KR20120101961A - A three-dimensional nanostructured array of protein nanoparticles - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A three dimensional nanostructure using protein nanoparticles is provided to detect a target material. CONSTITUTION: A method for preparing a protein-DNA multilayer nanostructure comprises: a step of fixing a control protein of which net charge changes at a substrate according to pH concentration except for a metal nano dot; a step of changing pH concentration to adjust the net charge of the control protein; and a step of laminating a DNA layer and a protein layer on the metal nano dot. The protein layer contains allogenic or xenogenic protein particles. The substrate is formed of metal, nickel. [Reference numerals] (AA) Gold; (BB) Nickel layer; (CC) Si wafer; (DD) Adding (his)6-tagged proteasome alpha particles(pH 7.4, 8); (EE) Adding ssDNA(polyA, 20bp), conversion to pH 5; (FF) Adding DPS particles[first layer formation], conversion to pH 8; (GG) Adding dsDNA(519bp), conversion to pH 5; (HH) Adding DPS particles[second layer formation], moving to pH 8; (II) Adding dsDNA(519bp), conversion into pH 5; (JJ) Adding DPS particles[third layer formation], conversion to pH 8; (KK) Type 1 DPS particle layers; (LL) Type 2 DPS particle layers; (MM) N layer formation on fourth layer; (NN) Type 1 DPS particles for capturing antibody marker 1; (OO) Antigen peptide fixed on the surface, which specifically binds to antibody marker 1; (PP) Type 2 DPS particles for capturing antibody marker 2; (QQ) Antigen peptide fixed on the surface, which specifically binds to antibody marker 2; (RR) Simultaneous detection and diagnosis system(example)

Description

단백질 나노입자를 이용한 3차원 나노구조체{A Three-Dimensional Nanostructured Array of Protein Nanoparticles}A three-dimensional nanostructured array of protein nanoparticles

본 발명은 단백질 나노 입자 및 DNA를 금속 나노닷 위에 선택적이고 순차적으로 쌓아올려 3차원의 나노구조체를 만들고 이 구조체를 바이오센서로 활용하는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a technique for selectively and sequentially stacking protein nanoparticles and DNA on metal nanodots to create a three-dimensional nanostructure and use the structure as a biosensor.

타겟 물질의 존재를 확인하거나 시험물질의 활성을 확인하는 과정에서 프로브로써 단백질을 사용할 때 기존 보고된 기술들에서는 일반적으로 단백질의 2차원적 어레이를 사용해 왔다. 만일 단백질의 3차원적 다층구조체를 만들 수 있다면 반응할 수 있이 표면적을 증가하므로 크기가 작으면서도 민감도는 높은 바이오센서를 만드는데 매우 유리할 것이다. Previously reported techniques have generally used two-dimensional arrays of proteins when using proteins as probes to confirm the presence of a target substance or to confirm the activity of a test substance. If a three-dimensional multilayer structure of proteins can be made, the surface area that can be reacted increases, so it is very advantageous to make a biosensor with small size and high sensitivity.

그러나 기존에 보고된 3차원 다층구조체를 만드는 기술은 pH조건이 산성이거나 제조 온도가 고온이거나 하는 등의 제조 조건이 단백질에는 적합하지 않고, 또한 쌓아올리는 재료물질에 특별한 화학적 처리가 필요하고, 공정시간이 상대적으로 긴 문제점이 있었다.However, the technology for making a three-dimensional multilayer structure, which has been reported previously, is not suitable for protein, such as pH conditions are acidic or manufacturing temperature is high, and also requires special chemical treatment on the stacking material material, process time There was this relatively long issue.

본 발명은 기재 상에 형성된 금속 나노닷에만 선택적으로 DNA 층과 단백질층을 순차적으로 반복하여 쌓아올려 3차원 단백질 다층 나노구조체를 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 단백질 다층 나노구조체, 이를 포함하는 바이오센서를 제공하고자 한다.The present invention provides a method for producing a three-dimensional protein multilayer nanostructure by sequentially stacking a DNA layer and a protein layer only on a metal nanodot formed on a substrate, and a protein multilayer nanostructure manufactured accordingly, and a biosensor comprising the same. To provide.

본 발명은 The present invention

금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재의 금속 나노닷을 제외한 부분에 pH에 따라 네트 전하가 변화하는 컨트롤 단백질을 고정화하고, pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 금속 나노닷 상에 DNA층과 단백질층이 순차적으로 반복하여 적층되어 있는 단백질 다층 나노구조체를 제조하는 방법을 제공한다. On the metal nanodots by immobilizing a control protein whose net charge changes with pH at a portion other than the metal nanodots of the substrate where the metal nanodots are formed on the surface, and adjusting the net charge of the control protein by changing the pH. It provides a method for producing a protein multilayer nanostructure in which a DNA layer and a protein layer are sequentially and repeatedly stacked.

본 발명에서는, 단백질-DNA 다층 나노구조체를 제조하기 위한 기재로서 금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재를 사용한다. 본 발명에서 사용되는 기재의 소재는 특별히 한정되지 않는다. 단백질과의 결합성이 우수하거나, 단백질을 기재와 결합시키기 위한 기능기를 도입하기에 적합한 소재이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재는 금속으로 이루어진 것일 수 있다. 이 때 금속 기재와 금속 나노닷은 서로 상이한 소재인 것이 바람직할 것이다. In the present invention, a substrate in which metal nanodots are formed on the surface is used as a substrate for producing protein-DNA multilayer nanostructures. The raw material of the base material used by this invention is not specifically limited. Any material may be used as long as the material is excellent in binding to a protein or suitable for introducing a functional group for binding a protein to a substrate. In one embodiment, the substrate on which the metal nanodots are formed may be made of a metal. In this case, the metal substrate and the metal nano dot may be different materials from each other.

기재의 표면에 형성되어 있는 금속 나노닷의 소재 또한 특별히 한정되지 않는다. 단백질이나 DNA와의 결합성이 우수하거나, 단백질이나 DNA와 결합시키기 위한 기능기를 도입하기에 적합한 소재이면 어떠한 것이든 사용 가능할 것이다. The material of the metal nano dot formed in the surface of a base material is not specifically limited, either. Any material may be used as long as it has excellent binding to protein or DNA, or a material suitable for introducing a functional group for binding to protein or DNA.

기재나 금속 나노닷의 소재로 사용할 수 있는 금속으로써, 단백질이나 DNA와 결합성이 우수한 것으로 알려져 있는 니켈이나 금과 같은 금속을 예로 들 수 있다. 니켈은 히스티딘과의 결합성이 우수한 것으로 알려져 있으며, 금은 폴리아데닌 올리고머와의 결합성이 우수한 것으로 알려져 있다. 또한, 예를 들어, 티올기와 같은 공지의 기능기를 이용하여 금과 같은 금속 표면에 단백질이나 DNA를 표면에 결합시킬 수도 있다.As a metal which can be used as a base material or a metal nanodot material, metals, such as nickel and gold, are known to have excellent binding property with proteins and DNA. Nickel is known to have excellent binding to histidine and gold is known to have excellent binding to polyadenine oligomer. For example, a protein or DNA may be bound to the surface of a metal such as gold by using a known functional group such as a thiol group.

한편, 표면에 금속 나노닷이 형성되어 있는 기재는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 쉽게 제조할 수 있다. 도 1은 표면에 금속 나노닷이 형성되어 있는 기재의 일 예로서, 금 나노닷이 형성되어 있는 니켈 기재를 제조하는 공정을 개략하여 도시한 것이다. 도 1을 예로 들어 설명하면, 먼저 니켈을 실리콘 웨이퍼위에 전자빔 증착법(e-beam evaporation)으로 증착시키고, 그 위에 LOL™2000 (Shipley Ltd.)을 스핀코팅(spin-coating) 한 후에 실리콘 마스터몰드(master mold)를 붙이고 산소플라즈마를 이용한 산소 반응성 이온 에칭(oxygen reactive ion etching (RIE)) 을 한 후, 다시 금(Gold)을 전자빔 증착법 으로 증착시킨다. 그런 다음 레지스트-제거 용액(Resist-removing solution)을 이용하여 리프트-오프(lift-off) 공정을 진행하면 니켈 표면 위에 일정한 간격의 골드닷(Gold dot)을 만들 수 있다.On the other hand, the substrate on which the metal nano dot is formed can be easily manufactured using a method known in the art. 1 illustrates an example of a substrate on which a metal nano dot is formed on a surface, and schematically illustrates a process of manufacturing a nickel substrate on which a gold nano dot is formed. Referring to FIG. 1 as an example, first, nickel is deposited on a silicon wafer by e-beam evaporation, and spin-coating LOL ™ 2000 (Shipley Ltd.) thereon, followed by silicon master mold ( After attaching a master mold and oxygen reactive ion etching (RIE) using oxygen plasma, gold is again deposited by electron beam deposition. Then, a lift-off process using a resist-removing solution can be used to create a gold dot at regular intervals on the nickel surface.

금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재 상에는 pH에 따라 네트 전하가 변화하는 “컨트롤 단백질”을 고정화한다. 본 발명에 있어서, “컨트롤 단백질”이란 pH에 따라 네트 전하가 변화하는 단백질을 의미하는 것으로 구체적인 단백질의 종류는 특별히 제한되지 않는다. “컨트롤 단백질”은 pH에 따라 네트 전하가 변화하여 적층하고자 하는 DNA나 단백질과 동일한 전하를 띠게 되어 DNA나 단백질이 컨트롤 단백질 위가 아닌 금속 나노닷 상에 이미 적층되어 있는 단백질층이나 DNA층에 적층될 수 있도록 하는 중요한 역할을 한다. “컨트롤 단백질”은 이러한 역할을 수행하기 위해 금속 기재 중 금속 나노닷을 제외한 부분에 고정화된다. “컨트롤 단백질”을 기재 상에 고정화하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업자에게 알려져 있는 공지의 단백질 고정화 방법을 사용할 수 있다. On the substrate where the metal nanodots are formed on the surface, the "control protein" immobilizes the net charge with pH. In the present invention, "control protein" means a protein whose net charge changes with pH, and the type of specific protein is not particularly limited. "Control protein" is the net charge changes according to pH, and the same charge as the DNA or protein to be stacked, so that the DNA or protein is deposited on the protein layer or DNA layer already deposited on the metal nanodot, not on the control protein It plays an important role in making it possible. The "control protein" is immobilized on the metal substrate except the metal nanodots to perform this role. The method of immobilizing the “control protein” on the substrate is not particularly limited, and known protein immobilization methods known to those skilled in the art can be used.

컨트롤 단백질을 기재의 금속 나노닷을 제외한 부분에 고정화한 후에는, 금속 나노닷 상에는 1차적으로 DNA층이나 단백질층을 형성하게 된다. 앞서 설명한 바와 같이, 금속 나노닷 상에 DNA이나 단백질을 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. After the control protein is immobilized to a portion other than the metal nanodot on the substrate, a DNA layer or a protein layer is primarily formed on the metal nanodot. As described above, methods for introducing DNA or proteins onto metal nanodots are well known in the art.

금속 나노닷 상에 1차적으로 DNA층이나 단백질층을 형성하고 나면, pH를 조정하여“컨트롤 단백질”의 네트 전하가 적층하고자 하는 단백질이나 DNA와 동일한 전하를 띠도록 조정함으로써 적층하고자 하는 단백질이나 DNA가 1차적으로 금속 나노닷 상에 형성되어 있는 DNA층이나 단백질층에 적층되도록 할 수 있다.After the first DNA or protein layer is formed on the metal nanodot, the pH is adjusted so that the net charge of the "control protein" is adjusted to have the same charge as the protein or DNA to be stacked. May be laminated on a DNA layer or a protein layer formed primarily on a metal nano dot.

상기 “컨트롤 단백질”의 네트 전하는 컨트롤 단백질 자체의 pI 값과 금속 나노닷 상에 적층시킬 DNA나 단백질을 포함하는 용액의 pH 값에 따라 변화한다. 단백질의 pI 값은 고정되어 있으므로, 선택된 컨트롤 단백질의 pI 값을 고려하여 금속 나노닷 상에 적층시킬 DNA나 단백질을 포함하는 용액의 pH 값을 조정함으로써 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정할 수 있을 것이다.The net charge of the "control protein" changes depending on the pI value of the control protein itself and the pH value of the solution containing DNA or protein to be deposited on the metal nanodots. Since the pI value of the protein is fixed, the net charge of the control protein may be adjusted by adjusting the pH value of a solution containing DNA or protein to be deposited on metal nanodots in consideration of the pI value of the selected control protein.

“컨트롤 단백질”의 pH에 따른 네트 전화 변화를 이용한 DNA나 단백질의 적층 방법을 보다 구체적으로 설명하기 위해 본 발명의 실시예에서 “컨트롤 단백질”로서 사용한 프로테아좀 α를 예로 들어 설명하도록 한다. 예를 들어, DNA를 포함하는 완충액의 pH가 7.5 내지 8.5일 때, 프로테아좀 α의 네트 전하는 음전하를 띠게 되어, 동일한 음전하를 띠는 DNA는 프로테아좀 α에 결합하지 않고 금속 나노닷 또는 금속 나노닷 상에 적층되어 있는 단백질층에만 결합하게 된다. 또한, 완충액의 pH가 5.5 내지 6.5일 때, 프로테아좀 α의 네트 전하는 상대적으로 DNA에 비해 양전하를 띠게 되어, 적층하고자 하는 단백질이 동일한 양전하를 띠는 프로테아좀 α에 결합하지 않고 음전하를 띠는 DNA와 결합하도록 해 준다. In order to explain in more detail a method of stacking DNA or protein using a net conversion of the pH of the “control protein”, the proteasome α used as the “control protein” will be described as an example. For example, when the pH of the buffer containing DNA is 7.5 to 8.5, the net charge of the proteasome α is negatively charged, so that the DNA with the same negative charge does not bind to the proteasome α and is either a metal nanodot or a metal. It binds only to protein layers stacked on nanodots. In addition, when the pH of the buffer is 5.5 to 6.5, the net charge of the proteasome α is relatively positive compared to the DNA so that the protein to be stacked is negatively charged without binding to the same positively charged proteasome α. Allows binding to DNA.

즉, 본 발명은 컨트롤 단백질의 네트 전하를 적층될 순서의 DNA 또는 단백질과 동일한 전하를 띠도록 조정함으로써, 적층하고자 하는 DNA나 단백질이 프로테아좀 α가 아닌 단백질층이나 DNA층에 선택적이고 순차적으로 적층되도록 하는 것을 특징으로 한다.That is, the present invention adjusts the net charge of the control protein to have the same charge as the DNA or protein in the order of stacking, so that the DNA or protein to be stacked is selectively and sequentially in the protein layer or the DNA layer instead of the proteasome α. It is characterized in that to be laminated.

본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체에 있어서, 적층되는 각각의 단백질층은 동종 또는 이종의 단백질 입자로 이루어진 것일 수 있다. In the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention, each protein layer to be stacked may be composed of homogeneous or heterologous protein particles.

만일 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체에서, 상기 각각의 단백질층이 모두 동일한 종류의 단백질로 이루어져 있는 경우에는 단일한 타겟 물질을 탐지할 수 있게 된다. 반면, 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체에서, 각각의 단백질층이 2 이상의 상이한 종류의 단백질, 예컨대 2 이상의 상이한 종류의 캡처 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질로 이루어져 있는 경우 복수의 타겟 물질을 동시에 탐지할 수 있게 된다.In the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention, when each protein layer is composed of the same kind of protein, a single target material can be detected. In contrast, in the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention, when each protein layer is composed of two or more different kinds of proteins, such as recombinant proteins comprising two or more different kinds of capture peptides, a plurality of target substances are simultaneously detected. You can do it.

만일 적층되는 각각의 층이 이종의 단백질 입자로 이루어진 것일 경우, 타겟물질에 대한 프로브로서의 결합력을 높이기 위해 단백질층은 2 이상의 층이 연속적으로 동종의 단백질층으로 적층되어 있는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 상기 재조합 단백질층이 총 7층일 때, 제1 내지 4의 재조합 단백질층이 서로 동일한 종류의 단백질층으로 적층되어 있고, 제5 내지 제7의 재조합 단백질층은 이와는 다른 종류의 단백질층으로 적층되어 있을 수 있다. If each layer to be laminated is composed of heterogeneous protein particles, it is preferable that two or more layers are successively stacked with homogeneous protein layers in order to increase the binding force as a probe to the target material. For example, when the recombinant protein layer has a total of seven layers, the first to fourth recombinant protein layers are stacked in the same kind of protein layer, and the fifth to seventh recombinant protein layers are different kinds of protein layers. May be stacked.

만일 적층되는 각각의 층이 이종의 단백질 입자로 이루어진 것일 경우, 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체의 가장 윗층은 시료와 접촉할 수 있는 표면적이 다른 층에 비해 더 넓기 때문에 윗 부분에 적층되는 단백질층들은 아랫 부분에 적층되는 단백질층에 비해 적층되는 층의 수가 적을 수 있을 것이다. 한편, 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체에 있어서, 상기 적층되는 단백질은 단백질이 시료 내의 존재 여부를 탐지하고자 하는 타겟 물질에 대한 프로브로서 사용될 수 있도록 N-말단 또는 C-말단에 캡처 펩타이드를 포함할 수 있다. If each layer to be laminated is composed of heterogeneous protein particles, the uppermost layer of the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention is stacked on the upper part because the surface area which can come into contact with the sample is larger than the other layers. The protein layers may have a smaller number of layers than the protein layers stacked below. On the other hand, in the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention, the stacked protein is a capture peptide at the N-terminal or C-terminal end so that the protein can be used as a probe for the target material to detect the presence in the sample It may include.

상기 캡처 펩타이드는 항원 또는 항체 결합 도메인일 수 있다. 탐지하고자 하는 타겟 물질의 종류에 따라 적당한 항원 또는 항체 결합 도메인을 선택하고 이를 캡처 펩타이드로서 재조합 단백질 내에 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 캡처 펩타이드로서 항체 결합 도메인을 사용할 경우에는 이에 결합하는 항체가 타겟 물질을 탐지하는 프로브로서 작용하게 되므로 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체에 이러한 항체를 추가적으로 결합시켜 사용하게 될 것이다. The capture peptide may be an antigen or antibody binding domain. Depending on the type of target substance to be detected, an appropriate antigen or antibody binding domain may be selected and incorporated into the recombinant protein as a capture peptide. For example, if an antibody binding domain is used as a capture peptide, the antibody binding to the antibody will act as a probe for detecting a target substance, and thus the antibody-binding domain will be used as an additional binding of the antibody to the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention. .

한 구체예에서, 상기 캡처 펩타이드는 항원일 수 있다. 시료 내에 존재하는지 탐지하고자 하는 타겟 물질이 항체일 때, 캡처 펩타이드는 항원일 수 있다. 타겟 물질의 종류를 탐지할 수 있도록 사용되는 캡처 펩타이드로서의 항원의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 시료, 예컨대 혈액 내에 존재하는 항체를 탐지해 낼 수 있는 것이면 어떠한 것이든 관계 없다. 예를 들어, 상기 항원은 암에 대한 항원일 수 있다. 이 경우, 이를 통해 혈액 내에 존재하는지 탐지하고자 하는 항체는 이러한 암 항원에 대한 자가항체일 수 있다. In one embodiment, the capture peptide may be an antigen. When the target substance to be detected in the sample is an antibody, the capture peptide may be an antigen. The type of antigen as a capture peptide used to detect the type of target substance is not particularly limited. Preferably, it does not matter whatsoever as long as it can detect the antibody present in a sample, such as blood. For example, the antigen may be an antigen for cancer. In this case, the antibody through which it is intended to detect whether it is present in the blood may be an autoantibody against this cancer antigen.

본 발명의 한 구체예에서, 컨트롤 단백질은 프로테아좀 α일 수 있다. In one embodiment of the invention, the control protein may be proteasome α.

한 구체예에서, 상기 기재는 금속으로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 기재는 니켈로 이루어진 것일 수 있다. In one embodiment, the substrate may be made of a metal. In one embodiment of the present invention, the substrate may be made of nickel.

컨트롤 단백질을 니켈 기재 상에 고정할 때에는 컨트롤 단백질에 히스티딘 태그(His-tag)를 포함시킨 재조합 컨트롤 단백질을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 표면에 금 나노닷이 형성되어 있는 니켈 기재에 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 프로테아좀 α 입자를 함유하는 완충액을 처리하면 금 나노닷이 형성되어 있는 부분을 제외한 나머지 니켈 부위에 재조합 프로테아좀 α 을 선택적으로 결합시킬 수 있게 된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 기재는 니켈로 이루어진 것이고, 컨트롤 단백질은 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 컨트롤 단백질일 수 있다.When immobilizing the control protein on the nickel substrate, it may be advantageous to use a recombinant control protein in which the control protein contains a histidine tag. For example, when a buffer containing a recombinant proteasome α particle containing a histidine tag is treated on a nickel substrate having a gold nanodot formed on its surface, the recombinant pro Theasome α can be selectively bound. Thus, in one embodiment, the substrate is made of nickel and the control protein can be a recombinant control protein comprising a histidine tag.

한 구체예에서, 금속 나노닷은 금 나노닷일 수 있다.In one embodiment, the metal nanodots can be gold nanodots.

금속 나노닷이 금 나노닷일 때에는 금 나노닷 상에 단백질을 적층시키기 위한 전 단계로서 폴리아데닌 올리고머를 결합시키는 단계를 포함하는 것이 유리할 수 있다. When the metal nanodots are gold nanodots, it may be advantageous to include the step of binding the polyadenine oligomer as a preliminary step for depositing proteins on the gold nanodots.

폴리아데닌 올리고머는 금과 선택적으로 결합하는 것으로 잘 알려져 있다. 폴리아데닌 올리고머가 기재 상에 이미 고정되어 있는 컨트롤 단백질에 결합하지 않고 금 나노닷에만 결합하도록 하기 위해서는, pH를 변화시켜 컨트롤 단백질의 네트 전하를 음전하로 조정함으로써, 동일한 음전하를 띠는 폴리아데닌 올리고머가 금 나노입자에만 선택적으로 결합하도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체의 제조 방법의 한 구체예에서, 상기 금속 나노닷이 금 나노닷일 경우, pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 금 나노닷 상에 폴리아데닌 올리고머를 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.Polyadenine oligomers are well known for selectively binding with gold. In order for the polyadenine oligomer to bind only to gold nanodots without binding to the control protein already immobilized on the substrate, the same negatively charged polyadenine oligomer is modified by changing the pH to adjust the net charge of the control protein to negative charge. It can be selectively bonded only to gold nanoparticles. Therefore, in one embodiment of the method for producing a protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention, when the metal nanodot is a gold nanodot, the pH is adjusted on the gold nanodot by adjusting the net charge of the control protein. Binding adenine oligomers.

금속 나노닷 상에 DNA층을 형성하는 것은 상기 방법에 제한되지 않으며, 당업계에 알려져 있는 통상의 방법을 이용할 수 있다.Forming the DNA layer on the metal nanodot is not limited to the above method, and conventional methods known in the art may be used.

금속 나노닷 상에 DNA층이나 단백질층을 1차적으로 형성하고 나면, 앞서 설명한 바와 같이 pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 매우 간단하게 금속 나노닷 상에 DNA층과 단백질층을 순차적으로 반복하여 적층할 수 있게 된다. After the first formation of the DNA or protein layer on the metal nanodot, as described above, by changing the pH to adjust the net charge of the control protein, very simply sequential DNA and protein layer on the metal nanodot Can be repeatedly stacked.

한편, 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체를 제조함에 있어서, 적층시키고자 하는 단백질에는 강한 양전하를 부여할 수 있는 아미노산이 포함되어 있는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 적층되는 단백질은 양전하를 띠는 복수개의 아미노산을 추가로 포함하는 재조합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 적층되는 단백질은 N-말단 또는 C-말단에 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 양전하성 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 실시예에서 사용한 Dps 단백질과 같이 폴리라이신과 같은 양전하성 아미노산을 포함하는 단백질을 적층시킬 단백질로 선택하고, 이의 일 말단에 캡처 펩타이드를 갖도록 재조합 단백질을 제조하여 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체의 제조에 사용할 수도 있다. Meanwhile, in preparing the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention, it may be preferable that the protein to be stacked contains amino acids capable of imparting a strong positive charge. Thus, in one embodiment, the protein to be stacked may be a recombinant protein further comprising a plurality of positively charged amino acids. For example, the protein to be stacked may further comprise a positively charged amino acid such as lysine, arginine or histidine at the N-terminus or C-terminus. Alternatively, a protein containing a positively charged amino acid such as polylysine, such as the Dps protein used in the embodiment of the present invention is selected as a protein to be stacked, and a recombinant protein is prepared to have a capture peptide at one end thereof according to the present invention. It can also be used to prepare protein-DNA multilayer nanostructures.

본 발명에서 사용되는 재조합 단백질들은 정제의 편의를 위해 N- 또는 C-말단에 히스티딘 태그를 포함시킬 수도 있다. 한편, 단백질층과 단백질층 사이에 적층하게 되는 DNA는 충분한 음전하를 제공해 줄 정도의 길이만 충족시키면 되고, 상기 DNA 서열을 이루고 있는 핵산의 구체적인 구성은 문제가 되지 않는다. 충분한 음전하를 제공해 줄 정도의 DNA의 길이는 사용되는 재조합 단백질의 종류, 크기에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자가 적절히 조절할 수 있을 것이다. Recombinant proteins used in the present invention may include a histidine tag at the N- or C-terminus for convenience of purification. On the other hand, the DNA to be laminated between the protein layer and the protein layer only needs to satisfy the length enough to provide a sufficient negative charge, the specific configuration of the nucleic acid constituting the DNA sequence is not a problem. The length of the DNA to provide sufficient negative charge may vary depending on the type and size of the recombinant protein used, which will be properly adjusted by those skilled in the art.

한편, 금속 나노닷 상에 DNA층과 단백질층을 적층하는 과정의 반복 횟수에 따라 적층되는 단백질층의 수를 조정할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체는 2 내지 20층의 단백질층을 포함할 수 있다. Meanwhile, the number of protein layers to be stacked may be adjusted according to the number of repetitions of the process of laminating the DNA layer and the protein layer on the metal nano dot. Although not limited thereto, the protein-DNA multilayer nanostructure according to the present invention may include 2 to 20 protein layers.

본 발명은 또한 상기 제조 방법에 의해 제조된 단백질-DNA 다층 나노구조체 및 이를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 각각의 구성요소에 대한 설명은 앞서 설명한 바를 인용한다.The present invention also provides a protein-DNA multilayer nanostructure produced by the above production method and a biosensor comprising the same. The description of each component is cited above.

본 발명은 금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재; 상기 기재의 금속 나노닷을 제외한 부분에 고정되어 있는 pH에 따라 네트 전하가 변화하는 컨트롤 단백질; 및 pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 금속 나노닷 상에 순차적으로 반복하여 적층시킨 DNA층과 단백질층을 포함하는 단백질-DNA 다층 나노구조체를 포함하는 바이오센서를 제공한다. The present invention is a substrate having a metal nano dot formed on the surface; A control protein whose net charge changes according to a pH fixed to a portion excluding the metal nanodot of the substrate; And it provides a biosensor comprising a protein-DNA multilayer nanostructure comprising a DNA layer and a protein layer sequentially and repeatedly stacked on a metal nano dot by changing the pH of the control protein by changing the net charge of the control protein.

이러한 바이오센서는 적층되는 단백질층이 모두 동일한 종류의 단백질로 이루어져 있는 단백질-DNA 다층 나노구조체를 포함할 수도 있고, 적층되는 단백질층에 따라상이한 종류의 단백질로 이루어져 있는 단백질-DNA 다층 나노구조체를 포함할 수도 있다. 재조합 단백질층이 모두 동일한 종류의 재조합 단백질로 이루어져 있는 단백질-DNA 다층 나노구조체가 바이오센서에 포함되는 경우에는 하나의 단백질-DNA 다층 나노구조체를 하나의 단위로 하여, 여러 종류의 단백질-DNA 다층 나노구조체를 포함하는 수 개의 단위를 포함하는 형태로 구성함으로써 동시에 여러가지 타겟물질을 탐지할 수 있도록 할 수 있을 것이다. Such biosensors may include protein-DNA multilayer nanostructures in which the stacked protein layers are all composed of the same kind of protein, or include protein-DNA multilayer nanostructures composed of different kinds of proteins according to the stacked protein layers. You may. When the biosensor includes a protein-DNA multilayer nanostructure in which the recombinant protein layers are all composed of the same type of recombinant protein, the protein-DNA multilayer nanostructure is composed of one protein-DNA multilayer nanostructure as one unit. It may be possible to detect various target materials at the same time by constructing a form including several units including a structure.

본 발명은 또한 앞서 설명한 단백질-DNA 다층 나노구조체를 시료와 접촉시키고 타겟 물질의 존재를 확인하는 것을 포함하는 타겟 물질의 탐지 방법을 제공한다. The present invention also provides a method of detecting a target material comprising contacting the protein-DNA multilayer nanostructure described above with a sample and confirming the presence of the target material.

한 구체예에서, 상기 타겟 물질은 항체 또는 항원일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 타겟 물질은 항체일 수 있다. In one embodiment, the target substance may be an antibody or an antigen. In other embodiments, the target material can be an antibody.

한편, 상기 타겟 물질의 존재를 확인하는 것은 신호 물질을 이용하여 수행될 수 있다. 신호 물질은 타겟 물질에 결합하여 타겟 물질이 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체 상의 캡처 펩타이드에 결합되었는지를 모니터링할 수 있게 해 준다. 시각적으로 쉽게 확인할 수 있도록 상기 신호 물질로는 형광 물질, 발색 물질, 퀀텀닷 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 타겟 물질이 항체인 경우, 신호물질은 상기 항체에 결합될 수 있는 항원 모티프를 포함하며, 형광 단백질을 포함하는 재조합 단백질일 수 있다. On the other hand, confirming the presence of the target material may be performed using a signal material. The signal material binds to the target material and allows monitoring of whether the target material is bound to the capture peptide on the protein-DNA multilayer nanostructures according to the present invention. As the signal material, a fluorescent material, a coloring material, a quantum dot, etc. may be used to visually easily identify the signal material. For example, when the target material is an antibody, the signal material includes an antigen motif capable of binding to the antibody, and may be a recombinant protein including a fluorescent protein.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley ＆ Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.Matters related to genetic engineering in the present invention are described in Sambrook et al. (Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)) and Frederick et al. M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volumes 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

본 발명에 따르면 pH를 변화시켜 컨트롤 단백질의 네트 전하를 쌓아올리고자 하는 단백질 또는 DNA와 동일한 전하로 조정함으로써, 단백질이나 DNA가 컨트롤 단백질이 아닌 DNA층이나 단백질층에 선택적이고 순차적으로 적층할 수 있게 된다. 이렇게 제조된 3차원의 단백질-DNA 다층 나노구조체는 타겟 물질을 검출할 수 있는 바이오센서에 적용할 수 있다.
According to the present invention, by adjusting the pH to the same charge as the protein or DNA to accumulate the net charge of the control protein, so that the protein or DNA can be selectively and sequentially stacked on the DNA layer or protein layer, not the control protein do. Thus prepared three-dimensional protein-DNA multilayer nanostructures can be applied to a biosensor capable of detecting the target material.

도 1은 표면에 금 나노닷이 형성되어 있는 니켈 기재를 제조하는 공정을 예시한 도면이다.
도 2는 유방암 또는 대장암 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원 펩타이드[BRCAA1(breast cancer associated antigen 1)의 610-619 단편 또는 인간 HDAC3(histone deacetylase 3)의 411-428 단편]가 각각의 DPS 모노머의 C-말단에 연결되도록 E. Coli DPS를 유전공학적으로 조작한 재조합 DPS 단백질의 구조를 보여주는 도면이다.
도 3은 재조합 DPS와 프로테아좀 α 나노입자가 pH 5.0 및 8.0의 수용액에서 고유의 나노구조를 유지함을 보여주는 사진이다.
도 4는 재조합 프로테아좀 α 입자의 등전점을 보여주는 제타 포텐셜 분석의 결과이다.
도 5는 유전공학적으로 조작된 재조합 DPS 단백질 입자가 야생형 DPS 단백질 입자와 동일한 DNA 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여주는 젤 시프트 어세이의 결과이다.
도 6은 야생형 DPS 단백질 입자 및 재조합 DPS 단백질 나노입자의 DNA 결합 활성이 산성 조건 (pH 5)하에서 더 높음을 보여준다.
도 7은 본 발명에 따른 단백질-DNA 다층 나노구조체의 제조를 위한 단백질 나노입자와 DNA의 반복적인 layer-by-layer 어셈블리에 대한 구체적인 과정을 개략적으로 보여주는 모식도이다.
도 8은 AFM에 의한 2D 및 3D 이미지와 수직 섹션 분석 결과를 보여준다.
도 9는 각기 다른 항원성 펩타이드를 입자 표면에 디스플레이 하고 있는 각기 다른 타입의 재조합 DPS 입자를 이용한 이종성의 단백질-DNA 다층 나노구조체를 이용하여 복수의 항체 마커의 동시적 탐지가 가능함을 보여주는 모식도이다.1 is a diagram illustrating a process of manufacturing a nickel substrate having gold nanodots formed on a surface thereof.
FIG. 2 shows antigenic peptides specifically recognized by breast or colorectal cancer antibodies [610-619 fragment of breast cancer associated antigen 1 (BRCAA1) or 411-428 fragment of human HDAC3 (histone deacetylase 3)] Figure shows the structure of a recombinant DPS protein genetically engineered E. Coli DPS to be linked to the C-terminus of.
Figure 3 is a photograph showing that the recombinant DPS and proteasome α nanoparticles retain their intrinsic nanostructure in aqueous solutions of pH 5.0 and 8.0.
4 shows the results of zeta potential analysis showing the isoelectric point of the recombinant proteasome α particles.
5 is the result of a gel shift assay showing that genetically engineered recombinant DPS protein particles have the same DNA binding affinity as wild type DPS protein particles.
6 shows that the DNA binding activity of wild type DPS protein particles and recombinant DPS protein nanoparticles is higher under acidic conditions (pH 5).
Figure 7 is a schematic diagram showing a specific process for the repeated layer-by-layer assembly of protein nanoparticles and DNA for the production of protein-DNA multilayer nanostructures according to the present invention.
8 shows 2D and 3D images and vertical section analysis results by AFM.
9 is a schematic diagram showing the simultaneous detection of a plurality of antibody markers using heterogeneous protein-DNA multilayer nanostructures using different types of recombinant DPS particles displaying different antigenic peptides on the particle surface.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various forms. It is provided to fully convey the scope of the invention to those skilled in the art, and the present invention is defined only by the scope of the claims.

[실시예][Example]

실시예 1: 골드닷의패턴화된어레이를갖는니켈플레이트의제조Example 1 Preparation of Nickel Plates with Patterned Arrays of Gold Dots

Si 마스터 몰드를 통상적인 DUV 리소그라피 및 CF4 플라즈마로의 반응성 이온에칭에 의해 제조하였다. SEM으로 확인해 본 바에 따르면, 상기 Si 마스터는 500 nm의 직경, 900 nm의 간격, 그리고 16 nm의 높이를 갖는 육각형과 유사한 모양의 닷 어레이 구조를 갖는다. 점착 방지 처리를 위해, HDFS-SAM을 상기 Si 마스터 몰드 상에 코팅하였다[2]. 도 1은 니켈 층 상에 Au 나노닷을 제조하기 위한 과정의 개략도를 보여준다. 우선, 100nm의 두께를 갖는 니켈층을 선세정된 Si 웨이퍼 상에 전자빔 증착법(e-beam evaporation)을 통해 증착시켰다. LOL™2000 (Shipley Ltd.)를 Ni이 코팅된 Si 웨이퍼 상에 30초 동안 6000 rpm에서 스핀 코팅하였다. 그런 다음, 적량의 모노머 기반 열 경화성 수지를 상기 기재에 적가하고, 상기 HDFS-SAM 층을 포함하는 Si 마스터 몰드를 상기 기재 상에 두었다. Si 마스터 몰드를 균일하게 가압하기 위하여, 압력-용기 타입의 임프린팅 시스템을 사용하였다. 임프린팅 과정은 20 atm, 120℃에서 5분 동안 수행되었다 [3]. 임프린팅 과정이 완료된 후, Si 마스터 몰드를 상기 기재로부터 떼어내고, 산소 플라즈마로 반응성 이온 에칭 공정을 수행하였다. 이러한 산소 반응성 이온 에칭 (RIE) 공정은 200 W의 전압, 40 mTorr의 압력, 그리고 40 sccm의 산소 주입 속도로 90초 동안 수행되었다.[4] 산소 RIE 후, 두께 16 nm의 Au 층이 전자빔 증착법에 의해 임프린팅된 패턴을 갖는 기재 상에 증착되었다. 레지스트-제거 용액으로 리프트-오프 공정(lift-off process)을 통해 Ni 층이 코팅된 Si 웨이퍼 상에 두께 16 nm의 Au 닷 어레이를 형성하였다.
Si master molds were prepared by conventional DUV lithography and reactive ion etching with CF 4 plasma. As confirmed by SEM, the Si master has a dot array structure shaped like a hexagon having a diameter of 500 nm, a gap of 900 nm, and a height of 16 nm. For anti-sticking treatment, HDFS-SAM was coated onto the Si master mold [2] . 1 shows a schematic of a process for producing Au nanodots on a nickel layer. First, a nickel layer having a thickness of 100 nm was deposited on the precleaned Si wafer by e-beam evaporation. LOL ™ 2000 (Shipley Ltd.) was spin coated on a Ni coated Si wafer at 6000 rpm for 30 seconds. An appropriate amount of monomer based thermosetting resin was then added dropwise to the substrate and a Si master mold comprising the HDFS-SAM layer was placed on the substrate. In order to pressurize the Si master mold uniformly, a pressure-vessel type imprinting system was used. The imprinting process was performed at 20 atm and 120 ° C. for 5 minutes [3] . After the imprinting process was completed, the Si master mold was removed from the substrate and subjected to a reactive ion etching process with oxygen plasma. This oxygen reactive ion etching (RIE) process was performed for 90 seconds at a voltage of 200 W, a pressure of 40 mTorr, and an oxygen injection rate of 40 sccm. [4] After the oxygen RIE, an Au layer having a thickness of 16 nm was deposited on the substrate having an imprinted pattern by an electron beam deposition method. A 16-nm-thick Au dot array was formed on the Ni layer coated Si wafer through a lift-off process with a resist-removal solution.

실시예 2: 유전공학적으로조작된 DPS, 프로테아좀-α나노입자, eGFP, 및 DsRed의합성Example 2: Synthesis of genetically engineered DPS, proteasome-α nanoparticles, eGFP, and DsRed

자기 조립되어 원통형의 나노입자를 형성하는 14개의 프로테아제 α 서브유닛으로 이루어진 T. acidophilum 프로테아좀 α [33-36] 는 각각의 서브 유닛의 N-말단에 헥사히스티딘을 갖도록 유전공학적으로 조작되었다. T. acidophilum proteasome α [33-36] consisting of 14 protease α subunits self-assembled to form cylindrical nanoparticles was genetically engineered to have hexahistidine at the N-terminus of each subunit.

NH2-NcoI-헥사히스티딘 -[T. acidophilum 프로테아좀 α의 모노머 서브유닛]-HindIII-COOH 를 코딩하는 유전자 클론을 적당한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고 pET28a (Kan+)(Novagen, Germany)의 NcoI-HindIII 클로닝 사이트에 라이게이션시켜, 재조합 프로테아좀 α 나노입자의 합성을 코딩하는 발현 벡터 pET28a-PROT를 제조하였다. NH 2 -NcoI-hexahistidine-[T. The gene clone encoding the monomeric subunit of acidophilum proteasome α-HindIII-COOH was PCR amplified using a suitable primer and ligated to the NcoI-HindIII cloning site of pET28a (Kan + ) (Novagen, Germany) for recombination. An expression vector pET28a-PROT was prepared encoding the synthesis of proteasome α nanoparticles.

한편, 12개의 모노머 서브유닛으로 이루어진 고유의 E. coli DPS는 E. coli 세포질 중에서 자기조립을 통해 10nm 직경의 구형 나노입자를 형성하며, 이는 N-말단 리신 클러스터로 인하여 높은 양성 표면 전하를 가지며, 그로 인하여 DNA에 대한 강한 친화성을 나타낸다 [32] . On the other hand, the unique E. coli DPS consisting of 12 monomer subunits forms spherical nanoparticles of 10 nm diameter through self-assembly in the E. coli cytoplasm, which has a high positive surface charge due to the N-terminal lysine cluster, This results in a strong affinity for DNA [32] .

E. coli DPS 나노입자의 N- 및 C-말단은 입자의 바깥은 향해 있으므로 (도 2), DPS 입자 표면을 다양한 항원 펩타이드를 결합시켜 다양하게 기능화시킬 수 있다. 이를 이용하여, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 각각의 DPS 모노머의 C-말단에 각각 유방암 또는 대장암 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원 펩타이드[즉, BRCAA1(breast cancer associated antigen 1)의 610-619 단편 또는 인간 HDAC3(histone deacetylase 3)의 411-428 단편]가 각각의 DPS 모노머의 C-말단에 연결되도록 E. Coli DPS를 유전공학적으로 조작하였다. 또한 금속 친화성 정제를 용이하게 하기 위해 히스티딘 태그를 DPS의 말단에 연결시켰다. 이렇게 유전공학적으로 조작된 DPS 나노입자는 DNA, 질환 마커, 및 니켈에 대한 3중의 친화성을 갖게 된다.Since the N- and C-terminus of E. coli DPS nanoparticles are toward the outside of the particle (FIG. 2), the surface of the DPS particles can be variously functionalized by binding various antigenic peptides. Using this, as can be seen in Figure 2, at the C-terminus of each DPS monomer, each of the antigen peptides specifically recognized by breast or colorectal antibodies [i.e., 610 of BRCAA1 (breast cancer associated antigen 1) E. Coli DPS was genetically engineered so that the -619 fragment or the 411-428 fragment of human HDAC3 (histone deacetylase 3) was linked to the C-terminus of each DPS monomer. The histidine tag was also linked to the end of the DPS to facilitate metal affinity purification. These genetically engineered DPS nanoparticles have triple affinity for DNA, disease markers, and nickel.

이를 위해, NH2-NdeI-헥사히스티딘-[E. coli DPS의 모노머 서브유닛]-G2SG2SGSGS-XhoI-COOH 및 NH2-XhoI-[HDAC3의 411-429 단편]-BamHI-COOH (또는 NH2-XhoI-[BRCAA1의 610-619 단편]-BamHI-COOH)을 코딩하는 유전자 클론들을 적당한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고, pT7-7 (Amp+)의 NdeI-XhoI-BamHI 클로닝 사이트에 라이게이션시켜 표면에 노출된 펩타이드 HDAC3 (또는 BRACAA1)를 갖는 재조합 DPS 나노입자의 합성을 코딩하는 발현 벡터 pT7-DPS-HDAC3 (또는 pT7-DPS-BRCAA1)를 제조하였다(도 2). To this end, NH 2 -NdeI-hexahistidine- [E. monomeric subunit of coli DPS] -G2SG2SGSGS-XhoI-COOH and NH 2 -XhoI- [411-429 fragment of HDAC3] -BamHI-COOH (or NH 2 -XhoI- [610-619 fragment of BRCAA1] -BamHI-COOH ) Gene clones encoding PCR) using appropriate primers and ligated to the NdeI-XhoI-BamHI cloning site of pT7-7 (Amp + ) to recombinant DPS nano with peptide HDAC3 (or BRACAA1) exposed to the surface. An expression vector pT7-DPS-HDAC3 (or pT7-DPS-BRCAA1) encoding the synthesis of the particles was prepared (FIG. 2).

NH2-NdeI-헥사히스티딘-[eGFP(enhanced green fluorescence protein)]-G2SG2SGSGS-XhoI-COOH 및 NH2-XhoI-[BRCAA1의 610-619 단편]-BamHI-COOH 을 코딩하는 유전자 클론들을 PCR-증폭시키고, pT7-7의 NdeI-XhoI-BamHI 클로닝 부위에 라이게이션시켜 펩타이드 BRCAA1과 연결된 재조합 eGFP의 합성을 코딩하는 발현 벡터 pT7-GFP-BRCAA1를 생산하였다(도 2). 유사하게, pT7-7의 동일한 클로닝 부위 NdeI-XhoI-BamHI를 사용하여 NH2-NdeI-헥사히스티딘-[DsRed(red fluorescence protein)]-G2SG2SGSGS-XhoI-COOH 및 NH2-XhoI-[HDAC3의 411-429 단편]-BamHI-COOH을 코딩하는 PCR 증폭된 유전자 클론들을 라이게이션시켜 펩타이드 HDAC3와 연결된 재조합 DsRed의 합성을 코딩하는 발현 벡터 pT7-RED-HDAC3를 생산하였다(도 2). NH 2 -NdeI- hexa-histidine - [eGFP (enhanced green fluorescence protein )] - G2SG2SGSGS-XhoI-COOH and NH 2 -XhoI- [BRCAA1 610-619 fragment of] the PCR- amplified gene clone encoding the -BamHI-COOH And ligated to the NdeI-XhoI-BamHI cloning site of pT7-7 to produce the expression vector pT7-GFP-BRCAA1 encoding the synthesis of recombinant eGFP linked to peptide BRCAA1 (FIG. 2). Similarly, 411 of NH 2 -NdeI-hexahistidine- [DsRed (red fluorescence protein)]-G2SG2SGSGS-XhoI-COOH and NH 2 -XhoI- [HDAC3 using the same cloning site NdeI-XhoI-BamHI of pT7-7 -429 Fragmentation] PCR amplified gene clones encoding BamHI-COOH were ligated to produce expression vector pT7-RED-HDAC3 encoding the synthesis of recombinant DsRed linked to peptide HDAC3 (FIG. 2).

DNA 시퀀싱을 완료한 후, 상기 발현 벡터들로 E. coli BL21 (DE3)[F-ompThsdSB(rB-mB-)]을 형질전환시키고, 암피실린- (또는 카나마이신-) 내성 형질전환체를 최종적으로 선별하였다. 재조합 E. coli 배양, 유전자 발현, 단백질 나노입자의 정제는 우리의 이전 논문에 잘 기술되어 있다 [5, 6] . 유전공학적으로 조작된 DPS 및 프로테아좀 α의 합성은 SDS-PAGE 어세이를 통해 확인하였다.After completion of the DNA sequencing, the expression vector into E. coli BL21 (DE3) was transformed with [F-ompThsdS B (rB - - mB)], ampicillin (or kanamycin-) the transformants resistant transformants finally Screened. Recombinant E. coli cultures, gene expression, and purification of protein nanoparticles are well described in our previous paper [5, 6] . Synthesis of genetically engineered DPS and proteasome α was confirmed via SDS-PAGE assay.

도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 재조합 DPS와 프로테아좀 α 나노입자는 pH 5.0 및 8.0의 수용액에서 충분히 긴 기간 동안 고유의 나노구조를 유지하였으며, 이는 이들 단백질 나노입자가 layer by layer 어셈블리의 공정을 위해 사용되기에 충분히 안정함을 나타낸다. 한편, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 재조합 프로테아좀 α 입자의 등전점은 제타 포텐셜 분석의 결과에서 6.6으로 나타났다.
As can be seen in FIG. 3, the recombinant DPS and proteasome α nanoparticles retained their intrinsic nanostructures for sufficiently long periods in aqueous solutions at pH 5.0 and 8.0, in which these protein nanoparticles were subjected to the process of layer by layer assembly. Stable enough to be used for On the other hand, as can be seen in Figure 4, the isoelectric point of the recombinant proteasome α particles was found to be 6.6 in the result of zeta potential analysis.

실시예 3: DPS 돌연변이입자에대한 DNA의결합을평가하기위한젤시프트어세이(Gel shift assay)Example 3: Gel shift assay to assess the binding of DNA to DPS mutants

유전공학적으로 조작된 DPS 입자가 야생형 DPS 입자와 동일한 DNA 결합 친화성을 갖는다는 것을 입증하기 위하여 DNA 프로브와 DPS 돌연변이 입자들의 배양 혼합물로 젤 시프트 어세이를 수행하였다.Gel shift assays were performed with a culture mixture of DNA probes and DPS mutant particles to demonstrate that genetically engineered DPS particles had the same DNA binding affinity as wild type DPS particles.

구체적으로, 야생형 DPS 입자와 표면에 노출된 BRCAA1 또는 HDAC3 펩타이드를 갖는 DPS 돌연변이 입자의 DNA-결합 활성을 DNA 프로브로서 슈퍼-코일 형태의 pET 28a DNA (5369 bp, 20 nM)를 이용하여 젤 시프트 어세이를 통해 평가하였다[6]. 재조합 프로테아좀 α 입자 또한 음성 대조군으로서 시험하였다. DNA 프로브를 TAE 버퍼 중에서 야생형 및 변이된 DPS 입자(3 mΜ)와 함께 pH 5 및 8에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. DNA 프로브 및 DNA-단백질 인큐베이션 혼합물을 동일한 TAE 버퍼 중에서 1% 아가로스 젤을 이용하여 젤-전기영동하였다. Specifically, the DNA-binding activity of wild-type DPS particles and DPS mutant particles having BRCAA1 or HDAC3 peptides exposed to the surface was gel shifter using super-coiled pET 28a DNA (5369 bp, 20 nM) as a DNA probe. This was assessed through essays [6] . Recombinant proteasome α particles were also tested as negative controls. DNA probes were incubated with wild-type and mutated DPS particles (3 mM) in TAE buffer for 30 minutes at room temperature at pH 5 and 8. DNA probes and DNA-protein incubation mixtures were gel-electrophoresed using 1% agarose gel in the same TAE buffer.

도 5는 단백질이 없는 DNA 프로브, 그리고 DNA 프로브 및 프로테아좀 α 입자의 배양 혼합물과 비교할 때, DNA 프로브과 야생형/돌연변이 DPS 입자의 배양 혼합물의 이동이 아가로스 젤 중에서 유의하게 지연되어 있음을 보여준다. 이는 야생형과 돌연변이 DPS 입자가 모두 DNA에 강하게 결합함을 나타낸다. 이전에 보고된 바와 같이,[1]도 6에서도 DPS 및 그의 2 개의 돌연변이의 DNA 결합 활성은 산성 조건 (pH 5)하에서 더 높음을 관찰할 수 있었다.
FIG. 5 shows that the migration of the DNA probe and the culture mixture of wild-type / mutant DPS particles is significantly delayed in agarose gels when compared to the protein-free DNA probe and the culture mixture of DNA probe and proteasome α particles. This indicates that both wild type and mutant DPS particles bind strongly to DNA. As previously reported, [1] in FIG. 6 it was also observed that the DNA binding activity of DPS and its two mutations was higher under acidic conditions (pH 5).

실시예 4: layer-by-layer 어셈블리및다층단백질나노구조의패턴화된배열Example 4 Patterned Arrays of Layer-by-Layer Assemblies and Multilayer Protein Nanostructures

도 7은 단백질 다층의 패턴화된 어레이에 대한 단백질 나노입자와 DNA의 반복적인 layer-by-layer 어셈블리에 대한 구체적인 과정을 개략적으로 설명하고 있다. Figure 7 schematically illustrates the specific process for repeated layer-by-layer assembly of protein nanoparticles and DNA for a patterned array of protein multilayers.

우선, 골드닷이 패턴화되어 배열되어 있는 니켈 플레이트를 96웰 플레이트 (Cat. No. 3599, Corning, NY, USA)의 각 웰에 맞을 수 있는 크기로(4 mm x 4 mm) 잘랐다(DASOM RMS, Seoul, Korea). 어셈플리 가공을 시작하기 전에 니켈 플레이트를 세척하고 아세톤으로 세정하였다. 그런 다음 1분의 초음파 분해 후 플레이트를 에탄올에 적시고 물로 3회 세척한 후, 다시 1분 동안 초음파 분해를 실시하였다. First, the nickel plate, in which gold dots were patterned and arranged, was cut to a size (4 mm x 4 mm) to fit each well of a 96 well plate (Cat. No. 3599, Corning, NY, USA) (DASOM RMS , Seoul, Korea). The nickel plate was washed and washed with acetone before starting the assembly process. Then, after sonication for 1 minute, the plate was soaked in ethanol, washed three times with water, and then sonicated for 1 minute.

그런 다음, PBS 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) 중의 재조합 프로테아좀 α 입자(1.2 g/L)를 니켈 플레이트에 가하고, 천천히 교반하면서 20분 동안 인큐베이션한 후, 5분 동안 PBS 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하였다. 프로테아좀 α 입자에 결합된 헥사히스티딘 펩타이드의 니켈 친화성으로 인하여 재조합 프로테아좀 α 입자는 니켈 영역에 선택적으로 결합된다. Then, recombinant proteasome α particles (1.2 g / L) in PBS buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 2 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4) were added to a nickel plate, Incubate for 20 minutes with slow stirring, then wash three times with PBS buffer (pH 7.4) for 5 minutes. Due to the nickel affinity of the hexahistidine peptide bound to the proteasome α particles, the recombinant proteasome α particles are selectively bound to the nickel region.

그 후, 단일 가닥 폴리A 올리고머 (20 bp) (pH 8.0 의 PBS 중 100 μM)를 플레이트에 가하고, 10분 동안 인큐베이션하고, 5분 동안 PBS 완충액(pH 8.0)으로 2회 세척하였다. 이는 폴리아데닌과 금 간의 강력하고도 선택적인 친화성[37,38]을 이용한 것으로서, 골드닷에만 선택적으로 폴리A가 결합되게 된다. 폴리A 올리고뉴클레오타이드가 골드 닷에 결합할 때에는 완충액의 pH가 8.0을 유지하게 되므로, 재조합 프로테아좀 α 입자의 네트 전하는 음전하를 띠게 됨으로써(도 4), 가해진 폴리A와 프로테아좀 α 입자 간의 비선택적인 결합을 방지할 수 있게 된다. Single stranded polyA oligomer (20 bp) (100 μM in PBS at pH 8.0) was then added to the plate, incubated for 10 minutes and washed twice with PBS buffer (pH 8.0) for 5 minutes. It utilizes the strong and selective affinity between polyadenine and gold [37,38], which selectively binds polyA to gold dots only. When the polyA oligonucleotide binds to the gold dot, the pH of the buffer is maintained at 8.0, so that the net charge of the recombinant proteasome α particles is negatively charged (Fig. 4), so that the ratio between the added polyA and the proteasome α particles is Selective bonding can be prevented.

그 다음에는, 완충액을 교환하여 pH를 5.0으로 전환시키고, PBS 완충액 (pH 5.0) 중의 재조합 DPS 입자(0.5 g/L)를 가하고, 천천히 교반하면서 플레이트와 함께 5분 동안 인큐베이션한 후, PBS 완충액 (pH 7.4)으로 5분 동안 2회 세척하여, 골드닷에만 형성된 DPS의 제1층을 만들었다. 완충액을 교환하여 다시 pH를 8.0으로 되돌려, 제1층의 DPS 입자에만 결합하도록 이중가닥 DNA 분자(519 bp) (34 nM, pH 8.0)를 가한 후, 10분 동안 인큐베이션하고, PBS 완충액 (pH 8.0)으로 5분 동안 2회 세척하였다. 제2층부터 제7층까지의 DPS 입자의 형성을 위해, 재조합 DPS 입자와 이중 가닥 DNA가 교대로 가해졌으며 동시에 완충액을 교환하여 pH 또한 8.0 내지 5. 변동시켰다. Next, the buffer was exchanged to switch the pH to 5.0, recombinant DPS particles (0.5 g / L) in PBS buffer (pH 5.0) were added and incubated with the plate for 5 minutes with slow stirring, followed by PBS buffer ( washing twice with pH 7.4) for 5 minutes, to form a first layer of DPS that was formed only in gold dots. Exchange the buffer and return the pH to 8.0 again, add double-stranded DNA molecules (519 bp) (34 nM, pH 8.0) to bind only to the DPS particles in the first layer, incubate for 10 minutes, and incubate PBS buffer (pH 8.0) ) Twice for 5 minutes. To form the DPS particles from the second layer to the seventh layer, recombinant DPS particles and double-stranded DNA were alternately added, and at the same time the buffer was exchanged to change the pH from 8.0 to 5.

가해진 Dps 입자와 이중 가닥 DNA는 니켈 표면을 덥고 있는 프로테아좀 α 입자와는 거의 결합하지 않는다. 왜냐하면 프로테아좀 α 입자의 네트 전하가 적당한 버퍼 pH 전환에 의해 Dps 입자 또는 이중 가닥 DNA와 동일한 전하로 조정되고 있기 때문이다(도 8). Layer-by-layer 어셈플리는 골드닷 상에서만 발생하게 되므로, Dps 입자의 다층은 골드닷과 동일한 어레이 패턴을 갖게 된다. The added Dps particles and double-stranded DNA hardly bind to the proteasome α particles on the nickel surface. This is because the net charge of the proteasome α particles is being adjusted to the same charge as the Dps particles or double stranded DNA by appropriate buffer pH conversion (FIG. 8). Layer-by-layer assembly only occurs on gold dots, so the multilayer of Dps particles has the same array pattern as gold dots.

실시예 5: TEM 및 AFM 분석Example 5: TEM and AFM Analysis

전자 현미경 관찰을 위한 정제된 단백질 용액의 염색되지 않은 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids) 상에 샘플 용액의 작은 방울을 자연건조시켜 제조하였다. 단백질 나노입자의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 단백질 나노입자 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 높은 회절 강도를 얻기 위하여 단백질 나노입자가 차지하고 있는 선택된 영역으로부터 전자 회절 패턴을 기록하였다. 단백질 다층의 패턴화된 배열의 AFM 분석을 위한 스캐닝 프로브 실험을 탭핑 모두에서 상업적인 기계를 이용하여 수행하였다(AutoProbe CP from Park Scientific Instruments (PSI), Sunnyvale, CA).Unstained samples of purified protein solutions for electron microscopy were prepared by naturally drying small drops of sample solution on carbon coated copper electron microscopy grids. To obtain stained images of protein nanoparticles, an electron microscope grid containing naturally dried samples was incubated with 2% (w / v) aqueous uranil acetate solution for 10 minutes at room temperature and 3-4 times with distilled water. Washed. Protein nanoparticle images were observed using a Philips Technai 120 kV electron microscope. Electron diffraction patterns were recorded from selected areas occupied by protein nanoparticles to obtain high diffraction intensity. Scanning probe experiments for AFM analysis of patterned arrays of protein multilayers were performed using commercial machines at both tapping (AutoProbe CP from Park Scientific Instruments (PSI), Sunnyvale, CA).

AFM(도 8)에 의한 2D 및 3D 이미지와 수직 섹션 분석을 통해, 재조합 Dps 입자의 layer-by-layer 어셈플리와 다층 단백질 나노기둥의 패턴화된 어레이의 형성은 주어진 주형 상에 성공적으로 이행되는 것을 주목할 수 있었다. 상대적으로 큰 크기(519 bp)를 갖는 최초로 가해진 이중 가닥 DNA가 이중 가닥 DNA와 음으로 하전된 프로테아좀 α 입자 간의 반발로 인하여, 높은 측면의 표면에 결합하지 않고, 제1 DPS 층의 넓은 윗쪽 표면에 보다 잘 결합하는 것으로 나타났다. 유사하게 새로이 가해진 이중 가닥 DNA와 이전에 결합된 이중 가닥 DNA 간의 동일한 전하-전하 반발력은 계속적으로 가해진 이중 가닥 DNA가 DPS 층의 넓은 윗쪽 표면에 더 잘 결합하도록 유도하였으며, 이는 수직 방향으로의 연속적인 다층 성장이 일어나도록 하였다.
Through 2D and 3D images and vertical section analysis by AFM (FIG. 8), the formation of layer-by-layer assemblies of recombinant Dps particles and patterned arrays of multilayer protein nanopillars is successfully implemented on a given template. Could be noted. The first applied double-stranded DNA with a relatively large size (519 bp) does not bind to the high side surface due to repulsion between the double-stranded DNA and the negatively charged proteasome α particles, but the wide top of the first DPS layer It appeared to bind better to the surface. Similarly, the same charge-charge repulsion between newly applied double-stranded DNA and previously bound double-stranded DNA induces that the continuously applied double-stranded DNA binds better to the broad upper surface of the DPS layer, which is continuous in the vertical direction. Multilayer growth was allowed to occur.

실시예 4: 유방암및대장암항체마커의탐지Example 4 Detection of Breast and Colon Cancer Antibody Markers

각기 다른 항원성 펩타이드를 입자 표면에 디스플레이 하고 있는 각기 다른 타입의 재조합 DPS 입자를 이용하여 이종성의 다층을 쉽게 형성할 수 있으며, 이들 각각은 항체 마커에 대하여 특이적이다(도 7). 이는 이종성 다층의 패턴화된 어레이를 이용하여 복수의 항체 마커의 동시적 탐지가 가능함을 나타낸다 (도 9a). 탐지 신호는 항체-특이적 항원성 펩타이드[즉, BRCAA1 (유방암의 항원성 펩타이드) 또는 HDAC3 (대장암의 항원성 펩타이드)]와 결합된 재조합 녹색 또는 적색 형광 단백질(즉, 유전공학적으로 조작된 eGFP 또는 DsRed) (도 2 및 도 9a)을 이용하였다. 유방암과 대장암은 개발도상국과 선진국 모두에서 가장 흔한 암이며, 그들이 조기에 탐지될 때 상대적으로 치료가능한 암에 해당한다 [39]. 최근, 혈청 항체들이 암의 탐지에서의 유망한 바이오마커로서 출현하였다[40]. 보고된 바에 따르면 [41], 펩타이드 BRCAA1 에피토프는 65%의 유방암 검체에서 양성 발현을 나타내며, 이는 그의 혈청 항체 수준이 유방암 진단을 위해 도움이 될 수 있음을 제시한다. 또한, Weichert 등은 대장암에 대한 혈청학적 항원/바이오마커로서 HDAC3에 대한 항체의 탐지를 제안한 바 있다 [42]. 이러한 최근의 발견들은 항체 탐지 기반의 진단이 암 진단에 대해 임상적으로 유의할 수 있음을 제시한다. Different types of recombinant DPS particles displaying different antigenic peptides on the particle surface can easily be used to form heterogeneous multilayers, each of which is specific for antibody markers (FIG. 7). This indicates that simultaneous detection of multiple antibody markers is possible using a heterogeneous multilayered patterned array (FIG. 9A ) . The detection signal is a recombinant green or red fluorescent protein (ie genetically engineered eGFP) coupled with an antibody-specific antigenic peptide (ie BRCAA1 (antigenic peptide of breast cancer) or HDAC3 (antigenic peptide of colorectal cancer)). Or DsRed) (FIGS. 2 and 9A). Breast and colorectal cancer are the most common cancers in both developing and developed countries and are relatively treatable when they are detected early [39] . Recently, serum antibodies have emerged as promising biomarkers in the detection of cancer [40]. Reportedly [41] , the peptide BRCAA1 epitope shows positive expression in 65% of breast cancer samples, suggesting that its serum antibody levels may be helpful for the diagnosis of breast cancer. Weichert et al. Have also proposed the detection of antibodies to HDAC3 as serological antigens / biomarkers for colorectal cancer [42] . These recent findings suggest that antibody detection based diagnosis can be clinically significant for cancer diagnosis.

우선, 우리는 표면에 노출된 BRCAA1를 갖는 재조합 DPS 입자를 이용하여 1, 3, 5, 및 7 층의 나노구조를 갖는 4개의 상이한 어레이를 준비하고, 상기 동질의 다층을 유방암 항체 마커 (1 pM)를 탐지하기 위해 사용하였다 (도 9a). First, we prepared four different arrays with 1, 3, 5, and 7 layers of nanostructures using recombinant DPS particles with BRCAA1 exposed to the surface, and the homogeneous multilayers were labeled with breast cancer antibody markers (1 pM). ) Was used to detect (FIG. 9A ) .

보다 구체적으로, 상기 DPS 다층의 패턴화된 어레이에, PBS 중에 포함된 래빗 항-BRCAA1 다클론 항체(1.0 pM) (Cat. No. ab36962, Abcam, Cambridge, UK) 및/또는 마우스 항-HDAC3 단클론 항체(1.0 pM) (Cat. No. ab49992, Abcam, Cambridge, UK)를 가하고, 1시간 동안 천천히 교반하면서 인큐베이션하고, PBS 완충액 (pH 7.4)으로 15분 동안 2회 세척하였다. More specifically, in the patterned array of DPS multilayers, the rabbit anti-BRCAA1 polyclonal antibody (1.0 pM) contained in PBS (Cat. No. ab36962, Abcam, Cambridge, UK) and / or mouse anti-HDAC3 monoclonal Antibody (1.0 pM) (Cat. No. ab49992, Abcam, Cambridge, UK) was added and incubated with slow stirring for 1 hour and washed twice with PBS buffer (pH 7.4) for 15 minutes.

그런 다음, 상기 항체의 존재를 알려주는 신호입자로서 사용되는, 유전공학적으로 조작된 BRCAA1 펩타이드가 결합되어 있는 eGFP (0.2 g/L) 및/또는 HDAC3 펩타이드가 결합되어 있는 DsRed (0.2 g/L)를 가하고, 1시간 동안 천천히 교반하면서 인큐베이션한 후, PBS 완충액 (pH 7.4)으로 15분 동안 2회 세척하고, 마이크로플레이트 리더기(GENios, Tecan, Austria)를 이용하여 녹색과 적색 형광을 측정하였다. 녹색 형광에 대한 여기 및 발광 파장은 각각 485 및 535 nm였다. 음성 대조군 실험에 대하여, 우리는 비-마커 항체, 또는 항-염소 폴리클로날 IgG (1.0 pM) (Cat. No. sc2384, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 사용하였다.Then, eGFP (0.2 g / L) to which the genetically engineered BRCAA1 peptide is bound and / or DsRed (0.2 g / L) to which the HDAC3 peptide is bound, which is used as a signal particle indicating the presence of the antibody. Was added, incubated with slow stirring for 1 hour, washed twice with PBS buffer (pH 7.4) for 15 minutes, and green and red fluorescence was measured using a microplate reader (GENios, Tecan, Austria). The excitation and emission wavelengths for green fluorescence were 485 and 535 nm, respectively. For negative control experiments, we used non-marker antibodies, or anti-goat polyclonal IgG (1.0 pM) (Cat. No. sc2384, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

그 결과, 녹색 형광 강도는 전체 층 수가 증가함에 따라 점진적으로 증가하였으며(도 9b)), 이는 3차원적 배치가 보다 선택적으로 마커들을 탐지함을 나타낸다. 보고된 바에 따르면, 3차원적 나노구조는 타겟 단백질 마커가 캡쳐 프로브에 대한 향상된 접근성을 갖도록 해 준다.[28,43]이 경우, 다층 단백질 나노구조는, 통상적인 이차원적 분석법에서 오직 선행 분산이 일어나는 것과 달리, 항체 마커와 같은 큰 분자의 방사형의 분산을 허락해주며, 그에 따라 센싱 부위에 대한 접근성과 탐지 민감도를 유의하게 증가시킨다. DPS 입자가 한 층도 없는 경우 형광 신호는 무시할만 했다는 점(도 9b)도 주목할만 했다. 이는 템플릿의 니켈 표면이 재조합 프로테아좀 α 입자에 의해 완전히 덮여, 재조합 eGFP가 노출된 니켈 표면에 결합하는 것을 막았다는 것을 의미한다. As a result, the green fluorescence intensity gradually increased as the total number of layers increased (FIG. 9B) ) , indicating that the three-dimensional arrangement detects markers more selectively. Reportedly, the three-dimensional nanostructure allows the target protein markers to have improved access to the capture probes. [28,43] In this case, multilayer protein nanostructures allow the radial dispersion of large molecules such as antibody markers, as opposed to only prior dispersion in conventional two-dimensional assays, thereby providing access to sensing sites. And significantly increase the detection sensitivity. It was also noteworthy that the fluorescence signal was negligible when there was no layer of DPS particles (FIG. 9B). This means that the nickel surface of the template was completely covered by the recombinant proteasome α particles, preventing the recombinant eGFP from binding to the exposed nickel surface.

다음으로, 2종의 상이한 유형의 재조합 DPS 입자를 이용하여 이종성 다층 어셈블리를 형성하였다. 즉, 제1층 내지 제4층과 제5층 내지 제7층이 각각 HDAC3와 BRCAA1 펩타이드를 갖는 각기 다른 DPS 입자로 이루어져 있는 이종성 다층 어셈블리를 형성하였다(도 7 및 도 9a). 이종성 7층의 나노구조의 어레이를 유방암과 대장암 마커 모두의 탐지를 위해 사용하였을 때(도 9a), 유방암과 대장암 항체(1 pM)가 그들을 별도로 어레이에 가했을 때 재빨리 탐지되었다(도 9c). 항체 마커들 모두가 동일한 샘플 내에 존재할 때, 그들은 또한 동시에 녹색과 적색 형광을 발광하며 명확하게 관찰되었다(도 9c). 게다가, 2종의 항체 마커(1 pM) 의 다중 탐지는 상기 마커들이 인간 혈청 중에 함유되어 있을 때조차도 성공적으로 재현되었다(도 9d). 2개의 음성 대조군 분석이 또한 수행되었다(도 9c 및 도 9d). 음성 대조군 1은 항체 마거가 없는 PBS 완충액 또는 인간 혈청(NC1)으로 수행되었으며, 음성 대조군 2는 비-마커 항체 (즉, 소 항-염소 폴리클로날 IgG)를 함유한 PBS 완충액 또는 인간 혈청(NC2)으로 수행되었다. 음성 대조군 양쪽 모두에서, 형광 신호는 항체 마커 어세이와 비교하여 충분히 낮았으며, 이는 2개의 상이한 암 마커의 독립적인 그리고 동시적인 분석에서 탐지가 특이적이었음을 나타낸다.Next, heterogeneous multilayer assemblies were formed using two different types of recombinant DPS particles. That is, the first to fourth and fifth to seventh layers formed a heterogeneous multilayer assembly composed of different DPS particles having HDAC3 and BRCAA1 peptides, respectively (FIGS. 7 and 9A). When an array of heterogeneous seven-layer nanostructures was used for the detection of both breast and colorectal cancer markers (FIG. 9A), breast and colorectal cancer antibodies (1 pM) were quickly detected when they were added to the array separately (FIG. 9C). . When all of the antibody markers were present in the same sample, they were also clearly observed, simultaneously emitting green and red fluorescence (FIG. 9C). In addition, multiple detection of two antibody markers (1 pM) was successfully reproduced even when the markers were contained in human serum (FIG. 9D). Two negative control assays were also performed (FIG. 9C and FIG. 9D). Negative Control 1 was performed with PBS buffer or human serum (NC1) without antibody margare, and Negative Control 2 was PBS buffer or human serum (NC2) containing non-marker antibody (ie bovine anti-goat polyclonal IgG). Was performed. In both negative controls, the fluorescence signal was sufficiently low compared to the antibody marker assay, indicating that the detection was specific in independent and simultaneous analysis of two different cancer markers.

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Claims (20)

금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재의 금속 나노닷을 제외한 부분에 pH에 따라 네트 전하가 변화하는 컨트롤 단백질을 고정화하고, pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 금속 나노닷 상에 DNA층과 단백질층을 순차적으로 반복하여 적층하는 것을 포함하는 단백질-DNA 다층 나노구조체의 제조 방법.On the metal nanodots by immobilizing a control protein whose net charge changes with pH at a portion other than the metal nanodots of the substrate where the metal nanodots are formed on the surface, and adjusting the net charge of the control protein by changing the pH. Method for producing a protein-DNA multilayer nanostructure comprising the steps of sequentially repeating a DNA layer and a protein layer. 제1항에 있어서,
상기 컨트롤 단백질의 네트 전하가 적층될 순서의 DNA 또는 단백질과 동일한 전하를 띠도록 조정되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1,
And the net charge of the control protein is adjusted to have the same charge as the DNA or protein in the order in which they are to be stacked. 제2항에 있어서,
상기 적층되는 단백질층이 동종 또는 이종의 단백질 입자로 이루어진 것인 방법.The method of claim 2,
The stacked protein layer is a method consisting of homogeneous or heterologous protein particles. 제3항에 있어서,
상기 적층되는 단백질이 N-말단 또는 C-말단에 캡처 펩타이드를 포함하는 것인 방법.The method of claim 3,
Wherein said stacked protein comprises a capture peptide at the N-terminus or C-terminus. 제4항에 있어서,
상기 캡처 펩타이드가 항원 또는 항체 결합 도메인인 방법.The method of claim 4, wherein
The capture peptide is an antigen or antibody binding domain. 제5항에 있어서,
상기 캡처 펩타이드가 항원인 방법.The method of claim 5,
The capture peptide is an antigen. 제6항에 있어서,
상기 캡처 펩타이드가 암에 대한 항원인 방법.The method of claim 6,
The capture peptide is an antigen for cancer. 제1항에 있어서,
컨트롤 단백질은 프로테아좀 α인 방법.The method of claim 1,
The control protein is proteasome α. 제1항에 있어서,
상기 기재는 금속으로 이루어진 것인 방법.The method of claim 1,
Wherein said substrate consists of a metal. 제1항에 있어서,
상기 기재는 니켈로 이루어진 것인 방법.The method of claim 1,
Wherein said substrate consists of nickel. 제1항에 있어서,
상기 기재는 니켈로 이루어진 것이고, 컨트롤 단백질은 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 컨트롤 단백질인 방법.The method of claim 1,
Wherein said substrate is comprised of nickel and the control protein is a recombinant control protein comprising a histidine tag. 제1항에 있어서,
상기 금속 나노닷은 금 나노닷인 방법.The method of claim 1,
The metal nanodot is a gold nanodot. 제1항에 있어서,
상기 금속 나노닷은 금 나노닷이고,
pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 금 나노닷 상에 폴리아데닌 올리고머를 결합시키는 단계를 포함하는 방법.The method of claim 1,
The metal nano dot is a gold nano dot,
binding the polyadenine oligomer onto the gold nanodots by varying the pH to adjust the net charge of the control protein. 제3항에 있어서,
적층되는 단백질이 양전하를 띠는 복수개의 아미노산을 추가로 포함하는 재조합 단백질인 방법.The method of claim 3,
The stacked protein is a recombinant protein further comprising a plurality of positively charged amino acids. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 형성된 단백질-DNA 다층 나노구조체.A protein-DNA multilayer nanostructure formed by the method according to any one of claims 1 to 14. 금속 나노닷이 표면에 형성되어 있는 기재;
상기 기재의 금속 나노닷을 제외한 부분에 고정되어 있는 pH에 따라 네트 전하가 변화하는 컨트롤 단백질; 및
pH를 변화시켜 상기 컨트롤 단백질의 네트 전하를 조정함으로써 금속 나노닷 상에 순차적으로 반복하여 적층시킨 DNA층과 단백질층을 포함하는 단백질-DNA 다층 나노구조체
를 포함하는 바이오센서.A substrate on which metal nanodots are formed;
A control protein whose net charge changes according to a pH fixed to a portion excluding the metal nanodot of the substrate; And
Protein-DNA multilayer nanostructure comprising a DNA layer and a protein layer sequentially stacked on a metal nanodot by adjusting the net charge of the control protein by changing the pH
Biosensor comprising a. 제15항의 단백질-DNA 다층 나노구조체를 시료와 접촉시키고 타겟 물질의 존재를 확인하는 것을 포함하는 타겟 물질의 탐지 방법.A method of detecting a target material comprising contacting the protein-DNA multilayer nanostructure of claim 15 with a sample and confirming the presence of the target material. 제15항에 있어서,
상기 타겟 물질은 항체 또는 항원인 방법.16. The method of claim 15,
The target material is an antibody or antigen. 제17항에 있어서,
상기 타겟 물질의 존재를 확인하는 것은 신호 물질을 이용하여 수행하는 것인 방법.18. The method of claim 17,
Confirming the presence of the target material is performed using a signal material. 제17항에 있어서,
상기 신호 물질은 형광 물질, 발색 물질 또는 퀀텀닷인 방법.18. The method of claim 17,
The signal material is a fluorescent material, a coloring material or a quantum dot.
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