ₄ 에 의해서 유도된 간 손상 동물 모델의 제조

6주령 랫트를 임의로 한 그룹당 6마리로, 6그룹으로 나누었다: 그룹 1) 올리브 오일(olive oil)과 식염수 공급, 그룹 2) CCl₄ 1 g/kg과 식염수 공급, 그룹 3) CCl₄1 g/kg과 블랙베리 에탄올/염산 추출물 100 ㎎/㎏ 공급, 그룹 4) CCl₄ 1 g/kg과 블랙베리 에탄올/염산 추출물 200 ㎎/㎏ 공급, 그룹 5) CCl₄ 1 g/kg과 블랙베리 에탄올/염산 추출물 400 ㎎/㎏ 공급, 및 그룹 6) 올리브 오일과 블랙베리 에탄올/염산 추출물 400 ㎎/㎏ 공급.

블랙베리 에탄올/염산 추출물은 일반 식염수에서 제조되었으며, 50% CCl₄는 올리브 오일에서 제조되었다. 식염수를 이용하여 제조된 블랙베리 에탄올/염산 추출물은 15일 동안, 400 ㎕ 씩 하루에 한번 구강으로 투여되었다. 그룹 1), 2)는 블랙베리 에탄올/염산 추출물 투여군과 동일하게 식염수 400 ㎕를 15일 동안 하루에 한번 구강으로 투여하였다. 마지막 투여 3시간 후, 랫트에 올리브 오일을 이용하여 제조된 CCl₄ 300 ㎕를 복강으로 투여하였다. 그룹 1), 6)은 올리브 오일만 300 ㎕를 복강으로 투여하였다. 그 후, 18시간 동안 절식하였으며 그 후 모든 랫트를 안락사시켰다.

혈액은 혈청의 아스파라진산 아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase, AST) 및 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT) 활성을 측정하기 위하여, 에테르(ether)를 이용하여 상기 랫트를 마취시킨 후, 후대 정맥(postcaval vein)으로부터 채취하였다. 또한, 상기 간은 신속하게 채취하여, 항산화 효소 분석에 사용하였다.

< 실험예 1> 블랙베리 추출물의 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 산화 스트레스 억제 효과 확인

CCl₄는 사이토크롬(cytochrome) P450에 의해서 트리클로로메틸 자유잔기(trichloromethyl free radical, ?CCl₃)로 전환되며, 그 결과 트리클로로메틸 퍼옥사이드(trichloromethyl peroxide, Cl₃COO^-)가 형성되었다. 이러한 자유 잔기들은 염산, 단백질, 지질과 같은 세포 구성성분을 공격하며, 특히 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)을 공격하며, 또한, 지질 과산화(lipid peroxidation)를 유발한다고 알려져 있다(Akindele, A.J. et al., Journal of Ethnopharmacology , 2010; Ozturk, I.C., et al., Cell Biochemistry and Function , 2009).

말론디알데하이드(Malondialdehyde, MDA)는 지질 과산화의 중요한 산물이다. 본 발명자들은 본 발명 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트의 간에서 지질 과산화의 정도를 측정하기 위하여, 말론디알데하이드(Malondialdehyde, MDA)의 농도를 측정하였다.

분석시약은 케이먼 케미컬(cayman chemical)에서 TBARS assay kit (Catalog No. 10009055)를 구입하여 분석하였다. TBA(Thiobarbituric acid)는 고온(90-100℃)에서 MDA와 반응하여 MDA-TBA 부산물을 만들며 530 ~ 540 ㎚에서 측정된다. 이러한 원리를 이용하여 TBARS assay kit를 이용하여 MDA농도를 측정할 수 있다. color 시약은 22 ㎎의 TBA와 TBA 초산(acetic acid), 수산화나트륨(Sodium hydroxide)을 혼합하여 만들었다. 신속하게 적출한 상기 간 조직 25 ㎎에 RIPA 버퍼 250 ㎕를 첨가하고 초음파를 쬐어 분해한 후 원심분리하여 조직 현탁액을 준비하였다. 먼저, 100 ㎕의 샘플에 키트에 포함된 SDS 용액 100 ㎕를 혼합한 후 4 ㎖의 color 시약을 첨가하여 100 ℃ 끓는 물에서 1시간 동안 끓였다. 얼음 위에서 10분간 식힌 후 1600 g, 4℃에서 원심분리하여 실온에 30분간 방치한 후 분광광도계를 이용하여 532 ㎚에서 흡광도를 측정하여 MDA 농도를 계산하였다.

그 결과, 하기 도 1에 나타난 바와 같이, CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서는 CCl₄를 투여하지 않은대조군 랫트에 비하여 MDA 수준이 현저히 높았다. 그러나, 블랙베리 에탄올/염산 추출물을 먼저 투여한 후, CCl₄를 투여한 랫트에서는 블랙베리 에탄올/염산 추출물의 투여 농도가 100 ㎎/㎏에서 400 ㎎/㎏으로 증가할수록 MDA 수준이 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 블랙베리 에탄올/염산 추출물이 랫트의 간에서 CCl₄에 의해서 유도되는 지질 과산화 억제를 통하여 산화 스트레스를 감소시킬 수 있다는 것을 나타냈다(도 1).

< 실험예 2> 블랙베리 추출물의 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 항산화 효소 활성 증가 효과 확인

본 발명에 따른 블랙베리 에탄올/염산 추출물의 CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 산화 스트레스에 대한 보호효과를 측정하기 위하여 본 발명자들은 항산화 효소의 활성을 측정하였다.

SOD(Superoxide dismutase), CAT(Catalase), GPx, 및 GR 활성은 Cayman Chemical에서 구입한 키트를 이용하여 측정하였다. 상기 <실시예 3>의 6개 군의 CCl₄유도 급성 간 독성 랫트로부터 채취한 혈액 샘플을 상온에서 30분동안 응고되게 하였다. 상기 혈액 혈청은 4℃에서 15분 동안 2,000g 이상에서 원심분리하였다.

그 결과, 도 2의 A 및 B에 나타난 바와 같이, 항산화 효소인 SOD와 CAT의 활성은 CCl₄를 투여하지 않은대조군 랫트에 비하여, CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서 약 70% 감소하였다. 그러나 본 발명에 따른 블랙베리 에탄올/염산 추출물을 미리 투여한 후, CCl₄를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 블랙베리 에탄올/염산 추출물의 투여 농도가 100 ㎎/㎏에서 400 ㎎/㎏으로 증가할수록 SOD와 CAT의 활성이 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 A 및 B).

또한, 도 2의 C 및 D에 나타난 바와 같이, 항산화 효소인 GPx와 GR의 활성이 CCl₄유도 급성 간 독성 랫트의 간에서 CCl₄를 투여하지 않은대조군 랫트에 비하여 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 블랙베리 에탄올/염산 추출물을 미리 투여한 후, CCl₄를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 블랙베리 에탄올/염산 추출물의 투여 농도가 100 ㎎/㎏에서 400 ㎎/㎏으로 증가할수록 GPx와 GR의 활성이 대조군에 비하여 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 2의 C 및 D).

또한, SOD, CAT, GPx, 및 GR의 활성은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 블랙베리 에탄올/염산 추출물만을 투여한 군 사이에서 차이가 보이지 않았으며, 이렇게 증가한 효소의 활성은 지질과산화 분석의 결과와 일치하였다.

< 실험예 3> 블랙베리 추출물의 CCl ₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서의 간 보호효과 확인

CCl₄에 의한 간 손상은 세포막의 투과성(permeability)을 증가시키고, 간에서 혈액으로 급성 간 손상의 표지로 알려진 AST와 ALT를 분비시킨다(Adesanoye, O.A., et al., Experimental and Toxicologic Pathology, 2010; Ranawat, L., et al., Journal of Ethnopharmacology, 2010). 본 발명자들은 혈청 AST와 ALT의 수준을 간 손상의 지표로서 측정하였다.

AST와 ALT의 수준은 임상 생화학 자동 분석기(biochemistry automatic analyzer)(Hitachi Model 7180, Japan)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, CCl₄ 유도 급성 간 독성 랫트에서는 대조군 랫트에 비하여 AST와 ALT의 수준이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 흥미로운 점은, 본 발명에 따른 블랙베리 에탄올/염산 추출물(100, 200, 400 ㎎/㎏)을 미리 투여한 후, CCl₄를 투여하여 제조한 간 독성 랫트에서는 AST와 ALT의 수준이 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 지질 과산화 분석에 의해서 측정된 감소된 간 손상의 산화 스트레스와 일치하였다(도 3).

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 블랙베리 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 블랙베리 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 블랙베리 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

본 발명의 블랙베리 추출물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

본 발명의 본 발명의 블랙베리 추출물 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<제조예 2> 식품의 제조

<2-1> 과자 및 분식의 제조

본 발명의 본 발명의 블랙베리 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 유제품의 제조

본 발명의 본 발명의 블랙베리 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-3> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 본 발명의 본 발명의 블랙베리 추출물 을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 본 발명의 블랙베리 추출물 의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명의 실시예 <1-3> 추출물의 건조분말(3 중량부),

영지(0.5 중량부), 및

지황(0.5 중량부)

< 제조예 3> 음료의 제조

본 발명의 블랙베리 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 블랙베리 추출물은 간 손상을 유발시킨다고 알려진 CCl₄ 처리에 의해서 유도되는 산화 스트레스 및 간 손상에 대하여 보호효과를 나타내므로, 블랙베리 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 간 기능 보호용 약학적 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 블랙베리 추출물은 물, C₁ 내지 C₃ 저급알코올 또는 이들의 혼합물로 추출되는 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 블랙베리 추출물은 에탄올과 염산을 99:1(v/v) 내지 95:5(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
블랙베리(Rubus fruticosus L.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품.
제 6항에 있어서, 상기 블랙베리 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물로 추출되는 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품.
제 6항에 있어서, 상기 상기 블랙베리 추출물은 에탄올과 염산을 99:1(v/v) 내지 95:5(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품.
제 6항에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 개선용 건강식품.