KR20120102499A

KR20120102499A - 진단 방법으로서의 ｉｇｆｂｐ-4 단편의 검출

Info

Publication number: KR20120102499A
Application number: KR1020117031706A
Authority: KR
Inventors: 알렉세이 지. 카트루카; 알렉산더 비. 포스티니코프; 타티아나 아이. 솔로프예바; 알렉세이 브이. 카리토노프
Original assignee: 휘테스트 리미티드
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2012-09-18
Also published as: KR101767611B1; US20120178113A1; EP2448969A1; WO2011001029A1; JP2012531396A; CN102471379A; JP5840605B2; US9964549B2; CN102471379B; EP2448969A4; EP2448969B1; US9012610B2; US20150219671A1; FI20095733A0

Abstract

본 발명은 환자의 시료에서 IGFBP-4 (인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질-4) 단편들을 검출함으로써 심혈관계 질환 또는 암 질환을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들에 대한 항체의 특이적 인식도 역시 기재된다.

Description

진단 방법으로서의 ＩＧＦＢＰ-4 단편의 검출{DETECTION OF IGFBP-4 FRAGMENTS AS A DIAGNOSTIC METHOD}

본 발명은 환자의 혈액에서 IGFBP-4 (인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질-4)단편을 검출하는 것을 포함하는, 심혈관계 질환 및 암 질환 등의 인간 질환의 진단을 위한 방법을 설명한다.

본 발명은 특이적 단백질 분해효소 PAPP-A에 의하여 IGFBP-4 분자의 분할 이후 그로부터 유래되는 IGFBP-4의 단백질 분해 단편들 (N- 및 C- 말단 모두)에 특이적인 항체 및 항체에 대한 에피토프를 제공한다. 이들 특정한 에피토프들을 인식하는 항체들은 오로지 IGFBP-4 단편에 대하여만 특이적이고, 온전한 길이의 IGFBP-4 분자와는 전혀 상호 반응하지 않거나 낮은 수준으로 반응한다. 항체들은 인간 혈액에서 IGFBP-4 단편의 정량적 또는 정성적 검출을 위한 면역분석 방법의 개발에 사용될 수 있다.

소마토메딘 (somatomedins)으로 이미 알려져 있는 인슐린 유사 생장 인자 I (IGF-I) 및 인슐린 유사 생장 인자 II (IGF-II)는 구조적으로 인슐린과 관련되어 있고 인간의 혈장에서 순환하는 가장 풍부한 두 가지 폴리펩티드 생장 인자들이다 (1). IGF들은 일반적인 조직 생장 및 재생을 담당하는 다분화성 생장 인자들이다. 게다가, IGF들은 그 포도당 저감화 활성과 인슐린 민감화 활성에 의하여 포도당 항상성에 유익한 효과를 나타내는 것으로 추측되어 왔다. 그러나, IGF의 모든 효과가 유익한 것으로 여겨지는 것은 아니며, 역학적 연구들은 IGF-I과 IGF-II가 일반적인 암, 동맥경화증 (atherosclerosis) 및 제2형 당뇨병의 발생에도 연관되어 있다고 추측하고 있다 (2). IGF들은 평활근 세포 및 대식세포 등 많은 유형의 세포에 의하여 분비된다. IGF들의 세포내 효과는 고친화성 막 결합 수용체에 의하여 매개된다. IGF 수용체들은 두 가지 이형으로 존재하고 매우 다양한 세포들에서 발현된다. IGF들은 강력한 평활근 세포 마이토젠 (mitogens)이고, 이들 폴리펩티드들은 측분비, 자기분비 또는 내분비 기작을 통하여 동맥경화증 병변 형성에 기여하는 것으로 여겨진다 (3).

혈장 및 기타 생물학적 유액에서, IGF는 소위 IGF 결합 단백질 (IGFBP)이라고 불리는 구조적으로 관련되어 있는 단백질군의 단백질들과 복합체를 형성한다. IGFBP는 순환하는 전체 IGF 중 대략 99%와 결합한다. 이러한 단백질 군은 6종 이상의 IGFBP들을 포함한다. IGFBP는 IGF 수용체와는 구별된다. IGFBP는 뼈 등 다양한 조직에서 IGF의 효과를 조절하는 것으로 여겨진다 (4).

IGFBP-4는 25 kDa 단백질로 인간 골세포 조정 배지 (conditioned medium)로부터 최초로 정제되었다. 후에 IGFBP-4는 다양한 세포 유형으로부터 수집된 조정 배지로부터도 정제되었고, IGFBP-4의 발현은 다양한 세포 유형에서 밝혀졌다 (5, 6). 인간 IGFBP-4 단백질의 기본적인 구조는 인간 태반 및 골육종 (osteosarcoma)의 상보적 DNA (cDNA) 라이브러리로부터 추론된다 (7, 8). 인간 IGFBP-4의 cDNA는 258개 잔기의 단백질을 인코딩하고, 시그널 서열이 제거되는 과정을 거쳐 하나의 아스파라긴 관련 글리코실레이션 부위를 가지는 237개 잔기의 성숙형 단백질 (25.6 kDa)이 된다 (7). 배양 중에 다양한 유형의 세포들이 글리코실레이션된 (28-29 kDa) 및 글리코실레이션되지 않은 (24-25 kDa) 유형의 IGFBP-4를 분비하지만, 정상적인 인간의 혈액 중에는 글리코실레이션되지 않은 것이 통상적으로 가장 많다 (5, 6).

6종의 IGFBP 중에서 IGFBP-4는 가변적인 L-도메인에 2개의 추가적인 시스테인 잔기를 갖는다는 점이 독특하다. IGFBP-4의 이러한 독특한 특성은 IGFBP-4의 고유한 생물학적 기능에 기여할 수 있다 (13).

성인 인간의 혈청 중에서 IGFBP-4의 평균 수준은 IGFBP-1, IGFBP-2 및 IGFBP-6보다 높고, IGFBP-5의 수준과는 비슷하며, IGFBP-3의 수준보다는 낮다. 혈청의 IGFBP-4가 연령에 따라 증가하는 경향은 IGFBP-1 및 IGFBP-2에 대하여 보고된 바과 유사하지만, IGFBP-3 및 IGFBP-5의 수준이 연령에 따라 낮아지는 것과는 다르며, 이는 인간의 혈청에서 다양한 IGFBP들의 수준이 연령이 증가함에 따라 상이하게 조절되고 있다는 것을 시사한다 (12).

혈청 IGFBP-4의 정확한 기능적 역할이 전적으로 명확한 것은 아니지만, 인 비트로 (in vitro) 연구는 IGFBP-4가 골세포 및 기타 유형의 세포에서 IGF 활성을 억제한다는 것을 보여주었다. 모한 (Mohan) 등 (9, 10)은 IGFBP-4가 닭 배아의 두개관 세포 (calvaria cells)와 MC3T3-E1 마우스 골 아세포 (osteoblasts)의 IGF-I 및 IGF-II 유발성 세포 증식을 억제한다는 것을 입증하였다. IGFBP-4는 다양한 유형의 세포에서 DNA 합성을 자극하였던 IGF-I 및 IGF-II를 억제하였다 (6).

IGFBP-4 합성은 전사 수준 또는 전사 후 수준에서 전신 호르몬 및 국소적 생장 인자에 의하여 조절될 수 있다 (11). 인 비트로 연구들은 부갑상선 호르몬, 1,25-디하이드록시비타민 D, IGF-I, IGF-II, 형질전환 생장 인자-베타 및 골 형성 단백질-1 (osteogenic protein-1)/골 형태 형성 단백질-7 (bone morphogenetic protein-7)이 인간 골세포에서 IGFBP-4의 주요 조절자들이라는 것을 밝혔다 (8, 9).

특이적 단백질 분해는 IGFBP-4 기능의 주요 조절 기작이다. IGF 의존성 IGFBP-4 특이적 단백질 분해효소는 인간 및 양의 피부 섬유아세포 (dermal fibroblasts) 양자 모두에 의하여 조정된 배지에서 최초로 보고되었다. 이 단백질 분해효소는 후에 임신 관련 혈장 단백질-A (PAPP-A)로 밝혀졌다. 인간의 골 아세포, 혈관 평활근 세포, 과립막 세포, 영양막 세포와 탈락막화된 자궁내막 기질 세포 (decidualized endometrial stromal cells)로부터의 조정 배지 및 난포액과 인간 임신 혈청 중에서도 역시 동일한 단백질 분해 활성이 검출되었다 (13).

PAPP-A는 대용형 호산구 주염기성 단백질 (proform of eosinophil major basic protein, proMBP)과 함께 사합 복합체 (tetrameric complex)로서 1974년에 임신한 인간 혈청으로부터 최초로 단리되었다. PAPP-A가 금속 단백질 분해효소 거대군인 메트진신 (metzincin)군에 속한다는 것이 밝혀졌다. 재조합 PAPP-A는 유일한 위치인 M135/K136 (아미노산 잔기의 단일 글자 코드가 사용되었다) 사이에서 IGFBP-4를 분할할 수 있는 활성 단백질 분해효소임이 드러났다. PAPP-A에 의한 IGFBP-4의 분할은 IGFBP가 IGF와 복합체를 이룬 경우에만 가능하다. 또한, PAPP-A는 S143/K144 사이에서도 IGFBP-5를 분할할 수 있지만, 이 경우에 IGF가 존재하여야 하는 것은 아니다.

임신 관련 혈장 단백질 A는 바예스-제니스 (Bayes-Genis) 등에 의한 연구 후 처음에는 동맥경화반 (atherosclerotic plaques) 불안정성의 생물학적 마커 (marker)로 추측되었다. 이 저자들은 불안정한 플라크의 세포 외 기질에서 PAPP-A의 고수준을 입증하였다. 몇몇 연구는 급성 관동맥 증후군 (acute coronary syndrome, ACS)를 앓는 환자들의 혈액 중 PAPP-A의 농도가 안정형 관상 동맥 질환 (stable coronary artery-disease)을 앓는 환자들 또는 대조군 대상체들의 혈액에서보다 높다는 것을 보여주었다. 그러므로 PAPP-A는 관상 동맥 혈액 응고와 관련된 심혈관계 질환, 예컨대 불안정 협심증 (unstable angina) 및 심근 경색증 (myocardial infarction)의 마커로 추측되었다.

동맥경화반에서, 활성화된 평활근 세포에 의하여 발현된 PAPP-A가 IGF와 복합체를 이룬 IGFBP-4를 분할하는 활성 효소로서 기능할 수 있고, 그러므로 IGF의 생물학적 이용도를 증가시킬 수 있다는 가설이 세워졌다. IGF 시스템은 동맥경화반 발생, 탈안정화 및 급성 관동맥 사건을 일으키는 파열의 원인이 될 수 있다 (17).

IGFBP-4는 폐 선암 (lung adenocarcinoma), 비 소세포 폐암 (non- small-cell lung cancer), 유방암 (breast cancer), 결장암 (colon carcinoma), 갑상선 여포암 (follicular thyroid carcinoma), 위암 (gastric cancer), 신경교종 (glioma), 간암 (hepatoma), 골수종 (myeloma), 신경 모세포종 (neuroblastoma), 골육종 (osteosarcoma) 및 전립선암 (prostate cancer) 등 여러 가지 종양원 세포에 의하여 발현된다는 것이 알려졌다. 인 비트로 및 인 비보 (in vivo) 연구들은 아마도 자기분비적 IGF 활성을 억제함으로써 IGFBP-4가 다양한 종양의 생장 조절에 중요한 역할을 하는 것이라고 추측하고 있다. IGF의 생물학적 이용도를 조절하면 종양 생장 및 발생에 결정적인 역할을 할 수 있을 것이다 (13).

혈장의 PAPP-A 농도를 측정하면 불안정 동맥경화반을 가지고 있는 환자들의 변별 및 암 환자들의 동정에 가치가 있을 것이라는 가용 증거들이 제시되고 있다고 보여진다. 그러나, 정확한 혈중 PAPP-A를 측정하는 것이 쉽지 않다는 것이 현재 밝혀져 있다. 이것은 우선, 이 단백질이 환자의 혈장 중에 극히 낮은 수준으로 존재한다는 사실 때문이다. 또한, 헤파린을 주입하면 환자의 혈장 중 PAPP-A 수준에 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌다 (18).

본 발명자들은 PAPP-A 효소 활성의 산물을 측정하는 것이 PAPP-A를 직접 측정하는 것보다 임상적으로 큰 가치가 있을 것이라고 제안하였다. 그 이유는 이러한 산물들은 PAPP-A 보다 혈중에서 높은 농도로 존재할 것이고, 이들의 혈중 농도는 헤파린 주입에 의하여 영향을 받지도 않을 것이기 때문이다.

본 발명은 체내에서 PAPP-A 활성 증가의 마커, 그 결과로 PAPP-A 농도 및 활성의 증가와 관련된 여러 가지 질환들의 마커로서 IGFBP-4 단편을 활용하고자 하였다. 환자의 시료에 온전한 IGFBP-4가 존재한다고 하여도 IGFBP-4의 단백질 분해 단편을 특이적으로 측정하기 위하여 설계된 면역 분석 방법은 ACS 및 암 등의 다양한 병리의 진단 또는 예측에 실용적인 가치가 있을 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 심혈관계 질환 및 암 등 인간 병리에 대한 신규한 혈액 마커 - IGFBP-4의 단백질 분해 단편의 발견에 관한 것이다.

본 연구에서, 본 발명자들은 동맥경화반에서 발현된 PAPP-A가 활성 단백질 분해효소라는 것을 밝혀내었다. 동맥경화 혈관으로부터의 PAPP-A는 균질하게 정제되었고 IGF-II의 존재 하에서 효과적으로 IGFBP-4를 분할할 수 있음을 보여주었다. PAPP-A는 아미노산 잔기 M135와 K136 사이에서 IGFBP-4를 분할하여 2개의 IGFBP-4 단편을 제공하는데, 이름하여 "N-말단 단편" (온전한 IGFBP-4 분자의 N-말단으로부터 M135까지의 아미노산 잔기를 포함) 및 "C-말단 단편" (온전한 IGFBP-4 분자의 K136으로부터 C-말단까지의 아미노산 잔기를 포함)이다.

IGFBP-4 단백질 분해 단편들에 특이적이고 전장 분자와는 상호 반응성을 나타내지 않거나 반응성이 낮은 모노클로날 항체를 수득하였다. 이들 MAb들은 오로지 PAPP-A에 의하여 아미노산 잔기 M135와 K136 사이에서 분할된 IGFBP-4에 의하여 생긴 신규한 에피토프만을 인식할 수 있었고, 온전한 (전장) IGFBP-4 분자와는 상호 반응성이 없거나 낮았다. 특히, 본 발명의 항체들은, 그들이 전장 IGFBP-4를 인식하는 것보다 높은 친화도로 효소 의존적 IGFBP-4 분할에 의해 생성된 신규한 에피토프를 특이적으로 인식한다.

이들 단편 특이적 항체 중 하나와 온전한 IGFBP-4를 인식하는 또 하나의 항체를 짝지워 사용하여, 몇 가지 샌드위치 면역 분석법을 설계하였다. 이들 분석법들은 시료 중에 전장 IGFBP-4가 존재한다고 하여도 IGFBP-4 단편을 정량하기에 적합하다 (도 2B).

상기 면역 분석법은 ACS 환자 및 건강한 기증자의 혈액에서 IGFBP-4의 단백질 분해 단편 두 가지 모두를 측정하는데 응용된다. ACS 환자들의 혈중 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 수준이 건강한 기증자들의 혈중에서보다 현저히 높다는 것이 드러났다. ACS 환자들의 혈장에서 IGFBP-4 단편의 평균 수준은 건강한 기증자들의 혈장에서보다 3.2배 높았다 (p<0.0005), (도 3). 이러한 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 IGFBP-4의 단백질 분해 단편 두 가지 모두가 동맥경화반 탈안정화 및 파열의 마커로 사용될 수 있다고 제안하였다.

그러므로, 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 심혈관계 질환 등의 인간 병리에 대한 새로운 표지들로서 IGFBP-4 단편들, 환자의 혈액에서 IGFBP-4 단편들을 측정함으로써 ACS를 예후 및 진단하는 방법을 설명한다.

도면의 간단한 설명

도 1. 동맥경화 조직으로부터 정제된 PAPP-A의 단백질 분해 활성을 입증하기 위한 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 웨스턴 블롯 검출.

IGFBP-4 (레인당 200 ng)을 다음과 같이 처리하였다:

레인 1, 재조합 PAPP-A,

레인 2, 동맥경화 조직 PAPP-A,

레인 3, PAPP-A 처리하지 않음,

레인 4, 분자량 표준자, kDa으로 표시.

면역염색용으로 항IGFBP-4 래빗 폴리클로날 항체를 사용하였다.

도 2A. ELISA로 IGFBP-4 단편 특이적 MAb 시험:

전장 재조합 IGFBP-4 또는 PAPP-A 의존성 분할로 생성된 IGFBP-4 단편들 10 ng을 폴리스티렌 플레이트에 흡착시켰다. 세척 후, 단편 특이적 MAb들인 IBP3, IBP12, IBP27, IBP13 및 IBP28 (10 μg/ml)을 웰에서 30분간 교반하며 배양하였다. 특이적으로 결합한 항체들을 홀스래디쉬 과산화효소 (기질: TMB)와 짝지워 항마우스 IgG 폴리클로날 항체로 검출하였다.

도 2B. IGFBP-4 단편 특이적인 샌드위치 면역 분석법.

면역 분석법:

포획 MAbs: IBP513, IBP521 (200 ng/웰).

검출 MAbs: 안정한 Eu3+ 킬레이트로 표지한 IBP12, IBP27, 및 IBP30 (1 μg/ml).

항원: 전장 재조합 IGFBP-4 또는 PAPP-A 의존성 분할에 의하여 생성된 IGFBP-4 단편 100 ng/ml.

배양 부피: 0.1 ml.

배양 시간: 실온에서 30분.

CPS - 초당 계수 (counts per second); AU (450nm) - 450 nm에서 흡광도 단위.

도 3. 인간 혈장에서의 IGFBP-4 단편 검출.

면역 분석법:

포획 MAb: IBP521 (200 ng/웰).

검출 MAb: 안정한 Eu3+ 킬레이트로 표지한 IBP30 (1 μg/ml).

MAb IBP521는 전장 IGFBP-4 및 PAPP-A 매개 단백질 분해로 생성되는 그의 C-말단 단편을 인식한다.

MAb IBP30는, IGFBP-4의 C-말단 단편만을 특이적으로 인식하고 전장 IGFBP-4는 인식하지 않는다.

배양 부피: 0.1 ml. 배양 시간: 실온에서 30분. CPS - 초당 계수.

양호한 실시 상태들에 대한 상세한 설명

본 발명은, 건강한 기증자들의 혈장과 비교하였을 때 ACS 또는 일부 암 환자들의 혈장 시료에서 현저하게 높은 수준으로 존재하는 바이오마커로서 IGFBP-4의 N-말단 및 C-말단 단백질 분해 단편들을 설명한다. IGFBP-4 단편에 대한 면역 분석법은 ACS 또는 암의 조기 검출용으로, 또는 질병 발생의 위험도를 측정하기 위하여 사용될 수 있다.

IGFBP-4 펩티드 및 온전한 IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체들을 개발하기 위하여 표준 프로토콜을 따랐다. IGFBP-4 단편들에 특이적인 모노클로날 항체를 얻기 위하여 동물 면역화용으로 사용되는 합성 펩티드들은 PAPP-A 의존성 분할 부위의 IGFBP-4 단백질 분해 단편에 해당하였다. 합성 펩티드들은 커플링 목적을 위하여 추가적인 말단 시스테인을 함유하였다 (단백질 분해 추정 부위와는 반대편). 서열을 질량 분석기 분석으로 확인하고 펩티드들을 캐리어 단백질에 컨쥬게이션시켰다. 결과물인 컨쥬게이트들을 마우스 면역화를 위하여 항원으로 사용하였다.

펩티드와 결합한 모노클로날 항체들을 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 표준 기법 (19-20)에 따라 제조하였다. 몇 사이클의 동물 면역화 후에 마우스의 비장세포를 골수종 세포주와 융합시켰다. 이러한 프로토콜은 제조한 항체의 목적하는 특이성을 위하여, 형성된 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 단계도 역시 포함한다. 본 발명의 항체를 얻기 위하여, IGFBP-4 단백질 분해 단편에 해당하는, IGFBP-4 펩티드들에 특이적으로 결합하고, 동시에 온전한 IGFBP-4와는 반응하지 않는 하이브리도마 클론들이 스크리닝되었다. 이러한 접근은 IGFBP-4 단백질의 PAPP-A 의존성 분할 과정에서 형성되는, IGFBP-4의 신규한 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 몇 개의 하이브리도마 클론을 밝혀낼 수 있게 해준다 (도 2A).

상기 실험으로 PAPP-A 의존성 분할로 생성된 IGFBP-4 단백질 분해 단편들에 특이적이고, 온전한 IGFBP-4와의 상호 반응성이 5% 미만인 1군의 모노클로날 항체들이 제조되고 선택되었다. 그러나, 얻어진 상호 반응성 퍼센트는, 예컨대 사용된 방법에 의존적인 것이고, 5%라는 값을, 낮은 상호 반응성에 대한 한정적인 값으로 고려하여서는 아니된다.

온전한 전장 IGFBP-4의 존재 하에서도 IGFBP-4 단백질 분해 단편을 특이적으로 측정하기 위한 샌드위치 면역 분석법 개발용으로 적절한 2 부위 항체 조합을 찾기 위하여, 수득한 펩티드 특이적 항체를 온전한 (전장) IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체와 함께 샌드위치 면역 분석법으로 시험하였다. 온전한 IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체는 포획 항체로 사용된 반면, IGFBP-4 단백질 분해 단편에 특이적인 모노클로날 항체는 검출 항체로 사용되었다. 일부 실시 상태에 있어서, 항체들의 상반된 배치도 역시 가능하다. 본 발명에서 기재되는 샌드위치 면역 분석법은 IGFBP-4의 단백질 분해 단편에 대하여 고도로 특이적이었다 (도 2B).

본 발명에서, 개발된 샌드위치 면역 분석법의 검출 항체들은 안정한 Eu3+ 킬레이트로 표지되었다. 다양한 다른 실시 상태에 있어서, 검출 항체는 다양한 표준 방법들, 예컨대 발광, 화학발광, 형광, 흡광, 방사능 검출 등, 또는 현미경, 이미징 등을 사용하여 시각화되거나 검출될 수 있는 여러 가지 유형의 신호를 생성할 수 있는 다양한 유형의 표지들로 표지화될 수 있다. 면역 분석법은 면역조직화학, 효소흡착면역측정법 (ELISA), 웨스턴 블롯, 네펠로법 (nephelometry), 비탁법 (turbidimetry), 방사면역측정법, 측방 유동 (lateral flow), 면역조직/세포 화학 및 기타 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 방법들을 포함할 수 있다.

면역 분석법은 시료 중 바이오마커의 존재 또는 부존재 여부 및 시료 중의 바이오마커의 양을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 시료 중의 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 양은 레퍼런스 또는 표준, 예컨대 온전한 IGFBP-4 또는 시료 중에 존재하는 것으로 알려진 다른 폴리펩티드와 비교하여 (또는 이들에 대한 비율로서) 측정될 수 있다. 시료 중의 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 양은 레퍼런스 또는 표준, 예컨대 레퍼런스 또는 대조군 시료 중의 내재성 또는 재조합 또는 합성 IGFBP-4 단편의 양과 비교하여 측정될 수도 있다. 따라서, 시료 중의 바이오마커의 양은 절대량으로 정량되어질 필요는 없지만, 레퍼런스 또는 대조군에 대한 상대량으로 측정될 수 있다.

본 발명에서, ACS 환자의 혈장 시료 중의 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 검출이 수행되었다. IBP521-IBP30 샌드위치 쌍을 이용하여 상기 단편이 현저하게 증가함을 밝혔다 (도 3). 본 발명의 다양한 실시 상태는 ACS 발생 위험을 평가하기 위하여 환자의 혈장 시료에서 IGFBP-4의 N-말단 또는 C-말단 단편, 또는 C-말단과 N-말단 단편을 동시에 검출하는 것을 포함한다.

본 발명의 추가적인 실시 상태는 시료 중에서 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 검출 또는 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 양을 측정하기 위한 면역 분석 키트이다. 이 키트는 (i) IGFBP-4 단백질 분해 단편의 N-말단 또는 C-말단에 특이적인 모노클로날 항체와, (ii) 온전한 IGFBP-4의 임의의 적절한 에피토프에 특이적인 제2 모노클로날 검출 항체 및 (iii) 적어도 부분적으로는 IGFBP-4 단편의 서열에 해당하는 내재성 IGFBP-4 단편 또는 재조합 단백질에 대한 표준 또는 교정 제제를 포함할 수 있다. 제2 모노클로날 항체는 항체-IGFBP-4 단편 복합체의 검출을 위하여 적절하게 표지될 수 있다.

일부 실시 상태에 있어서, IGFBP-4 단편들의 경쟁적 측정을 위한 상기 키트는 (i) IGFBP-4 단백질 분해 단편의 N-말단 또는 C-말단에 특이적인 모노클로날 항체와, (ii) 검출을 위하여 표지된, 내재성 IGFBP-4 단편 또는 적어도 부분적으로는 IGFBP-4 단편의 서열에 해당하는 재조합 단백질에 대한 표준 또는 교정 제제를 포함할 수 있다. 분석 시료 중 IGFBP-4 단편의 수준은 IGFBP-4 단편에 대한 상기 표지된 표준 제제의 경쟁적 제거 비율로 측정될 수 있다.

실시예 1. 단백질 분해 매개된 IGFBP -4의 신규한 에피토프에 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 제조.

마우스 면역화를 위하여 얻은 합성 펩티드는 다음과 같다:

펩티드-1 (SEQ ID NO. 1)

펩티드-2 (SEQ ID NO. 2)

펩티드-1과 펩티드-2를 고체상 Fmoc 화학법을 이용하여 합성하였다 (23). 펩티드를 p-알콕시벤질알코올 레진에서 제조하였다. 레진으로부터 분리한 이후, 원료 펩티드 제제를 역상 고압 액체 크로마토그래피로 정제하였다. C18 조제 컬럼을 물에 녹인 트리플루오로아세트산 0.1%와 아세토니트릴에 녹인 트리플루오로아세트산 0.1% 구배에 적용시켰다. C18 고압 액상 크로마토그래피 분석과 질량 분석 (정확도 ±0.5 Dalton의 기질 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법 (Matrix-Assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI))으로 순도 (>95%)를 측정하였다.

IGFBP-4 펩티드-1 (SEQ ID NO. 1)은 IGFBP-4 단편 122-135과 동일한 아미노산 서열을 함유하고, N-말단에 1개의 추가 시스테인 잔기를 함유하였다. IGFBP-4 펩티드-2 (SEQ ID NO. 2)는 IGFBP-4 단편 136-150과 동일한 아미노산 서열을 함유하고, C-말단에 1개의 추가 시스테인 잔기를 함유하였다. 이들 추가적인 시스테인 잔기의 술프하이드릴기는 캐리어 단백질과의 펩티드 컨쥬게이트를 제조하는 데 이용되었다.

캐리어 단백질과 상기 펩티드의 컨쥬게이트의 제조는 제조사의 안내에 따라 Pierce (Rockford, IL)로부터 얻은 술포-SMCC를 이용하여 수행되었다. 컨쥬게이션용으로 2.5 mg의 캐리어 단백질 - 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 오브알부민 (두 가지 모두 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 얻음)을 10 mg/ml의 농도로 10 mM KHPO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4 (PBS)에 용해시켰다. 0.1 ml 디메틸 술폭사이드에 용해시킨 2 mg의 술포-SMCC를 상기 단백질 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 캐리어 단백질 활성화 반응을 수행하였다. NAP-5 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ로부터 얻음)을 이용하여 겔-필트레이션 (gel-filtration)으로 나머지 술포-SMCC를 제거하였다. NAP-5 컬럼은 10 mM KHPO₄, 150 mM NaCl, pH 7.2로 예비 평형을 맞춰두었다. 그 후 2 mg의 합성 펩티드-1 또는 펩티드-2를 단백질 용액에 첨가하여 컨쥬게이션을 개시시켰다. 2시간 동안 얼음에서 일정하게 교반하며 이 반응을 수행하였다. PBS로 예비 평형을 맞춰둔 NAP-5 겔-필트레이션 컬럼을 이용하여 단백질-펩티드 컨쥬게이트로부터 반응하지 않은 펩티드 분율을 제거하였다. 적절한 캐리어 단백질과 상기 펩티드들의 컨쥬게이션은 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 밝혀진, 단백질 분자량이 3-5 kDa만큼 증가한 것으로 확인되었다. 컨쥬게이트를 분획으로 나누어 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다.

펩티드-( 캐리어 단백질) 컨쥬게이트를 이용한 마우스 면역화

다섯 마리의 BALB/c 마우스들의 그룹을 펩티드-단백질 컨쥬게이트로 5회 면역화시켰다.

그룹 1:

제1 면역화: 60%의 프로운트 완전 보강제 (Freund's complete adjuvant)를 함유한 PBS에 녹인 10 μg의 BSA-펩티드-1 0.2 ml를 복강 내로 주입.

제2 면역화: 30일째, 60%의 프로운트 불완전 보강제를 함유한 PBS에 녹인 5 μg의 BSA-펩티드-1 0.2 ml를 복강 내로 주입.

제3 면역화: 60일째, PBS에 녹인 2.5 μg의 BSA-펩티드-1 0.2 ml를 복강 내로 주입.

그룹 2:

제1 면역화: 60%의 프로운트 완전 보강제를 함유한 PBS에 녹인 10 μg의 BSA-펩티드-2 0.2 ml를 복강 내로 주입.

제2 면역화: 30일째, 60%의 프로운트 불완전 보강제를 함유한 PBS에 녹인 5 μg의 BSA-펩티드-2 0.2 ml를 복강 내로 주입.

제3 면역화: 60일째, PBS에 녹인 2.5 μg의 BSA-펩티드-2 0.2 ml를 복강 내로 주입.

제3 면역화로부터 20일 후, 최종 면역화 및 혼성화용으로 펩티드 특이적인 항체의 역가가 가장 높은 마우스들을 선택하였다. 그룹 1에 있어서 PBS에 녹인 10 μg의 BSA-펩티드-1 0.2 ml를, 그룹 2에 있어서 PBS에 녹인 10 μg의 BSA-펩티드-2 0.2 ml를 마우스의 정맥으로 주입하였다. 동일한 프로토콜로 다음날도 정맥 주입을 반복하였다 (제5 면역화). 그 이후, 제5 면역화로부터 2일 후에, 면역화된 마우스의 비장을 멸균 단리하고 종래 설명된 대로 분쇄된 조직을 마우스 골수종 세포주 sp2/0와 융합하였다 (19-22).

하이브리도마 생장 중의 조정 배양액을 효소흡착면역측정법 (ELISA)으로 항체에 대하여 스크리닝하였다. 펩티드-1 또는 펩티드-2에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마를 각각 미리 흡착시킨 항원으로서 오브알부민-펩티드-1 또는 오브알부민-펩티드-2를 사용하여 ELISA 함으로써 선택하였다. 또한, 추가 실험에서는 미리 흡착시킨 항원으로서 NS0 세포주 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 얻음)에서 발현시킨 인간의 재조합 IGFBP-4를 사용하였다. 실험을 위하여 웰당 50 ng/0.1 ml PBS의 오브알부민-펩티드-1 또는 오브알부민-펩티드-2 또는 인간의 재조합 IGFBP-4를 면역 분석용 폴리스티렌 플레이트 (Corning, Cambridge, MA.으로부터 얻음)에 흡착시켰다. 항원 흡착 40분 후, 플레이트를 2회 세척하고 세제 Tween 20 0.1%를 함유하는 PBS (PBST)로 10분간 블로킹하였다. 그 후 플레이트를 생장 중인 하이브리도마로부터 수집한 조정 배지 0.05 ml로 30분간 처리하고 PBST로 2회 세척하였다. PBST에 1:1000 희석한, HRP와 짝지워진 항마우스 IgG 폴리클로날 제2 항체 0.1 ml를 웰마다 30분 처리하여, 미리 흡착시킨 항원에 결합한 마우스 항체를 밝혀내었다. 제2 항체는 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 얻은 것이다. 제2 항체로 처리한 후, PBST로 플레이트를 6회 세척하고, 0.03% 과산화수소를 함유하는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 퍼옥시데이즈 기질을 첨가하였다. 15분간 처리한 후, 0.5 M 인산 0.1 ml를 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm에서 흡광도를 웰마다 측정하였다. 흡광도 측정은 Labsystems Multiscan microplate reader (Labsystems, Finland)로 이루어졌다.

이후 작업에서, 오브알부민과 컨쥬게이션된 (상기 기술한 조건에서 450 nm에서의 흡광도가 백그라운드보다 >0.5인 것), 동시에 인간의 재조합 IGFBP-4와는 반응하지 않는 (450 nm에서의 흡광도가 백그라운드보다 <0.025인 것), 적절한 펩티드에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택되었다. 이러한 하이브리도마를 한계 희석으로 클로닝하였다. 대상 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 10% 소 태아 혈청 (FBS, HyClone Laboratories, Logan, UT)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다.

항체의 친화 정제 ( affinity purification )

선택된 하이브리도마 클론을 복강내 주입한 후 마우스 복수액에서 모노클로날 항체를 생산하였다. 단백질 A 친화 크로마토그래피를 이용하여 복수액으로부터 항체를 정제하였다. 레진은 GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ)로부터 얻었고, 정제는 제조사의 안내에 따라 수행되었다. 정제된 모노클로날 항체를 50% 황산 암모늄에 현탁하여 4℃에 저장하였다.

모노클로날 항체의 특이도 ( specificity ) 연구

선택된 모노클로날 항체의 특이도를 확인하기 위하여 IGFBP-4 단백질 분해 단편을 마련하였다. PAPP-A 의존성 단백질 분해 반응은 종래 기술된 조건에 따라 시행되었다 (14). 2 mM CaCl₂, 1.8 μg IGF-II (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 얻음), 40 ng의 인간 재조합 PAPP-A (HyTest, Turku, Finland) 및 2 μl 단백질 분해효소 억제제 칵테일 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구입)의 존재하에서, 2 μg의 인간 재조합 IGFBP-4를 0.23 ml의 50 mM Tris-HCl, pH 7.5으로 처리하였다. 반응은 37℃에서 15시간 동안 수행되었고, 시료를 -20℃에서 동결시킴으로서 중단되었다. IGFBP-4의 PAPP-A 의존성 분할 정도를, Abcam (Cambridge, MA)으로부터 얻은 1 μg/ml의 특이적 래빗 폴리클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블롯함으로써 측정하였다 (도 1).

친화 정제된 항체를 이용한 간접적인 ELISA로 선택된 모노클로날 항체의 IGFBP-4 단백질 분해 단편에 대한 특이도 연구를 수행하였다 (도 2A). 전장 재조합 IGFBP-4 또는 PAPP-A 의존성 분할로 생성된 IGFBP-4 단편 (상기 기재된 제제)을 폴리스티렌 플레이트에 흡착시켰다. 처리 40분 후, 플레이트를 2회 세척하고 세제 Tween 20 0.1%를 함유하는 PBS (PBST)로 10분간 블로킹하였다. 그 후 선택된 MAbs (10 μg/ml)를 실온에서 30분간 교반하면서 반응시킨 후 PBST로 2회 세척하였다. PBST에 1:1000 희석한, HRP와 짝지워진 항마우스 IgG 폴리클로날 항체 0.1 ml로 특이적으로 결합한 항체를 웰마다 검출하였다. 제2 항체는 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 얻은 것이다. 제2 항체로 처리한 후, PBST로 플레이트를 6회 세척하고, 0.03% 과산화수소로 보충된, 퍼옥시데이즈 기질을 함유하는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB)을 첨가하였다. 15분간 처리한 후, 0.5 M 인산 0.1 ml를 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. PAPP-A 의존성 분할에 의하여 생성된, 온전한 IGFBP-4과의 상호 반응성이 5% 미만인, IGFBP-4 단백질 분해 단편에 특이적인 모노클로날 항체군이 최종적으로 선택되었다: IBP28, IBP27, IBP12, IBP3, IBP4, IBP7, IBP13, IBP18, IBP19, IBP20, IBP30, IBP167, IBP166, IBP168, IBP174, IBP160, IBP161, IBP164, IBP171. 모든 모노클로날 항체들은 IgG 아이소타입 (isotype)이었고, 예외적으로 IBP30은 IgM 아이소타입이었다.

IGFBP -4 단편의 정량을 위한 샌드위치 면역 분석법의 설계

친화 정제된 모노클로날 항체들의 특이도는 샌드위치 면역 분석법으로도 검토되었다 (도 2B). IGFBP-4 단백질 분해 단편에 특이적인 한 가지 모노클로날 항체 (N-말단 또는 C-말단; 간접 ELISA에서 전장 분자와의 상호 반응은 5% 미만인 것)와, 온전한 IGFBP-4의 임의의 에피토프를 인식하는 또 하나의 MAb를 이용하는 몇 가지 샌드위치 분석법을 개발하였다. 온전한 IGFBP-4에 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 제작은 실시예 2에 기재된다.

샌드위치 형광 면역 분석법을 수행하기 위하여, 본 발명자들은 히티애 등 (Hyytia et al)에 의하여 기재된 바와 같이 안정한 Eu3+ 킬레이트로 표지된 MAbs 검출을 이용하였다 (24). 이 분석법에서 포획 항체는 온전한 IGFBP-4에 특이적인 것인 반면, 검출 항체는 IGFBP-4의 단백질 분해 네오 (neo) 에피토프에 특이적인 것이었다. 웰당 100 μl의 인산 완충 염용액에 녹인 포획 항체 (IBP513, IBP521) 2 μg를, 실온에서 30분간 96-웰 면역 분석 플레이트에서 일정하게 교반하면서 반응시켰다. 0.15 M NaCl, 0.025 % Tween 20 및 0.5 g/l NaN₃ (완충액 A)로 보충된 10 mM Tris-HCl (pH 7.8) 완충액으로 플레이트를 세척하였다. 세척 후, 전장 인간 재조합 IGFBP-4 또는 PAPP-A 의존성 분할에 의하여 생성된 IGFBP-4 단편 100 ng/ml을 함유하는 분석 완충액 (50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.7, 9 g/l NaCl, 0.01 % Tween 40, 0.5% BSA 및 0.5 g/l NaN₃) 0.1 ml를 플레이트에 첨가하였다. 일정하게 교반하면서, 실온에서 30분간 상기 플레이트를 반응시켰다. 완충액 A로 세척한 후, 분석 완충액에 녹인 검출 항체 (IBP12, IBP27 및 IBP30) 용액 (1 mg/l) 0.1 ml을 첨가하였다. 일정하게 교반하면서, 실온에서 30분간 상기 플레이트를 반응시켰다. 완충액 A로 세척한 후, 웰당 0.2 ml의 증강 용액 (1.75 M NaSCN, 1 M NaCl, 5% 글리세롤, 20% 1-프로판올, 5 mM Na₂CO₃, 50 mM 글리신-NaOH, pH 10.0)을 첨가하고, 약하게 교반하면서 실온에서 3분간 반응시켰다. Victor 1420 multilabel counter (Wallac-Perkin Elmer)에서 Eu3+의 형광을 측정하였다. 형광은 초당 계수 (CPS)로 표현되었다.

개발된 샌드위치 면역 분석법으로는 오로지 PAPP-A 의존성 분할로 생성된 IGFBP-4 단편만을 검출할 수 있을 뿐이고, 전장 IGFBP-4와는 상호 반응성이 없다 (또는 매우 낮다 - 1% 미만).

실시예 2. 온전한 IGFBP -4에 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 제조.

마우스의 면역화

다섯 마리의 BALB/c 마우스를 포유류 NS0 세포주에서 발현된 인간 재조합 IGFBP-4로 5회 면역화시켰다. 단백질은 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 구매하였다. 제1 면역화: 60%의 프로운트 완전 보강제 (Freund's complete adjuvant)를 함유한 PBS에 녹인 5 μg의 IGFBP-4 0.2 ml를 복강 내로 주입. 제2 면역화: 30일째, 60%의 프로운트 불완전 보강제를 함유한 PBS에 녹인 2 μg의 IGFBP-4 0.2 ml를 복강 내로 주입. 제3 면역화: 60일째, PBS에 녹인 2 μg의 IGFBP-4 0.2 ml를 복강 내로 주입.

제3 면역화로부터 20일 후, 다음 면역화 및 혼성화용으로 단백질 특이적인 항체의 역가가 가장 높은 마우스들을 선택하였다. PBS에 녹인 2 μg의 IGFBP-4 0.2 ml를 마우스의 정맥으로 4회 주입하였다. 동일한 프로토콜에 따라 다음날에 최종 정맥 주입을 수행하였다 (제5 면역화). 2일 후에, 면역화된 마우스의 비장을 멸균 단리하고 종래 설명된 대로 분쇄된 조직을 마우스 골수종 세포주 sp2/0와 융합하였다 (19-22).

하이브리도마 생장 중의 조정 배양액을 효소흡착면역측정법 (ELISA)으로 항체에 대하여 스크리닝하였다. 온전한 IGFBP-4에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마를 간접 ELISA 수단으로 선택하였다. 실험을 위하여 웰당 50 ng/0.1 ml PBS의 전장 인간의 재조합 IGFBP-4를 면역 분석용 폴리스티렌 플레이트에 흡착시켰다. 40분간 처리한 후, 플레이트를 2회 세척하고 세제 Tween 20 0.1%를 함유하는 PBS (PBST)로 10분간 블로킹하였다. 그 후 플레이트를 생장 중인 하이브리도마를 함유하는 웰로부터 수집한 조정 배지 0.05 ml로 30분간 처리하였다. 처리 후, 플레이트를 PBST로 2회 세척하였다. 세척 후, HRP와 짝지워진 항마우스 IgG 폴리클로날 제2 항체 (PBST에 1:1000 희석) 0.1 ml를 웰마다 30분간 처리하였다. 제2 항체로 처리한 후, PBST로 플레이트를 6회 세척하고, TMB 및 0.03% 과산화수소를 함유하는 퍼옥시데이즈 기질을 첨가하였다. 15분간 처리한 후, 0.5 M 인산 0.1 ml를 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm에서 흡광도를 웰마다 측정하였다.

전장 IGFBP-4에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 (상기 기술한 조건에서 450 nm에서의 흡광도가 백그라운드보다 >0.5인 것)를 한계 희석법으로 클로닝하였다. 대상 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 DMEM에서 배양하였다.

항체의 친화 정제 ( affinity purification )

선택된 하이브리도마 클론을 복강내 주입한 후 마우스 복수액에서 전장 IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하였다. 단백질 A 친화 크로마토그래피를 이용하여 복수액으로부터 항체를 정제하였다. 레진은 GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ)로부터 얻었고, 정제는 제조사의 안내에 따라 수행되었다. 정제된 모노클로날 항체를 50% 황산 암모늄에 현탁하여 4℃에 저장하였다.

실시예 3. 동맥경화증의 PAPP -A의 단백질 분해 활성

인간의 동맥경화 관상 혈관 시료를 사용하기까지 -70℃에 보관하였다. 0.15 M NaCl, 0.5% Triton X100, 및 단백질 분해효소 억제제 칵테일을 함유하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) 완충액에서 조직을 분쇄한 후 동맥경화 관상 동맥으로부터 PAPP-A를 추출하였다. 추출된 PAPP-A를 친화 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. PAPP-A 정제용으로 사용된 친화 기질은 PAPP-A 특이적 모노클로날 항체 4G11 (HyTest, Turku, Finland로부터 얻음)을 이용하여 제작되었다. PAPP-A의 정제된 단백질의 동정을 확인하기 위하여, 몇 가지 PAPP-A 특이적 모노클로날 항체들을 이용한 웨스턴 블롯 및 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분석법 (tandem mass spectroscopy)이 사용되었다.

동맥경화증의 PAPP-A의 단백질 분해 활성을 분석하기 위하여, 2 mM CaCl₂, 1.8 μg IGF-II (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 얻음), 40 ng의 동맥경화 PAPP-A 및 2 μl 단백질 분해효소 억제제 칵테일 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구입)의 존재하에서, 2 μg의 인간 재조합 IGFBP-4를 0.23 ml의 50 mM Tris-HCl, pH 7.5으로 처리하였다. 반응은 37℃에서 15시간 동안 수행되었고, 시료를 -20℃에서 동결시킴으로서 중단되었다. IGFBP-4의 PAPP-A 의존성 분할 정도를, IGFBP-4 특이적 래빗 폴리클로날 항체 (Abcam ,Cambridge, MA으로부터 얻음)를 이용하여 웨스턴 블롯함으로써 측정하였다 (도 1).

동맥경화 PAPP-A는 재조합 PAPP-A와 동일한 효율로 IGFBP-4를 분할한다는 것이 드러났다. 그러므로, 이것은 인간 플라크에서 발현된 내생 PAPP-A가 IGF-II의 존재하에서 IGFBP-4를 분할할 수 있는 활성 단백질 분해효소라는 것을 처음으로 밝힌 것이다.

실시예 4. ACS 환자의 혈장 시료에서 IGFBP -4 단편의 측정.

ACS를 앓고 있는 43명의 환자 (ST-분절 상승) 혈액 및 34명의 건강한 기증자로부터의 혈장 시료를 단편 특이적 샌드위치 면역 분석법으로 시험하였다. 모든 혈장 시료는 EDTA의 존재하에서 환자로부터 수집되었으며 측정 전에는 -70℃에 보관되었다.

샌드위치 면역 분석 측정을 위하여, 인산 완충 염용액 0.1 ml에 녹인 웰당 2 μg의 포획 항체 IBP521를 96-웰 면역 분석 플레이트에서 일정하게 교반하면서 실온에서 30분간 반응시켰다. 완충액 A로 세척한 후, 분석 완충액으로 1:1 희석시킨 환자의 혈장 시료 0.1 ml을 플레이트에 첨가하였다. 일정하게 교반하면서, 실온에서 30분간 상기 플레이트를 반응시켰다. 완충액 A로 세척한 후, 분석 완충액에 녹인 검출 항체 IBP30 (1 mg/l) 0.1 ml를 첨가하였다. 일정하게 교반하면서, 실온에서 30분간 상기 플레이트를 반응시켰다. 완충액 A로 세척한 후, 웰당 0.2 ml의 증강 용액을 첨가하고, 약하게 교반하면서 실온에서 3분간 반응시켰다. Victor 1420 multilabel counter (Wallac-Perkin Elmer)를 이용하여 Eu3+의 형광을 측정하였다. ACS 환자의 혈장에서 IGFBP-4의 수준은 건강한 기증자의 혈장에서보다 3.2배 높았다 (p<0.0005)(도 3). 도면에 평균값±표준편차를 나타내었다. 형광은 초당 계수 (CPS)로 표현되었다.

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SEQUENCE LISTING <110> Hytest Ltd <120> Detection of IGFBP-4 fragments as a diagnostic method <130> 48539 <150> FI 20095733 <151> 2009-06-29 <150> US 61/221,225 <151> 2009-06-29 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys His Phe Ala Lys Ile Arg Asp Arg Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Val Asn Gly Ala Pro Arg Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Cys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (135)..(136) <223> PAPP-A cleavage site <400> 3 Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu Glu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 15 Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Glu Pro Gly Cys 20 25 30 Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly Met Pro Cys Gly Val 35 40 45 Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys Tyr Pro Pro Arg Gly 50 55 60 Val Glu Lys Pro Leu His Thr Leu Met His Gly Gln Gly Val Cys Met 65 70 75 80 Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Gln Pro Ser Asp 85 90 95 Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe Ser Pro Cys Ser Ala 100 105 110 His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala Lys Ile Arg Asp Arg 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met Lys Val Asn Gly Ala Pro Arg Glu Asp 130 135 140 Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser Glu Leu His Arg Ala 145 150 155 160 Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr His Glu Asp Leu Tyr 165 170 175 Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly Asn Phe His Pro Lys 180 185 190 Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly Lys Cys Trp Cys Val 195 200 205 Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly Leu Glu Pro Lys Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe Arg Glu 225 230 235

Claims

IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들을 인식하는, SEQ ID NO:3으로 나타내는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:3와 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
제1항에 있어서, 전장 IGFBP-4를 인식하는 것보다 높은 친화도로 IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들을 특이적으로 인식하는 것인 항체.
IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들을 특이적으로 인식하고 전장 IGFBP-4를 인식하지 않는, SEQ ID NO:3으로 나타내는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:3와 적어도 80%의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
제3항에 있어서, 아미노산 잔기 M135와 K136 사이에서 IGFBP-4를 분할하는 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들을 특이적으로 인식하고, 전장 IGFBP-4를 인식하지 않는 것인 항체.
제1항에 있어서, 아미노산 잔기 M135와 K136 사이에서 IGFBP-4를 분할하는 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들을 특이적으로 인식하는 것인 항체.
제5항에 있어서, 전장 IGFBP-4를 인식하는 것보다 높은 친화도로 아미노산 잔기 M135와 K136 사이에서 IGFBP-4를 분할하는 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프를 특이적으로 인식하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 전장 IGFBP-4를 인식하는 것보다 높은 친화도로 아미노산 잔기 M135와 K136 사이에서 PAPP-A에 의한 IGFBP-4의 분할 결과로 생성되는 신규한 에피토프들을 특이적으로 인식하는 것인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 항체와 동일한 특이도를 가지는 앱타머 또는 다른 바인더.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그 단편인 것인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리클로날 항체 또는 그 단편인 것인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 항체 또는 그 단편인 것인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 1종 이상의 항체를 이용하는 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 정성적 또는 정량적 검출 방법.
제8항에 따른 1종 이상의 앱타머 또는 바인더를 이용하는 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 정성적 또는 정량적 검출 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 진단 면역 분석법인 것인 방법.
제14항에 있어서, 심혈관계 질환을 진단하기 위한 것인 방법.
제14항에 있어서, 암을 진단하기 위한 것인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들에 해당하는 에피토프들을 포함하는 내생 또는 재조합 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 제제 또는 합성 펩티드들을 표준으로 이용한 검량선 준비 단계를 더 포함하는 것인 진단 방법.
제17항에 있어서, 준비된 검량선에 검출된 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 수준을 비교하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 면역 분석법은 제1 포획 항체 및 제2 검출 항체를 이용하는 샌드위치 면역 분석법인 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 1종 이상의 모노클로날 항체 또는 제8항에 따른 앱타머 또는 바인더를 포함하는 면역 분석을 위한 표준 또는 교정기로서, IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들에 해당하는 에피토프들을 포함하는 내생 또는 재조합 IGFBP-4 단백질 분해 단편들 또는 합성 펩티드들의 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체와 동일한 특이도를 가지는 항체들을 생산하기 위한 항원으로서, IGFBP-4의 효소 의존성 분할에 의하여 생성되는 신규한 에피토프들에 해당하는 에피토프들을 포함하는 내생 또는 재조합 IGFBP-4 단백질 분해 단편들 또는 합성 펩티드들의 용도.
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체와 동일한 특이도를 가지는 항체와,
(b) 전장 IGFBP-4의 임의의 에피토프에 특이적인 또 하나의 항체 및
(c) 제20항에 정의된 표준 또는 교정기 제제
을 포함하는, 환자의 시료에서 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 진단 분석을 위한 면역 분석 키트.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 1종 이상의 항체 또는 제8항에 따른 앱타머 또는 바인더를 이용하는 분석법을 사용하여 환자의 시료에서 PAPP-A 단백질 분해 활성을 측정하는 것을 포함하는 진단 방법.
제23항에 따른 진단 방법용 표준 또는 교정기 제제로서, 효소적으로 활성인 내생 또는 재조합 PAPP-A.